KR100332425B1

KR100332425B1 - 색소표식단백질복합체 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR100332425B1
Application number: KR1019990016353A
Authority: KR
Inventors: 시게토노부유키; 미야자키진세이; 나카야마히로시
Original assignee: 모리시타 요이찌; 마쯔시다덴기산교 가부시키가이샤
Priority date: 1998-05-14
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2002-04-13
Anticipated expiration: 2019-05-07
Also published as: EP0957364A3; DE69902419D1; EP0957364B1; KR19990088119A; DE69902419T2; JPH11322796A; CN1235848A; CN1122533C; JP3601972B2; EP0957364A2

Abstract

다수의 색소분자로 표식된 색소표식단백질복합체가 개시되어 있다. 이 색소표식단백질복합체는, 디설파이드결합에 의하여 단백질과 결합한 항체로 이루어지는 단백질복합체, 및 이하의 식(1)로 나타내는 시아닌계 색소로부터 이루어지며, 상기 단백질복합체가 상기 색소로 표식되어 있다.

(단, R₁및 R₂는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알칼리금속, n은 1∼4의 정수를 나타낸다.)

Description

색소표식단백질복합체 및 그 제조방법 {Dye-labeled protein conjugate and method for preparing the same}

본 발명은, 단백질과 결합한 항체로 이루어지는 단백질복합체를 시아닌계 색소로 표식한 색소표식단백질복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.

항체를 색소로 표식한 색소표식항체는, 시료액 중에 포함되는 항원과 특이적으로 반응하고, 또한 시인성이 있기 때문에, 예컨대, 면역학적 항원항체반응을 이용하여, 시료액 중에 포함되는 검체의 검출을 하는 면역 센서에 사용되고, 각종 의료기관에서의 진단에 활용되고 있다.

항체를 표식하는 색소로서는, 높은 몰흡광계수를 갖고, 반응성이 높은 시아닌계 색소가 사용되는 경우가 많다(Bioconjugate Chemistry V0L.4, No.2, pp105-111,1993).

이러한 시아닌계 색소는, 그 관능기가 항체의 아미노기 또는 카르복실기와 반응하여 공유결합하고, 1분자의 항체에 대하여 20∼50분자의 상기 색소가 결합한다.

이렇게 하여 제작된 시아닌계 색소표식항체는, 일반적으로 시인성이 좋고, 예컨대 면역 크로마토그래피에 도입되어, 임부의 요 중에만 존재하는 인간융모성(絨毛性) 성선호르몬 등의 미량성분을 검출하는 데 효율적으로 사용하고 있다.

통상, 항체에는, 수백에서 수천의 아미노기 또는 카르복실기가 존재한다. 그러나, 항원은 3차원의 입체구조를 가지기 때문에, 이들 중에서 반응에 관여할 수 있는 것은 50개 정도로 생각되며, 1분자의 항체에 대하여, 색소 50 분자가 결합하는 것이 한계였다.

따라서, 이 색소표식항체를 면역 센서 등에 이용한 경우, 검출대상물의 농도가 낮으면, 그 검출이 곤란하다는 문제가 발생하였다.

본 발명은, 상기 과제에 비추어, 다수의 색소분자로 표식된 색소표식단백질복합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은, 디설파이드결합에 의하여 단백질과 결합한 항체로 이루어지는 단백질복합체, 및 이하의 식(1)로 나타내는 시아닌계 색소로 이루어지며, 상기 단백질복합체가 상기 색소로 표식되어 있는, 색소표식단백질복합체를 제공한다.

항체에 단백질을 결합시키면, 시아닌계 색소가 결합할 수 있는 면적이 넓어지기 때문에, 단백질복합체에 결합하는 시아닌계 색소의 수는, 항체단체의 경우보다도 많아진다. 예컨대 항체 1분자당 결합하는 색소분자수가 근접하게는 종래법의 약 10배로 할 수 있다. 그 때문에, 얻어진 색소표식단백질복합체는, 시인성이 뛰어나다.

따라서, 본 발명에 의한 색소표식단백질복합체를 예컨대, 면역크로마토그래피에 이용하면, 측정대상물(검체)의 농도가 낮은 경우에도, 검체를 고감도로 검출할 수 있다. 또한 그 고감도로부터 본 발명의 색소표식단백질복합체는, 바이오센서에도 적용할 수 있다.

본 발명에 의한 색소표식단백질복합체는, 상기 시아닌계 색소의 숙신이미딜기 유래의 아실탄소와 상기 단백질복합체의 아미노기 유래의 질소가 공유결합함에 의해, 상기 색소의 골격이 단백질복합체에 결합하고 있는 구성인 것이 바람직하다.

본 발명의 색소표식단백질복합체의 제조방법은, 중성 또는 약알칼리성의 인산완충액 중에서 단백질을 환원하는 공정, 이 완충액 중에 항체를 첨가하여 단백질복합체를 제작하는 공정, 및 이 완충액 중에 식(1)로 표시되는 시아닌계 색소를 첨가하여 상기 단백질복합체를 표식하는 공정을 포함한다.

또한 중성 또는 약알칼리성의 인산완충액 중에서 단백질을 환원하는 공정, 이 완충액 중에 식(1)로 나타내는 시아닌계 색소를 첨가하여 상기 환원된 단백질을 표식하는 공정, 및 이 완충액 중에 상기 항체를 첨가하는 공정을 포함하는 구성으로도 좋다.

환원된 단백질과 항체를 결합시키는 공정 전에, 항체를 중성 또는 약알칼리성인 인산완중액 중에서 식(2)에 나타내는 바와 같은 숙신이미딜피리딜디티오프로피오네이트를 이용하여 표식하는 공정을 포함시켜도 된다.

어떤 방법에 있어서도, 인산완충액의 pH는 7.0∼8.0의 범위인 것이 바람직하다.

본 발명의 색소표식단백질복합체에 이용할 수 있는 항체는, 특히 제한되어 있지 않고, 그 유래나 서브클래스 등에 관계없이 사용할 수 있다. 예컨대, 면역글로브린(Ig)으로서, 마우스 IgG, 마우스 IgM, 마우스 IgA, 마우스 IgE, 래트 IgG,래트 IgM, 래트 IgA, 래트 IgE, 토끼 IgG, 토끼 IgM, 토끼 IgA, 토끼 IgE, 염소 IgG, 염소 IgM, 염소 IgE, 염소 IgA, 양 IgG, 양 IgM, 양 IgA, 양 IgE 등을 들 수 있다. 이들 항체는, 시판품으로서 입수하여도, 직접 그 동물로부터 채취하여도 좋다.

항체에 결합하는 단백질은, 항체로서의 기능을 발휘하지 않는 단백질이면 된다. 또한 수용성이 풍부한 것이면 보다 바람직하다. 예컨대 혈청유래의 알부민 등은, 항체의 반응을 저해하지 않을뿐더러, 높은 수용성을 가지고 있으므로, 가장 알맞다.

식(1)로 표시되는 시아닌계 색소는, 육안으로 확인하는 것이 용이한 적색계통의 색소로, 공역탄소의 수가 적기 때문에, 시아닌계 색소 중에서는 가장 수용성이 풍부하다.

식(1)에서, X로 표시되는 할로겐으로서는, 예컨대, 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 들 수 있다. 또한, M으로 표시되는 금속으로서는, 리튬, 나트륨 및 칼륨 등을 들 수 있다.

이하에, 항체와 시아닌계 색소의 결합반응의 메카니즘을 설명한다.

우선, 식(3)에 나타내는 바와 같이, 항체에 대하여, 숙신이미딜기를 가지는 시아닌계 색소를 배합하면, 상기 색소의 숙신이미딜기의 에스테르결합부분에, 항체의 아미노기가 접근한다.

그리고 식(4)에 나타내는 바와 같이, 상기 아미노기와 상기 에스테르결합부분이 반응하고, 상기 아미노기로부터 수소원자를 1개 빼앗긴다. 그리고, 이 아미노기로부터 탈리한 수소원자는, 상기 숙신이미딜기의 숙신이미드와 결합한다. 숙신이미드는 숙신이미딜기로부터 히드록시숙신이미드가 되어 탈리하고, 이와 동시에, 상기 숙신이미딜기의 나머지 부분과, 상기 수소원자를 1개 빼앗긴 아미노기가 아미드결합을 형성하고, 이 아미드결합에 의하여 상기 색소와 상기 항체가 결합한다.

또한, 이하에 식(1)로 나타내는 시아닌계 색소의 합성경로의 일예를 나타낸다.

우선, 히드라디노벤젠술폰산(5)과 이소프로필메틸케톤을 산성용매에 용해하여 가열함으로써 인도레늄술포네이트(6)를 제작한다. 그리고, 인도레늄술포네이트(6)의 알콜용액에 금속수산화물포화의 알콜용액을 가함으로써, 인도레늄술포네이트의 금속염(7)을 얻는다.

다음에, 상기 금속염(7)의 유기용매용액에 포화지방산의 할로겐화물을 가하고, 가열하여 카르복시알킬인도레늄술포네이트의 금속염(8)을 얻는다. 상기 포화지방산의 탄소수는, 물에의 용해성을 생각하여, 1∼4가 바람직하다.

그리고, 상기 금속염(8)과 N-카르복시에틸-3,3-디메틸인도레닌을 염기성유기용매에 용해하고, 가열함으로써 카르본산 유도체(9)를 제작하고, 마지막으로 상기 카르본산 유도체(9)의 유기용매용액 중에 히드록시호박산이미드와, 축합제로서 디시클로헥실카르보디이미드를 가하여 교반함으로써, 식(1)로 나타내지는 시아닌계표식색소를 얻는다.

또한, 식(1), 식(8) 및 식(9)로 나타내는 각 화합물에 포함되는 할로겐으로서는, 예컨대 불소, 염소, 브롬, 요오드를 들 수 있다. 또한 식(1), 식(7)∼식(9)로 나타나는 각 화합물에 포함되어 있는 금속으로서는, 예컨대 리튬, 나트륨, 칼륨 등을 들 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 들어, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

(실시예1)

(1)마우스 IgG의 숙신이미딜피리딜디티오프로피오네이트표식

5 mg(3.3×10^-5mmol)의 마우스 IgG(이하, IgG로 칭한다)를 2 ml의 인산완충액(이하, PBS라고 한다.)에 용해하였다. 이것을 실온에서 교반하면서 숙신이미딜피리딜디티오프로피오네이트(이하, SPDP 라고 한다.)의 에탄올용액 0.1 ml를 적하하였다. 적하한 SPDP의 에탄올용액 중에는, 0.52mg (1.67×10^-3mmol)의 SPDP가 포함되어 있었다.

이후, 실온에서 30분간 교반한 후, 세파로스겔(팔마시아사제품;세파덱스 G25M 칼럼)을 사용하여 여과하고, 약 6 ml의 SPDP표식 IgG(이하, IgG-SPDP라 한다.)의 PBS용액을 얻었다. 얻어진 용액의 농도 및 항체에 대한 SPDP의 결합분자수를 다음과 같이 계산하여 구하였다.

우선, 얻어진 용액을 0.5 ml 취하고, 280 nm에서의 흡광도를 측정한 결과, 흡광도는, 1.25이었다.

다음에 이 용액에 0.025 ml의 100 mM의 디티오슬레이토르(이하, DTT라 한다)수용액을 가하여, 1분간 정치한 후, 343 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 얻어진 흡광도는 0.39였다.

IgG에는 343 nm에 흡수가 없으므로, 관측된 343 nm의 흡광은 DTT에 의한 환원에 의하여 방출된 티오피리돈에 유래하는 것이다. 이 방출티오피리돈은 SPDP의 피리딜디티오기가 환원된 것으로, 이 농도는 항체에 결합되어 있는 SPDP의 농도와 동등한다. 따라서 SPDP의 농도[SPDP]는, 다음과 같이 구할 수 있다. 단, 티오피리돈의 343 nm에 있어서의 몰흡광계수를 8.08×10^-3으로 하였다.

[SPDP]＝0.39/(8.08×10³)＝4.83×10^-5(M)

또한, 관측된 280 nm의 흡광은 IgG에 유래하는 것이지만, 결합하고 있는SPDP가 280 nm에도 흡수를 가지므로, 이 영향을 빼고 IgG의 농도[IgG]를 구하면 다음과 같이 된다. 단, IgG에 유래하는 280 nm의 흡광도를 Ab_280,IgG.으로 하고, SPDP의 280 nm에 있어서의 몰흡광계수를 5.1×10³, IgG의 280 nm에 있어서의 몰흡광계수를 2.10×10⁵으로 하였다.

Ab_280,IgG.＝1.25－(4.83×10^-5×5.1×10³)＝1.00

[IgG]＝1.00/(2.10×10⁵)＝4.78×10^-6(M)

따라서, IgG 1분자당 결합한 SPDP의 분자수는 다음과 같이 되었다.

[SPDP]/[IgG]=4.83×10^-5/4.78×10^-6=10.1(개)

(2) 소혈청알부민의 디티오슬레이토르에 의한 환원

110 mg의 소혈청알부민(이하, BSA라고 한다)을 10 ml의 PBS에 용해하고, 이에 1 ml의 PBS에 용해한 77 mg의 DTT를 가하여 실온에서 15분간 교반하였다. 신중하게 세파덱스 G25M 칼럼을 이용하여 겔여과하고, 약 24 ml의 BSA(SH 유리)의 PBS용액을 얻었다.

(3) 단백질복합체(IgG-SPDP-BSA)의 제작

얻어진 BSA(SH유리)용액은, 신중하게 상기에서 얻어진 IgG-SPDP의 PBS용액(6 ml)과 혼합하고, 4℃에서 20시간 정치하였다. 미반응의 BSA를 제거하기 위하여, PBS에 방부제로서 나트륨아지드를 첨가한 용액(이하, PBS·Az라고 한다) 20리터(5리터×4)에 대하여 투석하고, 약 2.5 ml인 IgG-SPDP- BSA의 PBS용액을 얻었다.

(4)단백질복합체(IgG-SPDP-BSA)의 색소에 의한 표식

식(1)로 나타내는 색소 122.7 mg을 1 ml의 PBS에 용해하고(총단백량의 400배등량), 색소용액(이하, SLIC1로 한다)을 조제하였다. 단, 식(1)에 있어서의 X는 요오드, M은 칼륨, 탄소수 n은 2의 것을 이용한다.

그리고, SLIC1을, (3)에서 얻어진 IgG-SPDP-BSA 용액(총단백량을 3.18×10^-4mmol으로 한다.)에 천천히 적하하였다. 그후, 4℃에서 20시간 정치한 후, 미반응의 색소분자를 제거하기 위하여, 20리터의 PBS·Az에 대하여 투석하고, 약 26 ml의 SLIC1표식단백질복합체인 PBS용액을 얻었다. 얻어진 SLIC1표식단백질복합체인, 단백질복합체 1분자당의 SLIC1의 분자수를 다음과 같이 계산하여 구하였다.

얻어진 용액의 430 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 80이었다. IgG-SPDP-BSA는 430 nm에서 흡수하지 않기 때문에, 관측된 흡광은, 결합한 SLIC1에 연유되는 것이다. 따라서, SLIC1의 농도[SLIC1]은, 다음과 같이 구할 수 있다. 단, SLIC1의 430 nm에서의 몰흡광계수를 1×10⁵으로 한다.

[SLIC1]=80/1×10⁵=8.0×10^-4(M)

SLIC1표식단백질복합체인 PBS용액중의 IgG의 농도[IgG]를 1.06×10^-6M(SPDP표식이후의 각 스텝에서, IgG의 손실이 없는 것으로 한다)으로서, 단백질복합체 1분자당 SLIC1의 분자수를 구하면 다음과 같이 된다.

[SLIC1]/[IgG]=8.0×10^-4/1.06×10^-6＝755(개)

실시예2

(1) IgG의 SPDP에 의한 표식

실시예1에서 나타낸 방법에 따라, IgG의 SPDP표식을 행하였다. 전체량은 6 ml, IgG농도는 4.10×10^-6M, 그리고 IgG 1분자당 SPDP의 분자수는 11.5개였다.

(2) BSA-SLIC1의 제작

110 mg(1.62×10^-3mmol)의 BSA를 10 ml의 PBS에 용해하였다. 다음에 이것을 실온에서 교반하면서 SLIC1를 천천히 1 ml 적하하였다. 단, 적하한 SLIC1중에는, 실시예1과 같은 색소가, 162.7 mg(0.162 mmol, 100등량)이 포함되어 있었다.

이후, 4℃에서 하룻밤 교반한 후, 20리터(5리터×4)인 PBS·Az에 대하여 투석하고, 6 ml의 SLIC1표식 BSA의 PBS용액을 얻었다. 용액의 농도, 및 BSA1 분자당 결합하고 있는 SLIC1의 분자수를 다음과 같이 계산하여 구하였다.

얻어진 용액의 280 nm 및 430 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 각각 9.6 및 59.0이었다. BSA는 430 nm에서 흡수하지 않기 때문에, 관측된 430 nm의 흡광은, BSA에 결합한 SLIC1에 연유되는 것이다. 따라서, SLIC1의 농도[SLIC1]은, 다음과 같이 구할 수 있다. 단, SLIC1의 430 nm에서의 몰흡광계수를 1×10⁵으로 한다.

[SLIC1]=59.0/1×10⁵=5.9×10^-4(M)

또한, 관측된 280 nm의 흡광은 BSA에 유래하는 것이지만, 결합하고 있는SLIC1이 280 nm에도 흡수를 가지므로, 이 영향을 빼고 BSA의 농도[BSA]를 구하면 다음과 같이 된다. 단, BSA에 유래하는 280 nm의 흡광도를 Ab_280,BSA으로 하고, SLIC1의 280 nm에 있어서의 몰흡광계수를 9.8×10³, BSA의 280 nm에 있어서의 몰흡광계수를 4.36×10⁴으로 하였다.

Ab_280,BSA＝9.6－(5.9×10^-4×9.8×10³)＝3.818

[BSA]＝3.818/4.36×10⁴＝8.76×10^-5(M)

따라서, BSA 1분자당 결합한 SLIC1의 분자수는 다음과 같이 된다.

[SLIC1]/[BSA]=5.9×10^-4/8.76×10^-5=6.7(개)

(3) BSA-SLIC1의 DTT환원

상술한 BSA-SLIC1용액(110 mg, 13 ml)에, 1 ml의 PBS에 용해한 100 mg의 DTT(최종농도 50 mM)를 가하여 실온에서 15분간 교반하였다. 신중하게 세파덱스 G25M 칼럼을 이용하여 겔여과하고, 약 24 ml의 BSA-SLIC1(SH 유리)의 PBS용액을 얻었다.

(4) 색소표식단백질복합체의 제작

얻어진 BSA-SLIC1(SH 유리)용액과, 상술한 SPDP표식 IgG용액을 혼합하여, 4℃에서 하룻밤 교반한 후, 20리터의 PBSㆍAz에 대하여 투석하고, 미반응의 BSA-SLIC1를 제거하였다. 약 30 ml인 색소표식단백질복합체의 PBS용액을 얻었다. 얻어진 SLIC1표식단백질복합체 1분자당 SLIC1의 분자수를 다음과 같이 계산하여 구하였다.

얻어진 용액의 430 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 30.2이었다. IgG는 430 nm에서 흡수하지 않기 때문에, 관측된 흡광은, BSA에 결합한 SLIC1에 연유되는 것이다. 따라서, SLIC1의 농도[SLIC1]은, 다음과 같이 구할 수 있다. 단, SLIC1의 430 nm에서의 몰흡광계수를 1×10⁵으로 한다.

[SLIC1]=30.2/1×10⁵=3.02×10^-4(M)

SLIC1표식단백질복합체인 PBS용액중의 IgG의 농도[IgG]를 8.20×10^-7M(SPDP표식이후의 각 스텝에서, IgG의 손실이 없는 것으로 한다)으로서, 단백질복합체 1분자당 SLIC1의 분자수를 구하면 다음과 같이 된다.

[SLIC1]/[IgG]=3.02×10^-4/8.20×10^-7＝368(개)

상기와 같이, 본 발명에 의한 색소표식단백질복합체는, 단백질 1분자당 결합하고 있는 색소분자수가 근사적으로 종래법의 약 10 배가 된다. 그 때문에, 예컨대 면역크로마토를 이용한 센서에 도입하면 고감도의 센서를 제작할 수 있다.

Claims

디설파이드결합에 의하여 단백질과 결합한 항체로 이루어지는 단백질복합체, 및 이하의 식(1)로 나타내는 시아닌계 색소로 이루어지며, 상기 단백질복합체가 상기 시아닌계 색소로 표식되어 있는, 색소표식단백질복합체.

(단, R₁및 R₂는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알칼리금속, n은 1∼4의 정수를 나타낸다.)
제 1 항에 있어서, 상기 색소의 골격이 상기 시아닌계 색소의 숙신이미딜기 유래의 아실탄소와 상기 단백질복합체의 아미노기 유래의 질소와의 공유결합에 의해 단백질복합체에 결합하고 있는 색소표식단백질복합체.
중성 또는 약알칼리성의 인산완충액 중에서 단백질을 환원하는 공정, 이 완충액 중에 항체를 첨가하여 단백질복합체를 제작하는 공정, 및 이 완충액 중에 이하의 식(1)로 표시되는 시아닌계 색소를 첨가하여 상기 단백질복합체를 표식하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 중합된 항체를 표식하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 색소표식단백질복합체의 제조방법.

(단, R₁및 R₂는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알칼리금속, n은 1∼4의 정수를 나타낸다.)
중성 또는 약알칼리성의 인산완충액 중에서 단백질을 환원하는 공정, 이 완충액 중에 이하의 식(1)로 표시되는 시아닌계 색소를 첨가하여 상기 환원된 단백질을 표식하는 공정 및 이 완충액 중에서 상기 항체를 첨가하는 공정을 포함하는 것을 특징으로 하는 색소표식단백질복합체의 제조방법.

(단, R₁및 R₂는 수소 또는 알킬기, X는 할로겐, M은 수소 또는 알칼리금속, n은 1∼4의 정수를 나타낸다.)