KR101695347B1 - 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 조산 위험성 예측용 조성물 및 이의 이용 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 산모의 시료로부터 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 조산 위험성을 진단하기 위한 조성물, 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
Description
본 발명은 산모의 시료로부터 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 검출함으로써, 조산 위험성을 진단하기 위한 조성물, 진단 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
조산(preterm birth)은 일반적으로 20주를 지나 37주 이전에 분만하는 것을 의미한다. 조산으로 태어난 신생아는 전체 영아 사망자의 약 60%를 차지할 정도로 사망의 위험이 높고, 생존아의 경우에도 신경계 발달장애, 호흡기계 합병증, 출생 후 성장지연 등으로 신생아 집중치료가 필요하며, 더 나아가 심각한 장기적 또는 단기적 질환에 이환율이 높다. 또한, 조산의 약 75%는 조기진통과 양막파수, 그리고 이와 관련된 자궁경관 무력증과 융모막염 등을 수반하여 발생하게 된다. 하지만 조산과 관련된 기전은 아직 명확히 밝혀져 있지 않으며, 자연적 진통과 흔히 연관된 위험인자는 생식기계감염, 다태 임신, 2,3 삼분기 출혈, 이전의 조산기왕력 등이 있다.
조산아의 생존율을 향상시키기 위한 최소한의 임신주수는 27주, 출생체중은 0.9 kg이고, 출생 신생아의 이환과 사망은 출생체중보다는 일차적으로 임신주수, 즉 성숙도에 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 따라서 이른 주수에 조산의 징후가 왔을 때, 적절한 치료를 통하여 분만 주수를 지연시켜 신생아를 성숙도를 높이는 것은 산모와 신생아의 건강과 삶의 질과 비용에 중대한 관건이 된다.
현재까지 조산의 치료를 위하여 조기진통의 산모에게 자궁수축 억제제 투여, 항생제 치료, 스테로이드제 및 프로게스테론 투여를 통해 진통을 억제하고 분만을 지연시켜왔다. 그러나, 이미 조기진통 및 조기양막파수가 발생한 경우에는 자궁 내 감염 및 염증에 대한 항생제의 치료 효과는 매우 제한적이며 조산을 막을 수는 없는 것으로 알려져 있다. 또한 자궁경관 무력증의 산모인 경우 감염과 유산에 대한 상당한 위험이 있기 때문에 조기분만의 치료와 예방으로서 자궁경부봉축술을 시행하여 왔으나, 이것이 근본적인 치료는 될 수 없으며 단기간의 임신 연장에 도움이 되는 정도로 알려져 있다.
따라서, 조산의 위험성을 미리 예측함으로써 조산위험 산모군을 선별하고, 이들에 대한 적절한 관리를 통하여 조산을 방지하거나 효과적인 치료방법을 개발하는 것이 필요하다. 또한, 조산의 시기가 빠를수록 신생아에게 후유증을 남길 가능성이 높고 후유증의 정도도 심하기 때문에 조산을 예측할 수 있다면 미숙아와 그로 인한 장애아의 발생률을 현저하게 줄일 수 있을 것으로 기대된다.
조산을 예측하기 위한 일반적인 접근 방법은, 산부인과학적으로, 인구통계학적으로 및 여러 가지 증후군에 따라 특별한 주의를 기울여야 하는 여성군을 확인하는 것이었으나(Main et al., Am. J. Obste. Gynecol., 151:892-898, 1985), 이러한 접근 방법은 그 방식이 민감하거나 특이적이지 않다는 문제가 있다. 이러한 문제점을 극복하기 위하여, 갑작스런 조산이나 양막파수를 예견하기 위한 생화학적인 표지자를 발견하기 위하여 많은 연구가 시행되어 왔고, 플라즈마 에스트라디올-17 베타(plasma estradiol-17 beta), 프로게스테론(progesterone), C-반응성 단백질(C-reactive protein)과 같은 물질들이 후보로 지명되었으나, 이 역시 그 정확도가 떨어지는 것으로 나타났다. 따라서, 보다 검출이 용이하고 민감도와 특이도가 높은 표지자의 개발이 필요하다.
Main et al., Am. J. Obste. Gynecol., 151:892-898 (1985)
이에, 본 발명에서는 산모에게서 조산 위험성을 시사하는 조산의 예측 표지자를 발굴하여 조산의 예방에 기여하고자 한다.
이를 위하여, 일예로, 본 발명의 목적은 mir-886(microRNA-886) 및 INS-IGF2(INS-IGF2 readthrough)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 산모의 조산 위험성의 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
다른 예로, 본 발명의 또 하나의 목적은, 상기 조성물을 포함하는, 산모의 조산 위험성 진단용 키트를 제공하는 것이다.
다른 예로, 본 발명의 또 하나의 목적은, 산모의 시료로부터 mir-886 및 INS-IGF2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 정상 분만 산모의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 조산 위험성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
다른 예로, 본 발명의 또 하나의 목적은, 산모의 시료로부터 mir-886 및 INS-IGF2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및 상기 메틸화 수준을 정상 분만 산모의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는, 산모의 조산 위험성을 진단하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 조산 분만 산모와 정상 분만 산모의 혈액 내 유전자에서 유의적인 CpG 메틸화(methylation) 수준의 차이를 나타내는 유전자들을 선별한 결과를 기초로 하여, 상기 유전자들의 CpG 부위의 메틸화 정도를 바이오 마커로서 이용하여 조산 위험성을 예측하는 기술을 제공한다
본 발명의 일 실시예에서는 임신 중 조기 진통으로 입원한 산모를 대상으로 혈액을 채취하여 분만주수를 확인하여 37주 미만의 조산군과 37주 이후에 분만한 정상군으로 구별한 후, 이들 산모 혈액에서 DNA를 추출하였다. 또한, 유전자의 메틸화 수준을 비교 분석하기 위하여 Illumina HumanMethylation 450 BeadChip(Illumina)을 이용하여 Genome-Wide DNA Methylation Patterns 을 조사한 결과, 조산 산모군에서 통계적 유의한 DNA 메틸화 수준 차이가 있는 유전자를 선별하였다. 나아가, 이와 같이 유전자의 발현에 영향을 준 특정 CpG 부위를 확인하였으며, 해당 유전자의 특정 CpG 위치에서 일어나는 메틸화 정도를 측정함으로써 산모의 조산 위험도를 예측할 수 있다는 것을 확인하였다.
따라서, mir-886 및/또는 INS-IGF2 유전자의 CpG 위치에서 일어나는 DNA 메틸레이션의 과메틸화(hypermethylation) 또는 저메틸화(hypomethylation)는 조산을 진단하거나 조산 위험도를 예측할 수 있는 바이오 마커로 활용될 수 있다.
보다 상세하게, mir-886 의 CpG 부위가 조산 위험군 산모에서 특이적으로 과메틸화(hypermethylation)되며, INS-IGF2 유전자의 CpG 부위가 조산 위험군 산모에서 특이적으로 저메틸화(hypomethylation)되므로, 이들 중 각각을 조산 위험성을 예측하기 위한 단독의 바이오 마커로 사용하거나, 이들 중 2종 이상을 복합 바이오 마커로 사용할 수도 있다.
따라서, 하나의 양태로서, 본 발명은 mir-886 및 INS-IGF2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 조산 위험성의 진단용 조성물 및 이를 포함하는 키트에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "진단" 또는 "예측"이란, 산모에 대하여 임신주수 37주 미만에서 조산을 할 가능성이 있는지, 37주 미만에서 조산의 가능성이 상대적으로 높은지, 또는 37주 미만에서 조산의 징후를 나타낼 가능성이 있는지 여부를 판별하는 것을 말한다. 본 발명은 산모들에 대하여 37주 미만의 조산 위험성이 높은 산모들을 특별하고 적절한 관리를 통하여 조산을 지연시키거나 방지하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 37주 미만의 조산을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)" 또는 "표지자"란 조산 산모(예를 들어, 37주 미만의 조산 산모)와 정상 분만 산모(예를 들어, 37주 이상에서 분만하는 산모)를 미리 예측하여 구분할 수 있는 물질로, 정상 분만 산모의 시료에 비하여 조산으로 예측되는 산모의 시료에서 유의적인 차이를 나타내는 생체 유기 분자들을 의미한다. 본 발명의 목적상, 조산으로 예측되는 산모의 시료에서 특이적으로 DNA 메틸화 변화를 나타내는 유전자들을 의미할 수 있다.
본 발명에서 용어, "메틸화"는 DNA를 구성하는 염기에 메틸기가 부착되는 것을 말한다. 바람직하게, 본 발명에서 메틸화 여부는 특정 유전자의 특정 CpG 부위의 사이토신에서 일어나는 메틸화 여부를 의미한다. 메틸화가 일어난 경우 그로 인하여 전사인자의 결합이 방해를 받게 되어 특정 유전자의 발현이 억제되며, 반대로, 비메틸화 또는 저메틸화가 일어나는 경우 특정 유전자의 발현이 증가하게 된다.
포유동물 세포의 게놈 DNA 에는 A, C, G 및 T 에 더하여, 사이토신 링의 다섯번째 탄소에 메틸 그룹이 부착된 5-메틸사이토신(5-methylcytosine, 5-mC)이라는 5번째 염기가 존재한다. 5-메틸사이토신의 메틸화는 CpG라고 불리는 CG 디뉴클레오티드(5'-mCG-3')의 C에서만 일어나고, CpG의 메틸화는 alu 또는 트랜스포존과 게놈의 반복서열이 발현되는 것을 억제한다. 또한, 상기 CpG의 5-mC가 자연적으로 탈아미노화하여 티민(T)이 되기 쉽기 때문에, CpG는 포유동물 세포에서 대부분의 후성유전학적 변화가 자주 일어나는 부위이다.
본 발명에서 용어, "메틸화 수준의 측정"은 mir-886 및/또는 INS-IGF2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것으로서, 메틸화 특이적인 PCR, 예를 들어 메틸화 특이적 PCR(methylation-specific polymerase chain reaction, MSP), 실시간 메틸화 특이적 PCR(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 또는 정량 PCR 등을 통해 측정할 수 있다. 또는, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱과 같은 자동염기분석 등의 방법으로 측정할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
바람직하게, 상기 유전자의 CpG 부위란, 상기 유전자의 DNA 상에 존재하는 CpG 부위를 말한다. 상기 유전자의 DNA 는, 상기 유전자가 발현하는데 필요하며 서로 작동가능하게 연결되어 있는 일련의 구성 단위를 모두 포함하는 개념으로, 예를 들어, 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 및 터미네이터 영역을 포함한다. 따라서, mir-886 및/또는 INS-IGF2 유전자의 CpG 부위는 해당 유전자의 프로모터 영역, 단백질 코딩 영역(open reading frame, ORF) 또는 터미네이터 영역 등에 존재할 수 있다. 바람직한 예로는, 상기 유전자의 프로모터 영역에 존재하는 CpG 부위일 수 있다.
바람직하게, 본 발명에서 mir-886 의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 5번 염색체의 135416005 내지 135416405 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 5번 염색체의 135416005 내지 135416405 번째 염기를 서열번호 1로 나타내었다.
더욱 바람직하게, 본 발명에서 mir-886 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 5 번 염색체의 135416205 번째 (서열번호 1의 209번째) 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한 바람직하게, 본 발명에서 INS-IGF2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 11 번 염색체의 2161281 내지 2161681 번째 염기 중에 나타나는 CpG 부위의 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다. 본 발명에서는, 상기 11 번 염색체의 2161281 내지 2161681 번째 염기를 서열번호 2로 나타내었다.
더욱 바람직하게, 본 발명에서 INS-IGF2 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 것은, 11 번 염색체의 2161481 (서열번호 2의 200 번째) 위치하는 사이토신의 메틸화 수준을 측정하는 것을 의미할 수 있다.
또한, 산모 유전자의 비정상적인 메틸레이션의 변화는 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 생물학적 시료에서 얻은 게놈 DNA의 메틸레이션 변화와 상당한 유사성을 보이므로, 본 발명의 마커를 이용할 경우 조산의 진단 또는 조산 위험성 예측에 대하여, 혈액이나 체액 등을 통한 손쉬운 진단이 가능하다는 장점이 있다.
본 발명에서, CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머, 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다.
상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 CpG 부위의 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다(WO01/26536; US2003/0148326A1).
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있다. 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며 이에 제한되지 않는다. 상기 제한효소 인식부위의 C에서의 메틸화 또는 비메틸화에 따라 제한효소에 의한 절단 여부가 달라지고 이를 PCR 또는 서던블롯(Southern Blot) 분석을 통해 검출할 수 있게 된다. 상기 제한효소 이외의 다른 메틸화 민감성 제한효소는 당 업계에 잘 알려져 있다.
산모의 mir-886 및/또는 INS-IGF2 유전자의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하는 대표적인 방법으로, 환자의 생물학적 시료에서 게놈 DNA를 수득하고, 수득한 DNA에 메틸화되지 않은 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소를 처리한 후, 상기 처리된 DNA를 프라이머를 이용하여 PCR에 의해 증폭시키고 그 증폭된 결과물의 존부를 확인하는 것을 통해 측정할 수 있다.
따라서, 본 발명의 제제는 mir-886 및/또는 INS-IGF2 유전자의 메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머 및 비메틸화된 대립형질 서열에 특이적인 프라이머를 포함할 수 있다. 본 발명에서, 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 또한, 프라이머는, 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스 및 안티센스 핵산으로서, DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다.
본 발명의 프라이머는 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍, 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍일 수 있다.
상기 조성물 및 키트에는 상기 제제 이외에도, 중합효소 아가로스, 전기영동에 필요한 완충용액 등이 추가로 포함될 수 있다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 mir-886 및 INS-IGF2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 조산 위험성을 진단하는 방법에 관한 것이다.
또 하나의 양태로서, 본 발명은 mir-886 및 INS-IGF2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위에서의 메틸화 수준을 측정하여 조산 위험성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
일예로, 본 발명은 산모의 혈액 시료로부터 mir-886 및 INS-IGF2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
상기 메틸화 수준을 대조군 시료의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는,
조산 위험성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 대조군 시료는 정상 분만 산모의 시료일 수 있다.
또한, 상기 방법은, 산모의 시료에서 측정된 mir-886 유전자의 CpG 부위 메틸화 수준이 대조군 시료에서 측정된 메틸화 수준보다 높거나, 산모의 시료에서 측정된 INS-IGF2 유전자의 CpG 부위 메틸화 수준이 대조군 시료에서 측정된 메틸화 수준보다 낮은 경우, 해당 산모가 조산의 위험성이 있는 것으로 결정하는 단계를 더욱 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어 "생물학적 시료"란 조산 위험군 산모와 정상 산모 간에 mir-886 및/또는 INS-IGF2 유전자의 메틸화 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는 혈액 또는 체액 시료일 수 있다.
먼저, 산모로부터 게놈 DNA를 수득하여 메틸화 수준을 측정하기 위하여, 게놈 DNA의 수득은 당 업계에서 통상적으로 사용되는 페놀/클로로포름 추출법, SDS 추출법(Tai et al., Plant Mol. Biol. Reporter, 8: 297-303, 1990), CTAB 분리법(Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide; Murray et al., Nuc. Res., 4321-4325, 1980) 또는 상업적으로 판매되는 DNA 추출 키트를 이용하여 수행할 수 있다.
상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계는, 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소, 유전자 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머, 및 비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 이용하여 수행될 수 있다.
보다 상세하게는, 수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
상기 처리된 DNA를 유전자 CpG 부위의 메틸화 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 선택하여 메틸화 수준을 측정하는 단계에 의해 수행될 수 있다.
상기에서, 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트일 수 있으며, 바람직하게는 소듐 바이설파이트일 수 있다. 이러한 바이설파이트를 이용하여 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시켜 유전자 메틸화 여부를 검출하는 방법은 당 업계에 널리 공지되어 있다.
또한, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 위에서 설명한 바와 같이, 특정 CpG 부위의 메틸화를 특이적으로 검출할 수 있는 제한효소로서 제한효소의 인식부위로 CG를 함유하는 제한효소일 수 있으며, 예를 들면, SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI, NotI 등이 있으며, 이에 제한되지 않는다.
상기 프라이머는 위에서 설명한 바와 같이, 메틸화 여부를 분석하는 대상이 되는 특정 CpG 부위의 서열에 따라 바람직하게 디자인될 수 있으며, 각각 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 쌍일 수 있다.
메틸화 수준의 측정은, 당 업계에 공지된 방법, 예를 들면 전기영동을 수행하여 원하는 위치의 밴드의 검출 여부에 따라서 수행될 수 있다. 예를 들면, 비메틸화 사이토신 잔기를 변형시키는 화합물을 사용한 경우 두 종류의 프라이머쌍, 즉 메틸화되어 바이설파이트에 의해 변형되지 않았던 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 메틸화되지 않아 바이설파이트에 의해 변형된 사이토신을 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍에 의해 각각 증폭된 PCR 결과물의 존부에 따라 메틸화 정도를 판단할 수 있다. 바람직하게, 샘플 게놈 DNA를 바이설파이트로 처리하고, 해당 유전자의 CpG 부위를 PCR로 증폭하고, 증폭된 부위의 염기서열을 분석하는 바이설파이트 게놈 시퀀싱 방법을 사용하여 메틸화 여부를 판단할 수 있다.
또한, 제한효소를 이용한 경우에도 당 업계에 공지된 방법, 예를 들어 mock DNA에서 PCR 결과물이 나타난 상태에서, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 있는 경우는 유전자가 메틸화된 것으로 판단하고, 제한효소로 처리된 DNA에서 PCR 결과물이 없는 경우는 유전자가 비메틸화 한 것으로 판단하는 것에 따라 그 메틸화 여부를 판단할 수 있으며, 이는 당업자에게 자명하다. 상기에서 mock DNA란 시료에서 분리되고 아무런 처리를 하지 않은 상태의 시료 DNA를 의미한다.
이와 같은 방법에 따라, 산모의 시료 내 mir-886 유전자의 CpG 부위가 특이적으로 과메틸화되거나, INS-IGF2 유전자의 CpG 부위가 특이적으로 저메틸화 상태로 측정되는 경우, 조산의 위험성이 있다고 예측할 수 있는 것이다.
따라서, 상기 본 발명에 따를 경우, mir-886 및/또는 INS-IGF2 유전자의 CpG의 메틸화 여부를 효과적으로 확인하여 조산 위험도를 용이하게 판단할 수 있다.
본 발명을 이용하여 조산의 위험성을 조기에 진단하고 조산을 방지하여 신생아의 이환, 뇌성마비와 같은 신생아의 심각한 합병증과 후유증을 예방하는데 사용할 수 있다.
도 1은 조산 산모(왼쪽)와 정상 산모(오른쪽)의 혈액 내 mir-886의 메틸화 수준을 파이로시퀀싱을 통해 정량 분석한 결과를 나타낸 것이다. 세로축은 메틸화 정도(%)를 나타내며, 기호 "*" 는 p<0.05을 나타낸다.
도 2는 조산 산모(왼쪽)와 정상 산모(오른쪽)의 혈액 내 INS-IGF2의 메틸화 수준을 파이로시퀀싱을 통해 정량 분석한 결과를 나타낸 것이다. 세로축은 메틸화 정도(%)를 나타내며, 기호 "*" 는 p<0.05을 나타낸다.
도 2는 조산 산모(왼쪽)와 정상 산모(오른쪽)의 혈액 내 INS-IGF2의 메틸화 수준을 파이로시퀀싱을 통해 정량 분석한 결과를 나타낸 것이다. 세로축은 메틸화 정도(%)를 나타내며, 기호 "*" 는 p<0.05을 나타낸다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 연구대상
2014년 6월부터 12월까지 이화여자대학교 목동 병원(대한민국)에 임신 중 조기 진통으로 입원한 산모를 대상으로 분만주수를 확인하여 37주 미만의 조산군(n=5)과 37주 이후에 분만한 정상군(n=5)으로 구별하였고, 산모의 혈액을 채취하여 메틸화 스크리닝을 실시하였다. 또한, 메틸화 스크리닝 결과 조산군과 정상군 산모의 혈액에서 유의한 메틸화 차이가 있는 것으로 스크리닝된 유전자는, 37주 미만의 조산 산모 41명 및 37주 이후에 분만한 정상 산모 40명에서 추가로 혈액을 채취하여 파이로시퀀싱(pyrosequencing)을 이용하여 메틸화 수준 차이를 검증하였다.
실시예
2.
genomic
DNA
의 추출
채취한 산모 혈액에서 Qiagen mini kit (Qiagen)를 이용하여 genomic DNA를 추출하였다. 추출방법은 제조사의 매뉴얼을 따라 실시하였다. 추출된 genomic DNA는 spectrophotometer를 이용하여 정량하였으며, DNA 상태는 1% agarose gel에서 전기영동하여 degradation여부를 확인하였다.
실시예
3.
바이설파이트
(
Bisulfite
) 처리
Genomic DNA 에 바이설파이트(Bisulfite)를 처리하면 DNA 염기서열 중 5'-CpG-3' 부위의 사이토신이 메틸화된 경우에는 그대로 유지되지만, 비메틸화된 경우에는 우라실로 바뀌어서 메틸화 정도를 측정할 수 있다. 따라서, 메틸화된 시토신과 비메틸화된 시토신을 구별하기 위하여 genomic DNA를 바이설파이트로 처리하였다. 우선, ~700ng 의 genomic DNA를 Zymo EZ DNA Methylation Kit (Zymoresearch Inc.)을 이용하여 제조사의 매뉴얼에 따라 처리하였고, 이렇게 만들어진 바이설파이트 처리된 DNA를 H2O로 녹여서 사용 시까지 -20℃에서 보관하였다.
실시예
4.
DNA
메틸레이션
마이크로어레이
Infinium(®) Human Methylation 450K BeadChip을 사용하여, DNA 메틸레이션 마이크로어레이를 수행하였다. 제조사의 매뉴얼을 따라, 바이설파이트 처리된 DNA를 증폭하고, 절단(fragmentation), 침전(precipitation) 및 재현탁(resuspension)한 후 BeadChip에 혼성화(hybridization)하였다. 세척한 후, BeadChip을 HiScan SQ system(Illumina)을 이용하여 스캔하고, Genome Studio software(Illumina)를 이용하여 β 값을 계산하였다. DNA 메틸레이션 정도는 0~1 값을 갖는 β 값으로 표시되며 β값 0은 해당 CpG 부위가 완전히 비메틸화 된 것을 의미하며, 1은 완전히 메틸화된 것을 의미한다.
실시예
5. 정상 대비 조산 관련
후성유전자의
정량적 메틸화 검증
후보 유전자의 메틸화 유전자 증폭을 위해 각각의 디자인된 프라이머를 이용하여 바이설파이트 전처리된 DNA를 증폭시켰다.
miR886 Forward primer:GtAAAGTTAAAAGGGATAAAAAA (서열번호 3)
miR886 Reverse primer: AtAGAGATGGAtAGATAGAAAGTt (서열번호 4)
INS-IGF2 Forward primer:TtTGGGttAGGtTTGGAGtt (서열번호 5)
INS-IGF2 Reverse primer:GTtTGGGGAAAttATtTttTGG (서열번호 6)
PCR 조건은 95℃ 10분, 45 cycles (95℃ 30초, 48℃ 30초, 72℃ 30초), 72℃ 5분으로 Surecycler-8800 (Agilent)을 이용하여 증폭하였다. 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 분석을 위하여 비오틴이 결합된 증폭산물을 스트렙타비딘-세파로스 비드(streptavidin-separose bead)가 있는 결합 완충액으로 비드에 결합시켰다. 증폭산물이 결합된 스트렙타비딘-세파로스 비드 는 96 magnetic ejectable microcylinder를 포함한 PSQ 96 샘플 프렙툴에 흡착시키고, 변성 및 수세하였다. 염기분석용 프라이머[miR886:ATAAAAGGGTtAGTAAGtAt (서열번호 7), INS-IGF2: GTTGGAtTTGtATAGA (서열번호 8)]를 이용하여, 어닐링 완충액에 비드를 넣고, 80℃에서 2분간 변성시켰다. 실온에서 염기분석 시동체와 증폭산물이 상보적으로 결합시켜 PyroMark ID (Qiagen)을 이용하여 정상군 대비 조산군 관련 후성 유전자의 정량적 메틸화 검증하였다.
실험결과
정상 산모와 조산 산모의 혈액에서 통계적으로 유의한 메틸화 차이를 보이는 유전자를 스크리닝한 결과, 총 485,577 CpG 부위 중에서 10개의 유전자 프로모터는 조산 산모 혈액에서 정상에 비하여 2배 이상 높은 수준의 메틸화(hypermethylation)를 나타내었고, 13개의 유전자 프로모터는 2배 이상 낮은 수준의 메틸화(hypomethylation)를 보였다. 그 중에서 정상 산모에 비하여 과메틸화를 나타낸 mir-886과, 저메틸화를 나타낸 INS-IGF2를 선별하였다 (p<0.05, 표 1).
| 유전자 | 유전자명 | Genebank 등록번호 | 염색체 | CpG 부위 |
| 조산 위험군에서 과메틸화(Hypermethylation in preterm birth) | ||||
| mir-886 | Homo sapiens vault RNA 2-1 (VTRNA2-1), vault RNA | NR_030583 | 5 | chr5 : 135416005 -135416405 |
| 조산 위험군에서 저메틸화(Hypomethylation in preterm birth) | ||||
| INS-IGF2 | INS-IGF2 readthrough | NR_003512 | 11 | chr11: 2161281 -2161681 |
표 2는 DNA 메틸레이션 마이크로어레이를 통하여 β 값을 계산한 결과를 나타낸다. DNA 메틸레이션 정도는 0~1 값을 갖는 β 값으로 표시되며 β값 0은 해당 CpG 부위가 완전히 비메틸화 된 것을 의미하며, 1은 완전히 메틸화된 것을 의미한다. mir-886은 조산 산모군에서 과메틸화 되어 있고, INS-IGF2는 조산 산모군에서 저메틸화 되어 있음을 확인할 수 있다.
| probe ID | Gene | β 값 | |
| 정상 산모군 |
조산 산모군 | ||
| cg04481923 | mir-886 | 0.1217 | 0.3892* |
| cg04072545 | INS-IGF2 | 0.1421 | 0.0657* |
*p<0.05
표 3은 조산 산모군 및 정상 산모군에서 유의한 메틸화 변화를 나타낸 mir-886 및 INS-IGF2 유전자에 대하여, 조산 산모 41명 및 정상 산모 40명에서 추가로 혈액을 채취하여 파이로시퀀싱을 이용하여 메틸화 수준 차이를 검증한 결과를 나타낸다. 그 결과는 정량적 분석 후 평균으로 나타내었으며, 이에 따른 그래프는 도 1 및 도 2에 나타내었다.
| (단위: %) | 조산 산모군 (n=41) |
정상 산모군 (n=40) |
P value |
| mir-886 | 35.55 ± 3.17 | 27.43 ± 3.53 | 0.034* |
| INS-IGF2 | 3.23 ± 0.42 | 4.51 ± 0.38 | 0.013* |
*p<0.05
<110> Ewha University - Industry Collaboration Foundation
<120> Composition for predicting a risk of preterm delivery using CpG
methylation status of gene and uses thereof
<130> DPP20152964KR
<160> 8
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 400
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)..(400)
<223> chr5 : 135416005-135416405
<400> 1
tacctggcag tacaggctgg tcacgcacgc cctgtaagac cagtggccag cctccatact 60
ttctgtcaca ccttcaaagt gacaccaact tatgttatca gcctattaat ttagcaaagt 120
taaaagggat aaaaaataac aaagccttca gagtgacaga ttataccgaa tttattgcat 180
aaaagggtca gtaagcaccc gcgggtctcg aaccccagca cagagatgga cagatagaaa 240
gtccggcatg aggaggtaac cgcttgagct aactccgacc cgggtaggag tgtgcgactg 300
aaacttctaa accatagaag agtgacgatg tggagaggga cgggctgcat gtgctccccg 360
cccccgagag gcctgcgtca tgcggtctcg cccgctctgc 400
<210> 2
<211> 400
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<220>
<221> gene
<222> (1)..(400)
<223> chr11: 2161281-2161681
<400> 2
atctgggcca ggcttggagc ctacggaggc tccggccgcc agaggagaga ggatcagggc 60
gggaaacaca gctcaaatcc tacctgcatg gccgagctca ccggggtgcg tctaagtagc 120
tcgcctttgc ggcccaccca aaatatctgg ataatggtta ccccgtcctc agtgcgttgg 180
acttgcatag acgcgagttc ggtctcgggg gccaccacga taatttgggg gtctggggaa 240
accatctcct ggagagtttg aacgatgtaa gaaagcactg tgatttttac caagtcaaaa 300
accacgcaca aaatcccgca ccccgccagc cccccgccgc ctaagcctag ccaaggggaa 360
ggggccgccg gcggaatctc gcgcccccct ggcccccctc 400
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR886 Forward primer
<400> 3
gtaaagttaa aagggataaa aaa 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR886 Reverse primer
<400> 4
atagagatgg atagatagaa agtt 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INS-IGF2 Forward primer
<400> 5
tttgggttag gtttggagtt 20
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INS-IGF2 Reverse primer
<400> 6
gtttggggaa attatttttt gg 22
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> miR886 primer
<400> 7
ataaaagggt tagtaagtat 20
<210> 8
<211> 16
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> INS-IGF2 primer
<400> 8
gttggatttg tataga 16
Claims (13)
- mir-886(microRNA-886) 및 INS-IGF2(INS-IGF2 readthrough)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 산모의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제를 포함하는,
조산 위험성 진단용 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 제제는,
비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소;
상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화된 서열에 특이적인 프라이머; 및
비메틸화된 서열에 특이적인 프라이머를 포함하는 것인 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI 또는 NotI인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 mir-886 유전자의 CpG 부위는 서열번호 1(5번 염색체의 135416005 내지 135416405 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 조성물.
- 제1항에 있어서, 상기 INS-IGF2 유전자의 CpG 부위는 서열번호 2(11 번 염색체의 2161281 내지 2161681 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는,
조산 위험성 진단용 키트.
- 산모의 시료로부터 mir-886 및 INS-IGF2 로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준을 측정하는 단계; 및
상기 메틸화 수준을 정상 분만 산모의 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준과 비교하는 단계를 포함하는,
조산 위험성 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 유전자의 CpG 부위의 메틸화 수준의 측정 단계는,
수득된 시료 내 게놈 DNA를 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물 또는 메틸화 민감성 제한효소로 처리하는 단계; 및
상기 처리된 DNA를 유전자 CpG 부위의 메틸화 부위를 증폭할 수 있는 프라이머를 이용하여 메틸화 특이적 중합효소반응(methylation-specific polymerase chain reaction), 실시간 메틸화 특이적 중합효소반응(real time methylation-specific polymerase chain reaction), 메틸화 DNA 특이적 결합 단백질을 이용한 PCR, 정량 PCR, 파이로시퀀싱 및 바이설파이트 시퀀싱으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 선택하여 메틸화 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 비메틸화 사이토신 염기를 변형시키는 화합물은 바이설파이트(bisulfite) 또는 이의 염인 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 메틸화 민감성 제한효소는 SmaI, SacII, EagI, HpaII, MspI, BssHII, BstUI 또는 NotI인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 mir-886 유전자의 CpG 부위는 서열번호 1(5번 염색체의 135416005 내지 135416405 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 INS-IGF2 유전자의 CpG 부위는 서열번호 2(11 번 염색체의 2161281 내지 2161681 번째)의 염기서열 중에 나타나는 CpG 를 포함하는 것인 방법.
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