KR102273473B1

KR102273473B1 - 신규한 미백용 화합물 및 이를 포함하는 미백용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102273473B1
Application number: KR1020200189494A
Authority: KR
Inventors: 장대길; 배영숙; 장덕환; 이범주; 이슬해
Original assignee: 스타링포스 주식회사; 주식회사 케미랜드
Priority date: 2020-12-31
Filing date: 2020-12-31
Publication date: 2021-07-06
Anticipated expiration: 2040-12-31

Abstract

본 발명은 신규한 미백용 화합물 및 이를 포함하는 미백용 화장료 조성물에 관한 것으로, 구체적으로 우수한 멜라닌 합성 저해 효과 및 타이로시나아제(tyrosinase) 활성 저해 효과를 가지면서도 피부 자극이 없는 신규한 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 신규한 피부 미백용 조성물에 관한 것이다.

Description

신규한 미백용 화합물 및 이를 포함하는 미백용 화장료 조성물{Novel whitening compound and whitening cosmetic composition comprising the same}

피부는 외부 환경과 직접 접하면서 인체를 보호하며 생화학적, 물리적인 기능을 가지는 아주 중요한 조직이다. 이 조직은 크게 3가지 즉, 표피(epidermis), 진피(dermis) 및 피하(hypodermis)로 나누어지는데, 멜라닌은 피부의 표피층에 존재하는 색소로서, 표피의 기저층에 존재하는 멜라닌세포로부터 생성된다. 멜라닌의 합성 과정을 구체적으로 살펴보면, 멜라노사이트 내의 멜라노좀이라는 소포체에서, 먼저 티로시나제(Tyrosinase)에 의해서 타이로신이 도파(DOPA, 3,4-dihydroxyphentl-alanine)로 변환되고, 이후에 도파퀴논(DOPAquinone)으로 산화되며, 도파크롬(DOPAchrome)을 거쳐 흑갈색의 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 생성된 멜라닌은 케라티노사이트(keratinocyte)라는 표피 세포로 이동하여 개체의 피부, 모발 및 눈동자의 색을 결정할 뿐 아니라, 자외선에 의한 손상으로부터 진피 이하의 피부 기관을 보호하며, 피부 생체 내에 생겨난 유해산소 및 프리라디칼 등을 잡아주는 등 외부 유해인자로부터 피부를 보호하는 역할을 수행한다.

그러나, 멜라닌의 과잉 생산은 멜라닌 축적을 유도하는데, 멜라닌의 비정상적인 과도한 축적은 흑화현상, 노인반점, 검버섯, 기미, 주근깨 등의 색소 침착으로 이어져 외관상의 문제가 될 뿐만 아니라, 피부노화 및 피부암 등에 치명적인 원인이 된다. 따라서, 멜라닌 생성을 억제하고 비정상적인 과색소침착(hyperpigmenation)을 예방 및 개선하기 위한 미백제의 개발을 위한 연구가 활발이 진행되고 있으나, 강한 독성, 낮은 안정성 및 변색 가능성 측면에서 화장품이나 의약품에 유효농도 이상으로 사용하는 데 문제점이 지적되어, 실제 사용시에는 낮은 함량으로 인해 만족할 만한 미백 효과를 내지 못하는 실정이다. 또한, 현재까지 개발된 멜라닌 생성 저해제, 티로시나아제 저해제 등의 부작용으로 인해, 안전한 천연식물소재로부터 추출된 미백활성성분을 활용한 미백제의 개발에 대한 관심이 모아지고 있다.

상기 천연식물소재의 일 예로, 선복화(旋覆花)를 활용한 여러 연구들이 이루어지고 있다. 선복화는 약용식물의 일종인 금불초(Inula britanica Linne ssp. japonica Kitamura)의 꽃으로 생약명으로 선복화라 칭하며, 한방에서는 맛은 쓰고 매우며 성질이 따뜻하다고 알려져 있으며, 소담(消痰)으로 가래가 있어 기침이 나고 숨이 차는 증상 또는 만성 위염 치료에 효과가 있음이 알려져 있다. 지금까지 선복화 추출물의 미백 기능성에 대해 보고된 기술현황을 살펴보면, 대한민국 공개특허 2011-0069541, 대한민국 등록특허 10-1942872, 대한민국 등록특허 10-1721666 등에서 선복화로부터 추출한 락톤계 화합물에 대한 미백 효능이 알려진 바 있다.

그러나, 기존의 미백 기능성을 가지는 선복화 추출물은 물질의 화학적 안정성 및 수용해도가 낮기 때문에 화장료 조성물이나 약학 조성물에서 재결정 또는 석출 현상이 발생하여 고농도로 함유되기 어려운 문제가 존재한다. 따라서, 조성물 내에 유효농도 미만의 낮은 함량으로 포함될 수 밖에 없어, 만족할 만한 미백 효과를 내지 못하는 실정이다.

KR 10-2011-0069541 A KR 10-1942872 B1 KR 10-1721666 B1

본 발명은 신규한 미백용 화합물 및 이를 유효성분으로 포함하는 미백용 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다. 구체적으로, 본 발명은 우수한 멜라닌 생성 저해 및 타이로시나아제(tyrosinase) 활성 저해 효과를 가지면서도, 안정성 및 수용해도가 개선된 피부 미백용 화장료 또는 피부 미백용 약학 조성물로 응용이 가능한 신규한 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

[상기 화학식 1에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고;

L₁은 C2-C6알케닐렌이고;

A는 카르복실기(-COOH), 포스포닉기(-PO₃H₂), 포스피닉기(-HPO₂H) 또는 술폰산기(-SO₃H)이고;

n은 0 내지 4의 정수이다.]

일 측면에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.

[화학식 2]

[상기 화학식 2에서,

R₂는 C1-C6알킬이고;

R₁₁ 및 R₁₂는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고;

L₁은 C2-C6알케닐렌이고;

A는 카르복실기(-COOH)또는 술폰산기(-SO₃H)이다.]

일 측면에 따르면, 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다.

[화학식 3]

[상기 화학식 3에서,

R₂및 R₁₁ 내지 R₁₂는 각각 독립적으로 C1-C4알킬이다.]

일 측면에 따르면, 상기 화학식 3의 화합물은 하기 화학식 4로 표시될 수 있다.

[화학식 4]

[상기 화학식 4에서,

R₂ 및 R₁₁ 내지 R₁₂는 각각 독립적으로 C1-C3알킬이다.]

또한 본 발명은 상기의 화합물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 조성물을 제공한다.

일 측면에 따르면, 상기 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 피부 미백용 조성물은 멜라닌 합성을 억제하는 것일 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 피부 미백용 조성물은 tyrosinase 활성을 저해하는 것일 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 조성물은 화장료 조성물 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 에센스 또는 팩으로 제형화되는 것일 수 있다.

또한 본 발명은 상기의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 피부 색소 침착 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물을 제공한다.

일 측면에 따르면, 상기 피부 색소 침착 질환은 기미, 주근깨, 반점, 일광흑자, 약물성 색소침착, 염증성 색소침착, 노인성 색소침착 및 임신성 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있다.

일 측면에 따르면, 상기 약학 조성물은 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형인 것일 수 있다.

본 발명에 따른 신규한 화합물(Inularin A)은 기존의 선복화 추출물 및 이의 분획물들에 비해 현저하게 우수한 멜라닌 생성 저해 효과 및 타이로시나아제(tyrosinase) 활성 저해 효과를 가진다. 따라서, 본 발명에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 탁월한 미백 효과를 가진다.

본 발명에 따른 조성물을 인체에 도포 시, 상술한 바와 같은 효과로 인해 노인반점, 검버섯, 기미, 주근깨 등의 색소 침착 및 피부노화 촉진 현상 등에 유효한 효과를 발현할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 화합물은 화학적 안정성 및 인체에 대한 안전성이 우수할 뿐만 아니라, 수용해도가 개선되어 미백용 화장료 조성물 및 약학 조성물등의 다양한 외용제 제형으로 제조될 시, 유효농도 이상으로 포함될 수 있기 때문에 만족할 만한 미백 효과를 기대할 수 있다.

도 1은 Inularin A의 제조방법을 도식화 한 것이다.
도 2은 Inularin A의 HR-ESI-MS 스펙트럼이다.
도 3은 Inularin A의 IR 스펙트럼이다.
도 4는 Inularin A의¹H-NMR 스펙트럼이다.
도 5는 Inularin A의 ¹³C-NMR 스펙트럼이다.
도 6은 Inularin A의 ¹H-¹H COSY 스펙트럼이다.
도 7은 Inularin A의 HMBC 스펙트럼이다.
도 8은 Inularin A의 NOESY 스펙트럼이다.
도 9는 MTT assay를 통한 세포독성 확인 그래프이다.
도 10은 멜라닌 합성 저해효과 그래프이다.
도 11은 타이로시나아제(tyrosinase) 활성 저해 효과 그래프이다.
도 12는 in-vivo zebrafish 모델을 이용한 미백효능 그래프이다.
도 13은 in-vivo zebrafish 모델을 이용한 미백효능 사진이다.

이하, 실시예들을 참조하여 본 발명을 구체적으로 설명한다. 이때 사용되는 기술 용어 및 과학 용어에 있어서 다른 정의가 없다면, 이 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 통상적으로 이해하고 있는 의미를 가지며, 하기의 설명에서 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있는 공지 기능 및 구성에 대한 설명은 생략한다.

본 명세서의 용어, “포함한다”는 “구비한다”, “함유한다”, “가진다” 또는 “특징으로 한다” 등의 표현과 등가의 의미를 가지는 개방형 기재이며, 추가로 열거되어 있지 않은 요소, 재료 또는 공정을 배제하지 않는다.

본 명세서의 용어, “알킬”은 탄소 및 수소 원자만으로 구성된 1가의 직쇄 또는 분쇄 포화 탄화수소 기를 의미한다. 이러한 알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, 이소부틸, t-부틸, 펜틸, 헥실 등을 포함하지만 이에 한정되지는 않는다.

본 명세서의 용어, "알케닐렌"은 이중결합을 하나 이상 포함하는 직쇄 또는 분쇄형태의 탄화수소로부터 유도된 2가의 유기 라디칼을 의미한다.

이하, 본 발명에 대하여 구체적으로 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 신규한 화합물을 제공한다.

[화학식 1]

[상기 화학식 1에서,

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고;

L₁은 C2-C6알케닐렌이고;

A는 카르복실기(-COOH), 포스포닉기(-PO₃H₂), 포스피닉기(-HPO₃H) 또는 술폰산기(-SO₃H)이고;

n은 0 내지 4의 정수이다.]

보다 바람직하게는, 상기 화학식 1의 A는 카르복실기(-COOH) 또는 술폰산기(-SO₃H)이며, n은 0 내지 2의 정수이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2로 표시될 수 있다.

[화학식 2]

[상기 화학식 2에서,

R₂는 C1-C6알킬이고;

R₁₁ 및 R₁₂는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고;

L₁은 C2-C6알케닐렌이고;

A는 카르복실기(-COOH)또는 술폰산기(-SO₃H)이다.]

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 3으로 표시될 수 있다.

[화학식 3]

[상기 화학식 3에서,

R₂및 R₁₁ 내지 R₁₂는 각각 독립적으로 C1-C4알킬이다.]

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화학식 3의 화합물은 하기 화학식 4로 표시될 수 있다.

[화학식 4]

[상기 화학식 4에서,

R₂ 및 R₁₁ 내지 R₁₂는 각각 독립적으로 C1-C3알킬이다.]

본 발명에 따른 상기 화합물은 세포 내에서 멜라닌 합성에 중요한 역할을 하는 효소인 타이로시나아제(tyrosinase) 활성을 억제함으로써, 피부 미백 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 화합물은 상기와 같은 구조를 가짐으로써, 화합물은 화학적 안정성 및 인체에 대한 안전성이 우수할 뿐만 아니라, 수용해도가 개선되어 미백용 화장료 조성물 및 약학 조성물등의 다양한 외용제 제형으로 제조될 시, 유효농도 이상으로 포함될 수 있기 때문에 만족할 만한 미백 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 화합물은 선복화로부터 분리된 것일 수 있다. 예를 들어, 선복화로부터 수득한 추출물을 분획 및 정제하여 고순도의 피부 미백용 화합물을 제공함으로써, 뛰어난 미백 효과를 나타내면서도 피부에 자극을 주지 않을 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따른 화합물의 추출 방법은 a)선복화를 에탄올로 추출하여 에탄올 추출물을 수득하는 단계; 및 b)상기 에탄올 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 활성 분획물을 수득하는 단계; 및 c)상기 활성 분획물 을 역상 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 활성 화합물을 분리 및 정제하는 단계;를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 a)단계의 선복화는 재배한 것 또는 시판된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 a)단계의 에탄올은 100%를 이용하는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않으며, 선복화의 양에 1 내지 20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 2 내지 10배 첨가하여 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 또한, 추출온도는 30℃내지 100℃인 것이 바람직하고, 50℃ 내지 90℃인 것이 더욱 바람직하다. 또한, 추출시간은 1시간 내지 5시간이 바람직하며, 1시간 내지 3시간이 더욱 바람직하다. 또한, 추출횟수는 1 내지 5회 반복 추출하는 것이 바람직하고, 2 내지 3회 반복 추출하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 추출 방법은 열수 추출, 중탕 추출, 초음파 추출법, Soxhlet 추출법 및 환류냉각 추출법 등 당업계의 통상적인 추출방법은 모두 사용될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 b)단계의 용매로 디클로로메탄-메탄올을 사용할 수 있다. 본 발명의 활성 분획물이 얻어지는 디클로로메탄과 메탄올의 비율은 90:1 내지 3:1일 수 있으며, 보다 바람직하게는 70:1 내지 5:1일 수 있다. 본 발명은, 상기와 같은 비율의 이동상 용매를 사용함으로써, 기존 선복화 추출물 대비 현저히 우수한 미백효과 및 보다 개선된 수용해도를 가지는 신규한 화합물이 포함된 분획물을 얻을 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 c)단계의 역상 컬럼 크로마토그래피는 1회 내지 3회 반복실시 될 수 있으며, 1회 내지 2회 반복실시 되는 것이 보다 바람직하다. 또한, 상기 c)단계의 이동상으로 메탄올-물을 사용할 수 있으며, 메탄올과 물의 비율은 50:50 내지 90:10일 수 있으며, 60:40 내지 80:20인 것이 보다 바람직하다. 본 발명은 상기와 같은 용매 비율을 사용하며, c)단계를 반복실시 함으로써 기존 선복화 추출물 대비 현저히 우수한 미백효과 및 수용해도를 나타내는 신규한 활성 화합물을 얻을 수 있으며, 신규 화합물을 Inularin A로 명명하였다.

또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 상기 피부 미백용 조성물을 인체에 도포 시 노인반점, 검버섯, 기미, 주근깨 등의 색소 침착 및 피부노화 촉진 현상 등에 유효한 효과를 발현할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 물질 자체의 안정성뿐만 아니라, 인체에 대한 안전성이 우수하여 미백용 화장료 조성물 및 미백용 약학 조성물 등의 다양한 외용제 제형으로 응용이 가능하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 20중량%로 포함될 수 있으며, 보다 바람직하게는 0.1 내지 10중량%로 포함될 수 있다. 상술된 범위로 유효성분을 포함하는 경우, 제형의 안정성을 해치지 않으면서도 본 발명에서 목적하는 효과, 즉 용도에 현저함을 보여 보다 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 피부 미백용 조성물은 멜라닌 합성을 억제하는 것일 수 있다. 멜라닌의 과잉 생산은 멜라닌 축적을 유도하는데, 멜라닌의 비정상적인 과도한 축적은 흑화현상, 노인반점, 검버섯, 기미, 주근깨 등의 색소 침착으로 이어져 외관상의 문제가 될 뿐만 아니라, 피부노화 및 피부암 등에 치명적인 원인이 된다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 멜라닌 합성을 억제함으로써 색소 침착 및 피부질환의 개선을 가능하게 한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 피부 미백용 조성물은 tyrosinase 활성을 저해하는 것일 수 있다. 타이로시나아제(tyrosinase)은 멜라닌 합성에 관여하는 중요한 역할을 하는 효소로, 티로시나제에 의해서 타이로신이 도파(DOPA, 3,4-dihydroxyphentl-alanine)로 변환되고, 이후에 도파퀴논(DOPAquinone)으로 산화되며, 도파크롬(DOPAchrome)을 거쳐 흑갈색의 공중합체인 멜라닌이 생성된다. 따라서, 본 발명에 따른 조성물은 타이로시나아제 활성을 억제함으로써, 멜라닌 합성이 저해되어 색소 침착 및 피부질환의 개선 효과를 기대할 수 있다.

또한, 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 조성물은 피부 부작용을 초래하지 않으며, 피부에 대한 안전성이 우수하고, 물리적·화학적으로 매우 안정하여 제형 개발이 용이하여 화장료 조성물, 약학 조성물 등으로 안전하고 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 기대 된다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 피부 미백용 조성물은 화장료 조성물일 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 화학적 안정성 및 인체에 대한 안전성이 우수할 뿐만 아니라, 수용해도가 개선되어 미백용 화장료 조성물로 제조될 시, 유효농도 이상으로 포함될 수 있기 때문에 만족할 만한 미백 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 상술된 유효성분 및 잔량을 물을 포함하는 것일 수 있으며, 다양한 양태로 제형화될 수 있음은 물론이다.

본 발명의 일 실시예에 따른 화장료 조성물은 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형 등으로 제형화될 수 있다. 일 예로, 상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 에센스 또는 팩으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 화장료 조성물은 목적하는 바에 따라 적절하게 추가의 첨가제를 더 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 화합물(Inularin A)과 함께 당업계에 공지된 주름 개선용 성분, 항산화용 성분, 미백 성분 등에서 선택되는 성분을 더 포함할 수 있다. 일 예로, 레티노산, TGF, 동물 태반 유래의 단백질, 베튤린산 및 클로렐라 추출물 등에서 선택될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 화장료 조성물은 안정화제, 유화제, 점증제, 보습제, 액정 막 강화제, pH 조절제, 항균제, 수용성 고분자, 피막제, 금속 이온 봉쇄제, 아미노산, 유기 아민, 고분자 에멀션, pH조정제, 피부 영양제, 산화 방지제, 산화 방지조제, 방부제, 향료 등에서 선택되는 하나 이상의 수성 첨가제; 및 유지류, 왁스류, 탄화 수소유, 고급 지방산유, 고급 알콜, 합성 에스테르유 및 실리콘유 등에서 선택되는 하나 이상의 유성 첨가제;에서 선택되는 하나 이상의 첨가제를 더 포함할 수 있다.

이때, 상기 각 첨가제는 상기 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 포함될 수 있으며, 구체적으로는 0.01 내지 10중량%, 0.05 내지 5중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 신규 화합물을 유효성분으로 포함하는, 피부 색소 침착 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물을 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물은 화학적 안정성 및 인체에 대한 안전성이 우수할 뿐만 아니라, 수용해도가 개선되어 피부 색소 침착 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물로 제조될 시, 유효농도 이상으로 포함될 수 있기 때문에 만족할 만한 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 피부 색소 침착 질환은 기미, 주근깨, 반점, 일광흑자, 약물성 색소침착, 염증성 색소침착, 노인성 색소침착 및 임신성 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 따른 조성물은 통상적으로 알려진 제조방법을 이용하여, 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한 약학 조성물로 제형화될 수 있다. 일 예로 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 제형일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 피부 색소 침착 질환의 치료 및 예방용 약학 조성물은 목적하는 바에 따라 적절하게 추가의 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 일 예로, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 또는 미네랄 오일 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 담체 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등의 담체를 더 포함할 수 있다.

이때, 상기 각 담체는 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 20 중량%로 포함될 수 있으며, 구체적으로는 0.01 내지 10중량%, 0.05 내지 10중량%로 포함될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] Inularin A의 제조

추출 전처리

대전시 한약전문약방인 백초당한약방에서 구입한 선복화 2 kg을 음건한 후 분쇄하여 10배수의 에탄올 20L에 침지한 후 80℃에서 3시간 환류 추출하였다. 상기와 같은 조건에서 3회 반복 추출 농축하여 에탄올 추출물 110g을 얻었다. 상기에서 추출한 에탄올 추출물에 대해 디클로로메탄(CH₂Cl₂)- 메탄올(MeOH) 혼합액(1:0→0:1)의 gradient 용매조건으로 이동상의 극성을 점차 증가시키며 silica gel column chromatography (column size 70-230 mesh, 10×5.0cm)를 실시하여 분취하였다. 각 분취액을 TLC (hexane:EtOAc = 4:1 또는 1:1)로 확인하여 유사한 것끼리 합하고 농축하여, 분획1(CH₂Cl₂-MeOH 60:1), 분획2(CH₂Cl₂-MeOH 20:1), 분획3(CH₂Cl₂-MeOH 10:1), 분획4(CH₂Cl₂-MeOH 5:1) 등 4개의 컬럼 분획을 얻었다.

Inularin A의 순수 분리정제

상기 분획3에 대하여 메탄올-물 혼합액(20:80→90:10)을 이동상으로 하여 역상 컬럼 크로마토그래피 (reverse phase column chromatography, 컬럼크기: 5×50cm)를 실시하여 3개의 소분획(분획 3-1 ~ 분획 3-3)으로 나누었다. 그 중 분획 3-1에 대해 메탄올-물 혼합액(60:40→80:20)을 이동상으로 하여 reverse phase column chromatography (컬럼크기: 3×50cm)를 실시하여 하기 화합물 1(Inularin A)을 34mg 분리하였다. (도 1)

[화합물 1]

[실험예 1] Inularins A의 화학구조 규명

MS, UV, IR분석

Inularin A는 질량분석기(HR-ESI-MS, High-resolution electron ionization mass spectrometric)로부터 얻어진 m/z 349.1626의 분자이온[M+Na]⁺피크로부터 C₁₇H₂₆O₆의 분자식을 가지는 sesquiterpene계 화합물로 추정할 수 있었다(도 2). UV스펙트럼 분석에서는 210nm에서 최대 흡광도를 보였고, IR(Infrared) 스펙트럼 분석에서는 수산화기 (3500 cm^-1), 2개의 카보닐기 (1,730, 1,722 cm^-1) 및 이중결합(1,640 cm^-1)의 존재를 확인하였다 (도 3).

¹ H-NMR 스펙트럼 분석

화합물의 수소와 탄소 골격을 확인하기 위해 NMR 스펙트럼 분석을 진행하였다. ¹H-NMR 스펙트럼에서는 δH 6.28 및 5.68(2H, each singlet)에서 한 쌍의 이중결합 (olefinic) 수소, δH5.29 (1H, multiplet) 및 3.28 (1H, dd, J = 10.4, 4.8 Hz)에서 2개의 산화성(oxygenated) methine 수소, δH 1.17 및 1.03(each 3H, s)에서 2개의 3차 메틸기, δH 1.95 (3H, s)에서 1개의 acetoxymethyl기를 확인하였다 (도 4).

¹³ C-NMR 스펙트럼 분석

¹³C-NMR 스펙트럼 분석에서는 3개의 methyl기(δC22.8, 21.2, 16.1), 5개의 methylene기(δC126.1, 45.5, 41.9, 29.0, 21.7), 4개의 methine기(δC80.6, 71.5, 54.6, 44.2), 3개의 4차 탄소(δC143.2, 72.3, 40.4) 및 2개의 카보닐 탄소(δC172.2, 170.0)를 포함한 총 17개의 탄소 신호를 관측하였다(도 5). 이 중 15개의 탄소는 eudesmane골격의 sesquiterpene(탄소 15원자로 구성되는 사슬식 또는 고리식의 탄화수소 및 그 유도체) 화합물로 추정되었고, 나머지 2개(δC172.2, 21.2)는 acetyl기에 해당하는 신호로 확인되었다. δC143.2 및 126.1에서 관측되는 탄소신호는 C-11과 C-13에 해당하는 이중결합에 해당하며, δC80.6, 72.3, 및 71.5에서 관측되는 탄소신호는 C-1, C-4, 및 C-8에서 관측되는 산화성 탄소로 확인되었다(도 5).

2D-NMR(COSY, HMQC, HMBC, NOESY) 분석

추가적으로 화합물 1의 2D-NMR(COSY, HMQC, HMBC, NOESY) 분석을 통해 분자 내 치환기 위치 및 입체배향을 포함한 정확한 구조를 분석하였다. ¹H-¹H COSY(Correlation spectroscopy) 스펙트럼 분석을 통해 CH(1)-CH₂(2)-CH(3) 및 CH(5)-CH₂(6)-CH(7)-CH(8)-CH₂(9)의 연결 구조를 확인하였다(도 6).

HMBC(Heteronuclear Multiple-Bond Correlation) 스펙트럼 분석을 통해 분자 내 치환기들의 결합위치를 확인하였다. 즉, (H-13/C-7, C-8, C-11, C-12) 간의 신호로부터 α-methylene-carboxylic acid 치환기는 탄소 7번 위치에 결합되어 있으며, (H-8/C=O) 간의 신호로부터 acetyl 치환기는 C-8에 결합되어 있음을 확인하였다(도 7).

NOESY (nuclear Overhauser enhancement spectroscopy) 스펙트럼 (3차원 공간상에서 거리가 가까운 수소들 간의 신호 분석) 분석을 통해 분자 내 입체구조를 규명하였다. (H-1/H-5) 및 (H₃-14/H₃-15)의 신호로부터 탄소 1번의 수산화기와 탄소 5번의 수산화기는 각각 α 배향 및 β 배향을 나타냄을 확인하였다. 또한 (H-5/H-7) 및 (H-7/H-8)의 신호로부터 α-methylene- carboxylic acid 및 acetyl 치환기는 모두 β 배향을 나타냄을 확인하였다(도 8).

이상의 결과를 토대로 화합물 IB1의 정확한 화학적 구조를 1β,4α-dihydroxy-8β-acetoxy-5αH-eudesma-11(13)-en-12-oic acid로 결정하였으며(화합물 1), 이 화합물은 천연에서 본 연구에서 처음으로 보고된 물질로 본인에 의해서 Inularin A로 명명하였다.

[실험예 2] Inularins A의 세포독성

선복화 추출물로부터 순수하게 분리한 Inularin A의 미백활성을 규명하기 위하여 B16F10 melanoma 세포를 이용하여 MTT assay로 세포독성을 측정하였다. 먼저, Inularin A를 10, 20, 50, 80, 100μM 농도로 세포에 처리하여 세포독성을 조사하였다. 그 결과, 도 9와 같이 Inularin A 화합물을 10, 20, 50, 80, 100μM 농도로 순차적으로 농도를 높여 처리하여도 세포독성은 거의 나타나지 않았으며, 특히 100μM 농도에서도 94% 이상의 세포 생존율을 보여 매우 안전한 화합물로 확인되었다. 따라서 이후에는 생존율 및 증식에 영향을 미치지 않는 100μM 까지를 실험조건으로 설정하여 실험을 진행하였다.

[실험예 3] Inularins A의 멜라닌 합성 저해효과

멜라닌 생성 유도물질인 α-MSH는 뇌하수체 및 피부를 포함한 여러 조직에서 분비되며 표피세포의 성장과 증식, 멜라닌 색소 생성 등 다양한 기능을 담당하고 있다. 따라서 Inularin A 화합물이 멜라닌 생합성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 B16F10 melanoma 세포에 α-MSH를 처리하여 멜라닌 생성을 유도한 후 Inularin A를 10, 50, 100μM 농도별로 처리하여 세포 내 생성된 멜라닌 함량을 측정하여 도 10에 나타냈다.

그 결과, 도 10에서 보는 바와 같이 대조군에 비하여 α-MSH를 단독으로 처리한 경우 뚜렷하게 멜라닌 생성이 증가하였고, Inularin A를 처리할 경우 α-MSH 단독 처리한 경우에 비하여 농도가 증가할수록 멜라닌 생성이 통계적으로 유의성 있게 억제되는 것이 관찰되었다. 특히 Inularin A 화합물 100μM 처리시 약 40% 이상의 멜라닌 생합성이 억제되었다. 이상으로 Inularin A 화합물은 α-MSH에 유도된 멜라닌 생성을 효과적으로 억제하는 미백 소재임을 확인하였다. 양성대조군으로 사용된 kojic acid의 경우 200μM 농도로 처리했을 시 멜라닌 합성이 20% 저해된 반면, Inularin A를 100μM 농도로 처리했을 시 멜라닌 합성이 25% 저해되었다.

[실험예 4] Inularins A의 세포내 tyrosinase 활성 저해 효과

Tyrosinase는 멜라닌 색소생성에 중요한 역할을 하는 효소로 멜라닌이 합성되면 피부의 노화가 촉진될 뿐만 아니라 피부 색소의 침착, 흑화현상, 노인반점, 검버섯 등의 생성 원인이 된다. 특히 tyrosinase는 멜라닌 생합성 경로에서 가장 중요한 초기 단계에 관여하는 효소로 많은 미백 성분들은 이 효소를 억제하는 작용기전을 가지고 있다. 따라서 미백화장품 소재 개발은 인체에 안전하면서도 부작용이 없는 tyrosinase 저해 물질의 개발에 연구가 집중되고 있다고 볼 수 있다. 본 실험에서는 Inularin A 화합물이 tyrosinase 효소 억제 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 tyrosinase 효소활성 유도물질인 α-MSH와 Inularin A 화합물을 10, 50, 100μM 농도별로 처리하고 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 도 11과 같이, α-MSH 처리하였을 시 tyrosinase 활성이 급속히 증가하는 것을 확인하였다. 여기에 Inularin A를 10, 50, 100μM 농도별 처리한 결과 α-MSH만을 처리한 대조군에 비하여 tyrosinase 활성이 농도 의존적으로 감소하였다. 즉, 양성대조군으로 사용된 kojic acid의 경우 200μM 농도로 처리했을 시 tyrosinase 활성이 25% 저해된 반면, Inularin A를 100μM 농도로 처리했을 시 tyrosinase 활성이 33% 저해되는 것을 확인하였다. 이상의 결과로부터 Inularin A 화합물은 α-MSH로 유도된 멜라닌을 효과적으로 억제하는 유용한 tyrosinase 저해 활성을 가지고 있음을 알 수 있다.

[실험예 5] in vivo Zebrafish 모델을 이용한 미백효능

Zebrafish는 기능적으로나 형태학적으로 인간과 유사한 장기를 가지고 있기 때문에 이미 심장이나 혈관질환 등의 인간 질병의 작용기전을 밝히거나 효능 물질을 screening하는 시스템으로 유용하게 이용되고 있다. 또 zebrafish는 몸이 투명하여 색소 생성 관찰이 용이한 점을 이용해 일찍이 미백제 탐색에 많이 이용 되었다. 따라서 본 연구에서는 수정 후 10시간이 경과한 zebrafish의 발생 배에 Inularin A를 농도 별로 처리한 후 28.5℃에서 48시간을 배양한 후 부화된 발생 배의 색소가 일어나는 부위의 변화 양상을 해부 현미경을 이용하여 관찰하였다.

양성대조군인 kojic acid 1mM과 PTU 200μM, 그리고 Inularin A를 10, 50, 및 100μM 농도로 처리한 실험군에서 zebrafish의 형태학적 변화, 즉 머리가 커지거나 몸 일부가 휘어지는 등의 변화가 관찰되지 않았으므로 Inularin A는 독성이 없으며 안전한 화합물인 것으로 추정되었다. Inularin A를 10μM 처리한 군에서도 0.1% DMSO만 처리한 대조군에 비해 멜라닌 색소의 형성이 감소 되는 것이 관찰되었고, Inularin A 50μM 및 100μM 처리군에서 보다 현저하게 멜라닌 색소의 형성이 감소함이 확인되었다(도 12 및 도 13). 이상으로 제브라피쉬의 발생 배에 Inularin A를 처리했을 시, 처리 농도가 증가함에 따라 색소생성의 억제 정도가 비례하여 증가하였으며, 양성대조군인 kojic acid (1mM)와 PTU (200μM)에서도 멜라닌 색소의 생성이 각각 13% 및 81% 억제됨이 확인되었다 (도 12 및 도 13).

Claims

하기 화학식 1로 표시되는 화합물.
[화학식 1]

상기 화학식 1에서,
R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고;
L₁은 C2-C6알케닐렌이고;
A는 카르복실기(-COOH), 포스포닉기(-PO₃H₂), 포스피닉기(-HPO₂H) 또는 술폰산기(-SO₃H)이고;
n은 0 내지 4의 정수이다.
제 1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 2로 표시되는, 화합물.
[화학식 2]

상기 화학식 2에서,
R₂는 C1-C6알킬이고;
R₁₁ 및 R₁₂는 각각 독립적으로 C1-C6알킬이고;
L₁은 C2-C6알케닐렌이고;
A는 카르복실기(-COOH)또는 술폰산기(-SO₃H)이다.
제 1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은 하기 화학식 3으로 표시되는, 화합물.
[화학식 3]

상기 화학식 3에서,
R₂및 R₁₁ 내지 R₁₂는 각각 독립적으로 C1-C4알킬이다.
제 3항에 있어서,
상기 화학식 3의 화합물은 하기 화학식 4로 표시되는, 화합물.
[화학식 4]

상기 화학식 4에서,
R₂ 및 R₁₁ 내지 R₁₂는 각각 독립적으로 C1-C3알킬이다.
제 1항 내지 4항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는, 피부 미백용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 20 중량%로 포함되는, 피부 미백용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 피부 미백용 조성물은 멜라닌 합성을 억제하는 것인, 피부 미백용 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 피부 미백용 조성물은 tyrosinase 활성을 저해하는 것인, 피부 미백용 조성물.
제 5항에 있어서,
상기 조성물은 화장료 조성물인, 피부 미백용 조성물.
제 9항에 있어서,
상기 화장료 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 에센스 또는 팩으로 제형화되는 것인, 피부 미백용 조성물.
제 1항 내지 4항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는, 피부 색소 침착 질환의 개선용 화장료 조성물.
제 11항에 있어서,
상기 피부 색소 침착 질환은 기미, 주근깨, 반점, 일광흑자, 약물성 색소침착, 염증성 색소침착, 노인성 색소침착 및 임신성 색소침착으로 구성된 군으로부터 선택되는 것인, 피부 색소 침착 질환의 개선용 화장료 조성물.
삭제
제 1항 내지 4항에서 선택되는 어느 한 항에 따른 화합물을 포함하는, 선복화 추출물.