KR102736620B1 - 스트렙토코커스 뮤탄스 억제 및 항염증 효능을 갖는 신규한 락토바실러스 애시도필러스 균주 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 락토바실러스 애시도필러스 균주에 관한 것으로, 상기 균주는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)를 억제할 뿐만 아니라, 항균, 항염증 효능을 가쳐 구강 내 환경을 개선시키는 식물유래 유산균분말의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로는 스트렙토코커스 뮤탄스를 직접적으로 억제하며 항염증효과를 가져 염증으로 인한 잇몸병의 유발억제 등 구강환경을 개선시킬 수 있는 식물유래 유산균의 제조방법에 관한 것이다.

Description

스트렙토코커스 뮤탄스 억제 및 항염증 효능을 갖는 신규한 락토바실러스 애시도필러스 균주 및 이의 용도{Novel Lactobacillus acidophilus strain having Streptococcus mutans inhibition and anti-inflammatory effect and use thereof}

본 발명은 구강내에서 충치 및 치주질환을 유발하는 미생물인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)을 억제하며 항염증효능이 인정되어 구강 내 환경을 개선시키는 식물유래의 신규한 락토바실러스 애시도필러스 유산균 및 이의 용도에 관한 것이다.

예로부터 건강한 치아는 오복 중 하나라는 말이 있을 정도로 치아는 건강을 판단하는 가장 큰 지표 중 하나였다. 그러나 2020년도 건강보험심사평가원의 통계자료를 보면 전체 인구 중 30% 이상은 충치(치아우식) 또는 잇몸병(치주질환을) 보유하고 있을 정도로 충치 및 잇몸병은 흔한 질환이다. 그 중 치아우식증은 구강 내 존재하는 세균, 특히 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)로 인하여 유발되는 질병으로 충치가 지속되면 치주염으로 발전한다. 스트렙토코커스 뮤탄스가 구강관리에 있어 중요한 점은 스트렙토코커스 뮤탄스가 탄수화물을 대사하는 과정에서 형성하는 바이오필름(Biofilm) 때문이다. 스트렙토코커스 뮤탄스는 글루코실트랜스퍼레이즈(Glucosyltransferase)와 같은 효소를 분비하여 전분, 당 등의 탄수화물을 기질로 불용성 글루칸(Glucan)을 생성하는데 이러한 불용성 글루칸(Glucan)은 끈적한 물성을 가지며 치아에 각종 세균을 달라붙게 하는 바이오필름이 된다. 일단 치아 표면에 바이오필름이 형성되면 충치원인균인 스트렙토코커스 뮤탄스 뿐만 아니라 치주질환 원인균인 포르피로모너스 진지발리스(Porphyromonas gingivalis)와 같은 다른 구강 유해균도 부착된다. 바이오필름에 다른 구강유해균이 부착되어 군집형태를 이룬 것이 치태(dental plaque)인데 이 상태에서는 스트렙토코커스 뮤탄스가 치아 표면에서 산에 의해 치아의 칼슘질이 빠져나가는 탈회반응이 일어나 치아가 부식되게 된다. 더 심각한 것은 스트렙토코커스 뮤탄스가 분비한 산이 흘러내리거나 사라지는 것이 아니라 치태(dental plaque)에 남아 지속적으로 치아를 약화시킨다는 것이다. 이러한 상태가 지속되면 치아에서 탈회된 칼슘질이 치태에 합쳐지게 되어 치석(dental calculus)을 형성하게 되고 치아와 치석 사이는 혐기상태가 되어 절대혐기균인 포르피로모너스 진지발리스와 조건부 혐기균인 스트렙토코커스 뮤탄스가 더욱 잘 자라게 되고 이로 인해 잇몸염증이 발생, 심화되게 된다.

위와 같은 기전에 따라 기존에는 충치 예방을 위해 바이오필름을 제거하거나 바이오필름 생성억제, 구강미생물 제거의 방법이 사용되고 있으나 그 한계가 명백하다. 바이오필름 제거 방법은 우리가 알고 있는 양치, 치실을 하는 것으로 장소에 제약이 있어 음식물 섭취 직후 바로 시행하기가 어려울 뿐더러 치아 사이, 잇몸 틈과 같은 곳은 칫솔, 치실로 잘 닿지 않기 때문에 바이오필름의 제거가 용이하지 않다. 바이오필름 생성억제 방법은 당알콜의 일종인 자일리톨을 섭취하는 방법으로 자일리톨은 스트렙토코커스 뮤탄스가 바이오필름을 생성하는데 이용되지 않기 때문에 바이오필름생성의 억제가 가능하나 자일리톨이 아닌 다른 탄수화물을 섭취할 경우 다시 바이오필름을 형성하므로 지속적인 효과를 보기 위해서는 자일리톨 외 다른 탄수화물은 섭취하지 말아야 한다는 결론에 도달하기 때문에 충치예방 등 구강개선효과를 기대하기는 어렵다.

구강미생물 제거방법은 구강미생물 제거제로 가글을 하는 방법으로 살균효과를 지닌 약물 또는 조성물을 이용하여 구강내부를 헹구고 뱉어내는 방식을 사용하는데 구강내 수술후 사용되는 클로르헥시딘글루콘산염액과 같은 살균제는 지속적으로 사용시 부작용으로서 구강내 정상균무리를 파괴하여 다른 구강질환을 유발하므로 10일 이상 사용하지 못하게 되어있으며 상업용 가글로 판매되는 용제에 주성분으로 포함되는 유칼립톨, 세틸피리디늄염화물수화물은 정상균무리를 함께 파괴하여 구강질환을 유발할 뿐만 아니라 자칫 삼키게 되면 간세포와 신장에 손상을 일으킬 수 있는 등 부작용을 일으킬 가능성이 매우 높다.

공개특허공보 제10-2018-0131823호 등록특허공보 제10-0898491호

Toll-Like Receptor 4 Signaling Augments Transforming Growth Factor-β Responses: A Novel Mechanism for Maintaining and Amplifying Fibrosis in Scleroderma, The American Journal of Phathology, Volume 182, Issue 1, January 2013, Page 192-205.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 구강 내에서 충치 및 치주질환을 유발하는 미생물인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)을 억제하고, 항균 및 항염증 효능을 가져 구강 내 환경을 개선시키는 신규한 락토바실러스 애시도필러스 균주 및 이의 다양한 용도를 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위해 본 발명은 신규한 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 균주를 제공한다.

상기 균주는 서열번호 1의 16s rRNA 서열을 갖거나 수탁번호 KCTC14587BP의 균주이다.

또한, 상기 균주는 항균 효과가 인정되는데, 제한되는 것은 아니지만, 바람직하게는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)에 대한 항균 효과가 인정된다.

또한, 상기 균주는 항염증용 효과가 인정되며, 상기 항염의 대상 질환은 아토피 피부염, 여드름, 건선, 부비동염, 비염, 결막염, 천식, 피부염, 염증성 콜라겐 혈관질환, 사구체신염, 뇌염, 염증성 장염, 과민성 대장 증후군, 만성 폐쇄성 폐질환, 패혈증, 패혈성 쇼크증, 폐섬유증, 관절염, 염증성 골용해, 바이러스 또는 박테리아 감염에 의한 만성 염증질환, 염증성 장 질환, 관절염, 류마티스 관절염, 반응성 관절염, 골관절염, 공피증, 골다공증, 아테롬성 동맥경화증, 심근염, 심내막염, 심낭염, 낭성 섬유증, 하시모토 갑상선염, 그레이브스병, 나병, 매독, 라임병(Lyme disease), 보렐리아증(Borreliosis), 신경성-보렐리아증, 결핵, 사르코이드증(Sarcoidosis), 루프스, 동창성 루프스, 결핵성 루프스, 루프스 신염, 전신성 홍반성 루프스, 황반변성, 포도막염, 과민대장 증후군, 크론병, 쇼그랜 증후군, 섬유근통, 만성피로 증후군, 만성피로 면역부전 증후군, 근육통성 뇌척수염, 근위축성 측삭경화증, 파키슨병, 및 다발성경화증, 구강 내 염증 질환 중 어느 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 구강 내 염증질환일 수 있다. 상기 구강 내 염증 질환은 예를 들어, 치주염, 치은염, 구내염, 설염 또는 치아 우식증일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 상기 신규한 락토바실러스 애시도필러스 균주를 포함하는 항균용 조성물 또는 항염증용 조성물을 제공한다. 이때, 상기 락토바실러스 애시도필러스 균주는 특정 처리가 되지 않은 균주 또는 분말화된 균주, 상기 균주의 배양물 또는 상기 균주의 추출물일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항균용 조성물은 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학 조성물 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.

또한, 상기 항염증용 조성물을 화장료 조성물, 식품 조성물 또는 약학 조성물 중 선택되는 어느 하나일 수 있다.

본 발명에서의 화장료 조성물은 상기 신규한 락토바실러스 애시도필러스 균주 이외에 당 업계에서 화장료 조성물을 제조할 때 통상적으로 사용하는 보존제, 안정화제, 계면활성제, 용해제, 보습제, 에몰리언트제, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, pH 조정제, 유기 및 무기 안료, 향료, 냉감제 또는 제한제 등을 추가적으로 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 화장료 조성물은 스킨소프너, 토너, 로션, 크림, 파운데이션, 에센스, 영양 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 현탁액, 겔, 분말, 페이스트, 마스크팩 또는 시트 또는 에어로졸 조성물, 치약, 가글액 등을 포함하는 제형으로 제조될 수 있으며, 당 업계에서의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다.

본 발명에서의 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물은 당 업계에서 식품을 제조하기 위해 통상적으로 사용하는 향미제, 풍미제, 안정화제, 증점제, 방부제 등을 추가적으로 더 포함할 수 있고, 예를 들면 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말디톨, 전분, 알지네이트, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 말토덱스트린, 이산화규소, 셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 상기 식품 또는 건강기능식품 조성물은 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 분말, 과립, 정제, 캡슐,과자, 등의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명에 따른 식품 또는 건강기능식품 조성물 조성물은 섭취 대상의 연령, 체중, 건강 상태, 성별, 투여시간, 유효성분의 함량, 질환의 중증도 등에 따라 적절하게 선택될 수 있고, 섭취 횟수는 1일 1회 또는 2회, 격일마다, 격주마다, 격월 등의 방식으로 섭취할 수 있다.

또한, 본 발명에서의 약학 조성물은 다당류 이외에 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체, 붕해제, 결합제, 활택제, 결합제, 향료 등을 추가적으로 더 포함할 수 있다.

또한, 상기 약학 조성물은 당 업계에서 제제화에 통상적으로 사용되는 방법으로 정제, 캡슐, 서방형 제제, 엘릭서, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼, 단위 투약 주사제 앰플, 현탁액 등의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명에 의하면, 구강 내에서 충치 및 치주질환을 유발하는 미생물인 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans)을 억제하며 항염증효능을 가쳐 구강 내 환경을 개선시키는 식물유래 유산균분말 및 이의 용도를 제공할 수 있는데, 상기 유산균은 현재 충치 및 치주질환을 예방하기 위해 사용되는 방법인 양치, 구강세정제, 자일리톨 섭취 등의 방법보다 안전하고 효과적으로 충치 유발균인 스트렙토코커스 뮤탄스 억제, 잇몸의 염증반응을 억제하는 활성을 갖는 장점이 있다.

또한, 본 발명에 의하면 200L 규모의 발효 탱크에서 상기 유산균을 상업적으로 사용 가능할 정도로 고농축 배양, 분말화할 수 있는 방법을 제공할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 항균활성평가를 위한 후보 유산균의 배양 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 S.mutans 배양 과정을 나타낸 것이다.
도 3은 균주선정을 위한 항균 활성 평가 사진을 나타낸 것이다.
도 4는 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP) 대량배양 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 200L 탱크를 이용한 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP) 배양액 생균수 변화를 나타낸 것이다.
도 6은 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP)동결건조 분말 제조공정을 나타낸 것이다.
도 7은 diffision test(100㎕) 결과 plate 사진을 나타낸 것이다.
도 8은 diffision test(150㎕) 결과 plate 사진을 나타낸 것이다.
도 9는 농도별 처리에 따른 BHI Broth 배지의 S.mutans 배양억제 결과를 나타낸 것이다.
도 10은 LS-803 배양액(pH 3.79), Lactic acid 첨가배지(pH 3.79) S. mutans 항균활성 비교 결과를 나타낸 것이다.
도 11은 분말화된 시료의 S. mutans 억제 공인시험성적서를 나타낸 것이다.
도 12는 Raw 264.7 cell MTT assay 결과를 나타낸 것이다.
도 13은 Raw 264.7cell NO assay(항염증) 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 Raw 264.7cell NO assay(염증예방) 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 LPS 자극에 의한 염증인자 및 해당인자의 유전자 발현 세포 전달 체계를 나타낸 것이다.
도 16은 HS68 cell MTT assay 결과 그래프를 나타낸 것이다.
도 17은 HS68 cell 에서의 MMP-9 유전자 발현량을 나타낸 것이다.
도 18은 HS68 cell 에서의 COL1A1 유전자 발현량을 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 식물유래 유산균주

본 발명을 위해 검토된 식물유래 유산균주는 ㈜웰빙엘에스에서 보유한 식물유래의 유산균 야외분리균주로써 모두 16s rRNA 분석을 통해 동정이 완료된 미생물을 사용하였으며 균주번호, 균주의 학명 및 분리원은 아래의 표 1과 같다.

S. mutans 억제효과 검토를 위한 식물유래 유산균주

균주 번호	학명	분리원	지역
LS-22	Lactobacillus plantarum	발효콩	강원도 인제
LS-65	Lactobacillus plantarum	고들빼기 김치	강원도 인제
LS-104	Weissella cibaria	커피 파치먼트	강원도 강릉
LS-107	Enterococcus faecium	커피 파치먼트	강원도 강릉
LS-117	Pediococcus pentosaceus	커피 파치먼트	강원도 강릉
LS-502	Lactobacillus plantarum	곤드레	강원도 정선
LS-601	Straptococcus thermophilus	곤드레	강원도 정선
LS-801	Lactobacillus plantarum	커피체리	전라도 고흥
LS-802	Lactobacillus fermentum	커피체리	전라도 고흥
LS-803	Lactobacillus acidophillus	커피체리	전라도 고흥

<실시예 2> 유산균 선별(충치유발균에 대한 항균효과)

2-1 유산균 배양

도 1에 첨부한 사진처럼 배양은 50ml conical tube에 MRS broth 4ml를 분주하고 glycerol stock 상태의 균주를 일부 긁어내어 접종하였다. 이후 30℃, 33℃, 37℃, 40℃, 43℃의 다섯 가지 온도 조건에 맞춰 진탕 배양기에서 24시간 배양을 진행하였다. 배양이 완료된 균주별, 온도조건별 배양액은 분광광도계를 이용하여 600nm의 파장에서 0.1의 흡광도를 가지도록 희석하였다. 균주별, 온도별 균주배양 희석액 중 2ml은 15,000rpm에서 원심분리하여 상등액만을 취하였으며 최종적으로 생균이 포함되지 않은 상등액(A)과 생균이 포함된 현탁액(B)으로 균주별, 온도조건별 시료를 준비하였다.

2-2 스트렙토코커스 뮤탄스 배양

스트렙토코커스(이하, S.mutans)는 KCTC에서 KCTC 5365 균주를 분양받아 사용하였다. 균주 배양에 사용된 배지는 MB cell사에서 MSB agar 배지를 이용하여 single colony 분리에 사용하였고, MB cell사의 BHI Broth를 이용하여 액체 배양에 사용하였다.

도 2와 같이 glycerol stock한 균주를 MRS agar 배지에 균 stock을 일부 떼어내 streaking 하여 single colony를 분리하였고 이후 colony 하나를 떼어 BHI broth 20ml에 접종, 37℃ 진탕 배양기에 24시간 배양했으며 분광광도계를 이용하여 600nm의 파장에서 0.1의 흡광도를 가지도록 희석하였다.

2-3 충치유발균 억제활성균주 선정시험

항균 활성 평가를 진행하기 위해 1% Glucose BHI agar배지를 제조 후 40~45℃까지 서서히 식힌 뒤 무균작업대 안에서 Petri-dish에 20ml을 평판하고 희석된 S.mutans 배양액 1.5ml를 접종하여 25℃ 상온에서 20분간 방치하여 굳혔다. 배지가 완전히 굳은 후 직경 약 1cm의 멸균된 test tube를 이용하여 직경 1cm의 구멍을 천공하여 well을 형성시키고 형성된 well 안에 각각 30℃, 33℃, 37℃, 40℃, 43℃의 온도 조건으로 배양 후 희석된 상등액(A)과 현탁액(B)을 100㎕씩 처리하여 37℃ 배양기에서 24시간 배양하였다.

24시간 배양 후 형성된 생육저해환의 크기를 측정하여 상등액과 현탁액 모두에서 생육저해환의 크기가 가장 큰 균주를 선별하였다.

균주, 온도별 충치유발균 억제활성 시험결과

sample No.	33℃		37℃		40℃		43℃
	상등(A)	현탁(B)	상등(A)	현탁(B)	상등(A)	현탁(B)	상등(A)	현탁(B)
LS-22	15mm	16mm	14mm	16mm	13.5mm	14mm	-	-
LS-65	14mm	15.5mm	14mm	16mm	13mm	13mm	-	-
LS-104	13mm	15mm	-	14mm	-	-	-	-
LS-107	13mm	14mm	-	-	-	-	-	-
LS-117	13mm	15mm	-	15mm	-	14mm	-	-
LS-502	14mm	15mm	14.5mm	16mm	13mm	15mm	-	-
LS-602	-	-	-	-	-	13.5mm	-	-
LS-801	-	14.5mm	14mm	15.5mm	-	13mm	-	-
LS-802	14mm	16mm	13.5mm	15mm	15mm	16mm	14mm	15mm
LS-803	14mm	16mm	14mm	16mm	14mm	16mm	15mm	16mm

식물유래 유산균주의 상등액과 현탁액으로 S.mutans에 대한 생육억제효과를 시험한 결과 락토바실러스 애시도필러스 LS-803 균주에서 온도, 상등액, 현탁액에 관계없이 고루 높은 저해효과를 확인하였다(도 3). 위와 같은 결과로 최종적으로 락토바실러스 애시도필러스 LS-803 균주를 대량배양 균주로 선정하였다. 상기 락토바실러스 애시도필러스 LS-803는 한국생명공학연구원에 수탁번호: KCTC14587BP로 기탁하였고, 상기 균주의 16s rRNA 서열은 서열번호 1에 나타내었다.

<실시예 3> 선별유산균의 제조

3-1 Seed 배양

-70℃에서 극저온 보관중인 생균수 1.0×10^9cfu/ml인 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP)를 멸균 후 상온까지 식힌 MRS Broth배지 1,000㎖에 1%(v/v)접종하여 37℃, 100rpm조건에서 14hr 배양하였다. 배양이 완료된 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP) 균주를 20℃, 8,000 rpm으로 30min 원심분리 후 상등액은 제거하고 상등액과 동량의 멸균생리식염수 다시 희석하여 생균수 2.0×10^9cfu/ml인 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP) 희석액을 얻었다.

3-2 200L 탱크배양

200L 탱크를 이용하여 도 4와 같이 접종 및 배양하였다. 이때 접종균은 위 3-1에서의 Seed 배양에 따른 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP) 희석액을 배지량의 0.5%(v/v) 만큼 사용하며 배지는 아래 표에 따랐다.

LS-803균주의 배지조성

원료명	함량%(w/v)
Soy peptone	3.00
Yeast extract	1.50
Dextrose	6.00
polysorbate 80	0.10
Sodium acetate	0.50
Magnesium sulfate	0.01
Dipotassium phosphate	0.40

200L 탱크를 이용하여 150L를 배양한 결과는 도 5와 같으며 이때 Lactobacillus acidophilus LS-803(수탁번호: KCTC14587BP) 배양액의 생균수는 4.0~5.0×10^9cfu/ml 으로 하였다. 15hr 배양액의 경우 14hr 배양 후 원심분리 경과시간 동안의 생균수 변화이다.

3-3 원심분리 및 동결건조 과정

원심분리는 튜블라타입 원심분리기를 이용하며 15,000rpm에서 유량 150L/hr로 하여 1시간 동안 분리한다. 이때 원심분리 균체 회수량은 1.3~1.5kg이며 생균수는 5.0~6.0×10^11cfu/g이다. 회수된 균체는 회수균체의 중량대비 증류수150~200%(w/w), 트레할로스35~40%(w/w), 전분25~35%(w/w), 0.4% 알긴산 수용액10~20%(w/w)를 혼합 후 동결건조 트레이에 1.2kg씩 분주하며 100L 동결건조기를 이용하여 선반온도 -40℃, 가열온도 25℃, 진공 0.5m Tor조건에서 60~65hr 동결건조 하였다. 이때 동결건조한 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP) 분말의 중량은 배양액의 1.0~1.5%(w/w)이며 유산균 생균수는 4.0~6.0×10^11cfu/g으로 하였다(도 6 참조).

<실시예 4> 동결건조 분말의 충치유발균(S. mutans)억제 및 항염증 억제효과 확인

4-1 Paper disk diffusion을 이용한 항균활성

락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP)가 동결건조 분말화 후 충치유발균인 S.mutans에 대한 항균력을 유지하는지 알아보기 위해 시험을 실시하였다. 또한 기존에 충치에 효과가 있다고 알려진 락토바실러스 루테리(Lactobacillus reuteri) ATCC PTA 5289균주를 입수하여 비교시험을 실시하였다.

각 균주는 MRS Broth배지를 이용하여 100rpm 37℃에서 16hr 사전 배양을 진행한 뒤, 분광광도계를 이용하여 Abs(600nm)에서 흡광값이 0.1이 나오도록 동일하게 MRS Broth 배지로 희석하여 사용하였다. 희석된 배양액은 8,000rpm, 30분 4℃ 조건으로 원심분리하여 상등액만을 취하고, 상등액은 0.2nm pore size의 필터로 여과하여 실험에 사용하였다. 스트렙토코커스 뮤탄스(이하 S.mutans)는 KCTC에서 KCTC 5365 균주를 분양받아 사용하였다. Glycerol stock된 S.mutans 균주를 MRS agar 배지에 균 stock을 일부 떼어내 streaking 하여 single colony를 분리하였고 이후 colony 하나를 떼어 BHI broth 20ml에 접종, 37℃ 진탕 배양기에 24시간 배양했으며 분광광도계를 이용하여 600nm의 파장에서 0.1의 흡광도를 가지도록 희석하였다. 항균 활성 평가를 진행하기 위해 1% Glucose BHI agar배지를 제조 후 40~45℃까지 서서히 식힌 뒤 무균작업대 안에서 Petri-dish에 20ml을 평판하고 희석된 S.mutans 배양액 1.5ml를 접종하여 25℃ 상온에서 20분간 방치하여 굳혔다. 배지가 완전히 굳은 후 직경 약 8mm의 멸균된 test tube를 이용하여 직경 1cm의 구멍을 천공하여 well을 형성시키고 8mm의 멸균된 Paper disk를 삽입하여 준비하였다. Paper disk에는 아래 표와 같은 시료 100, 150㎕를 처리하여 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP)의 분말화 후 항균활성을 확인하였다.

항균 활성 평가(diffusion test) 시료의 Sample No

샘플번호	처리
#18	Lactobacillus acidophilus LS-803(KCTC14587BP)
C	Lactobacillus reuteri ATCC PTA 5289
M	MRS Broth
N.C	PBS
P.C	Ampcillin (100ug/ml)

도 8에서와 같이 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP)가 기존에 S. mutans 저해효과가 있다고 알려진 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289보다 S. mutans의 생장억제 항균활성이 더 뛰어난 것을 알 수 있으며 농도가 올라갈수록 저해활성이 커지는 것도 알 수 있다.

4-2 배양액에서의 S.mutans 균주 항균력 평가

S.mutans는 BHI Broth이용하여 사전에 배양하고 분광광도계로 600nm에서 흡광도를 측정, 새로운 BHI Broth를 이용하여 흡광값이 0.05가 되도록 희석하여 준비하였다.

락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP), 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289균주는 MRS Broth배지를 이용하여 100rpm 37℃에서 16hr 사전 배양을 진행한 뒤, 분광광도계를 이용하여 Abs(600nm)에서 흡광값이 0.1이 나오도록 동일하게 MRS Broth 배지로 희석하여 사용하였다. 희석된 배양액은 8,000rpm, 30분 4℃ 조건으로 원심분리하여 상등액만을 취하고, 상등액은 0.2nm pore size의 필터로 여과하여 실험에 사용하였다.

흡광도 0.05로 S.mutans가 희석된 BHI Broth 현탁액은 하나의 조건 당 20ml씩 준비하였고 아래의 표 5와 같은 시료를 처리하며 각 시료당 처리량은 1ml, 2ml, 3ml로 하여 실험하였다.

샘플번호	처리
#18	Lactobacillus acidophilus LS-803 (KCTC14587BP) 상등액
C	Lactobacillus reuteri ATCC PTA 5289 상등액
C(-)	MRS Broth
C(+)	Ampcillin (100ug/ml)
C(0)	무처리(BHI Broth)

1ml, 2ml 처리 시료의 경우 3ml 처리 시료와의 차이만큼 MRS Broth(여과)를 추가하였고, 처리가 완료된 S.mutans 배양 BHI Broth 현탁액은 37℃, 170rpm으로 배양하며 1시간마다 600nm에서 흡광도를 측정, 기록하였다.

S.mutans가 흡광값 600nm에서 0.05의 값을 보이도록 희석한 BHI Broth 배지에 흡광값이 0.1이 나오도록 배양한 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(KCTC14587BP), 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289의 상등액을 처리한 결과 두 균주 모두 상등액의 처리농도가 높아질수록 S.mutans에 대한 항균활성이 증가하였으며 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(KCTC14587BP) 균주의 상등액은 모든 처리 구간에서에서 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289균주의 상등액보다 높은 항균력을 보였다(도 9).

유산균을 배양한 배지 상등액에 항균 물질이 포함되어 있다는 것을 확인하기 위해 배지의 pH와 동일한 pH의 젖산을 첨가한 MRS 액체 배지를 준비하여 S.mutans에 처리했을 때 항균력을 비교하였다. MRS Broth 배지에 1.0×10^9cfu/ml 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP) 1% 접종 후 37℃, 120rpm에서 16hr 배양하여 배양액의 pH를 측정하고(pH3.79), 미사용 MRS 배지에 젖산(lactic acid)를 처리하여 동일한 pH(pH3.79)로 맞췄다. 상기 두 시료 모두 0.2nm pore size 필터로 여과 후 실험에 사용하였다.

BHI Broth배지를 이용하여 Abs(600nm)에서 흡광값이 0.05가 되도록 S.mutans를 희석하고, 희석한 배양액 20ml에 시료를 처리하였다. 1ml, 2ml 처리 시료의 경우 3ml 처리 시료와의 차이만큼 MRS Broth(여과)를 추가하여 동일한 부피를 가지도록 처리하고 처리가 완료된 S.mutans 배양 BHI Broth 현탁액은 37℃, 170rpm으로 배양하며 1시간마다 600nm에서 흡광도를 측정, 기록하였다(표 6).

샘플번호	처리	pH
#18	Lactobacillus acidophilus LS-803(KCTC14587BP)	3.79
MRS	Lactic acid	3.79

측정 결과 S. mutans 균주의 경우 젖산에 의해 저해를 받기는 하였으나 젖산보다는 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP)가 분비하는 산이 아닌 항균물질의 영향으로 인해 저해되는 것이 더 큰 것으로 확인되었다(도 10). 상기의 실험을 참고하여 한국 의과학 연구원에 공인시험을 의뢰하였다. 시험은 S. mutnas균이 7.5~8.5×10^6cfu/ml로 배양된 배양액 30ml에 1.0×10^8cfu/g으로 희석된 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP)분말과 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289분말을 1% 처리하였으며 37℃, 170rpm으로 1, 3, 6hr 현탁 방치하여 아래와 같은 결과를 얻었다.

시험결과 동결건조 분말을 처리할 경우 생균에 의한 효과로 인해 더욱 강력한 S. mutans 살균효과가 나타나는 것을 알 수 있으며 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289보다 그 효과가 더욱 우수한 것을 알 수 있다(도 11).

4-3 NO assay를 통한 항염증효과 확인

세포독성 확인을 위한 MTT assay

락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP)과 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289 배양액의 세포 독성을 평가하여 비교하기 위해서 MTT assay를 진행하였다. Raw 264.7 세포는 5x10⁴cell/well이 되도록 24 well plate에 seeding 후 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 배양하였다. 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(수탁번호: KCTC14587BP), 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289균주는 MRS Broth 배지를 이용하여 100rpm 37℃에서 16hr 사전 배양을 진행한 뒤, 분광광도계를 이용하여 Abs(600nm)에서 흡광값이 0.1이 나오도록 동일하게 MRS Broth 배지로 희석하여 사용하였다. 희석된 배양액은 8,000rpm, 30분 4℃ 조건으로 원심분리하여 상등액만을 취하고, 상등액은 0.2nm pore size의 필터로 여과하여 실험에 사용하였다. 배양이 종료된 Raw 264.7 세포에 시료 샘플을 각각 10㎕씩 처리하였으며 시료의 샘플번호에 따른 처리는 아래 표 7과 같다. 각 대조군과 실험군은 2개 well 씩 처리하여 신뢰도를 높였다.

샘플번호	처리
#18	Lactobacillus acidophilus LS-803 (KCTC14587BP) 상등액
C(reuteri)	Lactobacillus reuteri ATCC PTA 5289 상등액
C(M)	PBS buffer
C(0)	무처리

시료 처리 후 37℃에서 24시간 배양한 뒤 배지를 400㎕만 남기고 제거한 뒤 5mg/ml 농도로 녹인 MTT solution(thiazolyl blue tetrazolium bromide)을 1/10 용량인 40㎕ 처리하였다. 용액이 잘 섞이도록 Plate를 잘 흔들어 준 뒤 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3시간 반응시켰다. 3시간 반응 종료 후 배지를 모두 제거한 뒤 well 당 DMSO 500㎕를 처리하여 세포를 용해하고 96 well plate에 40㎕씩 duplication하여 옮겨 550nm에서 흡광도를 측정하였다. 세 번의 반복 실험을 진행하여 SPSS 통계 프로그램을 통해 통계처리 하였다. 통계 처리 결과 10㎕/ml 처리에서 세포 독성이 없음을 확인하여 해당 농도로 처리를 결정하였다(도 12).

항염증효과 확인을 위한 NO assay

세포는 5x10⁴cell/well이 되도록 24 well plate에 seeding 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 후 LPS를 최종농도에서 1㎍/ml이 되도록 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 23시간 배양하였다. 23시간 배양 후 각 위의 실험에서 사용한 것 과 같은 유산균 배지 상등액을 사용하여 시료를 처리하였으며 샘플번호에 따른 시료는 아래 표 8과 같다.

샘플번호	LPS 자극(1㎍/ml)	처리
C(-)	O	PBS buffer
LPS(-)	X	PBS buffer
C(+)	O	NIL
C(M)	O	MRS Broth
#18	O	Lactobacillus acidophilus LS-803(KCTC14587BP) 상등액
C(reuteri)	O	Lactobacillus reuteri ATCC PTA 5289 상등액

각 시료를 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 1시간 반응하고, 1시간 반응 종료 후 Plate를 흔들어 잘 섞은 뒤, 상등액 100㎕를 96 well plate에 옮기고 Griess reagent 100㎕를 넣어 37℃에서 15분간 반응시킴. 반응 종료 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 동일 실험을 세 번의 반복 실험을 진행하여 SPSS 프로그램을 통해 통계처리 하였다. 실험결과 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(KCTC14587BP) 상등액에서 염증반응(NO생성)이 25% 억제되었으며 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289 상등액은 유의미하지 않은 수준에서 염증반응(NO생성)의 감소를 보였다(도 13).

NO assay(염증예방에 대한 반응 실험)

세포는 5x10⁴cell/well이 되도록 24 well plate에 seeding 후 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 배양하였다. 염증 예방효과에 대해 알아보기 위해 LPS 자극과 시료의 처리를 동시에 진행하였다.

샘플번호	LPS 자극(1㎍/ml)	처리
LPS(+)	O	PBS buffer
LPS(-)	X	PBS buffer
#18	O	Lactobacillus acidophilus LS-803(KCTC14587BP) 상등액
reuteri	O	Lactobacillus reuteri ATCC PTA 5289 상등액

각 시료를 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 후 Plate를 흔들어 잘 섞은 뒤, 상등액 100㎕를 96 well plate에 옮기고 Griess reagent 100㎕를 넣어 37℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 종료 후 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 동일 실험을 세 번의 반복 실험을 진행하여 SPSS 프로그램을 통해 통계처리 하였다. 염증예방 반응 실험에서도 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(KCTC14587BP) 상등액에서 염증반응(NO생성)이 23% 억제되었으며 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289 상등액은 유의미하지 않은 수준에서 염증반응(NO생성)의 감소를 보였다. 이에 따라 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(KCTC14587BP) 섭취시 이미 발생된 염증뿐만 아니라 발생가능성이 있는 염증까지 예방하는 효과가 있음을 확인할 수 있다(도 14).

4-4 세포파괴인자 MMP-9(Metalloproteinase-9) 발현 억제 효능 검정

MMP-9(Metalloproteinase-9) LPS 자극에 의해 염증이 발생하면 생성되는 콜라겐분해효소로써 염증세포 주변에 분비되어 세포와 세포를 연결하는 콜라겐을 분해해기 때문에 세포파괴 인자로 알려져 있다. 따라서 MMP-9(Metalloproteinase-9)은 주요 염증반응을 확인하는 주요 인자료 알려져 있으며 이를 이용하여 락토바실러스 애시도필러스 LS-803(KCTC14587BP) 균주의 염증억제 반응을 확인했다.

참조한 논문(비특허문헌 1, 도 15)에 따르면 LPS에 의해 염증 환경이 조성되었을 때 MMP-9의 발현량이 증가하고, 이에 따라 MMP-9이 증가하여 콜라겐을 파괴하므로 콜라겐을 회복시키기 위해 콜라겐중합효소를 생성하는 COL1A1의 유전자 발현량 또한 증가하였다. 따라서 단순 MMP-9 유전자의 발현감소가 아닌 MMP-9의 감소를 확인하기 위해서는 COL1A1유전자가 함께 감소되어야 염증으로 인한 세포의 파괴가 억제된다고 할 수 있다(도 14).

4-5 HS68 MTT assay

Human foreskin fibroblast인 HS68 세포주를 대상으로 유산균 배지 상등액(여과)에 대한 세포독성을 평가하였다. 세포는 1x10⁵cell/dish가 되도록 24 well plate에 seeding하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 여과한 유산균 배지 상등액을 각각 10㎕씩 처리하였다. 각 대조군과 실험군은 2개 well 씩 처리하여 신뢰도를 높였다. 시료 처리 후 24시간 배양한 뒤 배지를 400㎕만 남기고 제거한 뒤 5mg/ml 농도로 녹인 MTT solution(thiazolyl blue tetrazolium bromide)을 1/10 용량인 40㎕ 처리하였다. 용액이 잘 섞이도록 Plate를 잘 흔들어 준 뒤 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 3시간 반응시켰다. 3시간 반응 종료 후 배지를 모두 제거한 뒤 well 당 DMSO 500㎕를 처리하여 세포를 용해하고 96 well plate에 40㎕씩 duplication하여 옮겨 550nm에서 흡광도를 측정하였다(도 16). 샘플 10㎕ 처리량에서 세포독성이 나타나지 않아 샘플 처리량은 10㎕로 고정하였다.

4-6 세포파괴인자 MMP-9(Metalloproteinase-9) 발현량 검정(qRT-PCR)

Human foreskin fibroblast인 HS68 세포주를 대상으로 LPS로 자극하여 염증성 환경을 조성한 HS68에 유산균 배양액을 처리했을 때 세포파괴인자인 MMP-9과 COL1A1의 유전자 발현량의 차이를 검증하기 위해 실험하였다. 세포는 2.5x10⁵cell/dish가 되도록 60mm dish에 seeding하고, 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후 아래 표와 같이 시료를 처리하였다(이때 유산균 배양 상등액은 5N NaOH로 pH7.0까지 적정 후 여과하여 사용함).

샘플번호	LPS 자극(1㎍/ml)	처리
LPS(+)	O	PBS buffer
LPS(-)	X	PBS buffer
LS-803	O	Lactobacillus acidophilus LS-803 (KCTC14587BP) 상등액
L.reuteri	O	Lactobacillus reuteri ATCC PTA 5289 상등액

각 시료를 처리한 후 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 2시간 반응하고, 2시간 반응 종료 후 LPS를 최종농도 1㎍/ml이 되도록 처리하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 22시간 배양하였다. 배양 후 세포는 수확하고, RNA 분리, cDNA 합성 절차를 거쳐 MMP-9, COL1A1에 대한 유전자 발현량을 qRT-PCR을 수행하여 검정하였다.

MMP-9, COL1A1(Human) 프라이머 서열

유전자	방향	서열
MMP-9	Forward	5´-ATCCAGTTTGGTGTCGCGGAGC-3´ (서열번호 2)
	Reverse	5´-GAAGGGGAAGACGCACAGCT-3´ (서열번호 3)
COL1A1	Forward	5´-TCTGCGACAACGGCAAGGTG-3´ (서열번호 4)
	Reverse	5´-GACGCCGGTGGTTTCTTGGT-3´ (서열번호 5)
GAPDH	Forward	5´-CTGCACCACCAACTGCTT-3´ (서열번호 6)
	Reverse	5´-TTCTGGGTGGCAGTGATG-3´ (서열번호 7)

락토바실러스 애시도필러스 LS-803(KCTC14587BP) 상등액을 처리한 군에서 MMP-9, COL1A1 유전자 발현량 모두 감소하는 경향을 나타냈다. MMP-9 발현량에서는 락토바실러스 애시도필러스 LS-803 (KCTC14587BP) 상등액, 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289 상등액 모두 P<0.001 까지 유의한 결과를 나타냈으며(도 17), COL1A1 발현량에서는 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289 상등액은 P<0.05, 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289 상등액은 P<0.01 까지 유의한 결과를 나타냈다(도 18).

종합적으로 판단할 때 락토바실러스 애시도필러스 LS-803 (KCTC14587BP)의 경우 LPS자극으로 인해 발현되는 MMP-9 유전자 뿐만 아니라 MMP-9 유전자 발현으로 인해 기인하는 MMP-9의 세포간 콜라겐파괴를 억제하여 COL1A1유전자의 발현도 억제했다고 판단되며 그 억제의 정도가 락토바실러스 루테리 ATCC PTA 5289 균주보다 월등한 것으로 보인다.

기탁기관명 : 한국생명공학연구원

수탁번호 : KCTC14587BP

수탁일자 : 20210327

<110> Wellbeing LS Co., Ltd <120> Novel Lactobacillus acidophilus strain having Streptococcus mutans inhibition and anti-inflammatory effect and use thereof <130> 21-11994 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1480 <212> DNA <213> Lactobacillus acidophilus <400> 1 ccttttattt gttatgttat tattagcaag tcgagcgagc agaaccagca gatttacttc 60 ggtaatgacg ctggggacgc gagcggcgga tgggtgagta acacgtgggg aacctgcccc 120 atagtctggg ataccacttg gaaacaggtg ctaataccgg ataagaaagc agatcgcatg 180 atcagcttat aaaaggcggc gtaagctgtc gctatgggat ggccccgcgg tgcattagct 240 agttggtaag gtaacggctt accaaggcaa tgatgcatag ccgagttgag agactgatcg 300 gccacattgg gactgagaca cggcccaaac tcctacggga ggcagcagta gggaatcttc 360 cacaatggac gcaagtctga tggagcaacg ccgcgtgagt gaagaaggtt ttcggatcgt 420 aaagctctgt tgttggtgaa gaaggataga ggtagtaact ggcctttatt tgacggtaat 480 caaccagaaa gtcacggcta actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc 540 gttgtccgga tttattgggc gtaaagcgag cgcaggcgga agaataagtc tgatgtgaaa 600 gccctcggct taaccgagga actgcatcgg aaactgtttt tcttgagtgc agaagaggag 660 agtggaattc catgtgtagc ggtggaatgc gtagatatat ggaagaacac cagtggcgaa 720 ggcgactctc tggtctgcaa ctgacgctga ggctcgaaag catgggtagc gaacaggatt 780 agataccctg gtagtccatg ccgtaaacga tgagtgctaa gtgttgggag gtttccgcct 840 ctcagtgctg cagctaacgc attaagcact ccgcctgggg agtacgaccg caaggttgaa 900 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960 acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc tagtgccatc ctaagagatt aggagttccc 1020 ttcggggacg ctaagacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1080 gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt tattagttgc cagcattaag ttgggcactc 1140 taatgagact gccggtgata aaccggagga aggtggggat gacgtcaagt catcatgccc 1200 cttatgacct gggctacaca cgtgctacaa tggacagtac aacgagaagc gagcctgcga 1260 aggcaagcga atctctgaaa gctgttctca gttcggactg cagtctgcaa ctcgactgca 1320 cgaagctgga atcgctagta atcgcggatc agaacgccgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1380 ttgtacacac cgcccgtcac accatggaag tctgcaatgc ccaaagccgg tggcctaacc 1440 ttcgggaagg agccgtctat ggcacgggcc agagttaagg 1480 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for MMP-9 <400> 2 atccagtttg gtgtcgcgga gc 22 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for MMP-9 <400> 3 gaaggggaag acgcacagct 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for COL1A1 <400> 4 tctgcgacaa cggcaaggtg 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for COL1A1 <400> 5 gacgccggtg gtttcttggt 20 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for GAPDH <400> 6 ctgcaccacc aactgctt 18 <210> 7 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for GAPDH <400> 7 ttctgggtgg cagtgatg 18

Claims (6)

1. 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) LS-803 균주(수탁번호 KCTC14587BP)로서,
   상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA를 가지며,
   상기 균주는 스트렙토코커스 뮤탄스(Streptococcus mutans) 억제 활성 및 항염 활성을 동시에 가지는 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스 LS-803 균주.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 항염증은 치주염, 치은염, 구내염, 설염 또는 치아 우식증 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 구강 내 염증에 대한 항염증 효과인 것을 특징으로 하는 락토바실러스 애시도필러스 LS-803 균주.
5. 삭제
6. 제1항 또는 제4항의 균주를 포함하는 항염증용 조성물.