KR101299512B1

KR101299512B1 - 스핑고신 1-포스페이트를 유효성분으로 함유하는 관절염 질환 치료 조성물

Info

Publication number: KR101299512B1
Application number: KR1020110036383A
Authority: KR
Inventors: 박상열; 문명희; 정재교; 설재원; 이유진
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2011-04-19
Filing date: 2011-04-19
Publication date: 2013-08-22
Anticipated expiration: 2031-04-19
Also published as: KR20120118784A

Abstract

본 발명은 본 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate)를 유효성분으로 함유하는 관절염 치료용 조성물에 관한 것으로서, 약학적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 유효성분으로서 스핑고신 1-포스페이트를 함유하는 조성물은 관절염과 관련된 염증유발 인자를 저해하는 것을 특징으로 하며, 본 발명에 따른 조성물은 연골에서 여러 염증인자를 억제하는 효과를 나타내기 때문에 새로운 관절염 치료제의 표적이 될 수 있고, 다양한 관절염 치료제의 개발로 이어질 수 있다.

Description

스핑고신 1-포스페이트를 유효성분으로 함유하는 관절염 질환 치료 조성물 {Composition used in diseases linked to arthritis comprising sphingosine 1-phosphate as an active ingredient}

본 발명은 본 스핑고신-1-포스페이트 (sphingosine-1-phosphate)를 유효성분으로 함유하는 관절염 치료용 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 스핑고신-1-포스페이트가 골관절 내 세포외 기질을 분해하는 기질단백분해효소를 발현시키는 염증인자인 NF-kB와 COX-2의 발현을 감소시키는 것을 특징으로 하는 관절염 치료용 조성물에 관한 것이다.

퇴행성관절염이라고도 불리는 골관절염(osteoarthritis, 이하 OA라 함.)은 55세 이상 인구의 약 10%가 보유하며, 60세 이상 환자의 25%에서 심한 동통과 관절운동장애를 동반한다. 특히, 인구의 고령화 추세에 따라 유병률이 빠르게 상승하고 있는 대표적인 근골격계 질환이다.

주요한 OA 치료방법으로는 체중감량, 하지근육 강화운동, 물리치료와 같은 비약물요법과 함께, 아세트아미노펜 혹은 비스테로이드성 소염진통제류(non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)의 복용 또는 외용과, 스테로이드 약물의 관절강 내 주사와 같은 약물요법, 그리고 관절치환술과 같은 수술요법 등이 사용되고 있다.

하지만, 가장 흔히 적용되는 약물요법 중에서 NSAID는 위장관 장애 등이 빈발하며, 스테로이드는 전신 부작용 및 반복주사에 따른 연골의 파괴 또는 감염의 위험이 상승하므로 장기간 사용이 곤란하다는 단점 외에, 무엇보다도 이 약물들이 OA의 통증만을 완화시킬 뿐 적극적인 질병치료 수단으로서는 미흡한 점이 많다.

골관절염의 치료 목적은 통증의 경감, 운동성의 유지와 장애의 최소화인데, 통증의 기전과 연골 대사에 대한 많은 연구가 진행되고 있음에도 불구하고, 골관절염의 치료제의 개발은 아직 요원한 숙제로 남아 있다.

연골세포 염증을 유도하는 인자들인 COX-2, NF-kB의 발현을 감소시켜 연골을 직접적으로 분해하는 기질단백분해효소 (Matrix Metalloproteinases, MMPs)들의 발현 및 활성을 효과적으로 억제하여, 연골의 구성성분 중 하나인 글리코사미노글리칸의 유리를 효과적으로 감소시켜 다양한 관절염 치료제의 개발로 이어질 수 있는 제제에 대한 개발이 필요한 실정이다.

생체 내에 존재하는 지질대사물질인 스핑고신-1-포스페이트는 혈관신생촉진제, 선유화(fibrosis) 억제제, 탈수초성질환, 진행성 치매 또는 퇴행성 뇌 질환의 치료제, 면역억제효과, 암세포에서 아폽토시스를 유발시키는 효과, 스핑고신키나제의 세포 증식 촉진 활성을 억제함으로써 과증식성 질환(예컨대 암 또는 건선 등)을 치료하는 것에 대한 연구결과는 있지만, 현재까지 스핑고신-1-포스페이트 제제로 연골세포 염증 억제 효과를 나타내는 것에 대한 연구보고는 없었다.

따라서, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 연골세포 염증을 유도하는 인자인 COX-2, NF-kB의 발현을 감소시켜서 기질단백분해효소들의 발현 및 활성을 효과적으로 억제할 수 있는 조성물로서, 스핑고신 1-포스페이트를 유효성분으로 함유하는 염증유발 인자 저해 조성물, 연골세포 염증을 억제 조성물 및 관절염 질환을 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 과제를 달성하기 위하여,

약학적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 유효성분으로서 스핑고신 1-포스페이트(sphingosine 1-phosphate)를 함유하는 COX-2(cyclooxygenase-2), iNOS (inducible nitric oxide synthesis) 및 NF-kB(nuclear factor kB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염증유발 인자를 저해하는 조성물, 연골세포 염증 억제 조성물 및 관절염 질환을 치료하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 관절염 질환은 류마티스 관절염 , 퇴행성 관절염 , 강직성 척추염 및 골다공증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 본 발명은 약학적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 유효성분으로서 스핑고신 1-포스페이트(sphingosine 1-phosphate) 수용체 아고니스트를 함유하는 COX-2(cyclooxygenase-2), iNOS (inducible nitric oxide synthesis) 및 NF-kB(nuclear factor kB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염증유발 인자를 저해하는 조성물, 연골세포 염증 억제 조성물 및 관절염 질환을 치료하기 위한 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 스핑고신-1-포스페이트를 유효성분으로 함유하는 조성물은 연골세포 염증을 유도하는 인자들의 발현을 감소시켜 연골을 직접적으로 분해하는 기질단백분해효소들의 발현 및 활성을 효과적으로 억제하여, 연골의 구성성분 중 하나인 글리코사미노글리칸의 유리를 효과적으로 감소시킨다. 또한, 본 발명에서 연골의 염증에 있어서 스핑고신 1-포스페이트 수용체 아고니스트가 중요한 역할을 하며, 이 수용체의 활성이 연골에서 여러 염증인자를 억제하는 효과를 나타내기 때문에 새로운 관절염 치료제의 표적이 될 수 있고, 다양한 관절염 치료제의 개발로 이어질 수 있다.

도 1a 내지 도 1d는 S1P 처리에 의한 연골세포의 염증유발인자의 유전자 및 단백질 발현 감소를 보여주는 결과 및 그래프이다.
도 2a 내지 도 2d는 S1P 처리에 의한 연골세포 외 기질단백분해효소 관련 유전자 및 활성 감소를 보여주는 결과 및 그래프이다.
도 3a 내지 도 3e는 S1P1 수용체에 의해 매개된 S1P의 연골세포의 염증 유발 인자의 발현 억제 효과를 보여주는 결과 및 그래프이다.
도 4a 내지 도 4b는 S1P1 수용체에 의해 매개된 S1P의 연골조직의 글리코사미노글리칸의 유리 억제 효과를 보여주는 그래프이다.

이하, 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.

본 발명에 따른 약학적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 유효성분으로서 스핑고신 1-포스페이트를 함유하는 조성물은 COX-2, iNOS 및 NF-kB로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염증유발 인자를 저해하고, 연골세포 염증을 억제하며, 이에 따라 다양한 관절염을 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명에 따른 약학적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 유효성분으로서 스핑고신 1-포스페이트 수용체를 함유하는 조성물은 COX-2, iNOS 및 NF-kB로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염증유발 인자를 저해하고, 연골세포 염증을 억제하며, 이에 따라 다양한 관절염을 치료할 수 있는 것을 특징으로 한다.

상기와 관련하여, 본 발명은 후술하는 연골세포에서 염증 유발시 스핑고신-1-포스페이트 처리 유무에 대한 염증 정도를 비교하였고, 염증 유발 관련 유전자 및 단백질 발현 정도(COX-2, NF-kB, MMPs의 발현정도)를 RT-PCR, Immunoblotting로 확인하였다. 또한, 기질단백분해효소의 활성 억제(MMP-2의 활성 정도)를 Gelatine zymography로 확인하였으며, 연골조직에서 글리코사미노글리칸의 유리 정도를 GAG release test로 확인하였다.

상기 "치료"라 함은 발병 증상을 보이는 객체에 사용될 때 질병의 진행을 중단 또는 지연시키는 것을 의미하고, 본 발명에 따른 "조성물"은 스핑고신 1-포스페이트 유효성분과 함께 필요에 따라 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 부형제, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 "담체(carrier)"라 함은 세포 또는 조직 내로 화합물의 부가를 용이하게 하는 물질을 의미한다.

상기 "희석제(diluent)"라 함은 대상 화합물의 생물학적 활성 형태를 안정화시킬 뿐만 아니라, 화합물을 용해시키는 물에서 희석되는 물질로 정의된다.

상기 "약학적으로 허용되는"이라 함은 화합물의 생물학적 활성과 물성을 손상시키지 않는 성질을 의미한다.

기타 본 명세서에서 사용된 용어와 약어들은 달리 정의되지 않는 한 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 의미로서 해석될 수 있다.

본 발명의 화합물은 약학적으로 또는 수의학적으로 수용가능한 담체 또는 희석제를 또한 함유하는 약학적 또는 수의학적 조성물로 사용하기 위해 제형화할 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 통상적인 방법에 따라 일반적으로 제조하여, 약학적으로 또는 수의학적으로 적절한 형태로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명의 바람직한 실시예에 의하면, 정제, 캡슐, 당-코팅, 필름-코팅 정제, 액체 용액 또는 현탁액의 형태와 같은 경구적으로 투여할 수 있고, 또는 피하나 근육내로 또는 정맥내로 주사 또는 주입의 방법을 통하여 비경구적으로 투여할 수도 있다.

이하, 바람직한 실시예를 들어 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이에 의하여 제한되지 않는다는 것은 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 자명할 것이다.

<실시예>

(1) 스핑고신 1-포스페이트(Sphingosine-1-phosphate, S1P, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA; #62570)는 0.3 N NaOH에 2 mM 농도로 녹이고, 지시된 각 농도에 맞게 처리하기 위해 세포 배양 배지로 희석하였고, Recombinant human IL-1β (Santa Cruz Biotechnology, CA, USA)는 10 ㎍/㎖의 농도로 DW에 녹여 10 ng/㎖의 농도로 처리하였다. SEW2871 (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA; #10006440)은 에탄올에 10 mM의 농도로 녹여 지시된 각 농도에 맞게 세포 배양 배지로 희석하여 사용하였으며, W146 (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA; #10009109)은 에탄올에 5mM의 농도로 녹여 지시된 각 농도에 맞게 세포 배양 배지로 희석하여 사용하였다.

(2) 연골세포 분리 및 단층 연골세포배양

관절 연골세포를 분리하기 위한 연골조직 표본은 관절염 환자로부터 인공관절 대체 수술시 절제한 무릎 관절을 사용하였다. 연골조직을 멸균 PBS로 수회 세척을 실시한 후, 연골조직 표본을 작은 절편으로 자른 후 다시 멸균된 PBS용액으로 3회 세척을 하고, 연골세포외 기질을 제거하기 위해서 0.25% trypsin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; #T4174)으로 30분간 처리하고 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen-Gibco)와 항생제 (100 ㎍/㎖ penicillin-treptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; #P0781)가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지에 0.1% collagenase (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; #C6885)를 37 ℃에서 6시간 처리하였다.

70　μm cell strainer (Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA)를 통해 단일 연골세포들을 획득한 후 tissue culture flask에 10% FBS와 항생제가 첨가된 DMEM 배지를 넣고 배양하였다. 2 일에 한 번씩 배지를 갈아주고, 배양 후 7 일 후에 플라스크가 가득차면 한번 나누고 다시 높은 밀도로 세포가 자라면 이 첫 번째 계대배양한 연골세포들을 가지고 실험하였다. S1P, SEW2871, W146, IL-1β 처리를 하기 전에 1% FBS DMEM으로 배지를 갈고 처리하였다.

(2) qRT-PCR (Quantitative Real-time PCR)

세포로부터 총 RNA의 분리는 Easy-spin™ total RNA extraction kit(iNtRON Biotechnology, Seoul, Korea)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 이후, cDNA의 합성은 TaKaRa Prime Script™ 1st strand cDNA synthesis kit(Takara Bio Inc., Tokyo, Japan)의 프로토콜에 따라 수행하였다.

Quantitative PCR을 수행하기 위해, 총 20 ㎕ 반응액에 SYBR green과 1 ㎕의 유전자 프라이머를 첨가하였다. 상기 사용된 프라이머는 하기에 나타내었다.

프라이머

COX-2:

forward, 5'AGTCCCTGAGCATCTACGGTTTG3',

reverse, 5'CATCGCATACTCTGTTGTGTTCCC3';

iNOS:

forward, 5'CCAGCCGTGCCACCATCC3',

reverse, 5'CCATCCACCACTCGCTCCAG3';

MMP1:

forward, 5'TCCACTGCTGCTGCTGCTG3',

reverse, 5'TTTCAACTTGCCTCCCATCATTCTTC3';

MMP3:

forward, 5'TGAACAATGGACAAAGGATACAACAGG3',

reverse, 5'ATCATCTTGAGACAGGCGGAACC3';

MMP13:

forward, 5'AGTGGTGGTGATGAAGATGATTTGTC3',

reverse, 5'TCTAAGGTGTTATCGTCAAGTTTGCC3';

β-actin:

forward 5'TGAGAGGGAAATCGTGCGTGAC3',

reverse 5'GCTCGTTGCCAATAGTGATGACC3';

iTaq SYBR green supermix(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)의 모든 반응은 CFX96 real-time PCR detection system(Bio-Rad Laboratories)에서 수행하였다.

(3) Western blotting

세포를 용해버퍼(25 mM HEPES; pH 7.4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0.1 mM DTT 및 protease inhibitor mixture)로 용해시켰다. 이후, 단백질을 10-15 % SDS gel에 전기영동으로 분획한 후, 이뮤노블롯팅(immunoblotting)을 수행하였다. 단백질 용해물의 Equal amounts를 10-15 % SDS-polyacrylamide gel위에 분획시킨 후, 니트로셀룰로오스 막(nitrocellulose membrane)에 전기영동으로 전이시켰다.

Immunoreactivity는 HRP(horseradish peroxidase)-결합된 이차 항체(secondary antibodies) 및 ECL reagents의 연속적인 배양을 통해 검사하였다.

이뮤노블롯팅(immunoblotting)에 사용된 항체는 p-65, COX-2 (Santa Cruz Biotechnology) and β-actin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 을 사용하였다.

(4) Gelatin zymography

Gelatin zymography는 배지로 분비되어 나온 기질단백분해효소(MMP) 단백질의 분비와 활성화 상태를 측정하기 위한 실험으로서, 각 조건에 맞게 약물을 처리하여 얻은 배지를 모아 원심분리 후 세포 찌꺼기를 제거하여 -20 ℃에 보관하였다.

각 샘플을 SDS sample buffer로 1:1 섞은 후에 30 분간 상온에서 반응시킨다. 각 샘플들은 10% acrylamide와 1 ㎎/㎖ gelatin이 함유된 SDS-PAGE 겔로 전기영동하여 분리시켰다. 증류수에 녹인 2.5% (w/v) Triton X-100 용액을 상온에서 30분간 2 번 washing 후 50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 0.2 M NaCl and 5 mM CaCl₂ 이 함유된 developing buffe로 37 ℃에서 36 시간 배양하였다.

이 developing buffer는 단백질의 구조를 다시 환원시켜 단백분해능을 다시 갖게 해주는 역할을 한다. 36 시간 후에 겔을 50% ethanol, 10% acetic acid에 녹인 0.2% Coomassie Blue R-250 용액으로 상온에서 1 시간 동안 염색시킨 후에 20% methanol, 10% acetic acid, 70% 증류수로 구성된 destaining 용액으로 1 시간 이상 탈색시키면 활성화된 MMP에 의해 젤라틴이 분해된 부분은 염색이 되지 않고 투명하게 보여지게 되고, 나머지 MMP 단백질 부분은 어둡게 염색된체로 남아있게 된다. Fusion FX7 acquisition system (Vilbert Lourmat, Eberhardzell, Germany) 을 이용하여 겔의 사진을 찍고 분석하였다.

(5) 조직에서 media로 유리된 GAG 측정

연골조직을 2×2×1 ㎣ or 3 ㎜ disc로 (50-100 ㎎) 잘라서 24 well plate에 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS) (Invitrogen-Gibco)와 항생제 (100　㎍/㎖ penicillin-treptomycin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA; #P0781)가 첨가된 Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) (Invitrogen-Gibco, Grand Island, NY, USA) 배지를 넣고 4-6 disc를 배양시켰다.

1% FBS가 함유된 DMEM 배지로 교체 후에 각 실험에 맞는 약물을 72 시간 동안 처리였다. 배양한 배지를 모아 연골조직에서 분해되어 유리된 글리코사미노글리칸의 양을 측정하였다. Chondroitine sulfate (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)를 녹인 용액을 농도별로 희석하여 standard로 잡아 standard 용액 10 ㎕ 혹은 배지 샘플 10 ㎕와 180 ㎕ (B) dimethylene blue (DMB, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 용액을 30 분간 상온에서 반응시켜 540 ㎚에서 흡광도를 측정하여 글리코사미노글리칸의 양을 측정하였다. 이 때, 상층액은 protein assay를 하여 농도를 측정하여 글리코사미노글리칸의 양을 ㎍/㎎ 단위로 계산하였다. 이 때, DMB 용액은 48 ㎎/㎖ DMB, 40 mM glycine, 40 mM NaCl, 10 mM HCl로 구성되며 pH 3.0으로 맞춘 용액을 사용하였다. Chondroitine sulfate standard 용액은 PBS로 5 ㎍/㎖ 농도로 녹여 계대 희석하여 사용하였다.

(6) 통계학적 평가

수행한 실험의 모든 데이터는 means±SD(standard deviations)로 나타내었으며, Student's t-test 및 SAS statistical package의 ANOVA Duncan test를 이용하여 비교하였다. 이후 결과들을 *P < 0.05 또는 **P < 0.01의 값과 #P < 0.05, ##P < 0.01의 값에 대해 유의하다고 고려하였다.

<평가예>

(1) S1P 처리에 의한 연골세포의 염증유발인자의 유전자 및 단백질 발현 감소

연골조직에서 분리한 연골세포를 단층으로 배양시킨 세포에 Interleukin-1β (IL-1β) 10 ng/㎖를 처리하여 골관절염 유발시킨 후 S1P를 처리로 인해 주요 염증유발인자들의 발현이 감소되는지를 real time RT-PCR과 Western blotting을 통하여 확인하였고, 그 결과를 하기 도 1a 내지 도 1d 나타내었다.

하기 도 1a 내지 도 1d에서 보는 바와 같이, cyclooxygenase-2 (COX-2)의 발현이 처리한 S1P의 농도 의존적으로 농도가 증가함에 따라 (0.1 μM, 1 μM, 10 μM) COX-2의 유전자 발현과 단백질 발현량이 현저히 감소되는 것을 알 수 있다. 특히, S1P 10 μM 농도에서는 8 배 가량 COX-2의 발현량을 낮췄다. 또한, nitric oxide를 생산하여 연골세포의 사멸과 염증을 유발시키는 인자 중에 하나인 inducible nitric oxide synthesis (iNOS) 의 발현 역시 S1P처리에 의해 감소되는 것을 알 수 있다.

(2) S1P 처리에 의한 연골세포 외 기질단백분해효소 관련 유전자 및 활성 감소

S1P가 직접적으로 골관절염이 유발되었을 때 염증유발인자에 의해 분비되는 기질단백분해효소의 발현 및 활성에 어떠한 영향을 주는지 확인하기 위하여, 연골조직에서 분리하여 단층으로 배양시킨 연골세포에 10 ng/㎖ 농도의 IL-1β를 처리하여 골관절염을 유발시킨 뒤 S1P가 증가된 기질단백분해효소의 발현 및 활성에 대해 방어효과를 갖는지를 확인하기 위하여 real time RT-PCR과 gelatin zymography를 실시하였고, 그 결과를 하기 도 2a 내지 도 2d에 나타내었다.

하기 도 2a 내지 도 2d에서 보는 바와 같이, 기질단백분해효소 1의 유전자 발현량이 IL-1β 처리에 의해 150 배 가량 증가되었지만 S1P 처리농도를 증가시킴에 따라 MMP 1의 유전자 발현량이 농도 의존적으로 현저히 감소되었으며, S1P 10 μM 농도에서는 5배 가량 감소함을 알 수 있다. 또한, 기질단백분해효소의 발현량 뿐만 아니라 활성 자체가 감소되는지를 확인하기 위해 gelatin zymogrphy를 실시한 결과, 역시 IL-1β 처리에 의해 증가되었던 기질단백분해효소 2의 활성화가 S1P의 처리농도가 증가함에 따라 감소됨을 알 수 있다. 따라서, S1P는 COX-2의 발현량을 감소시켜 그 하위 기전인 기질단백분해효소들의 발현 및 활성을 막는 역할을 함을 알 수 있다.

(3) S1P1 수용체에 의해 매개된 S1P의 연골세포의 염증 유발 인자의 발현 억제 효과

S1P의 연골세포에서의 항염증작용이 어떠한 수용체를 통해서 나타나는지를 확인하기 위해 S1P1 수용체 길항제인 W146을 농도별 (0, 10, 50, 100 μM)로 처리하여 S1P1 수용체를 막고 IL-1β로 염증을 유발시킨 뒤 S1P 10 μM을 처리한 후 RT-PCR을 실시하여 COX-2의 유전자 발현 결과를 하기 도 3a에 나타내었다.

또한, COX-2, P-65의 발현량 역시 Western blot을 실시하여 그 결과를 하기 도 3d에 나타내었다. S1P1 수용체 선택적인 효현제 SEW2871을 농도별로 (0, 1, 10, 50 μM) 처리하여 S1P와 동일 효과가 나타나는지 또한, 그 효과가 S1P1 수용체 길항제를 처리하였을 경우 나타나지 않는지 real-time RT-PCR과 Western blot을 실시하여 COX-2의 발현과 P-65의 유전자 및 단백질 발현 결과를 하기 도 3b, 도 3c, 도 3e에 각각 나타내었다.

하기 도 3a 내지 도 3e에 나타난 바와 같이, IL-1β 처리로 증가된 COX-2 유전자 발현량이 S1P 처리에 의해 감소되었고 이 감소는 S1P1 수용체가 길항제 처리에 의해 저해되었을 때에는 나타나지 않는 것을 알 수 있다. 또한, COX-2와 P-65의 단백질 발현량 역시 S1P 처리에 의해 감소 대조군 수준으로 돌아온 발현량이 S1P1 수용체가 막혔을 때에는 그 염증유발물질의 발현 저해 작용이 나타나지 않음을 알 수 있다. S1P1 선택적 효현제를 농도별로 처리하였을 경우, COX-2의 유전자 발현량이 대조군 수준으로 감소됨을 확인하였고, 그러한 효과는 S1P1 길항제 처리로 나타나지 않음을 확인하였다. 이는 COX-2, P-65의 단백질 발현량에서도 유사한 결과를 보였다. 즉, S1P의 연골세포의 염증 유발 인자들의 발현 억제 작용은 S1P1 수용체를 경유하여 일어나는 것임을 알 수 있다.

(4) S1P1 수용체에 의해 매개된 S1P의 연골조직의 글리코사미노글리칸의 유리 억제 효과

연골조직에서도 S1P가 항염증작용을 나타내는지 직접적으로 확인하기 위해서 관절염이 유발되었을 경우 염증 유발 물질에 의해 발현 및 활성화되는 기질단백분해효소에 의해 유리되어 나오는 기질 단백질 중 글리코사미노글리칸의 양을 측정하였다. 연골조직을 2×2×1 ㎣ 잘라서 24 well plate에 4-6 disc를 배양하여 IL-1β를 처리하여 염증을 유발시킨 후에 S1P1 길항제 100 μM 과 함께 또는 단독으로 S1P를 농도별로 (0, 0.1, 1, 10 μM) 를 처리하고, 72 시간 후에 배양한 배지를 모아 dimethylene blue를 이용하여 배지로 유리되어 나온 글리코사미노글리칸의 양을 측정한 결과를 하기 도 4a에 나타내었다.

또한, S1P1 선택적 효현제인 SEW2871 50 μM을 단독 또는 S1P1 길항제 W146 100 μM 을 미리 1 시간 전처리하여 같은 방법으로 글리코사미노글리간의 양을 측정한 결과를 하기 도 4b에 나타내었다.

하기 도 4a에서 보는 바와 같이, IL-1β 처리로 연골조직의 기질 분해가 일어나 배지로 유리되어 나온 글리코사미노글리칸의 양이 증가되었지만 S1P를 농도별로 처리하였을 때 농도가 증가함에 따라 대조군 수준으로 연골조직의 기질 분해가 저해되었음을 알 수 있다. 또한, 하기 도 4b를 살펴보면 S1P1 수용체를 선택적으로 활성화시켰을 경우에도 S1P와 동일한 효과가 나타났고, S1P1 수용체 길항제를 사용했을 경우, 그 효과가 사라지는 것으로 보아 S1P의 연골조직의 기질 분해 억제 작용은 S1P1 수용체를 경유해서 일어남을 알 수 있다.

상기 실시예 및 평가예에서 볼 때, S1P가 연골세포 및 연골 조직의 항염증 작용을 가지고 있는데, 이 억제 작용이 S1P1 수용체를 통해 염증 유발 인자인 COX-2, p-65의 발현을 조절하여 그 하위 기전인 기질단백분해효소의 발현 및 활성을 억제하여 결과적으로는 연골 조직의 기질 단백질의 분해를 감소시켜 연골의 분해를 막는 것임을 알 수 있다. 특히, S1P가 연골세포에서 항염증 작용을 조절하고, 특히, 이 조절과정에 있어서 S1P1 수용체가 중요한 역할을 함을 알 있다.

Claims

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약학적으로 수용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 유효성분으로서 스핑고신1-포스페이트(sphingosine 1-phosphate, S1P) 수용체 아고니스트를 함유하고, COX-2(cyclooxygenase-2), iNOS (inducible nitric oxide synthesis) 및 NF-kB(nuclear factor kB)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발현을 저해하며,
상기 S1P 수용체 아고니스트는 1 ~ 50μM의 SEW2871(Cayman Chemical사의 상품명 10006440)인 것을 특징으로 하는 관절염 질환을 치료 및 예방하는 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 조성물 미사용에 대비하여,
COX-2(cyclooxygenase-2)의 발현량이 1.5 ~ 2.5배 감소 되는 것을 특징으로 하는 관절염 질환을 치료 및 예방하는 조성물.
제 5 항에 있어서,
상기 관절염 질환은 류마티스 관절염 , 퇴행성 관절염 , 강직성 척추염 및 골다공증으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 관절염 질환을 치료 및 예방하는 조성물.
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