KR100772424B1 - ⅤＥＧＦ－Ａ，ⅤＥＧＦ－Ｂ，및 ⅤＥＧＦ－Ｃ의 안티센스 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 ⅤＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스를 포함하는 암의 유전자 치료제 - Google Patents

ⅤＥＧＦ－Ａ，ⅤＥＧＦ－Ｂ，및 ⅤＥＧＦ－Ｃ의 안티센스 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 ⅤＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스를 포함하는 암의 유전자 치료제 Download PDF

Info

Publication number
KR100772424B1
KR100772424B1 KR1020050071557A KR20050071557A KR100772424B1 KR 100772424 B1 KR100772424 B1 KR 100772424B1 KR 1020050071557 A KR1020050071557 A KR 1020050071557A KR 20050071557 A KR20050071557 A KR 20050071557A KR 100772424 B1 KR100772424 B1 KR 100772424B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
raav
vegf
ashvegf
tshvegfr
associated virus
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
KR1020050071557A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20070016688A (ko
Inventor
박기랑
김원재
조영화
Original Assignee
박기랑
주성대학산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 박기랑, 주성대학산학협력단 filed Critical 박기랑
Priority to KR1020050071557A priority Critical patent/KR100772424B1/ko
Publication of KR20070016688A publication Critical patent/KR20070016688A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100772424B1 publication Critical patent/KR100772424B1/ko
Assigned to 정선주 reassignment 정선주 권리의 일부이전등록 Assignors: 박기랑, 주성대학산학협력단
Assigned to 단국대학교 산학협력단 reassignment 단국대학교 산학협력단 권리의 전부이전등록 Assignors: 박기랑, 정선주, 주성대학산학협력단
Assigned to 주식회사 큐로진생명과학 reassignment 주식회사 큐로진생명과학 권리의 전부이전등록 Assignors: 단국대학교 산학협력단
Assigned to (주) 씨드모젠 reassignment (주) 씨드모젠 권리의 전부이전등록 Assignors: 주식회사 큐로진생명과학
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/66—General methods for inserting a gene into a vector to form a recombinant vector using cleavage and ligation; Use of non-functional linkers or adaptors, e.g. linkers containing the sequence for a restriction endonuclease
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S424/00—Drug, bio-affecting and body treating compositions
    • Y10S424/801—Drug, bio-affecting and body treating compositions involving antibody or fragment thereof produced by recombinant dna technology

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 VEGF-A, VEGF-B, 및 VEGF-C의 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV 벡터와 VEGF 수용체단백질(VEGFR)의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 포함하는 암의 유전자 치료제에 관한 것이다.
본 발명에 따른 유전자 치료제는 종양의 증식 및 전이에 필수적인 혈관신생에 관여하는 VEGF의 발현 및 기능을 억제하여, 종양의 성장을 감소시킴으로서 암을 유전자 차원에서 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
rAAV, 유전자 치료제, VEGF, VEGF 수용체, 아데노-연관 바이러스

Description

ⅤＥＧＦ－Ａ，ⅤＥＧＦ－Ｂ，및 ⅤＥＧＦ－Ｃ의 안티센스 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 ⅤＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스를 포함하는 암의 유전자 치료제{Gene Therapeutic Agent of Cancer Comprising Recombinant Adeno-associated Virus Containing Antisense cDNAs of VEGF-A, VEGF-B and VEGF-C and Recombinant Adeno-associated Virus Containing VEGFR truncated soluble cDNA}
도 1은 본 발명에 따른 pAAV-AShVEGF-ABC의 유전자 지도이다.
도 2는 본 발명에 따른 pAAV-TShVEGFR-1의 유전자 지도이다.
도 3은 본 발명에 따른 pAAV-TShVEGFR-2의 유전자 지도이다.
도 4a는 rAAV-TShVEGFR-1 및 rAAV-TShVEGFR-2 벡터에 의한 상처치유의 세포이동 효과를 분석한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4b는 rAAV-TShVEGFR-1 및 rAAV-TShVEGFR-2 벡터에 의한 상처치유의 세포이동 효과를 확인한 현미경사진이다.
도 5는 본 발명에 따른 rAAV 벡터를 복강주사한 누드마우스에서 종양체적 변화를 나타낸 그래프이다.
발명의 분야
본 발명은 VEGF-A, VEGF-B, 및 VEGF-C의 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV 벡터와 VEGF 수용체단백질(VEGFR)의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 포함하는 암의 유전자 치료제에 관한 것이다.
발명의 배경
암으로 인한 사망률은 국내·외를 막론하고 해마다 증가하는 추세이다. 암은 세계적으로 감염성 질환 및 심혈관계 질환과 더불어 주요한 사망원인 중 하나로 손꼽히고 있다. 세계보건기구(WHO)의 세계 보건 보고서(World Health Report)에 따르면, 2004년 총 사망자의 12.5%인 7,121,000명이 암으로 사망하였으며, 식습관, 환경의 변화 및 수명연장으로 인하여 향후 25년 내에 암 발생인구가 매년 약 3천만 명으로 늘어나고, 이중 2천만 명의 인구가 암으로 사망할 것으로 예상하고 있다.
현재 암치료에 사용되는 방법은 크게 외과적 수술, 방사선 치료 및 약물치료가 있는데, 이들 방법은 암치료를 위해 독자적으로 사용되거나 두 가지 이상의 방법이 병용된다. 일반적으로, 외과적 수술은 다양한 암의 단계에서 적용될 수 있다. 초기단계의 암들은 대체적으로 외과적 수술로 치료가 가능하지만, 암이 많이 진전되었거나 전이가 일어난 경우에는 외과적 수술만으로 어렵기 때문에 방사선 치료 또는 약물치료를 같이 사용한다. 방사선 치료는 외부에서 방사선을 조사하거나, 체 내로 투여한 방사성 물질에서부터 나온 X-선 또는 γ-선을 암세포에 조사하여 암을 치료한다. 약물치료는 항암제를 경구나 주사로 투여하여 암세포의 증식에 필요한 DNA나 관련 효소를 파괴하거나 억제하는 방법이다. 다른 방법에 비하여, 약물치료가 가지는 장점은 몸의 어떤 부위에 생긴 암이라도 약물이 도달할 수 있고, 전이된 암을 치료한다는 것이다. 현재 약물치료는 전이성 암 치료의 표준요법으로 사용되고 있다. 물론 전이된 암을 약물요법으로 완치할 수 있는 것은 아니지만, 증상을 완화시킴으로써 수명을 연장시키는 중요한 역할을 한다. 하지만, 이러한 약물요법의 주류를 이루고 있는 화학요법제는 부작용, 항암제 내성 등의 문제점을 가지고 있다.
그러나, 생명과학분야의 눈부신 발전에 힘입어 생물요법제가 급성장하고 있다. 생물요법제는 신체 본연의 면역 기능을 회복시키거나 증가시킴으로써 암세포의 활동력을 약화시켜 암의 진행을 막는 것을 치료적 근거로 삼고 있다. 신체의 면역 체계가 제 기능을 발휘할 때 암세포들을 효과적으로 사멸시킬 수 있으나, 그렇지 않은 경우 암세포가 쉽게 증식하거나, 또는 다른 병원균들이 쉽게 공격을 가할 수 있게 된다. 생물요법제의 상기 단점을 보완하기 위해 외과적 수술요법, 방사선요법, 화학요법 등과 같은 다른 치료법들과 같이 사용되기도 한다.
현재 생명과학분야에서 관심을 받고 있는 생물요법제로는 안티센스 항암제 및 혈관생성 억제제를 들 수 있다. 안티센스 항암제는 암세포의 특이적 mRNA에 상보적으로 결합할 수 있는 DNA단편을 사용하여, mRNA의 프로세싱 또는 단백질의 발현을 저해하는 방법으로, 암세포의 사멸을 유도하는 것이다. 인간게놈 프로젝트의 결과로 인하여 30,000여개의 유전자 서열이 판독되고, 100,000여개의 mRNA서열을 알 수 있게 되었다. 이로써 암세포와 연관된 mRNA 후보군에 대한 정보가 대량 확보되면서, 신호전달 체계와 관련된 유전자, 세포사멸(apoptosis) 및 세포 증식에 관련된 유전자들에 대한 안티센스 항암제를 스크리닝하여 임상 실험중에 있다.
종양의 성장은 이에 필요한 산소 및 영양분을 공급해주는 새로운 혈관의 생성(angiogenesis)이 있어야 가능하다. 일반적으로 암세포가 증식함에 따라 종양 내부는 저산소 상태가 되고, 조직이 괴사하게 된다. 또한, 종양 자체의 압력에 의해 혈관이 파괴됨으로써 저산소 상태는 더욱 악화된다. 이러한 저산소 상태를 극복하기 위하여 종양은 신혈관 생성과 관련된 인자들(VEGF, bFGF, IL-8, PDGF, PD-EGF 등)을 발현하게 되어 신혈관 생성을 촉진하게 된다. 즉, 신혈관 생성은 종양의 성장에 있어서 필수적인 과정인 것이다.
신혈관 생성 억제제는 이러한 종양의 신혈관 생성을 방해하여 종양의 성장을 저해함으로써, 암을 치료하는 것을 목적으로 한다. 직접적인 신혈관 생성 억제제는 혈관 내피세포의 증식 및 이동을 방해하거나, 신혈관 생성인자에 대한 반응을 억제함으로써 신혈관 생성을 방해한다. 직접적인 신혈관 생성 억제제는 후천내성(acquired drug resistance)을 보다 적게 유발한다는 장점을 지니고 있다. 간접적인 신혈관 생성 억제제는 신혈관 생성을 활성화시키는 종양내의 단백질 발현을 억제하거나, 상기 종양 단백질과 혈관 내피 세포표면 수용체 사이의 결합을 차단함으로써 신혈관 생성을 억제한다.
상기 기술한 바와 같이, 치료분야의 변화양상을 살펴보면, 인공적인 화학물 질에서 천연 생체내 물질을 이용하는 방향으로 변화하고 있음을 알 수 있다. 특히, 다양한 분야의 유전체 연구 사업들이 진행되면서 각종 질병의 병인으로 작용하는 유전자들이 발견되고 있다. 이러한 연구 결과들을 임상적인 치료나 예방효과와 연결짓기 위하여, 기능이 소실되거나 변형된 유전자를 교정하기 위한 유전자를 체내에 도입하여 기능을 정상화시키거나 치료기능을 활성화 시켜주는 유전자 전달 기술에 대한 연구, 즉 유전자 치료(gene therapy) 분야에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다. 상기 유전자 치료분야는 최근 수년간 관심과 연구가 집중되면서 그에 따른 결과들도 급증하고 있다.
유전자 치료법은 유전자 전달 및 발현에 의하여 질병을 치료하는 방법으로서, 약물치료와는 달리 장애가 있는 특정 유전자를 목표로 유전적 결함을 교정하는 치료법이다. 유전자 치료의 궁극적인 목표는 살아있는 세포를 유전적으로 변형하여 유익한 치료 효과를 얻는 것이다. 상기 치료법은 질환부위로 유전인자의 정확한 전달, 생체 내에서의 완전한 분해, 독성 및 면역 항원성 부재(不在) 및 유전인자의 장기간 안정적인 발현이라는 장점을 지니고 있어서, 질병치료에 있어 더할 나위없는 최선의 치료법으로 각광받고 있다.
유전자 치료의 주 연구분야는 특정 질병에 치료효과를 나타내는 유전자를 도입하거나, 항암제 등에 저항성을 나타내도록 정상세포의 저항기능을 증강시키거나, 각종 유전성 질환자에 있어서 변형되거나 소실된 유전자를 대체하는 분야로 요약할 수 있다.
유전자 치료법은 크게 생체내(in vivo)와 생체외(in vitro) 두 가지로 구분 된다. in vivo 유전자 치료법은 치료 유전자를 직접 체내에 주입하는 것이고, in vitro 유전자 치료법은 일차적으로 목적 세포(target cell)를 시험관내에서 배양하고, 이들 세포에 유전자를 도입시킨 다음, 유전자 변형된 세포를 다시 체내로 주입하는 것이다. 현재 유전자 치료 연구 분야에서는 in vivo 유전자 치료법보다는 in vitro 유전자 치료법을 많이 사용하고 있다.
유전자 전달기술은 크게 바이러스를 수송체로 사용하는 방법(viral vector-based transfer method), 합성 인지질이나 합성 양이온성 고분자 등을 사용하는 비바이러스성 방법(non-viral delivery method) 및 세포막에 일시적인 전기자극을 가하여 유전자를 도입하는 전기 투과법(electroporation) 등의 물리적 방법으로 구분할 수 있다.
상기 유전자 전달기술 중에서, 바이러스 수송체를 사용하는 방법은 치료유전자로 대체된 유전자를 지니는 일부 또는 전체의 복제능력이 결손된 벡터로서 유전인자의 전달이 효율적으로 이루어질 수 있기 때문에 유전자치료를 위해 선호되고 있다. 바이러스 수송체 또는 바이러스 벡터로 사용되는 바이러스로는 RNA 바이러스 벡터(레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등)와 DNA 바이러스 벡터(아데노바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 등)가 있으며, 이 외에도 단순포진 바이러스 벡터(herpes simplex viral vector), 알파 바이러스 벡터(alpha viral vector) 등이 있다. 이중에서도 특히 연구가 활발히 진행되고 있는 것은 레트로바이러스와 아데노바이러스이다.
숙주세포의 게놈에 통합기능이 있는 레트로바이러스(retrovirus)의 특징은 인체에 해가 없지만 통합 시 정상세포의 기능을 억제할 수 있고, 다양한 세포에 감염되고, 증식이 쉬우며, 1~7 kb 정도의 외부 유전자를 수용할 수 있고, 복제결핍 바이러스를 생성할 수 있는 능력이 있다는 것이다. 그러나, 유사분열 이후의 세포에 감염되기 힘들며, in vivo 상태에서 유전자 전달이 어렵고, 체세포 조직을 항시 in vitro에서 증식하여야만 한다는 단점도 지니고 있다. 또한, 레트로바이러스는 원형암유전자(proto-oncogene)에 통합될 수 있어 돌연변이의 위험성이 있고 세포를 괴사시킬 수도 있다.
한편, 아데노바이러스(adenovirus)는 클로닝 벡터(cloning vector)로 여러 가지 장점을 가지는데, 중간정도의 크기로 세포 핵 속에서 복제될 수 있으며, 임상적으로 무독성이고, 외부 유전자를 삽입하여도 안정적이며, 유전자의 재배열이나 손실이 일어나지 않고, 진핵생물을 형질전환시킬 수 있으며, 숙주세포 염색체에 통합되어도 안정적이면서도 높은 수준으로 발현된다. 아데노바이러스의 좋은 숙주세포는 인간의 조혈, 림프, 골수종의 원인이 되는 세포이다. 그러나, 선상 DNA라서 증식이 어렵고, 감염된 바이러스를 회복시키는 것이 쉽지 않으며, 바이러스의 감염율이 낮다. 또한 전달된 유전자의 발현이 1~2주 후에 가장 많이 되고, 일부 세포에서는 3~4주정도만 발현이 유지된다. 또한, 문제가 되는 것은 높은 면역 항원성을 갖는다는 것이다.
아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus, AAV)는 상기와 같은 문제점들을 보완할 수 있으면서, 유전자 치료제로의 많은 장점을 가지고 있어 최근에 선호되고 있다. AAV는 단일가닥의 원바이러스(provirus)로서, 복제하기 위하여 보조 바이러스를 필요로 하고, AAV 게놈(genome)은 4,680 bp로서 감염세포의 염색체 19번 특정부위에 삽입이 가능하다. 트랜스 유전자(trans-gene)는 각각 145bp의 두 개의 역위말단반복(inverted terminal repeat, ITR) 서열부분과 시그날 서열(signal sequence)부분에 의해 연결된 플라스미드 DNA(plasmid DNA)에 삽입된다. AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 다른 플라스미드 DNA와 함께 트랜스팩션(transfection)시키고 아데노바이러스는 보조바이러스로서 첨가한다. AAV는 유전자를 전달하는 숙주세포의 범위가 넓고, 반복투여 시 면역 부작용이 적으며, 유전자 발현 기간이 긴 장점을 지니고 있다. 더구나, AAV 게놈이 숙주세포의 염색체에 통합되어도 안전하고, 숙주의 유전자발현을 변형시키거나 재배열시키지 않는다.
1994년 CFTR 유전인자를 포함한 AAV 벡터가 섬유아세포증(cystic fibrosis) 치료를 위하여 NIH에 승인된 이래, 다양한 질병의 임상치료에 이용되고 있다. 혈액응고인자인 인자 IX 유전자(factor IX gene)를 포함한 AAV벡터는 B형 혈우병(hemophilia B)을 치료에 이용되고 있고, AAV 벡터를 이용한 A형 혈우병 (hemophilia A) 치료제 개발이 진행되고 있다. 또한, 여러 가지 종류의 항암유전자를 함유한 AAV 벡터는 종양 백신으로 사용하는 경우가 인증되었다.
VEGF를 사용한 유전자 치료로는 폐순환승압을 치료하기 위해 맥관형성 인자를 암호화하는 핵산을 포함하는 재조합 결손 아데노바이러스(대한민국 특허출원: 10-2001-7013633)를 예로 들 수 있지만, 상기 치료법은 VEGF 센스 염기서열을 사용하였기 때문에 허혈성 질환 치료에 한해서만 사용이 가능하고, 신혈관생성에 의한 질병, 특히, 암의 치료에는 사용이 불가하다. 더욱이, 아데노바이러스는 면역 항원 성이 높고, 숙주세포로의 감염성이 낮을 뿐 아니라, 발현 기간이 짧은 단점을 지니고 있어 치료용으로 사용하기에는 부적절하다.
암을 치료용 폴리펩타이드에 대한 연구는 기존에 많이 진행되어 왔지만, 상기 물질들의 대부분은 화학요법제에 속한다. 그리고, 폴리뉴클레오티드에 대한 연구도 지속적으로 진행되어 왔지만, 바이러스 벡터 등을 통하여 효율적으로 생체내에 이동시키는 방법과 연계해서는 그 결과가 미흡하다.
한편, 본 발명자들은 VEGF-A의 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV-AShVEGF-A 벡터(KR 10-2004-54043), VEGF-A, VEGF-B 및 VEGF-C의 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV-AShVEGF-ABC 벡터(PCT/KR2005/002435)가 암의 유전자 치료제로써 효율적이라는 것을 규명하고, 이를 특허출원한 바 있다. 아울러, VEGF-A의 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV-AShVEGF-A 벡터, VEGFR-1 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV-TShVEGFR-1 벡터 및 VEGFR-2 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV-TShVEGFR-2 벡터를 함유하는 암의 유전자 치료제에 대해서도 특허출원한 바 있다 (KR 10-2005-67661).
본 발명자들은 더욱 효율적인 암의 유전자 치료제를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, VEGF-A, VEGF-B 및 VEGF-C의 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV-AShVEGF-ABC 벡터, VEGFR-1 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV-TShVEGFR-1 벡터 및 VEGFR-2 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV-TShVEGFR-2 벡터를 함유하는 유전자 치료제가 in vivo 상에서 뛰어난 종양억제효과를 나타낸다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 VEGF-A 안티센스 cDNA, VEGF-B 안티센스 cDNA 및 VEGF-C 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV 벡터, VEGFR-1의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV 벡터 및 VEGFR-2의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 포함하는 암의 유전자 치료제를 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) VEGF-A, VEGF-B 및 VEGF-C의 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV 벡터; (b) VEGFR-1의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV 벡터; 및 (c) VEGFR-2의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 포함하는 암의 유전자 치료제를 제공한다.
본 발명에 있어서, VEGF-A, VEGF-B 및 VEGF-C의 안티센스 cDNA는 각각 서열번호 1, 서열번호 4 및 서열번호 7의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있고, VEGFR-1의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA 및 VEGFR-2의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA는 각각 서열번호 12 및 서열번호 15의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있 어서 자명할 것이다.
실시예 1: 혈관신생 억제기능 유전자를 함유한 pAAV 플라스미드 클로닝
VEGF-A, VEGF-B, 및 VEGF-C의 안티센스 cDNA가 삽입된 rAAV 벡터를 제작하기 위하여, 먼저 상기 안티센스 cDNA가 삽입된 pAAV벡터, pAAV-AShVEGF-ABC-IRES-EGFP를 제작하였다. 상기 pAAV-AShVEGF-ABC-IRES-EGFP를 제작하기 위하여 먼저 pAAV-AShVEGF-B-IRES-EGFP를 제작하고, 여기에 AShVEGF-A와 AShVEGF-C의 cDNA를 결합시켰다.
VEGF의 세가지 isoform과 작용하는 수용체인 VEGFR-1 (Flt-1; NCBI accession # NM_002019 for human)과 VEGFR-2 (Kdr/Flk-1; NCBI accession # AF063658 for human)의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA도 같은 방식으로 삽입 혹은 대치하여, pAAV-TShVEGFR-1 및 pAAV-TShVEGFR-2의 trans-gene constructs를 제작하였다.
트랜스-유전자(trans-gene)는 각각 145bp의 두 개의 역위말단반복서열부분 (ITR)과 CMV(human cytomegalovirus) 조기반응 프로모터(immediate early promoter), SV40 early mRNA polyadenylation signal 서열부분에 의해 연결된 pAAV 플라스미드 DNA에 삽입시켰다.
(1) pAAV-AShVEGF-A의 제작
인간혈관내피세포{(HUVEC)(Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., USA)} 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 하기의 AShVEGF-A 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 인간 VEGF-A isoform 안티센스 cDNA(서열번호 1)를 증폭하였다. 증폭 단편을 제한효소 KpnI 및 XhoI으로 처리하여, 동일한 제한효소로 절단된 pAAV-FIX cis 플라스미드 DNA(US 6,093,292)와 라이게이션시켜, pAAV-AShVEGF-A를 제작하였다.
AShVEGF-A F2: GG GGTACC GTCTTGCTCTATCTTTC(서열번호 2)
KpnI
AShVEGF-A R1: CC CTCGAG GGCCTCCGAAACCATGAACT(서열번호 3)
XhoI
(2) pAAV-AShVEGF-B의 제작
인간혈관내피세포{(HUVEC)(Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., USA)} 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 하기 AShVEGF-B 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 인간 VEGF-B isoform 안티센스 cDNA(서열번호 4)를 증폭하였다. 증폭 단편을 제한효소 EcoRV 및 XhoI으로 처리하여, 동일한 제한효소로 절단된 pAAV-FIX cis 플라스미드 DNA와 라이게이션시켜, pAAV-AShVEGF-B를 제작하였다.
AShVEGF-B F2: A GATATC CAGAGTCCCAGCCCGGAACAGA(서열번호 5)
EcoRV
AShVEGF-B R2: CC CTCGAG ATGAGCCCTCTGCTCCG (서열번호 6)
XhoI
(3) pAAV-AShVEGF-C의 제작
인간혈관내피세포(HUVEC) 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 하기 AShVEGF-C 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 인간 VEGF-C isoform 안티센스 cDNA(서열번호 7)를 증폭하였다. 증폭 단편을 제한효소 KpnI 및 XhoI으로 처리하여, 동일한 제한효소로 절단된 pAAV-FIX cis 플라스미드 DNA와 라이게이션시켜, pAAV-AShVEGF-C를 제작하였다.
AShVEGF-C F1: GG GGTACC ACATCTGTAGACGGACACACA(서열번호 8)
KpnI
AShVEGF-C R3: CC CTCGAG CTCGACCTCTCGGACGC(서열번호 9)
XhoI
(4) pAAV-AShVEGF-B-IRES-EGFP의 제작
pIRES2-EGFP 플라스미드 DNA(Clontech, Cat#6029-1, USA)를 제한효소 XhoI 및 NotI과 klenow 단편으로 처리하여 IRES-EGFP cDNA insert를 준비하였다. 상기 (2)에서 제작된 pAAV-AShVEGF-B 플라스미드 DNA를 제한효소 XhoI 및 BamHI과 klenow 단편으로 처리하여 선형화된 벡터(linearized vector)를 준비하였다. 상기 insert DNA와 상기 선형화된 벡터(linearized vector)를 혼합하고, T4 DNA ligase를 첨가하여 서브클로닝을 수행하여 pAAV-AShVEGF-B-IRES-EGFP를 제작하였다.
(5) pAAV-AShVEGF-AB-IRES-EGFP construct 제작
상기 (1)에서 제작된 pAAV-AShVEGF-A plasmid DNA를 제한효소 KpnI 및 XhoI과 klenow 단편으로 처리하여 AShVEGF-A cDNA insert를 준비하였으며, 상기 (4)에서 제작된 pAAV-AShVEGF-B-IRES-EGFP 플라스미드 DNA를 제한효소 EcoRV로 처리하여 선형화된 벡터(linearized vector)를 준비하였다. 상기 insert DNA와 상기 선형화된 벡터(linearized vector)를 혼합하고, T4 DNA ligase를 첨가하여 subcloning을 수행하여, pAAV-AShVEGF-AB-IRES-EGFP를 제작하였다.
상기 제작된 pAAV-AShVEGF-AB-IRES-EGFP의 insert DNA의 방향성을 확인하기 위하여, antisense A의 cDNA의 서열을 이용하여 디자인된 하기 AShVEGF-A F2 프라이머(서열번호 10)와 antisense B의 cDNA의 서열을 이용하여 디자인된 하기 AShVEGF-B R2 프라이머(서열번호 11)를 이용하여 PCR을 실시하였다.
AShVEGF-A F2: GGGGTACCGTCTTGCTCTATCTTTC(서열번호 10)
AShVEGF-B R2: CCCTCGAGATGAGCCCTCTGCTCCG(서열번호 11)
(6) pAAV-AShVEGF-ABC-IRES-EGFP의 제작
상기 (3)에서 제작된 pAAV-AShVEGF-C 플라스미드 DNA를 제한효소 KpnI 및 BamHI과 klenow 단편으로 처리하여 AShVEGF-C cDNA insert DNA를 준비하였다. 상기 (5)에서 구축한 pAAV-AShVEGF-AB-IRES-EGFP plasmid DNA를 제한효소 XhoI과 klenow 단편으로 처리하여 선형화된 벡터(linearized vector)를 준비하였다. 상기 insert DNA와 상기 선형화된 벡터(linearized vector)를 혼합하고, T4 DNA ligase를 첨가하여 subcloning을 수행하여 pAAV-AShVEGF-ABC-IRES-EGFP를 제작하였다.
(7) pAAV-AShVEGF-ABC의 제작
상기 (6)에서 제작된 pAAV-AShVEGF-ABC-IRES-EGFP을 제한효소 XbaI 및 XhoI로 처리하여 AShVEGF-ABC 단편을 얻었으며, 상기 AShVEGF-ABC 단편과 동일한 제한효소 XbaI 및 XhoI로 처리한 pAAV-FIX cis 플라스미드를 혼합하고, 라이게이션하여, pAAV-AShVEGF-ABC를 제작하였다 (도 1).
(8) pAAV-TShVEGFR-1의 제작
암세포주 LCSC#1 세포(WO 02/061069)로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 하기 TShVEGFR-1 F1 및 TShVEGFR-1 R3 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 가용성 불완전(truncated soluble) human VEGFR-1 수용체 cDNA(서열번호 12)를 증폭하였다. 증폭단편을 제한효소 KpnI 및 XhoI으로 처리하여, 동일한 제한효소로 절단된 pAAV-FIX cis 플라스미드 DNA와 라이게이션시켜, pAAV-TShVEGFR-1을 제작하였다 (도 2).
TShVEGFR-1 F1:
AA GGTACCGCCACC ATGGTCAGCTACTGGGACA(서열번호 13)
Kpn I Kozak
TShVEGFR-1 R3:
CG CTCGAGCTA TCTGATTGTAATTTCTTTCTTCTG(서열번호 14)
Xho I stop codon
(9) pAAV-TShVEGFR-2의 제작
암세포주 LCSC#1 세포로부터 RNA를 추출하여 cDNA를 합성하였으며, 하기 TShVEGFR-2 F1 및 TShVEGFR-2 R2 프라이머를 이용하여 RT-PCR 방법으로 가용성 불완전(truncated soluble) human VEGFR-2 수용체 cDNA(서열번호 15)를 증폭하였다. 증폭 단편은 제한효소 KpnI 및 XhoI으로 처리하여, 동일한 제한효소로 절단된 pAAV-FIX cis 플라스미드 DNA와 라이게이션시켜, pAAV-TShVEGFR-2를 제작하였다 (도 3).
TShVEGFR-2 F1:
GG GGTACCGCCACC ATGGAGAGCAAGGTGCT(서열번호 16)
Kpn I Kozak
TShVEGFR-2 R2:
CG CTCGAGT TAGCCTGTCTTCAGTTCCCCTCCATT(서열번호 17)
Xho I stop codon
실시예 2: 혈관신생억제 유전자치료제로 이용되는 rAAV 벡터 구축
유전자 치료에 이용되는 재조합 AAV-AShVEGF-ABC (rAAV-AShVEGF-ABC) 벡터를 제작하기 위해서는 실시예 1에서 제작된 pAAV-AShVEGF-ABC 이외에 AAV rep 부분과 cap 부분을 발현시키는 AAV rep-cap 플라스미드 DNA (pAAV-RC 플라스미드, Stratagene Co., USA)와 아데노바이러스 헬퍼 플라스미드 (pHelper 플라스미드, Stratagene Co., USA)가 필요하다. 상기 세 가지 종류의 플라스미드 DNA(pAAV-AShVEGF-ABC, pAAV-RC 및 pHelper)를 HEK293 (human embryonic kidney 293; ATCC CRL-1573) 세포에 모두 트랜스팩션시킨 다음, 96시간 배양한 후, HEK293 세포를 모 아서 초음파 파쇄하고, 재조합 AAV (rAAV) particle을 CsCl 밀도구배 원심분리를 3번 반복하여, RI (Refractive Index)가 1.37~1.41g/ml인 부분을 모아 순수하게 분리하여 rAAV-AShVEGF-ABC 벡터를 수득하였다. rAAV-TShVEGFR-1 벡터는 pAAV-AShVEGF-ABC 대신에 pAAV-TShVEGFR-1을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 수득하였고, rAAV-TShVEGFR-2 벡터는 pAAV-AShVEGF-ABC 대신에 pAAV-TShVEGFR-2을 사용하여 상기와 동일한 방법으로 수득하였다.
상기 수득된 rAAV-AShVEGF-ABC, rAAV-TShVEGFR-1 및 rAAV-TShVEGFR-2의 particles 적정(titration)은 CMV 프로모터 부위의 PCR 프라이머[CMV F1: 5'-GGG CGT GGA TAG CGG TTT GAC TC-3' (서열번호 18), CMV R1: 5'-CGG GGC GGG GTT ATT ACG ACA TT-3' (서열번호 19)]를 제작하여 Quantitative PCR 방법으로 적정하였다. 이때 농도를 알고 있는 각 pAAV 플라스미드 DNA를 표준물질로 이용하였으며, 상기 방법으로 생산 분리된 재조합 rAAV 벡터는 보통 1012~1013 viral particles/ml의 rAAV particle titer를 가진다는 것을 확인하였다.
실시예 3: rAAV - TShVEGFR -1 및 rAAV - TShVEGFR -2 벡터의 혈관신생억제 효과확인 (wound healing migration assay)
완전배지(EGM-2 BulletKit, Cat# CC-3162, Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., USA)에서 배양된 인간혈관내피세포(HUVEC)에 rAAV-TShVEGFR-1, rAAV-TShVEGFR-2 및 [rAAV-TShVEGFR-1 + rAAV-TShVEGFR-2]의 M.O.I가 각각 2×105 되도록 24시간동안 처리하고, 48시간 후 세포가 자란 플레이트를 cell scraper로 긁어 상처(wound)를 내었다. 상처를 낸 플레이트는 수득배지[EBM-2 (Cat# CC-3156, Cambrex Bio Science Walkersville, Inc., USA) + 1% FBS]를 이용하여 2번 세척하여 떨어진 세포를 제거하였다. 상기 플레이트에 VEGF protein (Calbiochem, Cat. #676472)을 10ng/ml이 되도록 처리하고 24시간 후 migrated cell을 촬영 분석하였다.
그 결과 표 1, 도 4a 및 도 4b에 나타난 바와 같이, rAAV-TShVEGFR-1과 rAAV-TShVEGFR-2를 각각 처리하거나, 동시에 처리한 경우, 무처리군 및 VEGF protein만을 처리한 군에 비하여 이동된 세포의 수가 현저히 적었다.
이는 rAAV-TShVEGFR-1 및/또는 rAAV-TShVEGFR-2 처리시 VEGF의 기능을 억제하여, 상처치유의 세포이동이 억제되는 것을 의미한다. 이 결과로부터, 본 발명의 rAAV-TShVEGFR-1 및/또는 rAAV-TShVEGFR-2는 VEGF가 혈관 내피세포를 이동시켜 혈관을 생성시키는 것을 억제하여, 종양의 증식을 방해함으로써 항암효과를 나타낼 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명의 rAAV 벡터 처리에 따른 상처치유의 세포이동 억제효과
VEGF protein (10ng/ml) - + + + + +
rAAV - - rAAV-EGFP rAAV- TShVEGFR-1 rAAV- TShVEGFR-2 rAAV- TShVEGFR-1+ rAAV- TShVEGFR-2
Migrated cells 150.2±7.95 217.2±21.70 195.8±19.27 143.8±13.81 104.63±9.21 134.71±13.06
실시예 4: 본 발명의 rAAV 벡터를 이용한 항암효과 분석( Xenograft 분석)
본 실시예에서는 실시예 3의 wound healing migration assay에서 항암효과가 입증된 rAAV-TShVEGFR-1 및 rAAV-TShVEGFR-2와 본 발명자들의 특허출원(PCT/KR2005/002435)에서 항암효과가 입증된 rAAV-AShVEGF-ABC를 모두 투여한 경우의 항암효과를 in vivo 상에서 조사하였다.
(1) 실험동물 및 환경조건
16±0.2g 체중을 가지는 4주령 수컷 BABL/c nu/nu 마우스(중앙실험동물주식회사, Japan SLC, Inc.)에 인간 폐암세포주 NCI-H460(human lung cell) (ATCC HTB-177)을 도입하여 고형암 유발모델을 제작한 다음, 이를 이용하여 본 발명에 따른 유전자 치료제 (rAAV-AShVEGF-ABC + rAAV-TShVEGFR-1 + rAAV-TShVEGFR-2)의 효능을 확인하였다.
본 실시예에서 사용된 누드마우스는 입수시 일반건강상태에 대해 수의학적 검역을 실시하여, 시험을 실시하는데 적합하고 건강한 개체를 선별하기 위하여 1주일간의 순화기간을 두었다. 본 실험은 온도 23±2℃, 상대습도 55±5%, 환기횟수 10~12회/hr, 조명시간 12시간(07:00~19:00), 조도 150~300Lux로 설정된 동물실험 전용 실험실에서 실시하였다. 사료는 실험동물용 멸균고형사료((주)샘타코바이오코리아)를 자유 섭취시켰으며, 음용수는 멸균 정제된 물을 자유 섭취시켰다.
음용수에 대하여서는 충청북도 보건환경연구소(충북 청주시 송정동 140-50)에 의뢰하여 검사한 결과 시험에 영양을 미치는 요인인 중금속은 수은, 카드늄, 비소 등이 불 검출 되었고 미생물에 있어서는 일반세균, 대장균, 분원성 대장균, 대장균 군 등이 검출되지 않았다
(2) 실험조건
본 실험에 사용된 BABL/c nu/nu 마우스의 암화과정은 다음과 같다. NCI-H460 세포주를 10% FBS와 항생제가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 3계대 이상 배양한 후 5x108 cells/ml의 NCI-H460 cell을 상기 누드마우스의 견부 아래쪽 피하에 주사기(26게이지)를 이용하여 0.2ml를 주입한 다음, 20일 후에 종양을 적출하여 새로운 개체에 가장자리의 단단한 종양조직을 이용하여 2차 계대를 실시하였다. 14~16일 후에 종양을 2차 계대와 같은 방법으로 최종 실험에 쓰일 마우스에게 일정크기의 종양절편(3x3x3mm)을 잘라서 trocha를 이용하여 3차 이식한 후 종양체적이 200~300mm3이 된 개체를 선별하고 군 분리하여 시험물질을 미세정맥주사 하였다.
본 실시예에서는 실시예 2에서 제작된 rAAV-AShVEGF-ABC, rAAV-TShVEGFR-1 및 rAAV-TShVEGFR-2를 미세정맥주사방법 (tail vein injection)으로 마우스에 투여하였다. 본 발명에 따른 rAAV-AShVEGF-ABC, rAAV-TShVEGFR-1 및 rAAV-TShVEGFR-2 벡터를 6주령의 수컷 마우스에 0.3ml(1.5×1011 virus particles/mouse)씩 미세정맥주사방법으로 투여하였다. 최종 투여된 rAAV-AShVEGF-ABC, rAAV-TShVEGFR-1 및 rAAV-TShVEGFR-2 벡터의 양은 각각 0.5×1011 virus particles/mouse이었다. 한편 대조군으로 사용된 HEPES buffer도 미세정맥주사방법으로 투여하였고, 본 발명자들에 의해 이미 항암효과가 입증된 rAAV-AShVEGF-A 및 rAAV-AShVEGF-ABC 벡터도 상기와 동일한 방법으로 투여하였다 (표 2).
미세정맥주사방법에 의한 시험군(IV)
시험군 투여용량 (virus particles/mouse) 동물수
대조군 HEPES buffer 8
rAAV-AShVEGF-A 1.5 × 1011 8
rAAV-AShVEGF-ABC 1.5 × 1011 8
rAAV-AShVEGF-ABC + rAAV-TShVEGFR-1 +rAAV-TShVEGFR-2 1.5 × 1011 8
투여 후 10분, 30분, 1시간, 2시간, 4시간, 12시간까지 생존 확인 및 기타 임상 증상을 관찰하였으며, 그 후 4주간 매일 2회 마우스의 생존 및 이상 유무를 관찰하였다.
(3) 체중변화 및 종양체적 측정
모든 동물의 체중을 투여 직전과, 시험물질 투여 후 주 2회 측정하였고, 종양의 체적도 주 2회 버니어 캘리퍼스(vernier calipers)를 이용하여 4주 동안 측정하였다. 그 결과, 낮은 체중증가율을 보였고, 암 치료효과와 시험동물의 체중변화율과는 상관관계가 없는 것으로 관찰되었다.
한편, 종양체적 변화율을 조사한 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, rAAV-AShVEGF-A 투여군 및 rAAV-AShVEGF-ABC 투여군에 비해, 본 발명에 따른 유전자 치료제인 [rAAV-AShVEGF-ABC + rAAV-TShVEGFR-1 + rAAV-TShVEGFR-2] 투여군에서 탁월한 종양억제 효과를 나타낸다는 것을 확인할 수 있었다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 VEGF-A, VEGF-B 및 VEGF-C의 안티센스 cDNA를 함유하는 rAAV 벡터, VEGFR-1의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV 벡터 및 VEGFR-2의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 rAAV 벡터를 포함하는 암의 유전자 치료제를 제공하는 효과가 있다.
본 발명에 따른, 유전자 치료제는 종양의 증식 및 전이에 필수적인 혈관신생에 관여하는 VEGF의 발현 및 기능을 억제하여, 종양의 성장을 감소시킴으로서 암을 유전자 차원에서 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (3)

  1. 다음의 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV) 벡터를 포함하는 암의 유전자 치료제:
    (a) 서열번호 1의 염기서열을 가지는 VEGF-A의 안티센스 cDNA, 서열번호 4의 염기서열을 가지는 VEGF-B의 안티센스 cDNA 및 서열번호 7의 염기서열을 가지는VEGF-C의 안티센스 cDNA를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV);
    (b) 서열번호 12의 염기서열을 가지는 VEGFR-1의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV); 및
    (c) 서열번호 15의 염기서열을 가지는 VEGFR-2의 가용성 불완전(truncated soluble) cDNA를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스(rAAV).
  2. 삭제
  3. 삭제
KR1020050071557A 2005-08-05 2005-08-05 ⅤＥＧＦ－Ａ，ⅤＥＧＦ－Ｂ，및 ⅤＥＧＦ－Ｃ의 안티센스 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 ⅤＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스를 포함하는 암의 유전자 치료제 Expired - Lifetime KR100772424B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050071557A KR100772424B1 (ko) 2005-08-05 2005-08-05 ⅤＥＧＦ－Ａ，ⅤＥＧＦ－Ｂ，및 ⅤＥＧＦ－Ｃ의 안티센스 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 ⅤＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스를 포함하는 암의 유전자 치료제

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020050071557A KR100772424B1 (ko) 2005-08-05 2005-08-05 ⅤＥＧＦ－Ａ，ⅤＥＧＦ－Ｂ，및 ⅤＥＧＦ－Ｃ의 안티센스 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 ⅤＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스를 포함하는 암의 유전자 치료제

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20070016688A KR20070016688A (ko) 2007-02-08
KR100772424B1 true KR100772424B1 (ko) 2007-11-01

Family

ID=41637245

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020050071557A Expired - Lifetime KR100772424B1 (ko) 2005-08-05 2005-08-05 ⅤＥＧＦ－Ａ，ⅤＥＧＦ－Ｂ，및 ⅤＥＧＦ－Ｃ의 안티센스 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 ⅤＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스를 포함하는 암의 유전자 치료제

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR100772424B1 (ko)

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000068506A (ko) * 1996-09-06 2000-11-25 테크니온 리서치 앤 디벨롭먼트 컴파니 리미티드 혈관형성 인자 및 그의 심혈관계 질병 치료용의 용도

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20000068506A (ko) * 1996-09-06 2000-11-25 테크니온 리서치 앤 디벨롭먼트 컴파니 리미티드 혈관형성 인자 및 그의 심혈관계 질병 치료용의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
KR20070016688A (ko) 2007-02-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU756549B2 (en) Interleukin-3 gene therapy for cancer
Angarita et al. Mounting a strategic offense: fighting tumor vasculature with oncolytic viruses
Conrad et al. Linking transgene expression of engineered mesenchymal stem cells and angiopoietin-1–induced differentiation to target cancer angiogenesis
JP7538210B2 (ja) がん細胞療法用のｐ２１発現単球
Chiocca et al. Viral therapy for glioblastoma
Emdad et al. Cancer terminator viruses (CTV): A better solution for viral‐based therapy of cancer
JP2003526685A (ja) 腫瘍治療用の全身性遺伝子送達運搬体
US20110178282A1 (en) Methods and compositions for cancer therapy using a novel adenovirus
KR100772424B1 (ko) ⅤＥＧＦ－Ａ，ⅤＥＧＦ－Ｂ，및 ⅤＥＧＦ－Ｃ의 안티센스 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스 및 ⅤＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관 바이러스를 포함하는 암의 유전자 치료제
KR102169798B1 (ko) 아데노바이러스의 감염 및 복제가 가능한 중간엽 줄기세포주
CN110072593A (zh) 适用于肾癌治疗的方法和药物组合物
KR100563099B1 (ko) ＶＥＧＦＲ 트렁케이티드 솔루블 ｃＤＮＡ를 함유하는재조합 아데노-연관 바이러스（ｒＡＡＶ）및 이를 함유하는대장암, 방광암 및/또는 폐암 특이적 유전자 치료제
KR100737286B1 (ko) ＶＥＧＦＲ 트렁케이티드 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합아데노-연관 바이러스 및 이를 함유하는 암-특이적 유전자치료제
KR100697321B1 (ko) ＶＥＧＦ－Ａ, ＶＥＧＦ－Ｂ 및 ＶＥＧＦ－Ｃ의 안티센스ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합 아데노-연관바이러스（ｒＡＡＶ） 및 이를 함유하는 대장암, 방광암및/또는 폐암 특이적 유전자 치료제
KR100732248B1 (ko) ＶＥＧＦ 안티센스 ｃＤＮＡ를 함유하는 재조합아데노-연관 바이러스（ｒＡＡＶ）및 이를 함유하는 대장암및/또는 폐암 특이적 유전자 치료제
KR20060005163A (ko) ＶＥＧＦ-Ａ 안티센스 ｃＤＮＡ와 아데노-연관 바이러스를함유하는 대장암 및/또는 폐암-특이적 유전자 치료제
WO2007018322A1 (en) Gene therapeutic agent of cancer comprising recombinant adeno-associated virus containing antisense cdnas of vegf-a, vegf-b and vegf-c and recombinant adeno-associated virus containing vegfr truncated soluble cdna
Meng et al. Tumor suppressor gene therapy for cancer: from the bench to the clinic
WO2007013704A1 (en) Recombinant adeno-associated virus comprising antisense cdnas of vegf-a, vegf-b and vegf-c and gene therapeutic agent specific to large intestine cancer, bladder cancer and/or lung cancer comprising the same
WO2005037218A2 (en) Lentiviral vector delivery of il-21 for treatment of cancer
WO2007026973A1 (en) Recombinant adeno-associated virus containing vegfr truncated cdna and gene therapeutic agent for cancer comprising the same
Pan et al. The latest advances of experimental research on targeted gene therapy for prostate cancer
Vega et al. Viral vectors in cancer immunotherapy
Carroll et al. Gene therapy for liver tumors
US20050281785A1 (en) Method of reducing side effects of cancer therapy using p53 recombinant adenovirus

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
PA0109 Patent application

St.27 status event code: A-0-1-A10-A12-nap-PA0109

PA0201 Request for examination

St.27 status event code: A-1-2-D10-D11-exm-PA0201

N231 Notification of change of applicant
PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-3-3-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-3-3-R10-R11-asn-PN2301

D13-X000 Search requested

St.27 status event code: A-1-2-D10-D13-srh-X000

D14-X000 Search report completed

St.27 status event code: A-1-2-D10-D14-srh-X000

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

E13-X000 Pre-grant limitation requested

St.27 status event code: A-2-3-E10-E13-lim-X000

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

PG1501 Laying open of application

St.27 status event code: A-1-1-Q10-Q12-nap-PG1501

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

St.27 status event code: A-1-2-D10-D21-exm-PE0902

P11-X000 Amendment of application requested

St.27 status event code: A-2-2-P10-P11-nap-X000

P13-X000 Application amended

St.27 status event code: A-2-2-P10-P13-nap-X000

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

St.27 status event code: A-1-2-D10-D22-exm-PE0701

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

St.27 status event code: A-2-4-F10-F11-exm-PR0701

PR1002 Payment of registration fee

St.27 status event code: A-2-2-U10-U11-oth-PR1002

Fee payment year number: 1

PG1601 Publication of registration

St.27 status event code: A-4-4-Q10-Q13-nap-PG1601

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R14-asn-PN2301

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 4

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 5

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20121017

Year of fee payment: 6

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 6

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20131004

Year of fee payment: 7

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140929

Year of fee payment: 8

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20151005

Year of fee payment: 9

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 9

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-4-4-P10-P22-nap-X000

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20161004

Year of fee payment: 10

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 10

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-4-4-P10-P22-nap-X000

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20171011

Year of fee payment: 11

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20181108

Year of fee payment: 12

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 12

P22-X000 Classification modified

St.27 status event code: A-4-4-P10-P22-nap-X000

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 13

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R14-asn-PN2301

P14-X000 Amendment of ip right document requested

St.27 status event code: A-5-5-P10-P14-nap-X000

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 14

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R14-asn-PN2301

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 15

P14-X000 Amendment of ip right document requested

St.27 status event code: A-5-5-P10-P14-nap-X000

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 16

PN2301 Change of applicant

St.27 status event code: A-5-5-R10-R13-asn-PN2301

St.27 status event code: A-5-5-R10-R11-asn-PN2301

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 17

P14-X000 Amendment of ip right document requested

St.27 status event code: A-5-5-P10-P14-nap-X000

PR1001 Payment of annual fee

St.27 status event code: A-4-4-U10-U11-oth-PR1001

Fee payment year number: 18

R18-X000 Changes to party contact information recorded

St.27 status event code: A-5-5-R10-R18-oth-X000

PC1801 Expiration of term

St.27 status event code: N-4-6-H10-H14-oth-PC1801

Not in force date: 20250806

Ip right cessation event data comment text: Termination Category : EXPIRATION_OF_DURATION