KR100242596B1 - 사람 흉선세포 백혈병 바이러스-i 및 ii 펩티드 항원 및 그 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 HTLV-I 및 HTLV-II 항혈청을 스크리닝 및 확인하기 위한 진단 검정방법에 사용하는 신규한 HTLV-I 및 HTLV-II 펩티드 항원에 관한 것이다. 이 펩티드들은 HTLV-I 및 HTLV-II gp46 막단백질과 동일한 지역에서 유래되며, HTLV-II 특이적 단일클론 항체와의 면역반응성 및 HTLV-I 및 HTLV-II 특이적 항체에 대한 항원의 반응성에 의해 구별될 수 있다.

Description

[발명의 명칭]

사람 흉선세포 백혈병 바이러스-I 및 II 펩티드 항원 및 그 제조방법

[발명의 상세한 설명]

본 출원은 발명의 명칭이 “HTLV-I 펩티드 항원 및 방법”인 미국특허원 제653091호에 대한 우선권을 주장하고 있는데, 상기 미국특허원 제653,091호는 발명의 명칭 “HTLV-I 펩티드 항원 및 방법”으로 1989년 6월 13일자로 출원된 미국특허원 제366,313호의 일부 연속출원이며, 미국특허원 제366,313호는 발명의 명칭 “HTLV-I 펩티드 항원 및 방법”으로 1986년 12월 31일자로 출원되어 현재 포기된 미국특허원 제948,270호의 연속출원이다.

[발명의 분야]

본 발명은 HTLV-I 특이성 항원, 및 이 항원을 제조하는 방법과 사용하는 방법에 관한 것이다.

[참고문헌]

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[발명의 배경]

사람 T-세포 백혈병 바이러스(HTLV)는 3가지의 공지의 구성원으로 이루어진 T-세포 레트로바이러스과를 대표한다. HTLV 유형 I(HTLV-I)은 시험관내에서 형질전환 활성을 나타내고 있으며, 세계 도처에서 풍토병성인 것으로 알려져 있는, 성인 T-세포 백혈병에 병인학적으로 관련되어 있다. HTLV-II는 시험관내에서 형질전환 능력을 가지는 또다른 레트로바이러스로서, 융모세포 백혈병의 T-세포 변종을 가지고 있는 환자로부터 단리된다.

림프절병증 관련 바이러스라고도 불리워 왔고 현재 사람 면역결핍 바이러스(HIV)라고 알려진 HTLV-III는 특정 종류의 T-세포에 대하여 용해성을 가지고 있으며, 후천성 면역결핍증(AIDS)의 병인에 관련되어 있다. HTLV-I 또는 HTLV-II 바이러스들과는 달리, HTLV-III은 시험관내 형질전환 활성을 가지는 것으로 알려지지 않았다.

HTLV-I 감염의 진단은 HTLV-I 펩티드 항원에 대한 혈청 항체 반응을 기초로 하는 것이 보통이다. 이러한 진단 방법은 대개 HTLV-I 비리온 펩티드를 사용한 효소 면역검정 방법(EIA)을 기초로 HTLV-I 항체를 확인하는 초기의 스크리닝 검정방법을 포함한다. 혈액 스크리닝용으로 사용된 이러한 검정방법은 0.5 내지 0.05% 의 HTLV-I 및 HTLV-II 양성을 검출하는데, 이중에서 약 4/5 가 거짓양성이다. 그러므로, 양성 혈청은, 특이성 HTLV-I 펩티드 항원에 대한 항체반응을 검출하는 웨스턴 블롯 방법이나 방사성 면역 침전 검정방법을 이용한 확인 검정방법으로 추가로 시험되어야 한다.

현재의 혈액검사 방법에서는, HTLV-I p24 gag 단백질과, 외피단백질 gp46, gp21 또는 gp68 중의 한가지 이상과의 면역반응을 기초로 하는 확인 시험이 필요하다. 비리온 단백질로부터 시험용 항원이 제조될 때, 단지 gp46 만으로도 참(true) HTLV-I 혈청양성과의 높은 항체반응 비율을 제공한다. 그 다음으로는, 더욱 예민한 방사성 면역침전 검정방법을 이용하여 추가로 항원을 검사함으로써 gp46 과의 반응을 검출할 수 있다. 위와같은 스크리닝 방법과 확인 시험방법으로는 HTLV-I 및 HTLV-II 양성을 확인할 수 있으나 2가지 HTLV 바이러스간의 차이를 구별할 수는 없다.

그러므로, HTLV-I 양성 혈청을 검출할 수 있는 개선된 방법을 제공하는 것이 요망된다. 구체적으로, 개선된 시험방법은 모든 HTLV-I 및 HTLV-II 양성 혈청을 최소한의 수의 거짓 양성반응으로 검출할 수 있어야 하고, HTLV-II 양성 혈청으로 부터 HTLV-I 양성 혈청을 구별해낼 수 있어야 한다.

[발명의 요약]

그러므로 본 발명의 목적은, HTLV-I 및 HTLV-II 양성 사람혈청을 검출하는 개선된 방법 및 키트를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 HTLV-I 및 HTLV-II 양성 혈청을 구별할 수 있는 방법 및 키트를 제공하는 것이다.

“HTLV-I 펩티드 항원 및 검정방법” 에 대한 상기 특허출원에는, ATCC 세포주 HB 8755 (Matsushita)에 의해 제조된 .5α 단일클론 항체(Mab)에 대하여 면역 반응성을 가지는 HTLV-I gp 46 외피단백질 영역으로 이루어진 HTLV-I 펩티드가 개시되어 있다. 이 영역은 MTA-1, MTA-4 및 MTA-5 로 표시되는 3 가지의 gp46 펩티드 항원의 42 아미노산 중첩영역에 함유되어 있다. 42 아미노산 서열 중첩영역에는 서열 Ser-Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Ile-Trp-Phe-Leu-Asn-Thr-Glu-Pro-Ser-Gln-Leu-Pro-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser이 함유되어 있고, 42 아미노산 서열의 C-말단 Ser 잔기에 추가의 잔기 Ile-Pro-Trp-Lys-Ser-Lys가 포함되어 있다. .5α Mab와 면역반응성을 가지는 재조합 및 합성 펩티드내의 공통 아미노산 서열은 Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser 이다.

다른 면에서, 본 발명은 사람의 혈청에 HTLV-I 이 감염되어 있는지를 검출하는 키트를 포함한다. 이 키트에는 gp46 펩티드 항원이 지지되는 고형 지지체, 및 펩티드 항원에 결합된 사람 항체의 존재를 검출하기 위한 리포터 시스템이 포함된다.

한가지 실현에 있어서, 본 발명의 키트는 HTLV-I 항체에 대하여 사람의 혈청을 스크리닝하는 EIA 형태로 제공된다. 다른 실현에 있어서는, 펩티드 항원이 하나 이상의 확인용 HTLV-I 항원과 함께, HTLV-I 혈청 항체를 확인하는 웨스턴 블롯 형태의 스트립상에 고정된다.

본 발명의 또 다른 실현에 있어서, 본 발명의 키트에는, 이하에서 정의 하는 바와같이, HTLV-II 양성 혈청으로부터의 항체와 특이적으로 반응할 수 있는 HTLV-II 특이성 항원이 포함되어 있다. 이 키트에 의해서 HTLV-I 및 HTLV-II 양성 혈청의 특이적 검출을 수행할 수 있다.

본 발명에는 또한 HTLV-I 양성 사람 혈청을 검출하는 방법이 포함된다. 이 방법에 있어서는, .5α Mab 으로 표시되는, 시험혈청이 ATCC 세포주 HB 8755 에서 유래된 항-HTLV-I 단일클론 항체(Mab)와의 면역 반응성이 있는 펩티드 항원과 반응하게 된다. 항원에 결합된 항-HTLV-I 항체의 존재는 적합한 리포터(reporter)-표지된 항-사람 항체에 의해서 검출된다.

.5α Mab-반응성 펩티드는, 바람직하게는 5-10 아미노산 잔기를 암호하는 임의 서열 폴리누클레오티드의 혼합물을 적합한 발현 벡터에 도입시켜서 임의의 서열 벡터의 라이브러리를 형성시키는 임의-서열 선택 방법에 의해서 제조될 수 있다. 라이브러리 벡터의 발현 생성물은 .5α Mab 에 대하여 면역반응성이 있는 아미노산 서열의 존재에 대해서 스크리닝할 수 있다. 그 다음에는, 이러한 면역반응성 아미노산 서열을 발현시키는 라이브러리 클론을 단리시켜서, 삽입된 서열에 의해 코드화된 폴리펩티드를 제조하는데 사용할 수 있다.

또한 본 발명에서는, HTLV-II 외피 단백질 gp46 으로부터 유도된 약 50개 미만의 아미노산으로 이루어지고 아미노산 서열 Met-Thr-Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Leu-Trp-Phe-Ile-Thr-Ser-Glu-Pro-Thr-Gln-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser-Thr-Ser-Trp-Thr-Thr-Lys 으로 형성된 면역원성 영역을 포함한 HTLV-II 펩티드 항원이 개시되어 있다. HTLV-II 항혈청에 면역반응성이 있는 재조합 및 합성 펩티드내의 공통 아미노산 서열은 Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser, 또는 이 서열의 Ser C-말단에서 아미노산 서열 Thr-Ser-Trp-Thr-Thr-Lys에 의해 연장되어 있는 상기 서열을 지닌다.

펩티드 항원은 사람의 혈청이 HTLV-II 에 감염되어 있는가를 검출하기 위한 시험용 키트에 사용된다. 이 키트에는 펩티드 항원을 보유하는 고형 지지체와, 펩티드 항원에 사람 항체가 결합되어 있는지를 검출할 수 있는 리포터 시스템이 포함되어 있다.

위와 같은 본 발명의 목적 및 그밖의 목적들은 도면을 참조로 본 발명의 상세한 설명에 의해서 더욱 명백해질 수 있을 것이다.

[도면의 간단한 설명]

제1(a)도는, 위 선에 gp46 외피 단백질 코딩 서열이 함유된 HTLV-I 게놈의 일부를 도시하고 있고, 아래 선에는 본 발명에 따라 형성된 중첩 HTLV-I 펩티드 항원을 코드화하는 서열이 함유된 gp46 코딩 영역의 일부가 도시되어 있으며, 제1(b)도에서는 MTA-4, MTA-1 및 MTA-5를 나타내고 있으며 ,

제2도는 HTLV-I 코드 서열, 및 HTLV-I 외피 단백질의 일부에 해당하는 아미노산 서열을 도시한 것이고,

제3도는 본 발명의 펩티드 항원 영역에 있는 HTLV-I 및 HTLV-II gp46의 상동성 영역의 아미노산 서열을 도시하고, 본 발명에 따른 몇가지 HTLV-I gp46 펩티드 항원의 펩티드 서열(도면의 상부)과 HTLV-II 펩티드 항원의 펩티드 서열(도면의 하부)을 도시한 것이며,

제4(a)도 및 제4(b)도는 MTA 1 펩티드 및 이것에 대응하는 HTLV-II gp46 펩티드에 대한 항원성을 도시한 것이고 ,

제5도는 본 발명에 따라 임의 서열 펩티드를 제조 및 선택하는 재조합방법을 나타내는 것이고,

제6도는 HTLV-II 코딩 서열, 및 본 발명의 HTLV-II 펩티드가 유도되는 gp46 외피 단백질의 영역내에 있는 대응 아미노산 서열을 도시한 것이며,

제7도는 HTLV-I 바이러스 용해물과 재조합 단백질 p21E 및 MTA-4를 함유하는 변형된 웨스턴 블롯을 도시하는 것이고, 여기에 레인 A-F 와 G-R 은 각각 HTLV-I 및 HTLV-II 항혈청이다.

[발명의 상세한 설명]

[I. HTLV-I 펩티드 항원의 제조]

본 단락에서는 HTLV-I 관련된 T-세포 백혈병에 걸린 개체들에서 발견된 항-HTLV-I 항체에 대하여 면역반응성을 가지는 HTLV-I 펩티드 항원의 제조방법을 설명한다. 적합한 발현 벡터에서 클로닝된 100-300 염기쌍 길이의 임의의 HTLV-I 유전자 서열을 이용하여 항원을 제조한 다음, 면역반응성 펩티드의 발현을 위하여 항체와 함께 선택하였다.

[A. HTLV-I 게놈 라이브러리]

HTLV-I 프로바이러스 게놈을 함유하는 세포성 DNA로부터, 종래의 방법으로 HTLV-I 의 게놈 라이브러리를 제조하였다. 이중 나선 DNA는, HTLV-I 바이러스로 감염된 것으로 밝혀진 환자에게 단리된 T-세포, 또는 HTLV-I 바이러스를 생산하는 것으로 밝혀진 예컨대 HUT 102-B2 (Poiesz), MT-2 (Miyoshi), 및 MJ-종양(Popovic) 세포와 같은 공지의 세포주들을 포함하는 HTLV-I 감염 세포로부터 제조될 수 있다. 바이러스성 게놈은 이들 세포중의 숙주 DNA내로 일체화된다. HTLV-I 게놈을 함유하는 세포주의 제조 방법은 상기의 참고문헌들에 상세하게 개시되어 있다.

상기의 세포주로부터의 모든 숙주 게놈 DNA 는, 15-20kb 크기 범위의 부분 절단편을 생성시키는 조건에서 예컨대 HaeIII 또는 A1ul 과 같은 보통의 절단효소를 이용하여 부분적으로 절단시키고, 이 절단된 물질을 예컨대 수크로오스 구배 원심분리에 의해 분별화시켜서 15-20kb 단편들을 단리시킨다. 그 다음에는 단편들을 적합한 클로닝 벡터, 바람직하게는 15-20kb 삽입체를 효율적으로 혼입시킬 수 있는 파지(phage) 클로닝 벡터내로 클로닝시켰다. 바람직한 방법에 있어서는, 단리시킨 단편들을 EcoRI 메틸라아제로 처리하고, 표준조건(Maniatis)에서 상기 단편의 끝에 EcoRI 링커를 연결시킨 다음, 독특한 EcoRI 삽입부위를 가진 예컨대 λ 카론(Charon) 4a 와 같은 파지 벡터내로 클로닝시켰다.

클로닝된 게놈 단편들을 HTLV-I 게놈의 완전 복사체의 소정의 서열에 상보적인 프로브로 스크리닝하였다. HTLV-I 서열은 소정의 서열에 대한 방사성 표지된 합성 올리고누클레로티드 프로브를 제조방법에서 알려진 바와 같이 공지되어 있다(Seiki). 또한, 특정 서열의 합성 올리고누클레오티드는, 예컨대 신서틱 제너틱스, 인코포레이티드(Synthetic Genetics, Inc.; San Diego, CA)와 같은 판매원에 의해 제조된다. 이러한 올리고누클레오티드프로브를 사용하여, HTLV-I 서열이 함유된 분자 클론을 표준 혼성화 방법(Maniatis, p. 322)으로 라이브러리로부터 단리하였다. 제한부위 분석에 의해 클론을 분석하여, 전체 바이러스 게놈 서열이 존재하는 것을 확인할 수 있는데, 이러한 서열의 존재는 일체화된 바이러스 게놈에 접하는 직접적인 장말단 반복단위의 존재에 의해 나타난다. 확인된 분자클론을 적합한 엔도누클레아제로 절단하여 바이러스 게놈의 완전 복사체를 생성시킬 수 있다. 이러한 목적에 바람직한 엔도누클레아제는, 바이러스 코딩서열의 어느 장말단 반복단위(LTR)에 있는 바이러스 게놈의 한쪽 끝을 절단하지만 내부는 절단하지 않는 Sacl 이다. 만일 클론의 HTLV-I 게놈이 제3의 Sacl 부위를 가진 변종이라면, 적절한 제한효소를 선택하여 완전한 길이의 게놈을 단리시킬 수 있다. 정제된 전체 복사서열은 약 9.5kb 단편이다. 다른 방법으로는, env 유전자 서열을 나타내는 게놈의 단편만을 발현 라이브러리 제조를 위해 정제시킬 수 있다.

또 다른 방법으로는, HTLV-I 이중나선 DNA 완전 복사체를 함유하는 클로닝 벡터들이 보고된 바 있고(Seiki), 실시예 1 에 기재된 대로 이를 연구자들로부터 직접 입수할 수도 있다.

원하는 HTLV-I 게놈 라이브러리를 제조하기 위해서, 예컨대 Sacl 을 이용한 완전 절단방법으로 상기 클로닝 벡터로부터 HTLV-I 삽입체 완전 복사체를 절단해 내고, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 9.5 kb 단편으로 분리시켜낼 수 있다. 단리된 단편의 완전 복사체 단편을 절단하여 DNA 단편, 바람직하게는 크기가 주로 약 100-300 염기쌍인 임의 단편들을 제조한다. 실시예 1 은 DNAase 절단에 의해서 위와 같은 단편을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 아미노산이 약 30-100개 사이인 펩티드 항원을 얻는 것이 바람직하므로, 절단 단편들은 예를들어 겔 전기영동에 의해서 크기를 분획화하여, 크기 범위가 약 100-300 염기쌍인 분획들을 선택하는 것이 바람직하다.

게놈 절단단편들은, 적당한 클로닝 벡터, 바람직하게는 적당한 숙주내에서 펩티드에 대한 암호를 발현시키는 발현벡터내에 삽입되는 것이 바람직하다. 바람직한 발현 벡터중의 한가지는, β-갈락토시다아제 유전자의 전사 종료 코드의 상류에 있는 독특한 EcoRI 삽입부위 53 염기쌍을 함유하는 λ gt11 이다. 따라서, 삽입된 서열은 β-갈락토시다제로서 발현될 수 있다. 따라서, 삽입 유전자는 β-갈락토시다아제 유전자 대부분의 N-말단 부분, 이형구조 펩티드, 및 β-갈락토시다아제 유전자의 적어도 일부 C-말단 영역을 함유하고 있는 β-갈락토시다아제 융합단백질로서 발현될 수 있다. 이 벡터는 또한 허용온도인 예컨대 32℃에서 바이러스 용원성(lysogeny)을 야기하는 온도-감응성 억제인자(cl857)를 생성시켜서, 예컨대 42℃와 같은 승온상태에서 바이러스의 용해를 유도한다. 이 벡터의 장점은 (1) 재조합체 형성에 매우 효율적이고 (2) 허용 온도에서는 숙주세퍼의 성장을 기초로, 용원성 숙주세포를 선택할 수 있는 능력을 가지지만, 비-허용 온도에서는 상기 능력을 가지지 못하며 (3) 재조합 융합단백질의 제조 수준이 높다는 점이다. 또한, 이형구조 삽입체가 함유된 파아지는 비활성 β-갈락토시다제 효소를 생성하기 때문에, 삽입체를 가진 파아지는 β-갈락토시다제 착색된 기질 반응으로 용이하게 식별될 수 있다.

발현 벡터내로 삽입된 절단 단편은 필요에 따라서는 예컨대 EcoRI 링커와 같이 소정의 제한부위 링커를 함유하도록 통상적인 방법에 따라 변형시킬 수도 있다. 실시예 1 은 절단 단편들을 λgt11 내로 클로닝시키는 방법들을 설명하는 것으로서, 이 방법은 단편의 끝을 평활말단화(blunt-ending)시키는 단계, EcoRI 링커를 첨가시키는 단계, 및 단편들을 EcoRI 절단된 λgt11으로 결찰시키는 단계를 포함한다. 결과의 바이러스 게놈 라이브러리를 점검하여 비교적 큰(대표적) 라이브러리가 제조되었음을 확인한다. 이 단계는, λgt11 벡터의 경우에, 적합한 박테리아 숙주를 감염시키고, 박테리아를 플레이팅한 다음, β-갈락토시다아제 활성의 손실에 대하여 플라크(plaque)를 검사함으로써 수행할 수가 있다. 실시예 1 에 설명된 방법을 이용하여, 제1도에 도시된 바와 같은 효소활성의 손실을 나타내는 파아지의 바탕수준에 비교했을 때, 약 60% 의 플라크가 효소 활성의 손실을 나타내었다.

[B. 펩티드 항원 발현]

앞에서 형성된 게놈 라이브러리를, 관심의 대상이 되는 사람 항-HTLV-I과 면역반응성인 펩티드 항원(융합 단백질로서 발현됨)의 제조에 대하여 스크리닝한다. HTLV-I 감염을 진단하기에 특히 바람직한 한가지 항체는, 앞에서 언급한 바와 같이, HTLV-I 감염에 관련된 T-세포 백혈병을 가진 환자에게서 존재하는 항체와 동일한 특이성을 가지는 .5α 단일클론 항체(Mab)이다. 이 항체는 ATCC 수탁번호가 HC8755 인 EBV-형질전환된 B-림프 세포주에 의해 제조된다(실시예 2 참조).

바람직한 스크리닝 방법에 있어서는, 파지 라이브러리 벡터에 감염된 숙주 세포들을 상기와 같이 플레이팅하고, 플레이트를 니트로셀룰로오스 필터로 블로팅하여, 세포에서 제조된 재조합 항원들을 필터에 옮긴다. 그 다음에는, 필터를 항-HTLV-I 항체와 반응시키고, 세척하여 미결합 항체를 제거하고, 필터에 결합되는 리포터 표지된 항-사람 항체를 항-HTLV-I 항체를 통해 샌드위치 형태로 반응시킨다.

전형적으로는, 목적하는 재조합 항원의 제조에 의해 확인된 파지플라크를, 비교적 낮은 농도로 항체 반응성 융합 단백질의 제조에 대하여 다시 시험한다. 실시예 2 에 설명된 스크리닝 방법은 설명을 하기 위한 것이다. 과정도중에, 면역 반응성 재조합 항원을 제조하는 몇개의 재조합 파아지 클론을 확인하였다.

앞에서와 같이 확인된 1가지 이상의 라이브러리 벡터를 핵산 서열화에 의해 분석하여, HTLV-I 게놈내의 펩티드 코딩 영역의 위치를 결정하는 것이 바람직하다. 선택된 라이브러리 벡터로부터 이종구조 삽입체(필요에 따라서는, 융합 단백질의 인접 코드서열을 포함한다)를 절단하고, 절단된 단편들을 정제 및 서열화하는 방법은, 실시예 3 에 요약된 공지의 방법으로 수행되는 것이 일반적이다. .5α Mab와 면역 반응성이 있는 것으로 밝혀진 3개 펩티드의 코딩서열이 도면상에 도시되어 있다. 3개의 이종구조 서열은 공지의 HTLV-I 서열과 결합되어 있다(Seiki). 실시예 3 에 더욱 완전하게 논의되어 있는 바와 같이, 이 서열들은 모두 HTLV-I 외피 단백질 gp46 (도면, A 부분)을 코딩하는 유전자내의 HTLV-I 게놈중 5565 내지 5895 염기쌍내에 속하며, 5664 내지 5790 염기쌍 사이(도면, B부분)에는 중첩되는 코딩 서열(도면상의 2개 화살표로 지시됨)이 있다. 도면에 도시되어 있는 바와 같이, 중첩되는 서열인 C 부분은 다음과 같은 아미노산 서열을 가지는 42개 아미노산 펩티드 항원을 코드화 한다 : Ser-Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Ile-Trp-Phe-Leu-Asn-Thr-Glu-Pro-Ser-Gln-Leu-Pro-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser. 본 발명하에 수행된 스크리닝 연구에서는 MTA-1 펩티드가 특히 일본계의 피검체중에서 HTLV-I 양성 혈청에 대하여 최고의 백분율을 수득하는 것으로 나타났다. 제3도에 도시된 바와 같이, MTA-1 펩티드에는 상기 서열의 Ser C-말단에 추가의 ILe-Pro-Trp-Lys-Ser-Lys 잔기가 포함된다. 본 발명의 바람직한 실현에 있어서, HTLV-I 특이성 펩티드에는 0.55α Mab 와 면역반응성이 있는 C-말단 48개 아미노산 MTA-1 서열의 면역원성 영역이 함유되어 있다.

더욱 일반적으로, 본 발명의 HTLV-I 펩티드에는 0.5 α Mab 와 반응성이 있는 상기 아미노산 서열의 면역원성 영역이 포함된다. 본 명세서에 규정되어 있는 바와 같이, 특정 서열에는 .5α Mab 에 대한 펩티드 항원의 면역반응성을 조금이라도 감소시키지 않는 약간의 중성 아미노 치환기가 포함된다. 이러한 아미노 치환기는 소수성, 크기, 전하, 소수결합 능력, 그리고 공지의 아미노산 치환 원리에 따른 2차 구조상의 효과에 있어서의 유사성을 기초로 선택될 수 있다.

선택된 클론은, 재조합 단백질의 정체를 목적으로 정률증가(scale-up) 제조용으로 사용될 수 있다. 정률제조 방법은, (a) 예컨대 E. coli와 같은 적합한 숙주를 소정의 λgt11 재조합체로 용원화시키고, (b) 높은 수준의 이형구조 펩티드가 수득되는 조건에서 형질도입 세포를 배양하며, (c) 재조합 항원을 용해된 세포로부터 정제시키는 단계로 이루어진다.

상기 λgt11 클로닝 벡터를 포함하는 바람직한 방법에 있어서는, 고-생산자 E. coli 숙주 BNN 103을 선택된 라이브러리 파지로 감염시키고 복제물을 2개의 플레이트상에 복제하였다. 플레이트들중 바이러스 용원성이 발생되는 하나는 32℃에서 성장시키고, 감염 파아지를 용해 단계에 있는 다른 하나는 42℃에서 성장시킨 다음, 세포성장을 억제시킨다. 그 결과, 더 높지 않은 온도가 아닌 보다 낮은 온도에서 성장시킨 세포들이 성공적으로 용원화되었다.

그 다음으로, 바이러스 삽입체가 함유된 융합단백질을 높은 수준으로 제조하는 액체 배양조건에서, 상기 용원화 숙주세포를 성장시키고, 급냉방법에 의해 용해시켜 원하는 융합 단백질을 방출시켰다. 이 방법들은 실시예 4에 상세하게 설명되어 있다.

펩티드 항원 MTA-1을 발현시키는 λgt11 클론으로부터의 HTLV-I 코딩서열은 이하의 단락 II에 기재된 바와 같은 PCR 증폭에 의해서 제조하고, pGEX-1 발현벡터(Pharmacia, Piscataway, NJ)내로 클로닝한다. pGEX-1 내로 클로닝된 삽입체들을 기생충인 스키스토소마 야포니쿰 (Schistosoma japonicum)에서 연유된 26 Kdal의 글루타티온 S-전이효소인 단백질 Sj26과의 융합 단백질로서 발현시킨다. HTLV-I 또는 HTLV-II 로 감염된 개체들로부터 유리된 혈청에 대한 pGEX-MTA-1 의 제한된 패널링(paneling)은 pGEX-MTA-1 대 β-gal-MTA-1 의 반응성간에 큰 차이를 나타내지 않았다.

[C. 펩티드 정제]

차별 침전법, 분자 시브(sieve) 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 등전(isoelectric) 포커싱(focusing), 겔 전기영동 및 친화성 크로마토그래피를 포함하는 표준 단백질 정제방법에 의해서, 재조합 단백질을 정제시켰다. 예컨대 앞에서와 같이 제조된 β-갈락토시다아제-융합 단백질과 같은 융합단백질의 경우에, 이용된 단백질 단리기술을 원래 단백질의 단리에 사용된 기술과 접목시킬 수 있다. 따라서, 갈락토시다아제 융합단백질의 단리에 있어서는, 표면-결합 항-갈락토시다아제 항체를 가지는 고형 지지체상으로 세포 용해물질을 통과시키는 단순 친화성 크로마토그래피에 의해서 단백질을 용이하게 단락시킬 수 있다. 이러한 방법은 실시예 4 에서 시도되었다.

[II. .5α Mab와의 펩티드 면역 반응성]

다른 면에 있어서, 본 발명에는, 또한, HTLV-I 양성 사람 혈청을 ATCC 세포주 HB 8755 에 의해 제조된 HTLV-I Mab 즉 .5α Mab 와의 면역반응성이 있는 펩티드 항원과 반응시킴으로써 HTLV-I 양성 사람 혈청을 검출하는 방법이 개시되어 있다. 혈청내의 HTLV-I 특이성 항체의 존재를, 실시예 7 에 설명된 리포터-표지화 항-사람 항체에 의해 검출한다.

[A. HTLV-I 유도 펩티드]

한가지 실현에 있어서, 펩티드에는 상기 MTA-1, MTA-4 및 MTA-5 HTLV-I 펩티드로부터의 42개 아미노산 중첩영역에서 연유된 면역원성 영역이 함유되어 있다. 이 펩티드 항원들은 42개 아미노산 서열 중첩영역에 있는 면역 반응성 영역의 위치를 확인할 수 있도록 더욱 더 특정화된다. 중첩영역의 C-말단 부분에 있는 면역반응성 영역의 위치는 2가지 라인의 증거에 의해 제시되었다. 우선, .5α Mab 는 HTLV-I 외피 단백질과 특이적으로 반응하는 것으로 보고되었는데, 즉 HTLV-II 또는 HTLV-III(HIV-1) 외피 단백질과는 아무런 반응도 관찰되지 않았다. 본 출원인과 공동 연구자들은 이 사실로부터 앞에서 설명한 gp46 펩티드 항원 MTA-1 및 MTA-4 는 HTLV-I 과 반응성이 있지만 HTLV-II 나 HTLV-III 항혈청과는 반응성이 없는 것을 알게되었다(Lipka).

두 번째로는, MTA-1 펩티드의 아미노산 서열과 이것에 대응되는 HTLV-II gp46 단백질내의 상응하는 영역의 비교(제3도)에서는, 펩티드의 N-말단부 절반에 있어서의 동질성이 C-말단부 절반에 있어서보다도 실질적으로 큰 것으로 나타났다(제3도에 도시된 HTLV-I 및 HTLV-II 서열의 중심영역). 이러한 결과는 항원성에 있어서의 최대차가 펩티드 영역의 C-말단 절반부에서 발견된다는 것을 나타낸다.

이는 각각 HTLV-I 및 HTLV-II 펩티드에 대한 제4(a)도와 제4(b)도에 도시된 2개의 대응 펩티드 영역에 관한 항원성 도면에서 더욱 확실하게 확인할 수 있다. 항원성에 관한 도면은 피씨 진 프롬 인텔리제니틱스(PC Gene from Intelligenetics; Palo Alto, CA)의 표준 소수성 프로그램 “항원(Antigen)”에 의해 제공된다. 도시된 바와 같이, 2개의 도면은 잔기 3-28에서 실질적으로 중첩되지만, 잔기 28-40에서는 명백하게 일치하지 않는다. 중첩되지 않는 잔기들에는 다음의 HTLV-I 서열이 포함되어 있다 :

Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser

바로 앞에서 나타낸 C-말단 영역이 포함된 다수개의 펩티드 항원들을 제조하여 .5α Mab, 그리고 HTLV-I 및 HTLV-II 항혈청에 대한 결합에 관하여 테스트하였다. 이러한 몇가지 펩티드들의 서열은 제3도의 윗부분에, MTA-1, MTA-4 및 MTA-5 펩티드 항원의 서열과 함께 표시되어 있다. 표준 방법에 따른 고형상 합성방법에 의해 펩티드를 제조하였다. 간단히 말해서, N-α-보호된 아미노산 무수물을 결정화된 형태로 제조하고, 이것을 사용하여 N-말단에서 연속적인 아미노산 첨가반응을 수행한다. 각각의 잔기 첨가반응에서, 성장중인 펩티드를 (고형 지지체상에서) 산으로 처리하여 N-α-보호기를 제거하고, 몇차례 세척하여 잔류의 산을 제거함과 동시에 반응 매질에 대한 펩티드 말단의 접근가능성을 촉진시켰다. 이어서, 펩티드를 활성화된 N-보호된 아미노산 대칭성 무수물과 반응시키고, 고형 지지체를 세척해 낸다.

각각의 잔기-첨가 단계에서, 총 2 또는 3회의 별도의 첨가반응으로 아미노산 첨가반응을 반복하여 반응하는 성장 펩티드 분자의 백분율을 증가시킬 수 있다. 전형적으로, 처음 12개 잔기의 첨가에 대해서는 1-2회의 반응 사이클을 사용하고, 나머지 잔기들에 대해서는 2-3회의 반응 사이클을 사용하였다. 성장중인 펩티드 사슬을 완료한 후, 보호된 펩티드 수지를 액체 플루오르화 수소산으로 처리하여 펩티드를 지지체로부터 해제 및 방출시켰다.

실질적으로 실시예 6에 기재된 바와 같은 결합 경합 연구에 의해서, 펩티드를 .5α Mab와의 특이성 면역반응성에 대하여 시험하였다. MTA-4 또는 MTA-1 의 18개 C-말단 잔기가 함유된 K163 펩티드는 .5α Mab 가 MTA-4 에 결합하는 것을 강하게 억제한다. 그러나, MTA-4 의 11개 C-말단 잔기만을 함유하는 펩티드 K162 에 대해서는 아무런 결합 간섭작용이 관찰되지 않았다. MTA-4의 6개 C-말단 잔기와 추가의 C-말단 13 잔기를 함유하고 있는 펩티드 K164 는 .5α Mab 와 MTA-4 또는 MTA-1 사이의 결합을 약하게 억제한다.

이 결과는, gp46 펩티드내에서 .5α Mab 에 대하여 가장 효능적인 면역 반응성 영역이, 펩티드 K163을 포함하는 영역내에 있는데, 이러한 사항이 상기 영역내에서 HTLV-I 및 HTLV-II 서열간에 서열 동질성과 항원성 도면에서의 불일치와 부합됨을 나타내고 있다. K164 펩티드에 대한 .5α Mab 의 약한 결합은 목적하는 에피토프가 K163 과 K164 사이의 중첩영역 His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser-His-Ile-Leu내에 있으며, 여기서, 인접한 N-말단 또는 C-말단 서열들이 항원 표현에 요구됨을 나타내거나, .5α Mab와의 약한 면역 반응성이 있는 추가의 에피토프 영역이 K164 펩티드에 함유되어 있다는 것을 시사할 수 있다.

또한 펩티드들을, HTLV-I 감염 환자의 항혈청이 MTA-4 에 결합하는 것을 억제할 수 있다는 자체의 능력에 대하여 테스트하였다. 일반적으로, .5α Mab 가 MTA-4에 결합하는 것을 억제하는 모든 특정 펩티드의 능력이, ELISA 결합 프로토콜(실시예 6B)에서 HTLV-I 항혈청에 결합할 수 있거나 웨스턴 블롯 검정 방법(실시예 8C)에서 사람 HTLV-I 항혈청이 MTA-4 또는 MTA-1에 결합하는 것을 억제할 수 있는 능력과 유사하다는 것이 밝혀졌다. 그러므로, 펩티드 K162 는 ELISA 프로토콜의 어떠한 HTLV-I 혈청과도 반응하지 않고 J-254 혈청이 MTA-1 또는 MTA-4 에 결합하는 것을 억제하지 않는다.

[B. 임의 서열 펩티드]

다른 실현에 있어서, 본 발명의 방법에 사용하기 위한 .5α Mab-반응성 펩티드를 임의 서열 펩티드의 선택법에 의해서 제조한다. 최근, 특이적으로 짧은(5-10개 잔기) 펩티드에 대응되는 항체들을 이용하여 면역반응성 종에 대한 임의적 발생 펩티드의 라이브러리를 스크리닝할 수 있다는 것이 입증되었다(Scott ; Cwirla 등). 이러한 방법을 이용하여 본 발명에서 .5α 단일클론 항체에 대하여 면역 반응성을 가지는 신규한 서열을 확인하였다.

바람직한 방법에 있어서는, 사상(filamentous) 파아자 fUSE5 를 벡터로 이용하여 에피토프 라이브러리를 구성함으로써 약 10⁸개의 신규한 헵타 펩티드를 제조한다. 다른 사상 파아지 벡터들이 이러한 라이브러리를 발현시키는데 있어서 동일한 정도로 유용한 것으로 사료된다.

제5도는 fUSE5 사상 파아지 에피토프 라이브러리를 생성 및 스크리닝하는데 필요한 단계들의 순서를 개략적으로 도시한 것이다. 간단히 말해서, fUSE5 RF DNA를 제한 엔도누클레아제 Sfil 으로 절단하여 외래 DNA의 삽입을 위한 삽입부위를 조성한다. (NNK)m 형(여기에서, N은 A, G, C 또는 T를 나타내고, K 는 G 또는 T 를 나타내며, m 은 2 내지 15로 다양하다)의 변형 서열을 함유하고 있는 합성(15+3m) 염기쌍(bp) BgII DNA 단편을 제조한다. 본 발명의 바람직한 실현에 있어서, m 은 5 내지 10 의 범위이고, 염기는 주형의 프라이머에 단 1 회에 임의로 첨가된다. 20개의 아미노산을 코딩하는 코돈의 임의적 첨가를 달성하는 다른 방법은 각각의 아미노산을 나타내는 트리누클레오티드 코돈들을 주형 프라이머에 임의로 부착시키는 것이다.

삽입체를 클로닝 벡터에 결찰시킨 다음, E. coli 세포들의 형질감염에 의해서 사상 파아지 벡터의 증폭을 달성할 수 있다. 벡터에 수반된 마커의 존재에 의해서 성공적으로 형질감염이 되었는지를 측정한다. 본 발명의 바람직한 실현에 있어서는, 이러한 마커가 테트라사이클린 내성이다. 그 다음으로, 재조합 파아지를 박테리아 세포로부터 단리시킨다. 목적으로 하는 서열을 가지는 파아지를, 파아지를 .5α Mab 나 이것의 Fab 단편과 함께 인큐베이션시키는 항체 팬닝(panning) 방법에 의해 단리시킨다. 그 다음에는 비오티닐화된 제2차 항체(염소의 항-사람 IgG)를 첨가하고, 비오티닐화 2차 항체, .5α Mab 및 면역반응성 펩티드 함유 파아지가 함유된 복합체를 스트렙타비딘 피복 플레이트에 부착시킴으로서 미반응 항체와 파아지로부터 분리시킨다. 그 다음에는, 면역반응성 서열을 함유하고 있는 파아지를 용리시켜서, 자체의 DNA 서열을 측정하였다.

사상 파아지 융합 단백질 pIII 에 존재하는 외래 DNA 서열은 면역반응성 펩티드의 서열을 결정한다. 이 과정을 거쳐서 면역반응성을 가지는 것으로 밝혀진 펩티드들을 표준 펩티드 합성방법에 의해서 합성하고 적합한 펩티드 담체에 콘주게이션함으로써 면역원으로 제조할 수 있다.

[III. HTLV-II 펩티드 항원]

본 단락에서는 HTLV-II 항혈청과 특별히 면역반응성인 HTLV-II 펩티드의 확인 및 클로닝 방법에 관한 것이다. 이 펩티드들은 앞에 설명된 HTLV-I gp46 영역으로 부터의 MTA-1 펩티드와 동질성인 HTLV-II gp46 외피 단백질 영역으로부터 유도된다.

원하는 펩티드 서열에 대응되는 HTLV-II 코딩 서열을 클로닝함으로써, HTLV-I 펩티드 MTA-1 에 대응하는 GH2-K15 로 표시된 (제3도) HTLV-II 펩티드를 제조하였다. 중합효소 연쇄반응 (PCR)방법(Perkin-Elmer/Cetus GeneAmp 키트)을 이용하여 HTLV-II 게놈의 5648 내지 5794 누클레오티드에 대응하는 147 염기쌍(bp) HTLV-II DNA 단편을 HTLV-II 클론 pM04 (플라스미드 pBR 322 의 BamH I 부위내에 클로닝된 대부분의 HTLV-II 게놈이 함유됨)로부터 증폭시켰다.

전방 방향과 역 프라이머들을 제6도에 도시하였다. 증폭된 DNA 를 λgt11 파아지 벡터의 EcoRI 부위내로 결찰시켜, λgt11의 -갈락토시다아제 유전자내로 삽입시킬 147 HTLV-II DNA 삽입체를 함유하는 3K15와 같은 클론을 형성시켰다. 재조합 파아지를 이용하여 E. coli 주 BNN103을 형질감염시켰다. 이에 관한 상세한 사항은 실시예 5 에 기제되어 있다.

예비적 실험에서, 감염되지 않는 약 150 개체로부터의 혈청 뿐만 아니라, PCR 방법으로 확인한 바 HTLV-I 또는 HTLV-II 로 감염된 약 200 개체로부터의 혈청을 GH2-K15 항원에 대하여 패널링(paneling)하였다. HTLV-II 에 감염된 개체들로부터 채취한 혈청의 98% 는 GH2-K15 와 반응하였다. HTLV-I 감염 혈청이나 감염되지 않은 혈청중의 어느 것도 GH2-K15 와 반응하지 않았다. 스크리닝 결과에서는, GH2-K15 펩티드가 HTLV-II 양성 혈청과의 특이적 면역반응성이 있는 것이 증명되었다.

GH2-K15 아미노산 서열이 함유되어 있는 몇개의 더 작은 펩티드들을 단락 I에 설명된 재조합 방법으로 제조하였다. 요약하자면, 실시예 5 에 상세하게 설명된 바와같이 지시된 서열의 증폭을 촉진할 수 있게 설계된 PCR 프라이머를 이용하여, HTLV-II 게놈 DNA 의 PCR 증폭에 의해 펩티드를 제조하였다. 이 펩티드들 중, (GH2-) K14, K16, K24, K35, 및 K34 로 표시된 5개는 제3도에 도시된 서열을 가진다.

앞에서 설명된 재조합 HTLV-II 펩티드를, 실시예 8 에 설명된 바와같이, ELISA 방법으로 몇 개의 HTLV-II 및 HTLV-I에 대하여 면역스크리닝하였다. 결과는 표 1에 나타내었다. GH2-K16 을 제외한 모든 λgt11 HTLV-II 클론은, 시험된 6개 HTLV-II 혈청중의 1개 이상에 의해서 인식되었다. 유일한 비-반응성 클론인 GH2-K16 은 GH2-K15 에 포함된 카르복시 말단의 22개 아미노산을 결실하고 있다. 시험한 다른 모든 클론들에는 펩티드 K125 에 존재하는 다음과 같은 17개 이상의 아미노산이 함유된다 : Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser

또한 표 1에 나타낸 바와 같이, 시험된 펩티드들중의 어느 것도 HTLV-I혈청이나 .5α Mab 와 전혀 반응하지 않았다.

원래의 HTLV-II 클론중의 3가지, GH2-K15, GH2-K35 및 GH2-K16 을 pGEX-1 발현벡터내로 클로닝하였다. 3가지 pGEX-1 HTLV-II 클론 GH2-K15, GH2-K25 및 GH2-K35 에 의해서 발현된 재조합 단백질은 모두 J-317 HTLV-II 혈청에 의해 인식되었다.

[표 1]

K15 서열내에 아미노산 서열이 함유된 다수의 펩티드 항원을 상기의 단락 III 에 설명된 고형상 방법으로 제조하였다. 이 펩티드들중에서 (GH2-) K169, K170, K125, K126 및 K128 로 표시된 5개 펩티드의 서열들을 제3도에 도시하였다. 이 펩티드들을 ELISA 방법에 의해서 몇가지 HTLV-I 및 HTLV-II 양성 혈청과의 면역 반응성에 대하여 시험하고, 또한 이 펩티드들중의 일부를 HTLV-II 항체가 K15 항원에 결합하는 것을 억제하는 능력에 대하여 시험하였다.

K125 펩티드는 ELISA 방법으로 분석하였을 때 다중 HTLV-II 혈청에 의해 인식되었다. 한가지 실험에서는, 12개 HTLV-II 혈청중의 6개가 K125에 효과적으로 결합할 수 있었다. 같은 실험에서, 7개 HTLV-I 혈청중의 어느 것도 펩티드 K125에 결합하지 않았다. 또한 K125 펩티드는 강한 반응성 HTLV-II 혈청인 J-317이 웨스턴 블로팅을 한 GH2-K15에 결합하는 것을 억제하였다. GH2-K15에 결합하는 혈청 J-317의 능력은 HTLV-I 펩티드 K163이나 HTLV-II 펩티드 K128과 함께 인큐베이션시키는 것에 의해 영향을 받지는 않는다.

HTLV-II 펩티드 K170은 ELISA를 기초로 하는 검정방법에서 다중 HTLV-II 혈청에 의해서 인식되고, 같은 방법에서 HTLV-I 혈청에 의해서는 인식되지 않는다. K169 펩티드는 ELISA를 기초로 하는 검정 방법에서 HTLV-I 혈청에 의해 인식되지 않는다.

HTLV-II 재조합 항원 분석과 합성 HTLV-II 펩티드의 분석 모두로부터의 데이터에서는 HTLV-II 특이성 에피토프가 GH2-K15 펩티드내의 하기 17개 아미노산 서열내에 포함되어 있다는 것을 알수 있다 : Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser.

앞에서 설명한 HTLV-I 항원 MTA-1 및 MTA-4 의 광범위한 패널링에 의해 얻어진 데이터에서는 GH2-K15 의 6개의 최종 아미노산 Thr-Ser-Trp-Thr-Thr-Lys 가 HTLV-II 항혈청에 의해 인식된 에피토프에 기여할 수도 있다는 점을 시사하고 있다.

[IV. HTLV-I 및 HTLV-II 진단방법]

이하에서는, 본 발명의 HTLV-I 및 HTLV-II 펩티드 항원의 기본적인 3가지 유형의 진단적 적용에 관하여 설명하기로 한다. 제1의 적용은, 보충물 중재된, 항체-의존적 세포용해를 펩티드에 의해 억제하는 것을 기초로 한다. 이 방법에 있어서는, 시험 개체로부터의 혈청을 보충물의 존재하에, HTLV-I 또는 HTLV-II 감염된 T-세포에 클론과 반응시킨다. 항-HTLV-I 또는 항-HTLV-II 항체의 존재는, 예를들어, 트리판(trypan) 블루 염료 배제에 의해서 판단되는 세포 용해에 의해 입증된다.

세포용해가 관찰되는 경우, 혈청을 과량의 HTLV-I 또는 HTLV-II 펩티드와 반응시킨 다음, 보충물의 존재하에서 이 혈청을 세포들과 혼합시킴으로써 HTLV-I 펩티드에 대한 항-HTLV-I 항체의 특이성이 입증된다. HTLV-I 이나 HTLV-II 항체의 존재는 세포 용해의 실질적 감소로 나타나게 된다. 이 방법은 실시예 6A 에 설명되어 있다.

이 방법을 사용하면, 펩티드의 양을 증가시켜가면서 혈청을 적정하고, 세포 용해의 정도에 대하여 괄목할만한 효과가 관찰되는 펩티드 농도를 측정함으로써, 분석 혈청내의 항체 역가를 정량할 수도 있다.

제2의 일반적 검정유형은, 사람의 혈청을 HTLV-I 이나 HTLV-II 감염에 대하여 효소-면역 검정하는 방법이다. 이 검정방법에서는 표면에 결합된 HTLV-I 또는 HTLV-II gp46 펩티드 항원을 가지는 고상 시약을, 항체가 시약상의 펩티드에 결합할 수 있게 하는 조건하에 분석물질 혈청과 반응시킨다. 시약을 세척하여 결합되지 않은 혈청 성분을 제거한 후, 시약을 효소-표지화된 항-사람 항체와 반응시켜서, 효소를 고형 지지체상의 결합 항-HTLV-I 항체의 양에 대한 비율로 시약에 결합시킨다. 시약을 다시 세척하여, 비결합된 항체를 제거하고, 시약과 결합된 효소의 양을 측정한다. 알칼리성 포스파타제로 표지화된 항-사람 항체를 사용하는 한가지 예시적 방법을 직접적인 HTLV-I 스크리닝 검정법에 대해서 실시예 7에 상세하게 설명하였다. 본 발명에 있어서, 효소로 표지된 항체와 효소 검출방법에 요구되는 시약들은 또한, 고형 지지체상의 펩티드 항원에 결합된 사람 항체의 존재를 검출하기 위한 리포터 수단으로 언급되고 있다.

상기 검정방법에서의 고형 표면시약은 단백질 물질을 예컨대 중합체 비이드, 계량봉(dip stick) 또는 필터 물질과 같은 고형 지지물질에 부착시키는 공지의 기술로 제조된다. 이러한 부착방법에는 일반적으로, 단백질을 지지체(실시예 8 에 개시된 필터 지지체)에 비-특이적으로 흡착시키는 방법, 또는 자유 아미노기를 통해 단백질을 고체 지지체상의 예컨대 활성화된 카르복실기, 히드록실기 또는 알데히드기와 같은 화학적 반응기에 공유결합으로 부착시키는 방법이 포함된다.

제3의 일반적인 검정방법의 유형은 HTLV-I 또는 HTLV-II 항혈청을 확인하는데 사용하기 위한 웨스턴 블록 검정방법이다. 이 검정방법에는, 본 발명의 gp46 펩티드 항원 이외에도, HTLV-I 또는 HTLV-II 항혈청의 검출에 효과적인 1가지 이상의 확인용 HTLV-I 또는 HTLV-II 항원이 포함된다. 한가지 바람직한 방법에 있어서, 확인용 펩티드로서는 HTLV-I 바이러스 용해물질로부터의 p24 gag 단백질, 그리고 HTLV-I gp21 외피 단백질의 대부분을 함유하고 있는 p21E 재조합 외피 단백질이 포함된다(Samuel, 1984, 1985). p24 용해물질 단백질은 HTLV-I 및 HTLV-II 양성 혈청을 대부분 취하고 있지만 전부를 취하지는 않는다. p21E 재조합 단백질은 실질적으로 모든 HTLV-I 및 HTLV-II를 습득할 뿐만 아니라 어느정도의 거짓 양성을 제공하기도 한다. 이 변형된 웨스턴 블롯 검정방법을 본 출원인 및 공동 연구자들에 의해 보고된 바 있다(Lipka). 상세한 블로팅 검정방법은 실시예 8에 기재되어 있다.

앞에서 설명된 바와 같이, 그리고 실시예 8 에 상세하게 설명된 바와 같이, 변형된 웨스턴 블롯 방법은, 바이러스 용해물질 단백질 p24 및 재조합 단백질 p21E 와의 면역반응에 의해 입증되는 바와 같이, 시험된 모든 HTLV-I 및 HTLV-II 양성 혈청(95 의 패널)을 검출해 낸다. 또한, MTA-4 펩티드는 확인된 HTLV-I 혈청에 대해서만 면역반응성을 가진다. 이렇게 변형된 블로팅 검정방법을 이용하면, HTLV-I 이나 HTLV-II 항혈청을 확인하고 본 발명의 펩티드와의 선택적 면역반응성에 의해서 2가지 유형의 HTLV 바이러스를 구별할 수 있다.

웨스턴 블롯 검정방법의 다른 실현에서는, HTLV-I 펩티드 항원을 단락 III에 기재된 HTLV-II gp 펩티드 항원으로 교체한다. 이러한 방법에서는, HTLV-I 바이러스 용해물 단백질과 p21E 재조합 단백질이 앞에서와 같이 HTLV-I 또는 HTLV-II 항혈청을 확인할 수 있게 해준다. HTLV-II 특이성 펩티드는 HTLV-II 항혈청을 취하지만 HTLV-I 항혈청을 취하지 않으므로 HTLV-II 항혈청에 대한 양성 확인을 제공한다.

2가지 방법은 HTLV-I 및 HTLV-II 특이성 펩티드 항원을 모두 포함할 수 있도록 조합하여 HTLV 항혈청중의 어느 한가지에 대한 양성 확인을 제공할 수 있다.

[V. 백신 조성물]

본 발명에는 또한, HTLV-I gp 46 펩티드, 그리고 항원 펩티드가 결합하게되는 예컨대 면역원성 단백질과 같은 항원 담체가 함유된 백신 조성물이 포함된다. 펩티드는 앞선 단락 I에 설명된 MTA-1, MTA-4 및 MTA-5 펩티드의 42- 또는 47- 아미노산 중첩부에 의해 형성된 면역원성 영역을 함유하고 있는데, 이 영역은 항-HTLV-I .5α Mab, 즉 ATCC 세포주 HB8755 에서 유도된 항체와 면역반응성이 있다. 더 구체적으로, 이 펩티드에는 다음과 같은 펩티드 서열의 면역원성 영역이 포함되어 있다 : Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser.

.5a Mab 는 중화 항체이기 때문에, 펩티드에 의해서 발생되는 항체는 중화 항체인 것으로 예상된다.

다른 방법에 있어서, 백신 조성물은 아미노산 서열 : Met-Thr-Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Leu-Trp-Phe-Ile-Thr-Ser-Glu-Pro-Thr-Gln-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser-Thr-Ser-Trp-Thr-Thr-Lys, 바람직하게는 아미노산 서열 : Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser-Thr-Ser-Trp-Thr-Thr-Lys, 또는 Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser에 의해 형성된 HTLV-II 특이성 면역원성 영역을 함유하는 HTLV-II gp46 펩티드를 포함하고 있다.

펩티드(들)에 대하여 특히 유용한 단백질 담체로서는 키이홀(key hole) 꽃양산 조개의 헤모시아닌(KLH), 파상풍균의 독소, 폴리-1-(Lys : Glu), 피너츠의 응집소, 폴리-D-라이신, 디프테리아 독소, 오발부민(ovalbumin), 대두(soybeen) 응집소, 우혈청 알부민(BSA), 사람 혈청 알부민 등이 있다.

면역원성 펩티드(들)는 화학적 유도 방법을 포함한 많은 공지의 방법들과 유전공학 기술을 이용하여 담체에 결합될 수 있다. 위와 같은 유전공학 기술은 문헌 [Gerald Quinnan, “Proceedings of a Workshop”, November 13-14, 1984]에 더 자세하게 기술되어 있다. 본 발명의 백신과 접종물은 보통 근육주사나 피하주사방법으로, 장용 캡슐이나 정제 수단에 의한 경구용으로, 좌약용이나 비강내 분무용으로, 또는 기타 적당한 투여경로에 의해서 투여될 수 있다. 환자에게 대해서, 적당한 폴리펩티드 투여량은 부분적으로는 선택된 투여경로에 따라서, 그리고 다수의 다른 요인들에 따라 달라진다. 이러한 요인들로서는, 면역화시킬 포유동물의 체중, 사용되는 담체물질, 사용되는 보조제, 그리고 이용하고자 하는 접종의 횟수가 있다.

사람 환자에 대한 각각의 접종물에는 폴리펩티드에 결합될 수 있는 어떠한 담체 이외에 약 10㎍ 내지 약 100㎎ 단위 용량의 폴리펩티드가 함유될 수 있다. 필요에 따라서는, 최적의 면역을 위해서 일정 기간에 걸쳐 일련의 용량을 투여할 수 있다. 필요에 따라서는 전술된 양의 폴리펩티드가 함유된 백신의 단위 용량형을 제공할 수도 있다.

어떠한 경우에라도, 백신이나 접종물질에 함유되어 있는 면역원은 “유효량” 으로 존재하는데, 이 양은 면역학 분야에 널리 공지된, 예를들어 면역화시킬 포유 동물의 체중, 사용자는 보조제, 원하는 보호기간, 그리고 원하는 면역화 프로토콜과 같은 여러가지 요인들에 따라 달라지게 된다.

이하의 실시예에서는 조금이라도 본 발명의 범위를 제한하는 바 없이 본 발명을 상세하게 설명하고자 한다.

[물질]

이하의 실시예에 사용되는 물질들은 다음과 같다 :

효소 : 뵈링거 만하임 바이오케미칼스(Boehringer Mannheim Biochemicals; BMB, Indianapolis, IN)에서 DNAase I과 알칼리성 포스파타제를 구입하였고 ; 뉴잉글랜트 바이오랩스(New England Biolabs ; NEB, Beverly, MA)로부터 EcoRI, EcoRI 메틸라제, DNA 리가제, 및 중합효소 I을 구입하였으며 ; 시그마(Sigma ; St. Louis, MO)로부터 RNase를 구입하였다.

기타의 시약 : NEB 사로부터 EcoRI 링커를 구입하고 ; 시그마사로부터 니트로블루 테트라졸륨(NBT), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 포스페이트(BCIP), 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-D-갈락토피라노시드(X-gal) 및 이소프로필-D-티오갈락토피라노시드 (IPTG)를 구입하였다.

[실시예 1]

[HTLV-I 게놈 라이브러리의 제조]

[게놈물질의 공급원]

내셔날 인스티튜트 오브 헬쓰(National Institutes of Health)의 더 라보라토리 오브 튜머 셀 바이올로지(the Laboratory of Tumor cell Biology)(Bethesda, MD)의 알.씨. 칼로 (R.C. Gallo)박사와 에프. 왕-스탤(F. Wong-Staal)박사로부터, HTLV-I 게놈에서 유도된 완전 복사 DNA 삽입체를 함유한 박테리오 파아지를 제공받았다. Sacl으로 박테리오파아지를 완전히 절단하여 바이러스 게놈 삽입체를 방출시켰다. 절단된 물질을 표준 1% 아가로스겔 상에서 전기영동시키고, 전기용출시켜 얻어진 9.5kb의 간편을 페놀/클로로포름으로 추출하여 에탄올 침전시켰다.

정제시킨 게놈 DNA를 표준 절단 완충액(0.5M Tris HCl, pH 7.5; 1 ㎎/㎖ BSA; 10mM MnCl₂)에 약 1 ㎎/㎖ 의 농도로 분산시키고 실온에서 약 5분동안 DNAase I으로 절단하였다. 앞선 측정연구로부터 상기의 반응조건을 결정하였는데, 이때 주로 100-300 염기쌍 단편을 제조하는데 필요한 인큐베이션 시간을 결정하였다. 페놀/클로로포름으로 물질들을 추출하고 나서 에탄올로 침전시켰다.

표준조건(Huynh)하에서 상기의 게놈단편들의 말단을 DNA Pol I으로 평활-말단화시킨 다음, 페놀/클로로포름으로 추출한 후 에탄올로 침전시켰다. 평활 말단화된 물질을 표준조건하에서 EcoRI 링커와 연결시킨 다음(Maniatis, pp. 396-397), EcoRI 으로 절단시켜서, 과도한 링커말단을 제거하였다. 그 다음에는, 이 물질을 아가로스 겔-분별화시켜서 아직 결찰되지 않은 링커를 제거하고 크기별로 선택하였다(이하 참조).

X174/HaeIII 및 X174/HindIII 크기 마커를 이용하여 1.2% 아가로스 겔상에서 전기영동함(5-10V/㎝)으로써, 앞선 단계에서 제조된 단편들을 분석하였다. 100 내지 300bp 분획을 NA45 스트립(Schleicher 과 Schuell)상으로 용리시키고, 그 다음에는 이것을 용리용액(1M NaCl, 50mM 아르기닌, pH 9.0)이 들어있는 1.5㎖ 미세시험관에 넣고 67℃ 로 30-60분동안 인큐베이션시켰다. 현재 용액 속에 있는 DNA 를 페놀/클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켰다. 형성된 펠릿을 20㎕ 의 TE(0.01M Tris HCl, pH 7.5, 0.001M EDTA)내에 재분산시켰다.

gt11 파아지 벡터(Huynh)를 프로메가 바이오텍(Promega Biotec; Madison, WI)로부터 구입하였다. 이 클로닝 벡터는 β-갈락토시다아제 번역 종료 코돈의 상류에 독특한 EcoRI 부위 53 염기쌍을 가지고 있다. 0.5-1.0㎍ 의 EcoRI-절단된 gt11, 0.5-3㎕ 의 상기 HTLV-I 게놈 단편, 0.5㎕ 의 10X 결찰 완충액(상기), 0.5㎕ 의 리가아제(200 단위), 그리고 5㎕ 까지의 증류수를 혼합하여, 상기의 게놈단편을 EcoRI 부위에 도입시켰다. 상기 혼합물을 14℃에서 밤새 인큐베이션한 후에, 표준방법(Maniatis, pp. 256-268)에 따라 시험관내 패키징(packaging) 하였다.(Maniatis, pp. 256-268j).

패키징시킨 상기 파아지를 이용하여 DNAX(Palo Alto, CA)의 케빈 무어(Kevin Moore) 박사로부터 입수한 E. coli 주 KM392 를 감염시켰다. 다른 방법으로서는, 아메리칸 타입 컬춰 콜렉션에서 입수할 수 있는 E. coli 주 Y1090(ATCC #37197)을 사용할 수도 있다. 감염된 박테리아를 플레이팅시키고, 표준 X-gal 기질 플라크 검정방법(Maniafis)을 이용하여, 생성된 콜로니를 X-gal의 존재하에 β-갈라토시다아제 활성의 손실(투명한 플라크)에 대하여 점검하였다. 하기의 표 2는 EcoRI-말단된 HTLV-I 단편을 삽입시켜서 얻어진 재조합(투명) 플라크의 수(제1행)을 나타낸다. EcoRI 링커 대조표준(제2행) 및 벡터단독(제3행)에 대해서도 마찬가지로 실행하였다. 도시된 바와 같이, 약 50%의 파아지 플라크가 효소(재조합)의 손실을 나타내었다. EcoRI 링커의 존재 또는 부재하에서 배경의 수준은 15% 이하로서, HTLV-I 에피토프 라이브러리의 성공적인 발생을 나타내는 것이다. 파아지 라이브러리는 약 106 플라크-형성단위(pfu)/㎖를 함유하였다.

[표 2]

[실시예 2]

[gp 46 코드 삽입체의 스크리닝]

사람 세포주(ATCC #C8755)로부터 유래된 정제된 .5 항체를 내셔날 인스티튜트 오브 헬쓰의 내셔날 캔서 인스티튜트(Bethesda, MD)의 사무엘 브로더(Samuel Broder) 박사로부터 제공받았다. 알칼리성 포스파타제와의 공유결합으로 유도된 마우스 항-사람 IgG 항체를 프로메가 바이오텍(Madison, WI)에서 입수하였다.

실시예 1로부터의 파아지 원료 약 10⁴pfu로 감염시킨 KM392 세포를 150㎜ 플레이트상에서 제조하고 37℃ 에서 5-8시간 동안 인큐베이션시키고 뒤집었다. 상기의 감염 세포들을 니트로셀룰로오스 시이트에 펼치고 HTLV-I 재조합 단백질이 플라크로부터 종이로 옮겨가도록 하였다. 플레이트와 필터를, 대응되는 플레이트와 필터의 위치를 짝지울 수 있도록 표시하였다.

필터를 TBST 완충액(10mM Tris, pH 8.0, 150mM NaCl, 0.5% 트윈 20)에 2회 세척하고, AIB(TBST 완충액에 1% 의 젤라틴이 들어 있음)로 차단시키고, 다시 TBST 에서 세척하여, .5 단일클론항체(AIB 에서 1-2㎍/㎖ 로 희석시킨 것, 12-15㎖/플레이트)를 첨가한 후, 밤새 인큐베이션하였다. 시이트를 TBST에서 2회 세척한 후, 효소-표지화 항-사람 항체와 접촉시켜서, .5 항체에 의해 인식되는 항원이 함유된 필터부위에 표지화-항체를 부착시켰다. 최종적으로 세척한 후, 5㎖ 의 알칼리성 포스파타제 완충액(100mM Tris, 9.5, 100mM NaCl, 5mM MgCl₂)내에 33㎕ 의 NBT(5℃ 로 유지된 50㎎/㎖ 원액)가 함유된 기질 배지에서 필터를 전개시켰다. 반응을 한 기질은, 0.5α Mab 로 인식된 바와 같이 항원이 제조된 지점에서만 나타났다.

앞 단계에서 결정된 항원의 제조영역을 82㎜ 플레이트상에 약 100-200pfu로 다시 플레이팅하였다. 5-8 시간 동안의 인큐베이션으로 시작하여 NBT/BCIP 전개를 거치는 앞단계를 반복하여, .5Mab 와 반응을 할 수 있는 항원을 분비하는 플라크를 확인하였다. 확인된 플라크를 취하여 파아지 완충액에서 용리시켰다(Maniatis, p.443). 항체-반응성 펩티드를 분비하는 3개의 재조합 파아지 플라크를 실시예 3의 방법에 따라 서열화 분석용으로 선택하였다. 해당되는 감염 파아지를 MTA4-, MTA-1 및 MTA5 로 표시하였다.

[실시예 3]

[파아지의 정제와 DNA 추출]

감염된 E. coli Y1088 박테리아의 플레이트 배양물로부터 파아지 MTA-4, MTA-1 및 MTA-5 를 단리시켰다. 이 세포들은 ATCC 로부터 입수되었다(ATCC #31195). 파아지 희석완충액을 첨가하여 파아지를 수집(maniatis)하고, 이 물질을 저속 원심 분리에 의해 박테리아 단편들로부터 정제시켜 내고, 상층액을 SW27관에 부었다. RNase 와 DNase 를 각각 원액 1㎎/㎖로부터 1㎍/㎖의 농도가 될 때까지 첨가하였다. 시료를 37℃ 로 30분간 인큐베이션시키고, 동일한 부피의 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 5.8g 의 NaCl, 2.0g 의 MgSO₄ㆍ7H₂O, pH 7.5, 1M Tris Cl, 및 2% 의 젤라틴을 첨가하였다. 시료를 1시간 동안 얼음조에 놓아두고 파아지 입자가 침전물을 형성할 수 있게 한 다음, 이것을 4℃ 에서 약 20분간 10k 로 원심분리함으로써 단리시켰다.

상층액을 따라내고, 펠릿을 0.6㎖ 의 PDB 완충액(5.8g NaCl, 2.0g MaSO₄ㆍ7H₂O, 50㎖ 의 1M Tris Cl, pH 7.5 및 5㎖ 의 2% 젤라틴)내에 제현탁시켜 .5㎖ 폴리프로필렌 마이크로튜브에 옮겼다. 5㎕ 의 10% SDS, 5㎕ 의 0.5M EDTA 및 2.5㎕ 의 단백질분해효소 K(20㎎/㎖)를 첨가하고, 시료를 50℃로 15분간 인큐베이션시켰다.

세제와 효소로 처리된 물질을 동일한 부피의 페놀/클로로포름으로 추출해내고 원심분리시켜서 상이 확실하게 분리되도록 하였다. 수성상을 새로운 시험관에 옮기고 클로로포름과 이소아밀 알코올의 혼합물로 추출/원심분리 방법을 반복하였다. 동일한 부피의 이소프로판올을 첨가하고 몇차례 뒤집어서 혼합한 다음 -70℃로 20분간 냉각 시켰다. 시료를 5분간 원심분리시키고 상층액을 따라내었다. 70% 에탄올에서 펠릿을 세척하고 37℃의 열차단내에서 약간 건조시켜 pH 7.5의 100㎕ TE 완충액에 재현탁시켰다.

단리된 파아지 DNA 를 Kpnl 과 Sacl 으로 절단시킨 다음, Kpnl/Sacl 절단 플라스미드 벡터 pGEM-3(Promega Biotec)과 조합하여, 목적 삽입체를 가진 플라스미드 재조합체를 단리시켰다. 그 다음에는, 표준 디데옥시 서열화방법, 및 EcoRI 삽입 부위에 접하는 λgt1 서열에 대한 순방향 및 역방향 프라이머를 이용하여 HTLV-I 삽입체를 서열화하였다.

도면에서는, 각각의 시험된 3개의 융합단백질에 대하여, 상기의 방법으로 형성된 융합단백질 일부의 코딩서열 및 해당되는 아미노산 서열을 도시하였다. β-gal 유전자의 말단 G 염기와 3개의 삽입서열 각각에 의해 기여받는 env 유전자의 인접 CC염기는 GCC(Ala) 코돈을 생성하여, 모든 3개 env 삽입체의 상기 코돈 위치에서 발생되는 Ser 코돈을 대치한다. 도시된 바와 같이, MTA-4 내의 삽입체에는 HTLV-I 코딩 영역의 5564 내지 5790 염기에 걸친 225개 염기쌍 서열이 포함되어 있다. MTA 5 파아지의 삽입체는 염기 5664에서 시작하여 염기 5895 까지 연장된다. 231개 염기쌍 서열은 gp46 단백질의 아미노산 162 내지 240에 걸쳐 존재한다.

5664 내지 5790의 삽입체 중첩영역은 본래의 gp46 단백질의 아미노산 162 내지 203의 42개 아미노산 서열을 포함한다.

[실시예 4]

[HLV-I 펩티드 항원의 단리]

[A. 용원(lysogen)의 구성]

스탠포드 대학(Stanford University; Stanford, CA)의 알. 데이비스 (R. Davis)박사로부터 Eco RI 주 C600을 입수하였다. 다른 방법으로는, Eco RI Y 1089(ATCC # 37196)를 사용할 수도 있다. 10㎕의 용출된 플라크를 밤새 배양한 50㎕의 박테리아 배양물에 흡착시킴으로써, 하룻밤 동안 배양시킨 포화세포 1㎖를 실시예 3으로부터의 3개 파아지중의 하나로 감염시켰다. 감염된 박테리아를 LB 아가 플레이트에만 펼쳐서 깔고(Maniatis, p. 440), 32℃에서 인큐베이션시켰다. 개개의 콜로니를 멸균된 집게로 집어서 2개의 별도의 플레이트상의 해당 그리드(grid)에 놓았다. 플레이트 중의 하나를 32℃로, 다른 하나는 42℃로 인큐베이션하였다. 고온이 아닌 (세포 용해 때문에) 저온에서 성장한 세포(파아지 억제 단백질의 존재에 의해 제조된 용원성 상태를 나타낸다)는 용원성인 것으로 추정된다. 3가지 파아지 유형 각각으로부터의 많은 용원성 콜로니가 발견되었다.

[B. 용원으로부터의 재조합 항원유도]

본 실시예에서는 MTA-4 파아지를 가진, 실시예 4에서 제조된 λgt11 용원으로부터의 HTLV-I 에피토프를 함유하는 재조합 단백질의 유도를 설명하기로 한다. 앞에서 설명한 바와같이, 항원은 파아지 -gal 단백질의 N-말단 부분을 함유하고 있는 -갈락토시다아제 융합 단백질의 형태로 제조된다.

하나의 1dHO 내에 35g의 박토트립톤, 2g의 박토-이이스트 추출물, 5g의 NaCl 및 5㎖의 1N NaOH가 함유된 수퍼브로쓰(superbroth)를 제조하였다. 500㎖의 수퍼브로쓰에 앞의 실시예에서 제조된 EcoRI λgt11 용원을 밤새 배양시킨 포화 배양물을 1 : 100으로 접종하였다. 배양물을 강력한 환기와 함께 A₆₀₀= 0.4 - 0.5까지 인큐베이션시켰다.

단백질의 제조를 최대화하기 위해, 배양물의 온도를 43-44℃까지 상승시킴으로써 온도 감응성-갈락토시다아제 억제 유전자를 비활성화시켰다. 환기를 시키면서 65℃의 수조에서 15분간 43℃로 유지시켰다. - 갈락토시다아제 억제인자에 경합적으로 결합함으로써 갈락토시다아제 발현을 유도하는 IPTG를 욕즙에 2mM까지 첨가하여 단백질의 제조를 더욱 증가시켰다. 배양물을 38℃의 진동장치에 다시 옮겨서 약 1 시간동안 진동시켰다. 그 다음에는 세포를 37℃에서 6000 × g로 15분간 펠릿화시키고 용해 완충액(10mM Tris, pH 7.4, 2% Triton × -100, 1% 아프로티닌 및 50㎍ PMSF)에 재현탁시켜서 즉시 액체 N₂내로 넣었다. 동결된 시료가 해동되었을때, 용해가 완료된다.

[C. 융합단백질의 정제]

앞의 실시예에서 얻은 세포 용해물을 해동시키고 37℃로 가온시켰다. 10㎕의 DNAse(1㎍/㎖)를 첨가하고, 점도가 감소될 때까지 혼합물을 인큐베이션시켰다. 용해 물질을 얼음위에서 신속하게 냉각시키고 마이크로퓨즈(microfuge) 내에서 4℃로 5분간 맑게 하며, 이것을 세파로즈 4B(Sepharoce 4B; Pharmacia)에 결합된 항- - 갈락토시다아제의 6㎖ 컬럼에 부하하였다. 컬럼을 1-2 시간동안 평형화시키고 7부피 (컬럼부피)의 TX 완충액 (10mM Tris, pH 8.0, 2% Triton X-100, 50㎍/㎖ PMSF)으로 세척을 하고 나서 TX 완충액내의 5mM 3,5-디요오도살리실산 2부피로 세척을 하였다. 그 다음에는, 융합 단백질을 TX 완충액내의 35mM 3,5-디요오도살리실산으로 컬럼으로부터 용리시켰다. 대부분의 단백질을 최초의 3-4 부피로 용리시키고, 7 부피 후에는 실질적으로 제거를 완료하였다.

용리된 시료를 탈염시키고 아미콘 필터(Amicon filter; Danvers, MA)를 이용하여 농축시켰다.

[실시예 5]

[HTLV-II 항원의 제조]

[A. HTLV-II DNA 서열의 합성 및 클로닝]

폴리머라제 연쇄반응(PCR) 방법을 이용하여 클로닝용 HTLV-II DNA 서열을 발생시켰다. 6개의 30bp DNA 프라이머를 합성하였다. 모두 6개의 프라이머가 3bp의 gt11 서열을 지녔고, 자체의 5'말단에 EcoRI 부위를 지녔다. 이 다음에는 21bp의 HTLV-II 서열이 있다. 3개의 전방 방향 프라이머는 누클레오티드 5648-5668, 5687-5707 그리고 5726-5745에 해당하는 HTLV-II 서열들을 함유하고 있다. 3개의 역방향 프라이머는 누클레오티드 5794-5774, 5776-5756 및 5728-5708에 해당되는 HTLV-II 서열을 함유하고 있다.

제조자의 지침(Perkin Elmer/Cetus)에 따라 PCR을 수행하고, 모든 PCR 반응물에는 주형으로서의 상기 HTLV 클론 2ng과 적당한 PCR 프라이머 1㎛이 함유되어있다. 25회에 걸쳐 PCR 증폭을 수행하였다. 각 사이클에는 94℃로 1분간 변형을 수행하는 단계, 주형에 대한 프라이머를 50℃로 2분간 어닐링(annealing)하는 단계, 그리고 72℃로 2분간 프라이머를 연장시키는 단계가 포함된다. 그 다음에는, 증폭된 DNA를 정제시키고 나서, EcoRI으로 절단을 완료시켰다. 절단된 DNA를 람다 gt11의 Ecol 부위에 결찰시켰다. 그 다음에는 재조합 파지 DNA를 패키징하고 비-재조합 파아지를 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 β-D-갈락토피라노시드의 존재하에서 플레이팅함으로써 비-재조합 파아지의 빈도를 결정하였다.

재조합 파아지 대 비-재조합 파아지의 비율은 약 50/1 이었다. 각각의 6개 재조합 파아지 클론으로부터의 다중 단리된 플라크를 취하고 나서, λgt11 플랭킹 프라이머 11F 및 11R 및/또는 앞에서 설명한 HTLV-II 플라크를 사용한 PCR 를 이용하여 스크리닝하였다. 그 다음에는, 크기가 정확히 구별되고 배향된 삽입체를 함유한 클론을 증폭시켜 차후의 면역스크리닝 검정방법에 사용하였다. 그 다음에는 3개의 클론 GH2-K15, GH2-K16 및 GH2-K35 로부터의 EcoRI 단편을 pGEX-1 플라스미드와 서열화된 DNA 내로 하위 클로닝하였다. 얻어진 서열들은 원하는 HTLV-II 영역에 대한 보고된 서열(Shimotokno)에 정확하게 결합된다.

[B. HTLV-II 클론에 대한 면역학적 분석]

재조합 파아지를 야생형 gt11 과 1/1 로 혼합시키고, 이것으로 E. coli 주 KM-392 를 감염시켰다. 파아지가 약 5시간 동안 성장할 수 있도록 한 후에, 발현된 단백질들을 니트로셀룰로오스 필터에 밤새 결합시켰다. 그 다음에는 필터를 TBS(0.5M NaCl, 20mM Tris pH 8.0)으로 3회 세척하고, 부분들로 절단하고, TBS 와 1% 의 젤라틴을 이용하여 블로킹하였다. 그 다음에는, 필터 부분을 TBS + 젤라틴에 1/100 으로 희석된 HTLV-I 또는 HTLV-II 감염 개체로부터의 혈청인 1단계 항체와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. TBS로 세척한 후에, 필터를 알칼리성 포스파타제와 콘주게이트된 염소 항-사람 혈청과 함께 1시간 이상동안 인큐베이션하였다. 필터를 TBS 로 세척하고, 그 다음에는 필터를 니트로블루 테트라졸륨 클로라이드와 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴포스페이트의 용액내에서 인큐베이션시킴으로써, 결합된 항체를 검출하였다. 만일 재조합 파아지로부터 유래된 플라크가 야생형 gt11 의 플라크와 명백히 구별될 수 있는 경우에는, 특정 혈청을 양성이라고 평가하였다.

[C. 재조합 항원의 발현 및 정제]

먼저, 용원을 발생시킴으로써 β-갈락토시다아제 융합단백질을 발현시켰다. 재조합 gt11 파아지를 이용하여 E. coli 주 BNN103 를 감염시키고, 2벌의 플레이트를 32℃ 와 42℃에서 성장시킴으로써 용원을 확인하였다. 융합단백질의 제조는 용원의 로그(log)상에 배양물의 온도를 15분간 42℃ 로 상승시킴으로써 유도할 수 있다. 그 다음에는 이소프로필 티오갈락토시드를 최종농도가 1.6 Mm 이 되도록 첨가하고, 배양물을 추가로 1시간동아 37℃에서 성장시켰다. 그 다음에는, 세포들을 5000 × g 로 15분간 원심분리하여 펠릿화시키고, 용해 완충액(2% Triton × -100, 1% 아프로티닌, 10mM Tris, pH 7.4) 원래 배양 부피의 1/50으로 다시 현탁시켰다. 그 다음에는, 용액을 드라이아이스/에탄올조에 침지시켜서 동결시킨 후, 해동시켰다. 최종 농도가 1㎍/㎖ 로 되도록 DNasel 을 첨가한 다음, 용해물을 실온에서 5분간 인큐베이션하였다. 그 다음에는 10분간 10,000 × g 원심분리함으로써 불용성 파편들을 펠릿화하였다. 그 다음에는 앞에서와 같이 상층액을 원심분리하였다. 펠릿과 상층액 분획의 표본에 대한 나트륨 도데실 술페이트-폴리아크릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE, Lammeli) 분석에서는, 상층액 분획에서 기본적으로 GH2-K15 가 발견된 것으로 나타났다.

그 다음에는, 상층액 분획을 2㎖의 프로토소브 락쯔 흡착제(Protosorb Lacz adsorbent; Promega)와 결합시키고, 진탕시키면서 25℃로 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 그 다음에는 컬럼수지를 1회용 컬럼에 붓고 10㎖ 의 TX 완충액(1% Aprotinin, 10mM Tris pH 7.4) 으로 2회 세척하였다. 결합된 단백질을 pH 10.8 의 탄산염 완충액 14㎖ 로 용리시키고, 2㎖ 의 분획을, 이미 1㎖ 의 2M 트리스 완충액(pH 7.5)이 들어있는 시험관에 수거하였다. 그 다음에는, 센트리콘 30에스 (Centricon 30s; Amicon)를 이용하여 다음 제조자의 지침에 따라 분획들을 농축시켰다. 2㎖ 의 MTBS 완충액(150mM NaCl, 4mM NaH₂PO₄, 16mM Na₂HPO₄, pH 7.3)으로 분획들을 세척한 후 다시 농축시켰다.

SDS-PAGE를 이용하여, 정제된 융합단백질의 위치, 수율 및 순도를 측정하였다. 면역 친화성 컬럼을 통해 1회 통과시킨 후, GH2-K15 재조합 항원의 순도는 ~70% 였다. 융합 단백질이 함유된 분획들을 모으고, 이중에서 표본을 다음 단계의 웨스턴 블롯 시험에 사용하였다. 웨스턴 블롯 분석방법은 기본적으로 앞에서 설명한 바대로 수행하였다(Lipka). 적정실험에서는, 정제된 GH2-K15 항원의 최적 적재량이 니트로셀룰로오스 ㎝ 당 단백질 3㎍ 인 것으로 측정되었다. 펩티드 경합실험을 실시예 6C 에 개시하였다. 그 다음에는, 블로팅한 항원이 함유된 니트로셀룰로오스 스트립을 혈청 시료에 첨가하고, 인큐베이션 하여 정상으로 발달시켰다.

[D. HTLV 항혈청]

HTLV-I, HTLV-II, 또는 ELISA 반응성-HTLV 음성 개체로부터 혈청시료를 얻었다. 이 시료들은 다수의 상이한 공급원과 여러지역에 걸쳐서 입수되었다. 또한, 종 특이성 DNA 프라이머를 가진 PCR 을 이용하여 많은 혈청양성 혈청 시료를 HTLV-I 또는 HTLV-II 감염에 대하여 유형을 분류하였다. HTLV-I 혈청 시료에는, 자메이카의 식품 조리사들로부터의 45 시료, 뉴 올리언즈 지역의 정맥주사자(IVDU) 2명의 시료, 그리고 11명의 북부 캘리포니아의 혈액 공급자들로부터의 시료로 이루어진, 58 PCR 입증 시료가 포함된다. 또한, 일본에서 총 238 HTLV-I 혈청 시료를 얻었다. 일본의 시료들에서는 PCR 데이터는 얻을 수 없었고, 감염을 앞에서 설정된 특징들을 사용하여 HTLV-I 항원에 대한 혈청 시료를 웨스턴 블로팅으로 분석하여 유형화하였다(Lipka 등, JID). HTLV-II 혈청 시료에는 뉴 올리언즈 지방의 6 IVDU, 북부 캘리포니아 지방의 24 IVDU 그리고 북구 캘리포니아 지방의 27 혈액공급자로 이루어진, 57개의 PCR 판명된 시료가 포함된다. HTLV 음성 혈청에는 자마이카의 식품 취급자 1명, 캘리포니아 혈액공급자 1 명, 및 일본의 혈액공급자 29명의 시료가 포함되었다. 상기와 같이 혈청 시료에 대하여 PCR 분석을 수행하였다.(Lipka).

[실시예 6]

[펩티드 항원의 면역반응성 검출]

[A. 세포 용해의 억제 인경]

HUT 102-B2 세포를 LTCB, NIH의 알.씨. 갈로(R.C. Gallo) 박사로부터 입수하였다. 이것은 HTLV-I을 생성시키는 것으로 알려진 장기간 배양된 T-세포주이다.

.5α 항체(~ 5㎍/㎖ IgG) 또는 여기에 동일형으로 짝지워진 대조군으로서 사람 IgG 를 MTA-4 재조합 펩티드 또는 이와 무관한 재조합체와 함께 실온에서 30분간 예비 인큐베이션하였다. 그 다음에는, 이 혼합물 50㎕ 를 96-웰 미세 역가 플레이트에 들어있는 5 × 105 HUT 102B2 세포들에 첨가하고, 실온에서 30분간 인큐베이션하였다. 각 웰당 30㎕ 의 토끼 보충물질을 첨가하고 37℃ 로 1시간 동안 인큐베이션하였다. 현미경 검사에 의해 세포의 생존가능성을 시험하였다. 세포의 용해현상은 MTA-4 펩티드 항원의 첨가에 의해 가시적으로 억제될 수 있지만, 무관한 재조합 펩티드 항원과 함께 예비 인큐베이션시키는 것으로 억제되지 않는다. 재조합 항원이나 무관한 재조합 펩티드 항원과 함께 예비적으로 인큐베이션시킨 후에, 동일형으로 짝지워진 사람 IgG 는 HUT 102-B2 생존성에 아무런 영향도 미치지 않았다.

[B. ELISA 검정방법]

HTLV-I 과 HTLV-II 펩티드를 ELISA 검정방법으로 시험하여, HTLV 감염 개체들로부터의 혈청이 상기 합성 펩티드들에 결합할 수 있는 능력을 측정하였다. 간단히 말해서, ELISA 검정방법에는, 정해진 양의 합성 펩티드를 미세 역가(microtiter) 플레이트에 결합시킨 다음, HTLV 감염 개체들로부터의 혈청을 첨가하는 단계가 포함된다. 그 다음에는, 결합되지 않은 혈청을 세척해내고, 펩티드에 결합된 항체를 2차 항체에 의해서 검출하였다. 무색 기질을 유색 생성물로 전환시키는 효소에 상기 2차 항체를 콘주게이트시켰다. 제조된 유색 생성물의 양은 펩티드에 결합된 혈청 항체의 양을 나타낸다. 결합된 펩티드에 대한 특정 혈청으로부터 얻어진 신호는 펩티드가 전혀 함유되지 않은 웰로부터의 혈청에 의해 얻어진 신호로부터 차감하였다. 마이너스 펩티드 바탕값을 차감한 후에 얻어진 값은 양성(positive)인 것으로 여겨지는 바탕값의 2.5 배가 되어야 한다.

[C. 항체 결합 억제]

억제 검정방법에는, 과다한 합성 펩티드를 HTLV 감염 개체로부터의 혈청과 함께 인큐베이션시킨 다음, HTLV-I 이나 HTLV-II 재조합 항원이 블로팅된 상태로 함유된 니트로셀룰로오스 스트립을 그 위에 놓아두는 단계가 포함된다. 만일 혈청이 펩티드에 결합될 수 있다면, 항체를 함유하고 있는 용액내의 광대한 초과량의 펩티드는 항체가 니트로셀룰로오스 스트립상에 존재하는 비교적 소량의 항원에 현저하게 결합하는 것을 방지한다. 니트로 셀룰로오스 스트립상의 재조합 항원에 결합된 항체의 양은 앞에서 ELISA 검정방법에 대하여 설명한 것과 유사한 방법으로, 효소 콘주게이트된 2차 항체를 이용하여 측정한다. 대조군에 대한 실험에는, HTLV-I 혈청을 HTLV-II 펩티드 K125 와 함께, 또는 HTLV-II 혈청을 HTLV-I 펩티드와 함께 인큐베이션한 다음에, 적합한 재조합 항원을 인식할 수 있는 혈청의 능력을 결정하는 단계가 포함된다.

[실시예 7]

[EIA 분석]

실시예 4 에 설명된 대로, 정제된 MTA-4 펩티드 항원을 제조하고, 니트로 셀룰로오스 필터상에 도트(dot) 블로팅한 다음, 고형상 검정방법에 이용하여, T-세포 백혈병에 걸린 환자(HTLV-I에 감염된 6명의 환자)의 혈청 항원을 측정하였다. 각각의 경우에, 각 개체들로부터의 1:100 내지 1:50,000 범위로 희석시킨 0.1㎖의 다양한 혈청 희석액을 필터에 첨가하여, 실온에서 30분간 정치시켜 두었다. 그 다음에는, 필터를 TBST 완충액(실시예 2)으로 2회 세척하고, 실시예 2 에서와 같이, 알칼리성 포스파타제와 콘주게이트된 항-사람 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 또한 실시예 2 에서와 같이, NBT 및 BCIP 에서의 색상 발현에 의해서 항체의 존재를 측정하였다.

[실시예 8]

[HTLV-I 양성 혈청을 확인하기 위한 변형된 웨스턴 블롯 방법]

실시예 4 에서와 같이 재조합 MTA-I을 제조하였다. 앞에서 설명한 바(Samuel, 1984, 1985)대로 재조합 p21E 를 제조하였다. 만성적으로 감염된 세포주 MT-2 로부터 HTLV-II 바이러스 용해물을 제조하였다(Hillcrest Biologicals, Cypress, CA). 이 HTLV-I 항원을 혼합시킨 다음, 11.5% 아크릴아미드 SDS/PAGE 겔(Laemmli) 상에서의 감압조건하에 분리하였다. 재용해시킨 단백질을 블로팅(100mM Tris-HCl, pH 7.4중의 5% 탈지분유, 2.5% 정상 염소의 혈청)에 의해 차단시킨 니트로셀룰로오스(니트로셀룰로오스 막)상에 전기적으로 블로팅한 다음, 공기건조시키고, 3㎜ 너비의 스트립으로 절단하였다.

검정방법에서, 우선 상기의 시험용 스트립을 TBS 완충액내에서 다시 수화시키고, 이 스트립들을 블로팅액내에 1:50 으로 희석된 사람의 시험용 혈청과 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 스트립을 세척 완충액으로 몇번 세척한 다음, 알칼리포스파타제와 콘주게이트된 염소 항-사람 IgG 와 함께 1시간동안 인큐베이션하였다(Bio-Rad, Richmond, CA). 세척 후에, 100mM Tris-HCl 완충액, pH 9.5, 50mM MgCl₂내에 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴 인산염, 및 니트로블루 테트라졸륨이 함유된 기질 용액내에서 스트립을 인큐베이션함으로서 색 발현을 달성하였다. 스트립상에 균일한 바탕색이 발현될 때까지 색 발현을 계속하고, 스트립을 탈이온수로 2회 헹구어 발현을 정지시켰다.

HTLV-I 또는 HTLV-II 양성 혈청의 패널을 시험하였다. 이 패널들은 PCR 분석방법(Lipka)에 의해서 HTLV-I 이나 HTLV-II 양성인 것으로 사전에 확인되었다. 결과는 제6도에 나타내었는데, 패널 A-G 는 HTLV-I 항혈청이고 패널 H-S 는 HTLV-II 항혈청이다. 바이러스 용해물 단백질 gp24 는, 재조합 펩티드 gp21E와 같은 모든 혈청 시료와 면역반응성이 있다. MTA-4는 HTLV-I 혈청 시료에 대해서만 면역반응성을 가진다.

지금까지는 본 발명의 구체적인 실현예, 구성방법 및 용도에 대하여 설명하였으나, 당업자라면 다양한 다른 용도와 제형, 그리고 실시 방법들이 본 발명의 범위이내에 포함된다는 것을 명백하게 알 수 있을 것이다.

Claims (7)

1. HTLV-II 외피 단백질 gp46에서 유도된 약 50개의 아미노산으로 이루어지며 사람 혈청중의 HTLV-I 감염의 존재를 검출하는데 사용되는 면역 반응성 펩티드 항원으로서, 상기 항원이 아미노산 서열 Met-Thr-Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Leu-Trp-Phe-Ile-Thr-Ser-Glu-Pro-Thr-Gln-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser-Thr-Ser-Trp-Thr-Thr-Lys에 의해 형성된 면역원성 영역을 포함하는 면역 반응성 펩티드 항원.
2. HTLV-II 외피 단백질 gp46에서 유도된 약 50개 미만의 아미노산으로 이루어지며 사람 혈청중의 HTLV-I 감염의 존재를 검출하는데 사용되는 면역 반응성 펩티드 항원으로서, 상기 항원이 아미노산 서열 Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser-Thr-Ser-Trp-Thr-Thr에 의해 형성된 면역원성 영역으로 구성되는 면역 반응성 펩티드 항원.
3. HTLV-II 외피 단백질 gp46으로부터 유도된 약 50개 미만의 아미노산으로 구성된 면역 반응성 펩티드 항원으로서, 상기 항원이 아미노산 서열 Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser에 의해 형성된 면역원성 영역으로 구성되는 면역 반응성 펩티드 항원.
4. HTLV-I 및 HTLV-II의 감염을 검출하고 구별해 내는 키트로서, ATCC HB8755로부터 유도된 항-HTLV-I 단일 클론성 항체와 면역 반응성인 아미노산 서열 Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser로 구성된 펩티드 영역을 함유하며 HTLV-I 외피 gp46으로부터 유도되는 제1고정상 펩티드 항원과, 아미노산 서열 Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser로 구성된 펩티드 영역을 함유하며 HTLV-II 외피 단백질 gp46으로부터 유도된 약 50개의 아미노산으로 구성되는 제2펩티드 항원이 지지된 고형 지지체를 포함하며, 상기 고형 지지체상의 하나 이상의 위치에서 고정된 제2항원이 HTLV-I 유도된 gp46 펩티드 항원의 위치로부터 이격되어 있으며, 혈청이 고형 지지체에 가해지고 사람 항체의 존재를 검출하는 리포터 수단이 지지체에 결합되는 경우에 혈청 항체가 고정된 펩티드 항원과 접촉되도록 지지체가 구성되어 있는 키트.
5. 제4항에 있어서, HTLV-II 특이성 펩티드 항원이 아미노산 서열 Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser-Thr-Ser-Trp-Thr-Thr로 구성된 펩티드 영역을 함유함을 특징으로 하는 키트.
6. 제4항에 있어서, HTLV-II 특이성 펩티드 항원이 아미노산 서열 Met-Thr-Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Leu-Trp-Phe-Ile-Thr-Ser-Glu-Pro-Thr-Gln-Pro-Pro-Pro-Thr-Ser-Pro-Pro-Leu-Val-His-Asp-Ser-Asp-Leu-Glu-His-Val-Leu-Thr-Pro-Ser-Thr-Ser-Trp-Thr-Thr-Lys로 구성되는 펩티드 영역을 함유함을 특징으로 하는 키트.
7. 제4항에 있어서, HTLV-I 특이성 펩티드 항원이 아미노산 서열 Ser-Leu-Leu-Val-Asp-Ala-Pro-Gly-Tyr-Asp-Pro-Ile-Trp-Phe-Leu-Asn-Thr-Glu-Pro-Ser-Gln-Leu-Pro-Pro-Thr-Ala-Pro-Pro-Leu-Leu-Pro-His-Ser-Asn-Leu-Asp-His-Ile-Leu-Glu-Pro-Ser-Ile-Pro-Trp-Lys-Ser-Lys로 구성되는 펩티드 영역을 함유함을 특징으로 하는 키트.