KR102278112B1 - 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 이용한 위양성 판단용 조성물 및 이를 이용한 위양성 판단 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 중합효소 연쇄반응(PCR) 과정 중, 양성 대조군 시료에 의한 검사 대상군 시료의 오염 여부를 판단하기 위한 방법이다. 양성 대조군에 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 삽입하고, 타겟 뉴클레오타이드의 일부 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드의 일부 서열과 결합하는 위양성 판단용 프로브를 설계한다. 본 발명에 따르면 검사 대상군 내 특정 인공 뉴클레오타이드 서열의 존부를 확인하여, 위양성 여부를 간단하고 정확하게 판단할 수 있다.
Description
본 발명은 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 이용한 위양성 판단용 조성물 및 이를 이용한 위양성 판단 방법에 관한 것으로써, 양성 대조군 뉴클레오타이드 서열에 타겟 뉴클레오타이드 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 삽입하고, 타겟 뉴클레오타이드의 일부 서열과 특정 인공 뉴클레오타이드의 일부 서열에 결합할 수 있는 프로브를 설계하여, 양성 대조군에 의해 검사 대상군이 오염되어 나타나는 위양성을 높은 정확도와 특이도로 판단할 수 있다.
분자 진단은 DNA, RNA를 포함하는 생체 지표물질을 검출하거나 분석하는 분야로, 1985년 Cetus Corporation (Chiron)의 Mullis에 의해 개발된 시험관에서 핵산을 증폭할 수 있는 기술인 Polymerase Chain Reaction (PCR)을 이용하기 시작하면서 사람을 비롯한 감염균 유전체지도의 완성 등의 유전자 분석이 용이해지게 되며 분자 진단 영역이 비약적으로 발전하였다. 분자레벨에서의 정확한 진단을 가능하게 하는 다양한 분자 진단검사 기술의 발전은 신속·정확한 진단과 진단기기의 소형화를 가능하게 하여, 개인 맞춤형 진단과 치료의 기반을 제공하고 있다.
특히 표적 DNA 또는 RNA를 정성 및 정량 분석이 가능한 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-Time PCR)은 qPCR(quantitative polymerase chain reaction)이라고도 부르는데, 유전자 분석기법 중에서 강력하면서도 고감도로 분석이 가능한 방법이다. 특히 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-Time PCR)은 분자진단에서 Golden Standard로서 자리매김을 하고 있으며, 유전자 발현의 정량분석이나 제노타이핑, SNP 분석, Pathogen의 탐지, 신약 개발과정의 평가, RNAi의 측정 등 다양한 분야에서 활용이 가능하다.
기존 중합효소 연쇄반응(conventional PCR)의 경우에는 분자시료의 복제 및 증폭 과정과 해당 분자시료의 정성적 분석 과정이 분리되어 진행되었으나 실시간 중합효소 연쇄반응 (Real-Time PCR)의 경우는 그 이름에도 드러나 있듯이 복제 및 증폭과정이 진행되는 중에서도 실시간으로 정량 분석이 가능한 장점이 있다.
그러나 PCR은 민감하고 신속한 검사법 중 하나이지만 이러한 민감성 때문에 위양성의 문제가 흔히 생길 수 있다. 이러한 위양성의 원인으로는 이전에 증폭된 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭산물에 의한 오염이나 검체에서의 유전물질의 추출 및 정제 등의 과정에서 발생하는 교차 오염 그리고 진단 실험시에 필수적으로 함께 진행이 되는 양성대조군에 의한 교차오염이 가장 문제시되고 있다. 양성대조군은 진단 결과의 신뢰성을 확보하기 위하여 진단 실험에 사용되고 있는 PCR의 전체 구성물(PCR Master Mix, Primers, Dual probed Dye 등)이 정상적으로 기능을 하는지에 대한 검증을 목적으로 검사 대상군과 함께 수행이 된다. 양성대조군에는 합성된 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 올리고머 또는 플라스미드를 일반적으로 103 copies 이상을 첨가하여 매 실험 마다 양성결과를 보여주어야 한다.
실제로 중합효소 연쇄 반응 진행 시 검사 대상군은 실험자의 실수 또는 이전의 실험에서 오염된 실험 기구 또는 실험실 공기 등을 통하여 양성 대조군에 첨가되는 합성된 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 올리고머 또는 플라스미드에(이하 양성 대조군이라 함은 합성되어진 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 올리고머 또는 플라스미드를 의미한다) 의해 오염될 수 있어, 검사 대상군에 타겟 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않는 경우에도 양성으로 나타나는 등 위양성의 문제가 크다.
본 발명자들은 검사 대상군의 오염에 의한 위양성 여부를 확인할 수 있는 방법을 연구하던 중 위양성 판단을 위하여 양성 대조군에 첨가되는 합성된 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함한 올리고머 또는 플라스미드를 "타겟 뉴클레오타이드 서열"내에 “특정 인공 뉴클레오타이드 서열”이 삽입되는 디자인으로 제작하고, "타겟 뉴클레오타이드 서열"의 일부와 “특정 인공 뉴클레오타이드 서열”의 일부에 동시에 결합할 수 있는 프로브를 이용하여 높은 정확도와 특이도로 위양성 판단이 가능함을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
상기 "타겟 뉴클레오타이드 서열"의 일부와 “특정 인공 뉴클레오타이드 서열”에 동시에 결합할 수 있는 프로브를 이용한 것은 각 진단 목적에 특이적으로 위양성을 판단할 수 있게 함으로서 특이적이지 못한 위양성 판단 방법에 의한 또 다른 거짓 위양성으로 판단되는 것을 방지하기 위함이다.
본 발명은 양성 대조군과 검사 대상군의 중합효소 연쇄반응(PCR) 진행 시 나타날 수 있는 양성 대조군에 의한 검사 대상군의 교차 오염 여부를 판단하여, 검사 결과가 위양성인지 여부를 신속하고 정확하게 판단할 수 있는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은, 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성 대조군; 상기 타겟 뉴클레오타이드의 서열에 결합하는 제1 프로브; 및 상기 타겟 뉴클레오타이드의 일부 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드의 일부 서열에 결합하는 제2 프로브를 포함하는 위양성 판단용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 위양성 판단 시 상기 타겟 뉴클레오타이드 서열에 특이적인 프라이머 세트가 이용될 수 있다. 특히 양성 대조군 제조 시 타겟 뉴클레오타이드 서열 내부에 특정 인공 뉴클레오타이드를 삽입하는 경우, 특정 인공 뉴클레오타이드의 검출을 위한 프라이머를 별도로 이용하지 않아도 된다.
본 발명에서 상기 '프로브'는 제1 프로브 및 제2 프로브를 포함하며, 더 많은 수의 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명의 프로브는 본 발명이 속하는 기술자가 통상적으로 사용할 수 있는 프로브를 이용할 수 있다. 본 발명의 바람직한 일 실시예에 따르면 상기 제1 프로브가 결합하는 타겟 뉴클레오타이드의 서열은 상기 제2 프로브가 결합하는 타겟 뉴클레오타이드의 서열의 일부와 상보적일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 양성 대조군의 특정 인공 뉴클레오타이드 서열은, 타겟 뉴클레오타이드 서열의 내부에 삽입될 수 있으며. 또는 타겟 뉴클레오타이드 서열과 독립적으로 위치할 수 있다. 앞서 살펴본 바와 같이, 특정 인공 뉴클레오타이드 서열이 타겟 뉴클레오타이드 서열의 내부에 삽입되는 경우 프라이머의 사용을 줄일 수 있다.
본 발명에서 상기 양성 대조군은 뉴클레오타이드로 이루어지며, 단일 가닥 또는 이중가닥의 유전자를 사용할 수 있고, 그 종류가 제한되지는 않으나, 바람직하게는 플라스미드 또는 올리고 뉴클레오타이드이다.
상기 특정 인공 뉴클레오타이드의 서열은 3~50mer, 3~30mer, 31~50 mer, 20~40mer 또는 5~20mer의 길이를 가질 수 있으며, 바람직하게는 15~35mer의 길이를 갖는다.
타겟 뉴클레오타이드의 일부 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드의 일부 서열에 결합하는 프로브(제2 프로브)는, 특정 인공뉴클레오타이드 서열의 절반 정도의 길이에 결합할 수 있다.
일 실시예에서, 상기 제2 프로브가 결합하는 특정 인공 뉴클레오타이드의 일부 서열의 길이는 5~30mer, 5~25mer, 5~23mer 또는 10~20mer 이거나, 바람직하게는 5~20mer일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 하나의 실험에서 검출하고자 하는 타겟 뉴클레오타이드 서열이 다수 개인 경우, 특정 인공 뉴클레오타이드; 및 하나의 타겟 뉴클레오타이드;에 결합할 수 있는 제2 프로브를 설계하여, 타겟 뉴클레오타이드에 따른 선택적인 위양성 판단도 가능하다.
본 발명은 또한, a. 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성 대조군의 시료를 제조하는 단계; b. 검체로부터 유전체를 수득한 후, 검사 대상군 시료로 제조하는 단계; c. 상기 양성 대조군 및 검사 대상군 시료 각각에 (i) 타겟 뉴클레오타이드의 서열에 결합하는 제1 프로브, (ii) 상기 타겟 뉴클레오타이드의 일부 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드의 일부 서열에 결합하는 제2 프로브 및 (iii) 프라이머 세트를 첨가하는 단계; d. 상기 c. 단계 이후, 양성대조군 및 검사 대상군 시료 각각을 중합효소 연쇄 반응 (PCR)시키는 단계; 및 e. 중합효소 연쇄 반응(PCR)결과 검사 대상군에서 제1 프로브에 상응하는 신호만 나타나는 경우 진양성으로 판단하는 단계를 포함하는, 위양성 판단 방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 위양성 판단 방법에는 상기 검사 대상군 시료에서 제1 프로브 및 제2 프로브 각각에 상응하는 신호가 나타나는 경우 위양성으로 판단하고, 제1 프로브 및 제2 프로브에 상응하는 신호가 나타나지 않는 경우 음성으로 판단하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 위양성 판단 방법에는 상기 위양성 판단용 조성물이 이용될 수 있다.
또 다른 실시예에 따르면, 타겟 뉴클레오타이드와 특정 인공 뉴클레오타이드는 서로 다른 플라스미드 또는 올리고 뉴클레오타이드에 존재할 수 있다.
본 발명에 따르면 양성 대조군에 의한 오염 여부를 쉽고 정확하게 높은 특이도를 가지고 파악할 수 있으며, 검사 대조군 PCR에서 위양성을 확인하기 위한 별도의 프라이머를 사용하지 않아 검사 대조군 PCR 반응성에 영향을 주지 않고 위양성을 확인할 수 있는 장점이 있다.
또한 특정 인공 뉴클레오타이드 서열과 타겟 뉴클레오타이드 서열에 동시에 결합하는 프로브를 사용함으로써 타겟 서열의 진단에 특이적으로 위양성을 판단할 수 있는 큰 장점을 가지고 있다.
특히, 하나 이상의 뉴클레오타이드를 타겟 뉴클레오타이드로 하여 PCR을 진행하는 경우, 제2 프로브가 결합할 수 있는 타겟 뉴클레오타이드 서열을 특정하여, 해당 타겟 뉴클레오타이드 서열이 존재하는지, 양성 대조군에 의해 오염되었는지 여부를 다른 타겟 뉴클레오타이드와 구분하여 알 수 있는 이점이 있다.
본 발명에 따르면, 특정 인공 뉴클레오타이드의 서열은 3~50mer, 3~30mer, 31~50mer,20~40mer 또는 5~20mer, 바람직하게는 15~35mer의 길이를 갖는 바, 서열이 길어짐에 따라 발생하는 비특이적 검출의 문제를 해소할 수 있고, 타겟 뉴클레오타이드 및 특정 인공 뉴클레오타이드와 동시에 결합하는 제2프로브를 사용하여 위양성 판단의 특이성을 높일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 타겟 뉴클레오타이드 서열 중간에 특정 인공 뉴클레오타이드가 삽입되어 특정 인공 뉴클레오타이드에 대한 별도의 프라이머가 없어도 특정 인공 뉴클레오타이드의 인식이 가능한 바, 프라이머의 과도한 사용을 방지할 수 있어 프라이머 간의 다이머 형성 등에 따라 발생하는 노이즈를 제거할 수 있다.
본 발명은 특정 인공 뉴클레오타이드와 타겟 뉴클레오타이드의 서열에 동시에 결합하는 프로브를 제공하여, 위양성 판단의 정확도를 높일 수 있다.
본 발명은 또한, 특정인공뉴클레오타이드 및 타겟뉴클레오타이드에 결합하는 제 2 프로브를 이용하여, 타겟뉴클레오타이드를 포함하는 양성대조군에 의한 오염만을 특이적으로 검출할 수 있는 이점이 있다.
도 1은 특정 인공 뉴클레오타이드의 존부에 따른 프로브의 결합 여부를 나타내는 PCR 모식도이다.
도 2는 서로 다른 타겟 뉴클레오타이드 서열이 다수 개 존재하는 양성대조군의 PCR 모식도이다.
도 3은, 특정 인공 뉴클레오타이드의 존부에 따른 양성 판단 여부를 확인한 이미지이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따라 제조된 양성 대조군, 프로브, 타겟 뉴클레오타이드 및 프라이머의 유전자 서열을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 주형 A와 제2 S프로브 및 제2 O프로브 각각의 결합관계를 나타내는 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 주형 B와 제2 S프로브 및 제2 O프로브 각각의 결합관계를 나타내는 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, S유전자를 타겟 뉴클레오타이드로 하였을 때, S 유전자의 뉴클레오타이드 서열; 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열;에 결합하는 제2 프로브(제2 S프로브)를 사용하여 S 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성대조군(주형 A)에 의한 오염을 확인한 결과이다. 도 7을 참조하면 양성대조군(주형 A)에 높은 특이도를 갖는 제2 S프로브가 발현(발광)하였는 바, 제2 S프로브를 이용하여 양성대조군(주형 A)에 의한 오염을 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, S유전자를 타겟 뉴클레오타이드로 하였을 때, S 유전자의 뉴클레오타이드 서열; 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열;에 결합하는 제2 프로브(제2 S프로브)를 사용하여 S 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 유전자 (주형 B)에 의한 오염의 검출 여부를 결과이다. 도 8을 참조하면, 해당 실험의 양성대조군(주형 A)에만 높은 특이도를 갖는 제2 S프로브는 주형 B에 의한 오염에도 발현(발광)하지 않아, 양성 대조군이 아닌 유전자(주형 B)에 의한 오염은 검출되지 않음을 확인할 수 있다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따라, ORF1ab유전자를 타겟 뉴클레오타이드로 하였을 때, ORF1ab 유전자의 뉴클레오타이드 서열; 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열;에 결합하는 제2 프로브(제2 O프로브)를 사용하여 ORF1ab 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성대조군(주형 B)에 의한 오염을 확인한 결과이다. 도 9의 양성대조군(주형B)에 높은 특이도를 가지고 있는 제2 O 프로브 발현(발광)에 따라, 양성대조군(주형 B)에 의한 오염을 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라, ORF1ab유전자를 타겟 뉴클레오타이드로 하였을 때, ORF1ab 유전자의 뉴클레오타이드 서열; 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열;에 결합하는 제2 프로브(제2 O프로브)를 사용하여 ORF1ab유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 유전자 (주형 A)에 의한 오염을 확인한 결과이다. 도 10을 참조하면, 해당 실험의 양성대조군(주형 B)에만 높은 특이도를 갖는 제2 O프로브는 주형 A에 의한 오염에도 발현(발광)하지 않아, 양성 대조군이 아닌 유전자(주형 A)에 의한 오염은 검출되지 않음을 확인할 수 있다.
도 11은 종래의 발명과 같이 위양성 판단 프로브와 타겟 뉴클레오타이드의 결합이 요구되지 않는 경우, 동일한 서열을 갖는 한 종류의 위양성 판단 프로브는 특정 인공 뉴클레오타이드의 존부에만 의존하여 발현(발광)하므로, 양성 대조군에 의한 위양성 판단 시 목적하지 않은 다른 유전자 서열에 의한 판정오류를 발생시킬 수 있음을 나타내는 모식도이다.
도 2는 서로 다른 타겟 뉴클레오타이드 서열이 다수 개 존재하는 양성대조군의 PCR 모식도이다.
도 3은, 특정 인공 뉴클레오타이드의 존부에 따른 양성 판단 여부를 확인한 이미지이다.
도 4는 본 발명의 일 실험예에 따라 제조된 양성 대조군, 프로브, 타겟 뉴클레오타이드 및 프라이머의 유전자 서열을 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 주형 A와 제2 S프로브 및 제2 O프로브 각각의 결합관계를 나타내는 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 주형 B와 제2 S프로브 및 제2 O프로브 각각의 결합관계를 나타내는 모식도이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라, S유전자를 타겟 뉴클레오타이드로 하였을 때, S 유전자의 뉴클레오타이드 서열; 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열;에 결합하는 제2 프로브(제2 S프로브)를 사용하여 S 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성대조군(주형 A)에 의한 오염을 확인한 결과이다. 도 7을 참조하면 양성대조군(주형 A)에 높은 특이도를 갖는 제2 S프로브가 발현(발광)하였는 바, 제2 S프로브를 이용하여 양성대조군(주형 A)에 의한 오염을 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라, S유전자를 타겟 뉴클레오타이드로 하였을 때, S 유전자의 뉴클레오타이드 서열; 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열;에 결합하는 제2 프로브(제2 S프로브)를 사용하여 S 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 유전자 (주형 B)에 의한 오염의 검출 여부를 결과이다. 도 8을 참조하면, 해당 실험의 양성대조군(주형 A)에만 높은 특이도를 갖는 제2 S프로브는 주형 B에 의한 오염에도 발현(발광)하지 않아, 양성 대조군이 아닌 유전자(주형 B)에 의한 오염은 검출되지 않음을 확인할 수 있다.
도 9은 본 발명의 일 실시예에 따라, ORF1ab유전자를 타겟 뉴클레오타이드로 하였을 때, ORF1ab 유전자의 뉴클레오타이드 서열; 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열;에 결합하는 제2 프로브(제2 O프로브)를 사용하여 ORF1ab 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성대조군(주형 B)에 의한 오염을 확인한 결과이다. 도 9의 양성대조군(주형B)에 높은 특이도를 가지고 있는 제2 O 프로브 발현(발광)에 따라, 양성대조군(주형 B)에 의한 오염을 검출할 수 있음을 확인할 수 있다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따라, ORF1ab유전자를 타겟 뉴클레오타이드로 하였을 때, ORF1ab 유전자의 뉴클레오타이드 서열; 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열;에 결합하는 제2 프로브(제2 O프로브)를 사용하여 ORF1ab유전자의 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 유전자 (주형 A)에 의한 오염을 확인한 결과이다. 도 10을 참조하면, 해당 실험의 양성대조군(주형 B)에만 높은 특이도를 갖는 제2 O프로브는 주형 A에 의한 오염에도 발현(발광)하지 않아, 양성 대조군이 아닌 유전자(주형 A)에 의한 오염은 검출되지 않음을 확인할 수 있다.
도 11은 종래의 발명과 같이 위양성 판단 프로브와 타겟 뉴클레오타이드의 결합이 요구되지 않는 경우, 동일한 서열을 갖는 한 종류의 위양성 판단 프로브는 특정 인공 뉴클레오타이드의 존부에만 의존하여 발현(발광)하므로, 양성 대조군에 의한 위양성 판단 시 목적하지 않은 다른 유전자 서열에 의한 판정오류를 발생시킬 수 있음을 나타내는 모식도이다.
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
본 명세서에서 "중합효소 연쇄반응(PCR)"이란, Polymerase Chain Reaction이라고도 하며, 내열성 DNA 중합효소를 이용하여 특정 유전자를 분석 혹은 유전자를 조작 (Genetic Engineering) 가능한 수준으로 증폭하는 방법이다. 일반적으로, 중합효소 연쇄반응은 온도 cycling을 통하여, 증폭 부위 양 말단에 해당하는 염기서열을 가진 프라이머가 증폭 대상 DNA에 결합하고, 중합되고, 다시 떨어지는 과정을 반복하면서 특정 부위의 DNA를 기하급수적으로 합성해내는 과정을 말한다.
본 명세서에서 "실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)"은 Real-Time PCR이라고도 하며, 중합효소 연쇄반응(PCR) 증폭 산물을 실시간으로 모니터링하는 해석 방법으로, 기존의 중합효소 연쇄반응(PCR)법으로는 측정하기 어려운 정확한 정량이 가능하다. 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)은 뉴클레오타이드 발현 해석과 같은 정량 분석뿐만 아니라 병원균 감염 진단과 같은 정성 분석에도 다양하게 이용될 수 있다. 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR)은 PCR 증폭산물의 양을 형광을 이용하여 검출한다.
Dual-Labeled Probe를 이용한 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR) 은 PCR 증폭을 위한 한 쌍의 프라이머(즉, 정방향 올리고뉴크레오타이드 프라이머 및 역방향 올리고뉴클레오타이드 프라이머)가 사용될 수 있으며, Dual-Labeled Probe가 검출 프로브로 사용될 수 있다. 상기 검출 프로브는 정방향 프라이머 결합 부위와 역방향 프라이머 결합 부위 사이의 어딘가에 표적 주형 DNA의 센스 또는 안티센스 가닥에 잡종화(hybridization)되는 단일 가닥 올리고뉴클레오티드이다. 어닐링 단계 동안, 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브는 단일 가닥 주형으로 어닐링된다. 증폭이 일어남에 따라 프로브는 DNA 폴리머라아제의 5-프라임 엑소뉴클레아제 활성에 의하여 절단되고 분해된다. 따라서, 특이적 주형 서열의 증폭이 일어남에 따라 검출 프로브는 기하급수적인 양으로 분해된다. 리얼타임 PCR의 검출 프로브는 일반적으로 리포터(리포터 형광 염료 또는 형광물질(reporter)라고 함) 및 소광제(퀀처(quencher)이라고도 함)로 구성된다. 일반적으로, 형광단은 올리고뉴클레오타이드의 5-프라임 단부 또는 그 근처에 부착되고, 소광제는 올리고뉴클레오타이드의 3-프라임 단부 또는 그 근처에 부착된다. 예컨대, Dual-Labeled Probe의 5' 말단에는 리포터가, 3'말단에는 형광을 흡수하는 소광제가 결합되어 있어, 어닐링이 일어나면, 소광제에 의해 발현된 형광이 흡수되지만 이어지는 신장(Extension)과정에서 Taq DNA polymerase의 5'→3' 엑소뉴클레아제의 작용으로 5'에 붙어 있던 형광단이 검출 프로브에서 떨어져 나오면서 형광을 발현한다. 이 형광량을 측정하면 타겟 뉴클레오타이드의 증폭량을 측정할 수 있다. 즉, 더 많은 타겟 뉴클레오타이드의 증폭이 일어나게 되면, 더 많은 올리고뉴클레오타이드 검출 프로브가 절단되어, 더 많은 형광단 및 소광제가 방출되며, 결과적으로 형광단/소광제 쌍이 분리됨으로써, 형광성 방출 진폭이 증가한다. 이를 통해 특정 프로브가 상보적인 염기서열에 결합하였음을 알 수 있고, 해당 염기서열이 존재함을 알 수 있는 것이다.
본 발명에서, 소광제(Quencher)로 사용되는 물질은 Black Hole Quencher(BHQ1, BHQ2, BHQ3), Blackberry Quencher(BBQ650), Dabcyl and Eclipes quencher 등이 많이 이용되지만 이에 한정하지는 아니하며 FRET을 통하여 형광체의 형광을 억제할 수 있는 모든 물질이 해당될 수 있다. 또한, 상기 리포터로서 400nm - 800nm 사이의 형광을 발하는 형광체(fluorophore)를 사용할 수 있으며, FAM, HEX, TET, JOE, CY3, CY5, CAL Fluor560, CAL Flour610, ATTO565 NHS-ester, ROX NHS-ester, TexasRed NHS-ester 및 Yakima Yellow 등의 형광체가 주로 이용되지만 이에 한정되지는 아니한다.
본 명세서에서"올리고뉴클레오타이드"란 일반적으로 실험실에서 생물학 및 유전체학, 생화학, 분자생물학적 연구나 실질적으로 유전자 검사를 위해 합성한 짧은가닥 DNA 또는 RNA 분자를 말한다.
본 명세서에서 "플라스미드"란, 세균의 세포 내에 복제되어 독자적으로 증식할 수 있는 염색체 이외의 DNA 분자를 의미한다.
본 명세서에서 "타겟 뉴클레오타이드 서열"이란, 검출하고자 하는 뉴클레오타이드 서열을 의미하고, "특정 인공 뉴클레오타이드 서열"이란, 임의의 특정된 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 본 명세서에서, 특정 인공 뉴클레오타이드 서열은, 타겟 뉴클레오타이드 서열과는 다른 유전자 서열을 갖는다.
본 명세서에서 "검사 대상군"은 검출하고자하는 타겟 뉴클레오타이드 서열의 존부를 확인하기위해 검체로부터 수득한 유전자를 의미하며, "양성 대조군"은 상기 "타겟 뉴클레오타이드 서열"이 존재하는 합성된 유전자를 의미한다.
본 명세서에서 "양성"이란 검사 대상군에 타겟 뉴클레오타이드 서열이 존재하는 것을 의미하며, "위양성"이란 타겟 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않음에도 양성으로 판정되는 것을 의미한다.
본 명세서에서 "오염"이란, "양성 대조군"의 뉴클레오타이드 서열이 공기 중 또는 실험자 또는 실험 도구 등을 통해 "검사 대상군"에 유입되는 것을 의미한다. 이 경우, 실시간 중합효소 연쇄반응(PCR) 결과 "검사 대상군"에 타겟 뉴클레오타이드 서열이 존재하지 않는 경우에도 타겟 뉴클레오타이드 서열이 존재하는 것으로 나타날 수 있는데, 이를 "위양성"이라 한다.
본 명세서에서 유전자 서열의 위치를 표현할 때,"독립적"이란, 유전자 서열이 혼합(서열 간 삽입)되지 않고 고유의 유전자 서열을 유지한 채 존재하는 것을 의미한다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 구체적으로 설명하도록 한다.
실시예 1. 특정 인공 뉴클레오타이드 서열 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성 대조군; 타겟 뉴클레오타이드에 결합하는 유전자 서열이 제1 프로브와 부분적으로 상보적인 제2 프로브;를 이용한 위양성 판단
본 발명의 일 실시예에 따르면, 위양성 판단용 조성물은 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성 대조군; 상기 타겟 뉴클레오타이드 서열의 특이적 부위에 결합하는 제1 프로브; 상기 타겟 뉴클레오타이드의 일부 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열에 동시에 결합하는 제2 프로브;를 포함할 수 있으며, 추가적으로 타겟 뉴클레오타이드 서열에 특이적인 프라이머 세트를 포함할 수 있다.
이때, 양성 대조군은, 이중 가닥 또는 단일가닥으로 구성될 수 있으며, 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 또는 플라스미드 형태일 수 있다.
상기 양성대조군의 "특정 인공 뉴클레오타이드 서열"은 "타겟 뉴클레오타이드 서열"의 내부에 삽입되거나 독립적으로 존재할 수 있다.
상기 타겟 뉴클레오타이드 서열의 특이적 부위에 결합하는 제1 프로브; 및 상기 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열에 결합하는 제2 프로브; 각각이 결합하는 타겟 뉴클레오타이드 서열은 부분적으로 서로 상보적 서열일 수 있다.
실시예 1의 모식도는 도 1과 같다. 도 1을 참조하면, 타겟 뉴클레오타이드 서열 내부에 특정 인공 뉴클레오타이드 서열이 삽입되는 경우, 본 발명에 따른 제2 프로브는 타겟 뉴클레오타이드의 일부 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드의 일부 서열에 동시에 결합할 수 있다. 상기 제2 프로브는, 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열이 존재하는 경우 주형 가닥에 결합할 수 있다. 반면, 특정 인공 뉴클레오타이드 서열이 주형 가닥에 존재하지 않는 경우, 제2 프로브는 주형 가닥에 결합하지 못한다.
도 2는 타겟 뉴클레오타이드 서열이 다수 개인 양성 대조군의 플라스미드 구성을 모식화한 것이다. 도 2를 참조하면 타겟 뉴클레오타이드 A 서열의 내부에 특정 인공 뉴클레오타이드 서열이 삽입될 수 있다. 타겟 뉴클레오타이드가 다수 개인 경우, 각 뉴클레오타이드에 결합 가능한 프라이머와 프로브를 사용할 수 있으며, 이때, 특정 인공 뉴클레오타이드는 타겟 뉴클레오타이드(A)의 서열 내부에 삽입되기 때문에 별도의 프라이머가 없어도 반응하여 특정 인공 뉴클레오타이드에 대한 인식이 가능하다.
실시예 2. 양성 대조군 내 특정 인공 뉴클레오타이드 서열 및 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성 대조군; 타겟 뉴클레오타이드에 결합하는 유전자 서열이 제1 프로브와 상이한 제2 프로브;를 이용한 위양성 판단
상기 예시 1과 전체적인 구성은 동일하나, 상기 제2 프로브가 결합하는 타겟 뉴클레오타이드의 서열이 제1 프로브와 겹치지 않고, 상이할 수 있다.
[실험예 1]
1-1. 특정 인공 뉴클레오타이드를 포함하는 양성 대조군의 제조
특정 인공 뉴클레오타이드의 존부에 따른 위양성 판단 가부를 확인하고자, 플라스미드 내 타겟 뉴클레오타이드 A, B, C, D(내부 대조군 뉴클레오타이드)를 삽입하였다. 이때, 타겟 뉴클레오타이드 A 서열의 중간에는 특정 인공 뉴클레오타이드를 삽입하였다.
1-2. 특정 인공 뉴클레오타이드를 포함하지 않는 양성 대조군의 제조
플라스미드 내에 특정 인공 뉴클레오타이드를 삽입하지 않았으며, 이외에는 실험예 1-1과 동일한 조건으로 양성 대조군을 제조하였다.
실험예 1-1 및 1-2에서 사용된 유전자 서열은 하기 표 1과 같으며, 제조 시 사용된 시료의 비율은 하기 표 2와 같다.
| name | sequence (5'→3') | mer |
| Plasmid DNA (주형) - 특정 인공 뉴클레오타이드 서열 포함 |
Plasmid -TATGCTTGGAACAGGAAGAGGCTCAGCAACTGTGTTGCTGATTAT TCTGTCTCGACGCTGCGTTGTTCCGCATCATTTTCCACTCTGTCCC TCATGTGGGCGAGCTACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCTTGAA CGGTAATAAAGGAGCTGGTGCCGTGGTATTCTTGCTAGTTAGAAGC CATCCTTACTGCGCTTCGAACGAAGCGCAGTAAGGATGGCTAGATT TGGACCTGCGAGCGTTTTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCGATACTTG TGGAGACAGCCGCTC- |
|
| Plasmid DNA (주형) - 특정 인공 뉴클레오타이드 서열 불포함 |
Plasmid -TATGCTTGGAACAGGAAGAGGCTCAGCAACTGTGTTGCTGATTATT CTGTTGTTCCGCATCATTTTCCACTCTGTCCCTCATGTGGGCGAGCT ACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCTTGAACGGTAATAAAGGAGCT GGTGCCGTGGTATTCTTGCTAGTTAGAAGCCATCCTTACTGCGCTTC GAACGAAGCGCAGTAAGGATGGCTAGATTTGGACCTGCGAGCGTTTT CTGACCTGAAGGCTCTGCGCGATACTTGTGGAGACAGCCGCTC- |
|
| 타겟 뉴클레오타이드 A 정방향 프라이머 | TATGCTTGGAACAGGAAGAG | 20 |
| 타겟 뉴클레오타이드 A 역방향 프라이머 | AGTGGAAAATGATGCGGAA | 19 |
| 타겟 뉴클레오타이드 A 프로브 (FAM) | TCAGCAACTGTGTTGCTGATTATTCTGT | 20 |
| 타겟 뉴클레오타이드 C 정방향 프라이머 | GTCCCTCATGTGGGCGA | 17 |
| 타겟 뉴클레오타이드 C 역방향 프라이머 | CACCAGCTCCTTTATTACCGTT | 22 |
| 타겟 뉴클레오타이드 C 유전자 프로브(HEX) | TACCAGTGGCTTACCGCAAGGTTCTTCT | 28 |
| 타겟 뉴클레오타이드 B 정방향 프라이머 | GTGGTATTCTTGCTAGTTA | 19 |
| 타겟 뉴클레오타이드 B 역방향 프라이머 | GAAGGTTTTACAAGACTCA | 19 |
| 타겟 뉴클레오타이드 B 프로브 (Cy5) | AGCCATCCTTACTGCGCTTCG | 19 |
| 내부 대조군 뉴클레오타이드 정방향 프라이머 | AGATTTGGACCTGCGAGCG | 19 |
| 내부 대조군 뉴클레오타이드 역방향 프라이머 | GAGCGGCTGTCTCCACAAGT | 20 |
| 내부 대조군 뉴클레오타이드 프로브 (CalRed610) | TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG | 23 |
| 특정 인공 뉴클레오타이드 프로브 (Cy5.5) | ACGCAGCGTCGAGACAGAATAATCAGC | 22 |
| 시료 | 부피 (ul) | 최종 농도 |
| 2X RT-qPCR Master Mix | 10 | 1X |
| 타겟 뉴클레오타이드 A 정방향 프라이머 (20 uM) | 0.25 | 0.5 uM |
| 타겟 뉴클레오타이드 A 역방향 프라이머 (20 uM) | 0.25 | 0.5 uM |
| 타겟 뉴클레오타이드 A 프로브 (5 uM) | 0.25 | 0.125 uM |
| 타겟 뉴클레오타이드 C 유전자 정방향 프라이머 (20 uM) | 0.25 | 0.5 uM |
| 타겟 뉴클레오타이드 C 역방향 프라이머 (20 uM) | 0.25 | 0.5 uM |
| 타겟 뉴클레오타이드 C 프로브 (5 uM) | 0.25 | 0.125 uM |
| 타겟 뉴클레오타이드 B 정방향 프라이머 (20 uM) | 0.25 | 0.5 uM |
| 타겟 뉴클레오타이드 B 역방향 프라이머 (20 uM) | 0.25 | 0.5 uM |
| 타겟 뉴클레오타이드 B 프로브 (5 uM) | 0.25 | 0.125 uM |
| 내부 대조군 뉴클레오타이드 정방향 프라이머 (20 uM) | 0.25 | 0.5 uM |
| 내부 대조군 뉴클레오타이드 역방향 프라이머 (20 uM) | 0.25 | 0.5 uM |
| 내부 대조군 뉴클레오타이드 프로브 (5 uM) | 0.25 | 0.125 uM |
| 특정 인공 뉴클레오타이드 프로브 (5 uM) | 0.25 | 0.125 uM |
| 증류수 | 1.75 | - |
| 주형 | 5 | - |
| 총 부피 | 20 | - |
상기 실험예 1-1 및 1-2에 따라 제조된 양성 대조군은 하기 표 3의 조건으로 PCR을 진행하였다.
상기 PCR의 결과는 도 3과 같다. 도 3을 참조하면, 실험예 1-1 및 1-2의 플라스미드는, 타겟 뉴클레오타이드인 A, B, C, D(내부 대조군)를 모두 포함하고 있는 것을 알 수 있다. 그러나, 특정 인공 뉴클레오타이드가 발현하는 실험예 1-1의 양성 대조군과 달리 실험예 1-2의 양성 대조군은 특정 인공 뉴클레오타이드가 발현하지 않음을 알 수 있다. 이에 따르면, 특정 인공 뉴클레오타이드의 존부로 양성대조군에 의한 검체의 오염여부를 확인할 수 있다.
[실험예 2]
목적하지 않은 다른 유전자(예를 들어, 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 유전자)에 의해 위양성 판단용 프로브(제2 프로브)가 발현(발광)하는 경우, 양성 대조군에 의한 오염 여부 판단을 명확히 할 수 없다.
예를들어, 타겟 뉴클레오타이드 서열이 S인 경우, 양성 대조군으로 주형 A(서열 S에 특정 인공 뉴클레오타이드 서열이 삽입)를 사용하고, 프로브로 제1 프로브(타겟 뉴클레오타이드에 결합) 및 제2 프로브(특정 인공 뉴클레오타이드 서열에만 결합)를 사용할 수 있다. 그러나, 이전 실험에서 주형 B(orf1ab 유전자 서열에 특정 인공 뉴클레오타이드 서열이 삽입)를 양성 대조군으로 이용하고, 제2 프로브를 동일하게 사용한 경우, 주형 B 에 의한 오염 시에도 제2 프로브에 의한 발현(발광)이 나타나는 바, 이전 실험(주형 B)에 의한 오염인지, 현재 실험에서의 양성 대조군(주형 A)에 의한 위양성인지 여부를 확인할 수 없는 문제가 있다.
반면, 본 발명은 특정 인공 뉴클레오타이드에 결합하는 제2 프로브가 타겟 유전자의 일부 서열에도 결합할 수 있는 것이 특징이다. 본 발명에서 제2 프로브는 해당 실험에서의 타겟 뉴클레오타이드와 결합이 요구되는 바, 해당 실험에서의 타겟 뉴클레오타이드 서열이 없는 유전자와는 제2 프로브가 결합하지 않아, 오직 현재 실험에서의 양성대조군에 의한 위양성만을 선택적으로 판단할 수 있어, 위양성 판단의 정확도가 높다.
2-1. 올리고 뉴클레오타이드의 제조
본 실험의 PCR 대상으로 주형 유전자(A, B)을 준비하였다. 주형 A는 S 유전자의 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, S 유전자의 서열은 S (F), S (R), S probe(FAM)로 표시되는 유전자의 서열을 포함한다. 본 실험에서 주형 A의 특정 인공 뉴클레오타이드의 서열은 ACGAGACCTACTG 이고, 주형 B의 특정 인공 뉴클레오타이드 서열은 ACGAGACCTACTGGT이다.
주형 B는, Orf1ab 유전자의 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드의 서열을 포함하며, Orf1ab 유전자의 서열은 Orf1ab (F), orf1ab (R), orf1ab-probe (HEX)로 표시되는 유전자의 서열을 포함한다.
실험예 2에서 사용된 제2 프로브는, S 유전자의 일부 서열 포함하는 제2 S 프로브, Orf1ab 유전자의 일부 서열을 포함하는 제2 O 프로브이다.
본 실험에 사용된 유전자 서열은, 도 4와 같이 제조하였다.
2-2. 타겟 뉴클레오타이드가 S유전자인 경우 위양성의 판단
2-2-1. 양성 대조군(주형 A)에 의한 오염 시 제2 S프로브를 이용한 위양성의 판단
양성 대조군(positive control)으로 주형 A(타겟 뉴클레오타이드 서열 S 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열 포함)를 사용한 경우, S 유전자의 일부 서열과 결합하는 제2 프로브(제2 S 프로브)를 이용하여 양성대조군에 의한 오염여부를 확인할 수 있다.
실험예 2-2-1에서는, 주형 A(양성대조군)에 의한 오염 시 제2 프로브(제2 S프로브)의 발현(발광) 여부를 확인하였다. 상기 실시예 2-2에 따라 제조된 주형 A 및 제2 S프로브를 하기 표 4와 같이 혼합한 후, 혼합된 시료를 하기 표 5와 같은 순서로 PCR을 진행하였다.
| Ul | |||
| Template A | 5 | ||
| Add 2x MasteMix chemical | 10 | ||
| S (FAM) | 정방향 프라이머(F) | 20 uM | 0.25 |
| 역방향 프리이머(R) | 20 uM | 0.25 | |
| 제1 S프로브 | 5 uM | 0.25 | |
| 제2 S프로브 (s gene 일부 시퀀스 포함) |
5 uM | 0.25 | |
실험 2-2-1의 결과는 도 7과 같다. 도 7을 참조하면, 본 실험에 사용한 제2 프로브는, S 유전자(타겟 뉴클레오타이드 서열)의 일부와 결합하는 제2 S프로브이기 때문에, 제1 프로브, 제2 프로브에 의한 두 개의 피크(peak)가 모두 검출된다. 이에 따라 타겟 뉴클레오타이드(S 유전자)가 존재하고(제1 프로브에 의한 peak), 양성대조군에 의한 위양성임(제2 프로브에 의한 peak)을 알 수 있다.
즉, 타겟 뉴클레오타이드가 S 유전자인 경우, 양성 대조군으로 S유전자에 특정 인공뉴클레오타이드 서열이 삽입된 주형 A를 사용할 수 있다. 이때, 제2 S프로브(S 유전자 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열에 결합)의 발현(발광)을 확인하여 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열의 존부를 확인할 수 있으므로, 양성대조군에 의한 위양성임을 판단할 수 있는 것이다.
2-2-2. 양성대조군이 아닌 유전자(주형 B)에 의한 오염 시 제2 S프로브의 발현(발광)여부 확인
타겟 뉴클레오타이드 서열이 S유전자인 경우, 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 주형 B에 의한 오염 시에도 제2 프로브가 발현(발광)한다면 양성대조군에 의한 위양성 판단에 방해가 된다.
본 실험에서는 주형 B에 의한 오염 시, 타겟 뉴클레오타이드 서열(S 유전자)과의 결합이 요구되는 제2 프로브(제2 S프로브)가 발현(발광)하는지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 2-2에 따라 제조된 주형 B 및 제2 프로브를 하기 표 6과 같이 혼합한 후, 혼합된 시료를 상기 표 5와 같은 순서로 PCR을 진행하였다.
| ul | |||
| Template B | 5 | ||
| Add 2x MasteMix chemical | 10 | ||
| ORF1ab (HEX) |
정방향 프라이머(F) | 20 uM | 0.25 |
| 역방향 프리이머(R) | 20 uM | 0.25 | |
| 제1 O프로브 | 5 uM | 0.25 | |
| 제2 S프로브 (s gene 일부 시퀀스 포함) |
5 uM | 0.25 | |
실험 2-2-2의 결과는 도 8과 같다. 도 8을 참조하면, 실험에 사용한 제2 S 프로브는 S 유전자(*orf1ab 유전자가 아님) 서열과의 결합이 요구되며, 주형 B에는 제2 S프로브가 결합할 수 있는 서열이 존재하지 않아, 제2 S프로브는 검출되지 않는다.
본 실험에 따르면, 타겟 뉴클레오타이드 (유전자 S) 서열이 존재하지 않는 주형 B에 의한 오염 시, 제2 S 프로브는 발현(발광)하지 않는다.
즉, 실험예 2-2-1 및 2-2-2를 참조하면, 위양성 판단용 프로브(제2 프로브)의 발현(발광)은 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 모두가 존재한다는 것을 의미하는 바, 제2 프로브를 사용하여 양성 대조군(주형 A)에 의한 위양성만을 판별할 수 있는 것이다.
2-3. 타겟 뉴클레오타이드가 Orf1ab 유전자인 경우 위양성의 판단
2-3-1. 양성 대조군(주형 B)에 의한 오염 시 제2 O프로브를 이용한 위양성의 판단
양성 대조군(positive control)으로 주형 B(타겟 뉴클레오타이드 서열인 Orf1ab의 유전자 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열 포함)를 사용한 경우, Orf1ab 유전자의 일부 서열과 결합하는 제2 프로브(제2 O 프로브)를 이용하여 양성대조군에 의한 오염여부를 확인할 수 있다.
실험예 2-3-1에서는, 양성대조군 주형 B에 의한 오염 시 제2 프로브(제2 O 프로브)에 의한 발현(발광) 여부를 확인하였다.
상기 실시예 2-2에 따라 제조된 주형 B 및 제2 O프로브를 하기 표 7과 같이 혼합한 후, 혼합된 시료를 하기 표 5와 같은 순서로 PCR을 진행하였다.
| ul | |||
| Template B | 5 | ||
| Add 2x MasteMix chemical | 10 | ||
| ORF1ab (HEX) |
정방향 프라이머(F) | 20 uM | 0.25 |
| 역방향 프리이머(R) | 20 uM | 0.25 | |
| 제1 O 프로브 | 5 uM | 0.25 | |
| 제2 O 프로브 (Orf1ab probe일부 시퀀스 포함) |
5 uM | 0.25 | |
실험 2-3-1의 결과는 도 9와 같다. 도 9를 참조하면, 본 실험에 사용한 제2 프로브로 제2 O 프로브(타겟 뉴클레오타이드인 Orf1ab 유전자 서열의 일부와 결합)를 사용하여, 제1 프로브, 제2 프로브에 의한 두 개의 피크(peak)가 모두 검출된다. 이에 따라 양성대조군 유전자(주형 B)가 존재하며(제1 프로브 peak), 양성대조군에 의한 위양성임(제2 프로브에 의한 peak)을 알 수 있다.
즉, 타겟 뉴클레오타이드가 Orf1ab 유전자인 경우, 양성 대조군으로 주형 B(타겟 뉴클레오타이드 Orf1ab 서열에 특정 인공뉴클레오타이드 서열 삽입)를 사용할 수 있다. 이때, Orf1ab 유전자의 일부 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드의 일부 서열에 결합하는 제2 O 프로브의 발현(발광)을 확인하여 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열의 존부를 확인할 수 있으므로, 양성대조군에 의한 위양성임을 판단할 수 있는 것이다.
2-3-2. 양성 대조군이 아닌 유전자(주형 A)에 의한 오염 시 제2 O 프로브의 발현(발광)여부 확인
타겟 뉴클레오타이드가 Orf1ab 유전자인 경우, 타겟 뉴클레오타이드 서열을 포함하지 않는 주형 A에 의한 오염 시에도 제2 프로브가 발현한다면 양성대조군에 의한 위양성 판단에 방해가 된다.
본 실험에서는 주형 A에 의한 오염 시, 타겟 뉴클레오타이드 서열(S 유전자)을 포함하는 제2 프로브(제2 O프로브)가 발현(발광)하는지 여부를 확인하기 위해, 상기 실시예 2-2에 따라 제조된 주형 A 및 제2 O 프로브를 하기 표 8과 같이 혼합한 후, 혼합된 시료를 상기 표 5와 같은 순서로 PCR을 진행하였다.
| ul | |||
| Template A | 5 | ||
| Add 2x MasteMix chemical | 10 | ||
| S (FAM) | 정방향 프라이머(F) | 20 uM | 0.25 |
| 역방향 프리이머(R) | 20 uM | 0.25 | |
| 제1 S프로브 | 5 uM | 0.25 | |
| 제2 O 프로브 (Orf1ab probe일부 시퀀스 포함) |
5 uM | 0.25 | |
실험 2-3-2의 결과는 도 10과 같다. 도 10을 참조하면, 실험에 사용한 제2 O 프로브는 ORF1ab 유전자(*S 유전자 아님) 서열의 일부와 결합이 요구된다. 주형 A에는 제2 O프로브가 결합할 수 있는 ORF1ab 유전자 서열이 존재하지 않아, 제2 O프로브는 검출되지 않는다. 본 실험에 따르면, 타겟 뉴클레오타이드 (ORF1ab 유전자) 서열이 존재하지 않는 주형 A에 의한 오염 시, 제2 O 프로브가 발현(발광)하지 않는다.
만약 제2 프로브가 타겟 뉴클레오타이드의 일부 서열과 결합하지 않는다면(도 11 참조), 현재 실험(도 11에서, B kit 이용) 이전의 실험(도 11에서 A kit 이용)에 의해 실험 도구 등이 오염된 경우에도, 이전 실험의 잔여물(도 11에서 주형 A)에 의해 제2 프로브가 발현(발광)하는 문제가 있다. 이 경우 타겟 유전자 서열이 검사 대상군에 존재하지 않아도 검사대상군, 음성 대조군에서 위양성 판단용 프로브(제2 프로브)가 발현(발광)하는 바, 양성 대조군에 의한 위양성 판단에 방해가 된다.
즉, 타겟 뉴클레오타이드 및 특정 인공 뉴클레오타이드와 결합하는 위양성 판단용 프로브(제2 프로브)를 이용하는 경우, 설정된 특정의 타겟 뉴클레오타이드가 존재하지 않는다면, 위양성 검출용 프로브(제2 프로브)는 검출되지 않는다. 따라서, 본 발명을 이용하는 경우, 설정된 특정의 타겟 뉴클레오타이드를 포함하는 양성대조군에 의한 오염여부만을 특이적으로 확인할 수 있다.
본 발명에 따르면, 타겟 뉴클레오타이드가 다수 개인 경우에도 타겟 뉴클레오타이드를 특정하여 해당 타겟 뉴클레오타이드만의 오염판단이 가능한 것이다.
본 발명은 이상에서 살펴본 바와 같이 바람직한 실시예 및 실험예를 들어 도시하고 설명하였으나, 상기한 실시예 및 실험예에 한정되지 아니하며, 본 발명의 목적을 벗어나지 않는 범위 내에서 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 다양한 변경과 수정이 가능할 것이다.
Claims (15)
- 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성 대조군;
상기 타겟 뉴클레오타이드의 서열에 결합하는 제1 프로브; 및
상기 타겟 뉴클레오타이드의 일부 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드의 일부 서열에 결합하는 제2 프로브를 포함하는 위양성 판단용 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 타겟 뉴클레오타이드 서열에 특이적인 프라이머 세트를 더 포함하는, 위양성 판단용 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 제1 프로브가 결합하는 타겟 뉴클레오타이드의 서열은 상기 제2 프로브가 결합하는 타겟 뉴클레오타이드의 서열의 일부와 상보적인, 위양성 판단용 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 양성 대조군의 특정 인공 뉴클레오타이드 서열은, 타겟 뉴클레오타이드 서열의 내부에 삽입된 것인, 위양성 판단용 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 양성 대조군의 특정 인공 뉴클레오타이드 서열은, 타겟 뉴클레오타이드 서열과 독립적으로 위치하는, 위양성 판단용 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 양성 대조군은 뉴클레오타이드로 이루어지며, 플라스미드 또는 올리고 뉴클레오타이드인, 위양성 판단용 조성물. - 제1 항에 있어서,
상기 특정 인공 뉴클레오타이드 서열은 15 내지 35mer의 길이를 갖고,
상기 제2 프로브가 결합하는 특정 인공 뉴클레오타이드의 길이는 5 내지 20mer인, 위양성 판단용 조성물. - a. 타겟 뉴클레오타이드 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 양성 대조군의 시료를 제조하는 단계;
b. 검체로부터 유전체를 수득한 후, 검사 대상군 시료로 제조하는 단계;
c. 상기 양성 대조군 및 검사 대상군 시료 각각에 (i) 타겟 뉴클레오타이드의 서열에 결합하는 제1 프로브, (ii) 상기 타겟 뉴클레오타이드의 일부 서열 및 특정 인공 뉴클레오타이드의 일부 서열에 결합하는 제2 프로브 및 (iii) 프라이머 세트를 첨가하는 단계;
d. 상기 c.단계 이후, 양성대조군 및 검사 대상군 시료 각각을 중합효소 연쇄 반응 (PCR)시키는 단계; 및
e. 중합효소 연쇄 반응(PCR)결과 검사 대상군에서 제1 프로브에 상응하는 신호만 나타나는 경우 진양성으로 판단하는 단계를 포함하는, 위양성 판단 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 검사 대상군 시료에서 제1 프로브 및 제2 프로브 각각에 상응하는 신호가 나타나는 경우 위양성으로 판단하고,
제1 프로브 및 제2 프로브에 상응하는 신호가 나타나지 않는 경우 음성으로 판단하는 단계를 포함하는, 위양성 판단 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 b. 단계의 프라이머 세트는, 타겟 뉴클레오타이드 서열에 특이적인, 위양성 판단 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 c. 단계의 제1 프로브가 결합하는 타겟 뉴클레오타이드의 서열은 상기 제2 프로브가 결합하는 타겟 뉴클레오타이드의 서열의 일부와 상보적인, 위양성 판단 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 양성 대조군의 특정 인공 뉴클레오타이드 서열은, 타겟 뉴클레오타이드 서열의 내부에 삽입된 것인, 위양성 판단 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 양성 대조군의 특정 인공 뉴클레오타이드 서열은, 타겟 뉴클레오타이드 서열과 독립적으로 위치하는, 위양성 판단 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 양성 대조군은 뉴클레오타이드로 이루어지며, 플라스미드 또는 올리고 뉴클레오타이드인, 위양성 판단 방법. - 제8 항에 있어서,
상기 특정 인공 뉴클레오타이드 서열은 15 내지 35mer의 길이를 갖고,
상기 제2 프로브가 결합하는 특정 인공 뉴클레오타이드의 길이는 5 내지 20mer인, 위양성 판단 방법.
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