KR100220091B1 - 한국산 무당거미의 장으로부터 분리된 신규 미생물 및 그로부터 생성된 단백질분해효소 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한국산 무당거미(Nephila clavata)의 장으로부터 분리된 신규 미생물 및 이로부터 생산된 단백질분해효소에 관한 것으로, 단백질 분해 활성을 나타내는 본 발명의 신규 미생물 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3는 20 내지 40 ℃의 온도 및 6 내지 10의 pH에서 안정하며 약 51.5 kd의 분자량을 갖는 단백질분해효소를 생산한다.

Description

한국산 무당거미의 장으로부터 분리된 신규 미생물 및 그로부터 생성된 단백질분해효소

본 발명은 한국산 무당거미(Nephila clavata)의 장으로부터 분리된 신규 장내세균류인 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3 및 이에 의해 생산된 단백질분해효소에 관한 것이다.

단백질분해효소는 그 특이성을 기초로 하여 다양하게 구분되며 각각의 특성에 따라 산업적 용도도 달라진다. 예를 들어, 작용 양상별로는 효소의 특이성에 맞는 단백질을 무작위로 절단하여 펩타이드를 형성시키는 엔도펩티다제와 펩타이드 쇄를 따라 아미노산 단위로 분해하는 엑소펩티다제가 있으며, 산도 특성에 따라서는 호산성, 호알칼리성, 중성으로 구분하고, 온도에 따라 내열성, 중온성, 고온성 등으로 구분하며, 효소의 구조에 따라 금속이온을 함유하는 메탈로프로타제, 아미노산 중 세린(serine) 잔기를 활성부위에 함유하는 세린프로타제 등으로 구분하기도 한다.

한편, 곤충류에 속하는 거미의 경우, 그 섭생의 특징이 강력한 독성 물질을 분비하여 포식하고자 하는 먹이를 죽인 다음 그의 체내를 액화시킨 후 섭취하는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 본 발명자들은 거미의 장내에는 외래의 단백질을 분해할 수 있는 다양한 효소 체계가 존재하고 있을 것이며 이들 효소 체계는 거미에 공생하고 있는 미생물에 의해서도 발현될 수 있을 것으로 생각되어, 거미의 장내 미생물 중 단백질 분해 활성을 나타내는 미생물을 탐색하였다. 수종의 거미를 대상으로 탐색하던 중 한국산 무당거미(Nephila clavata)의 장으로부터 단백질분해 능력이 뛰어나며, 특히 저온에서도 상당한 단백질 분해 활성을 나타내는 미생물을 분리하여 본 발명의 완성에 이르게 되었다.

본 발명의 목적은 한국산 무당거미의 장으로부터 분리된, 단백질 분해 활성이 우수한 신규 미생물 및 이로부터 생산된 단백질분해효소를 제공하는 것이다.

도 1은 본 발명에 따라 한국산 무당거미의 장으로부터 분리된 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3의 전자현미경 사진이고,

도 2는 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3의 분류학적 유연관계도를 나타낸 것이며,

도 3은 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3에 의해 생산된 단백질분해효소의 활성을 중성 폴리아크릴아미드겔 상에서 확인한 결과이다.

도 4는 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3의 16S rRNA의 염기서열을 나타낸 것이다.

상기 목적에 따라, 본 발명에서는 한국산 무당거미의 장으로부터 분리된 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3를 제공한다.

본 발명에서는 또한 20 내지 40 ℃의 온도 및 6 내지 10의 pH에서 안정하며 약 51.5 kd의 분자량을 갖는, 상기 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3로부터 생산된 단백질분해효소를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명의 미생물은 한국산 무당거미의 장으로부터 다음과 같이 분리할 수 있다. 먼저, 무당거미의 머리 부분을 제거하고 몸통 부분 만을 70 % 알콜에 10 분간 담구어 표면을 살균한다. 배를 절개하여 체표 부분을 제외한 장을 생리식염수와 함께 균질기에 넣고 균질화한 다음, 1 % 탈지분유를 첨가한 고체배지 상에 도말하여 투명환을 형성하는 균주를 선별한다.

상기와 같이 선별된, 단백질 분해 활성을 갖는 본 발명의 미생물은 그 균주적 특성, 형태적, 생리적 및 균체화학적 특성을 조사한 결과, 포자를 생성하지 않는 그람 음성균이며, 0.3 내지 0.5 ㎛의 세포 크기와 0.7 내지 1.2 ㎛의 세포 길이를 갖는 막대형의 세포로서, 운동성이 강하여 장내 세균류(Enterobacteriaceae)와 유사한 형태적 특징을 갖는 것으로 나타났으며, β-갈락토시다제, 우레아제 및 오르니틴 디카르복실라제를 생산하고, 구연산을 이용하며, 만니톨, 이노시톨, 솔비톨 등의 알콜성 탄수화물로부터 산을 생성하고, 질산염을 아질산염으로 환원하고 옥시다제 음성을 나타내는 생리·생화학적 특성을 가져 장내 세균류의 일반적인 특성과는 차이가 있었고, 균체내 지방산 조성은 탄소수 16 개의 포화 지방산(32%) 및 탄소수 17 개의 고리형 포화 지방산(12%), 그리고 탄소수 16 개 및 15 개의 복합체(20%)가 주지방산으로 존재하였다.

본 발명의 미생물은 상기와 같은 형태학적, 생리학적 및 균체학적 특성에 의거할 때 지금까지 전혀 알려지지 않은 신규의 장내 세균으로 밝혀졌으며 기존의 장내 세균으로는 동정이 불가하여, 본 발명의 미생물 동정을 위해 리보좀 소단위 유전자를 분리하여 그 염기서열을 분석한 결과, 기존의 장내 세균과 94 내지 97 % 정도의 유사성을 나타내었다. 이상과 같은 형태적, 생리적 및 균체화학적 특성 및 염기서열 분석 결과에 의거하여 본 발명의 미생물을 신규의 장내 세균류인 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3로 명명하였다.

본 발명에 따라 한국 무당거미의 장으로부터 분리된 신규 미생물 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3는 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자 은행에 1996년 8월 1일자 수탁번호 KCTC 0268BP로 기탁되었다.

상기와 같이 단백질 분해 활성을 나타내는 본 발명의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3로부터 생산되는 단백질분해효소를 분리하기 위해, 먼저 상기 미생물을 배양 배지(박토 트립톤 0.5 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화칼륨 0.05 %, 황산마그네슘 0.02 %, pH 7.0)에서 25 ℃로 30 시간 동안 배양한 후, 배양액을 원심분리하여 상등액을 취하고, 단백질을 농축하여 일부 정제된 조효소액을 제조한다. 조효소액을 10 % 중성 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하여 밴드를 분리하고 효소 활성 분획을 확인하기 위해 탈지분유 만을 함유한 순수한 평판배지 상에서 단백질 분해 활성을 조사하였을 때 상온에서 즉시 투명환을 형성하였으며, 다시 밴드를 용출하여 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기영동하여 단백질분해효소의 보조단위를 확인한 결과, 본 발명의 미생물에서 분리된 단백질분해효소는 단일 밴드로서 보조단위로 구성되어 있지 않으며 그 분자량은 약 51.5 kd이었다. 분리된 단백질분해효소는 4 ℃의 냉장조건에서도 즉시 투명환을 생성하며 하룻밤 방치하였을 때 직경 10 cm의 평판배지의 탈지분유를 모두 분해한다. 이와 같이 본 발명의 미생물에 의해 생산되는 단백질분해효소는 저온에서 활성을 나타내며 비교적 용이하게 정제할 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 한국산 무당거미로부터 미생물의 분리 및 동정

(단계 1) 미생물의 분리

대한민국 대전 및 충청지역에서 채집한 한국산 무당거미를 먼저 머리 부분을 제거한 다음 몸통 부분 만을 70 % 알콜에 10 분간 담구어 표면을 살균하였다. 살균된 거미의 몸통 부분에서 배를 절개하여 체표 부분을 제외한 장을 취하여 생리식염수와 함께 균질기에 넣고 균질화하였다. 균질액을 1 % 탈지분유를 첨가한 고체배지 상에 도말하여 투명환을 형성하는 콜로니를 선별하여 단백질 분해 활성을 나타내는 균주를 얻었다.

(단계 2) 분리된 균주의 특성 조사

본 발명에 따라 분리된 단백질분해효소를 생산하는 균주의 미생물학적 특징은 아래와 같다.

1) 형태학적 특성

단계 1에서 얻은 균주를 최적생육배지 조건에서 배양한 후 그람 염색(gram staining) 및 포자 염색 (spore staining)을 실시한 결과, 포자를 생성하지 않는 그람 음성균으로 확인되었다. 전자현미경으로 그 형태를 관찰한 결과, 도 1에서 볼 수 있듯이, 0.3 내지 0.5 ㎛의 세포 크기와 0.7 내지 1.2 ㎛의 세포 길이를 갖는 막대형(rod)이었으며, 균체의 몸체 전체에 분포하는(peritrichous) 3개 이상의 편모(flagella)를 함유하는 운동성이 강한 세균으로, 질산염을 아질산염으로 환원시킬 수 있는 질산염환원효소를 생산하는 전형적인 장내 세균류가 갖는 형태적 특징과 일치하였다.

2) 생리·생화학적 특성

생리·생화학적 특성은 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 β-갈락토시다제, 우레아제 및 오르니틴 디카르복실라제를 생산하고, 구연산을 이용하며, 만니톨, 이노시톨, 솔비톨 등의 알콜성 탄수화물로부터 산을 생성하고, 질산염을 아질산염으로 환원하고 옥시다제 음성을 나타내었다. 이와 같은 생리·생화학적 특성은 장내 세균류가 갖는 일반적인 특성으로 간주할 수 없었다.

특 성	반응성
운동성(Motility), 36℃	+
카탈라제	+
옥시다제(Kovac's)	-
β-갈락토시다제	+
아르기닌 디하이드롤라제	-
라이신 디카르복실라제	-
오르니틴 디카르복실라제	+
페닐알라닌 디아미나제	-
인돌 생성	-
보게스-프로스카우어 반응(Voges-Proskauer reaction)	+
황화수소 생성	-
우레아 가수분해	+
젤라틴 가수분해	+
시트레이트 이용	+
D-글루코즈, 산	+
락토즈 발효	+
슈크로즈 발효	+
D-만니톨 발효	+
미오-이노시톨 발효	+
D-솔비톨 발효	+
L-아라비노즈 발효	+
라피노즈 발효	+
L-람노즈 발효	-
말토즈 발효	+
트레할로즈 발효	+
셀로비오즈 발효	-
에리트리톨 발효	-
멜리비오즈 발효	-
D-아라비톨 발효	-
글리세롤 발효	+
아미그달린 발효	+

3) 균체화학적 특성

균체를 수확하여 균체내의 지방산 조성, (G+C) 함량 및 이소프로노이드 퀴논의 형태를 분석한 결과, 표 2에 나타낸 바와 같았으며, 균체내 지방산의 경우 탄소수 16 개의 포화 지방산 32 %, 탄소수 17 개의 고리형 포화 지방산 12 %, 그리고 탄소수 16 개 및 15 개를 가지는 복합체 20 %가 주 지방산으로 존재하였다.

특 성
G+C 함량 (%)	56.6
이소프레노이드 퀴논(Isoprenoid quinone)	Q-8
균체 지방산(major fatty acid, %)
C12iO	3.5
C14iO	5.0
C16iO	32.0
C17iO cyclo	12.0
C16il isoI/C14iO 3OH	10.0
C16il w7c/C15iO 2OH	21.5
C18il w7c/w9t/w12t	11.5
(w9c/w12t/w7c ; w12t/w9t/w7c)

4) 리보좀 소단위 유전자의 염기서열

리보좀 소단위 유전자(16S rDNA)는 균체로부터 DNA를 분리한 후 레인(Lane, D. J., 16S/23S rRNA Sequencing, Nucleic acid techniques in bacterial systematics, E. Stackebrandt and M. Goodfellow[eds.], Wiley, 115-175(1991))이 추천하는 프라이머 (8F, 1492R)를 사용하여 Taq DNA 중합효소로 PCR(연쇄중합반응)법에 의해 합성하였다.

합성된 리보좀 소단위 유전자를 순수분리하여 pGEM-T 벡터(Promega사)에 클로닝한 후, 대장균(E.coli) JM109 세포에 형질전환시키고, 푸른색 클론 함유 균주를 선별하여 태그 다이디옥시 터미네이터 사이클 시퀀싱 키트(Tag Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystem사)를 사용하여 그 염기서열을 결정하였다.

조사된 리보좀 소단위 유전자는 1406 bp로, 그 결과는 도 4에 나타난 바와 같다.

(단계 3) 미생물의 동정

상기 단계 2에서 조사한 형태적, 생리·생화학적 및 균체화학적 특성으로는 미생물의 정확한 동정은 불가능하였다. 장내 세균과(family Enterobacteriaceae)에 속하는 세라티아(Serratia) 속 또는 라넬라(Rhanella) 속으로 분류되었으나, 보다 정확한 동정을 위하여 리보좀 소단위 유전자의 염기서열을 조사하여 이를 분석하기 위하여 미국 국립보건원(NIH)에서 운영하는 GenBank 및 리보좀 소단위 유전자 만을 모아서 계통수와 함께 제공하는 리보좀 데이타베이스(RDP, 미국 일리노이 대학교)의 자료와 비교분석한 결과, 본 발명의 미생물 균주는 진딧물(Acyrthosiphon pisum)의 내생공생균(endosymbiont)과 분류학적으로 가장 근접한 신종의 미생물로 밝혀졌다. 도 2는 이러한 본 발명의 미생물 균주의 분류학적 유연관계도를 나타낸 것이다.

따라서, 본 발명의 미생물 균주는 학명의 명명체계에 따라 거미에서 유래된 단백질분해효소를 생산하는 세균이라는 뜻으로 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3라 명명하고, 1996년 8월 1일자로 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소내 유전자은행에 기탁되어 수탁번호 KCTC 0268BP를 부여받았다.

<실시예 2> 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3으로부터 단백질분해효소의 생산 및 활성 측정

(단계 1) 단백질분해효소의 생산

실시예 1에서 분리, 동정된 미생물 균주를 효소 생산 배지(박토 트립톤 0.5 %, 효모 추출물 0.5 %, 염화칼륨 0.05 %, 황산마그네슘 0.02 %)에서 pH를 7.0으로 조정한 후 25 ℃에서 30 시간 배양하였다. 배양액을 원심분리한 후 상등액을 취하고, 아미콘사의 센트리콘-30(Centricon-30)을 사용하여 단백질을 농축하여 조효소액을 얻었다. 조효소액을 함유한 평판배지 상에서 무균조작으로 단백질 분해 활성을 조사한 결과, 5 분후 바로 투명환을 형성하기 시작하였다. 도 3은 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3에 의해 생산된 단백질분해효소의 활성을 중성 폴리아크릴아미드겔 상에서 확인한 결과이다. 다시 이 부분을 용출시켜 10 % SDS-폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동한 결과 단일 밴드로서 보조단위로 구성되어 있지 않으며 그 분자량이 30 kd 이상, 구체적으로 약 51.5 kd임을 확인하였다. 분리된 단백질분해효소는 4 ℃의 냉장조건에서도 즉시 투명환을 생성하며 하룻밤 방치하였을 때 직경 10 cm의 평판배지의 탈지분유를 모두 분해하였다. 이와 같이 하여 실시예 1의 미생물 배양액으로부터 단백질분해효소의 생산을 비교적 용이하게 확인할 수 있었다.

(단계 2) 단백질분해효소의 열 및 pH에 대한 활성 및 안정성 측정

온도 및 pH가 저온성 단백질분해효소의 활성 및 안정성에 미치는 영향을 조사하기 위하여 실시예 2 단계 1에서 얻은 조효소액을 이용하여 온도 및 pH에 따른 활성 변화를 조사하였다.

단백질분해효소의 활성은 상기 실시예 2 단계 1에서 얻은 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3의 배양액을 사용하여 브라운 및 쉬미츠의 방법(Braun, V. and Schmitz, G., Excretion of a protease by Serratia marcescens, Arch. Microbiol., 124, 55-61(1980))에 따라 측정하였다.

즉, 아조카세인 1.2 g을 50 mM 인산 완충액(pH 7.5) 50 ㎖에 녹여 기질 용액을 제조하고, 기질 용액 600 ㎕와 세포 배양액 100 ㎕를 혼합하여 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 반응액에 10 % 삼염화초산 600 ㎕를 첨가하고 상온에서 1 시간 방치하였다. 7000 rpm으로 원심분리하여 얻은 상등액 600 ㎕에 10 N 수산화나트륨 300 ㎕를 첨가하고 414 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 역가는 1 분 동안 기질과 반응하여 티로신 1 ㎍에 해당하는 아미노산을 방출할 때의 효소량을 1 단위로 하였다.

먼저, 열에 대한 안정성 확인을 위해, 5 ℃에서 80 ℃까지 각 온도별로 2 시간씩 처리하고 상기 방법에 따라 잔존 활성을 측정한 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 20 내지 40 ℃에서 활성이 높았으며, 40 ℃ 이상에서는 급격히 활성이 감소하여 50 ℃에서는 활성이 거의 없는 것으로 확인되었다. 최적 온도는 40 ℃로 나타났다.

온도(℃)	5	10	15	20	25	30
활성	15.3037	23.3922	24.9394	32.0670	31.0564	42.3122
온도(℃)	35	40	50	60	70	80
활성	50.4485	50.4485	5.6439	5.5365	5.3792	0

다음으로, pH 의존성을 알아보기 위해, 구연산·인산(pH 5), 인산나트륨(pH 6∼7), 트리스-염산(pH 8∼9), 글리신-가성소다(pH 10-11) 등의 완충액에 기질을 녹여 기질 용액을 제조하고, 상기 단계 1에서 얻은 조효소액을 첨가하여 37 ℃에서 30 분간 반응시킨 후, 활성을 측정하여 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다. 여기에서 보듯이, 6 내지 10의 광범위한 pH에서 80 % 이상의 역가를 유지하였다.

pH	5	6	7	8	9	10	11
활성	6.9722	26.3769	37.4550	40.0604	37.3372	28.5297	9.1681

이상에서와 같이, 한국산 무당거미의 장으로부터 분리 동정된 본 발명의 신규 미생물 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3는 20 내지 40 ℃의 온도 및 6 내지 10의 pH에서 안정하며 약 51.5 kd의 분자량을 갖는 단백질분해효소를 생산한다.

Claims (2)

1. 한국산 무당거미(Nephila clavata)의 장으로부터 분리한 단백질 분해효소를 생산하는 아라니콜라 프로테오리티쿠스(Aranicola proteolyticus) HY-3(수탁번호 : KCTC 0268BP)
2. 20 내지 40 ℃의 온도 및 6 내지 10의 pH에서 안정하며 약 51.5 kd의 분자량을 갖는, 제1항의 아라니콜라 프로테오리티쿠스 HY-3 균주가 생산하는 단백질 분해효소.

Images