KR102609727B1 - 감귤류 카로티노이드 함량 예측용 프라이머 세트 및 이의 용도 - Google Patents

감귤류 카로티노이드 함량 예측용 프라이머 세트 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 감귤류 카로티노이드 함량 예측용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 감귤 유래 카로티노이드 생합성 유전자 특이적 프라이머 세트는 감귤류 분자 육종 과정에서 품종간에 다양한 카로티노이드 성분들의 함량을 비교하고 예측할 수 있게 해주는 중요한 도구로 활용할 수 있을 것이다.

Description

감귤류 카로티노이드 함량 예측용 프라이머 세트 및 이의 용도{Primer set for predicting carotenoid content of citrus fruit and uses thereof}
본 발명은 감귤류 카로티노이드 함량 예측용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.
카로티노이드는 식물을 비롯하여 조류(algae), 곰팡이, 박테리아에 존재하는 이소프레노이드(isoprenoid) 계열의 물질로, 광합성 및 비광합성 조직에 존재하며, 식물의 꽃과 열매를 비롯한 여러 조직과 기관들에 노란색, 오렌지색, 붉은색을 부여하는 주요 색소이다. 카로티노이드는 단순한 색소 이상의 기능을 갖는다. 엽록체에 존재하는 카로티노이드는 막안정제(membrane stabilizer)로 작용하며, 광합성 과정에서 빛의 수집(light collection)과 광보호(photoprotection) 기능을 수행한다. 또한, 식물 발달 및 환경과 식물의 상호작용을 조절하는 중요 식물 호르몬인 아브시스산(abscisic acid)과 스트리고락톤(strigolactone)의 전구물질로도 작용한다. 카로티노이드는 생태학적 측면에서도 중요한데, 수분(pollination), 종자 산포(seed dispersal) 등을 위하여 향기와 맛을 통해 곤충과 동물을 끌어들인다.
감귤 열매는 카로티노이드가 매우 풍부하며, 열매에서 115종 이상의 카로티노이드 성분이 확인되었다. 감귤 열매의 과육과 과피는 카로티노이드로 인한 오렌지색 외에 밝은 노란색에서 붉은색에 이르기까지 다양한 색을 갖는다. 카로티노이드의 함량과 조성은 조직뿐만 아니라, 종 및 품종 간에도 크게 차이를 보이는데, 함량 및 조성에서의 차이는 주요 생합성 유전자 그룹(family)에서의 진화 및 변이와 관련이 있는 것으로 여겨지고 있다.
카로티노이드 대사 경로의 각 생화학적 단계는 동위원소 표지, 저해제 처리, 돌연변이체 분석 등을 통해 규명되어 왔으며, 생합성 및 분해 경로에 관여하는 거의 모든 유전자가 다양한 식물에서 클로닝 되었다. 카로티노이드는 색소체(chloroplast, chromoplast)에서 MEP(2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate) 경로에서 유래하는 5-탄소 전구물질인 IPP(isopentenyl diphosphate)와 DMAPP(dimethylallyl diphosphate)의 축합을 통해 GGPP(geranylgeranyl diphosphate)를 만들면서 시작된다. 두 분자의 GGPP는 PSY(phytoene synthase)에 의한 축합 반응을 통해 무색을 띠는 최초의 카로티노이드인 15-cis-phytoene이 만들어지는데, 이 단계가 카로티노이드 생성에서 1차 병목 단계에 해당하며, 속도 조절 단계이다. 15-cis-phytoene은 불포화(desaturation)와 이성질화(isomerization) 과정을 거쳐 붉은색을 띠는 all-trans-lycopene을 만들며, 고리화(cyclization) 과정을 거쳐 최종적으로 오렌지색을 띠는 카로틴(α-carotene, β-carotene)이 만들어진다. α-carotene은 하이드록시화(hydroxylation) 과정을 거쳐 노란색의 루테인(lutein)으로 전환된다. β-carotene도 하이드록시화, 에폭시화(epoxidation), 탈에폭시화(de-epoxidation) 과정 등을 거쳐 노란색의 네오잔틴(neoxanthin)으로 전환된다. 고추, 참나리(tiger lily) 등에서 안테라잔틴(antheraxanthin)과 비올라잔틴(violaxanthin)은 CCS(capsanthin-capsorubin synthase)에 의해 각각 붉은색의 캡산틴(capsanthin)과 캡소루빈(capsorubin)으로 전환된다. 잔토필(xanthophyll) 계열의 카로티노이드(β-carotene, β-cryptoxanthin, zeaxanthin, violaxanthin, neoxanthin)는 CCD(carotenoid cleavage dioxygenase)와 NCED(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase)에 의해 식물 생장호르몬(strigolactone, abscisic acid), 붉은색의 β-시트라우린(citraurin)과 같은 아포카로티노이드(apo-carotenoids) 화합물로 전환된다.
카로틴과 잔토필을 포함하는 카로티노이드의 생합성에는 14개, 아포카로티노이드의 분해에는 2개 그룹에 속하는 유전자가 관여하는 것으로 알려져 있다. 스위트 오렌지(Citrus sinensis)의 ESTs(expressed sequence tags)와 BAC(bacterial artificial chromosome) 라이브러리로부터 카로티노이드 생합성 관여 유전자 발굴을 통해 기존 7종을 포함하여 총 26종, 7개 유전자 그룹이 발굴되었다. 최근 감귤 카로티노이드 생합성 조절에 관여하는 CsMADS6 유전자에 대해 조직별, 열매 발달 단계별 유전자 발현 분석이 이루어졌다. MADS-box 함유 전자조절자인 CsMADS5/CsMADS6가 카로티노이드 생합성 유전자들(LCYb1, PSY, PDS 등)의 프로모터에 결합하여 이들의 발현을 증가시키는 것으로 알려졌다. CsMADS5/CsMADS6 유전자를 토마토 또는 감귤에서 과발현시킨 결과, 카로티노이드 생합성에 관여하는 유전자들의 발현이 증가하였으며, 궁극적으로 카로티노이드 함량도 증가하였다. 현재까지 감귤류에서는 클레멘틴(C. clementina)과 스위트 오렌지(C. sinensis)를 비롯하여 10여 종의 감귤 품종 또는 야생종에 대한 표준유전체 또는 draft 유전체 정보가 확보되었다.
한편, 한국등록특허 제1444224호에 'PAP8 유전자 및 그 유전자를 이용한 식물체의 카로티노이드 함량 조절 방법'이 개시되어 있고, 한국등록특허 제0813284호에 '감귤 피토엔 생합성 효소 PSY 유전자가 형질전환된 유채식물체'가 개시되어 있으나, 본 발명의 감귤류 카로티노이드 함량 예측용 프라이머 세트 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 고품질의 감귤 표준유전체 정보(Citrus clementina cv. Clemenules v1.0)로부터 카로티노이드 생합성과 분해 경로에 관여하는 16개 패밀리(family)의 34개 구조 유전자를 발굴하였으며, 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자들의 발현 수준을 정량 및 정성 분석하기 위해 qRT-PCR(quantitative real time-PCR)을 위한 프라이머 세트를 제작하였다. 상기 제작된 본 발명의 프라이머 세트가 PCR 효율성 및 특이성이 우수하고, 완숙전 단계의 클레멘틴(C. clementina) 품종과 스위트 오렌지(C. sinensis 'Valencia') 품종의 과육(fruit flesh) 및 과피(fruit peel)를 대상으로 카로티노이드 생합성 관련 유전자들의 발현 수준을 측정함으로써 감귤류 내 카로티노이드 함량의 예측이 가능함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 감귤류 카로티노이드 함량 예측용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는, 감귤류 카로티노이드 함량 예측용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 감귤류 카로티노이드 함량을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 감귤 유래 카로티노이드 생합성 유전자 특이적 프라이머 세트는 분자생물학적 연구를 위한 재료로서 뿐만 아니라, 향후 감귤류 분자 육종 과정에서 품종간에 다양한 카로티노이드 성분들의 함량을 비교하고 예측할 수 있게 해주는 중요한 도구로 활용할 수 있을 것이다.
도 1은 식물의 카로티노이드 생합성 경로를 나타낸 그림이다.
도 2는 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 real time-PCR을 수행한 결과로, A는 PCR 증폭 산물에 대해 융해곡선(melting curve)을 측정하여 melting peak를 확인한 결과이고, B는 본 발명의 프라이머 세트의 PCR 효율을 확인한 결과이다.
도 3은 클레멘틴(C. clementina) 품종과 스위트 오렌지(C. sinensis 'Valencia') 품종의 과육(fruit flesh; A) 또는 과피(fruit peel; B)에서 카로티노이드 생합성 관련 유전자 각각의 발현 수준을 비교하여 나타낸 결과이다.
도 4는 클레멘틴(C. clementina; A) 품종과 스위트 오렌지(C. sinensis 'Valencia'; B) 품종의 과육(fruit flesh) 및 과피(fruit peel)에서 카로티노이드 생합성 관련 유전자의 발현 수준을 나타낸 결과이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는, 감귤류 카로티노이드 함량 예측용 프라이머 세트 조성물을 제공한다.
본 발명의 프라이머 세트는 바람직하게는 상기 16개의 프라이머 세트로 이루어진 군으로부터 선택되는 1개 이상의 프라이머 세트를 포함하며, 16개의 프라이머 세트, 즉, 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 모두 포함할 수 있다. 상기 16개의 프라이머 세트를 동시에 이용하면 감귤류 카로티노이드 함량을 더욱 효율적으로 예측할 수 있다.
본 발명의 프라이머 세트 조성물은 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 포함하는 것으로, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트는 PSY(phytoene synthase) 유전자, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 PDS(phytoene desaturase) 유전자, 서열번호 5 및 6의 프라이머 세트는 Z-ISO(ζ-carotene isomerase) 유전자, 서열번호 7 및 8의 프라이머 세트는 ZDS(ζ-carotene desaturase) 유전자, 서열번호 9 및 10의 프라이머 세트는 CRTISO(carotenoid isomerase) 유전자, 서열번호 11 및 12의 프라이머 세트는 LCYb(lycopene β-cyclase) 유전자, 서열번호 13 및 14의 프라이머 세트는 LCYe(lycopene ε-cyclase) 유전자, 서열번호 15 및 16의 프라이머 세트는 CYP97A(cytochrome P450-type monooxygenase 97A) 유전자, 서열번호 17 및 18의 프라이머 세트는 CYP97C(cytochrome P450-type monooxygenase 97C) 유전자, 서열번호 19 및 20의 프라이머 세트는 HYb(β-carotene hydroxylase) 유전자, 서열번호 21 및 22의 프라이머 세트는 ZEP(zeaxanthin epoxidase) 유전자, 서열번호 23 및 24의 프라이머 세트는 VDE(violaxanthin de-epoxidase) 유전자, 서열번호 25 및 26의 프라이머 세트는 CCS(capsanthin-capsorubin synthase) 유전자, 서열번호 27 및 28의 프라이머 세트는 NXS(neoxanthin synthase) 유전자, 서열번호 29 및 30의 프라이머 세트는 CCD(carotenoid cleavage dioxygenase) 유전자 및 서열번호 31 및 32의 프라이머 세트는 NCED(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase) 유전자에 특이적인 프라이머 세트이다.
본 발명의 상기 프라이머는 각 프라이머의 서열 길이에 따라 서열번호 1 내지 32의 서열 내의 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오드티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 1의 프라이머(23개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 1의 서열 내의 20개 이상, 21개 이상, 22개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 증폭 부위에 결합할 수 있는, 서열번호 1 내지 32의 각 염기서열에서 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다. 상기 서열번호 중 홀수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 정방향 프라이머이며, 짝수 번호의 올리고뉴클레오티드 프라이머는 역방향 프라이머이다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 "감귤류"는 운향과 감귤속(Citrus) 식물의 열매로, 스위트오렌지류(C. sinensis)(C. maxima x C. reticulata; 예, 발렌시아레이트 등), 온주밀감류(C. unshiu; 예, 유라조생 등), 만다린류(C. reticulata; 예, 클레멘틴, 미니향 등), 탄골류(C. reticulata x C. sinensis; 예, 가을향 등), 탄젤로류(C. reticulata x C. maxima 또는 C. reticulata x C. paradisi; 예, 미네올라 등), 사우어오렌지류(C. aurantium) (C. maxima x C. reticulata; 예, 지각 등), 문단류(C. maxima 또는 C. grandis; 예, 당유자 등), 그레이프푸르트류(C. paradisi; 예, 자몽), 레몬류(C. limon; 예, 리스본레몬 등), 라임류(C. latifolia, C. limonia, C. limettioides, C. aurantifolia 등; 예, 라임 등), 파페다류(C. sudachi, C. junos, C. sphaerocarpa, C. wilsonii 등; 예, 스다치 등), 시트론류(C. medica; 예, 불수감 등), 기타 감귤류(일향하 C. tamurana, 하루카 Citrus spp.‘Haruka’등)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있으나, 이에 특별히 제한되지 않는다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 조성물을 포함하는, 감귤류 카로티노이드 함량 예측용 키트를 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 추가로 포함할 수 있고, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트 조성물을 이용하여 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 감귤류 카로티노이드 함량을 예측하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 상기 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자는 PSY(phytoene synthase), PDS(phytoene desaturase), Z-ISO(ζ-carotene isomerase), ZDS(ζ-carotene desaturase), CRTISO(carotenoid isomerase), LCYb(lycopene β-cyclase), LCYe(lycopene ε-cyclase), CYP97A(cytochrome P450-type monooxygenase 97A), CYP97C(cytochrome P450-type monooxygenase 97C), HYb(β-carotene hydroxylase), ZEP(zeaxanthin epoxidase), VDE(violaxanthin de-epoxidase), CCS(capsanthin-capsorubin synthase), NXS(neoxanthin synthase), CCD(carotenoid cleavage dioxygenase) 및 NCED(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 실시간 PCR(Real time-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블로팅(Northern blotting) 및 DNA 마이크로어레이 칩 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 감귤류 카로티노이드 함량은 본 발명의 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 이용하여 real time-PCR을 통해 카로티노이드 생합성 관련 유전자들의 발현 수준을 확인한 후 카로티노이드 생합성 경로에 기반하여 감귤류 시료 내 카로티노이드 성분의 함량을 예측할 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 프라이머 세트(표 3)를 이용하여 클레멘틴(C. clementina) 품종과 오렌지(C. sinensis 'Valencia') 품종을 대상으로 real time-PCR을 수행한 결과, HYb, ZEP, NXS 및 CCD 유전자의 발현 수준이 다른 유전자들에 비해 상대적으로 높음을 확인하였다. 카로티노이드 대사 경로(도 1)에 기반하여 볼 때 HYb와 ZEP 유전자가 과일의 성숙전 단계에서부터 발현이 높게 유지됨으로써 카로티노이드 성분인 비올라잔틴(violaxanthin)과 β-크립토잔틴(cryptoxanthin)의 축적이 유도되고, NXS 유전자의 발현 수준이 높게 유지됨으로써 네오잔틴(neoxanthin)의 축적이 유도되며, CCD 유전자의 발현 수준이 높게 유지됨으로써 β-cryptoxanthin과 제아잔틴(zeaxanthin)으로부터 아포카로티노이드(apocarotenoid)에 속하는 β-시트라우린(citraurin)의 합성이 유도될 수 있음을 알 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예를 통해서 상세하게 설명한다. 하기의 특정한 예시 및 실시예는 발명의 일부 구현예를 포함하는 것으로 모든 구현예를 포함하고 있지는 않다는 점에 유의해야 한다. 본 명세서에 의해 개시되는 발명의 내용은 여기에서 설명되는 특정 실시예로 제한되지 않고, 본 발명이 속한 기술 분야에 있어 통상의 기술자가 다양하게 구현할 수 있다는 것을 포함하는 것은 자명하다. 따라서 본 명세서에 개시된 발명의 내용은 여기에 기재된 특정 실시예로 제한되지 않으며, 이에 대한 변형 및 다른 구현예들도 청구범위 내에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
재료 및 방법
1. 감귤류 카로티노이드 생합성 관련 유전자의 발굴
1-1. 애기장대 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자 검색
모델식물인 애기장대(Arabidopsis thaliana)에서 카로티노이드 생합성 관련 유전자를 발굴하기 위해 TAIR(The Arabidopsis Information Resource)에서 키워드 검색을 진행하였으며, 식물 카로티노이드 생합성 경로에 관여하는 것으로 알려진 16종 단백질(표 1)을 쿼리(query)로 입력해 나온 결과들을 애기장대 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자로 명명하였다.
1-2. Reciprocal best hits 법을 활용한 감귤 유전자 발굴
상기 애기장대 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자 서열로부터 감귤 유사 유전자 발굴을 위해 Phytozome 12.1 (https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)과 pathway/genome database (http://ptools.citrusgenomedb.org/)에서 BlastP 검색을 수행하였다. 검색된 감귤 유사 유전자(orthologs)로부터 최종 선발은 RBH(Reciprocal best hits) 방법을 따라 진행하였고, 일부 유전자들의 경우 유사도 차이에 따라 중복 선발하여 유사 유전자 패밀리로 분류하였다.
2. 유전자 서열 확보 및 프라이머 제작
감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자의 서열을 Phytozome 12.1의 클레멘틴(C. clementina)의 서열로부터 확보한 후, 이를 기초로 프라이머를 제작하였다. 프라이머 제작은 NCBI의 Primer-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)를 이용하였고, 기본 매개변수 설정은 증폭 크기 70~250 bp, 최적 Tm 값과 프라이머 길이는 각각 60℃와 23 mer로 설정하였다. 프라이머 특이성 검정을 위해 시트러스(Citrus)의 Refseq representative genome 데이터베이스 검색을 추가하였다. 검색 결과 나온 프라이머들 중 유전자 내 결합 위치와 엑손-인트론 접합 부위 여부 등을 고려하여 유전자별로 최종 2~3세트씩 우선 선발한 후, 이후 실험 과정을 통해 최종 선별하였다.
3. RNA 추출 및 cDNA 합성
감귤 과피와 과육에서 RNA를 추출하기 위해 Quick RNA prep kit (ZymoResearch)를 이용하여 제조사의 지침에 따라 수행하였다. 추출한 RNA의 정량 및 정성 분석은 DeNovix DS-11+ Spectrophotometer(DeNovix, 미국)와 아가로스 겔 전기영동을 통해 결정하였다.
cDNA 합성을 위해 시료별로 RNA 2 ㎍을 사용하여 다음과 같이 역전사 반응을 수행하였다. 2 ㎍ RNA와 1 ㎕ oligo dT(100 pmol/㎕)를 혼합한 후 DEPC 처리한 멸균증류수로 전체 부피를 11.5 ㎕로 맞추고, RNA 이차구조를 제거하기 위해 65℃에서 5분간 처리하였다. 이후 4 ㎕ 5X reaction buffer, 2 ㎕ 0.1 M DTT, 1 ㎕ dNTP mix(10 mM each dATP, dGTP, dCTP, dTTP), 0.5 ㎕ RNase inhibitor(20 u/㎕) 및 1 ㎕ reverse transcriptase(200 u/㎕; Philekorea Technology)를 첨가하여 최종 부피를 20 ㎕로 맞추고, 42℃에서 90분 동안 역전사 반응을 수행한 후 70℃에서 15분간 처리하여 효소 활성을 제거하였다.
4. 프라이머 특이성 검정
제작한 프라이머의 특이성 검정은 PCR 반응 후 아가로스 겔 전기영동법을 통해 1차 확인 후, real time-PCR을 통해 융해곡선(melting curve)을 분석하는 2차 검정 과정을 통해 수행되었다. PCR 반응은 클레멘틴(C. clementina)과 스위트 오렌지(C. sinensis)의 과피 및 과육에서 추출한 RNA로부터 합성한 cDNA를 주형으로 진행하였다.
PCR 반응물의 조성은 주형 cDNA 1 ㎕(25 ng/㎕), 정방향 및 역방향 프라이머 각각 0.4 ㎕(각각 10 μM), 2x Taq mix(DS biotech, China) 10 ㎕, 멸균증류수 8.2 ㎕를 혼합하여 최종 20 ㎕로 반응을 진행하였다. PCR은 94℃에서 5분간 열변성 후, 94℃ 15초, 58℃ 20초, 72℃ 30초의 사이클을 35회 반복하고, 72℃에서 5분간 반응시켰다. 반응이 끝난 후, 증폭산물 5 ㎕를 1% 아가로스 겔에서 전기영동하고, UV하에서 PCR 산물의 크기와 단일 절편 증폭 여부를 확인하였다.
융해곡선 분석을 위한 real time-PCR 반응물의 조성은 주형 cDNA 1 ㎕(25 ng/㎕), 정방향 및 역방향 프라이머(10 μM) 각각 0.4 ㎕, 2x TOPreal qPCR Premix(Enzynomics, 한국) 10 ㎕ 및 멸균증류수 8.2 ㎕를 혼합하여 최종 20 ㎕로 반응을 진행하였다. PCR은 95℃에서 5분간 열변성 후, 95℃ 15초, 58℃ 20초, 72℃ 30초의 사이클을 45회 반복하고, 95℃ 5초, 65℃ 1분 후, 97℃까지 온도를 천천히 올리며 형광을 측정하는 melting 단계를 거쳤다. 반응이 끝난 후, 융해곡선의 형태로 단일 피크 여부를 확인하여 프라이머 특이성을 검정하였다.
5. PCR 효율 검정
PCR 효율은 감귤 cDNA 혼합물을 100 ng부터 1/2씩 차례로 희석한 8개의 주형으로 real time-PCR을 수행하여 얻은 Cp 값과 주형의 로그값으로 그린 그래프의 기울기를 측정함으로써 결정하였다. 측정한 기울기로부터 PCR 효율은 PCR efficiency(%)=(10(1/-slope)-1)×100으로 계산되며, 개별 프라이머들의 PCR 효율은 동일 시료로 3회 반복 측정한 값들의 평균으로 결정하였다. 상기 감귤 cDNA는 클레멘틴의 과피와 과육 및 스위트 오렌지의 과피와 과육의 cDNA 혼합물을 의미한다.
6. Real time-PCR을 통한 유전자 발현 분석
감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자들의 발현 분석은 클레멘틴(C. clementina)과 스위트 오렌지(C. sinensis 'Valencia')의 과피와 과육에서 추출한 RNA를 이용해 진행하였다. real time-PCR은 통계분석을 위해 독립적으로 합성된 3세트의 cDNA 주형에 대해 각각 2회 반복하여 수행하였다. PCR 반응은 cDNA(6.25 ng/㎕) 4 ㎕, 정방향 및 역방향 프라이머(10 μM) 각각 0.4 ㎕, 2x TOPreal qPCR 2x PreMIX(SYBR Green with low ROX; Enzynomics) 10 ㎕ 및 멸균증류수 5.2 ㎕를 혼합한 후, LightCycler® 480 II real time-PCR system(Roche Diagnostics GmbH, 독일)에서 수행하였다. PCR 조건은 95℃에서 5분간 열변성한 후 95℃ 15초, 60℃ 20초, 72℃ 20초 과정을 45회 반복하였고, 증폭 결과는 comparative CT 법을 이용하여 2-(Ct target gene-Ct ACT7) 값을 계산하여 분석하였다.
실시예 1. 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자 발굴
감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자는 모델 식물인 애기장대의 해당 유전자들과 서열 유사도를 기초로 하여 발굴되었다. 카로티노이드 생합성 경로에 관여하는 16개 효소 단백질(표 1)에 대한 애기장대 유전자를 확보하기 위해, TAIR 데이터베이스에서 해당 단백질명을 쿼리로 키워드 검색을 수행한 결과, CCS(capsanthin-capsorubin synthase)를 제외한 총 15개 단백질에 대한 애기장대 유사 유전자 26종(표 2의 Arabidopsis locus)을 확보하였다.
상기 애기장대 유사 유전자 26종이 각각 암호화하는 단백질의 아미노산 서열을 input으로 Phytozome DB에서 BlastP 검색을 통해 감귤 오솔로그(ortholog)를 확보하였고, 확보한 감귤 오솔로그들은 RBH(Reciprocal best hits) 방법에 따라 이들을 input으로 애기장대 유사 단백질들을 재검색하였다.
검색 결과를 종합하여 최종적으로 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자들을 선발하였고, 감귤 유래 CCS 유전자의 경우는 Phytozome DB에서 키워드 검색을 통해 선발하였다. 한편, RBH 방법을 기초로 선발된 유전자와 더불어 감귤 오솔로그를 검색하는 과정에서 score값 100 이상, E-value가 E-10 이하인 오솔로그들 중, 최상위 검색 결과와 score 차이가 150 이하일 경우는 이들을 중복 선발하고, 이들은 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 단백질의 유사 유전자들로 분류하였다. 그 결과, 16개 카로티노이드 생합성 효소 단백질에 대응하는 총 34개의 감귤 카로티노이드 생합성 유전자를 최종 선발하였다(표 2).
실시예 2. 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자 증폭용 프라이머 세트의 제작 및 특이성 검정
상기 선발된 34개의 감귤 유래 카로티노이드 생합성 유전자들 중에서, RBH 방법에 의해 애기장대 유래 카로티노이드 생합성 유전자의 오솔로그로 우선 선발된 감귤 유전자 16개(Ciclev10011841m, Ciclev10005632m, Ciclev10020648m, Ciclev10002974m, Ciclev10011230m, Ciclev10004730m, Ciclev10008410m, Ciclev10011312m, Ciclev10011420m, Ciclev10005481m, Ciclev10025089m, Ciclev10019925m, Ciclev10031039m, Ciclev10014639m, Ciclev10028245m, Ciclev10012575)에 대해 real time-PCR을 위한 프라이머 세트를 제작하였고, 이들의 특이성을 검정하였다(표 3).
상기 프라이머 세트를 이용한 PCR 반응 및 전기영동 후 아가로스 겔에서 확인한 결과, 모든 프라이머들에서 단일증폭 절편이 확인되었고(보유결과 미제시), real time-PCR을 통해 융해곡선을 분석한 결과에서도 단일 피크를 나타내었다(도 2A). 이를 통해, 본 발명의 프라이머 세트들은 각각의 표적 유전자에 특이적으로 결합함을 알 수 있었다.
또한, 감귤 cDNA 혼합물을 이용하여 PCR 효율을 측정한 결과, 본 발명의 프라이머 세트들은 90~123%의 PCR 효율을 나타내었고(도 2B), 이는 real time-PCR 분석과정에서 상대정량 분석을 위해 허용되는 PCR 효율의 범위를 벗어나지 않는 것으로 판단되었다. 따라서, 이후 유전자 발현 분석에서는 comparative Ct 법의 수식(2-(Ct target gene-Ct ACT7))을 변형없이 사용하였다.
실시예 3. 감귤류에서 카로티노이드 생합성 관련 유전자의 발현 분석
본 발명의 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자에 특이적인 프라이머 세트를 클레멘틴(C. clementina) 품종과 스위트 오렌지(C. sinensis 'Valencia') 품종에 적용하여 실효성을 검증하기 위해서, 10월 말에 채집한 완숙전 단계의 두 품종의 과육(fruit flesh)과 과피(fruit peel)에서 각각 RNA를 추출하고, 이를 이용하여 real time-PCR을 통해 카로티노이드 생합성 관련 유전자들의 발현을 분석하였다.
그 결과, 클레멘틴 품종 및 스위트 오렌지 품종의 과육과 과피에서 카로티노이드 생합성 관련 유전자의 발현 수준에 차이가 있음을 확인하였으며(도 3A 및 도 3B), 특히 두 개의 감귤 품종에서 공통적으로 카로티노이드 생합성의 첫 단계를 매개하는 PSY 유전자와 카로티노이드 생합성 경로에 관여하는 HYb, ZEP, NXS 및 CCD 유전자의 발현 수준이 다른 유전자들(PDS, Z-ISO, ZDS, CRTISO, LCYb, LCYe, CYP97A, CYP97C, VDE, CCS, NCED)에 비해 상대적으로 높음을 확인하였다(도 4A 및 도 4B).
도 1의 카로티노이드 생합성 경로에서 발현 수준이 증가된 PSY, HYb, ZEP, NXS 및 CCD 유전자와 관련된 경로들을 보면, HYb와 ZEP 유전자가 과일의 성숙전 단계에서부터 발현이 높게 유지됨으로써 카로티노이드 성분인 비올라잔틴(violaxanthin)과 β-크립토잔틴(β-cryptoxanthin)의 축적이 유도될 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 두 개의 감귤 품종에서 NXS 유전자의 발현 수준이 높게 유지됨으로써 β-cryptoxanthin과 violaxanthin을 네오잔틴(neoxanthin)으로 전환시켜 neoxanthin의 축적이 유도될 수 있음을 알 수 있었다.
또한, 두 개의 감귤 품종에서 CCD 유전자의 발현 수준이 높게 유지됨으로써 β-cryptoxanthin과 제아잔틴(zeaxanthin)으로부터 아포카로티노이드(apocarotenoid)에 속하는 β-시트라우린(β-citraurin)의 합성이 유도될 수 있음을 알 수 있었다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 본 실험에서 사용된 완숙전 단계의 클레멘틴(C. clementina) 품종과 스위트 오렌지(C. sinensis 'Valencia') 품종에서 PSY, HYb, ZEP, NXS 및 CCD 유전자의 발현 수준이 높게 유지되어, β-cryptoxanthin과 violaxanthin 성분이 축적될 뿐만 아니라 이들로부터 neoxanthin 또는 β-citraurin으로의 전환이 활발히 진행되고 있음을 알 수 있다.
본 발명에서는 감귤의 카로티노이드 생합성 경로에 관여하는 유전자들을 체계적으로 발굴하고, 이들의 발현 분석을 위해 real time-PCR을 위한 프라이머 세트를 제작하여 그 효용성을 검증하였다. 제작된 프라이머 세트는 동일한 실험 조건에서 적용할 수 있도록 통일성 있는 매개변수를 바탕으로 설계되었다. 이러한 프라이머 세트들은 real time-PCR에 적합한 PCR 효율을 나타내고, 감귤 품종에서 특이성이 있음이 확인되었다. 따라서, 본 발명에서 개발한 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자들에 특이적인 프라이머 세트들은 분자생물학적 연구를 위한 재료로서 뿐만 아니라 향후 감귤 분자 육종 과정에서 품종간 다양한 카로티노이드 함량을 비교하고, 예측할 수 있게 해주는 중요한 도구로 활용할 수 있을 것이다.
<110> Biomedic Co.,LTD <120> Primer set for predicting carotenoid content of citrus fruit and uses thereof <130> PN21468 <160> 34 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 ttacccggaa ctttaagtct gct 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gtcatcagca aagttcccaa gta 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtgcacaagc aattgtacag gac 23 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 agctccaatt ataaaccctg cct 23 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 cagtcatgag gttgtaatgt tggt 24 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 gtgcaccaat aactttctca ccc 23 <210> 7 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tattattgga gctgggcttg cag 23 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cagaaacccg aaatcaagtt ttgaa 25 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 atgctggaaa catagctcga aag 23 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gtgctcacta taaagcactc tgc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctctgcttaa tggagtcacg gat 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 12 tcttgagacc aaacctaagc tcc 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tcttgattgg tcgtgcttat gga 23 <210> 14 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 acctgactcg acacaccttc tta 23 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 15 ctcatatttg ggatgatgcg gac 23 <210> 16 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 16 cgcaactgct actatgttct caa 23 <210> 17 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 17 gtattgcagg gaagatctgc atc 23 <210> 18 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 18 tcttatcaag acaggaggat gtgg 24 <210> 19 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 19 cacgatggtc tcgttcacaa aag 23 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 20 cttcttcaag ctccttaggt ccg 23 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 21 atgcccttaa tgcttagttg ggt 23 <210> 22 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 22 ttcgtaagtt gtcacttgcc ttg 23 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 23 acaatacctg aggcaaaaga ggt 23 <210> 24 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 24 ctccattcct tcagcacatt tgg 23 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 25 tagactttga tctcccctgg tttc 24 <210> 26 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 26 gatcaacaca acataccttg acact 25 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 27 attcacgctt catggttgtc ag 22 <210> 28 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 28 tgtcagttca gctttaggag caa 23 <210> 29 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 29 gaaaactggc ctagcttcac aaa 23 <210> 30 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 30 catatctttg cttcctgcca gtg 23 <210> 31 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 31 acctgctgac tcaattttca acg 23 <210> 32 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 32 agtttttcta ccaaggctgt tgc 23 <210> 33 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 33 gtggtcgtac aactggtatt gtg 23 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 34 caaacgaaga atggcatgag gaa 23

Claims (6)

  1. 서열번호 1 및 2의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 3 및 4의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 5 및 6의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 7 및 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 9 및 10의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 11 및 12의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 13 및 14의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 15 및 16의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 17 및 18의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 19 및 20의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 21 및 22의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 23 및 24의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 25 및 26의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 27 및 28의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 서열번호 29 및 30의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 31 및 32의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는, 감귤류 카로티노이드 함량 예측용 프라이머 세트 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항의 프라이머 세트 조성물을 포함하는, 감귤류 카로티노이드 함량 예측용 키트.
  4. 제1항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 감귤 유래 카로티노이드 생합성 관련 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는, 감귤류 카로티노이드 함량을 예측하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 감귤류 유래 카로티노이드 생합성 유전자는 PSY(phytoene synthase), PDS(phytoene desaturase), Z-ISO(ζ-carotene isomerase), ZDS(ζ-carotene desaturase), CRTISO(carotenoid isomerase), LCYb(lycopene β-cyclase), LCYe(lycopene ε-cyclase), CYP97A(cytochrome P450-type monooxygenase 97A), CYP97C(cytochrome P450-type monooxygenase 97C), HYb(β-carotene hydroxylase), ZEP(zeaxanthin epoxidase), VDE(violaxanthin de-epoxidase), CCS(capsanthin-capsorubin synthase), NXS(neoxanthin synthase), CCD(carotenoid cleavage dioxygenase) 및 NCED(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제4항에 있어서, 상기 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 실시간 PCR(Real time-PCR), 역전사 중합효소연쇄반응(RT-PCR), 경쟁적 RT-PCR(competitive RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection assay), 노던 블로팅(Northern blotting) 및 DNA 마이크로어레이 칩 방법으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
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