KR100776830B1 - 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료 - Google Patents

리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료 Download PDF

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Abstract

리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료가 제공된다.
본 발명에 따른 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료는 세포막 내의 환경하에서 방출되는 형광의 세기가 크고, 세포막의 소수성 영역과 친수성 영역을 명확히 구분할 수 있기 때문에 실제 리피트 래프트 영역을 제대로 영상화할 수 있으며, 세포에 적용하였을 때 독성이 없으므로 장시간에 걸쳐 리피드 래프트의 실시간 영상을 얻을 수 있는 등 생체 영상 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료{Two-photon dyes for real time imaging of lipid rafts}
도 1은 비교예 1 및 실시예 1에 의해 제조된 이광자 염료들에 대하여 용매의 극성도에 따라 단일 광자 방출 파장의 변화를 측정한 결과이다.
도 2는 DOPC, DOPC/sphingo/chol 및 DPPC 리포좀에 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조된 이광자 염료를 염색한 후 이들의 분광학적 특성을 도시한 그래프이다.
도 3은 DOPC, DOPC/Sphingo/Chol, DPPC로 구성된 거대 단일막 소낭에 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조된 이광자 염료를 염색한 후 편광에 의해 방출되는 형광을 나타내는 결과이다.
도 4는 DOPC, DOPC/Sphingo/Chol, DPPC로 구성된 거대 단일막 소낭에 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조된 이광자 염료를 염색한 후 측정한 이광자 형광 GP 영상이다.
도 5는 DOPC, DOPC/Sphingo/Chol, DPPC로 구성된 거대 단일막 소낭에 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조된 이광자 염료를 염색한 후 측정한 이광자 형광 GP 분포곡선이다.
도 6은 실시예 1에 의해 제조된 이광자 염료로 A431 세포를 염색한 후 측정한 GP 영상 및 GP 분포곡선이다.
도 7은 실시예 1에 의해 제조된 이광자 염료의 MTT 어세이 수행 결과이다.
도 8은 실시예 1에 의해 제조된 이광자 염료로 A431 세포를 염색한 후 촬영한 시간별 영상이다.
본 발명은 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료(Two photon dye)에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 물에서의 용해도가 크고 세포 독성이 없으며 이광자 형광의 세기가 크기 때문에 리피드 래프트의 실시간 영상에 적합한 이광자 염료에 관한 것이다.
리피드 래프트(lipid raft)는 최근 신호전달이 일어나는 세포소기관으로 제안되었으며 이를 통하여 질병이 발생되는 메카니즘에 대한 연구가 활발이 진행되고 있다. 리피트 래프트란 '인지질의 바다'에 떠있는 뗏목이란 의미를 가지는데, 구체적으로는 글리세로포스포리피드(glycerophospholipids)로 이루어진 바다에 글리코스핀고리피드(glycosphingolipids)와 콜레스테롤로 이루어진 단단한(rigid) 영역이 떠있는 플라즈마 멤브레인으로서 신호전달물질들이 존재하는 분획화된 원형질막을 의미한다. 만일 신호전달물질들이 유동성이 큰 원형질막에 제멋대로 위치한다면 신호전달 과정자체의 효율성과 속도는 상당히 떨어질 수밖에 없기 때문에 이러한 신호전달물질들을 일정한 장소에 모이게 하여 조직화함으로써 신호전달과정을 효율적으로 이루어지도록 하는 매개체가 필요한데, 이러한 매개체가 바로 리피드 래프트 인 것이다. 이러한, 리피드 래프트는 EGF, PDGF, insulin, IGF, VEGF, TNF 등에 대한 수용체뿐만이 아니라 여러 신호전달물질을 포함하고 있기 때문에 신호전달과정의 중심지라 할 수 있으며, 체내에서 광우병, 치매, 암, 세균성 질환 등의 발생 메커니즘과 밀접한 관계를 가진다고 알려져 있다.
따라서, 상기와 같은 신호전달, 광우병, 치매, 암 등을 이해하기 위하여 리피드 래프트에 대한 연구가 활발히 진행되고 있는데, 리피드 래프트의 직경은 100nm 이하이기 때문에 광학현미경 등으로는 그 실체를 관찰하기가 불가능하다. 따라서, AFM을 이용한 방법이 시도되었으나 실재 세포의 경우 리피드 성분 이외에도 단백질과 당복합체가 세포표면에 부착되어 있기 때문에 매우 복잡한 지형(topology)를 가지게 되어서 실재 살아있는 세포에서 리피드 래프트의 존재를 확인할 수는 없었다. 또한, 형광현미경을 이용한 방법도 시도되었는데, 이는 리피드 래프트 단백질들에 GFP(Green Fluorescent Protein)을 부착시킨 후, 이 리피드 래프트 단백질을 살아있는 세포에서 관찰하려는 시도였는데, 리피드 래프트가 존재한다면 이들 단백질들은 점무늬 패턴을 보여주어야 하지만 현재까지 어떤 리피드 래프트 단백질들도 상기와 같은 점무늬 패턴을 보여주지 못하고 있고 따라서 실재 세포에 리피드 래프트가 존재하는지에 대한 논란의 여지가 있었다.
그 결과 최근에는 형광 표지자를 이용하여 리피드 래프트의 분자영상을 얻으려는 시도가 행해졌는데, 리피드 래프트의 분자영상에 가장 널리 사용되고 있는 형광 표지자는 20년 전에 Weber교수가 개발하여 현재 Molecular Probe에서 상품화한 로단(Laurdan)이다. 이 물질은 모델 세포막(model membrane)의 액체 질서상(liquid ordered phase)와 액체 무질서상(liquid disordered phase)의 거동을 설명해 줄 수 있으므로 세포막의 모형 연구에 널리 사용되고 있으며, 최근에는 이것을 세포에 염색하여 세포막에 존재하는 리피드 래프트를 알아내고자 하는 연구가 시도되었으나 (PNAS, 1996, 93, 11443), 실험결과의 재현성이 없는 문제점이 있었다.
하기 화학식 1의 로단은 단일광자 형광 염료로 개발되었으며 약 365 nm의 광자를 흡수하여 들뜬 상태(excited state)에 도달하게 된다. 들뜬 상태의 로단은 다시 바닥 상태(ground state)로 돌아오면서 특정 파장의 형광을 방출하게 되는데, 이 형광은 로단이 녹아 있는 용매의 극성에 따라 서로 다른 파장에서 나오게 된다. (Weber G, et al., Biochemistry 18:3075-3078 (1979)). 최근에는 상기 로단을 세포 영상에 사용하기 위하여 이광자 형광 염료로 사용하고 있다.
Figure 112007047494795-pat00001
1932년 Maria Gopper-Mayer(Ann, Phys. 9(1931) 273)은 두 개의 광자를 자발적으로 흡수하는 현상을 예측하였으나, 이러한 이광자 들뜸(two photon excitation)현상은 강한 레이저 광원이 개발되기 전까지는 오랫동안 실용화되어 있지 않았다. 이광자 들뜸이란 센 광원을 조사하는 것에 의해, 단위 부피 및 단위 시간당의 광자 밀도가 충분히 높은 동일한 발광단에 2개의 광자가 동시에 흡수되는 현상을 말한다. 이때 흡수되는 에너지는 2개의 광자의 에너지의 합이며, 이광자 들뜸의 가능성은 광자밀도의 제곱에 의존한다. 따라서, 2개의 광자 흡수는 2차의 비선형(non-linear) 광학성질이다. 한편, 이러한 들뜬 상태는 바닥상태로 전이하며 밴드 갭 에너지에 해당하는 에너지를 형광으로 방출하게 되는데, 이를 이광자 형광(two photon fluorescence)이라 하며 상기 방출되는 광자의 에너지는 상기 조사 광원의 광자 에너지보다 당연히 크다. 이러한 이광자 들뜸에 의해 형광 발광을 수반하는 물질을 통상 이광자 염료라고 하는데, 이러한 이광자 염료는 물론 상기 밴드 갭 에너지에 해당하는 광자 에너지를 제공할 수 있는 광원에 의해서도 들뜰 수 있고, 이를 1광자 들뜸이라고 한다. 이광자 들뜸에 의한 형광발광의 스펙트럼은 1광자 들뜸에 의한 형광 발광 스펙트럼과 동일한 스펙트럼 특성을 가진다.
이러한 이광자 들뜸의 첫 번째 특징은 들뜸이 광조사점의 제한된 3차원 영역 근방에서만 일어나며, 따라서 상기 들뜸에 의한 형광 발광이 3차원 공간 편재화(localization)되기 때문에 백그라운드 형광(background fluorescence)이 최소화될 수 있다는 것이고, 조사되는 빛의 파장과 발광형광의 파장이 서로 다르다는 것이 두 번째 특징이 된다. 특히, 상기 이광자 들뜸은 들뜸 체적(excitation volume)이 상당히 작기 때문에 작은 체적의 시료를 관찰하는데 적합하다.
한편, 상기에서 언급한 바와 같은 특징으로 인하여, 근적외선 영역의 빛을 조사함으로써 이광자 들뜸을 일으킬 수 있는 이광자 분광학(Two Photon Microscopy)은 생체 영상(bio imaging) 분야에 있어 많은 주목을 받고 있다. 그 이유는 근적외선을 조사하기 때문에 생체 분자에 대한 손상이 적어서 살아 있는 세 포에 적용할 수 있으며, 근적외선의 투과 깊이(penetration depth)가 깊고, 세포 자발 형광(tissue auto-fluorescence)을 최소화할 수 있기 때문이다.
이러한 이광자 분광학에 사용되는 이광자 염료는 i) 근적외선 영역에서의 이광자 단면적(two photon cross section:δTPA)이 커야하고, ii) 물에 대한 적당한 용해도를 가질 것, ii) 광안정성(photostability)이 클 것 및 iv) 생체에 대한 결합력이 우수할 것 등의 요건을 만족해야 한다.
상기 로단은 구조적으로 소수성 꼬리를 갖고 있어서 세포막에 함입될 수 있고, 세포막에 존재하는 로단은 세포막의 유동성을 측정하는 중요한 지표가 될 수 있다. 현재 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 등의 방법을 이용하면 리프트 래프트의 존재를 확인할 수 있는데, 진핵세포의 세포막은 유동성이 큰 인지질 영역과 유동성이 작은 리피드 래프트 영역을 가지고 있다고 판단된다. 상기 인지질 영역은 불포화 지방산을 포함하고 있어서 물이 자유로이 통과할 수 있는 즉 상대적인 친수성 환경을 가지고 있는 반면, 당지질과 콜레스테롤로 주로 구성되어 있는 리피드 래프트 영역은 포화 지방산과 콜레스테롤 때문에 유동성이 작으면서 딱딱하여 물이 쉽게 통과하지 못하는 상대적인 소수성 환경을 가지고 있다. 상기 로단은 친수성 환경을 가지는 인지질에서는 470∼530nm의 형광을 방출하고, 소수성 환경을 지니는 리피드 래프트에서는 400∼460nm의 형광을 방출하는 성질을 가지고 있기 때문에 세포막에서 리피드 래프트를 가시화하는데 사용하여 왔다(Gaus et al., PNAS, 100, 15554, 2003; Gaus et al., JCB, 171, 121, 2005). 그러나 로단은 물에서 용해도가 매우 낮아 침전되어 450nm의 형광을 내기 때문에 리피드 래프트 영역에서의 방출파장과 혼동되어 실제 리피드 래프트를 가시화하는데 한계가 있으며, 용매의 극성도를 제대로 반영하지 못할 뿐만 아니라 대부분 수분으로 이루어진 세포내의 환경에서 방출되는 형광의 세기가 충분하지 않다는 문제점이 있었다. 또한, 인지질과 리피트 래프트가 혼합된 상태인 세포막 내에서 유동성이 작은 막 부분에 우선적으로 결합하는 문제점 때문에 유동성이 작은 막 부분과 유동성이 큰 막 부분의 영상을 제대로 구분하기 어렵다는 단점이 있었다.
따라서, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이광자 염료의 극성을 적절히 조절하는 것에 의하여 세포막 내의 친수성 영역 및 소수성 영역에 대한 상호작용을 균등하게 조절할 수 있으며, 세포막 내의 환경에서의 형광 세기가 크고 세포막 내에서 유동성이 작은 부분과 유동성이 큰 부분을 명확히 구분하여 영상화할 수 있기 때문에 리피드 래프트의 가시화 및 실시간 영상에 적합한 이광자 염료를 제공하는 것이다.
본 발명은 상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 하기 화학식 2의 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료를 제공한다.
Figure 112007047494795-pat00002
(상기 식에서, R1은 탄소수 5 내지 17의 알킬기이고,
R2는 -COOH, -CH2SO3Na 또는 ,
Figure 112007047494795-pat00003
이며,
상기 R3는 탄소수 5 내지 17의 알킬기임)
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 화학식 2의 화합물은 하기 화학식 3의 화합물일 수 있다.
Figure 112007047494795-pat00004
(상기 식에서, R1은 탄소수 5 내지 17의 알킬기임)
본 발명의 다른 실시예에 의하면, 상기 화학식 2의 화합물은 하기 화학식 4의 화합물일 수 있다.
Figure 112007047494795-pat00005
(상기 식에서, R1은 탄소수 5 내지 17의 알킬기임)
또한, 상기 화학식 2의 화합물은 하기 화학식 5의 화합물일 수 있다.
Figure 112007047494795-pat00006
(상기 식에서, R1 및 R3는 각각 탄소수 5 내지 17의 알킬기임)
본 발명의 또 다른 실시예에 의하면, 상기 화학식 3의 화합물은 하기 화학식 6으로 표시되는 군에서 선택된 어느 하나의 화합물일 수 있다.
Figure 112007047494795-pat00007
또한, 상기 화학식 4의 화합물은 하기 화학식 7로 표시되는 군에서 선택된 어느 하나의 화합물일 수 있다.
Figure 112007047494795-pat00008
또한, 상기 화학식 5의 화합물은 하기 화학식 8로 표시되는 군에서 선택된 어느 하나의 화합물일 수 있다.
Figure 112007047494795-pat00009
본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 상기 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료의 이광자 흡수 효율은 생체 상태에서 20 GM(10-50cm4s/photon) 이상이며, 이광자 여기광원의 파장범위는 750∼1000nm이고, 형광의 파장범위는 400∼700nm인 것일 수 있다.
또한, 더욱 바람직하게는 상기 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료의 이광자 흡수 효율은 150GM 이상이고, 소수성이 큰 환경(용매, 리포좀 및 GUV)에 서는 430∼470nm의 형광을, 친수성 환경(용매, 리포좀 및 GUV)에서는 470∼530nm의 형광을 방출하는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명에 따른 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료는 지질과의 상호작용이 우수하기 때문에 세포막에 염색이 잘 되며, 수분이 대부분인 세포막 내의 환경하에서 방출되는 형광의 세기가 크고, 소수성이 큰 환경(용매, 리포좀 및 GUV)에서는 430∼470nm의 형광을, 친수성 환경(용매, 리포좀 및 GUV)에서는 470∼530nm의 형광을 방출하여 양자의 구분이 명확하기 때문에, 세포막에 존재하는 리피드 래프트를 실시간으로 영상화할 수 있으며, 세포에 적용하였을 때 독성이 없으므로 장시간에 걸쳐 리피드 래프트의 실시간 영상을 얻을 수 있다는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료는 하기 식 1의 구조를 가지는 것을 특징으로 한다.
Figure 112007047494795-pat00010
(1)
(상기 식에서, R1은 탄소수 5 내지 17의 알킬기이고,
R2는 -COOH, -CH2SO3Na 또는 ,
Figure 112007047494795-pat00011
이 며,
상기 R3는 탄소수 5 내지 17의 알킬기임)
즉, 본 발명에 따른 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료는 상기 R2가 극성의 작용기이기 때문에 물에 대한 용해도를 향상시킬 수 있으며, 세포막에서 지질과의 상호작용이 우수하므로 세포막에 염색이 골고루 잘 되고, 더욱 밝은 영상을 얻을 수 있다. 또한, 근적외선을 흡수하여 발광하기 때문에 세포에 전혀 해를 미치지 않고 광탈색(photobleaching)이 잘 일어나지 않으므로 장시간에 걸쳐 실시간 영상을 획득하는데 매우 유리하다는 장점이 있다. 상기 R2에 카르보닐(TPD1), 설포닐(TPD2) 및 포스파티딜콜린(TPD3)의 각기 다른 극성 작용기를 도입함으로써 실제 세포의 지방산 및 인지질의 모양과 유사한 형태를 띠도록 제조할 수 있다.
상기 R1은 소수성 부분으로서 세포막에 함입되는 역할을 한다. 상기 R1은 탄소수 5 내지 17의 알킬기인데, 탄소수가 5 미만인 때에는 소수성이 미약하고, 17을 초과하는 때에는 물에 대한 용해도가 급격히 줄어들어 침전이 생기며 종래의 로단과 같은 문제점이 발생하기 때문에 탐침으로서 적당하지 않다.
본 발명에 따른 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료는 하기 식 2 내지 4의 화합물인 것이 바람직하다.
Figure 112007047494795-pat00012
(2)
(상기 식에서, R1은 탄소수 5 내지 17의 알킬기임: 이하, TPD1이라 함)
Figure 112007047494795-pat00013
(3)
(상기 식에서, R1은 탄소수 5 내지 17의 알킬기임: 이하, TPD3이라 함)
Figure 112007047494795-pat00014
(4)
(상기 식에서, R1 및 R3는 각각 탄소수 5 내지 17의 알킬기임: 이하, TPD2이라 함)
또한, 본 발명에 따른 상기 식 2 또는 3의 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료에서 R1은 탄소수 5개, 11개 또는 17개인 알킬기인 것이 바람직한데, 그 이유는 소수성 탄소수의 길이에 따라 세포막의 친수성 및 소수성 위치에 선택적으로 염색을 시킬 수 있으므로, 다양한 세포작용의 영상을 얻을 수 있기 때문이다.
또한, 본 발명에 따른 상기 식 4의 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료에서 R1은 탄소수 5개, 9개 또는 11개인 알킬기이고, R3는 탄소수 11개 또는 15개인 알킬기인 것이 바람직한데 그 이유 역시 소수성 탄소수의 길이에 따라 세포막의 친수성 및 소수성 위치에 선택적으로 염색을 시킬 수 있으므로, 다양한 세포작용의 영상을 얻을 수 있기 때문이다.
본 발명에 따른 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료의 이광장 흡수 효율은 생체 상태에서 20GM 이상이며, 여기광원의 파장범위는 750∼1000nm이고, 형광의 파장범위는 400∼700nm인 것을 특징으로 하는데, 더욱 바람직하게는 상기 이광자 흡수 효율은 150GM 이상이다.
이미 언급한 바와 같이, 종래의 대표적인 이광자 염료인 로단의 경우에는 친수성 환경을 가지는 인지질에서는 470∼530nm의 형광을 방출하고, 소수성 환경을 지니는 리피드 래프트에서는 400∼460nm의 형광을 방출하는 성질을 가지고 있기 때문에 세포막에서 리피드 래프트를 가시화하는데 사용하여 왔으나, 물에서의 용해도가 낮아 침전이 되며, 이에 의해 친수성 환경에서도 450nm의 형광을 방출하기 때문에 리피드 래프트를 가시화하는데 한계가 있었다. 그러나, 본 발명에 따른 이광자 염료는 물에 대한 용해도가 크기 때문에 표지자로 사용하기에 적절한 농도에서는 침전을 형성하지 않으며, 소수성이 큰 환경(용매, 리포좀 및 GUV)에서는 430∼ 470nm의 형광을 방출하고, 친수성 환경(용매, 리포좀 및 GUV)에서는 470∼530nm의 형광을 방출하기 때문에 세포막의 소수성 환경과 친수성 환경을 방출되는 형광에 의해 명확하게 구분할 수 있으며, 다양한 스트레스(열충격, 저산소증, 고장액충격 등)에 놓인 세포에서 원형질막의 유동성 변화는 물론 리피드 래프트의 역동성을 확인하는데 매우 적합하다.
또한, 후술하는 바와 같이, 본 발명에 따른 이광자 염료는 세포막의 친수성 및 소수성 환경에 대한 GP(Generalized Polarization) 값의 분포가 상호 대칭적이며 세포막내의 친수성 영역과 소수성 영역에 균등하게 분포되기 때문에 리피드 래프트를 명확히 관찰할 수 있다는 장점이 있다.
이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만 본 발명이 이에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1
1-(1) 6- Dodecanoyl -N-methyl-2- naphthylamine 의 제조
MeNH2·HCl (11.0 g, 0.13 mol)를 2-히드록시-6-도데카노일나프탈렌(2-hydroxy-6-dodecanoylnaphthalene)(8.0 g, 25 mmol), Na2S2O5(12 g, 61 mmol), NaOH (5.2 g, 0.13 mol) 및 물(100ml)가 혼합된 혼합물에 투입한 다음, 고압관에서 140℃로 48시간 동안 교반하였다. 생성된 고체를 걸러내고 물로 충분히 씻어 준 후 CH2Cl2-EtOH 로 재결정하여 6-도데카노일-N-메틸-2-나프틸아민을 제조하였다. (5.6 g, 수율: 67 %)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ8.31 (s, 1H), 7.94 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.91 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 6.77 (s, 1H), 3.97 (br s, 1H), 3.03 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 2.97 (s, 3H), 1.77 (quin, J = 7.5 Hz, 2H), 1.26 (m, 16H), 0.88 (t, J = 7.5 Hz, 3H)
13C-NMR (75MHz, CDCl3):δ200.59, 149.30, 138.23, 130.91, 130.87, 130.08, 126.22, 126.19, 125.05, 118.60, 103.28, 38.64, 32.15, 29.88, 29.86, 29.78, 29.77, 29.76, 29.74, 29.58, 25.09, 22.92, 14.36;
1-(2) TPD1 의 제조
상기 실시예 1-(1)에서 제조된 6-도데카노일-N-메틸-2-나프틸아민 (3.0 g, 8.8 mmol), 메틸 브로모아세테이트(methyl bromoacetate) (2.0 g, 13 mmol), Na2HPO4 (1.9 g, 13 mmol), 및 NaI (0.5 g, 3.5 mmol)로 된 혼합물을 질소 대기 하에서 80℃로 18시간 동안 교반하였다. 상기 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 브린(brine)으로 충분히 씻어주었다. 생성물을 얻기 위하여 에탄올로 재결정시켜 노란색 고체의 중간체를 얻을 수 있었다. 상기 중간체(2.0 g, 4.9 mmol)와 KOH (0.70 g, 12 mmol) 를 5시간 동안 에탄올(50ml)에서 교반하였다. 이 용액을 얼음물 (100 mL)로 묽히고 5℃ 이하에서 pH가 3이 될 때까지 진한 염산을 가하고 난 후, 생성된 침전물을 걸러냈다. 이 침전물을 증류수로 충분히 씻어준 후, chloroform- petroleum ether로 재결정시켜 흰색 고체상태의 TPD1을 얻었다. (1.5 g, 수율: 79 %)
1H-NMR (300 MHz, DMSO d 6): δ12.70 (br s, 1H), 8.43 (s, 1H), 7.89 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.80 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.66 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.20 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.92 (s, 1H), 4.26 (s, 2H), 3.09 (s, 3H), 3.03 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.61 (quin, J = 7.5 Hz, 2H), 1.22 (m, 16H), 0.83 (t, J = 7.5 Hz, 3H);
13C-NMR (75MHz, DMSO d 6): δ199.91, 172.44, 149.83, 137.75, 131.30, 130.71, 130.46, 126.66, 125.44, 124.69, 116.70, 105.56, 100.29, 39.75, 38.17, 31.99, 29.72, 29.70, 29.68, 29.65, 29.46, 29.41, 24.92, 22.80, 14.66;
실시예 2
TPD2 의 제조
상기 실시예 1-(1)에서 제조된 6-도데카노일-N-메틸-2-나프틸아민 (3.0 g, 8.8 mmol), BrCH2CH2SO3Na (2.1 g, 10.0 mmol), 및 Proton-sponge (2.2 g, 10.3 mmol)로 된 혼합물을 질소 대기 하에서 150℃로 12시간 동안 DMF (50 mL)에서 교반하였다. 상기 혼합물을 물과 디클로로메탄으로 추출하고, 소금물로 충분히 씻어주었다. 다음으로, 용매를 증발시키고 메탄올:에틸아세테이트=1:5인 용매를 사용하여 실리카 겔 컬럼으로 생성물을 정제였고, 클로로포름으로 재결정하여 TPD2를 제조하였다. (1.8 g, 수율: 44 %)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ8.42 (s, 1H), 7.90 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.89 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 6.90 (s, 1H), 3.71 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.08 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 3.01 (s, 3H), 2.68 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.61 (quin, J = 7.5 Hz, 2H), 1.26 (m, 16H), 0.83 (t, J = 7.5 Hz, 3H)
실시예 3
TPD3 의 제조
상기 실시예 1-(2)에서 제조된 TPD1 (1.6 g, 4.0 mmol), 하기 화학식 9의 화합물 (1.0 g, 2.0 mmol), DCC (2.4 g, 11.6 mmol), 및 디메틸아미노피리딘(dimethyl amino pyridine:DMAP) (0.24 g, 2.0 mmol)로 된 혼합물을 질소 대기 하에서 96시간 동안 클로로포름 (50 mL)에서 교반하였다.
Figure 112007047494795-pat00015
다음으로, 용매를 증발시키고 클로로포름:메탄올:물=18:9:1인 용매를 사용하 여 실리카 겔 컬럼으로 생성물을 정제하여 TPD3를 얻었다. (2.2 g, 수율: 63 %)
1H-NMR (600 MHz, CDCl3): δ8.27 (s, 1H), 7.88 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 6.85 (s, 1H), 5.23 (br m, 1H), 4.39 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 4.26 (d, J = 18 Hz, 1H), 4.18 (d, J = 18 Hz, 1H), 4.16 (s, 2H), 4.06 (dd, J = 12 Hz, 6.6 Hz, 1H), 3.94 (br s, 2H), 3.57 (br s, 2H), 3.14 (br s, 12H), 2.99 (t, J = 7.2 Hz, 2H), 2.08 (t, J = 7.8 Hz, 2H), 1.72 (m, 2H), 1.43 (m, 2H), 1.38-1.14 (m, 40H), 0.85 (t, J = 7.0 Hz, 6H)
비교예 1
1-(1) 2- Methoxy -6- dodecanoylnaphthalene 의 제조
알루미늄 클로라이드 (32.9 g, 0.25 mol)를 무수 니트로벤젠에 녹인 후 질소 대기 하에서 2-methoxynaphthalene (30.1 g, 0.19 mol) 을 가했다. 이 혼합물에 라우릴 클로라이드 (41.6 g, 0.19 mol)를 15분에 걸쳐 10∼13℃ 사이에서 천천히 적가 하고 5℃에서 2시간 동안 교반시킨 후 실온에서 12시간 동안 교반시켰다. 이 혼합물을 0℃에서 300mL의 3M HCl에 부은 후 클로로포름으로 추출하고 소금물로 충분히 씻어 주었다. 용매를 감압하에서 증발시키고 클로로포름으로 녹인 후 0.1M의 NaOH로 씻어 주었다. 마지막으로 클로로포름을 증발시킨 후 에탄올로 재결정하여 2-메톡시-6-도데카노일나프탈렌을 제조하였다. (41.5 g, 수율: 64.2 %)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ8.40 (s, 1H), 8.01 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 7.86 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.77 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.20 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 7.16 (s, 1H), 3.95 (s, 3H),3.06 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.78 (quin, J = 7.5 Hz, 2H), 1.26 (m, 16H), 0.87 (t, J = 7.5 Hz, 3H).
1-(2) 로단의 제조
Li (0.5g, 70 mmol)을 HMPA (20 mL)와 벤젠 (30 mL)에 넣고 dimethylamine (3.5g, 78 mmol)을 적가하고 1시간동안 격렬하게 교반시켰다. 이 혼합물에 상기 비교예 1-(1)에서 제조한 2-메톡시-6-도데카노일나프탈렌 (7.3g, 22 mmol)을 한번에 넣은 후 5시간 동안 실온에서 교반시켰다. 이 혼합물을 얼음물에 붓고 에테르로 추출 후 용매를 증발시키고 에탄올에서 재결정하여 Laurdan을 얻었다. (5.1 g, 수율: 66 %)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): 8.31 (s, 1H), 7.94 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 7.81 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.17 (dd, J = 9.0, 3.0 Hz, 1H), 6.87 (s, 1H), 3.11 (s, 6H), 3.04 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.78 (t, J = 7.5 Hz, 2H), 1.37-1.27 (m, 16H), 0.89 (t, J = 7.5 Hz, 3H)
시험예 1
용매의 극성도 반영 테스트
비교예 1 및 실시예 1에 의해 제조된 이광자 염료들에 대하여 용매의 극성도에 따라 단일광자 형광 파장의 변화를 측정하기 위해, 시간차 형광(time-resolved fluorescence:TRF)을 측정하고 그 결과를 도 1에 도시하였다. 본 시험예에서 용매로는 헥산, DMF, 에탄올 및 물을 사용하였으며, 극성도의 순서는 헥산, DMF, 에탄올 및 물의 순서로 커진다. 도 1을 참조하면, 비교예 1에 의한 이광자 염료(이하, 로단이라 함. 도 1(a))의 경우 용매의 극성이 증가할수록 최대 형광 파장은 증가하고 있으나 물에서 최대 형광 파장은 오히려 감소하여 청색 파장 쪽으로 이동하였고(blue-shifted, 청색 이동), 그 파장 폭이 넓어지고 있음을 확인할 수 있는데, 이는 로단이 물에 거의 녹지 않기 때문에 집합체(aggregate)를 형성하고 있음을 의미한다. 로단은 긴 탄화수소 꼬리를 가지고 있기 때문에 집합체의 이웃 분자의 꼬리에 둘러싸인 염료는 소수성 환경에 놓여있게 되어서 청색 파장 이동을 보여주는 것이다. 즉, 물에 존재하는 로단은 친수성 환경을 반영하지 못하고 오히려 소수성 환경에서 나오는 형광 파장인 400∼460nm의 빛이 방출되며, 따라서, 리피드 래프트의 실시간 영상에 적합하지 않다는 것을 확인할 수 있다. 그러나, 본 발명의 실시예 1에 따른 이광자 염료(이하 TPD1이라 함. 도 1(b))의 경우에는 용매의 극성도가 증가함에 따라 그 방출파장 역시 증가하며 용매의 극성도의 변화를 잘 반영하고 있으므로, 세포막의 극성의 차이에 따라 발광 영역이 명확히 구분된다는 것을 알 수 있다.
시험예 2
분광학적 성질의 측정
실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조된 이광자 염료에 대하여 4가지 용매(헥산, DMF, 에탄올 및 물)에 용해시켰을 경우의 단일광자 최대흡수파장(λmax), 단일광자 최대방출파장(λfl max ), 이광자 최대흡수파장 (λ(2) max ), 양자수율(quantum yield:Φ), 이광자 흡수효율(δmax)을 측정하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 흡수스펙트럼은 휴렛 팩커드 8453 다이오드 어레이 스펙트로포토미터(Hewlett-Packard 8453 diode array spectrophotometer)를 사용하여 측정하였고, 형광 스펙트럼은 아미코 보우만 시리즈 2 발광 스펙트로미터(Amico Bowman series 2 luminescence spectrometer)를 사용하여 측정하였다. 이광자 흡수효율은 이광자 단면적(two-photon cross section:δTPA)의 최대값을 의미하며, 상기 이광자 단면적은 하기 수학식 1에 의하여 구할 수 있다.
Figure 112007047494795-pat00016
상기 식에서 하첨자인 s와 r은 샘플과 레퍼런스 분자를 의미하며, δ는 구하고자 하는 이광자 단면적이고, CCD 디텍터에 의해 수집된 시그널의 강도를 S로 표시하고, 형광 양자효율을 Φ 로 표시하였으며 φ는 실험장비의 전체 형광 수집효율 을 의미한다. 용액 내 분자의 수밀도(number density)는 c로 표시하였다. δr은 레퍼런스 분자의 이광자 단면적을 의미한다.
용매 λmax λfl max λ(2) max Φ δmax (GM)
실시예 1 비교예 1 실시예 1 비교예 1 실시예 1 비교예 1 실시예 1 비교예 1 실시예 1 비교예 1
헥산 345 344 404 407 - - 0.10 0.11 - -
DMF 363 356 446 454 780 780 0.36 1.00 167 50
에탄올 383 363 494 487 780 780 0.43 1.00 153 57
물 384 354 522 431 820 - 0.11 0.01 323 -
상기 표 1을 참조하면, 실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조된 이광자 염료들은 모두 DMF와 에탄올에서 양자수율이 상당히 높다는 것을 알 수 있다. 그러나 용매를 에탄올에서 물로 변화시키면 비교예 1의 경우 양자수율이 1/100로 감소하는데 반해, 본 발명에 따른 이광자 염료의 경우에는 양자수율이 1/4로 감소하는데 불과하다는 것을 알 수 있다. 상기 비교예 1에 의한 로단이 물에서 존재할 때 양자수율이 급격하게 감소하는 이유는 침전에 의한 소광현상에 기인하는 것인데, 이처럼 양자수율이 급감하게 되면 형광의 세기 역시 감소하게 된다. 한편, 실시예 1에 따른 염료의 경우 이광자 흡수효율이 최소 153GM이고 최대 323GM으로서 비교예 1에 따른 염료에 비하여 약 3배에서 최대 6배 이상 크기 때문에 로단에 비하여 효율적인 이광자 염료임을 알 수 있다.
시험예 3
리포좀의 극성도 반영 테스트
실시예 1 및 비교예 1에 의해 제조된 이광자 염료들이 리포좀의 극성을 반영하는 정도를 조사하기 위해 유동성(극성)이 서로 다른 세 종류의 리포좀(liposome)을 제작하였다. 첫 번째 DOPC 리포좀은 불포화 지방산을 가지고 있는 1,2-디올레일-sn-글리세롤-3-포스포콜린(1,2-dioleoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine, DOPC)로 만들어 유동성이 상대적으로 크며 원형질막의 인지질의 유동성을 반영하도록 하였으며, 두 번째 DOPC/Sphingo/Chol 리포좀은 DOPC, 스핀고미엘린(sphingomyelin) 및 콜레스테롤(cholesterol)을 같은 비율로 섞어, 인지질과 리피드 래프트를 동시에 반영할 수 있도록 하였고, 세 번째 DPPC 리포좀은 포화 지방산을 가진 1,2-디팔미토일-sn-글리세롤-3-포스포콜린(1,2-dipalmitoyl-sn-glycerol-3-phosphocholine, DPPC)로 구성되어 있어 젤 상태의 유동성이 가장 적은 막으로서 리피드 래프트를 반영하도록 하였다. 다음으로 상기 세 종류의 리포좀에 로단과 TPD1을 염색한 후 이들의 분광학적 특성을 조사하여 그 결과를 도 2에 도시하였다. 도 2(a)(로단) 및 (b)(TPD1)를 참조하면 로단과 TPD1의 단일광자 흡수파장은 리포좀의 종류에 상관없이 360nm와 395 nm에서 최대치를 보인다는 것을 알 수 있다. 그러나 형광의 세기는 리포좀의 소수성이 클수록 증가하였으며(DOPC〈 DOPC/Sphingo/Chol〈 DPPC). 모든 경우에 있어서 TPD1은 로단보다 2∼5배 정도 더 센 형광을 방출한다는 것을 확인할 수 있다. 이는 TPD1의 단일광자 형광 효율이 로단에 비해서 더 크다는 것을 의미한다. 이중극자 분자의 이광자 허용상태는 프랭크-콘돈(Franck-Condon) 상태와 매우 비슷하기 때문에 상기의 결과는 780 nm에서의 TPD1의 이광자 흡수 효율이 더 크다는 사실과 잘 일치한다. 한편, 비교예 1에 따른 로단에 대한 정규화된 형광 스펙트럼 결과인 도 2(c)를 참조하면, DPPC에서 로단의 최대 형광 파장은 440nm이고, DOPC에서의 분광은 좀 더 넓게 퍼져 있으며 439nm와 484nm에서 두 개의 피크를 나타내는데, 이는 로단이 DOPC 리포좀에 잘 녹은 부분과 그렇지 않고 집합체(aggregate)로 존재하는 부분이 동시에 존재한다는 것을 의미한다. 한편, DOPC/Sphingo/Chol과 DPPC에서 로단의 형광 파장대는 상당히 겹쳐 있다는 것을 확인할 수 있는데, 이는 상기 로단이 인지질과 리피드 래프트가 혼합된 리포좀(DOPC/Sphingo/Chol 리포좀)에서 유동성이 큰(sol) 막 부분보다 유동성이 작은(gel) 막 부분에 우선적으로 결합하며, 양자를 영상으로 구분하기 어렵게 된다는 것을 의미한다. 반면에 도 2(d)를 참조하면 본 발명의 실시예 1에 따른 TPD1은 DPPC에서는 442nm의 형광을 방출하고, DOPC에서는 486nm의 형광을 방출하며, DOPC/Sphingo/Chol 리포좀에서 TPD1의 형광 스펙트럼은 넓게 퍼져 있고 이는 DPPC와 DOPC의 형광 스펙트럼을 합친 것과 거의 비슷하다는 것을 확인할 수 있는데, 본 발명에 따른 이광자 염료는 인지질과 래프트가 혼합된 리포좀에서, 유동성이 작은 막 부분과 유동성이 큰 막 부분에 균등하게 분포하고 있다는 것을 보여주는 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 이광자 염료는 세포막 내에서 극성(유동성)의 차이에 관계없이 균등하게 분포하며 극성(유동성)의 차이에 따라 다른 파장대의 형광을 방출하기 때문에 세포막의 극성(유동성)을 명확하게 구분할 수 있도록 하며 리피드 래프트의 실시간 영상에 적합하다는 것을 알 수 있다.
시험예 4
거대 단일막 소낭(GUV)에서의 광선택성 테스트
편광의 각도에 따른 이광자 형광을 조사하면 지질 이중층에 존재하는 이광자 표지자의 상대적인 배열에 대한 정보를 알 수 있다. DOPC, DOPC/Sphingo/Chol, DPPC로 구성된 거대 단일막 소낭(giant unilamellar vesicels, GUVs)들을 제작한 후 이 GUV들에 비교예 1에 따른 로단과 실시예 1에 따른 TPD1을 염색한 후 편광에 의하여 방출되는 형광의 분포를 조사한 후 그 결과를 도 3에 도시하였다. 도 3(a), (b) 및 (c)는 순서대로 비교예 1에 따른 로단을 각각 DOPC GUV, DOPC/Sphingo/Chol GUV 및 DPPC GUV에 염색한 경우의 형광 분포 사진이고, 도3(e), (f) 및 (g)는 순서대로 실시예 1에 따른 TPD1을 각각 DOPC GUV, DOPC/Sphingo/Chol GUV 및 DPPC GUV에 염색한 경우의 형광 분포 사진이다. 도 3을 참조하면 DOPC/Sphingo/Chol 및 DPPC로 구성된 GUV의 경우, 로단 또는 TPD1으로 염색하였을 때에 편광에 대해서 수직을 이루는 지역에서는 형광 세기가 매우 미약함을 알 수 있다. 그러나 도 3(a)를 참조하면 로단으로 염색된 DOPC GUV는 모든 지역에서 균일한 상태의 미약한 형광을 보이고 있는데 이는 로단이 DOPC GUV에서 마구잡이로 배열되어 있음을 보여주는 것이다. 이에 비하여, TPD1으로 염색된 DOPC GUV(도 3(e))에서는 편광에 수직을 이루는 지역에서는 형광이 매우 미약한 반면, 기타 부위에서는 형광의 세기가 큰 것을 확인할 수 있는데 이는 TPD1이 DOPC GUV에서도 지방산 꼬리에 평행하게 배열되어 있음을 보여주는 것이며 본 발명에 따른 이광자 염료는 DOPC GUV에서도 광선택성(photoselection)을 가지며 염색이 균일하게 잘되어 있음을 확인할 수 있다. 한편, 도 3(d) 및 (h)는 지질 이중층에 존재하는 이광자 표지자의 위치를 나타낸 모식도인데, 로단과 TPD1 모두 겔 상태(유동성이 작은 상태)에서는 지질 분자와 평행하게 배열되지만, 유동성이 큰 상태에서는 로단은 마구잡이로 배열되거나 집합체로 존재하게 되지만 TPD1은 지질의 머리 부분 가까이에서 물과 카르복실레이트사이의 친수성 상호작용 때문에 지질분자와 평행하게 배열되는 것으로 생각된다.
시험예 5
GP 영상을 이용한 거대 단일막 소낭의 친수성 및 소수성의 반영도 테스트
형광 염료를 이용하여 GP 영상을 얻을 때는 우선 세포나 모델막을 염색하고 400∼460nm와 470∼530nm에서의 형광의 세기를 하기 수학식 2를 통해 GP(Generalized Polarization)값을 구한 다음, 이값에 따라 색을 입혀서 최종 이미지를 얻는다.
Figure 112007047494795-pat00017
상기 식에서 I (400-460)은 400∼460nm 파장에서의 형광 세기를 의미하고, I (470-530)은 470∼530nm 파장에서의 형광 세기를 의미하며, G는 상기 두개의 파장대 영역에서의 민감도 보정 계수(sensitive correction factor)이다.
상기 GP값이 -1에 가까울수록 친수성인 물질이며 이것은 보라와 파랑색으로 표현되고, 소수성 물질일 경우에는 GP값이 1에 가까우며 빨강과 주황색으로 표현된다. 상기 세 종류의 GUV에 비교예 1에 따른 로단 및 본 발명의 실시예 1에 따른 TPD1을 각각 염색한 후 GP값을 GUV의 횡단면에서 계산한 후 이를 영상으로 전환하여 그 결과를 도 4에 도시하였다. 도 4(a), (b) 및 (c)는 순서대로 비교예 1에 따른 로단을 각각 DOPC GUV, DOPC/Sphingo/Chol GUV 및 DPPC GUV에 염색한 경우의 형광 GP 영상이고, 도 4(d), (e) 및 (f)는 순서대로 실시예 1에 따른 TPD1을 각각 DOPC GUV, DOPC/Sphingo/Chol GUV 및 DPPC GUV에 염색한 경우의 형광 GP 영상이다. 한편, 도 5에는 각각 로단 및 TPD1에 대한 GP 분포 곡선을 도시하였다(파랑:DOPC, 빨강:DPPC, 검정:DOPC/Sphingo/Chol). 도 5를 참조하면 DPPC GUV에서 GP 분포도는 매우 폭이 좁고 GP값은 로단의 경우 0.54, TPD1의 경우 0.41이었다. 또한, DOPC GUV에서 GP값은 로단의 경우 0.044, TPD1의 경우 -0.35였다. DOPC GUV는 친수성이 크기 때문에 GP값이 음의 값이어야 함에도 로단의 GP값이 양의 값을 갖는 이유는 로단이 유동성 막에서 집합체를 형성하기 때문일 것이다. 그러나 TPD1은 유동성 막에서 집합체를 형성하지 않기 때문에 DOPC GUV에서 음의 GP값을 나타내며 친수성 환경이라는 것을 명확히 구분해 낼 수 있다. 이것은 TPD1은 로단에 비해서 유동성이 큰 막과 작은 막을 더욱 뚜렷하게 구별할 수 있다는 것을 보여주는 결과이다. 한편, 비슷한 결과를 DOPC/sphingo/chol로 구성된 GUV의 GP 분포도에서도 확인할 수 있는데, 로단으로 염색된 GUV에서는 GP값이 다소 높으며, TPD1으로 염색된 GUV에서는 GP 분포도가 보다 대칭적임을 보여주고 있다. 각각의 분포도를 가우시안 커 브 피팅을 하여 쌍봉을 가지는 분포도로 전환하였을 때 로단의 경우 0.09와 0.36의 GP값으로서 모두 양의 GP값을 갖지만, TPD1의 경우 -0.14와 0.18의 GP값을 보이는데, 상기 두개의 봉은 서로 대칭되며 GP값도 거의 대칭이 되는 것을 확인할 수 있다. 한편, 여기서도 로단의 GP값이 TPD1에 비해서 상당히 크며, 낮은 GP 값의 분포도는 높은 GP 값의 분포도에 비해서 상당히 넓게 퍼져 있는데 이는 로단이 서로 다른 극성을 가지는 다양한 환경에 노출되어 있으며, 유동성 막에서 로단이 침전물로 존재한다는 것을 보여주는 것이다. 그러나, TPD1으로 염색된 GUV에서 낮은 GP와 높은 GP 분포도의 폭과 모양은 매우 비슷하며 상호 대칭적인데 이는 GUV에서 TPD1이 유동성이 작은 막(소수성)과 큰 막(친수성)의 환경을 보다 더 잘 반영할 수 있으며, 양자를 좀 더 명확히 구분해 낼 수 있다.
본 발명에서 단일광자 및 이광자 형광 이미지는 공초점 다광자 마이크로스코프(spectral confocal multiphoton microscopes, Leica사 제조, TCS SP2)를 이용하여 측정하였다. 단일광자 형광 마이크로스코프는 아르곤 레이저(488nm)를 광원으로 사용하였고, 이광자 형광 마이크로스코프는 모드-락 티타늄/사파이어 레이저(780nm)를 사용하였다. 한편, GP 값의 계산은 자체적으로 개발한 비쥬얼 C++ 기반의 프로그램을 사용하여 수행하였다.
시험예 6
세포에서의 GP 영상 테스트
A431 세포, 및 세포의 원형질막에서 콜레스테롤을 제거하는 methyl-β- cyclodextrin(MβCD)을 A431세포에 처리한 샘플에 대하여 실시예 1 및 비교예 1에 따른 이광자 염료로 염색한 후 이광자 형광 현미경 영상 촬영하고 이를 GP 영상으로 전환한 결과 및 GP 분포도를 도 6에 도시하였다. 상기 MβCD으로 처리하게 되면 콜레스테롤이 제거됨에 따라 세포막의 리피드 래프트가 파괴되는 것으로 알려져 있다. 따라서, 세포막을 MβCD으로 처리하면 친수성을 나타내는 낮은 값의 GP 분포도 피크는 변화가 없어야 하고 소수성을 나타내는 높은 값의 GP 분포도 피크는 사라져야 하는 것이 원칙이다. 도 6의 GP 분포도를 참조하면 로단으로 염색된 세포를 MβCD로 처리하면 높은 값의 GP 분포도 피크(중앙 GP값 = 0.49)가 사라지지 않고 중앙 GP 값이 0.51으로 약간 쉬프트 되었음을 알 수 있다. 이러한 결과는 콜레스테롤이 없는 세포에서 리피드 래프트가 여전히 존재한다는 잘못된 결론이 도출되는 원인이 된다. 이에 반하여, TPD1으로 염색된 세포는 비교예 1의 경우보다 더 밝고 균일한 영상을 나타내며, MβCD를 처리한 세포에서 높은 값의 GP 분포도 피크는 완전히 사라지지는 않아도 그 크기가 상당히 감소하였다는 것을 확인할 수 있다. 한편, 도 6의 GP 영상을 참조하면, 로단의 경우 소수성 영역(리피드 래프트)과 친수성 영역(인지질)을 명확히 구분할 수가 없으며, MβCD로 처리한 후의 영상을 참조하더라도 사라진 영역이 불규칙하며 무작위라서 MβCD로 처리하기 전의 영상에서 어떤 부분이 리피드 래프트였는지 구분할 수가 없다. 그러나, 본 발명에 따른 이광자 염료의 경우 세포막의 소수성 영역과 친수성 영역을 명확히 구분하여 영상화할 수 있는데, 붉은색 형광으로 나타내지는 부분이 소수성 영역(리피드 래프트)이고, 녹색으로 표시되는 부분이 친수성 영역(인지질)인 것으로 명확히 구분이 되며, MβCD로 처리한 이후의 영상을 보면, MβCD 처리 이전에 붉은색 형광으로 나타나던 부분(리피트 래프트 영역)이 모두 사라진 것을 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 이광자 염료는 실제 리피트 래프트 영역을 제대로 영상화할 수 있다는 것을 알 수 있다.
시험예 7
세포독성 테스트
본 발명에 따른 이광자 염료의 세포독성 여부를 알아보기 위해 실시예 1에 의해 제조된 이광자 염료에 대하여 MTT assay를 수행하였다. 즉, A431 세포에 TPD1 1 X 10-5M을 염색하고 DMSO 1%를 대조 용매로 사용하였으며, 그 결과를 도 7에 도시하였다. 도 7을 참조하면 y축은 cell viability인데, 6시간 incubation까지는 TPD1의 세포독성이 대조용매와 거의 차이가 없는 것으로 나타났기 때문에 본 발명에 따른 이광자 염료는 살아있는 세포의 영상에 적합한 염료임을 확인할 수 있다.
시험예 8
살아있는 세포에 대한 형광 GP 영상 촬영
A431 세포에 본 발명의 실시예 1에 따른 염료 1 x 10-5 M로 염색을 한 후 22분간 영상을 촬영하고 그 형광 GP 영상을 도 8에 도시하였다. 도 8을 참조하면, 본 발명에 따른 이광자 염료는 장시간에 걸친 리피드 래프트의 가시화에 매우 유용하게 사용될 수 있다는 것을 알 수 있으며, 세포의 리피드 래프트(붉은색 영역)는 항상 일정한 장소에 머물러 있는 것이 아니라 역동적으로 이동하고 있다는 것을 확인할 수 있다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료는 세포막 내의 환경하에서 방출되는 형광의 세기가 크고, 세포막의 소수성 영역과 친수성 영역을 명확히 구분할 수 있기 때문에 실제 리피트 래프트 영역을 제대로 영상화할 수 있으며, 세포에 적용하였을 때 독성이 없으므로 장시간에 걸쳐 리피드 래프트의 실시간 영상을 얻을 수 있는 등 생체 영상 분야에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (9)

  1. 하기 식 1의 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료.
    Figure 112007047494795-pat00018
    (1)
    (상기 식에서, R1은 탄소수 5 내지 17의 알킬기이고,
    R2는 -COOH, -CH2SO3Na 또는 ,
    Figure 112007047494795-pat00019
    이며,
    상기 R3는 탄소수 5 내지 17의 알킬기임)
  2. 제 1항에 있어서, 상기 식 1의 화합물은 하기 식 2의 화합물인 것을 특징으로 하는 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료.
    Figure 112007047494795-pat00020
    (2)
    (상기 식에서, R1은 탄소수 5 내지 17의 알킬기임)
  3. 제 1항에 있어서, 상기 식 1의 화합물은 하기 식 3의 화합물인 것을 특징으로 하는 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료.
    Figure 112007047494795-pat00021
    (3)
    (상기 식에서, R1은 탄소수 5 내지 17의 알킬기임)
  4. 제 1항에 있어서, 상기 식 1의 화합물은 하기 식 4의 화합물인 것을 특징으로 하는 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료.
    Figure 112007047494795-pat00022
    (4)
    (상기 식에서, R1 및 R3는 각각 탄소수 5 내지 17의 알킬기임)
  5. 제 2항에 있어서, 상기 식 2의 화합물은 하기 식 5로 표시되는 군에서 선택된 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료.
    Figure 112007047494795-pat00023
    (5)
  6. 제 3항에 있어서, 상기 식 3의 화합물은 하기 식 6으로 표시되는 군에서 선택된 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료.
    Figure 112007047494795-pat00024
    (6)
  7. 제 4항에 있어서, 상기 식 4의 화합물은 하기 식 7로 표시되는 군에서 선택된 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료.
    Figure 112007047494795-pat00025
    (7)
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료의 이광자 흡수 효율은 생체 상태에서 20GM 이상이며, 이광자 여기광원의 파장범위는 750∼1000nm이고, 형광의 파장범위는 400∼700nm인 것을 특징으로 하는 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료.
  9. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료의 이광자 흡수 효율은 150GM 이상이고, 소수성이 큰 환경(용매, 리포좀 및 GUV)에서는 430∼470nm의 형광을, 친수성 환경(용매, 리포좀 및 GUV)에서는 470∼530nm의 형광을 방출하는 것을 특징으로 하는 리피드 래프트의 실시간 영상용 이광자 염료.
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