KR102704355B1

KR102704355B1 - 리코칼콘 a를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물

Info

Publication number: KR102704355B1
Application number: KR1020230156640A
Authority: KR
Inventors: 최인호; 이은주; 임정호; 쿠르시드아마드; 샤히드알리; 천희진
Original assignee: 영남대학교 산학협력단
Priority date: 2023-05-23
Filing date: 2023-11-13
Publication date: 2024-09-09
Anticipated expiration: 2043-11-13
Also published as: WO2024242257A1

Abstract

본 발명은 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 리코칼콘 A가 마이오스타틴(myostatin)의 발현을 억제하고, 근아세포 증식, 근관 형성 및 근육세포로의 분화를 촉진하는 것을 확인함으로써, 근육질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물; 또는 근아세포 또는 근육 줄기세포의 근육세포로의 분화 촉진용 조성물로써 유용하게 활용될 수 있다.

Description

리코칼콘 A를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition for preventing or treating muscle diseases comprsing licochalcone A as an active ingredient}

본 발명은 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

근육(muscle)은 인체를 구성하는 중요한 요소로, 중배엽의 줄기세포에서 발현되는 조직이다. 근육은 우리 몸의 40% 정도를 담당하며, 뼈와 힘줄에 지지해서 위치하고 근섬유 다발들로 이루어져 서로 움직이고 세포의 크기를 변하도록 하여 수축을 유발한다. 근육은 골격근육, 심장근육 및 내장근육으로 구분되는데, 각각의 위치에서 힘을 만들어내고 움직임을 유발하며, 뼈, 관절, 내장 등의 신체기관을 보호하는 역할도 한다. 또한, 근육은 재생능력을 가지고 있어, 근육이 손상을 받게 되면 위성세포와 그 주변 환경에 의해서 변성된 후 다시 원래의 수축 이완 능력을 가진 근육으로 재생될 수 있다.

근육질환은 선천적인 유전이나 환경적인 원인에 의해서 발생되며, 최근 고령화 사회 및 수명 연장의 흐름에 따라 근 감소와 관련된 질환이 증가하고 있다. 사람의 근육은 40세 이후부터 매년 1% 이상씩 감소하고, 80세가 되면 최대 근육량의 50% 수준이 감소됨으로써, 노년의 근육 감소는 전반적인 신체기능을 떨어뜨리는 가장 중요한 원인으로 인식되고 있다. 이러한 근육질환은 과거에 비해 전 세계적으로 증가 추세에 있다.

하지만, 근육질환은 그 원인이 다른 질환에 비해 다양하기 때문에 정확한 진단이 쉽지 않고, 그 종류에 따라 증상 및 질환의 강도도 다양하며, 희귀 질환의 형태로 정확한 메커니즘이 밝혀지지 못한 경우가 많다. 근육질환은 그 증상이 급격하게 진행되고, 근육질환 환자들은 상기 질환이 진행됨에 따라 혼자서는 일상적인 생활이 어려울 정도로 고통받고 있으나, 근본적인 관련 질환에 대한 치료제들은 거의 없는 실정이다.

1. 대한민국 공개특허 KR 10-2014-0094962(2014.07.31. 공개)

본 발명의 목적은 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근아세포 또는 근육 줄기세포의 근육세포로의 분화 촉진용 시약 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 인간을 제외한 개체에 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 처리하는 단계를 포함하는, 근아세포 또는 근육 줄기세포의 근육세포로의 분화 촉진 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근아세포 또는 근육 줄기세포의 근육세포로의 분화 촉진용 시약 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 인간을 제외한 개체에 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 처리하는 단계를 포함하는, 근아세포 또는 근육 줄기세포의 근육세포로의 분화 촉진 방법을 제공한다.

본 발명에 따르면, 리코칼콘 A(Licochalcone A)가 마이오스타틴(myostatin)의 발현을 억제하고, 근아세포 증식, 근관 형성 및 근육세포로의 분화를 촉진하는 것을 확인함으로써, 근육질환 예방, 치료 또는 개선용 조성물; 또는 근아세포 또는 근육 줄기세포의 근육세포로의 분화 촉진용 조성물로써 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 리코칼콘 A(Licochalcone A; 이하 Lic A라 함), 마이오스타틴(myostatin; 이하 MSTN이라 함) 및 ACVRIIB(Activin receptor type-2B)의 상호작용을 분석한 결과이다. 도 1A는 MSTN+Lic A 복합체이고, 도 1B는 MSTN+ACVRIIB 복합체이고, 도 1C는 MSTN+Lic A+ACVRIIB 복합체이다.
도 2는 정상 근육조직 및 근육 줄기세포에서 Lic A가 미치는 영향을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 2A는 Lic A를 경구 처리한 마우스 모델 유래 근육조직을 염색한 후, 근육 직경을 측정한 결과이고, 도 2B 및 2C는 상기 근육조직에서 근육 관련 인자의 단백질 발현을 각각 조직면역염색법(Immunohistochemistry) 및 웨스턴 블롯(Western blot)으로 분석한 결과이며, 도 2D는 마우스 유래 근육 줄기세포를 Lic A가 포함된 배지에서 2일 동안 배양한 후, 근육 관련 인자의 유전자 및 단백질 발현을 실시간 PCR(real-time PCR) 및 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다. 실험 결과는 모두 평균±표준편차(Mean±SD)로 나타냈다(n=6). *P≤0.05, **P≤0.001, ***P≤0.0001.
도 3은 Lic A가 근육세포 증식에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 3A는 Lic A를 포함하는 증식 배지에서 배양한 근육세포를 MTS 분석으로 세포 증식을 분석한 결과이고, 도 3B는 상기 근육세포에서 근육 관련 인자의 유전자 및 단백질 발현을 실시간 PCR(real-time PCR) 및 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다. 실험 결과는 모두 평균±표준편차(Mean±SD)로 나타냈다(n≤35). *P≤0.05, **P≤0.001, ***P≤0.0001.
도 4는 Lic A가 근육세포 분화에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 4A는 Lic A를 포함하는 분화 배지에서 배양한 근육세포에서 근육 관련 인자의 단백질 발현을 면역형광염색법으로 분석한 결과이고, 도 4B는 상기 근육세포에서 크레아틴 키네이스(creatine kinase) 활성을 분석한 결과이며, 도 4C는 상기 근육세포에서 근육 관련 인자의 유전자 및 단백질 발현을 실시간 PCR(real-time PCR) 및 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다. 실험 결과는 모두 평균±표준편차(Mean±SD)로 나타냈다(n≤35). *P≤0.05, **P≤0.001, ***P≤0.0001.
도 5는 Lic A가 노화된 근육세포 증식에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 5A는 Lic A를 처리한 노화된 근육세포의 세포 증식을 MTS 분석으로 분석한 결과이고, 도 2B는 상기 근육세포에서 근육 관련 인자의 유전자 발현을 실시간 PCR(real-time PCR)로 분석한 결과이며, 상기 근육세포에서 근육 관련 인자의 단백질 발현을 웨스턴 블롯으로 분석한 결과이다. 실험 결과는 모두 평균±표준편차(Mean±SD)로 나타냈다(n≤35). *P≤0.05, **P≤0.001, ***P≤0.0001.
도 6은 리코칼콘 C(Licochalcone C; 이하 Lic C라 함)가 근육세포 증식 및 분화에 미치는 영향을 분석한 결과이다. 구체적으로, 도 6A는 Lic C가 포함된 증식 배지에서 배양한 근육세포의 세포 증식을 MTS 분석으로 분석한 결과이고, Lic C가 포함된 분화 배지에서 배양한 근육세포의 크레아틴 키네이스(creatine kinase) 활성을 분석한 결과이다. 실험 결과는 모두 평균±표준편차(Mean±SD)로 나타냈다(n≤35). *P≤0.05, **P≤0.001, ***P≤0.0001.

이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.

본 발명은 리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

상기 리코칼콘 A는 근아세포 증식, 근관 형성 또는 근육세포로의 분화를 촉진할 수 있다.

또한, 상기 리코칼콘 A는 크레아틴 키네이스(creatine kinase) 활성을 촉진할 수 있다.

또한, 상기 리코칼콘 A는 Ki67, Cyclin A2, MYL2(myosin light chain 2) 및 미오신 중쇄(myosin heavy chain)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현을 촉진할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 리코칼콘 A는 마이오스타틴(myostatin), Atrogin 1, ACVRIIB(Activin receptor type-2B) 및 MuRF(muscle RING-finger protein-1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현을 억제할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 근육질환은 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육감소증(sarcopenia), 근육병증(myopathy), 근무력증(myasthenia) 및 근육 손상(muscular injury)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸 히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 약학 조성물에 포함되는 첨가제의 함량은 특별히 한정되는 것은 아니며 통상의 제제화에 사용되는 함량 범위 내에서 적절하게 조절될 수 있다.

상기 약학 조성물은 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립, 정제, 크림, 젤, 패취, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 및 카타플라스마제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 피부 외용제 형태로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 제형화를 위해 추가로 있는 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 전분, 당 및 만니톨과 같은 부형제, 칼슘 포스페이트 등과 같은 충전제 및 증량제, 카르복시메틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스 등과 같은 셀룰로오스 유도체, 젤라틴, 알긴산염, 폴리비닐 피롤리돈 등과 같은 결합제, 활석, 스테아린산 칼슘, 수소화 피마자유 및 폴리에틸렌글리콜과 같은 윤활제, 포비돈 및 크로스포비돈과 같은 붕해제, 폴리소르베이트, 세틸알코올, 글리세롤 등과 같은 계면활성제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체 및 희석제는 대상체에게 생물학적 및 생리학적으로 친화적인 것일 수 있다. 희석제의 예로는 염수, 수용성 완충액, 용매 및/또는 분산제(dispersion media)를 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있다. 경구 투여일 경우, 정제, 트로키제(troches), 로젠지(lozenge), 수용성 현탁액, 유성 현탁액, 조제 분말, 과립, 에멀젼, 하드 캡슐, 소프트 캡슐, 시럽, 엘릭시르제 등으로 제형화될 수 있다. 비경구 투여일 경우, 주사액, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 연고, 도포용 파우더, 오일, 크림 등으로 제형화 될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 투여량은 환자의 상태, 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이 체질 특이성, 제제의 성질, 질병의 정도, 조성물의 투여시간, 투여방법, 투여기간 또는 간격, 배설율 및 약물 형태에 따라 그 범위가 다양할 수 있으며, 이 분야 통상의 기술자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예컨대, 약 0.1 내지 10,000mg/kg의 범위일 수 있으나 이제 제한되지 않으며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여될 수 있다.

상기 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여되거나 비경구 투여(예를 들면, 정맥 내, 피하 내, 복강 내 또는 국소에 적용)될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 약학적 유효량 및 유효 투여량은 약학 조성물의 제제화 방법, 투여 방식, 투여 시간, 투여 경로 등에 의해 다양해질 수 있으며, 당해 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 목적하는 치료에 효과적인 투여량을 용이하게 결정하고 처방할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여는 하루에 1회 투여될 수 있고, 수회에 나누어 투여될 수도 있다.

본 발명은 통상적으로 이용되는 식품으로써 일반적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 건강기능식품으로서 사용될 수 있다. 상기 “건강기능식품”이라 함은 건강기능 식품에 관한 법률에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, “기능성”이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

상기 건강기능식품 조성물은 통상의 식품 첨가물을 포함할 수 있으며, 상기 “식품 첨가물”로서의 적합 여부는 다른 규정이 없는 한, 식품의약품안전처에 승인된 식품 첨가물 공전의 총칙 및 일반시험법 등에 따라 해당 품목에 관한 규격 및 기준에 의하여 판정한다.

상기 “식품 첨가물 공전”에 수재된 품목으로는 예를 들어, 케톤류, 글리신, 구연산칼륨, 니코틴산, 계피산 등의 화학적 합성물, 감색소, 감초추출물, 결정셀룰로오스, 고량색소, 구아검 등의 천연첨가물, L-글루타민산나트륨 제제, 면류첨가알칼리제, 보존료제제, 타르색소제제 등의 혼합제제류들을 들 수 있다.

본 발명의 식품 조성물은 정제, 캡슐, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조 및 가공할 수 있다. 예를 들어, 캡슐 형태의 건강기능 식품 중 경질 캡슐제는 통상의 경질 캡슐에 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합 및 충진 하여 제조할 수 있으며, 연질 캡슐제는 본 발명에 따른 조성물을 부형제 등의 첨가제와 혼합하고 젤라틴 등 캡슐기제에 충진하여 제조할 수 있다. 상기 연질 캡슐제 는 필요에 따라 글리세린 또는 소르비톨 등의 가소제, 착색제, 보존제 등을 함유할 수 있다.

상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향제 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한이 없으며, 통상적인 의미에서의 건강 기능식품을 모두 포함한다.

본 발명에서 용어 “예방”은 본 발명에 따른 조성물의 투여로 근육질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어 “치료”는 본 발명에 따른 조성물의 투여로 근육질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 말한다.

본 발명에서 용어 “개선”은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하거나 섭취시켜 근육질환의 나쁜 상태를 좋게 하는 모든 행위를 의미한다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

[ 실험예 1] 인실리코 ( In silico ) 분석

MSTN(myostatin)의 3D 구조(PDB ID: 3HH2)는 단백질 데이터에서 얻었고, 헤테로 원자와 물 분자를 제거한 후, 추가 분자 도킹 연구를 위해 Discovery Studio 2021(DS)를 사용하여 MSTN의 단량체를 준비하였다. Auto Dock 4.2는 선택한 화합물을 MSTN의 활성 사이트에 도킹하는 데 사용하였다. 또한, ACVRIIB(Activin receptor type-2B)(PDB ID: 1S4Y)의 3D 구조를 검색하여 MSTN과의 단백질-단백질 상호작용(PPI) 연구에 사용하였다. MSTN 및 ACVRIIB 간의 PPI 연구 및 ACVRIIB와 MSTN-Lic A의 복합체는 PatchDock 웹 서버를 사용하여 수행하였고, FireDock을 사용하여 정제 및 순위를 지정하였다. 복합체(MSTN-Lic A 및 MSTN-ACVRIIB-Lic A)의 베스트 포즈를 최종 분석에 사용하였으며, 시각화 도구 PyMOL 및 DS는 도킹 결과의 모든 시각적 평가를 수행하는 데 사용하였다.

[ 실험예 2] 마우스 실험

C57BL/6 수컷 마우스(생후 6주)를 효창 과학에서 구입하였다. Lic A가 근육에 미치는 영향을 확인하기 위해, 6주 된 마우스에 Lic A(3mg/kg)를 11일 동안 하루에 한 번 투여하였다. 11일 후 비복근 및 혈장을 수집하였다.

[ 실험예 3] 팔로이딘 염색

상기 실험예 2에서 수집한 비복근 및 혈장의 세포를 4% 포름알데하이드(formaldehyde)로 10분간 고정하고, 생리식염수로 세척한 후, 팔로이딘(phalloidin)(1:400)으로 염색하였다. 그 후, 디지털카메라가 장착된 형광현미경으로 관찰하였다.

[ 실험예 4] H&E 염색 및 근섬유 직경 분석

상기 실험예에서 수집한 비복근(근육 절편)을 파라핀(paraffin)으로 포매하고, 자일렌(xylene)을 사용하여 탈파라핀화하고, 에탄올의 농도 구배를 사용하여 재수화(rehydration)한 후, H&E(hematoxylin & eosin)로 염색하였다. 그 후, 광학 현미경으로 관찰하고 400x 비율로 확대하여 사진을 찍은 후, 근섬유의 직경을 Image J 소프트웨어를 사용하여 측정하였다.

[ 실험예 5] 조직면역염색법( Immunohistochemistry )

파라핀이 함유된 근육조직에 각각 자일렌 및 에탄올로 디파라핀화(deparaffinization)하고, 수분을 공급한 후, 내생성 과산화효소 활성(endogenous peroxidase activity)을 중지하기 위해, 0.3% H₂O₂/메탄올에서 15분 동안 조직을 담궈 두었다. 그 후, 형태학 관찰을 위해 H&E로 염색하거나, 1%의 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 비특이적 항체와의 반응을 차단하기 위해 조직과 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 1차 항체(1:50)와 16시간 이상 4℃에서 반응시켰다. 16시간 후 PBS(phosphate buffer saline)로 3번 세척하고, HRP(horse radish peroxidase)가 부착된 2차 항체(1:100)를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. HRP가 부착된 스트렙트아비딘(streptavidin)을 첨가하여 단백질 발현을 현미경을 통해 관찰하였다.

[ 실험예 6] 조직면역형광염색법 ( Immunohistochemistry )

파라핀이 함유된 근육조직에 각각 자일렌 및 에탄올로 디파라핀화(deparaffinization)하고, 수분을 공급한 후, 내생성 과산화효소 활성(endogenous peroxidase activity)을 중지하기 위해, 0.3% H₂O₂/메탄올에서 15분 동안 조직을 담궈 두었다. 그 후, 형태학 관찰을 위해 H&E로 염색하거나, 1%의 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 비특이적 항체와의 반응을 차단하기 위해 조직과 1시간 동안 실온에서 반응시킨 후, 1차 라미닌 항체(1:50)와 16시간 이상 4℃에서 반응시켰다. 16시간 후 PBS(phosphate buffer saline)로 3번 세척하고, 2차 항체(Alexa Fluor 594 goat anti-Mouse SFX kit)와 1시간 동안 방치하였다. 1시간 후 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 세척한 후 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindol)로 핵을 염색하고 형광현미경을 이용하여 단백질의 발현을 관찰하였다.

[ 실험예 7] 마우스 근육 줄기세포 분리

6주 된 C57BL/6 마우스의 비복근을 채취하여 잘게 다지고, 1% 프로네이스(pronase) 효소로 37℃에서 1시간 동안 소화시킨 후, 1,000g에서 3분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)에 10% 소태아혈청(Fetal bovine serum; 이하 FBS라 함) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(이하 P/S라 함)이 포함된 배지를 첨가하여 조직을 부유시킨 후, 100μm 스트레이너(strainer)를 이용하여 조직과 세포층을 분리하였다. 분리한 세포층은 1,000g에서 5분 동안 원심분리하고, 형성된 상층액을 버린 후, DMEM에 10% FBS 및 1% P/S가 포함된 배지(증식 배지)를 첨가하여 세포층을 부유시킨 후, 1,000g에서 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리 후 상층액을 버리고 남아있는 세포층에 Ham's F-10에 20% FBS, 1% P/S 및 5ng/mL FGF2(Fibroblast Growth Factor 2)가 포함된 증식 배지를 첨가하여 부유시킨 후, 콜라젠(collagen)이 코팅된 세포배양 접시에 세포를 넣은 후 37℃에서 배양하였다.

[ 실험예 8] 근육세포 증식 및 분화 분석

8-1. 근육세포 증식 분석

Lic A가 근육세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해, C2C12 세포를 10% FBS 및 1% P/S를 포함하는 DMEM에서 배양하고, 상기 세포(2×10³ cells/mL)를 12 웰 플레이트에 넣고 24시간 동안 부착시킨 후, Lic A(1ng/mL)를 1일 동안 처리하고, MTS 분석을 수행하여 세포 증식을 분석하였다. MTS 분석은 세포 내 배양 배지를 제거하고, CellTiter 96 Aqueous One Solution Reagent가 포함된 증식 배지를 첨가한 후, CO₂ 배양기에서 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 1시간 후 490nm에서 흡광도를 측정하였다.

8-2. 근육세포 분화

Lic A가 근육세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해, 마우스 근육 줄기세포 또는 C2C12 세포가 100% 성장하였을 때 분화 배지(DMEM + 2% FBS + 1% P/S) 및 Lic A(1ng/mL)를 2일(마우스 근육 줄기세포) 또는 4일(C2C12 세포) 동안 처리하여 세포를 분화하였다.

8-3. 근육세포 분화 분석

세포 분화 분석을 위해, 배지를 제거하고 생리식염수로 C2C12 세포를 세척하였다. 세척한 세포에 PBS(200㎕ 생리식염수/6 웰 플레이트)를 넣고 세포를 긁어모은 후 음파처리(sonication)하고 원심분리(10,000g, 5분)하여 상층액을 새 튜브에 모았다. 크레아틴 키네이스(Creatine kinase) 활성 분석을 위해, 효소, 기질 및 완충재를 섞은 혼합물(반응: 효소 1㎕ + 기질 10㎕ + 완충재 100㎕)과 10㎕의 샘플(세포를 모은 후 원심분리를 하여 모은 상층액)을 섞고 방치한 후, 340nm에서의 흡광도를 반응 시작 후 20분과 25분에 각각 측정하고, 하기 수학식 1을 이용하여 크레아틴 키네이스 활성 값(U/L)을 계산하였다. 계산 후 아무것도 처리하지 않은 값을 100%로 두고 Lic A를 처리한 세포의 상대값을 계산하였다.

[수학식 1]

크레아틴 키네이스 ( Creatine kinase ) 활성(U/L) = [(25분 O.D 값 - 20분 O.D 값)/(calibrator O.D 값 - 증류수 O.D 값)]×600

[ 실험예 9] RNA 추출 및 cDNA 합성

트리졸(TRIzol™) 시약 1mL를 첨가하고, 초고주파 분쇄기(sonicator)를 이용하여 세포를 분쇄하였다. 분쇄한 세포를 원심분리하고(12,000rpm, 10분, 4℃), 상층액을 새 튜브에 옮긴 후, 클로로포름(chloroform) 200㎕를 넣고 실온에 10분 동안 방치하였다. 10분 후 원심분리하여(12,000rpm, 10분, 4℃) 투명색의 상층액을 수득하였다. 그 후, 이소프로판올(isopropanol) 500㎕를 넣고 10분 동안 방치한 후 원심분리하여 RNA 펠렛을 얻었다. RNA 펠렛에 70% 에탄올[에탄올 + 디에틸피로카르본산(diethylpyrocarbonate; 이하 DEPC라 함)이 처리된 증류수]을 첨가하여 세척 한 후, 완벽하게 제거하고 건조시켰다. 건조된 투명색의 RNA에 DEPC가 처리된 증류수를 넣고 -80℃에 보관하였다. 전체 RNA 양은 나노드롭(Nanodrop)으로 측정하였다. cDNA는 2μg의 총(total) RNA와 random hexamer 프라이머 및 역전사효소(Reverse Transcriptase)를 이용하여 합성하였다(25℃에서 10분, 37℃에서 120분 및 85℃에서 5분).

[ 실험예 10] 근육 관련 인자 발현 분석

10-1. 유전자 발현 분석

Lic A가 근육 관련 인자의 유전자 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, 실시간 PCR(real-time PCR)을 수행하였다, SYBR 그린(green)의 형광물질을 포함한 Power SYBR　Green PCR Master Mix를 이용하여 유전자 발현을 분석하였다(7500 real-time PCR system). PCR 프라이머는 NCBI GenBank에서 확보된 염기서열(nucleotide sequence)에 따라 Primer 3 software(http://frodo.wi.mit.edu)로 디자인하였다. PCR은 95℃에서 10분, 다시 95℃에서 33초, 유전자 프라이머 온도(tm)에 따라 33초, 72℃에서 33초 동안 40회 반응을 진행하였다. 실시간 PCR 분석을 통해 나온 c(t) 값을 fold change 2-^△△Ct 식을 통해 유전자 발현 값을 분석하였다. Lic A를 처리하지 않은 세포의 유전자 발현 값을 1로 설정하고, Lic A를 처리한 세포의 유전자 발현 값을 계산하였다. 유전자 c(t) 값 분석 시 평준화(normalization)는 GAPDH(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) 유전자를 이용하였다. 상기 PCR 프라이머의 서열은 표 1과 같다.

프라이머	크기(bp)	온도(℃)	Forward	Reverse
GAPDH	155	59	5'-tgctggtgctgagtatgtcg-3'	5'-caagcagttggtggtacagg-3'
MSTN	163	59	5'-acgctaccacggaaacaatc-3'	5'-ggagtcttgacgggtctgag-3'
MYL2	177	59	5'-aaagaggctccaggtccaat-3'	5'-cctctctgcttgtgtggtca-3'
MYH	248	59	5'-gggttccattgacattgacc-3'	5'-agggccagtgtttcacattc-3'
Atrogin1	160	59	5'-ttcagcagcctgaactacga-3'	5'-tgaaagcttcccccaaagta-3'
MuRF1	206	59	5'-tgaggtgcctacttgctcct-3'	5'-tcacctggtggctattctcc-3'
ACVRIIB	197	59	5'-aacttccagagagacgcctt-3'	5'-atcgtgggcctcatcttctt-3'
Ki67	247	59	5'-cagacttgctctggcctacc-3’	5'-gccgttccttgatgattgtc-3’
CyclinA2	227	59	5'-ctgtctctttacccggagca-3’	5'-agtgatgtctggctgcctct-3’
MSTN : myostatin MYL2 : myosin light chain 2 MYH : myosin heavy chain MuRF1 : muscle RING-finger protein-1

10-2. 단백질 발현 분석 1

Lic A가 근육 관련 인자의 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯(Western blot) 분석을 수행하였다. C2C12 세포의 배지를 제거하고, PBS로 세척하였다. 세척한 세포에 RIPA 버퍼와 단백질분해효소 억제제를 넣은 후 12000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 상층액에 포함된 단백질을 수집하였다. 추출한 단백질 중 40~60μg을 8~10%의 아크릴아마이드 겔(Acrylamide gel)에서 전기영동하고, PVDF 멤브레인(Polyvinylidene fluoride membrane, Milipore)에 옮겼다. 이를 3% 탈지유(skim milk)나 소혈청 알부민(bovine serum albumin; 이하 BSA라 함)으로 1시간 동안 실온에서 블로킹(blocking)하였다. 그 후, 1% 탈지유 또는 BSA에 희석한 1차 항체(MYL2; 1:1000, MYH; 1:500, MSTN; 1:1000, Atrogin1; 1:500, MuRF1; 1:500, ACVRIIB; 1:500, Ki67; 1:500, Cyclin A2; 1:500 및 ß-actin: 1:1000)를 첨가하고 16시간 이상 4℃에서 반응시켰다. 16시간 후 TBST(Tween 20이 포함된 Tris-Buffered Saline)로 3번 세척하고, HRP(horseradish peroxidase)가 부착된 2차 항체를 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 이를 TBST로 3번 세척하고 Super Signal West Pico Chemiluminescent Substrate를 넣어준 후 현상하였다.

10-3. 단백질 발현 분석 2

Lic A가 근육 관련 인자의 단백질 발현에 미치는 영향을 확인하기 위해, 세포조직면역염색법(Immunocytochemistry)을 수행하였다. 배양한 C2C12 세포의 배지를 제거하고 PBS로 1번 세척하였다. 세척한 세포에 4% 포름알데하이드(formaldehyde, Sigma)를 처리하여 15분간 세포를 고정한 후, PBS를 이용하여 세포를 세척하고 0.2% 트립톤(tipton) X-100(Sigma)을 넣은 후 5분간 방치하였다. 다시 생리식염수를 이용하여 세척하고 1%의 정상 염소 혈청(normal goat serum)을 넣고 30분간 방치한 후 1차 항체(MYL2 및 MYH, 1:50)를 넣고 4℃에서 14시간 동안 반응시켰다. 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 3번 세척한 후, 2차 항체(Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse & rabbit SFX kit)와 1시간 동안 방치하였다. 1시간 후 항체를 제거하고 PBS로 10분 동안 세척한 후 DAPI(4′,6-diamidino-2-phenylindol)로 핵을 염색하고 형광현미경을 이용하여 단백질의 발현을 관찰하였다.

[ 실험예 11] 통계분석

정규화된 유전자 발현의 평균 간의 차이의 유의성은 Tukey의 스튜던트화 범위(HSD; Honestly Significant Difference) 및 T 검정(T-test)를 사용하여 결정하였다. 내부 대조군에서는 GAPDH를 사용하였으며, 통계분석은 SAS ver. 9.0 프로그램으로 분석하였다. p≤0.05의 값은 통계적 유의성을 나타내는 것으로 간주하였다.

[ 실시예 1] Lic A, MTSN 및 ACVRIIB의 상호 작용 분석

수용체 ACVRIIB와 MSTN의 결합 효율에 대한 Lic A의 효과를 확인하기 위해, MSTN와 Lic A의 분자 도킹을 수행하고, ACVRIIB와 도킹된 복합체의 단백질-단백질 도킹을 수행하였다. 그 결과, 도 1에 나타난 바와 같이, MSTN+Lic A 복합체의 결합 에너지는 -6.9kcal/mol이고, MSTN+ACVRIIB 복합체의 결합 에너지는 -59.97kcal/mol이며, MSTN+ACVRIIB+Lic A 복합체의 결합 에너지는 -52.71kcal/mol인 것을 확인하였다.

[ 실시예 2] 정상 근육조직 및 근육 줄기세포에서 Lic A 효과 분석

마우스에 Lic A를 11일 동안 경구 투여하고, H&E, 팔로이딘 및 라미닌 염색을 한 후, 근섬유 직경을 측정하고, 근육 관련 인자 단백질 발현을 분석하였다. 그 결과, 도 2A~2C에 나타난 바와 같이, Lic A 처리군(126.9㎛)은 대조군(미처리군, 101.5㎛)에 비해 근섬유 직경이 증가하였고, MSTN, ACVRIIB, Atrogin1 및 MuRF1 단백질 발현이 감소하는 것을 확인하였다.

또한, 마우스 분화에 따른 Lic A 효과를 확인하기 위해, 마우스 근육 줄기세포를 분리하고, 분화 유도 시 Lic A가 포함된 분화 배지에서 2일 동안 배양한 후, 근육 관련 인자의 발현을 분석하였다. 그 결과, 도 2D에 나타난 바와 같이, Lic A가 MSTN, Atrogin1 및 MuRF1의 유전자 및 단백질 발현을 억제하고, MYH의 유전자 및 단백질 발현을 촉진하는 것을 확인하였다.

[ 실시예 3] 근육세포 증식 및 분화 분석

3-1. 근육세포 증식 분석

Lic A가 근육세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해, C2C12 세포를 Lic A가 포함된 증식 배지에서 하루 동안 배양하고, 세포 증식 및 근육 관련 인자 발현을 분석하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, Lic A가 세포 증식과 Ki67 및 Cyclin A2의 유전자 및 단백질의 발현을 촉진하고, MSTN, Atrogin1 및 MuRF1의 유전자 및 단백질 발현을 억제하는 것을 확인하였다.

3-2. 근육세포 분화 분석

Lic A가 근육세포 분화에 미치는 영향을 확인하기 위해, C2C12 세포를 Lic A가 포함된 분화 배지에서 4일 동안 배양하였다. 그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이, Lic A가 크레아틴 키네이스(creatine kinase) 활성과 MYL2 및 MYH 발현을 촉진하고, MSTN, Atrogin1 및 MuRF1의 발현을 억제하는 것을 확인하였다.

3-3. 노화된 근육세포 증식 분석

Lic A가 노화된 근육세포 증식에 미치는 영향을 확인하기 위해, C2C12 세포에 세라마이드(ceramide, 50μM)를 2일 동안 배양한 후 계대배양을 수행하였다. 계대배양 1일 후 Lic A를 처리하고 증식시키고, 세포 증식 및 근육 관련 인자 발현을 분석하였다. 그 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, Lic A가 세포 증식을 촉진하고, MSTN, Atrogin1 및 MuRF1의 유전자 및 단백질 발현을 억제하는 것을 확인하였다.

3-4. Lic C의 근육세포 증식 효과 분석

Lic A 및 Lic C의 근육세포 증식 효과를 비교하기 위해, C2C12 세포를 Lic C가 포함된 증식 배지에서 하루 동안 배양한 후 MTS 분석을 통해 세포 증식을 측정하였다. 그 결과, 도 6A에 나타난 바와 같이, Lic C는 근육세포 증식에 유의한 효과를 나타내지 않았다.

또한, Lic C의 근육세포 분화 효과를 확인하기 위해, C2C12 세포를 Lic C가 포함된 분화 배지에서 4일 동안 배양하여 크레아틴 키네이스 활성을 분석하였다. 그 결과, 도 6B에 나타난 바와 같이, Lic C는 크레아틴 키네이스 활성을 약 8.5% 억제하는 것을 확인하였다. 상기 결과로부터, Lic C는 근육세포 증식에는 유의미한 영향을 나타내지 않고, 근육세포 분화를 억제하는 것을 확인하였다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 즉, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다.

Claims

리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 치료용 약학 조성물로서,
상기 근육질환은 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육감소증(sarcopenia), 근육병증(myopathy), 근무력증(myasthenia) 및 근육 손상(muscular injury)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리코칼콘 A는 근아세포 증식, 근관 형성 또는 근육세포로의 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리코칼콘 A는 크레아틴 키네이스(creatine kinase) 활성을 촉진하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리코칼콘 A는 Ki67, Cyclin A2, MYL2(myosin light chain 2) 및 미오신 중쇄(myosin heavy chain)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현을 촉진하는 특징으로 하는 약학 조성물.
제1항에 있어서, 상기 리코칼콘 A는 마이오스타틴(myostatin), Atrogin 1, ACVRIIB(Activin receptor type-2B) 및 MuRF(muscle RING-finger protein-1)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
삭제
리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근육질환 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로서,
상기 근육질환은 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근육감소증(sarcopenia), 근육병증(myopathy), 근무력증(myasthenia) 및 근육 손상(muscular injury)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상인 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물.
리코칼콘 A(Licochalcone A)를 유효성분으로 포함하는 근아세포 또는 근육 줄기세포의 근육세포로의 분화 촉진용 시약 조성물.
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