KR100683025B1

KR100683025B1 - 뉴클레오티드쇄 수식방법

Info

Publication number: KR100683025B1
Application number: KR1020057017735A
Authority: KR
Inventors: 시게키 조코
Original assignee: 마츠시타 덴끼 산교 가부시키가이샤
Priority date: 2003-06-30
Filing date: 2004-06-29
Publication date: 2007-02-15
Anticipated expiration: 2024-06-29
Also published as: EP1647592A1; EP1647592A4; CA2517167C; CA2517167A1; EP1647592B1; ATE425250T1; KR20060021288A; DE602004019926D1; US20070077629A1; WO2005014808A1

Abstract

히포크산틴(Hx) 등의 특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열이 3'측에 존재하는 수식대상의 뉴클레오티드쇄(Ⅰ)에, 상기 특정 염기를 포함한 뉴클레오티드에 특이적인 분해효소를 작용시켜서 뉴클레오티드쇄(Ⅰ)의 3'말단에 소정 수식물질(예를 들면 아미노기를 가지는 NH2R)에 대해서 결합능을 가지는 관능기(예를 들면 알데히드기)를 부여하고, 이 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 상기 수식물질을 결합시키는 뉴클레오티드쇄 수식방법이다. 효소기질이 되는 특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열이 3'측에 존재하는 뉴클레오티드쇄를 수식대상으로 함으로써, 상기 뉴클레오티드 배열부분만을 분해해서, 소정 수식물질과 반응해서 결합하는 관능기를 형성하는 방법이다. 이와 같이 함으로써, 뉴클레오티드쇄를 수식물질로 직접 수식할 수 있고 간편하게 라벨화, 표식화할 수 있음과 아울러, 뉴클레오티드쇄의 고정화를 목적으로 할 경우에는, 수식물질을 링커로서 안정, 강고한 고정을 행하는 것이 가능하게 된다.

Description

뉴클레오티드쇄 수식방법{METHOD OF MODIFYING NUCLEOTIDE CHAIN}

본 발명은, 뉴클레오티드쇄 수식방법에 관한 것이고, 특히 뉴클레오티드쇄의 3'말단을 수식물질로 직접적으로 수식해서, 뉴클레오티드쇄를 라벨화, 표식화, 고정화하는 방법에 관한 것이다.

종래, 유전자해석에 있어서는, DNA, RNA, 올리고뉴클레오티드, 핵산 등의 뉴클레오티드쇄를 라벨화, 표식화하기 위한 수식물질로서 방사성 동위원소가 채용되어 왔지만, 반감기에 의한 취급기간의 제한, 취급장소의 제한, 피폭의 문제, 폐기의 문제 등이 있기 때문에, 그 이용은 감소경향에 있다. 최근에는, 방사성 동위원소에 대체하는 수식물질로서, 플루오레세인 등의 형광물질 혹은 비오틴 등을 이용해서 뉴클레오티드쇄를 수식하여 라벨화, 표식화하는 방법이 범용되게 되었다. 뉴클레오티드쇄를 수식하는 방법은, 5'말단수식법, 3'말단수식법, 내부수식법의 3가지로 대별할 수 있다.

5'말단수식법으로서는, 5'말단의 인산기를 통해서 비오틴으로 수식하는 방법이 고안되고 있다(예를 들면, 하기의 비특허문헌1 참조). 비오틴에 대해서는, 비오틴과 아비딘의 고친화성을 이용해서 알칼리포스파타아제, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 등의 효소로 수식하고, 이들 효소의 화학발광을 이용해서 유전자해석을 고감도화하는 방법이 보고되고 있다(예를 들면, 비특허문헌2~3 참조). 뉴클레오티드의 5'말단의 인산기를 통한 수식방법은, 이들 이외에도 다수 제안되고 있다(예를 들면, 특허문헌1 및 비특허문헌4~13 참조).

그러나 5'말단의 인산기를 통한 수식방법으로는, 뉴클레오티드쇄로의 수식물질의 수식량은 기본적으로 1개이고, 알칼리포스파타아제는 뉴클레오티드의 5'말단의 인산기를 해리(解離)시키므로, 고감도화를 실현하기 위해 알칼리포스파타아제와 조합하는 것은 기본적으로 피할 필요가 있다. 또한 알칼리포스파타아제는 공기 중에 부유하는 세균 중에도 존재하고 있고, 유전자해석 중에 협잡된 경우는, 5'말단의 인산기에 결합된 수식물질이 해리되기 쉬운 등, 수식상태에 안정성을 해치게 되어 백그라운드 노이즈의 요인도 된다. 또한, 5'말단수식법으로서 번용되는 포스포로아미다이트법은, 반응이 완전히 진행되지 않기 때문에, 미반응물을 액체 크로마토그래피 등으로 분리제거할 필요가 있는 등, 조작이 번잡하다.

내부수식법으로서는, 뉴클레오티드쇄를 복제시키는 반응시에, 라벨화, 표식화를 위한 수식물질로 미리 수식처리를 실시한 데옥시뉴클레오티드 3인산을 뉴클레오티드쇄 내에 주입시킴으로써, 뉴클레오티드쇄를 라벨화, 표식화하는 랜덤 프라이머법 혹은 닉 트랜슬레이션법이 개발되어 있다(예를 들면, 특허문헌4 및 비특허문헌20~22 참조).

이 수식방법은, 유전자 증폭반응인 폴리머라제 연쇄반응, 소위 PCR법(예를 들면, 특허문헌5~8 및 비특허문헌23~25 참조)과 조합시킴으로써 뉴클레오티드쇄의 증폭과 라벨화, 표식화를 동시에 행하는 것이 가능하고(예를 들면, 비특허문헌26 참조), 그것에 의해 유전자해석의 고감도화를 초래하여, 유전자 마이크로어레이로 대표되는 유전자해석의 하이스루풋화를 실현하고 있다(예를 들면, 특허문헌9 및 비특허문헌27~29 참조).

이들 랜덤 프라이머법, 닉 트랜슬레이션법 및 PCR법에 있어서는, 뉴클레오티드의 주입효율, 수식 뉴클레오티드 합성 등의 점으로부터, 티미딘으로 바꾸어서 우라실 혹은 미리 형광물질 등으로 라벨화, 표식화한 우라실을 주입한 뉴클레오티드쇄의 형성이 번용되고 있다. 또한 우라실로 대체하는 이점으로서, PCR법일 때에 반응혼액 중에 협잡되는 외인성 오염유래의 뉴클레오티드쇄에 우라실을 주입시키고, 우라실DNA글리코실라제를 작용시킴으로써 오염유래의 뉴클레오티드쇄의 증폭을 방지하는 방법도 있다(예를 들면, 특허문헌11~13 및 비특허문헌31~33 참조).

그러나 PCR법에 의한 수식물질의 뉴클레오티드쇄내로의 주입은, 주입수가 10~20 혹은 30정도(예를 들면, 비특허문헌30 참조)로 랜덤이고, 완전한 정량화에는 이르고 있지 않다. 또한 데옥시뉴클레오티드 3인산의 라벨화, 표식화처리는 번잡하기 때문에, 임의의 라벨화, 표식화처리체는 누구에게라도 용이하게 얻어지는 것이 아니고, 결과적으로 수식물질의 종류가 한정된다. 또한 뉴클레오티드쇄내에 수식물질이 주입되어 있기 때문에, 유전자해석의 하이브리다이제이션시에, 즉 뉴클레오티드쇄의 2개쇄 형성시에 수식물질에 의한 입체장해는 피할 수 없다. 뉴클레오티드쇄를 당초부터 형광물질 등으로 표식화하는 것에 용도가 한정되는 결점도 있다.

3'말단수식법으로서는, 미리 라벨화, 표식화처리를 실시한 데옥시뉴클레오티드 3인산 혹은 디데옥시뉴클레오티드 3인산을 합성하고(예를 들면, 비특허문헌14 및 특허문헌2 참조), 이 라벨화, 표식화 뉴클레오티드를 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제에 의해 뉴클레오티드쇄의 3'측에 부가시키는 테일링법이 개발되어 있다(예를 들면, 특허문헌3 및 비특허문헌15~18 참조). 이 3'말단수식법은 필요한 상황에 따라서 뉴클레오티드쇄를 수식할 수 있고, 5'말단수식법에 비해서 수식물질의 유지안정성이 높고, 수식부위로서 바람직하기 때문에 범용되고 있다.

그러나 데옥시뉴클레오티드 3인산 혹은 디데옥시뉴클레오티드 3인산의 라벨화, 표식화처리는 번잡하기 때문에, 임의의 라벨화, 표식화처리체는 누구에게라도 용이하게 얻어지는 것이 아니고, 결과적으로 수식물질의 종류가 한정된다. 또한 테일링 단계에서 뉴클레오티드쇄의 3'측에 불필요한 뉴클레오티드 배열이 부가되기 때문에, 특히 데옥시뉴클레오티드 3인산을 이용했을 경우에, 반응조건에 따라서 뉴클레오티드의 부가수가 랜덤으로 되기 때문에(예를 들면, 비특허문헌19 참조) 유전자해석의 고감도화는 실현될 수 있지만 정량성에 과제가 있다. 3'측에 부가된 불필요한 염기배열은 유전자해석의 하이브리다이제이션시에 미스매치의 요인으로도 된다.

여분의 염기의 부가라는 점에서는, 특허문헌10에 있어서, 부가된 우라실의 글리코시드 결합을 우라실 DNA 글리코시다아제에 의해 분해하는 것이 제안되어 있다. 그러나 상술한 랜덤 프라이머법, 닉 트랜슬레이션법, 및 PCR법에 있어서는, 티미딘으로 바꾸어서 우라실을 주입한 뉴클레오티드쇄의 형성이 번용되어 있다. 또한 PCR법시에, 오염유래의 뉴클레오티드쇄의 증폭을 방지하기 위해 이용하는 우라실이, 증폭을 목적으로 하는 뉴클레오티드쇄에도 주입된다. 따라서 우라실을 주입한 뉴클레오티드쇄에 대해서 특허문헌10에 기재된 방법을 적용하면, 3'측에 부가된 우라실 뿐만 아니라 수식대상의 뉴클레오티드쇄 중의 우라실에도 우라실 DNA 글리코실라아제가 작용되어 뉴클레오티드쇄 자체가 분해되어 버린다.

다른 3'말단수식법으로서, 화학합성 뉴클레오티드쇄를 형성시키는 합성초기에 3'말단의 뉴클레오티드에 직접적으로 라벨화, 표식화를 위한 수식물질을 결합시키는 방법도 있고, 뉴클레오티드쇄로의 수식물질의 높은 유지안정성을 실현하고 있다. 그러나 화학합성으로 얻어지는 뉴클레오티드쇄의 뉴클레티드수는 합성부산물, 수율 등의 합성능력의 관계에서 100정도이고, 여기서 사용되고 있는 3'말단으로의 직접적인 수식물질의 결합방법을 생체추출 및 PCR 등으로 증폭한 뉴클레오티드수 100을 넘는 뉴클레오티드쇄의 3'말단수식에 적용할 수는 없다. 즉, 수식되는 뉴클레오티드쇄의 쇄길이에 제한이 있다.

또한, 이들 3종류의 수식방법은 뉴클레오티드쇄가 2개쇄의 상태로 존재할 때에 한쪽의 뉴클레오티드쇄만을 선택적으로 수식하는 것은 곤란하다. 즉, 종래의 방법으로 뉴클레오티드쇄를 라벨화, 표식화할 경우, 통상은 2개쇄의 상태로 존재하고 있는 뉴클레오티드쇄의 양쇄가 동시에 수식되어 버려서, 어느 한쪽의 뉴클레오티드쇄를 선택적으로 수식하거나, 또 한쪽의 뉴클레오티드쇄를 분리제거하는 것은 곤란하다. 그 때문에, 2개쇄 중의 한쪽의 뉴클레오티드쇄에 포함되는 유전자정보를 해석할 때에, 정보를 필요로 하지 않는 또 한쪽의 뉴클레오티드쇄도 해석에 제공되어 유사결과를 초래하는 요인이 되고 있다.

한편, 뉴클레오티드쇄의 수식은, 라벨화, 표식화 외에 뉴클레오티드쇄를 기 판에 고정하기 위해 행해지고 있다. 이것을 위한 기판은 당초, 소수성과 정전하의 한쪽 또는 양쪽을 가지는 니트로셀룰로오스, 나일론, 불화폴리비닐리덴으로 이루어지는 것이 이용되고 있었지만, 고정화된 뉴클레오티드쇄가 해리되어 버리는 일이 있었다. 최근에는, 뉴클레오티드쇄의 5'말단 혹은 3'말단에 아미노기, 알데히드기 등의 관능기를 가지게 하는 수식처리를 실시하는 한편으로, 유리, 실리콘 등의 기판을 이용하여, 그 표면이 알데히드기 혹은 에폭시기 혹은 아미노기가 되도록 미리 처리를 실시함으로써, 뉴클레오티드쇄를 기판에 고정화하는 방법이 취해진다. 이와 같은 방법으로 배열이 다른 뉴클레오티드쇄를 기판 단위면적당 다수 고정화함으로써, 유전자해석 마이크로 어레이를 실현하고 있다. 그러나 이 뉴클레오티드쇄의 고정화에 있어서도, 상술한 뉴클레오티드쇄의 수식의 문제가 존재한다.

(특허문헌)

1 일본 특허 1706289호

2 일본 특허공개 소61-115094호

3 일본 특허공고 평7-31194호

4 일본 특허공표 2000-508709호

5 일본 특허 1814713호

6 일본 특허 2093730호

7 일본 특허 2093731호

8 일본 특허 2613877호

9 일본 특허공표 평10-503841호

10 일본 특허출원 2002-049055호

11 일본 특허 2103155호

12 일본 특허공표 2000-502251호

13 일본 특허공개 평11-113599호

(비특허문헌)

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26 데이(Day.P.J.R.) 외, Biochem.J., 267권, 119페이지, 1990년

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29 핵산 마이크로 어레이 특집, Nature Genet., 21권 Supplement, 1월, 1999년

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31 롱고(Longo.M.C.) 외, Gene, 93권, 125페이지, 1990년

32 손톤(Thornton.C.G.) 외, BioTechnigues, 13권, 180페이지, 1992년

33 소벡(Sobek.H.) 외, FEBS Lett., 388권, 1페이지, 1996년

본 발명은, 상기 종래의 문제점을 감안하여 이루어진 것으로, 뉴클레오티드쇄의 염기구성에 관계없이, 뉴클레오티드쇄의 분해를 따르지 않고, 3'말단부에 수식물질을 직접적으로 수식할 수 있는 뉴클레오티드쇄 수식방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은, 1개쇄의 뉴클레오티드쇄의 3'말단뿐만 아니라, 2개쇄를 형성하고 있는 한쪽의 뉴클레오티드쇄의 3'말단도 선택적으로 간편하게 수식할 수 있는 뉴클레오티드 수식방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명의 뉴클레오티드쇄 수식방법은, 특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열이 3'측에 존재하는 수식대상의 뉴클레오티드쇄에, 상기 특정 염기를 포함한 뉴클레오티드에 특이적인 분해효소를 작용시켜서 상기 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 소망의 수식물질에 대해서 결합능을 가지는 관능기를 부여하고, 상기 관능기를 가진 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 상기 수식물질을 결합시키는 것을 특징으로 한다. 효소기질로 되는 특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열이 3'측에 존재하는 뉴클레오티드쇄를 수식대상으로 함으로써, 상기 뉴클레오티드 배열부분만을 분해해서, 소망의 수식물질과 반응해서 결합되는 관능기를 형성하는 것이다. 이와 같이 함으로써 뉴클레오티드쇄를 수식물질로 직접 수식할 수 있고, 간편하게 라벨화, 표식화 가능하게 됨과 아울러, 뉴클레오티드쇄의 고정화를 목적으로 할 경우에는, 수식물질을 링커(linker)로서 안정, 강고한 고정을 행하는 것이 가능하게 된다.

특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열이, 주쇄가 되는 뉴클레오티드쇄의 3'측에 위치하고, 상기 특정 염기가 상기 주쇄에 존재하지 않는 염기인 것이 바람직하다. 이것에 의해, 분해효소가 작용해도 주쇄부분이 분해되는 것을 회피할 수 있고, 주쇄부분의 배열정보가 완전하게 유지된 상태를 유지할 수 있게 된다. 뉴클레오티드쇄의 배열정보를 정의하기 위해서는, 적어도 10염기 전후의 뉴클레오티드 배열을 가지는 것이 바람직하다.

특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열을, 주쇄로 되는 뉴클레오티드쇄의 3'측에 부가해도 된다. 효소기질이 되는 염기를 가진 뉴클레오티드를 의도적으로 부가시키는 방법이다. 수식대상의 뉴클레오티드쇄가 1개쇄인지 2개쇄인지 관계없이, 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 한정해서, 수식물질로 간편하게 수식하는 것이 가능하다. 부가되는 뉴클레오티드 배열을 적절히 선택함으로써, 불필요한 염기배열의 주입도 배제된다.

상세하게는, 수식대상이 되는 1개쇄 뉴클레오티드에, 상기 뉴클레오티드쇄의 3'말단영역에 상보적인 배열을 3'말단영역에 가지는 뉴클레오티드쇄를 어닐(anneal )하여, 상기 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'측에 특정 염기를 포함한 상보적인 뉴클레오티드 배열을 부가할 수 있다.

또한, 적어도 한쪽의 뉴클레오티드쇄를 수식대상으로 하는 2개쇄 뉴클레오티드를, 수식대상인 뉴클레오티드쇄의 3'말단영역의 염기배열을 특이적으로 인식하는 제한효소로 절단하고, 절단한 수식대상인 뉴클레오티드쇄의 3'측에 특정 염기를 포함한 상보적 뉴클레오티드 배열을 부가할 수 있다.

또한, 2개쇄 뉴클레오티드 중 적어도 한쪽인 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'말단측에 특정 염기를 포함한 뉴클레오티드 배열을 5'말단영역에 가진 2개쇄 뉴클레오티드를 DNA 리가아제로 접합하고, 접합한 뉴클레오티드쇄의 상기 특정 염기보다 3'말단측의 염기배열을 특이적으로 인식하는 제한효소로 절단함으로써, 상기 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'측에 특정 염기를 포함한 뉴클레오티드 배열을 부가할 수 있다.

뉴클레오티드 배열의 부가는, DNA 폴리머라제를 이용해서 뉴클레오티드를 주입함으로써 행할 수 있다.

특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열이 존재하는 뉴클레오티드쇄는, 화학합성된 뉴클레오티드쇄여도 된다.

분해효소를 작용시키기에 앞서, 특정 염기와 상보적인 염기배열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 첨가하는 것이 바람직하다. 2개의 뉴클레오티드의 염기 사이에 상보적 결합을 생기게 함으로써, 효소의 기질특이성을 높일 수 있고, 반응효율을 향상시키는 것이 가능하게 된다.

수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 예를 들면 알데히드기를 부여할 수 있다. 구체적으로는 분해효소로서 DNA 글리코시다아제를 사용함으로써, 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 알데히드기를 부여할 수 있다. 보다 구체적으로는 특정 염기가 히포크산틴일 때에 분해효소로서 3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제를 사용함으로써 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 알데히드기를 부여할 수 있다.

특정 염기 및 분해효소는 여러 가지 조합이 가능하지만, 예를 들면 우라실의 뉴클레오티드쇄로의 주입은, 유전자해석의 여러 방법 중에서 범용되고 있기 때문에, 이것을 특정 염기로서 이용하는 것은 바람직하지 않을 경우가 있다. 범용빈도가 낮은 히포크산틴과 그 분해효소를 이용함으로써, 뉴클레오티드쇄의 3'말단수식을 실시할 때의 이용자의 편리성을 대폭 향상하는 것이 가능하게 된다. 또한, 뉴클레오티드쇄의 염기의 구성이나 쇄길이에 관계없이, 뉴클레오티드쇄의 3'말단측을 직접적으로 간편하게 임의의 수식물질로 정량적, 안정적으로 수식하는 것이 가능하게 된다. 뉴클레오티드쇄내로의 불필요한 염기배열, 수식된 염기의 주입을 배제하고, 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 한정해서 수식물질로 수식할 수 있는 방법이다.

상기한 히포크산틴과 3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제와의 조합 외, 예를 들면 이하의 표 1에 나타내는 조합을 이용해도 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 알데히드기를 부여할 수 있다.

뉴클레오티드쇄 3'측에 주입하는 뉴클레오티드의 염기	적용하는 DNA 글리코시다아제· DNA 수복효소
·히포크산틴	·히포크산틴 DNA 글리코시다아제
·3-메틸아데닌 ·3-에틸아데닌	·3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제Ⅰ형
·3-메틸아데닌 ·히포크산틴 ·크산틴 ·3-메틸구아닌 ·7-메틸구아닌 ·1,N⁶-에타노아데닌 ·8-옥소구아닌 ·7-에틸푸린 ·3-에틸푸린 ·7,3-디에틸푸린 ·1-카르복시에틸아데닌 ·7-카르복시에틸구아닌 ·O²-메틸피리미딘 ·7(2-에톡시에틸)구아닌 ·7(2-히드록시에틸)구아닌 ·7(2-클로로에틸)구아닌 ·1,2-비스(7-구아닐)에탄 ·3-에틸티오에틸푸린 ·N² ^,3-에타노구아닌 ·N² ^,3-에타노구아닌 ·5-히드록시메틸우라실 ·5-포르밀우라실 ·1,N⁴-에테노시토신 ·1,N²-에테노구아닌 ·3,N²-에테노구아닌	·3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제Ⅱ형
·우라실 ·5-히드록시우라실 ·5,6-디히드록시우라실 ·5-플루오로우라실	·우라실 DNA 글리코시다아제

뉴클레오티드쇄 3'측에 주입하는 뉴클레오티드의 염기	적용하는 DNA 글리코시다아제· DNA 수복효소
·티민글리콜 ·5,6-디히드로티민 ·5,6-디히드록시디히드로티민 ·히드록시시토신 ·우레아 ·5-히드록시-5-메틸히단토인 ·6-히드록시-5,6-디히드록시피리미딘 ·5-히드록시우라실 ·5-히드록시-6-히드로티민 ·5,6-디히드로우라실 ·우라실글리콜 ·5-히드록시-6히드로우라실	·엔도뉴클레아제Ⅲ
·8-옥소구아닌 ·7,8-디히드로-8-옥소구아닌 ·8-옥소아데닌 ·포름아미드구아닌 ·메틸포름아미드구아닌	·8-옥소구아닌 DNA 글리코시다아제
·7-메틸구아닌 ·1,6-디아미노-5-포름아미드피리미딘 ·포름아미드구아닌 ·메틸포름아미드구아닌 ·포름아미드아데닌 ·8-옥소아데닌 ·8-옥소구아닌 ·7,8-디히드로-8-옥소구아닌 ·히드록시시토신 ·5-히드록시우라실 ·아플라톡신 결합 이미드졸 개환상 구아닌 ·이미다졸 개환상 N-2-아미노플루오렌-8- 구아닌	·포름아미드피리미딘 DNA 글리코시다아제
·8-옥소구아닌 ·아데닌/구아닌 미스매치	·MutY-DNA글리코시다아제
·1,N⁴-에테노시토신 ·우라실/구아닌 미스매치	·미스매치 우라실 DNA 글리코시라아제
·피리미딘다이머	·피리미딘다이머 DNA 글리코실라아제
·티민/구아닌 미스매치 ·구아닌/구아닌 미스매치	·티민 DNA 글리코시다아제

수식물질은, 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 부여되는 관능기와 결합을 형성하는 아미노기를 가지는 것을 바람직하게 사용할 수 있다.

수식물질은, 뉴클레오티드쇄를 라벨화, 표식화하는 물질이어도 된다. 이것에 의해, 수식된 뉴클레오티드쇄를 유전자해석에 있어서의 검출 프로브 혹은 타겟으로서 사용할 수 있다.

그와 같은 수식물질로서, 형광성 물질, 비타민, 지방질, 아미노산, 올리고펩티드, 단백질 또는, 생체외인성 물질을 바람직하게 사용할 수 있다. 아미노산, 올리고펩티드, 단백질은 아미노기를 가지고 있기 때문에, 그 외의 것은 아미노기를 가지게 함으로써 뉴클레오티드쇄의 3'말단의 알데히드기와 융합시키는 것이 가능하게 된다. 이것에 의해 뉴클레오티드쇄에 형광성 물질, 비타민, 지방질, 아미노산, 올리고펩티드, 단백질 또는, 생체외인성 물질이 가지는 기능을 부가할 수 있다.

수식물질은, 유전자해석을 위한 기판으로의 결합능을 가진 물질이어도 된다. 이것에 의해, 수식된 뉴클레오티드쇄를, 검출 프로브 혹은 타겟으로 해서, 기판에 안정적으로 고정화하는 것이 가능하게 된다.

그와 같은 수식물질로서, 아미노알칸티올 또는 아미노실란커플링 화합물을 바람직하게 사용할 수 있다. 이들 화합물은 귀금속제, 유리제 혹은 수지제 기판에 안정적으로 결합할 수 있다.

도 1은, 본 발명의 실시형태1의 뉴클레오티드쇄 수식방법의 원리를 나타낸 설명도이다.

도 2는, 도 1에 나타낸 뉴클레오티드쇄 수식방법의 일부과정으로서, 생성되는 알데히드 유도체를 플루오레세인으로 수식하는 과정의 화학반응식을 나타내는 도면이다.

도 3은, 도 1에 나타낸 뉴클레오티드쇄 수식방법의 일부과정으로서, 생성되 는 알데히드 유도체를 알칸티올로 수식하는 과정, 및 그것을 귀금속 기판에 고정화하는 과정의 화학반응식을 나타내는 도면이다.

도 4는, 본 발명의 실시형태2의 뉴클레오티드쇄 수식방법의 원리를 나타낸 설명도이다.

도 5는, 도 4의 뉴클레오티드쇄의 반응중심부의 화학반응식을 나타내는 도면이다.

도 6은, 본 발명의 실시형태3의 뉴클레오티드쇄 수식방법의 원리를 나타낸 설명도이다.

도 7은, 본 발명의 실시형태4의 뉴클레오티드쇄 수식방법의 원리를 나타낸 설명도이다.

도 8은, 본 발명의 실시형태5의 뉴클레오티드쇄 수식방법의 원리를 나타낸 설명도이다.

도 9는, 본 발명의 실시예1의 뉴클레오티드쇄 수식방법에 있어서의 각 반응과정의 뉴클레오티드쇄의 폴리아크릴아미드 전기영동의 결과를 나타내는 도면이다.

도 10은, 본 발명의 실시예2의 메클레오티드쇄 수식방법에 있어서의 각 반응과정의 뉴클레오티드쇄의 필름노광의 결과를 나타내는 도면이다.

도 11은, 본 발명의 실시예3의 뉴클레오티드쇄 수식방법에 있어서의 각 반응과정의 뉴클레오티드쇄의 폴리아크릴아미드 전기영동 및 필름 노광의 결과를 나타내는 도면이다.

이하, 본 발명의 실시형태를 도면을 참조하면서 설명한다.

(실시형태1)

본 발명의 실시형태1을 도 1에 기초하여 설명한다. 도면 중, l, m 및 n은, 0 또는 임의의 자연수를 나타내고, Base는 아데닌, 구아닌, 시토신, 티민, 우라실 등의 임의의 염기를 나타내며, Hx는 히포크산틴을, Cyt는 시토신을 각각 나타낸다.

임의의 염기배열을 가지는 뉴클레오티드쇄(Ⅰ)와, 2'-데옥시이노신-5'-3인산(A)(이하에 구조를 나타내는 바와 같이 히포크산틴(Hx)을 가지고 있다)에 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제를 작용시킴으로써, 뉴클레오티드쇄(Ⅰ)의 3'말단에 히포크산틴을 함유한 뉴클레오티드의 배열을 부가하여, 뉴클레오티드쇄(Ⅱ)를 얻는다.

얻어진 뉴클레오티드쇄(Ⅱ)에, 시토신을 가진 수십 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드쇄(B)를 어닐시킴으로써, 뉴클레오티드쇄(Ⅲ)를 얻는다.

이 일부 2개쇄로 된 뉴클레오티드쇄(Ⅲ)에 3-메틸아데닌 DNA 글리코실라아제Ⅱ형을 작용시키고, 알칼리 열처리함으로써 히포크산틴을 가지는 뉴클레오티드의 글리코시드 결합을 절단하고, 잔존하는 데옥시리보스인산 결합을 절단해서 3'말단에 알데히드기를 가진 뉴클레오티드쇄(Ⅳ)를 얻는다.

이 뉴클레오티드쇄(Ⅳ)에, 아미노기를 가지는 수식물질(H₂N-R(수식물질에 대해서는 후술한다))을 반응시킴으로써, 뉴클레오티드쇄(Ⅳ)와 수식물질이 탈수축합된 시프 염기, 즉, 3'말단이 수식물질로 직접적으로 수식된 뉴클레오티드쇄(Ⅴ)를 얻는다.

목적으로 하는 뉴클레오티드쇄가 화학합성가능한 수십 뉴클레오티드 쇄길이의 것이면, 미리 특정 염기의 배열을 가지는 뉴클레오티드쇄를 합성해 둠으로써, 제 1 단계의 반응을 생략하는 것도 가능하다.

도 2에 나타내는 바와 같이 3'말단에 알데히드기를 가진 뉴클레오티드쇄(Ⅳ)에 대해서 형광물질로서 알려지는 플루오레세인카다베린(C)을 반응시키면, 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 직접적으로 플루오레세인카다베린이 결합된 수식 뉴클레오티드쇄(Ⅵ)가 얻어진다.

이와 같이 해서 플루오레세인으로 수식함으로써, 뉴클레오티드쇄를 형광라벨화(표식화)할 수 있고, 이 뉴클레오티드를 하이브리다이제이션 등의 유전자해석을 위한 프로브 혹은 타겟으로서 이용할 수 있게 된다.

도 3에 나타내는 바와 같이 3'말단에 알데히드기를 가진 뉴클레오티드쇄(Ⅳ)에 대해서 아미노기를 가지는 티올, 여기서는 8-아미노-1-옥탄티올(D)을 반응시키면, 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 직접적으로 8-아미노-1-옥탄티올 잔기가 결합된 수식 뉴클레오티드쇄(Ⅶ)가 얻어진다.

이 수식 뉴클레오티드쇄(Ⅶ)를 귀금속 기판(E)에 작용시킴으로써 티올기와 기판(E)의 강고한 공유결합을 형성시켜서, 뉴클레오티드쇄(Ⅶ')를 기판(E)에 고정화할 수 있다.

이와 같이 해서 기판(E)에 고정화함으로써, 귀금속을 기판으로서 이용하는 전기화학적 측정법, 수정발진자 마이크로 밸런스법, 표면 플라스몬 공명법 등의 측정법을 유전자해석에 이용하는 것이 가능하게 된다.

또한, 뉴클레오티드쇄를 라벨화, 표식화하기 위한 수식물질은, 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 부여되는 관능기에 대한 결합능을 가지고 있으면 좋다. 예를 들면, 형광성 물질인 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, Cy3·Cy5로 대표되는 시아닌 화합물, 혹은 비형광물질인 비오틴, 디곡시게닌 등은, 아미노기를 말단에 형성함으로써 수식물질로서 사용할 수 있다. 이들 수식물질로 라벨화(표식화)한 뉴클레오티드쇄를 하이브리다이제이션 등의 유전자해석을 위한 프로브 혹은 타겟으로서 이용할 수 있게 된다.

아미노산, 펩티드, 단백질도 수식물질로서 사용가능하다. 아미노산 중, 페닐알라닌, 트립토판, 티로신은 형광성을 가지기 때문에, 라벨화, 표식화에 사용할 수 있다. 형광성을 가지지 않는 아미노산이나 펩티드도, 측쇄에 플루오레세인 등(이하, 표식화합물)을 결합시킴으로써 라벨화, 표식화에 사용할 수 있다.

아미노산이 연쇄된 펩티드는, 그 수에 따른 측쇄가 존재하기 때문에, 복수의 표식화합물을 결합시키는 것이 가능하게 된다. 예를 들면, 트리리신에는 측쇄에 아미노기가 3개 존재하기 때문에, 카르복실기, 숙신이미드기 등을 가지는 표식화합물을 임의로 합계 3개까지 결합시키는 것이 가능하게 된다.

펩티드뿐만 아니라 아미노기를 가지는 알킬, 알릴, 시클로알칸, 방향족, 당류 등의 탄화수소류를 표식화합물로 수식한 물질을 수식물질로서 사용해서, 뉴클레오티드쇄를 수식하는 것도 가능하고, 뉴클레오티드쇄의 라벨화, 표식화를 실현할 수 있다.

또한 예를 들면, 알칼리포스파타아제, 퍼옥시다아제, 유색성, 형광성을 가지는 트랜스페린, 헤모글로빈, 녹색형광 단백, 청색형광 단백, 에쿼린 등의 단백질을 수식물질로서 사용해서, 뉴클레오티드쇄를 라벨화, 표식화하는 것도 가능하고, 유전자해석, 특히 인사이튜(insitu)에서의 하이브리다이제이션에 유용하다.

그 외, 표면에 아미노기를 형성시킨 골드 콜로이드, 실버 콜로이드 등의 귀금속 콜로이드, 자성 미립자, 폴리스티렌비즈 등의 고분자 미립자로 대표되는 미립자 등도, 뉴클레오티드쇄의 수식물질로서 사용할 수 있다.

뉴클레오티드쇄를 귀금속에 고정화하고 싶을 경우는 수식물질로서 알칸티올로 총칭되는 티올 화합물 중에서 아미노기를 가지는 화합물을 채용할 수 있다. 수식물질을 통해서 뉴클레오티드쇄를 귀금속에 고정화할 수 있기 때문에, 귀금속을 기판으로서 이용하는 전기화학적 측정법, 수정발진자 마이크로 밸런스법, 표면 플라즈몬 공명법 등의 측정법을 유전자해석에 이용하는 것이 가능하게 된다.

알칸티올은, 귀금속과 결합하는 티올기와 아미노기가 존재하면, 구조 등에 특별히 한정 없이 사용할 수 있다. 아미노기·티올기 사이의 탄화수소잔기는 직쇄상, 분기쇄상, 시클로환상, 알릴쇄상, 방향환상 등, 여러 가지 형태이어도 좋고, 그 탄소수, 아미노기의 위치 등도 여러 가지로 가능하다.

기판수정발진자 마이크로 밸런스법, 표면 플라즈몬 공명법 등으로는, 금 기판을 범용하지만, 측정법 등에 따라서 백금, 은, 동, 파라듐, 인듐, 니켈, 철, 알루미늄 및 그들의 합금 등도 기판으로서 사용할 수 있다.

수식물질로서, 아미노기를 가지는 실란커플링 화합물을 사용해도 좋고, 그것에 의해 유리, 실리콘, 실리커, 산화알루미늄, 마이카 및 폴리스티렌, 나일론, 에폭시 등의 고분자 수지 등의 기판에 뉴클레오티드쇄를 고정화하는 것이 가능하게 되고, 종래로부터의 여러 가지 유전자해석수법에도 적용가능하게 된다.

실란커플링 화합물은, 아미노기와 알콕시기를 가지는 화합물이면, 알칸티올과 마찬가지로 구조 등에 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 사용가능한 실란커플링 화합물은 예를 들면, 감마-아미노프로필트리에톡시실란, N-베타(아미노에틸)-감마-아미노프로필메틸디메톡시실란, N-베타-(아미노에틸)-감마-아미노프로필트리메톡시실란, N-베타(아미노에틸)-감마-아미노프로필트리에톡시실란, 감마-아미노프로필트리메톡시실란 등이다.

본래는 아미노기를 가지지 않는 물질도 아미노기를 가지는 적당한 스페이서를 개재함으로써, 뉴클레오티드쇄를 수식할 수 있다. 예를 들면 카르복실기를 가지는 물질은, 스페이서로서 1,2-디아미노에탄, 1,6-디아미노헥산 등의 디아미노 구조를 가지는 물질을 개재시킴으로써 뉴클레오티드쇄를 수식할 수 있게 된다.

또한, 히드라딘기, 아미노옥실기, 시아노기를 가지는 물질, 혹은 Grignard 시약과 같이 할로겐화 마그네슘을 가지는 물질도 수식물질로서 사용가능하다.

(실시형태2)

도 4는, 본 발명의 실시형태2의 뉴클레오티드쇄 수식방법의 원리를 나타내고, 도 5는, 도 4의 뉴클레오티드쇄의 반응중심부의 화학반응식을 나타낸다.

도 4 및 도 5에 있어서, N₀은 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 중의 임의의 염기를 나타내고, N₁은 N₀과 상보적 염기쌍을 형성하는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 중의 임의의 염기를 나타낸다. N₂는 N₀과는 상보적 염기쌍을 형성하지 않는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 중의 임의의 염기를 나타내고, N₃은 N₂와 상보적 염기쌍을 형성하는 아데닌, 히포크산틴, 티민, 시토신 중의 임의의 염기를 나타낸다. C는 시토신을 나타내고, Hx는 히포크산틴을 나타내며, 이들 N₀, N₁, N₂, N₃, C, Hx는 모두, 2'-데옥시뉴클레오티드(이하, 간단히 뉴클레오티드라고 한다)에 함유되어 있다. N₀, N₁, N₂, N₃은 일부만 나타낸 것으로 개수를 한정할 의도는 없다.

또한, dITP, dATP, dCTP, dTTP는 각각, 2'-데옥시이노신-5'-3인산, 2'-데옥시아데노신-5'-3인산, 2'-데옥시시티딘-5'-3인산, 2'-데옥시티미딘-5'-3인산을 나타낸다. NH₂-R은, 상술한 바와 같은 아미노기를 가지는 임의의 수식물질을 나타낸다.

수식대상의 뉴클레오티드쇄(2-1:도 4 중의 번호를 나타낸다. 이하 같음)는, 염기(N₀)의 배열을 3'말단영역에 가지고 있다. 이 뉴클레오티드쇄(2-1)에 별도의 뉴클레오티드쇄(2-2)를 어닐시켜서, 2개쇄 뉴클레오티드를 형성한다. 뉴클레오티드쇄 (2-2)는, 뉴클레오티드쇄(2-1)의 3'말단영역의 염기(N₀)와 상보적인 임의의 염기(N₁)의 배열을 3'측에 가지고, 그 바로 5'측에 시토신(C)을 가지며, 계속해서 염기(N₀)와는 상보적이지 않은 임의의 염기(N₂)의 배열을 가지고 있어서, 어닐 후에 5'말단영역이 돌출된다.

이 부분적 2개쇄 뉴클레오티드에, DNA 폴리머라제를 촉매로 해서 dITP, dATP, dCTP, dTTP를 주입시킴으로써, 완전한 2개쇄 뉴클레오티드를 형성한다. 이 때에 형성되는 뉴클레오티드쇄(2-3)는, 뉴클레오티드쇄(2-1)의 3'말단에 뉴클레오티드쇄(2-2)의 1개쇄영역에 상보적인 뉴클레오티드 배열이 부가된 것이 되고, 뉴클레오티드쇄(2-2)의 시토신(C)에 대응하는 히포크산틴(Hx)을 가진다.

형성된 완전한 2개쇄 뉴클레오티드에 대해서 3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제Ⅱ형을 작용시켜, 알칼리 열처리함으로써, 히포크산틴(Hx)을 함유한 뉴클레오티드(데옥시리보스)의 1'위치의 탄소와 산소 사이의 글리코시드 결합을 특이적으로 분해하여, 이것에 의해 형성되는 뉴클레오티드쇄(2-4)의 3'말단에 알데히드기를 부여한다.

이어서, 아미노기를 가진 수식물질(NH₂-R)을 첨가해서, 각각의 알데히드기와 아미노기를 반응시킴으로써 시프 염기를 형성시킨다. 이때에 형성되는 뉴클레오티드쇄(2-5)가 목적산물이고, 출발물질인 뉴클레오티드쇄(2-1)의 3'말단에 직접 수식물질이 결합된 것이 된다.

수식종료 후에, 불필요한 뉴클레오티드쇄(2-2)를 분리제거한다. 이 뉴클레오 티드쇄(2-2)의 제거는, 수식물질이 결합한 2개쇄 뉴클레오티드를 열처리하거나 혹은 뉴클레오티드쇄(2-2)의 5'말단에 인산기를 존재시켜서, 이것을 특이적으로 분해하는 람다엑소뉴클레아제를 작용시킴으로써 용이하게 행할 수 있다. 미리 뉴클레오티드쇄(2-2)의 염기(N₁, N₂)의 구아닌 일부를 히포크산틴을 대신한 것으로 해둠으로써 3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제Ⅱ형에 의해 소단편화할 수도 있다.

(실시형태3)

도 6은, 본 발명의 실시형태3의 뉴클레오티드쇄 수식방법의 원리를 나타낸다. 이 방법에서는, 2개쇄 뉴클레오티드 중, 수식대상으로 하는 한쪽의 뉴클레오티드쇄에, 상술한 3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제Ⅱ형에 대한 기질이 되는 히포크산틴을 함유한 뉴클레오티드 배열을 부가한다.

도면 중, N₀, N₁, N₂, C, Hx, 5' 및 3'는 상기와 같은 뜻이고, N₄는 N₂와 상보적 염기쌍을 형성하는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신 중 어느 하나의 염기를 나타내며, A는 아데닌, G는 구아닌, T는 티민을 각각 나타낸다.

2개쇄 뉴클레오티드는, 제 1의 뉴클레오티드쇄(2-11)와 제 2의 뉴클레오티드쇄(2-12)로 이루어지고, 이 중, 뉴클레오티드쇄(2-11)가 수식대상이다. 뉴클레오티드쇄(2-11)는 3'말단영역에 염기(N₀)의 배열을 가지고, 뉴클레오티드쇄(2-12)는 5'말단영역에 염기(N₁)의 배열을 가지고 있다.

이 2개쇄 뉴클레오티드를 가열처리 혹은 알칼리 처리해서 1개쇄로 분해시키고, 분해된 뉴클레오티드쇄(2-11)에 제 3의 뉴클레오티드쇄(2-13)를 어닐시켜서, 부분적인 2개쇄 뉴클레오티드를 형성한다. 제 2의 뉴클레오티드쇄(2-13)는, 뉴클레오티드쇄(2-11)의 3'말단영역의 염기(N₀)와 상보적인 임의의 염기(N₁)의 배열을 3'측에 가지고, 그 바로 5'측에 시토신(C)을 가지며, 계속해서 염기(N₀) 배열과는 상보적이지 않는 임의의 염기(N₂)의 배열을 가지고 있어서, 어닐 후에 시토신(C)으로부터 5'측이 1개쇄로 된다.

이 부분적 2개쇄 뉴클레오티드에 DNA 폴리머라제를 촉매로 해서 dITP, dATP, dCTP, dTTP를 주입시킴으로써 완전한 2개쇄 뉴클레오티드를 형성한다. 이때에 형성되는 뉴클레오티드쇄(2-14)는, 뉴클레오티드쇄(2-11)의 3'말단에, 뉴클레오티드쇄(2-2)의 1개쇄 영역에 상보적인 뉴클레오티드 배열을 부가한 것으로 되고, 뉴클레오티드쇄(2-2)의 시토신(C)에 대응하는 위치에 히포크산틴(Hx)을 가진다.

이 완전한 2개쇄 뉴클레오티드에 대해서 실시형태2와 같은 조작을 행함으로써, 뉴클레오티드쇄(2-11)의 3'말단에 알데히드기를 부여하고, 수식물질을 결합시켜서 불필요한 뉴클레오티드쇄를 제거할 수 있다.

또한 여기서는 한쪽의 뉴클레오티드쇄만을 수식대상으로 할 경우의 수식방법을 예시했지만, 쌍방의 뉴클레오티드쇄를 수식대상으로 할 경우도 마찬가지로 해서 수식가능한 것은 이해되는 것이다.

(실시형태4)

도 7은, 본 발명의 실시형태4의 뉴클레오티드쇄 수식방법의 원리를 나타낸다. 이 방법은, 2개쇄를 형성하고 있는 뉴클레오티드쇄에 적절한 제한효소 절단부 위가 존재할 경우의 뉴클레오티드쇄 수식방법이다.

도면 중, N₀, N₁, A, G, T, C, Hx는 상기와 같은 뜻을 가지고, N₂, N₄는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 히포크산틴, 우라실 등의 염기 중으로부터 임의로 선택된 서로 상보적인 염기를 나타낸다.

2개쇄 뉴클레오티드는, 제 1의 뉴클레오티드쇄(2-21)와 제 2의 뉴클레오티드쇄(2-22)로 이루어지고, 이 중, 뉴클레오티드쇄(2-21)가 수식대상이다. 뉴클레오티드쇄(2-21)의 3'말단영역(뉴클레오티드쇄(2-22)의 5'말단영역)에는, 제한효소(BamHⅠ)가 인식해서 절단하는 염기배열(GGATCC/CCTAGG)이 존재하고 있다.

우선, 2개쇄 뉴클레오티드를 BamHⅠ에 의해 절단해서, N₀의 3'측에 G만이 존재하는 뉴클레오티드(2-23)와, N₁의 5'측에 CCTAG가 존재하는 뉴클레오티드(2-24)로 이루어지는, 부분적 2개쇄 뉴클레오티드를 형성한다.

이 부분적 2개쇄 뉴클레오티드에, DNA 폴리머라제를 촉매로 해서, dITP, dATP, dCTP, dTTP를 주입시킴으로써, 완전한 2개쇄 뉴클레오티드를 형성한다. 이것에 의해 형성되는 뉴클레오티드쇄(2-25)는, 뉴클레오티드쇄(2-23)의 3'말단에, 뉴클레오티드쇄(2-24)의 1개쇄 영역에 상보적인 뉴클레오티드 배열을 부가한 것이 되고, 뉴클레오티드쇄(2-24)의 시토신(C)에 대응하는 위치에 히포크산틴(Hx)을 가진다.

이 완전 2개쇄 뉴클레오티드에 대해서 실시형태2와 같은 조작을 행함으로써 뉴클레오티드쇄(2-21)의 3'말단에 1뉴클레오티드만을 부가해서 알데히드기를 부여 하고, 수식물질을 결합시켜 불필요한 뉴클레오티드쇄를 제거할 수 있다.

(실시형태5)

도 8은, 본 발명의 실시형태5의 뉴클레오티드쇄 수식방법의 원리를 나타낸다. 이 방법에서는, 미리 히포크산틴을 염기배열에 주입한 2개쇄 뉴클레오티드를 접합한다.

도면 중, N₀, N₁, C, Hx는 상기와 같은 뜻을 가지고, N₂, N₄는 아데닌, 구아닌, 티민, 시토신, 히포크산틴, 우라실 등의 염기 중에서 임의로 선택된 서로 상보적인 염기를 나타낸다.

2개쇄 뉴클레오티드는, 제 1의 뉴클레오티드쇄(2-31)와 제 2의 뉴클레오티드쇄(2-32)로 이루어지고, 이 중, 뉴클레오티드쇄(2-31)가 수식대상이다. 뉴클레오티드쇄(2-31)는, 3'말단영역에 염기(N₀)의 배열을 가지고, 뉴클레오티드쇄(2-32)는 뉴클레오티드쇄(2-31)의 3'말단영역과 상보적인 염기쌍을 형성하는 염기(N₁)의 배열을 5'측에 가지고 있다.

이 2개쇄 뉴클레오티드에, DNA 리가아제를 촉매로 해서 별도의 2개쇄 뉴클레오티드를 접합시킨다. 이 별도의 2개쇄 뉴클레오티드는, 히포크산틴(Hx)의 양측에 염기(N₄)의 배열을 가진 뉴클레오티드쇄(2-33)과 시토신(C)의 양측에 염기(N₄)에 상보적인 염기(N₂)의 배열을 가진 뉴클레오티드쇄(2-34)로 이루어지는 것을 이용하고, 수식대상의 뉴클레오티드쇄(2-31)의 3'측에 뉴클레오티드쇄(2-33)가 배치되도록 접 합시킨다. 이것에 의해, 뉴클레오티드쇄(2-35)(뉴클레오티드쇄(2-31)와 뉴클레오티드(2-33))와, 뉴클레오티드쇄(2-36)(뉴클레오티드(2-31)와 뉴클레오티드쇄(2-33))으로 이루어지는 2개쇄 뉴클레오티드가 형성된다.

이 완전 2개쇄 뉴클레오티드에 대해서, 실시형태2와 같은 조작을 행함으로써, 뉴클레오티드쇄(2-31)의 N₀배열의 근방의 3'말단에 알데히드기를 부여하고, 수식물질을 접합시켜 불필요한 뉴클레오티드쇄를 제거할 수 있다.

또한, 이 실시형태5에서는 히포크산틴(Hx)의 위치로부터 5'측(및 시토신(C)의 위치로부터 3'측)에 3염기쌍(N₂-N₄)에 상응하는 뉴클레오티드 배열을 가지게 하고 있지만, 이 부분의 뉴클레오티드 배열은 생략하는 것도 가능하다.

단, 접합개소에 제한효소에 의한 인식배열을 형성하면, DNA리가아제에 의한 접합반응의 효율이 높아지기 때문에, 히포크산틴(Hx)의 위치로부터 5'측(및 시토신(C)의 위치로부터3'측)에 3~4염기쌍에 상응하는 뉴클레오티드 배열을 가지게 해 두는 것이 바람직하다.

예를 들면, 뉴클레오티드쇄(2-31)의 3'말단의 염기(N₀)의 배열과 뉴클레오티드쇄(2-32)의 5'말단의 염기(N₁)의 배열이 이하의 배열(I)일 경우에, 뉴클레오티드쇄(2-33)에 있어서의 히포크산틴(Hx)의 위치로부터 5'측과, 뉴클레오티드쇄(2-34)에 있어서의 시토신(C)의 위치로부터3'측에 배열(Ⅱ)을 가지게 해 두면, 접합개소에 배열(Ⅲ)이 형성되고, 이 배열(Ⅲ)은 제한효소(HincⅡ)가 인식절단하는 배열이기 때문에, 리가아제 반응이 효율적으로 진행된다.

‥GTC 3' 5' GAC‥ ‥GTCGAC‥

‥CAG 5' 3' CTG‥ ‥CAGCTG‥

(Ⅰ) (Ⅱ) (Ⅲ)

접합하는 2조의 2개쇄 뉴클레오티드의 말단은, 상술한 뉴클레오티드쇄와 같은 평활말단이어도 좋고, BamHⅠ에 의한 절단부위와 같은, 한쪽의 뉴클레오티드쇄가 돌출된 돌출말단이어도 좋다.

이와 같은 제한효소에 의한 절단과 DNA 리가아제에 의한 접합은, 종래로부터 유전자의 벡터 등으로의 구비에 이용되고 있다. 본 발명방법을 병용함으로써, 유전자(뉴클레오티드쇄)의 벡터 등으로의 구비와 수식물질에 의한 수식을 동일 반응조건 하에서 실현할 수 있게 되고, 약간의 검체로부터 PCR법 등에 의해 증폭된 귀중한 뉴클레오티드쇄 시료를, 낭비하지 않고 유효하게 활용할 수 있게 된다. 예를 들면, 유전자 발현 벡터인 pET계 벡터(Studier,F.외, Methods Enzymol, 185권, 60페이지)는 그 유전자 삽입부위에 BamHⅠ 사이트를 가지고 있기 때문에, 실시형태4에 나타내는 방법을 적용함으로써 뉴클레오티드쇄의 수식과 벡터로의 구비가 동시에 실현가능하게 된다.

수식대상의 뉴클레오티드쇄의 쇄길이는 적어도 3 이상이면 되지만, 유전자해석의 용도로는 뉴클레오티드쇄의 배열을 규정할 필요가 있고, 그것을 위해서는 뉴클레오티드쇄의 쇄길이는 적어도 10 이상인 것이 바람직하다.

히포크산틴(Hx)보다 3'측에 배열되는 뉴클레오티드 배열은, 실시형태2 및 실시형태3의 방법을 사용할 경우는, 적어도 1염기쌍에 상응하는 쇄길이면 좋지만, 실 시형태4 및 실시형태5의 방법을 사용할 경우는, 2~4 염기쌍 이상의 쇄길이인 것이 바람직하다. 제한효소나 리가아제를 충분히 작용시키기 위해서는, 각 효소가 인식하는 배열영역보다 약간 긴 쇄길이가 필요하기 때문이다.

상술한 각 실시형태에서는, 히포크산틴(Hx)을 함유한 뉴클레오티드 배열을 부가하는 것, 또한 히포크산틴(Hx)를 함유한 뉴클레오티드를 기질로 하는 3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제Ⅱ형을 작용시키는 것을 예시했지만, 이것에 한정되지 않는다. 표 1(상기 게시)의 염기를 3'말단영역에 함유한 뉴클레오티드와 DNA 글리코시다아제와의 결합에서도 마찬가지로 해서 뉴클레오티드쇄의 3'말단을 소망의 수식물질로 수식할 수 있다.

이하, 구체적인 실시예를 들어서 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

(실시예1)

수식대상의 뉴클레오티드쇄로서, 뉴클레오티드수 30의 1개쇄 화학합성 뉴클레오티드쇄(Sigma-Genosya사에 합성을 위탁)를 이용했다. 이 뉴클레오티드쇄는, 대장균의 16S 리보솜 리보핵산 유전자의 8~37위치를 코드하는 것이고, 5'말단보다 이하의 염기배열을 가진다. A, T, G, C는 각각 데옥시뉴클레오티드 중의 염기, 아데닌, 티민, 구아닌, 시토신을 나타낸다.

AGAGTTTGATCATGGCTCAGATTGAACGCT(배열1)

우선, 뉴클레오티드쇄를 5μM가 되도록 2단위(이하, u로 약기한다)/㎕의 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제(Invitrogen사 제품), 10mM 2-데옥시이노신-5'-3인산, 2mM 염화코발트, 1mM 디티오트레이톨, 0.1M 카코딜산칼륨(pH 7.2)의 반응액 50㎕ 중에 혼화(混和)하고, 37℃에서 4시간 반응시켜서 뉴클레오티드쇄의 3'측에 히포크산틴 염기를 가지는 뉴클레오티드 배열을 테일링시켰다.

이 뉴클레오티드쇄를 에탄올 침전에 의해 회수하고, 100μM의 올리고데옥시시토신(뉴클레오티드수 18, New England Bio Labs사 제품)을 첨가해서, 뉴클레오티드쇄의 3'측에 테일링한 뉴클레오티드 배열의 히포크산틴 염기와 어닐링시켰다.

다음에 뉴클레오티드쇄를 0.3u/㎕의 3-메틸아데닌 DNA 글리코시라아제Ⅱ형(Trevigen 제품), 1mM 에틸렌디아민 4초산, 1mM 글리콜에테르디아민 4초산, 1mM 디티오트레이톨, 10mM 2-[4-(2-히드록시에틸)-1-피페라디닐]에탄술폰산-수산화칼륨(pH 7.4)의 반응액에 혼화하고, 37℃에서 하루동안 반응시켜서 뉴클레오티드쇄의 3'측에 테일링한 뉴클레오티드 배열의 글리코시드 결합을 절단했다.

이 반응액에 0.1M이 되도록 수산화나트륨을 첨가하고, 100℃에서 5분간 가열해서 뉴클레오티드쇄의 3'측에 잔존하는 인산을 분해시켜, 3'말단에 알데히드기를 형성시켰다.

이 뉴클레오티드쇄를 에탄올 침전에 의해 회수하고, 0.1M 탄산나트륨(pH 9.5) 조건 하에서 5mM 플루오레세인카다베린(Molecular Probes사 제품)과 혼합하여, 반응액을 50㎕로 해서 실온에서 2시간 반응시켜서 뉴클레오티드쇄의 3'말단의 알데히드기와 플루오레세인카다베린에 존재하는 아미노기 사이에서 시프 염기를 형성시켰다. 그 후에, 1㎎/㎖가 되도록 수소화붕소나트륨을 첨가하고 반응액을 100㎕로 해서, 4℃에서 하루동안 반응시킴으로써 시프 염기를 환원하여 결합을 안정화시켰다.

이 수식 프로세스를 7몰 요소-폴리아크릴아미드겔 전기영동(Molecular Cloning 제 2판 11.23페이지 1989년)에 의해 추적한 결과를 도 9에 나타낸다. 도면 중 좌측의 숫자와 화살표는 각 염기수를 가지는 뉴클레오티드쇄의 영동위치를 나타내고 있다. 뉴클레오티드쇄의 검출은, 은염색법(Electrophoresis 4권 92페이지 1983년)을 따랐다.

레인(A, B 및 C)는 각각, 분자량 마커, 올리고데옥시시토신, 및 미처리의 뉴클레오티드쇄를 각각 나타내고 있다. 레인(D)는 히포크산틴을 가지는 뉴클레오티드 배열이 3'측에 테일링한 뉴클레오티드쇄를 나타내고, 뉴클레오티드수는 100 이상으로 증가하고 있다. 레인(E)는 올리고데옥시시토신이 어닐링한 뉴클레오티드쇄를 나타낸다. 레인(F)는 3'말단에 알데히드기가 형성된 뉴클레오티드쇄를 나타내고, 뉴클레오티드수는 30으로 감소하고 있다. 레인(G)는 3'말단이 플루오레세인카다베린으로 수식되어 안정화된 뉴클레오티드쇄를 나타낸다.

레인(D)에 있어서, 히포크산틴을 가지는 뉴클레오티드의 테일링이 확인되지 않고 미반응의 뉴클레오티드쇄가 약간 잔존하고 있는 것이 확인되지만, 이것은 테일링 반응시간의 연장이나, 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제 첨가량의 증가 등에 따라 용이하게 해소할 수 있다.

또한, 수식대상의 뉴클레오티드쇠의 아데닌, 구아닌, 시토신에도 아미노기가 존재하기 때문에, 뉴클레오티드쇄 내부에서 반응이 생겨 자기중합해 버릴 가능성도 있지만, 레인(F)에 나타내는 대로, 자기중합은 발생하지 않았다. 그러나 필요가 있으면, 뉴클레오티드쇄의 화학합성시에 이용되는 벤조일기, 이소부틸기 등의 적당한 보호기로 뉴클레오티드쇄의 아미노기를 보호하는 것도 가능하다.

(실시예2)

실시예1에서 전기영동시킨 각 과정의 뉴클레오티드쇄를 Southern의 방법(J.Mol.Biol.98권, 503페이지, 1975년)에 따라서, 나일론막(Schleicher & Schuell사 제품)에 전사했다.

나일론막 위의 뉴클레오티드쇄에 대해서, 서양고추냉이 유래의 퍼옥시다아제로 표식한 항플루오레세인 항체(Amersham Biosciences사 제품)를 적하하고, 플루오레세인의 유무를 화학발광법(Amersham Biosciences사 제품, ECL Detection Reagents)에 따라 필름(Amersham Biosciences사 제품, Hyperfilm ECL)을 노광시켜서 검출했다. 결가를 도 10에 나타낸다. 도면 중 좌측의 숫자와 화살표는 도 9와 마찬가지로 각 염기수를 가지는 뉴클레오티드쇄의 위치를 나타내고 있다.

레인(A)는 분자량 마커를 나타낸다. 미리 플루오레세인 라벨한 2',3'-디데옥시우리딘-5'-3인산(Enzo Diagnostics사 제품)을 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스페라아제로 테일링처리한 것이다.

레인(B~F)에서는, 발광의 검출은 확인되지 않고, 뉴클레오티드쇄는 플루오레세인으로 수식되어 있지 않는 것을 알 수 있다.

레인(G)에 있어서, 뉴클레오티드수 30의 뉴클레오티드쇄의 발광이 검출되어 있고, 수식 뉴클레오티드쇄가 실제로 플루오레세인카바베린으로 수식된 것을 알 수 있다.

레인(G)에서는, 뉴클레오티드수 18의 올리고데옥시시토신도 플루오레세인카 바베린으로 수식되어 있다. 이것은, 테일링한 히포크산틴의 뉴클레오티드쇄 부분에 올리고데옥시시토신이 랜덤으로 어닐하기 때문에, 부분적으로 2개쇄가 형성되지 않고, 3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제Ⅱ형이 작용하지 않는 개소가 존재해 버리기 때문이다. 그것에 의해, 약간의 뉴클레오티드수의 올리고데옥시히포크산틴이 생기고, 그 3'말단에 알데히드기가 형성되며, 그 알데히드기를 플루오레세인카다베린이 수식하여, 이들의 반응 중에 올리고데옥시히포크산틴과 올리고데옥시시토신이 재어닐하기 때문이다. 그러나 불필요한 올리고데옥시시토신은 겔크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 또한 폴리스티렌비즈 등의 미립자에 적당한 방법으로 고정화한 올리고데옥시히포크산틴, 올리고데옥시구아닌, 혹은 이들을 혼합한 올리고뉴클레오티드와 어닐시킴으로써 용이하게 분리제거할 수 있다.

이상, 실시예1 및 실시예2에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 방법에 따라서 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 직접적으로 수식물질을 수식하는 것이 가능하다.

상기 각 실시예에 나타낸 뉴클레오티드쇄의 구성·쇄길이, 수식물질, 반응조건, 반응조성 등은 단지 예시이며, 이들에 한정되지 않고 임의로 개변가능하다.

(실시예3)

수식대상의 뉴클레오티드쇄로서, 사람의 골격근 미오신 중쇄1의 cDNA 배열 5831~5850위치(미국 국립 바이오테크놀로지 인포메이션 센터의 Gen Bank, 인터넷 웹사이트(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html), 엑세션 번호:NM_005963, 2004년 2월 현재)에 상응하는 뉴클레오티드수 20의 1개쇄 데옥시뉴클레오티드쇄(Sigma-Genosys사에 위탁합성)를 이용했다. 이 뉴클레오티드쇄에 상보적 인 뉴클레오티드쇄로서, 뉴클레오티드수 29의 1개쇄 데옥시뉴클레오티드쇄(Sigma-Genosys사에 위탁합성)를 이용했다. 수식물질로서, 아미노옥시메틸카르보닐히드라존-Cy5를 이용했다. 각 뉴클레오티드쇄는 하기의 염기배열을 가지고 있다

피수식 뉴클레오티드쇄

TGCTG AAAGG TGACC AAAGA(배열2)

상보적 뉴클레오티드쇄

ATCGGATCCTCTTTGGTCACCTTTCAGCA(배열3)

<스텝1>

피수식 뉴클레오티드쇄(이하, MYH1로 표기한다)와 상보적 뉴클레오티드쇄(이하, MYH1-BamHⅠ로 표기한다)를, 최종 농도가 각각 10μM, 20μM가 되도록, 50mM 염화나트륨, 10mM 염화마그네슘, 1mM 디티오트레이톨, 10mM 트리스-염산(pH 7.5)의 완충액에 현탁하고(총량 100㎕), 65℃에서 10분 가온한 후, 30분 이상 걸쳐서 실온까지 냉각함으로써, cMYH1-BamHⅠ의 5'영역(CTTTCAGCA)이 돌출된 2개쇄를 형성했다.

<스텝2>

형성된 2개쇄 뉴클레오티드를 에탄올 침전에 의해 회수하고, 10mM dITP, 10mM dATP, 10mM dTTP, 10mM dCTP, 50mM 염화나트륨, 20mM 염화마그네슘, 40mM 트리스-염산(pH 7.5)의 용액에 넣어, T7DNA폴리머라제 개변효소 시케네이스 ver.2.0(USB사)을 최종 농도 0.5u/㎕가 되도록 첨가하고(총량 100㎕), 37℃에서 4시간 반응시킴으로써, MYH1의 3'말단에 MYH1-BamHⅠ에 상보적인 히포크산틴을 함유한 뉴클레오티드 배열을 부가해서, 완전한 29 염기쌍의 2개쇄 뉴클레오티드를 형성했다. 이때에 형성되는 MYH1은 (배열1)-HxHxATCCHxAT로 나타내어진다.

<스텝3>

형성된 2개쇄 뉴클레오티드를 에탄올 침전에 의해 회수하고, 1mM 에틸렌디아민 4초산, 1mM 에틸렌글리콜비스(2-아미노에틸에테르) 4초산(=글리콜에테르디아민 4초산), 1mM 디티오트레이톨, 10mM 4-(2-히드록시에틸)피페라딘-1-에탄술폰산-수산화칼륨(pH 7.4)의 용액에 넣어, 3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제Ⅱ형(Trevigen사)을 최종농도 0.2u/㎕가 되도록 첨가하고(총량 100㎕), 37℃에서 하루동안 반응시킴으로써 히포크산틴을 가진 데옥시리보스의 글리코시드 결합부분을 가수분해해서, MYH1의 3'말단에 알데히드기를 부여했다. 이 MYH1은 (배열1)-CHO로 나타내어진다.

<스텝4>

MYH1의 말단에 알데히드기를 가진 2개쇄 뉴클레오티드를, 50mM 4-(2-히드록시에틸)피페라딘-1-에탄술폰산-수산화나트륨(pH 7.2)의 용액에 넣고, 수식물질로서의 아미노옥시메틸카르보닐히드라존-Cy5를 최종 농도 240μM가 되도록 첨가하여(총량 100㎕), 실온에서 하루동안 반응시킴으로써 MYH1의 3'말단의 알데히드기와 Cy5의 아민 사이에서 시프 염기를 형성시켰다. 이 MYH1은 (배열1)-CHHNOCHNHNH-Cy5로 나타내어진다.

각 스텝의 뉴클레오티드쇄를 16% 폴리아크릴아미드겔 전기영동(90mM 트리스-붕산·2mM 에틸렌디아민 4초산 완충액)으로 추적한 결과를 도 11에 나타낸다. 뉴클레오티드쇄는, SYBRGold(Molecular probes사)에 의해 염색되었다. 도면 중의 M은 분자량 마커를 나타내고, 20bp, 30bp, 50pb, 100bp는 각각, 2개쇄 뉴클레오티드의 20 염기쌍, 30 염기쌍, 50 염기쌍, 100 염기쌍의 영동위치를 나타내고 있다.

레인(1)의 밴드는 피수식 뉴클레오티드쇄(MYH1)를 나타내고; 레인(2)의 밴드는 상보적 뉴클레오티드쇄(MYH1-BamHⅠ)를 나타내고;레인(3)에 있어서 30 염기쌍 정도의 위치에 출현한 밴드는 스텝1에서 형성된 부분적 2개쇄 뉴클레오티드를 나타내고; 레인(4)에 있어서의, 레인(3)에 비해서 이동도가 약간 느린 밴드는, 스텝2에서 형성된 29 염기쌍의 완전 2개쇄 뉴클레오티드를 나타내고; 레인(5)에 있어서의, 레인(4)에 비해서 이동도가 약간 빠른 밴드는 알데히드기가 MYH1에 부여된 2개쇄 뉴클레오티드를 나타내고; 레인(6)에 있어서의 밴드는, 수식물질로 MYH1이 수식된 2개쇄 뉴클레오티드를 나타낸다.

레인(5)와 레인(6) 사이에는 이동도의 유의한 차는 확인되지 않지만, 전기영동 후의 각 레인의 2개쇄 뉴클레오티드를 Southern의 방법(J.Mol.Biol., 98권, 503페이지, 1975년)으로 나일론막(Schleicher & Schuell사)에 전사하고, 서양고추냉이 퍼옥시다아제 표식한 항시아닌 항체(Rockland사)를 이용해서 루미놀 반응에 의한 화학발광의 유무를 필름(상품명 Hyperfilm ECL, Amersham Biosciences사)으로 조사한 바, 필름의 노광은 레인(6)의 2개쇄 뉴클레오티드에 의해서만 일어났다(레인(6')). 이 결과는, 레인(6)의 2개쇄 뉴클레오티드에 서양고추냉이 퍼옥시다아제 표식한 항시아닌 항체가 결합되어 있는 것, 즉, 상기 항체가 결합가능한 아미노옥시메틸카르보닐히드라존-Cy5가 MYH1에 결합되어 있는 것을 나타낸다.

수식물질인 아미노옥시메틸카르보닐히드라존-Cy5(시아닌계 색소)는, Cy5-히 드라진(Amersham Biosciences사)을 출발물질로 해서, 이데 외(Ide et al., Biochemistry, 32권, 8276페이지, 1993년) 및 그루버 외(Gruber et al., Bioconjugate Chemistry, 11권, 161페이지, 2000년)의 방법에 준해서 이하와 같이 해서 혼합하여 정제했다.

1mM Cy5-히드라진과 3mM 제 3 부톡시카르보닐아미노옥시초산(t-Boc-NH-O-CH₂COOH)(Fluka사)을, 3mM N,N'-디시클로헥실카르보디이미드(DCC)와 3mM 1-히드록시-1H-벤조티아졸(HOBt)과의 존재 하(총량 300㎕), 4℃에서 하루동안 반응시켜서 축합시켜, 이 반응혼합물을 농축한 후, 50% 트리플루오로초산(TFA)(2000㎕)을 첨가하여 실온에서 1시간 반응시킴으로써 축합물의 제 3 부톡시카르보닐기(t-Boc)를 절단하고, 최후에 반응물 혼합물을 5% N,N'-디이소프로필에틸아민(DIPEA)으로 중화하여, C₁₈실리카겔칼럼으로 정제함으로써 목적의 화합물을 얻었다. 수율은 13.4%이다.

이상과 같이, 본 발명에 의하면 1개쇄 뉴클레오티드, 및 2개쇄 뉴클레오티드 중 선택된 한쪽 혹은 양쪽의 뉴클레오티드쇄의 3'말단을 뉴클레오티드쇄의 쇄길이에 관계없이 수식물질로 직접 수식할 수 있다. 특정 염기로서, 주쇄부분에 존재하지 않는 염기, 예를 들면, 본래는 유전자로서 존재하지 않고, PCR 증폭시 등에도 뉴클레오티드쇄에 주입되지 않는 염기를 선택함으로써 주쇄부분의 분해를 회피할 수 있다. 뉴클레오티드쇄(주쇄부분)의 염기구성이나 쇄길이에 관계없이 뉴클레오티드쇄의 3'말단측을 직접적으로 간편하게 임의의 수식물질로 정량적, 안정적으로 수식할 수 있는 방법이다.

따라서, 목적으로 하는 유전자정보를 가진 뉴클레오티드쇄를 한정해서 라벨화, 표식화할 수 있음과 아울러, 뉴클레오티드쇄의 고정화를 목적으로 할 경우에는, 수식물질을 링커로서 안정, 강고하게 고정화하는 것이 가능하고, 유전자해석의 유사결과를 방지할 수 있다.

본 발명의 뉴클레오티드쇄 수식방법은, 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'말단을 뉴클레오티드쇄가 1개쇄인지 2개쇄인지에 관계없이 임의의 수식물질로 정량적, 안정적으로 수식하는 것이 가능하고, 뉴클레오티드쇄의 라벨화, 표식화, 고정화 등을 필요로 하는 유전자해석 등에 유용하다.

Claims

특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열이 3'측에 존재하는 수식대상의 뉴클레오티드쇄에, 상기 특정 염기를 포함한 뉴클레오티드에 특이적인 분해효소를 작용시켜서 상기 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 소정 수식물질에 대해서 결합능을 가지는 관능기를 부여하고, 상기 관능기를 가진 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 상기 수식물질을 결합시키며, 상기 특정 염기로서 히포크산틴을 사용하고, 상기 분해효소로서 3-메틸아데닌 DNA 글리코시다아제를 사용하고, 또한 상기 관능기를 알데히드기로 하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 1항에 있어서, 특정 염기가, 주쇄가 되는 뉴클레오티드쇄의 3'측에 위치하고, 상기 특정 염기가 상기 주쇄에 존재하지 않는 염기인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 1항에 있어서, 특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열을, 상기 뉴클레오티드쇄의 3'측에 부가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 3항에 있어서, 특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열을 테일링법에 의해 부가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 3항에 있어서, 수식대상으로 하는 1개쇄 뉴클레오티드에, 상기 뉴클레오 티드쇄의 3'말단영역에 상보적인 배열을 3'말단영역에 가지는 뉴클레오티드쇄를 어닐하고, 상기 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'측에 특정 염기를 포함한 상보적 뉴클레오티드 배열을 부가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 3항에 있어서, 한쪽 또는 양쪽의 뉴클레오티드쇄를 수식대상으로 하는 2개쇄 뉴클레오티드를, 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'말단영역의 염기배열을 특이적으로 인식하는 제한효소로 절단하고, 절단한 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'측에 특정 염기를 포함한 상보적 뉴클레오티드 배열을 부가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 3항에 있어서, 2개쇄 뉴클레오티드의 한쪽 또는 양쪽인 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'말단측에, 특정 염기를 포함한 뉴클레오티드 배열을 5'말단영역에 가진 2개쇄 뉴클레오티드를 DNA리가아제로 접합하고, 접합한 뉴클레오티드쇄의 상기 특정 염기보다 3'말단측의 염기배열을 특이적으로 인식하는 제한효소로 절단함으로써, 상기 수식대상의 뉴클레오티드쇄의 3'측에 특정 염기를 포함한 뉴클레오티드 배열을 부가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 3항 또는 제 6항에 있어서, 뉴클레오티드 배열의 부가는 DNA 폴리머라제를 이용해서 뉴클레오티드를 주입함으로써 행하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 1항에 있어서, 특정 염기를 가진 뉴클레오티드 배열이 존재하는 뉴클레오티드쇄가, 화학합성된 뉴클레오티드쇄인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 1항에 있어서, 분해효소를 작용시키기에 앞서 특정 염기와 상보적인 염기배열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 첨가하는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
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제 1항에 있어서, 수식물질이 뉴클레오티드쇄의 3'말단에 부여되는 관능기와 결합을 형성하는 아미노기를 가지는 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 1항 또는 제 14항에 있어서, 수식물질이 뉴클레오티드쇄를 라벨화, 표식화하는 물질인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 15항에 있어서, 수식물질이 형광성 물질, 비타민, 지질, 아미노산, 올리고펩티드, 단백질 또는 생체외인성 물질인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
제 1항 또는 제 14항에 있어서, 수식물질이, 아미노알칸티올 또는 아미노실란커플링 화합물을 포함하는 유전자해석을 위한 기판으로의 결합능을 가진 물질인 것을 특징으로 하는 뉴클레오티드쇄 수식방법.
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