KR101200049B1 - 테크네튬-99엠 트리카보닐 표지 글리신 단량체 또는 올리고머 활용 생리활성분자를 이용한 프로브의 제조방법 및 이를 포함하는 영상제 조성물 - Google Patents

테크네튬-99엠 트리카보닐 표지 글리신 단량체 또는 올리고머 활용 생리활성분자를 이용한 프로브의 제조방법 및 이를 포함하는 영상제 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 생리활성물질 영상 프로브용 테크네튬-99엠 표지 글리신 올리고머류 및 이를 포함하는 생체분자에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 펩타이드 자동 합성장치를 사용하여 단일 공정으로 제조가 용이한 생리활성물질 영상 프로브용 글리신 올리고머류 및 이를 포함하는 생체분자에 관한 것이다. 본 발명의 테크네튬-99엠 트리카보닐이 표지된 글리신류는 감마영상 및 SPECT와 같은 영상장치를 이용하여 체내 추적이 가능한 분자 영상화제를 제작하는 데 유용하게 활용될 수 있으며, 펩타이드 자동합성법을 활용한 1단계 방식으로 테크네튬-99엠 트리카보닐을 표지할 수 있는 방법을 제공함으로써, RGD 펩타이드, somatostatin, neurotensin 등의 다양한 생리활성 펩타이드류에 확대 적용할 수 있고, 신장 배출에 의해 체내로부터 신속히 정화될 수 있는 우수한 효과가 있다.

Description

테크네튬-99엠 트리카보닐 표지 글리신 단량체 또는 올리고머 활용 생리활성분자를 이용한 프로브의 제조방법 및 이를 포함하는 영상제 조성물{Preparation of Technetium-99m tricarbonyl labeled glycine monomer or oligomer containing probes that have biomolecules and its application as imaging complex-composition}
본 발명은 펩타이드 자동 합성장치를 이용하여 단일 공정으로 제조가 용이한 테크네튬-99엠 트리카보닐 표지 글리신 단량체 또는 올리고머의 제조방법 및 이를 포함하는 조영제 조성물에 관한 것이다.
암의 완전 치유가 현대의학의 중요과제가 되는 시점에서 표적분자와 특이적으로 반응하는 방사성추적자를 이용하여 비-침습적으로 암의 조기 진단 및 치료를 위하여 질병의 분자수준 변화 관찰이 가능한 핵의학적 진단 및 치료 기술의 중요성은 널리 알려져 있다. 기존의 양전자 방출단층촬영(positron emission tomography, PET)용 방사성의약품인 [18F]-FDG는 체내 암 진단으로 널리 쓰이고는 있지만, 뇌종양의 진단이나 염증과 종양과의 구별이 안 된다는 등의 단점이 있으며, 또한 암의 신생혈관 생성 및 전이 증후에 대한 정보를 제공하기에는 한계성이 있다.
암의 성장 메카니즘 과정으로서 신생혈관은 암 조직 근처의 혈관 내 αvβ3 인테그린(integrin)의 과다 분포를 시작으로 진행되어짐이 알려져 있다. 인테그린은 세포의 부착(adhesion)이나 이동 등에 관여하는 α 및 β 서브유닛(subunit)으로 구성된 heterodimer 세포막 단백질로서 세포에 따라 여러 종류가 존재한다. 그 중 신생혈관에는 vitronectin 수용체라고도 불리는 αvβ3 종이 중요하며 기존의 혈관내피세포에는 발현이 없으나, 암에 의한 신생혈관작용이 활성화된 경우에만 발현한다. 상기 인테그린과 상호작용하는 단백질에는 공통적으로 알지닌-글리신-아스파르트산(Arg-Gly-Asp, RGD) 펩타이드 시퀀스가 존재하여 결합부위 역할을 한다. 상기 알지닌(R)-글리신(G)-아스파르트산(D)으로 구성되는 3개의 아미노산 서열을 갖는 작은 펩타이드인 RGD(arginylglycylaspartic acid)는 세포막에서 세포의 인지 등 다양한 세포 간 역할에 참여하는 펩타이드 서열로서, 이 서열을 기본으로 하여 다양한 종양, 질환의 진단 및 치료용으로 널리 연구되고 있는 펩타이드이다. 이와 같은 화합물을 기반으로 αvβ3 인테그린 정상기능을 막는 보다 높은 결합친화도를 갖는 길항물질로써 고리형 펩타이드 구조인 cRGD(cyclic Arg-Gly-Asp, cRGD) 펩타이드 화합물이 있으며, 지금까지 많은 국내?외 연구기관을 통해 이 화합물에 다양한 방사성동위원소를 도입하여 암의 신생혈관 영상화 연구가 진행되어왔다. 다양한 cRGD 유도체에 사용된 방사성동위원소는 PET용 플루오린-18, 갈륨-68, 구리-64 등과, SPECT용으로 테크네튬-99엠, 요오드-123, 인듐-111 등이 표지핵종으로 사용되었으며, 간 조직에서 배출을 빠르게 유도하기 위해 단당류를 부착시킴으로써 방사성추적자의 약물동태를 좋게 하거나, 더 높은 결합친화도를 갖게 하기 위해 두 개 또는 네 개의 cRGD를 부착한 방사성추적자가 연구되었다(참고논문: Haubner, R., Wester, H-J., Weber, W.A., Mang, C., Ziegler, S. I., Goodman, S. L., Senekowitsch-Schmidtke, R., Kessler, H., Schwaiger, M., Cancer Res., 2001, 61:1781-1785; Jeong, J.M., Hong, M.K., Chang, Y.S., Lee, Y.S., Kim, Y.J., Cheon, G.J., Lee, D.S., Chung, J.K., Lee, M.C., J. Nucl. Med., 2008, 49:830-836; Chen, W., Park, R., Tohme, M., Shahinian, A.H., Bading, J.R., Conti, P.S. Bioconjugate Chem., 2004, 15:41-49; Liu, S., Hsieh, W.Y., Kim, Y.S., Mohammel, S. I., Bioconjugate Chem., 2005, 16:1580-1588; Haubner, R., Wester, H-J., Reuning, U., Senekowitsch-Schmidtke, R., Diefenbach, B., Kessler, H., Stocklin G., Schwaiger, M., J. Nucl. Med., 1999, 40:1061-1071; Janssen, M., Oyen, W.J.G., Dijkgraaf, I., Massuger, L.F.A.G., Frielink, C., Edwards, D.S., Rajopadyhe, M., Boonstra, H., Corsten, F.H.M., Boerman, O.C., Cancer Res., 2002, 62:6146-6151; Wu, Y., Zhang, X., Xiong, Z., Cheng, Z., Fisher, D.R., Liu, S., Gambhir, S.S., Chen, X., J. Nucl. Med., 2005, 46:1707-1718.).
한편, 생리활성분자들은 생체 내에서 생리 및 병리작용을 매개하므로 이들 물질에 대한 체내 거동평가는 생체에서 생리 및 병리현상을 이해하고 질병을 진단, 치료하는데 주요한 의의를 갖는다. 최근 발달된 분자영상기술은 이러한 생리활성물질을 방사성 동위원소의 고감도 검출특성을 활용하여 생체 영상기법으로 임상에 적용하고 있으며, 일예로 체내 당대사율 변화 및 암 진단에 널리 활용되고 있는 [18F]-FDG(2-fluoro-2-deoxy-D-glucose)를 들 수 있다. 기존의 생리활성물질의 영상화는 Cyclotron과 같이 대형 시설을 이용하여 생산 가능한 F-18, C-11과 같은 양전자방출 방사성 동위원소를 이용하기 때문에 고가일 뿐 아니라 방사성 동위원소의 반감기가 각각 110분, 20분으로 짧은 단점이 있다. 이를 극복하기 위해 제너레이터 형태로 보다 널리 보급되어 편리하게 생산할 수 있어 임상 및 연구에 폭넓게 사용되고 있는 테크네튬-99엠을 활용한 생리활성물질의 표지가 널리 연구되고 있다.
여러 가지 방사성동위원소 중에서 테크네튬-99엠은 모든 병원에서 단일광자방출전산화단층촬영술(Single Photon Emission Computed Tomography; SPECT) 스캐너와 발생기(generator)만 있으면 간단한 표지 방법과 분리공정을 통해 SPECT 영상을 통한 진단을 이행할 수 있어서 활용적, 실용적인 면에서 우수한 방사성동위원소이며 같은 전구체를 사용하여 치료 목적 하에 레늄을 선택하여 표지할 수 있는 장점을 지니고 있다. 또한, 테크네튬-99엠은 최적의 γ-에너지(140 keV)와 적절한 반감기(6 시간), 저비용 및 넓은 유용성으로 인하여 조직 이미지화 진단을 위한 이상적인 방사성 동위원소인 것으로 알려져 있다.
그러나 의료용으로 널리 사용되고 있는 방사성 동위원소 테크네튬-99엠을 활용한 감마영상을 이용한 종래의 기술은 생리활성물질의 펩타이드 서열에 킬레이터를 접합하는 방법을 주로 사용하였다. 이러한 방법은 펩타이드 합성 후, 말단 또는 특정 아미노산 서열에 별도의 킬레이터를 화학적으로 도입하는 방식으로 펩타이드의 합성과 킬레이터의 접합이 2단계에 걸쳐 개별적으로 이루어져 합성수율에 따라 정제 등의 단계가 추가적으로 더 요구되는 단점을 지니고 있다.
방사성 영상용 리간드들이 체내에서 배출이 신속하게 이루어지지 않을 경우, 체내에서 비특이적 영상신호를 발생하게 되어 노이즈 대비 신호의 비가 낮아져 점출감도를 낮추며, 필요 이상으로 방사선에 노출될 우려가 있어 이를 개선하기 위한 연구가 추구되고 있다.
상기와 같은 종래 기술의 문제점을 해결하기 위하여, 본 발명자들은 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체에 결합이 용이하면서도 체내 주입 후 배출이 신속하게 이루어질 수 있는 조영제를 개발하고자 다양한 연구를 수행하였으며, 그 결과 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체에 결합이 용이하고, 이기능성 킬레이터 작용을 할 수 있는 테크네튬-99엠 트리카보닐 글리신류 복합체를 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 테크네튬-99엠 트리카보닐이 표지된 글리신 단량체 또는 올리고머의 제조방법 및/또는 이를 포함하는 조영제 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 테크네튬-99엠이 표지된 글리신 단량체(monomer) 또는 올리고머(oligomer)를 포함하는 광학영상용 조영제 조성물을 제공한다.
이에 더하여, 본 발명은 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체를 합성하는 단계 및 합성된 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체를 글리신 단량체(monomer) 또는 올리고머(oligomer)에 표지하는 단계를 포함하는 테크네튬-99엠이 표지된 글리신 단량체 또는 올리고머의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 테크네튬-99엠 트리카보닐이 표지된 글리신 올리고머류는 감마영상 및 SPECT와 같은 영상장치를 이용하여 체내 추적이 가능한 분자 조영제(영상화제)를 제작하는 데 유용하게 활용될 수 있으며, 펩타이드 자동합성법을 활용한 1단계 방식으로 합성된 글리신 단량체 또는 올리고머에 보다 용이하게 테크네튬-99엠 트리카보닐을 표지할 수 있는 방법을 제공함으로써, RGD 펩타이드, somatostatin, neurotensin 등의 다양한 생리활성 펩타이드류에 확대 적용할 수 있는 효과가 있으며, 테크네튬-99엠이 표지된 글리신 올리고머는 체내에 잔류하지 않고, 신장 배출에 의해 체내로부터 신속히 정화되는 우수한 효과가 있다.
도 1은 테크네튬-99엠(A), 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체(B), 테크네튬-99엠 트리카보닐 글라이신(C), 테크네튬-99엠 트리카보닐 글라이신 삼량체 (D), 테크네튬-99엠 트리카보닐 글라이신 오량체(E)의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다.
도 2는 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체(A), 테크네튬-99엠 트리카보닐 글라이신(B), 테크네튬-99엠 트리카보닐 글라이신 삼량체 (C), 테크네튬-99엠 트리카보닐 글라이신 오량체(D)의 ICR 마우스내 분포를 SPECT영상으로 나타낸 것이다.
도 3은 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체(A), 테크네튬-99엠 트리카보닐 AGRGDS (B: RGD펩타이드류), 테크네튬-99엠 트리카보닐 GGGAGRGDS (C: 글라이신 삼량체 포함 RGD펩타이드류), 테크네튬-99엠 트리카보닐 RRPIL (D: Neurotensin(8-13)펩타이드), 테크네튬-99엠 트리카보닐 Neurotensin(8-13) (E: 글라이신 삼량체 포함 RGD펩타이드류)의 HPLC 프로파일을 나타낸 것이다.
본 발명은 펩타이드 자동 합성장치를 사용하여 단일 공정으로 제조가 용이하고, 비용 및 시간을 단축할 수 있는 경제적인 효과가 있는 글리신 모노머 또는 올리고머의 활용에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 테크네튬-99엠이 표지된 글리신 단량체(monomer) 또는 올리고머(oligomer)를 포함하는 광학영상용 조영제 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.
또한, 본 발명은 하기 단계를 포함하는 테크네튬-99엠이 표지된 글리신 단량체(monomer) 또는 올리고머(oligomer)의 제조 방법을 제공한다:
a) 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체를 합성하는 단계; 및
b) 상기 합성된 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체를 글리신 단량체(monomer) 또는 올리고머(oligomer)에 표지하는 단계.
즉, 본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명자들은 기존의 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체를 준비하여 글리신 단량체, 삼량체(Gly(3)) 및/또는 오량체(Gly(5))에 표지하여 테크네튬 표지된 트리카보닐 글리신류를 합성하였고(실시예 1 참조), 이들이 친수성임을 옥탄올-물 분배계수시험을 통하여 확인하였으며(실시예 3 참조), 체내에서 빠르게 신장을 통해 배출됨을 영상을 측정하여 확인하였다(실시예 4 참조).
또한, 본 발명에 따르면 펩타이드 자동합성을 수행하여 기존에 알려진 표적화 펩타이드에 글리신류를 추가할 수 있으며, 보다 구체적으로 펩타이드의 합성은 본 발명의 일실시예에 따라 다음과 같은 방법으로 수행될 수 있으나 이 방법에 한정되는 것은 아니다. 펩타이드 합성을 위해 ASP48S 장비(펩트론)를 이용하여 Fmoc SPPS (solid phase peptide synthesis) 방법으로, 역상 Vydac Everest C18 column (250 mm × 22 mm, 10 μm)을 장착한 HPLC를 활용하여 분석하였으며, 용매는 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid 포함 water-acetonitrile linear gradient (0~75% (v/v) of acetonitrile)조건으로 사용하고, 합성 및 정제된 펩타이드의 분자량은 LC/MS (Agilent HP1100 series)로 정성 분석하였다.
Fmoc SPPS(solid phase peptide synthesis)방법을 이용한 펩타이드 합성은 C-말단부터 하나씩 coupling 하는 것으로, 펩타이드의 C-말단 첫 번째 아미노산이 Resine에 부착된 것을 사용하며, NH2-Ser(tBu)-2-chloro-TritylResin, NH2-Leu-2-chloro-TritylResin 등을 사용한다. 펩타이드 합성에 사용한 모든 아미노산 원료는 N-말단이 Fmoc(Fluorenylmethyloxycarbonyl)으로 protection되고, 잔기는 모두 산(acid)으로 제거되는 Trt, Boc, t-Bu, Pbf 등으로 protection된 것으로, 예를 들면, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp(OtBu)-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Pro-OH, Fmoc-Met-OH, Fmoc-His(Trt)-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Gly-OH, Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH 등을 사용한다. Coupling reagent로는 HBTU(2-(1H-Benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetamethylaminium hexafluorophosphate)/HOBt(N-Hydroxxybenzotriazole)/NMM(4-Methylmorpholine)를 사용하며, Fmoc의 제거는 DMF에 녹인 20% piperidine를 이용한다. 마지막으로 합성된 펩타이드를 Resin에서 분리하고, 잔기의 보호기를 제거하기 위해 TFA(trifluoroacetic acid):TIS(triisopropylsilane):H2O을 95:3:2의 비율로 혼합하여 사용한다. 이와 같은 방법으로 RGD 펩타이드 및 Neurotensin(8-13) 펩타이드 서열에 글리신 삼량체를 추가하였을 경우, 테크네튬 표지된 트리카보닐 전구체와의 표지율이 글리신 삼량체를 추가전에 비하여 표지율이 개선됨을 밝혔다(실시예 2 참조).
따라서, 본 발명의 테크네튬-99엠 트리카보닐이 표지된 글리신 단량체(monomer) 또는 올리고머(oligomer)는 표적화 펩타이드에 추가 결합될 수 있는 특징이 있다.
상기 표적화 펩타이드는 특정 생체물질에 결합하는 특징이 있는 펩타이드로서, 이에 한정되지는 않으나, 바람직하게는 RGD펩타이드(arginylglycylaspartic acid), 뉴로텐신(neurotensin), 소마토스타틴(somatostatin), 안지오텐신(angiotensin), 황체형성호르몬방출호르몬(luteinizing hormone releasing hormone; LHRH), 인슐린, 옥시토신, 뉴로키닌-1(Neurokinin-1; NK-1), 혈관활성장펩타이드(vasoactive intestinal peptide; VIP), P물질(Substance P; SP), 신경펩타이드Y(neuropeptide Y; NPY), 엔도텔린A(endothelin A), 엔도텔린B(endothelin B), 브라디키닌(bradykinin), 인터류킨-1(interleukin-1), 상피세포성장인자(epidermal growth factor; EGF), 콜레시스토키닌(cholecystokinin; CCK), 갈라닌(galanin), 멜라닌세포자극호르몬(melanocyte-stimulating hormones; MSH), 란레오티드(lanreotide), 옥트레오티드(octreotide), 및 아르기닌-바소프레신(arginine-vasopressin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것일 수 있고, 더욱 바람직하게는, RGD(arginylglycylaspartic acid) 또는 뉴로텐신(neurotensin)일 수 있다.
본 발명에 따른 광학영상용 조영제 조성물의 바람직한 투여방법은 비경구적, 예를 들어 농축괴(bolus)주입, 정맥주사 또는 동맥내 주입일 수 있고, 폐가 조영되어야 하는 경우 스프레이, 예를 들어 연무제 분사를 할 수 있으며, 경구 또는 직장 투여일 수 있으나, 이에 제한되지 않고 공지된 조영제 투여방법이면 모두 사용 할 수 있다. 이때, 비경구적 투여 가능한 형태는 무균이어야 하고, 생리학적으로 허용되지 않는 제제 및 상자성, 초상자성, 강자성 또는 준강자성 오염물질이 없어야 하며, 본 발명에 따른 조성물은 방부제, 항균제, 비경구적 용액에 통상적으로 사용되는 완충액 및 항산화제, 부형제 및 MR 조영제와 병용가능하고, 생성물의 제조, 저장 또는 이용을 방해하지 않는 다른 첨가제를 함유할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 광학영상용 조영제 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여경로, 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있으며, 바람직하게는, 1회 1 내지 1000 mg/체중kg으로, 더욱 바람직하게는 1회 3 내지 300 mg/체중kg으로 투여할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 제조예 1>
본 발명에 따른 테크네튬- 99엠 표지 글리신류의 제조
본 발명자들은 하기와 같은 재료를 사용하여 본 발명에 따른 테크네튬-99엠표지 글리신 단량체 및 올리고머를 제조하였다.
① 물질 : 일산화탄소 가스(99.5%)는 대한가스(서울, 한국)로부터 공급받아 산소 트랩으로 미리 여과하여 사용하였고, 테크네튬-99엠은 Unitech Tc-99m 발생기(삼영 Unitech. Co. Ltd., 한국)에서 0.9% 염화소듐으로 용출시켜 과테크네튬산으로 얻었으며, 글리신, Gly-Gly-Gly(글리신 삼량체), Gly-Gly-Gly-Gly-Gly(글리신 오량체)는 Sigma Chemical Co. (St. Louis, 미국)에서 구입하여 사용하였다.
②동물 실험 : Orient, Inc.(서울, 한국)으로부터 암컷 ICR 마우스(7주령)를 무균실험동물로 얻었으며, 1주간의 검역과 적응을 거친 후 사용하였다. 동물들은 상대습도 50±5%의 23±2℃ 로 유지된 방에서 12시간 명/12시간 암 환경으로 사육하였고, 표준 식이와 물을 자유식(ad libitum)으로 주었다. 모든 동물 실험은 한국원자력연구원(KAREI)의 동물실험 관련 위원회로부터 승인받은 후 수행하였다.
테크네튬- 99엠 트리카보닐 글리신 복합체의 제조
본 발명자들은 하기와 같이 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체에 방사성 동위원소를 표지함으로써, 본 발명의 테크네튬-99엠 트리카보닐 글리신류를 제조하였다.
<1-1> 테크네튬- 99엠 트리카보닐 전구체의 합성
[99mTc(CO)3(H2O)3]+는 potassium boranocarbonates (5.9 mg), sodium tetraborate decahydrates (2.85 mg), sodium tartrate dehydrate (8.5 mg) 및 sodium carbonate (7.15 mg)이 담긴 5 ml 약병에 99mTcO4 - 1 ml(10 mCi)를 가하여 상업용 발생기에서 준비한 다음 용액을 질소 가스 하에서 30분 동안 끓는 물에서 열을 가하였다. 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체의 표지 수율과 안정성은 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (reversed-phase HPLC)를 사용하여 측정하였다.
HPLC 측정기는 진공 탈가스기, 이중 펌프, 온도-조절 자동샘플러, 컬럼 오븐 부분, UV-Vis 검출기 및 방사성연대측정 검출기를 포함하는 Agilent 1200 시리즈(Agilent Technologies, Waldbronn, 독일)를 이용하였으며, 주변온도(ambient temperature)를 유지하면서 Nucleosil C18 (5 micron, 3.0 X 250 mm, Supelco Inc., PA, 미국) 컬럼에서 수행되었다. 이동상으로 메탄올(용매 B)과 0.05 M TEAP(용매 A)를 사용하였으며 트리클로로아세트산을 가해 pH를 2.3으로 조절하였다. HPLC 기울기는 처음 0-5분 동안 등용매 용리 (100% A); 5~8분 동안 75% A/25% B에서 100% A/0% B의 직선기울기, 8~11분 동안 66% A/34% B에서 75% A/25% B의 직선 기울기, 11~22분 동안 0% A/100% B에서 66% A/34% B의 직선 기울기와 22~25분 동안 등용매 용리(100% B)로 이루어졌다. 유속은 0.6 ml/min로, 10 ㎕ 분취액(aliquot)을 컬럼에 주입하여 수행하였다.
그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, [99 mTc(CO)3(H2O)3]+는 추가적인 정제 단계가 필요하지 않은 높은 방사성-수율(>95%)로 생성되었다.
<1-2> 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체의 방사성 동위원소 표지
테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체에 방사성 동위원소를 표지하기 위하여, 실온에서 상기 실시예 <1-1>에서 제조한 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체 1 ml를 50 ㎕의 글리신, 글리신 삼량체, 글리신 오량체(식염수에서 10 mg/ml)에 가하고, 반응 약병을 30분 동안 75℃로 가열하였다. 이후 반응 약병을 실온까지 냉각시키고, radio-HPLC로 표지수율을 측정하였다.
측정 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체를 이용한 글리신, 글리신 삼량체, 글리신 오량체의 세가지 표지 수율은 80% 이상이며, HPLC 분석에서 테크네튬-99엠 트리카보닐-글리신의 경우 10.3분에 단일 피크를 나타낸 반면, 테크네튬-99엠 트리카보닐 코어는 4분에 추출되었다. 글리신과 글리신 올리고머는 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체를 이용하여 높은 표지수율로 쉽게 표지되는 것으로 나타났다.
테크네튬-99엠 트리카보닐 방사성 표지된 RGD 및 neurotensin(8-13)에 글리신 삼량체 포함 여부가 미치는 영향 평가
올리고펩타이드의 종결 서열로써 글리신 삼량체를 적용하기 위해, 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체, 프로토타입 펩타이드(AGRGDS 및 RRPYIL) 및 글리신 삼량체가 추가된 펩타이드(GGGAGRGDS 및 GGGRRPYIL)를 하기 펩타이드 자동합성 방법으로 합성하였다.

<2-1> AGRGDS의 합성
AGRGDS는 펩타이드 자동합성 방법으로 다음과 같은 단계를 거쳐 합성되었다.
1) Coupling 단계 : NH2-Ser(tBu)-2-chloro-TritylResin에 protected amino acid(8당량)와 Coupling reagent HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량)을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시키고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc deprotection 단계 : 상기 Coupling 단계를 거친 Resin에 DMF에 녹인 20% piperidine을 가하고 상온에서 5분간 2회 반응시킨 다음 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 상기 1) 단계 및 2) 단계의 반응을 반복적으로 수행하여 펩타이드 기본 골격(NH2-A-G-R(Pbf)-G-D(tBu)-S(tBu)-2-chloro-TritylResin)을 만든 다음, TFA, TIS, H2O를 95:3:2의 비율로 혼합한 용액을 가하여 펩타이드를 Resin에서 분리하였다.
4) 얻어진 혼합물(mixture)에 Cooling diethyl ether를 가하고 원심분리하여 얻어진 펩타이드를 침전시킨 다음, HPLC로 정제하여 질량분석(MS)한 후 동결 건조하였다.

<2-2> GGGAGRGDS의 합성
GGGAGRGDS는 펩타이드 자동합성 방법으로 다음과 같은 단계를 거쳐 합성되었다.
1) Coupling 단계 : NH2-Ser(tBu)-2-chloro-TritylResin에 protected amino aid(8당량)와 Coupling reagent HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량)을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시키고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc deprotection 단계 : 상기 Coupling 단계를 거친 Resin에 DMF에 녹인 20% piperidine을 가하고 상온에서 5분간 2회 반응시킨 다음 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 상기 1) 단계 및 2) 단계의 반응을 반복적으로 수행하여 펩타이드 기본 골격(NH2-G-G-G-A-G-R(Pbf)-G-D(tBu)-S(tBu)-2-chloro-TritylResin)을 만든 다음, TFA, TIS, H2O를 95:3:2의 비율로 혼합한 용액을 가하여 펩타이드를 Resin에서 분리하였다.
4) 얻어진 혼합물(mixture)에 Cooling diethyl ether를 가하고 원심분리하여 얻어진 펩타이드를 침전시킨 다음, HPLC로 정제하여 질량분석(MS)한 후 동결 건조하였다.

<2-3> RRPYIL의 합성
RRPYIL은 펩타이드 자동합성 방법으로 다음과 같은 단계를 거쳐 합성되었다.
1) Coupling 단계 : NH2-Leu-2-chloro-TritylResin에 protected amino acid(8당량)와 Coupling reagent HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량)을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시키고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc deprotection 단계 : 상기 Coupling 단계를 거친 Resin에 DMF에 녹인 20% piperidine을 가하고 상온에서 5분간 2회 반응시킨 다음 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 상기 1) 단계 및 2) 단계의 반응을 반복적으로 수행하여 펩타이드 기본 골격(NH2-R(Pbf)-R(Pbf)-P-Y(tBu)-I-L-2-chloro-TritylResin)을 만든 다음, TFA, TIS, H2O를 95:3:2의 비율로 혼합한 용액을 가하여 펩타이드를 Resin에서 분리하였다.
4) 얻어진 혼합물(mixture)에 Cooling diethyl ether를 가하고 원심분리하여 얻어진 펩타이드를 침전시킨 다음, HPLC로 정제하여 질량분석(MS)한 후 동결 건조하였다.

<2-4> GGGRRPYIL의 합성
GGGRRPYIL는 펩타이드 자동합성 방법으로 다음과 같은 단계를 거쳐 합성되었다.
1) Coupling 단계 : NH2-Leu-2-chloro-TritylResin에 protected amino acid(8당량)와 Coupling reagent HBTU(8당량)/HOBt(8당량)/NMM(16당량)을 DMF에 녹여서 첨가한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시키고 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
2) Fmoc deprotection 단계 : 상기 Coupling 단계를 거친 Resin에 DMF에 녹인 20% piperidine을 가하고 상온에서 5분간 2회 반응시킨 다음 DMF, MeOH, DMF순으로 세척하였다.
3) 상기 1) 단계 및 2) 단계의 반응을 반복적으로 수행하여 펩타이드 기본 골격(NH2-G-G-G-R(Pbf)-R(Pbf)-P-Y(tBu)-I-L-2-chloro-TritylResin)을 만든 다음, TFA, TIS, H2O를 95:3:2의 비율로 혼합한 용액을 가하여 펩타이드를 Resin에서 분리하였다.
4) 얻어진 혼합물(mixture)에 Cooling diethyl ether를 가하고 원심분리하여 얻어진 펩타이드를 침전시킨 다음, HPLC로 정제하여 질량분석(MS)한 후 동결 건조하였다.

<2-5> 합성된 펩타이드의 테크네튬-99엠 트리카보닐 표지 및 분석
상기 실시예 <2-1> 내지 <2-4>에서 합성한 펩타이드를 표지 및 분석하였으며, 표지 및 분석 방법은 상기 실시예 1과 같다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 글리신 삼량체를 포함하는 GGGAGRGDS 및 GGGRRPYIL는 프로토타입 펩타이드인 AGRGDS 및 RRPYIL에 비하여 우수한 표지율을 나타냈다.
상기의 결과는 글라이신 삼량체를 생리활성물질에 추가함으로써 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체를 이용한 다양한 생리활성물질의 표지에 폭넓게 적용될 수 있음을 의미한다.
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테크네튬-99엠 트리카보닐 글리신류의 옥탄올-물 분배계수 측정
테크네튬-99엠 트리카보닐 글리신 복합체의 체내 잔류성 및 분해속도를 예측하기 위해, 옥탄올-물 분배계수를 측정하였으며 다음과 같은 방법으로 3번 반복하여 측정하였다. 500 ㎕의 질소-정화된 0.05 M PBS(phosphate-buffered saline, pH 7.4)를 500 ㎕의 n-옥탄올과 혼합하고, 10 ㎕의 테크네튬-99엠 트리카보닐 글리신, 글리신 삼량체 및 글리신 오량체를 각각 가한 후, vortex로 샘플을 3분 동안 완전히 섞어주었다. 그리고 SORVALL FRESCO 원심분리기(Asheville, NC, 미국)로 3,000 g에서 5분 동안 원심 분리시켜 두 개의 상으로 분리되도록 놓아두었다가 각각 20 ㎕의 PBS와 옥탄올 상을 well-type NaI(TI) 섬광 검출기(scintillation detector)로 측정하였으며, 계산은 하기의 식을 따라 이루어졌다.

<계산식>
Log p = log( 옥탄올 (cpm) / 물 (cpm))

테크네튬-99엠 트리카보닐-글리신과 올리고머들의 옥탄올-물 분배계수를 측정한 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, n-옥탄올/버퍼 분배계수 수치 범위는 약 -0.5에서 -1.6까지인 것으로 나타났다.

화합물 옥탄올/물 분배계수
(Kow logP)
테크네튬-99엠 트리카보닐-글리신 -0.48±0.00
테크네튬-99엠 트리카보닐-글리신 삼량체 -1.53±0.02
테크네튬-99엠 트리카보닐-글리신 오량체 -1.50±0.01

상기 결과를 통해, 옥탄올/물 분배계수가 낮은 것으로 나타난 테크네튬-99엠 트리카보닐-글리신 및 올리고머 화합물들은 친수성임을 알 수 있으며, 이에 따라 테크네튬-99엠 트리카보닐-글리신 및 올리고머 화합물이 생체물질로부터 방출되면, 체내에 잔류하지 않고 빠른 배출이 이루어질 것임을 알 수 있다.
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동물모델에서 테크네튬-99엠 트리카보닐 표지 글리신 올리고머의 Micro- SPECT/CT 영상화
본 발명자들은 테크네튬-99엠 트리카보닐 글리신 복합체의 생체 내 거동 및 분포특성을 평가하기 위해, Micro-SPECT/CT 측정을 통한 영상 연구를 실시하였으며, 테크네튬-99엠 트리카보닐 글리신 복합체의 표지는 상기 실시예 <1-2>와 같은 방법으로 수행하였다.
또한, Micro-SPECT/CT 영상화를 위해, 마우스는 1-핀홀 마우스 고감도 콜리메이터가 장착된 Inveon 소동물용 SPECT/CT 시스템(Siemens Medical Solutions, Knoxville, TN, 미국)으로 스캔하였다. 마우스를 2% isoflurane (크래들에서 복위자세)으로 마취시킨 다음, 테크네튬-99엠 트리카보닐 화합물 37 MBq를 정맥으로 주사 주입하고 30분 후에 Micro-SPECT 이미지를 측정하였다. CT 스캔은 15분 동안 X-선 방출원 300 ㎂, 60 kV(투영 당 한번 촬영)에서 이루어졌고, CT 해상도는 200 ㎛이며, 획득한 투영 수는 360이었다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 테크네튬-99엠 트리카보닐-글리신 삼량체는 빠르게 혈액 내에서 제거되는 특징을 나타냈으며, 신장에서 고농도로 검출되었고 경시적으로 방광에서 가장 높은 집적율을 나타내는 특징을 나타냈다. 테크네튬-99엠 트리카보닐-글리신과 펜타글리신 역시 빠른 혈액 클리어런스를 보였으나, 간에 일부 방사능이 남았다.
상기 결과로부터, 테크네튬-99엠 트리카보닐-글리신 세가지 화합물 모두 신장 배출에 의해 체내로부터 신속히 정화되는 것을 알 수 있으며, 특히 테크네튬-99엠 트리카보닐 트리글리신에서 가장 우수한 것으로 나타났다.
이러한 결과는, Gly-Gly-Gly(글리신 삼량체)이 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체와 함께 쉽게 방사성 동위원소로 표지되며, 우수한 클리어런스 특성을 보인다는 것을 의미한다.
이에 더하여, Gly-Gly-Gly는 다른 관심 펩타이드 서열에도 추가할 수 있기 때문에 신장 기능 영상화에 사용되어 온 99mTc-mercaptoacety-Gly-Gly-Gly(MAG3)처럼 쓰일 수도 있음을 알 수 있다.
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전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (9)

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  6. 하기 단계를 포함하는 테크네튬-99엠이 표지된 글리신 단량체(monomer) 또는 올리고머(oligomer)의 제조 방법:
    a) 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체를 합성하는 단계; 및
    b) 상기 합성된 테크네튬-99엠 트리카보닐 전구체를 글리신 단량체(monomer) 또는 올리고머(oligomer)에 표지하는 단계.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 글리신 올리고머는 글리신 삼량체 또는 글리신 오량체인 것을 특징으로 하는, 방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 글리신 단량체 또는 올리고머는 표적화 펩타이드가 추가 결합 될 수 있는 것을 특징으로 하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 표적화 펩타이드는 RGD펩타이드(arginylglycylaspartic acid), 뉴로텐신(neurotensin), 소마토스타틴(somatostatin), 안지오텐신(angiotensin), 황체형성호르몬방출호르몬(luteinizing hormone releasing hormone), 인슐린, 옥시토신, 뉴로키닌-1(Neurokinin-1), 혈관활성장펩타이드(vasoactive intestinal peptide), P물질(Substance P), 신경펩타이드Y(neuropeptide Y), 엔도텔린A(endothelin A), 엔도텔린B(endothelin B), 브라디키닌(bradykinin), 인터류킨-1(interleukin-1), 상피세포성장인자(epidermal growth factor), 콜레시스토키닌(cholecystokinin), 갈라닌(galanin), 멜라닌세포자극호르몬(melanocyte-stimulating hormones), 란레오티드(lanreotide), 옥트레오티드(octreotide), 및 아르기닌-바소프레신(arginine-vasopressin)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
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