KR102261908B1 - 이중 가교 가능한 2액형 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이중 가교 가능한 2액형 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen), 점성 증강제 및 윤활제를 포함하는 제1액과; 트롬빈을 포함하는 제2액을 포함하는 2액형 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것이다.

Description

이중 가교 가능한 2액형 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법{Dual-crosslinkable two component type composition of bio-ink and Method for Producing Tissue-Like Structure Using the Same}
본 발명은 이중 가교 가능한 2액형 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재1액에 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하면서, 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐을 모두 포함하되, 제2액에 트롬빈을 포함하는 이중 가교 가능한 2액형 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조방법에 관한 것이다.
3차원적인 세포 배양기술은 실험실 내(in vitro)에서 생체조직과 유사한 환경에서 세포 및 조직을 제조할 수 있는 기술로 발달하여 세포의 성장과 분화, 조직 및 기관의 형성과 관련된 여러 연구 분야에 적용되고 있다. 이러한 조직 유사기관은 실제 조직이나 장기를 대신하여 약물의 독성 및 약물 동력학 연구에서 유용하게 사용될 수 있으며, 이에 따라 인간 검체 및 기타 포유동물에의 직접적인 실험 적용을 줄일 수 있을 것으로 사료된다. 또한, 손상된 조직 및 장기를 대체 또는 치료하기 위한 목적인 조직공학(tissue engineering) 기법의 중요한 요소로 조직 및 장기의 공학적 설계에 기여하고 있다.
3차원 바이오 프린팅 기술은 이러한 조직 유사기관 및 이식 가능한 구조체를 정밀하게 제조하기 위한 유용한 장치가 되었다. 이러한 기술은 실제 인간의 조직을 거의 그대로 모방한 미세 및 거대 조직 구조체를 생성하는 것을 가능하게 하고 있다. 하지만 바이오 프린팅시 살아있는 세포를 운반하는 생체재료, 즉, 바이오 잉크(bio-ink)는 그 활용도에 있어서 많은 한계점을 나타내고 있다. 바이오 프린팅에 적용되기 위해 요구되는 바이오 잉크의 특성으로는 우수한 생체적합성이 요구되고, 미세구경의 디스펜싱 노즐(dispensing nozzle)을 원활히 통과하여 원하는 패턴으로 프린팅이 될 수 있는 우수한 프린팅성을 가져야 하며, 프린팅 후 세포-특이적 신호를 제공하면서 기계적인 지지체 역할을 유지할 수 있는 구조 안정성을 가져야 한다는 것 등이다. 비록, 3차원 바이오 프린팅 분야에서 천연 유래 또는 합성 하이드로겔 바이오 잉크가 개발되어 현재 사용되고 있지만, 이러한 기존 하이드로겔을 바탕으로 한 바이오 잉크는 생체적합성, 프린팅 적합성, 기하학적 정밀성, 정밀도와 같은 물리적 및 생물학적 측면에서 상당한 한계점을 보이고 있다.
본 발명의 발명자들은 선행연구를 통해 특정한 함량의 세포 운반물질, 점성 증강제, 윤활제 및 구조물질을 포함하는 바이오 잉크 조성물을 공개한바 있다(한국공개특허 제10-2017-0012099호). 이를 통해, 전술한 종래기술의 문제점 중 일부가 해결되는 성과를 얻을 수 있었지만 손상된 조직 및 장기를 대체 또는 치료하기 위한 목적인 조직공학에는 적합하지 않은 구조 안정성, 정교한 생체조직을 모사하기 위한 프린팅 정밀성 등에서 여전히 한계점이 있다는 것을 발견하고 이를 해결하기 위하여 예의 연구를 거듭하였다.
이에, 종래 바이오 잉크 조성물에서 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하면서, 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin)과 피브리노겐 및 트롬빈을 모두 포함하는 경우 놀라울 정도로 향상된 구조 안정성 및 세포 증식성을 가질 뿐만 아니라, 우수한 인쇄 적성을 가질 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen), 점성 증강제 및 윤활제를 포함하는 제1액과; 트롬빈을 포함하는 제2액을 포함하는 2액형 바이오 잉크 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 2액형 바이오 잉크 조성물을 이용한 조직 유사 구조체 제조방법 및 상기 방법으로 제조한 조직 유사 구조체를 제공하는 데 있다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen), 점성 증강제 및 윤활제를 포함하는 제1액과; 트롬빈을 포함하는 제2액을 포함하는 2액형 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 제1액에 포함된 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴 및 피브리노겐은 각각 25 ~ 35 mg/ml 및 16 ~ 24 mg/ml일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 제1액에 포함된 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 0.1 ~ 10 w/v%일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 점성 증강제는 히알루론산 또는 덱스트란이고, 상기 윤활제는 글리세롤일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 제1액은 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 바람직한 또 다른 일실시예에 있어서, 상기 제1액은 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포를 추가로 포함할 수 있다.
상기 트롬빈은 10 ~ 100 IU/mL 이고, 상기 제2액에 포함된 트롬빈의 농도는 0.1 ~ 1 mL/mL일 수 있다.
상기 제1액 및 상기 제2액의 부피비는 1: 0.5 내지 1: 10일 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen), 점성 증강제 및 윤활제를 포함하는 제1액을 대상으로 3차원 프린팅하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 프린팅된 제1액을 광 가교시킨 후, 트롬빈을 포함하는 제2액을 첨가하여 자연 가교시킴으로써, 이중 가교 결합시키는 단계를 포함하는 조직 유사 구조체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 있어서, 상기 (a) 단계에서 3차원 프린팅은 100 ~ 500 ㎛ 직경의 노즐을 구비한 3차원 바이오 프린터를 이용하여, 10 ~ 100 kPa의 압력 하에, 100 ~ 500%의 압출량으로 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 광 가교는 300 ~ 800 nm의 파장의 광을 1 ~ 20 cm의 거리에서 1 ~ 1000 초 동안 노출시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 있어서, 상기 (b) 단계에서 자연 가교는 4 ~ 30℃의 온도에서 10 분 ~ 1 시간 동안 방치함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 방법에 따라 제조된 조직 유사 구조체를 제공한다.
본 발명에 따른 2액형 바이오 잉크 조성물은 제1액에 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하면서, 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는바, 우수한 구조 안정성 및 세포 증식성을 가질 뿐만 아니라, 우수한 인쇄 적성을 가지기 때문에, 3차원 바이오 프린터를 이용한 조직 유사 구조체의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 제2액에 트롬빈을 포함하는 경우, 광 가교에 자연 가교를 함께 진행하여 이중 가교 결합시킬 수 있기 때문에, 조직 유사 구조체의 물성을 더욱 향상시킬 수 있다.
도 1은 실시예 1에서 사용되는 3차원 바이오 프린터와, 이를 이용한 3차원 프린팅 및 트롬빈 처리에 따른 구조체의 형태 변화를 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1에서 제조한 2액형 바이오 잉크 조성물(CFB 1%, CFB 2%, CFB 3%, CFB 4% 및 CFB 5%)을 이용한 경우, 그 구조체의 인쇄 적성을 비교한 사진이다.
도 3은 실시예 1에서 제조한 2액형 바이오 잉크 조성물(CFB 1%, CFB 2%, CFB 3%, CFB 4% 및 CFB 5%)을 이용한 경우, 그 구조체의 구조 안정성을 비교한 사진이다.
도 4는 실시예 1에서 제조한 2액형 바이오 잉크 조성물(CFB 1%, CFB 2%, CFB 3%, CFB 4% 및 CFB 5%)을 이용한 경우, 그 구조체의 세포 증식성을 비교한 사진이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
2액형 바이오 잉크 조성물
본 발명은 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen), 점성 증강제 및 윤활제를 포함하는 제1액과; 트롬빈을 포함하는 제2액을 포함하는 2액형 바이오 잉크 조성물을 제공한다.
본 명세서 내 “액형 바이오 잉크 조성물”이라 함은 제1액 및 제2액이 별도로 존재하는 상태의 바이오 잉크 조성물을 의미하는 것으로, 상기 제1액은 3차원 프린팅 및 광 가교의 대상이 되는 것이고, 상기 제2액은 3차원 프린팅 후에 첨가되어 자연 가교시키기 위한 것이다.
먼저, 본 발명에 따른 제1액은 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen), 점성 증강제 및 윤활제를 포함한다.
상기 구조물질은 빠른 가교결합의 형성 및 기계적 강성을 유지할 수 있는 물질로부터 선택되는 것이 바람직하며, 그중에서, 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐을 모두 포함하는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 메타크릴화된 젤라틴은 광 가교가 가능한 특징이 있다. 특히, 상기 피브리노겐은 구조 안정성 측면에서 구조물질로서 적합할 뿐만 아니라, 세포가 프린팅된 이후에 세포의 부착 및 분화에 적합한 미세환경을 조성한다는 점에서 바람직한 구조물질로 선택될 수 있는데, 특히, 상기 피브리노겐은 트롬빈과 자연 가교가 가능한 특징이 있으므로, 최종 제조되는 구조체의 기계적 물성을 더욱 향상시킬 수 있다.
상기 제1액에 포함된 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴 및 피브리노겐은 각각 25 ~ 35 mg/mL 및 16 ~ 24 mg/mL일 수 있고, 가장 바람직하게는 28 ~ 32 mg/mL 및 18 ~ 22 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포 운반물질은 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen)을 포함하는 것을 특징으로 한다.
이때, 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 식용으로 사용되는 저분자 콜라겐의 구조 안전성을 높이기 위해 메타크릴레이트(methacrylate) 반응을 진행한 것으로, 고비용의 고분자 콜라겐을 대체하여 세포의 점착이나 성장, 이동, 분화 등의 세포의 기능적인 면에 도움을 줌으로써 조직 재생 이외에도 많은 분야에 응용이 가능하다. 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐이란 화학적 변형을 통하여 가교할 수 있도록 변형된 형태의 저분자 콜라겐을 의미하는 것으로서, 바람직하게는 500 ~ 4000 Da의 분자량을 가진다.
상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 세포 운반물질로서의 역할과 함께 구조물질로서의 역할도 할 수 있다. 즉, 상기 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 바이오 프린팅된 구조체 내에서 세포가 생존하기에 적합한 환경을 제공할 수 있는 물질로서, 생체적합성을 나타내어야 함은 물론이며 바이오 프린팅된 이후에 구조체에 안정성을 부여할 수 있는 적절한 물리적 강성 또한 나타내어야 한다. 따라서, 상기 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 사용할 경우, 상기 세포 운반물질로 젤라틴만을 사용한 종래 바이오 잉크 조성물에 비해 프린팅 후 구조 안정성이 현저히 우수하고, 보다 정밀한 프린팅성을 나타낼 수 있다.
또한, 상기 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐에, 젤라틴, 콜라겐, 알기네이트, 아가(agar), 아가로스, 플루로닉(pluronic) 및 폴리비닐알콜로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 물질을 혼합하여 사용할 수 있다.
상기 제1액에 포함된 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐은 0.1 ~ 10 w/v%일 수 있고, 바람직하게는 1 ~ 10 w/v%일 수 있고, 보다 바람직하게는 3 ~ 10 w/v%일 수 있으며, 가장 바람직하게는 4 ~ 5 w/v%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 점성 증강제는 우수한 프린팅 경향성 및 바이오 잉크의 초기 강성(strength)을 유지하는데 적합한 것을 선택할 수 있으며, 이의 비제한적인 예시로는 히알루론산 또는 덱스트란일 수 있다.
상기 제1액에 포함된 점성 증강제는 2 ~10 mg/mL 일 수 있고, 가장 바람직하게는 2 ~10 mg/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 윤활제는 전단율(shear rate)을 최소화할 수 있고, 분배 속도(dispensing speed)를 개선할 수 있는 물질 중에서 선택되는 것이 바람직하며, 이의 비제한적인 예시로는 글리세롤을 들 수 있다.
상기 제1액에 포함된 윤활제는 0.01 ~ 1 mL/mL일 수 있고, 바람직하게는 0.05 ~ 0.5 mL/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제1액은 점성증강제 및 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴 및 피브리노겐을 혼합하여 교반하는 단계; 상기 교반 용액에 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 첨가하여 교반하는 단계; 및 상기 교반 용액에 윤활제를 첨가하여 교반하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.
따라서, 상기 제1액은 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 포함하면서, 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐을 모두 포함하는 것을 특징으로 하는바, 우수한 구조 안정성 및 세포 증식성을 가질 뿐만 아니라, 우수한 인쇄 적성을 가지기 때문에, 3차원 바이오 프린터를 이용한 조직 유사 구조체의 제조에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 상기 제1액은 구성성분의 광 가교를 촉진하기 위한 가교제 또는 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함할 수 있다.
상기 가교제는 통상적인 하이드로겔 조성물에 사용되는 다가 금속이온을 포함하는 화합물일 수 있다. 다가 금속이온 화합물은 알루미늄 화합물, 칼슘 화합물 및 마그네슘 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이 바람직하다. 예를 들어, 수산화알루미늄, 함수규산알루미늄, 염화칼슘, 염화마그네슘, 염화알루미늄, 메타규산알루미늄산마그네슘, 아세트산알루미늄 및 규산알루미늄산마그네슘으로 구성되는 그룹으로부터 하나 이상 선택되는 것일 수 있다.
상기 광학개시제는 빛에 노출됨에 따라 신속한 가교결합을 유발하는 물질을 의미한다. 본 발명에서 상기 광학개시제의 종류는 특별히 제한되는 것은 아니나, 자외선(UV)의 조사에 의해 가교반응이 일어나는 광학개시제 또는 가시광선의 조사에 의해 가교반응이 일어나는 광학개시제가 사용이 될 수 있다. 적절한 광학개시제의 비제한적인 예시로는, 아세토페논, 벤조인 메틸 에티르, 디에톡시아세토페논, 벤조일 포스핀 옥사이드 및 1-히드록시사이클로헥실 페닐 케톤, 에오신 등을 들 수 있다. 첨가되는 광학개시제의 양은 노출되는 빛의 파장 및 시간에 따라 달라질 수 있다.
또한, 상기 제1액은 세포 0.05 ~ 60×106/mL을 포함할 수 있다.
상기 세포는 바람직하게는, 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포 및 바이오 프린팅된 조직 유사 구조체 내에 포함된 세포는 당업계에 공지된 임의의 방식으로 배양될 수 있다. 세포 및 조직 배양 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어 문헌[Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures;Freshney (1987), Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다. 일반적인 포유동물 세포 배양 기술, 세포주, 및 본 발명과 함께 사용될 수 있는 세포 배양 시스템이 또한 문헌[Doyle, A., Griffiths, J. B., Newell, D. G., (eds.) Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures, Wiley (1998)]에 기술되어 있고, 상기 정보에 대한 이의 내용은 본원에 참고 인용된다.
세포는 또한 원하는 세포주를 따라 세포의 분화를 유도하는 세포 분화 물질과 배양될 수도 있다. 예를 들면, 줄기세포는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 됨으로써 일정 범위의 세포 유형을 생성한다. 다수 유형의 분화 배지가 적당하다. 상기 줄기세포는 비제한적 예로서 골원성(osteogenic) 분화 배지, 연골원성(chondrogenic) 분화 배지, 지방생성(adipogenic) 분화 배지, 신경 분화 배지, 심근세포 분화 배지, 및 장세포 분화 배지(예, 장표피)를 포함하는 분화 배지와 접촉하여 인큐베이션 될 수 있다.
상기 세포는 3차원적 바이오프린터로부터 제1액을 침착 또는 압출시킴으로써 바이오 프린팅될 수 있다. 상기 제1액은 복수의 세포를 포함하는 액체, 반고체, 또는 고체 조성물의 형태일 수 있다. 상기 제1액은 액체 또는 반고체 세포 용액, 세포 현탁액, 또는 세포 농축물을 포함한다. 상기 제1액은 1) 복수의 세포 또는 세포 응집체와 생체적합성 액체 또는 겔을 소정의 비율에서 혼합하여 제1액을 제조하는 단계, 및 2) 제1액을 치밀화하여 원하는 세포 밀도 및 점도를 갖는 제1액을 제조하는 단계 등에 의해 제조될 수 있다. 구체적으로, 상기 제1액의 치밀화는 원심분리, 접선류 여과("TFF"), 또는 이의 조합에 의해 실현되며 제1액의 치밀화는 압출가능한 조성물을 제조하여 다세포 응집체 또는 다세포체를 형성한다. 상기 "압출가능한"이란 노즐(nozzle) 또는 오리피스(예, 하나 이상의 구멍 또는 튜브)를 (예를 들어, 압력 하에서) 통과시킴으로써 성형될 수 있는 것을 의미한다. 또한, 상기 제1액의 치밀화는 적당한 밀도로 세포를 성장시키는 것으로부터 유도된다. 상기 제1액에 필요한 세포 밀도는 사용할 세포 및 제조할 조직 또는 장기에 따라 달라진다.
다음으로, 본 발명에 따른 제2액은 트롬빈을 포함한다. 상기 트롬빈은 상기 피브리노겐과 자연 가교가 가능한 특징이 있으므로, 최종 제조되는 구조체의 기계적 물성을 더욱 향상시킬 수 있다.
상기 트롬빈은 10 ~ 100 IU/mL (가장 바람직하게는 20 IU/mL 내지 100 IU/mL)이고, 상기 제2액에 포함된 트롬빈의 농도는 0.1 ~ 1 mL/mL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
한편, 상기 제1액 및 상기 제2액의 부피비는 1: 0.5 내지 1: 10일 수 있는데, 상기 제2액은 광 가교물을 충분히 침지시킬 정도의 부피인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
조직 유사 구조체 및 이의 제조방법
본 발명은 (a) 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen), 점성 증강제 및 윤활제를 포함하는 제1액을 대상으로 3차원 프린팅하는 단계; 및 (b) 상기 3차원 프린팅된 제1액을 광 가교시킨 후, 트롬빈을 포함하는 제2액을 첨가하여 자연 가교시킴으로써, 이중 가교 결합시키는 단계를 포함하는 조직 유사 구조체의 제조방법을 제공한다.
한편, 상기 방법은 (c) 상기 조직 유사 구조체를 배양액에서 배양하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 조직 유사 구조체의 배양을 통해 조직 유사 기관(organoid)을 제조할 수 있다.
또한, 필요에 따라 상기 조직 유사 구조체는 세포를 포함한 제1액을 3차원 프린팅하여 제조할 수 있으며, 세포를 포함하지 않은 제1액을 3차원 프린팅하여 구조체를 제조한 후, 구조체에 세포를 추가하여 배양할 수 있다.
먼저, 본 발명에 따른 조직 유사 구조체의 제조방법은 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen), 점성 증강제 및 윤활제를 포함하는 제1액을 3차원 프린터에 충전하는 단계[(a) 단계]를 포함한다.
상기 제1액에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.
상기 3차원 프린팅은 연속 및/또는 실질적으로 연속으로 수행될 수 있다. 연속 3차원 프린팅의 예시는 제1액의 저장소에 연결되는 분사 팁(dispense tip)(예, 주사기, 모세관 등)을 통해 바이오 프린터로부터 제1액을 분사하는 것이다. 연속 3차원 프린팅은 기능 단위의 반복 패턴에서 제1액을 분사하는 것이다. 상기 반복 기능 단위는 예를 들어 원형, 정사각형, 직사각형, 삼각형, 다각형, 및 불규칙 기하구조를 포함하는 임의의 적당한 기하구조를 갖는다. 또한, 3차원 프린팅된 기능 단위의 반복 패턴은 층을 포함하고 복수의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 3차원 프린팅 될 수 있다(예를 들면, 적층된다). 구체적으로, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 이상의 층이 조작된 조직 또는 장기를 형성하기 위해 인접하게 3차원 프린팅될 수 있다.
3차원 프린팅된 기능 단위는 격자무늬(tessellated) 패턴으로 반복될 수 있다. "격자무늬 패턴"은 중첩되지 않고 갭이 없는 평면을 충전하는 평면 도형이다. 연속 및/또는 격자무늬 바이오프린팅의 이점은 3차원 프린팅된 조직의 증가된 생산성을 포함할 수 있다. 또 다른 비제한적 잠재적 이점은 이전에 침착된 제1액의 요소와 바이오 프린터를 정렬할 필요를 없앨 수 있다는 것이다. 연속 바이오프린팅은 또한 경우에 따라 시린지 메커니즘을 사용하여 제1액의 대형저장소로부터 보다 큰 조직을 인쇄하는 것을 용이하게 할 수 있다.
3차원 바이오 프린터로부터 적당한 및/또는 최적의 분사 거리는 재료 편평화 또는 분사 바늘에의 부착화를 생성하지 않는다. 3차원 바이오 프린터 분사 팁은 약 5, 10, 20, 50, 100 ㎛ 이상 및 이 범위 내의 증분의 내경을 갖는다. 또한, 3차원 바이오 프린터의 제1액 저장소는 약 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100 입방 센티미터 이상 및 이 범위 내의 증분의 용적을 갖는다. 펌프 속도는 시스템에서의 잔류 압력 상승이 낮을 경우 적당하고/하거나 최적일 수 있다. 양호한 펌프 속도는 저장소의 단면적과 분사 바늘 사이의 비율에 의존할 수 있고, 보다 높은 비율은 보다 낮은 펌프 속도를 필요로 한다.
상기 3차원 프린팅은 100 ㎛ 내지 500 ㎛ 직경의 노즐을 구비한 3차원 바이오 프린터를 이용하여, 10 kPa 내지 100 kPa의 압력하에, 100% 내지 500%의 압출량으로 수행되는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
다음으로, 본 발명에 따른 조직 유사 구조체의 제조방법은 상기 3차원 프린팅된 제1액을 광 가교시킨 후, 트롬빈을 포함하는 제2액을 첨가하여 자연 가교시킴으로써, 이중 가교 결합시키는 단계[(b) 단계]를 포함한다.
상기 광 가교는 상기 제1액이 3차원 프린터에 의해 분사되어 적층된 이후 수행되는데, 이를 통해 단단한 구조체로 완성될 수 있도록 해준다.
상기 광(자외선 또는 가시광선)은 상기 3차원 프린팅된 제1액 표면에 직접적으로 노출시킬 수 있으며, 예를 들어 광(자외선 또는 가시광선) 발생기로부터 발생된 300 nm 내지 800 nm 의 파장을 이용하여 상기 3차원 프린팅된 제1액으로부터 1~20 cm 거리에서 1초 내지는 1000초간 노출이 될 수 있고, 또는 20초 내지 500초, 또는 40초 내지 240초간 노출될 수 있다. 이러한 광(자외선 및 가시광선) 노출 거리 및 시간은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 기술자라면, 짧은 거리 및 강한 파장이라면 짧은 시간 동안의 노출로도 충분한 가교결합을 형성할 수 있다는 것을 인지할 수 있을 것이다.
상기 광 가교를 위한 바람직한 광(자외선 또는 가시광선)의 파장은 300 nm ~ 800 nm일 수 있으며, 바람직하게는 자외선의 경우 350 nm ~ 380 nm, 가시광선의 경우 400nm ~ 600nm, 보다 바람직하게는 자외선의 경우 355 nm ~ 375 nm, 가시광선의 경우 400 nm ~ 500 nm, 가장 바람직하게는 자외선의 경우 360 nm ~ 370 nm, 가시광선의 경우 400nm ~ 480nm일 수 있다.
상기 제2액에 대해서는 전술한바 있으므로, 중복 설명을 생략하기로 한다.
상기 자연 가교는 상기 트롬빈은 상기 피브리노겐 간의 반응에 따른 것으로, 4 ~ 30℃의 온도에서 10 분 ~ 1 시간 동안 방치함으로써 수행될 수 있다. 이로써, 최종적으로 이중 가교 결합시킬 수 있기 때문에, 조직 유사 구조체의 물성을 더욱 향상시킬 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다.
이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 2액형 바이오 잉크 조성물 및 이를 이용한 조직 유사 구조체의 제조
메타크릴화된 저분자 콜라겐은 약 3500Da 분자량을 가지는 저분자콜라겐(Gelita, D-69412 )에 메타크릴산무수물(methacrylic anhydride)을 반응시켜 공지된 방법에 따라 제조하였다(R. Ravichandran et al., Journal of Materials Chemistry B, 4(2):318-326, 2016).
2액형 바이오 잉크 조성물은 상온에서 제조하였으며, 먼저 0.7 mL/mL DMEM(biowest)에 점성 증강제로서 4 mg/mL 히알루론산(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 1시간 동안 혼합하였다. 그 다음, 구조물질로서 30 mg/mL 메타크릴화된 젤라틴(GelMA, 자체제작) 및 20 mg/ml 피브리노겐(녹십자, 030A18005)을 첨가하고 1시간 동안 교반시킨 후, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 각각 1 w/v%, 2 w/v%, 3 w/v%, 4 w/v% 및 5 w/v%로 첨가하고 1시간 동안 교반시켰다. 그 후, 0.1 mL/mL 글리세롤(Sigma-Aldrich)을 첨가하고 30분 동안 교반하여 바이오잉크 조성물 CFB 1%, CFB 2%, CFB 3%, CFB 4% 및 CFB 5%)을 제조하였다. 한편, 0.2 w/v% 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone 광학개시제를 가하여 제1액을 제조하였고, 0.7 mL/mL DMEM(biowest)에 0.6 mL/mL 트롬빈 20 IU/mL를 첨가하고 30분 동안 교반하여 제2액을 제조하였다(표 1 참고).
제1액
10 mL 기준		 제2액
10 mL 기준
구조물질 세포 운반물질 점성증강제 윤활제 트롬빈
20UI/mL
(mL)
Gel-MA
(mg)		 피브리노겐
(mg)		 저분자
Col-MA
(mg)		 HA
(mg)		 글리
세롤
(ml)
실시예 1 (CFB 1%) 300 200 100 40 1 6
실시예 1 (CFB 2%) 200
실시예 1 (CFB 3%) 300
실시예 1 (CFB 4%) 400
실시예 1 (CFB 5%) 500
도 1에 도시된 3차원 바이오 프린터(노즐 직경 = 300 ㎛)를 이용하여, 제조된 제1액을 격자무늬 패턴의 구조체로 3차원 프린팅하였다. 이때, 3차원 바이오 프린터는 3축으로 움직이며, 제1액을 충전하기 위한 주사형 저장소와 압출 형태로 사출하기 위한 디스펜싱 모듈 및 노즐로 구성되어 있다. 또한, 3차원 바이오 프린팅은 50-80 kPa의 압력 하에, 250%의 압출량으로 수행되었다.
이후, 3차원 프린팅된 제1액에 365nm 파장에서 UV 조사하여 2분 동안 광 가교시킨 후, 제조된 제2액을 광 가교물이 잠길 정도로 첨가하고 25℃의 온도에서 30분 이상 자연 가교시킴으로써, 이중 가교된 구조체를 제조하였다. 이를 37℃인큐베이터(DAIHAN Scientific ThermoStable IG-50) 내에서 media(Aprotinin solution 20ug/mL) 5 mL에 담근 후 21일 동안 인큐베이팅하여 관찰하였다(도 1 참고).
비교예 1
실시예 1에서 제1액의 제조와 동일한 방법으로 수행하되, 점성 증강제로서 3 mg/mL 히알루론산(Sigma-Aldrich)을 사용하고, 구조물질로서 20 mg/mL 메타크릴화된 젤라틴(GelMA, 자체제작)만 사용하고, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐 대신 30 mg/mL 젤라틴(시그마, P1002776296)을 사용하여 1액형 바이오 잉크 조성물(Gel4cell)을 제조하였다. 한편, 제2액의 사용 및 자연 가교를 생략하였다(표 2 참고).
제1액
10 mL 기준
구조물질 세포 운반물질 점성증강제 윤활제
Gel-MA
(mg)		 젤라틴
(mg)		 HA
(mg)		 글리세롤
(ml)
비교예 1 200 300 30 1
비교예 2
실시예 1에서 제1액의 제조와 동일한 방법으로 수행하되, 구조물질로서 구조물질로서 50 mg/mL 메타크릴화된 젤라틴(GelMA, 자체제작)만 사용하고, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐을 각각 1 w/v% 및 3 w/v% 사용하여 1액형 바이오 잉크 조성물(CB 1% 및 CB 3%)을 제조하였다. 한편, 제2액의 사용 및 자연 가교를 생략하였다(표 3 참고).
제1액
10 mL 기준
구조물질 세포 운반물질 점성증강제 윤활제
Gel-MA
(mg)		 저분자
Col-MA
(mg)		 HA
(mg)		 글리세롤
(ml)
비교예 1 (CFB 1%) 500 100 40 1
비교예 3 (CFB 3%) 300
실험예 1: 구조체의 인쇄 적성 평가
실시예 1에서 제조한 2액형 바이오 잉크 조성물(CFB 1%, CFB 2%, CFB 3%, CFB 4% 및 CFB 5%)을 이용한 경우, 그 구조체의 인쇄 적성을 평가하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 2액형 바이오 잉크 조성물(CFB 1%, CFB 2%, CFB 3%, CFB 4% 및 CFB 5%)을 이용한 경우, 메타크릴화된 저분자 콜라겐의 농도가 증가함에 따라, 우수한 인쇄 적성을 가지는 것으로 확인되고, 특히, CFB 3 ~ 5%인 경우, 그 구조체의 인쇄 적성이 우수한 것으로 확인된다.
한편, 비교예 1에서 제조한 1액형 바이오 잉크 조성물(Gel4cell) 및 비교예 2에서 제조한 1액형 바이오 잉크 조성물(CB 1% 및 CB 3%)을 이용한 경우, 그 구조체는 인쇄 적성이 크게 저하되는 것으로 확인된다. 구체적으로, 비교예 1에서 제조한 1액형 바이오 잉크 조성물(Gel4cell)의 경우, 인쇄가 제대로 이루어지지 아니하여 구조체의 골격 조차 제대로 형성하지 못하는 것으로 확인되고, 비교예 2에서 제조한 1액형 바이오 잉크 조성물(CB 1% 및 CB 3%)을 이용한 경우, 인쇄시 그 조성물이 옆으로 퍼져서 구조체에서 패턴의 홀을 제대로 형성하지 못하는 것으로 확인된다.
실험예 2: 구조체의 구조 안정성 평가
실시예 1에서 제조한 2액형 바이오 잉크 조성물(CFB 1%, CFB 2%, CFB 3%, CFB 4% 및 CFB 5%)을 이용한 경우, 그 구조체의 구조 안정성을 평가하였다. 구체적으로, 37℃ 인큐베이터(DAIHAN Scientific ThermoStable IG-50) 내에서 media(Aprotinin solution 20ug/mL) 5 mL에 담근 후 7일 동안 인큐베이팅하여 그 부피 변화를 관찰하였다(표 4 참고).
　 0일 1일 3일 7일
비교예 1 100 99 64 44
비교예 2 (CB 1%) 100 87 76 71
실시예 1 (CFB 1%) 100 92 86 76
실시예 1 (CFB 2%) 100 91 87 77
실시예 1 (CFB 3%) 100 87 86 75
실시예 1 (CFB 4%) 100 88 87 82
실시예 1 (CFB 5%) 100 93 92 86
그 결과, 표 4 및 도 3에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 2액형 바이오 잉크 조성물(CFB 1%, CFB 2%, CFB 3%, CFB 4% 및 CFB 5%)을 이용한 경우, 메타크릴화된 저분자 콜라겐의 농도에 관계 없이, 7일 동안 구조 안정성이 우수한 것으로 확인되는데, 이는 구조물질로서 피브리노겐을 사용하여 제2액에 포함된 트롬빈과 자연 가교한 결과로 볼 수 있다. 특히, CFB 4 ~ 5%인 경우, 7일째 기준으로 그 구조체의 구조 안전성이 뛰어난 것으로 확인된다.
한편, 비교예 1에서 제조한 1액형 바이오 잉크 조성물(Gel4cell) 및 비교예 2에서 제조한 1액형 바이오 잉크 조성물(CB 1%)은 3일 이후 구조 안정성이 크게 저하되는 것으로 확인된다.
실험예 3: 구조체의 세포 증식성 평가
실시예 1에서 제조한 2액형 바이오 잉크 조성물(CFB 1%, CFB 2%, CFB 3%, CFB 4% 및 CFB 5%)을 이용한 경우, 그 구조체의 세포 증식성을 평가하였다. 구체적으로, 37℃인큐베이터(Thermo Scientific 3111) 내에서 C2C12 (mouse myoblast cell line) 1 x 106 cells/mL가 포함된 media에 담근 후 7일 동안 인큐베이팅하여 세포 증식성을 평가하였다.
그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, 실시예 1에서 제조한 2액형 바이오 잉크 조성물(CFB 1%, CFB 2%, CFB 3%, CFB 4% 및 CFB 5%)을 이용한 경우, 메타크릴화된 저분자 콜라겐의 농도에 관계 없이, 7일 동안 세포 증식성이 우수한 것으로 확인된다. 이는 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐를 사용한 결과로 볼 수 있다. 특히, CFB 4 ~ 5%인 경우, 그 구조체의 인쇄 적성이 우수하면서도 세포 증식성이 뛰어난 것으로 확인된다.
한편, 비교예 1에서 제조한 1액형 바이오 잉크 조성물(Gel4cell) 및 비교예 2에서 제조한 1액형 바이오 잉크 조성물(CB 3%)은 세포 증식성이 크게 저하되는 것으로 확인된다.

Claims (13)

  1. 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen), 점성 증강제 및 윤활제를 포함하는 제1액과;
    트롬빈을 포함하는 제2액을 포함하는
    2액형 바이오 잉크 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 제1액에 포함된 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴 및 피브리노겐의 농도는 각각 25 ~ 35 mg/mL 및 16 ~ 24 mg/mL인 것을 특징으로 하는, 2액형 바이오 잉크 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 제1액에 포함된 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐의 농도는 0.1 ~ 10 w/v%인 것을 특징으로 하는, 2액형 바이오 잉크 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 점성 증강제는 히알루론산 또는 덱스트란이고, 상기 윤활제는 글리세롤인 것을 특징으로 하는, 2액형 바이오 잉크 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 제1액은 가교제 또는 광학개시제(photoinitiator)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오 잉크 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 상기 제1액은 줄기세포, 조골세포(osteoblast), 근아세포(myoblast), 건세포(tenocyte), 신경아세포(neuroblast), 섬유아세포(fibroblast), 신경교아세포(glioblast), 배세포(germ cell), 간세포(hepatocyte), 신장세포(renal cell), 지대세포(Sertoli cell), 연골세포(chondrocyte), 상피세포(epithelial cell), 심혈관세포, 각질세포(keratinocyte), 평활근세포(smooth muscle cell), 심장근세포(cardiomyocyte), 신경교세포(glial cell), 내피세포(endothelial cell), 호르몬 분비세포, 면역세포, 췌장섬세포(pancreatic islet cell) 및 신경세포(neuron)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 세포를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, 2액형 바이오 잉크 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 트롬빈은 10 ~ 100 IU/mL 이고, 상기 제2액에 포함된 트롬빈의 농도는 0.1 ~ 1 mL/mL 인 것을 특징으로 하는, 2액형 바이오 잉크 조성물.
  8. 제1항에 있어서, 상기 제1액 및 상기 제2액의 부피비는 1: 0.5 내지 1: 10인 것을 특징으로 하는, 2액형 바이오 잉크 조성물.
  9. (a) 구조물질로서 메타크릴화된 젤라틴(methacrylated gelatin) 및 피브리노겐, 세포 운반물질로서 메타크릴화된 저분자 콜라겐(methacrylated low molecular weight collagen), 점성 증강제 및 윤활제를 포함하는 제1액을 대상으로 3차원 프린팅하는 단계; 및
    (b) 상기 3차원 프린팅된 제1액을 광 가교시킨 후, 트롬빈을 포함하는 제2액을 첨가하여 자연 가교시킴으로써, 이중 가교 결합시키는 단계를 포함하는 조직 유사 구조체의 제조방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 (a) 단계에서 3차원 프린팅은 100 ~ 500 ㎛ 직경의 노즐을 구비한 3차원 바이오 프린터를 이용하여, 10 ~ 100 kPa의 압력 하에, 100 ~ 500%의 압출량으로 수행되는 것을 특징으로 하는, 조직 유사 구조체의 제조방법.
  11. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 광 가교는 300 ~ 800 nm의 파장의 광을 1 ~ 20 cm의 거리에서 1 ~ 1000 초 동안 노출시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 조직 유사 구조체의 제조방법.
  12. 제9항에 있어서, 상기 (b) 단계에서 자연 가교는 4 ~ 30℃의 온도에서 10 분 ~ 1 시간 동안 방치함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는, 조직 유사 구조체의 제조방법.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 방법에 따라 제조된 조직 유사 구조체.
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