KR102764247B1 - 셀레노유기 화합물의 조성물 및 그의 사용 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식(I), 화학식(II), 또는 화학식(III)의 화합물, 및 이들의 조합과 같은 셀레늄 화합물을 포함하는 조성물, 및 대상체에서 글루코스 대사를 조절하기 위한 이들의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

셀레노유기 화합물의 조성물 및 그의 사용 방법{COMPOSITIONS OF SELENOORGANIC COMPOUNDS AND METHODS OF USE THEREOF}
[관련 출원들에 대한 교차참조]
본 출원은 2014년 3월 14일에 출원된 국제특허출원 PCT/US2014/029542의 일부계속출원(CIP)이며, 이 출원은 본원에서 참조로 포함된다.
[기술분야]
본 출원은 셀레노유기 조성물 및 화합물의 조성물 및 다양한 생물학적 프로세스에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절하는데 이들의 사용방법에 관한 것이다.
셀레늄 (Se)은 재생산, 갑상샘 호르몬 대사, DNA 합성, 및 산화적 손상 및 감염으로부터의 보호와 같은, 다수의 생물학적 프로세스에서 결정적 역할을 하는 필수 미량 원소이다. 셀레늄은 글루타티온 퍼옥시다제 (GPx), 티오레독신 리덕타제, 및 하나의 메티오닌-설폭사이드 리덕타제와 같은 다양한 셀레늄 의존성 효소의 촉매 부위에 도입된다. 이들 셀레노효소(selenoenzymes)는 대사 활성, 면역 기능, 항산화 방어, 세포내 산화환원 조절, 및 미토콘드리아 기능을 조절하는데 기여한다.
또한, 이 문헌의 결과에 따르면 상이한 화학적 형태의 셀레늄이 상이한 생체활성을 가지고 있음을 나타낸다. 예를 들어, 셀레노졸리딘은 셀레노메티오닌보다 폐 종양의 수를 감소시키는데 더 효과적이었다 (Poerschke et al, J Biochem Molecular Toxicology 2012, 26: 344). 바거 등(Barger et al.)은 상이한 공급원의 셀레늄, 예를 들어 셀레늄 메티오닌, 소듐 셀레나이트, 및 셀렌화된 효모가 공급된 마우스가 유전자 발현 및 미토콘드리아 구조 및 기능의 특정한 기능적 경로에 차등적 효과를 가지고 있음을 보여주었다 (Barger et al, Genes and Nutrition 2012, 7: 155). 셀렌화된 효모는 많은 셀레늄 및 황 화합물들을 함유하지만, 셀렌화된 효모 중의 셀레늄 화합물의 전부가 생물학적 프로세서에 영향을 미치는 것은 아니다. 또한, 셀렌화된 효모 중의 셀레늄과 황 화합물의 혼합물이 서로 억제성이고, 생물학적 프로세스에 악영향을 미치거나 세포에 독성인 것으로 나타났다.
인슐린-비의존성 (II형) 당뇨병 (DM)은 췌장 β-세포 기능으로 인한 인슐린 분비의 결함과 조합된, 골격근, 간 및 지방에서의 인슐린 내성을 특징으로 하는 질병이다. 인슐린 내성은 II형 당뇨병의 중추적 특징이다. 간에서, FOXO (Forkhead Box Class O) 전사인자 유전자군의 구성원들은 그들의 비인산화 상태에서 활성화되어지고, 세포핵 내에 존재한다. 핵에서, FOXO 전사인자들은 글루코스 6-포스파타제 (G6PC)와 같은 유전자들의 프로모터 영역에 결합한다. PGC-1α과 같은 다른 전사인자들과 함께, G6PC 의 전사를 증가시켜, 글루코스 생산 속도를 증가시킨다. 글루코스 6-포스파타제는 또한 간으로부터 글루코스의 방출을 초래하는 글루코스신합성 및 글리코겐분해의 마지막 단계를 촉매한다. 따라서, G6PC는 특히 당뇨병 환자에서 글루코스 항상성의 제어에 중요하다.
다른 화학적 형태의 셀레늄의 생체활성과 유용성의 명백한 차이는, 생물학적 프로세서에 유리한 영향을 미치는 셀레늄 함유 화합물을 동정할 것을 요구한다. 특히, 다양한 생물학적 경로에서 인슐린 대체, 인슐린 활성 증강, 글루코스 생산 억제 또는 글루코스 대사의 조절에서 셀레늄의 효과를 특성화시킬 필요가 있다. 더욱이, I형 및 II형 당뇨병으로 고통받는 개체들을 위한 인슐린 대체 요법으로서 셀레늄 화합물의 효과 및 이들의 효능을 결정할 필요가 있다.
본 발명은 대상체에서 인슐린을 대체하는 방법을 제공한다. 인슐린을 대체하는 방법은 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물, 화학식(III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 세개의 상이한 화합물을 포함한다. 본 방법의 조성물은 또한 담체를 포함한다.
본 발명은 또한 대상체에서 인슐린 활성을 증강시키는 방법을 제공한다. 인슐린 활성을 증강시키는 방법은 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물, 화학식(III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 세개의 상이한 화합물을 포함한다. 본 방법의 조성물은 또한 담체를 포함한다. 인슐린 활성을 증강시키는 방법은 인슐린 또는 그의 유사체 또는 유도체를 투여하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 대상체에서 글루코스 생산을 억제하는 방법을 제공한다. 글루코스 생산을 억제하는 방법은 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물, 화학식(III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 세개의 상이한 화합물을 포함한다. 본 방법의 조성물은 또한 담체를 포함한다.
본 발명은 글루코스 대사를 조절하는 방법을 제공한다. 글루코스 대사를 조절하는 방법은 대상체에게 조성물을 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물, 화학식(III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 세개의 상이한 화합물을 포함한다. 본 방법의 조성물은 또한 담체를 포함한다.
대상체에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절하는 방법에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인 및 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인을 포함할 수 있다. 대상체에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절하는 방법 중의 어느 하나에서, 조성물은 적어도 0.1%(w/v)의 5'-메틸셀레노아데노신을 포함할 수 있다. 대상체에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절하는 방법 중의 어느 하나에서, 조성물은 건조 또는 캡슐 형태일 수 있다.
대상체에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절하는 방법 중의 어느 하나에서, 조성물은 인슐린 또는 그의 유사체 또는 유도체를 추가로 포함할 수 있다. 대상체에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절하는 방법 중의 어느 하나에서, 조성물은 인슐린 증감제, 인슐린 분비 촉진제, 인크레틴 모방체를 추가로 포함할 수 있다. 대상체에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절하는 방법 중의 어느 하나에서, 조성물은 5'-메틸티오아데노신, S-아데노실-L-호모시스테인 또는 감마-글루타밀-메틸-시스테인 중 하나 이상을 배제할 수 있다.
대상체에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절하는 방법 중의 어느 하나에서, 조성물은 경구 투여될 수 있다. 대상체에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절하는 방법 중의 어느 하나에서, 5'-메틸셀레노아데노신 또는 화학식(I)의 화합물은 셀레노글리코시드이다. 대상체에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절하는 방법 중의 어느 하나에서, 조성물은 대상체의 간세포에 투여될 수 있다.
본 발명은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물 및 화학식(III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 세개의 상이한 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 조성물은 담체를 또한 포함할 수 있다.
본 발명은, 추가로, 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인 및 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 세개의 상이한 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 본 조성물은 담체를 또한 포함할 수 있다.
본 발명은 적어도 0.1%(w/v)의 화학식(I)에 따른 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하는 조성물을 제공한다:
상기 식에서,
R1은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R3은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 R4 및 이들이 부착되는 원자와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R4는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 R4 및 이들이 부착되는 원자와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R5는 옥소, 히드록시, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택된다.
R6은 옥소, 히드록시, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택된다.
R7은 C3-C16 알킬(여기서 상기 C3-C16 알킬은 카르복실기 및 아미노기를 둘 다 갖는 치환된 알킬이 아니다), 알케닐, 알키닐, 케톤, 아미노 알코올; 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산; OR', Se-R', S- R'이고, 여기서 OR'에서의 R'은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, Se-R'에서의 R'은 H, C3-C16 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, S-R'에서의 R'은 H, C3-C16 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
R8은 수소, 아지도, 알킬, 알케닐, 알키닐이다. 화학식(I) 조성물은 또한 담체를 포함할 수 있다. 그 외에, 상기 조성물의 5'-메틸셀레노아데노신 또는 화학식(I)의 화합물은 셀레노글리코시드일 수 있다. 화학식(I) 조성물은 또한 대상체의 간세포에 투여될 수 있다.
본 발명은 또한 적어도 0.1%(w/v)의 화학식(II)에 따른 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하는 조성물을 제공한다:
상기 식에서,
R1은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
R3은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 R4 및 이들이 부착되는 원자와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
R4는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 R4 및 이들이 부착되는 원자와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
R5는 옥소, 히드록시, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고,
R6은 옥소, 히드록시, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고,
R8은 수소, 아지도, 알킬, 알케닐, 알키닐이고,
R9는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R9는 R10과 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
R10은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R9는 R10과 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
R11은 OH, OR, 알콕시, 아르알콕시, 또는 아미노이고, 여기서 R은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 또는 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 분자내 염으로부터 선택된다.
화학식(II) 조성물은 담체를 포함할 수 있다. 화학식(II) 조성물은 또한 대상체의 간세포에 투여될 수 있다.
마지막으로, 본 발명은 적어도 0.1%(w/v)의 화학식(III)에 따른 화합물, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하는 조성물을 제공한다:
상기 식에서,
R1은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하며;
R3은 OH, OR, 알콕시, 아르알콕시 또는 아미노이고, 여기서 R은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 또는 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 분자내 염으로부터 선택되고;
R4는 H, 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 또는 약제학적으로 허용가능한 염, 또는 분자내 염이고;
R5는 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고, 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고;
R6는 옥소, 히드록시, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고,
R7은 C3-C16 알킬(여기서 상기 C3-C16 알킬은 카르복실기 및 아미노기를 둘 다 갖는 치환된 알킬이 아니다), 알케닐, 알키닐, 케톤, 아미노 알코올; 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산; OR', Se-R', S- R'이고, 여기서 OR'에서의 R'은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, Se-R'에서의 R'은 H, C3-C16 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, S-R'에서의 R'은 H, C3-C16 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
화학식(III) 조성물은 또한 담체를 포함할 수 있다. 화학식(III) 조성물은또한 대상체의 간세포에 투여될 수 있다.
본원에 기술된 조성물은 두개의 화합물 각각의 조성물 적어도 약 0.033% (w/v) 또는 세개의 화합물 각각의 조성물 적어도 약 0.033%(w/v)를 포함할 수 있다.
도면의 간단한 설명은 다음과 같다. 셀레늄 화합물들의 혼합물을 나타낼 때, ppb로 된 양은 그 혼합물에서 각각의 셀레늄 화합물 중의 셀레늄의 ppb 양을 가리킨다. 황 화합물의 혼합물을 나타낼때, ppb로 된 양은 그 혼합물 내 황 화합물 각각의 황의 ppb 양을 나타낸다. 예를 들어, 150 ppb의 화합물 CDE는, 화합물 C에서 150 ppb의 셀레늄, 화합물 D에서 150 ppb의 셀레늄, 및 화합물 E에서 150 ppb의 셀레늄을 함유하고, 조합해서 450ppb의 전체 셀레늄 농도를 함유한다. 예를 들어, 150 ppb의 화합물 HIJ는, 화합물 H에서 150 ppb의 황, 화합물 I에서 150 ppb의 황, 및 화합물 J에서 150 ppb의 황을 함유하고, 조합해서 450ppb의 전체 황 농도를 함유한다.
도 1은 AML-12 간 세포에서 OD490으로 표시된 세포 생존력에 대한, 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 H, 화합물 I, 및 화합물 J의 개별 화합물 각각 및 다양한 조합들의 150 ppb의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 2는 AML-12 간 세포에서 G6pc 유전자의 mRNA 발현 수준에 대한 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 H, 화합물 I, 및 화합물 J의 다양한 조합들의 효과를 보여준다.
도 2a는 48시간 동안 대조군 및 150 ppb 화합물 CDE 및 화합물 HIJ로 처리된 AML-12 세포에서 상대적 G6pc mRNA 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 2b는 48시간 동안 개별 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 H, 화합물 I, 및 화합물 J 로써 처리된 AML-12 세포에서 상대적 G6pc mRNA 발현을 보여주는 막대 그래프이다.
도 3은 AML-12 세포에서 상대적 G6pc mRNA 발현 수준에 대한 인슐린, 화합물 CDE, 및 인슐린과 화합물 CDE의 둘 모두의 조합의 효과를 보여주는 막대 그래프이다. 대조군 그룹(인슐린 및 화합물 CDE가 없는 처리군)과 비교한 경우, *는 P < 0.05이고, **는 P < 0.01임.
도 4는 8-CPT/Dex로써 병용 처리된 AML-12 세포에서 상대적 G6pc mRNA 발현 수준에 대한 인슐린, 화합물 CDE, 및 인슐린과 화합물 CDE의 둘 다의 조합의 효과를 보여주는 막대 그래프이다. 인셋(inset) 도면은 물 단독 (대조군), 8-CPT/Dex와 인슐린의 조합, 및 8-CPT/Dex, 인슐린 및 화합물 CDE의 조합을 사용하여 처리된 AML-12 세포에서 상대적 G6pc mRNA 발현 수준을 보여주는 고배율의 막대 그래프이다.
도 5는 AML-12 간 세포에서 Insr 및 lgflr의 상대적 mRNA 발현 수준에 대한 화합물 CDE 및 화합물 HIJ의 효과를 보여준다.
도 5a는 24시간 동안 150ppb의 화합물 CDE 및 150ppb의 화합물 HIJ로 처리된 AML-12 세포에서 상대적 Insr mRNA 발현 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 대조군 (물 비히클-처리된) 그룹과 비교한 경우, **는 P < 0.01임.
도 5b는 24시간 동안 150ppb의 화합물 CDE 및 150ppb의 화합물 HIJ로 처리된 AML-12 세포에서 상대적 Igflr mRNA 발현 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 대조군 (물 비히클-처리된) 그룹과 비교한 경우, **는 P < 0.01임.
도 5c는 대조군, 10 또는 100nM 인슐린, 150ppb 또는 300ppb의 화합물 CDE로 처리되거나, 또는 8-CPT/Dex, 인슐린 및 화합물 CDE로 병용 처리된 AML-12 세포에서 상대적 Insr mRNA 발현 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 대조군 (8-CPT/Dex/인슐린/화합물 CDE-무처리된) 그룹과 비교한 경우, *는 P < 0.05이고, **는 P < 0.01임.
도 5d는 대조군, 10 또는 100nM 인슐린, 150ppb또는 300ppb의 화합물 CDE로 처리되거나, 또는 8-CPT/Dex, 인슐린 및 화합물 CDE로 병용 처리된 AML-12 세포에서 상대적 Igflr mRNA 발현 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 대조군 (8-CPT/Dex/인슐린/화합물 CDE-무처리된) 그룹과 비교한 경우, *는 P < 0.05이고, **는 P < 0.01임.
도 6은 혈청-함유 배지에서 배양된 AML-12 세포에서 트레오닌 32에서 인산화된 Foxo3 (pFoxo3T32) 및 트레오닌28에서 인산화된 Foxo4 (pFoxo4T28)의 단백질 수준에 대한 화합물 CDE 및 화합물 HIJ의 효과를 보여준다.
도 6a는 물 대조군 또는 150ppb의 화합물 CDE 및 150ppb의 화합물 HIJ로써 6시간 동안의 AML-12 세포의 처리에 대한 반응에 있어서, pFoxo3T32 및 pFoxo4T28을 포함하는 다양한 신호전달 분자의 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 6b는 도 6A의 겔에서의 pFoxo3T32 단백질 수준의 정량분석을 보여주는 막대 그래프이다.
도 6c는 도 6A의 겔에서의 pFoxo4T28 단백질 수준의 정량분석을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7은 무혈청 배지에서 배양된 AML-12 세포에서 pFoxo3T32 및 pFoxo4T28의 단백질 수준에 대한 화합물 CDE, 화합물 CE, 및 화합물 DE의 효과를 보여준다.
도 7a는 물 대조군 또는 150ppb의 화합물 CDE, 150ppb의 화합물 CE, 및 150ppb의 화합물 DE로써 6시간 동안의 AML-12 세포의 처리에 대한 반응에 있어서, pFoxo3T32 및 pFoxo4T28을 포함하는 다양한 신호전달 분자의 단백질 발현을 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 7b는 도 7a의 겔에서 pFoxo3T32 단백질 수준의 정량분석을 보여주는 막대 그래프이다.
도 7c는 도 7a의 겔에서 pFoxo4T28 단백질 수준의 정량분석을 보여주는 막대 그래프이다.
도 8은 인간 IMR-32 신경 세포에서 pFOXO4T28, pFOXO4S193 및 다른 신호전달 분자의 단백질 수준에 대한 대조군 또는 150ppb의 화합물 CDE 및 150ppb의 화합물 HIJ의 효과를 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 9는 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산, G6pc mRNA 발현, 및 세포외 락테이트 데히드로게나제(LDH) 활성에 대한 화합물 CDE의 효과를 보여준다.
도 9a는 대조군, 8-CPT/Dex, 10 또는 100nM 인슐린, 150ppb또는 300ppb 화합물 CDE, 및 인슐린과 화합물 CDE의 조합으로 처리된 마우스 간세포의 배양 배지에서 상대적 글루코스 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 비히클 처리 그룹 (그래프에서 첫번째 막대)에 대해, *는 P < 0.05 임.
도 9b는 대조군, 10 또는 100nM 인슐린, 150ppb또는 300ppb 화합물 CDE, 및 인슐린과 화합물 CDE의 조합으로 처리된 마우스 간세포에서 상대적 G6pc mRNA 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 비히클 처리 그룹 (그래프에서 첫번째 막대)에 대해, *는 P < 0.05 임.
도 9c는 대조군, 10 또는 100nM 인슐린, 150ppb또는 300ppb 화합물 CDE, 및 인슐린과 화합물 CDE의 조합으로 처리된 마우스 간세포의 배양 배지에서 상대적 LDH 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 10은 8-CPT/Dex로써 자극된 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산, G6pc mRNA 발현, 및 세포외 LDH 활성에 대한 화합물 CDE의 효과를 보여준다.
도 10a는 대조군, 8-CPT/Dex, 8-CPT/Dex와 인슐린 또는 화합물 CDE의 조합들, 및 8-CPT/Dex, 인슐린 및 화합물 CDE의 조합들로 처리된 마우스 간세포의 배양 배지에서 상대적 글루코스 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 10B는 대조군, 8-CPT/Dex, 8-CPT/Dex와 인슐린 또는 화합물 CDE의 조합들, 및 8-CPT/Dex, 인슐린 및 화합물 CDE의 조합들로 처리된 마우스 간세포의 배양 배지에서 상대적 G6pc mRNA 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 10C는 대조군, 8-CPT/Dex, 8-CPT/Dex와 인슐린 또는 화합물 CDE의 조합들, 및 8-CPT/Dex, 인슐린 및 화합물 CDE의 조합들로 처리된 마우스 간세포의 배양 배지에서 상대적 LDH 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 비히클 처리 그룹 (그래프에서 첫번째 막대)에 대해, *는 P < 0.05 임.
도 11은 무혈청 배지에서 배양된 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산 및 세포외 LDH 활성에 대한 화합물 CDE의 효과를 보여준다.
도 11a는 6시간 동안 8-CPT/Dex의 존재 또는 부재하에 기저 대조군 (물 비히클), 10 또는 100nM 인슐린 (Ins), 150ppb또는 300ppb 화합물 CDE, 및 인슐린과 화합물 CDE의 조합들로 처리된 마우스 간세포의 배양 배지에서 상대적 글루코스 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 기저 대조군 그룹 (그래프에서 첫번째 막대)에 대해, #는 P < 0.05 임. 8-CPT/Dex 처리 그룹 (그래프에서 첫번째 검은색 막대) 에 대해, *는 P < 0.05 임.
도 11b는 6시간 동안 8-CPT/Dex의 존재 또는 부재하에 기저 대조군 (물 비히클), 10 또는 100nM 인슐린 (Ins), 150ppb또는 300ppb 화합물 CDE, 및 인슐린과 화합물 CDE의 조합들로 처리된 마우스 간세포에서 배양 배지에서 상대적 LDH 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 12는 마우스 일차 간세포에서 인산화 Pdk1 (pPdk1), 세린473에서의 Akt (pAktS473), 트레오닌24에서의 Foxo1 (pFoxo1T24), 트레오닌32에서의 Foxo3 (pFoxo3T32), 트레오닌28에서의 Foxo4 (pFoxo4T28), 및 세린9에서의 Gsk3b (pGsk3bS9)의 단백질 발현 수준에 대한 화합물 CDE의 효과를 보여준다.
도 12a는 마우스 일차 간세포에서 pPdk1, pAktS473, pFoxo1T24, pFoxo3T32, pFoxo4T28, 및 pGsk3bS9의 단백질 수준에 대한 대조군, 인슐린, 또는 150 ppb 또는 300 ppb 화합물 CDE의 효과를 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 12b는 대조군, 100nM의 인슐린, 또는 150 ppb 또는 300 ppb 화합물 CDE로 처리된 마우스 간세포에서 상대적 pPdk1 단백질 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 12c는 대조군, 100nM의 인슐린, 또는 150 ppb 또는 300 ppb 화합물 CDE로 처리된 마우스 간세포에서 상대적 pAktS473 단백질 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 12d는 대조군, 100nM의 인슐린, 또는 150 ppb 또는 300 ppb 화합물 CDE로 처리된 마우스 간세포에서 상대적 pFoxo1T24 단백질 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 12e는 대조군, 100nM의 인슐린, 또는 150 ppb 또는 300 ppb 화합물 CDE로써 처리된 마우스 간세포에서 상대적 pFoxo3T32 단백질 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 12f는 대조군, 100nM의 인슐린, 또는 150 ppb 또는 300 ppb 화합물 CDE로써 처리된 마우스 간세포에서 상대적 pGsk3bS9 단백질 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 13은 무혈청 조건 하에 배양된 마우스 일차 간세포에서 인산화 Pdk1, Akt, Foxo1 및 Foxo3의 단백질 발현 수준에 대한 화합물 CDE 처리의 시간-효과를 보여준다.
도 13a는 마우스 일차 간세포에서 pPdk1, pAktT308, pFoxo1T24, pFoxo3T32, Akt, 및 Actb의 단백질 수준에 대해 0분, 5분, 30분, 1시간, 2시간, 및 3시간 동안의 화합물 CDE 처리의 효과를 보여주는 웨스턴 블롯이다.
도 13b는 0분, 5분, 30분, 1시간, 2시간, 및 3시간 동안 화합물 CDE로써 마우스 간세포를 처리한 후에 상대적 pPdk1 단백질 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 화합물 CDE 무처리 (0분 그룹)과 비교한 경우, *는 P 적어도 < 0.05임.
도 13c는 0분, 5분, 30분, 1시간, 2시간, 및 3시간 동안 화합물 CDE로써의 마우스 간세포를 처리한 후에 상대적 pAktT308 단백질 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 화합물 CDE 무처리 (0분 그룹)과 비교한 경우, #는 P < 0.15이고, *는 PP 적어도 < 0.05임.
도 13d는 0분, 5분, 30분, 1시간, 2시간, 및 3시간 동안 화합물 CDE로써의 마우스 간세포의 처리 후에 결합된 pFoxo1T24 및 pFoxo3T32 단백질 수준을 보여주는 막대 그래프이다. 화합물 CDE 무처리 (0분 그룹)과 비교한 경우, #는 P < 0.15이고, *는 P 적어도 < 0.05임.
도 14는 Lepr db/db 마우스에서 혈액 글루코스 수준에 대한 화합물 CDE의 효과를 보여준다.
도 14a는 마우스 연령 27일에서 3.5개월까지 격일로 생리학적 식염수 또는 화합물 CDE를 복강내 주입한 후에 Lepr db/db 마우스에서 혈액 글루코스 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 14b는 마우스 연령 38일에서 66일까지 매일 생리학적 식염수 또는 화합물 CDE를 복강내 주입한 후에 Lepr db/db 마우스에서 혈액 글루코스 수준을 보여주는 막대 그래프이다.
도 15는 마우스 연령 27일에서 3.5개월까지 격일로 생리학적 식염수 또는 화합물 CDE를 복강내 주입한 후에 Lepr db/db 마우스에서 글루코스 내성에 대한 화합물 CDE의 효과를 보여준다.
도 15a는 제로 시점 (글루코스 주입 직전에 결정됨) 및 글루코스 주입 후의 다양한 시점 (0.25 시간, 0.5 시간, 1 시간 및 2 시간)에서 식염수- 및 화합물 CDE-처리된 Lepr db/db 마우스에서 혈액 글루코스 수준에 대한 화합물 CDE의 효과를 보여주는 그래프이다. 식염수-처리된 그룹과 동일한 시점에서 비교했을 때 *에서 P는 적어도 < 0.05 임을 나타낸다.
도 15b는 도 15a의 그래프에서 곡선 아래 면적 (AUC)의 정량 분석을 보여주는 그래프이다.
[발명의 상세한 설명]
정의
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "투여" 및 "투여하는"은 약물, 전구약물, 또는 기타 제제, 또는 치료적 처치 (예를 들어, 본 출원의 조성물)를 생체 내, 시험관 내 대상체에, 또는 생체 외 세포, 조직 및 장기에 제공하는 행위를 지칭한다. 본 명세서의 화합물 및 조성물은 당해 분야에 공지된 임의의 투여 경로에 의해 대상체에 제공될 수 있다. 인간 신체에의 예시적 투여 경로는 눈 (안구), 입 (경구), 피부 (국소 또는 경피), 코 (비강), 폐 (흡입제), 경구 점막 (볼), 뇌, 귀, 직장, 질을 통하거나 주사에 의한 것일 수 있다. 주사 경로는 정맥내, 피하, 근육내, 복강내 등으로 투여될 수 있다.
용어 "알킬"은 1 내지 24개의 탄소 원자, 및 바람직하게는 적어도 3개의 탄소 원자의 분지되거나 분지되지 않은 포화 탄화수소기를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "알킬"기는 1 내지 16개의 탄소원자를 함유하며 (즉, C1-16 알킬이고), 구체적으로, 다른 실시양태에서, 알킬은 3 내지 16개 원자를 포함한다 (즉, C3-16 알킬이다). 알킬기는 아실, 아미노, 아미도, 아지도, 카르복실, 알킬, 아릴, 할로, 구아니딜, 옥소, 설파닐, 설페닐, 설포닐, 헤테로사이클릴 또는 히드록실기로 선택적으로 치환될 수 있다. 알킬기의 추가 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소-펜틸, 네오-펜틸, 헥실, 이소-헥실, 3-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸, 네오-헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실 및 헥사데실이 포함된다.
C3-C16 알킬의 한 실시양태에서, 알킬은 치환된 알킬은 아니다. 다른 실시양태에서, 치환된 알킬은 카르복실기 및 아미노기를 둘 모두 갖지 않는다. 추가 실시양태에서, C3-C16 알킬은 카르복실기 및 아미노기를 둘 모두 갖는 치환된 알킬은 아니다.
용어 "알칼리 금속"은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 적합한 알칼리금속 (예를 들면 IA족) 염, 알칼리토금속염 (예를 들면 IIA족), 및 기타 생리학적으로 허용가능한 금속이 포함되는 금속 염을 지칭한다. 금속염은 알루미눔, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 포타슘, 소듐, 아연 또는 이들의 조합으로부터 제조될 수 있다.
용어 "알케닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 이중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지된 탄소 쇄를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "알케닐"은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 탄소 원자를 함유하는 탄화수소 (즉 C1-10 알케닐)을 지칭한다. 알케닐 기의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 에텐, 프로펜, 부텐, 펜텐, 헥센, 헵텐, 옥텐, 노넨 및 데센이 포함된다. 알케닐 기는 아미노, 알킬, 할로, 또는 히드록실 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "아미도"는 --CONR'R'' 모이어티와 같은 C-아미도 기 또는 --NR'COR'' 모이어티와 같은 N 아미도 기 중 어느 하나를 지칭하고, 여기서 R' 및 R''는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 알콕시, 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 아릴, 또는 아르알킬일 수 있다. "설포아미도" 기는 --NR'--SO2--R'' 모이어티를 포함하고, 여기서 R' 및 R''는 수소, 알킬, 아릴, 또는 아르알킬이다.
용어 "알키닐"은 적어도 하나의 탄소-탄소 삼중 결합을 함유하는 직쇄 또는 분지된 탄소 쇄를 지칭한다. 예시적인 실시양태에서, "알키닐"은 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 탄소 원자를 함유하는 탄화수소 (즉, C2-10 알키닐)을 지칭한다. 알키닐 기의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 에틴, 프로핀, 부틴, 펜틴, 헥신, 헵틴, 옥틴, 노닌 및 데신이 포함된다. 알키닐 기는 아미노, 알킬, 할로, 또는 히드록실 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "아릴"은 1, 2 또는 3개 고리를 함유하는 카르보사이클릭 방향족계를 지칭한다. 상기 고리들은 펜던트 방식으로 함께 부착될 수 있거나 또는 함께 융합될 수 있다. 용어 "아릴"은 페닐, 나프틸, 테트라히드로나프틸, 테트랄린, 인단, 인덴 및 비페닐과 같은 방향족 기를 포함한다. 아릴 기는 아미노, 알킬, 할로, 히드록실, 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 또는 또 다른 아릴 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
본원에서 사용되는 "조합"은 복수개의 성분들을 지칭한다. 조합은 원자, 화합물, 조성물, 구성분, 성분, 요소, 모이어티, 분자 또는 혼합물을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어질 수 있거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다. 조합에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 혼합물이 포함된다.
용어 "융합된"은 제2 고리가 제1 고리와 공통으로 (즉, 공유된) 2개의 인접한 원자들을 가짐으로써 존재하는 (즉, 부착되거나 형성되는) 것을 의미한다. 용어 "융합된"은 용어 "축합된", "부착된" 및 "결합된"과 동등하고, 이들은 서로 호환적으로 사용될 수 있다.
용어 "사이클로알킬"은 다수의 고리 원자들을 포함하는, 모노사이클릭의 포화된 또는 부분적으로 포화된 탄소 고리를 지칭한다. 일부 실시양태에서, "사이클로알킬"은 3-12 고리 원자를 함유하는 탄소 고리 (즉, C3-12 사이클로알킬)를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 사이클로알킬은 모노사이클로, 가교된, 스피로형의, 융합된, 바이사이클로 및 트리사이클로 고리 구조를 포함한다. 사이클로알킬 기의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 사이클로프로필, 사이클로부틸, 사이클로펜틸, 사이클로펜테닐, 사이클로헥실, 사이클로헥세닐, 사이클로헵틸, 사이클로헵테닐, 노르보르닐, 데칼린, 아다만틸, 및 사이클로옥틸이 포함된다. 사이클로알킬 기는 아미노, 알킬, 할로, 또는 히드록실 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "아르알킬"은 아릴-치환된 알킬 모이어티를 지칭한다. 아르알킬 기는 "저급 아르알킬" 기일 수 있고, 여기서 아릴기는 1 내지 6개 탄소 원자를 갖는 알킬기에 부착되어 있다. 아르알킬 기의 예시에는 벤질, 디페닐메틸, 트리페닐메틸, 페닐에틸, 및 디페닐에틸이 포함된다. 용어 "벤질" 및 "페닐메틸"은 서로 호환적이다. 일부 실시양태에서, 알킬은 C3-C16 알킬이다. 다른 구현예에서, 알킬은 카르복실기 및 아미노기 둘 모두를 갖는 치환된 알킬기는 아니다.
용어 "아릴옥시"는 산소 원자에 부착된 아릴 기를 지칭한다. 아릴옥시 기는 할로, 히드록실, 또는 알킬 기로 선택적으로 치환될 수 있다. 이러한 기의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 페녹시, 4-클로로-3-에틸페녹시, 4-클로로-3-메틸페녹시, 3-클로로-4-에틸페녹시, 3,4-디클로로페녹시, 4-메틸페녹시, 3-트리플루오로메톡시페녹시, 3-트리플루오로메틸페녹시, 4-플루오로페녹시, 3,4-디메틸페녹시, 5-브로모-2-플루오로페녹시, 4-브로모-3-플루오로페녹시, 4-플루오로-3-메틸페녹시, 5,6,7,8-테트라히드로나프틸옥시, 3-이소프로필페녹시, 3-사이클로프로필페녹시, 3-에틸페녹시, 4-터트-부틸페녹시, 3-펜타플루오로에틸페녹시, 및 3-(1,1,2,2-테트라플루오로에톡시)페녹시가 포함된다.
용어 "알콕시"는 알킬 또는 사이클로알킬 기로 치환된 옥시-함유기를 지칭한다. 알콕시기의 예시에는, 제한 없이, 메톡시, 에톡시, tert-부톡시, 및 사이클로헥실옥시가 포함된다. "저급 알콕시" 기는 1 내지 6개 탄소 원자를 가지며, 이로 제한되는 것은 아니지만, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 부톡시, 이소프로폭시, 및 tert-부톡시 기가 포함된다.
용어 "아르알콕시"는 산소 원자를 통해 다른 기에 부착되는 옥시-함유 아르알킬 기를 지칭한다. "저급 아르알콕시" 기는 저급 알콕시기에 부착된 페닐기들이다. 저급 아르알콕시 기의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 벤질옥시, 1-페닐에톡시, 3-트리플루오로메톡시벤질옥시, 3-트리플루오로메틸벤질옥시, 3,5-디플루오로베닐옥시, 3-브로모벤질옥시, 4-프로필벤질옥시, 2-플루오로-3-트리플루오로메틸벤질옥시, 및 2-페닐에톡시가 포함된다.
용어 "아실"은 -C(=O)R 모이어티를 지칭하고, 여기서 R은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 아릴, 또는 아르알킬이다. 바람직하게는, R은 수소, 알킬, 아릴, 또는 아르알킬이다.
용어 "카르복실"은 --R'C(=O)OR'' 부위를 지칭하고, 여기서 R' 및 R''는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 헤테로사이클로알킬, 아릴, 에테르, 또는 아르알킬이다. R'은 부가적으로 공유 결합일 수 있다. "카르복실"에는 카르복실산, 및 카르복실산 에스테르 둘 모두가 포함된다.
용어 "카르복실산"은 R''이 수소, 또는 염인 카르복실 기를 지칭한다. 카르복실산에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부티르산, 발레르산, 2-메틸 프로피온산, 옥시란-카르복실산, 및 사이클로프로판 카르복실산이 포함된다.
용어 "카르복실산 에스테르" 또는 "에스테르"는 R''이 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 아릴, 또는 아르알킬인 카르복실 기를 지칭한다. 카르복실산의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 포름산, 아세트산, 프로피온산, 부타노산, 펜타노산, 헥사노산, 헵타노산, 옥타노산, 노나노산, 데카노산, 사이클로프로판카르복실산, 사이클로부탄카르복실산, 사이클로펜탄카르복실산, 사이클로헥산카르복실산, 사이클로헵탄카르복실산, 사이클로옥탄카르복실산, 또는 사이클로노난카르복실산이 포함된다.
용어 "카르보닐"은 C=O 모이어티를 지칭하며, 또한 "옥소" 기로도 알려져 있다.
용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릴" 또는 "헤테로사이클릭 고리"는 3 내지 12개의 탄소 원자를 갖는 방향족 또는 비-방향족 사이클릭 탄화수소를 지칭한다. 예시적인 실시양태에서, "헤테로사이클릴"은 3, 4, 5, 또는 6개 고리 원자를 함유하는 사이클릭 탄화수소 (즉, C3-6 헤테로사이클릴)를 지칭한다. 헤테로사이클은 선택적으로 치환될 수 있으며, 포화되거나 불포화될 수 있다. 대표적으로, 고리 원자 중의 적어도 하나는 산소 (O), 질소 (N), 황 (S), 인 (P), 또는 셀레늄 (Se)이다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 헤테로사이클릴로부터의 고리 N 원자는 -C(O) 모이어티에 결합하여 아마이드, 카르바메이트, 또는 우레아를 형성하는 원자이다. 헤테로사이클릭 기의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 아지리딘, 옥시란, 티이란, 아제티딘, 옥세탄, 티에탄, 피롤리딘, 이미다졸, 테트라히드로퓨란, 피란, 티오피란, 티오모르폴린, 티오모르폴린 S-옥사이드, 옥사졸린, 테트라히드로티오펜, 피페리딘, 테트라히드로피란, 티안, 이미다졸리딘, 옥소디옥솔레닐, 옥사졸리딘, 티아졸리딘, 디옥솔란, 디티올란, 피페라진, 옥사진, 디티안, 디옥산, 피리디닐, 퓨라닐, 벤조퓨라닐, 이소벤조퓨라닐, 피롤릴, 티에닐, 1,2,3-트리아졸릴, 1,2,4-트리아졸릴, 인돌릴, 이미다졸릴, 티아졸릴, 티아디아졸릴, 피리미디닐, 옥사졸릴, 트리아지닐, 및 테트라스틸라가 포함된다. 예시적인 헤테로사이클에는 벤즈이미다졸, 디히드로티오펜, 디옥신, 디옥산, 디옥솔란, 디티안, 디티아진, 디티아졸, 디티올란, 퓨란, 인돌, 3-H 인다졸, 3-H-인돌, 인돌리진, 이소인돌, 이소티아졸, 이속사졸, 모르폴린, 옥사졸, 옥사디아졸, 옥사티아졸, 옥사티아졸리딘, 옥사진, 옥사디아진, 피페라진, 피페리딘, 퓨린, 피란, 피라진, 피라졸, 피리딘, 피리미딘, 피리미딘, 피리다진, 피롤, 피롤리딘, 테트라히드로퓨란, 테트라진, 티아디아진, 티아디아졸, 티아트리아졸, 티아진, 티아졸, 티오펜, 트리아진, 및 트리아졸이 포함된다. 헤테로사이클은 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 히드록실, 카르보사이클릭, 티오, 다른 헤테로사이클릭, 또는 아릴 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "헤테로아릴"은 복수개의 고리 원자들 중의 적어도 하나가 O, N, S, P 또는 Se인, 사이클릭 탄화수소를 지칭한다. 헤테로아릴의 고리는 고리 구성원들 사이에 공유된 비국재화 [pi] 전자 (방향성)를 특징으로 한다. 본원에 정의된 바의 헤테로아릴 모이어티는 탄소(C), N, S, P 또는 Se 결합 핸드 (bonding hand)을 갖는다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 헤테로아릴로부터의 고리 N 원자는 -C(O) 모이어티에 결합하여 아마이드, 카르바메이트, 또는 우레아를 형성하는 원자이다. 예시적인 실시양태에서, "헤테로아릴"은 5 또는 6개 고리 원자를 포함하는 사이클릭 (즉, C5-6 헤테로아릴)을 지칭한다. 헤테로아릴 기의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 피롤, 퓨란, 티엔, 옥사졸, 티아졸, 이속사졸, 이소티아졸, 이미다졸, 피라졸, 옥사디아졸, 티아디아졸, 트리아졸, 테트라졸, 피리딘, 피리미딘, 피라진, 피리다진, 및 트리아진이 포함된다.
용어 "히드록시" 또는 "히드록실"은 치환기 -OH를 지칭한다.
용어 "옥소"는 치환기 =O를 지칭한다.
용어 "니트로"는 NO2를 지칭한다.
용어 "아지도"는 N3을 지칭한다.
용어 "황 유사체(들)"는 하나 이상의 셀레늄 원자가 하나 이상의 황 원자로 대체되어 있는 화합물의 유사체이다.
용어 "설파닐"은 --SR' 모이어티를 지칭하고, 여기서 R'은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 아릴, 또는 아르알킬이다.
용어 "설페닐"은 --SOR' 모이어티를 지칭하고, 여기서 R'은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 아릴, 또는 아르알킬이다.
용어 "설포닐"은 --SOR' 모이어티를 지칭하고, 여기서 R'은 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 아릴, 또는 아르알킬이다.
용어 "케톤"은 카르보닐 탄소가 2개의 다른 탄소 원자에 결합되어 있는 적어도 하나의 카르보닐 기를 함유하는 모이어티를 지칭한다. 예시적인 실시양태에서, "케톤"은 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 탄소 원자를 함유하는 카르보닐-함유 모이어티 (즉, C3-10 케톤)을 지칭한다. 케톤 기의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 아세톤, 부타논, 펜타논, 헥사논, 헵타논, 옥타논, 노나논, 데카논, 사이클로부타논, 사이클로펜타논, 사이클로헥사논, 사이클로헵타논, 사이클로옥타논, 사이클로노나논 및 사이클로데카논이 포함된다.
용어 "아미노"는 화학식 --NR'R''의 일차, 이차 또는 삼차 기를 지칭하고, 여기서 R' 및 R''는 독립적으로 수소, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 아릴, 카르복실, 사이클로알킬, 헤테로사이클릭, 또는 또 다른 아미노기 (히드라지드의 경우에서와 같음)이다. R' 및 R''는 이들이 부착된 질소 원자와 함께 4-8 원자를 갖는 고리를 형성한다. 따라서, 용어 "아미노"에는 비치환된, 일치환된 (예컨대, 모노알킬아미노 또는 모노아릴아미노), 및 이치환된 (예컨대, 디알킬아미노 또는 아르알킬아미노) 아미노 기가 포함된다. 아미노 기에는 --NH2 모이어티, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 메틸-에틸아미노, 피롤리딘-1-일 또는 피페리디노, 모르폴리노 등이 포함된다. 고리를 형성하는 다른 예시적인 "아미노" 기에는 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이미다졸릴, 이소인돌릴, 인돌릴, 인다졸릴, 퓨리닐, 퀴놀리지닐이 포함된다. 아미노 기를 함유하는 고리는 또 다른 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 또는 히드록실 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "아민"은 화학식 --NR'R''의 일차, 이차 또는 삼차 아미노 기를 지칭하고, 여기서 상기 정의에서 사용된 바의 R' 및 R''는 독립적으로 수소, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 아릴, 카르복실, 사이클로알킬, 헤테로사이클릭, 또는 다른 아미노 (히드라지드의 경우)이거나 또는 R' 및 R''는 이들이 부착되는 질소 원자와 함께 4-8 원자를 갖는 고리를 형성한다. 따라서, 본원에서 사용되는 용어 "아미노"에는 비치환된, 일치환된 (예컨대, 모노알킬아미노 또는 모노아릴아미노), 및 이치환된 (예컨대, 디알킬아미노 또는 아르알킬아미노) 아미노 기를 포함된다. 아미노 기에는 --NH2, 메틸아미노, 에틸아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 메틸-에틸아미노, 피롤리딘-1-일 또는 피페리디노, 모르폴리노 등이 포함된다. 고리를 형성하는 다른 예시적인 "아미노" 기에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 피롤릴, 이미다졸릴, 피라졸릴, 이소티아졸릴, 이속사졸릴, 피리딜, 피라지닐, 피리미디닐, 피리다지닐, 인돌리지닐, 이미다졸릴, 이소인돌릴, 인돌릴, 인다졸릴, 퓨리닐, 퀴놀리지닐이 포함된다. 아미노 기를 함유하는 고리는 또 다른 아미노, 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로, 또는 히드록실 기로 선택적으로 치환될 수 있다.
용어 "알코올"은 "히드록시", "히드록실" 또는 -OH 모이어티를 포함하는 임의의 치환기를 지칭한다.
용어 "아미노 알코올"은 알코올 및 아민기를 둘 모두 함유하는 관능기를 지칭한다. "아미노 알코올"은 또한 카르복실산 기 대신에 알코올에 결합된 탄소를 갖는 아미노산을 지칭한다. 예시적인 실시양태에서, "아미노 알코올"은 알코올-보유 탄소에 인접한 탄소에 결합되는 아민을 포함한다. 예시적인 실시양태에서, "아미노 알코올"은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개 탄소 원자를 함유하는 아민 및 알코올-함유 모이어티 (즉, C1-12 아미노 알코올)를 지칭한다. 아미노 알코올의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 에탄올아민, 헵트아미놀, 이소에타린, 노르에피네프린, 프로판올아민, 스핑고신, 메탄올아민, 2-아미노-4-머캅토부탄-1-올, 2-아미노-4-(메틸티오)부탄-1-올, 시스테이놀, 페닐글리시놀, 프롤리놀, 2-아미노-3 -페닐-1-프로판올, 2-아미노-1-프로판올, 사이클로헥실글리시놀, 4-히드록시-프롤리놀, 류시놀, tert-류시놀, 페닐알라니놀, a-페닐글리시놀, 2-피롤리딘메탄올, 티로시놀, 발리놀, 세리놀, 2-디메틸아미노에탄올, 히스티디놀, 이소류시놀, 류시놀, 메티오니놀, 1-메틸-2-피롤리딘메탄올, 트레오니놀, 트립토파놀, 알라니놀, 아르기니놀, 글리시놀, 글루타미놀, 4-아미노-5-히드록시펜탄아마이드, 4-아미노-5-히드록시펜타노산, 3-아미노-4-히드록시부타노산, 리시놀, 3-아미노-4-히드록시부탄아마이드, 및 4-히드록시-프롤리놀이 포함된다.
용어 "아미노산"은 카르복실산 및 상기 카르복실레이트 기에 바로 인접한 탄소 원자에 결합된 아민을 함유하는 기를 지칭하고, 천연 및 합성 아미노산 둘 모두를 포함한다. 아미노산의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판이 포함된다. 일부 실시양태에서, 카르복실은 H, 염, 에스테르, 알킬, 또는 아르알킬로 치환된다. 아미노 기는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르복실, 사이클로알킬, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로 또한 치환될 수 있다.
용어 "에테르"는 --R'--O--R'' 모이어티를 지칭하고, 여기서 R' 및 R''는 독립적으로 수소, 알킬, 알케닐, 알키닐, 카르보사이클릭, 헤테로사이클릭, 아릴, 또는 아르알킬이다. R'은 부가적으로 탄소에 부착된 공유 결합일 수 있다.
용어 "할로겐"은 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자를 지칭한다.
용어 "할라이드"는 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자에 결합된 원자를 함유하는 관능기를 지칭한다. 본원에 기술된 예시적인 실시양태에는 "알킬 할라이드", "알케닐 할라이드", "알키닐 할라이드", "사이클로알킬 할라이드", "헤테로사이클릴 할라이드", 또는 "헤테로아릴 할라이드" 기가 포함될 수 있다. 예시적인 실시양태에서, "알킬 할라이드"는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개 탄소 원자를 함유하는 탄소-할로겐 결합을 함유하는 모이어티 (즉, C1-10 알킬 할라이드)를 지칭한다. 알킬 할라이드 기의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 플루오로메틸, 플루오로에틸, 클로로메틸, 클로로에틸, 브로모메틸, 브로모에틸, 요오도메틸 및 요오도에틸 기가 포함된다. 달리 지시되지 않는 한, 본원에 언급된 임의의 탄소-함유 기는 하나 이상의 탄소-할로겐 결합을 함유할 수 있다. 비제한적인 예시로서, C1알킬기는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 메틸, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 클로로메틸, 디클로로메틸, 트리클로로메틸, 브로모메틸, 디브로모메틸, 트리브로모메틸, 요도도메틸, 디요오메틸, 트리요오도메틸, 클로로플루오로메틸, 디클로로플루오로메틸, 및 디플루오로클로로메틸일 수 있다.
본원에 기술된 화합물에서, 헤테로원자는 다수의 다른 원자가를 가질 수 있다. 비제한적인 예시로서, S, Se 및 N은 중성이거나 또는 양성 전하를 가질 수 있다. 또한, O는 중성이거나 또는 양성 또는 음성 전하를 가질 수 있다.
본 발명의 화합물 및 조성물의 예시적인 실시양태는 화학식 (I), (II), 또는 (III)을 포함하는데, 이들은 예시적 화합물의 디아스테레오머 및 에난티오머를 포함할 수도 있다. 에난티오머는 서로의 거울상이고 중첩될 수 없는 한 쌍의 분자적 실체의 하나로서 정의된다. 디아스테레오머 또는 디아스테레오이소머는 에난티오머 이외의 스테레오이소머로서 정의된다. 디아스테레오머 또는 디아스테레오이소머는 거울상으로 관련되지 않는 스테레오이소머이다. 디아스테레오이소머는 물리적 특성에서의 차이를 특징으로 한다.
본 발명의 실시양태는 하기 화학식 (I)에 따른 화합물, 또는 이의 약 학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함할 수 있다:
본 발명의 실시양태는 하기 화학식 (I)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함할 수 있다:

R1은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택됨; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R3은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 R4 및 이들이 부착되는 원자와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R4는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 이들이 부착되는 원자 및 R4와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R5는 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택된다.
R6는 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택된다.
R7은 C3-C16알킬, 여기서 C3-C16알킬은 카르복실기 및 아미노기를 둘 모두 갖는 치환된 알킬기는 아님, 알케닐, 알키닐, 케톤, 아미노알콜, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, OR', Se-R', S-R'이고, 여기서 OR'에서의 R'은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, Se-R'에서의 R'은 H, C3-C16알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, S-R'에서의 R'은 H, C3-C16알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고;
R8은 수소, 아지도, 알킬, 알케닐, 알키닐이다.
용어 "화합물 C"는 (2R,4S,5S)-2-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-5-((메틸셀라닐)메틸)테트라히드로퓨란-3,4-디올 (CAS 등록 번호 5135-40-0)로도 알려져 있는 5'-메틸셀레노아데노신을 지칭하고, 이의 임의의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

본 발명의 또 다른 실시양태는 화학식 (II)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함할 수 있다:

상기식에서,
R1은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R3은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 R4 및 이들이 부착되는 원자와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R4는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 이들이 부착되는 원자 및 R4와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R5는 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고;
R6은 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고;
R8은 수소, 아지도, 알킬, 알케닐, 알키닐이고;
R9는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R9는 R10과 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R10은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R9는 R10과 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고; 및
R11은 OR, 알콕시, 아르알콕시 또는 아미노이고, 여기서 R은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 또는 약학적으로 허용가능한 염, 또는 내부 염으로부터 선택된다.
용어 "화합물 D"는 5'-셀레노-아데노실 호모시스테인; (2R)-2-아미노-4-((((2S,3S,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-3,4-디히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메틸)셀라닐)부타노산 (CAS 등록 번호 4053-91-2)를 지칭하고, 이의 임의의 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

본 발명의 추가 실시양태는 화학식 (III)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함할 수 있다:

상기 식에서,
R1은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴임; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R3은 OH, OR, 알콕시, 아르알콕시, 또는 아미노이고, 여기서 R은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 또는 약학적으로 허용가능한 염, 또는 내부 염으로부터 선택되고;
R4는 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 또는 약학적으로 허용가능한 염, 또는 내부 염이고;
R5는 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고;
R6는 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고; 및
R7은 C3-C16알킬, 여기서 C3-C16알킬은 카르복실기 및 아미노기를 둘 모두 갖는 치환된 알킬기가 아님, 알케닐, 알키닐, 케톤, 아미노알콜, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, OR', Se-R', S-R'이고, 여기서 OR'에서의 R'은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, Se-R'에서의 R'은 H, C3-C16알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, S-R'에서의 R'은 H, C3-C16알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
용어 "화합물 E"는 N5-(1-카르복시-2-(메틸셀라닐)에틸)-L-글루타민으로도 알려져 있는, γ-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인; 또는 이의 임의의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.

용어 "화합물 CDE", "화합물들 CDE", "화합물 CDE 조합" 또는 "조합된 화합물 CDE"는 화합물 C, 화합물 D 및 화합물 E, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 조합 또는 혼합물을 지칭한다.
용어 "화합물 H"는 5'-메틸티오아데노신; 5'-S-메틸-5'-티오아데노신 (CAS 등록 번호 2457-80-9), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.

용어 "화합물 I"는 (S)-5'-(S)-(3-아미노-3-카르복시프로필)-5'-티오아데노신 (CAS 등록 번호 979-92-0)으로도 알려진, S-아데노실-L-호모시스테인 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.

용어 "화합물 J"는 감마-글루타밀-메틸-시스테인으로도 알려진, γ-L-글루타밀-메틸-L-시스테인, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.

용어 "화합물 HIJ"는 화합물 H, 화합물 I 및 화합물 J의 혼합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 지칭한다.
용어 "유사체" 및 "유도체"는 서로 호환적이고 소정의 분자의 적어도 하나의 위치의 자연적 또는 비자연적 변형을 지칭한다. 예를 들어, 소정의 화합물 또는 분자의 유도체는 관능기 또는 원자의 부가, 관능기 또는 원자의 제거 또는 관능기 또는 원자의 다른 관능기 또는 원자(이로 제한되는 것은 아니지만, 동위원소 포함) 로의 변화 중의 어느 하나에 의해 변형된다.
용어 "포함하는"은 포괄적이고 부가적인 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는 조성물, 화합물, 제형 또는 방법을 지칭한다. 용어 "포함하는"은 포괄적이고 부가적인 요소 또는 방법 단계를 제외하지 않는, 본 발명의 조성물, 화합물, 제형 또는 방법 실시양태들을 또한 지칭한다.
용어 "이루어진"은 임의의 부가적인 성분 또는 방법 단계의 존재를 제외하는 화합물, 조성물, 제형, 또는 방법을 지칭한다. 용어 "이루어진"은 임의의 부가적인 성분 또는 방법 단계의 존재를 제외하는, 본 발명의 화합물, 조성물, 제형, 또는 방법을 또한 지칭한다.
용어 "필수적으로 이루어진"은 조성물, 화합물, 제형 또는 방법의 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 부가적인 요소 또는 방법 단계를 포괄하는 조성물, 화합물, 제형 또는 방법을 지칭한다. 용어 "필수적으로 이루어진"은 조성물, 화합물, 제형 또는 방법의 특징(들)에 실질적으로 영향을 미치지 않는 부가적인 요소 또는 방법 단계를 포괄하는, 본 발명의 조성물, 화합물, 제형 또는 방법을 또한 지칭한다.
용어 "화합물(들)"은 질환, 질병, 병, 또는 신체 기능의 장애를 치료, 진단, 또는 예방하기 위해 사용될 수 있는 임의의 하나 이상의 화학적 실체, 모이어티, 조제약, 약물 등을 지칭한다. 화합물은 본 출원의 스크리닝 방법을 이용하여 치료제인 것으로 결정될 수 있다.
용어 "조성물(들)"은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 담체 제제와 같은 다른 제제를 갖거나 갖지 않는 하나 이상의 화합물들의 조합을 지칭한다. (예컨대, 조성물을 시험관 내, 생체 내 또는 생체 외 진단적 또는 치료적 용도에 특히 적합하게 만드는, 비활성 또는 활성인 담체를 갖는 하나 이상의 셀레늄 함유 화합물).
용어 "성분"은 화합물, 또는 조성물의 구성 부분을 지칭한다. 예를 들어, 조성물의 성분들에는 화합물, 담체, 및 조성물 내에 존재하는 임의의 기타 제제가 포함될 수 있다.
용어 "유효량"은 유익한 또는 원하는 결과를 초래하기에 충분한 조성물 또는 화합물의 양을 지칭한다. 유효량은 하나 이상의 적용 또는 투약량으로 투여될 수 있고 특별한 제형 또는 투여 경로로 제한되는 것으로 의도되지 않는다.
용어 "수화물"은 분자 형태로 물과 연관되고 (즉 H-OH 결합이 분열되지 않음) , 예를 들어, R이 본원에 기술된 화합물인 화학식 (R x H2O)로 표시될 수 있는 화합물을 지칭한다. 소정의 화합물은, 예를 들어, 일수화물 (R x H2O), 이수화물 (R2xH2O), 삼수화물 (R3xH2O)등을 포함하는, 하나 이상의 수화물을 형성할 수 있다.
용어 "억제성" 또는 "길항적"은 다른 화합물의 작용 또는 기능을 감소시키고, 제한하고, 억제하거나, 또는 차단하는 화합물의 성질을 지칭한다.
용어 "단리된"은 혼합물 내 적어도 하나의 다른 물질로부터 또는 어느 한 물질과 자연적으로 관련된 물질들로부터 그 물질의 분리를 지칭한다. 예를 들어, 합성적으로 합성된 화합물은 출발 물질 또는 중간체로부터 분리된다.
"공지의 치료적 화합물"은 (예컨대, 동물 실험 또는 인간에의 투여를 이용한 사전 경험을 통해) 어떤 치료에 효과적인 것으로 보여진 바 있는 치료적 화합물을 지칭한다. 다시 말하면, 공지된 치료적 화합물은 질환 (예컨대, 신경퇴행성 질환)의 치료에 효과가 있는 것으로 공지되거나 나타낸 화합물로 제한되지 않는다.
용어 "미토콘드리아 전위"는 막을 가로지르는 양성 전하의 순 이동 (net movement)에 의해 유지되는 내부 미토콘드리아 막을 가로지르는 전압 차이를 지칭한다.
용어 "글루코스 대사를 조절하다"는 글루코스 또는 그의 성분을 형성하거나, 전환하거나 또는 파괴시키는 생화학적 경로의, 세포나 살아있는 유기체에서 공지되거나 또는 결정된 상태로부터 화합물의 상태 (예컨대, 활성 또는 양)를 변화시키는 것을 지칭한다.
"선택적" 또는 "선택적으로"는 연속적으로 기술된 사건 또는 상황이 일어나거나 일어나지 않을 수 있는 상황을 지칭하는데, 상기 기술은 전술한 사건 또는 상황이 일어나는 경우와 일어나지 않는 경우를 포함한다. "선택적으로"는 기술된 조건이 존재하는 실시양태와, 기술된 조건이 존재하지 않는 실시양태를 포함한다. 예를 들어, "선택적으로 치환된 페닐"은, 페닐이 치환되거나 치환되지 않을 수 있다는 것, 그리고 상기 기술이 비치환된 페닐 및 치환이 존재하는 페닐을 둘 모두 포함한다는 것을 의미한다.
용어 "유기 셀레늄" 또는 "셀레노-유기 화합물"은 셀레늄이 황을 대체시킨 임의의 유기 화합물을 지칭한다. 따라서, 유기 셀레늄은 효모에 의해 생합성된 임의의 그러한 화합물을 지칭하거나, 유리 셀레노메티오넨과 같이, 화학적으로 합성된 유리 유기 셀레노-화합물을 지칭할 수 있다.
용어 "환자" 또는 "대상체"는 서로 호환적으로 사용되고 동물계의 임의의 구성원을 지칭한다. 대상체는 포유동물, 예컨대 인간, 길들여진 포유동물 (예를 들면, 개 또는 고양이) 또는 가축 포유동물 (예를 들면, 소 또는 돼지)이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "ppb"는 셀레늄-함유 화합물에 대해서는 셀레늄을 기준으로 또는 황-함유 화합물에 대해서는 황을 기준으로 10억분의 1을 지칭한다. 셀레늄 함유 화합물의 예시는 화합물 C, 화합물 D, 및 화합물 E이다. 황 함유 화합물의 예시는 화합물 H, 화합물 I, 및 화합물 J이다. 셀레늄을 기준으로 하는 ppb를 셀레늄 함유화합물의 ppb로 변환하기 위해서는, 표시된 ppb를 다음 인자들로 곱한다: 화합물 C의 경우 4.35, 화합물 D의 경우 5.46, 및 화합물 E의 경우 3.94. 황을 기준으로 하는 ppb를 황 함유 화합물의 ppb로 변환하기 위해서는, 표시된 ppb를 다음 인자들로 곱한다: 화합물 H의 경우 9.28, 화합물 I의 경우 12.00, 및 화합물 J의 경우 8.25.
어구 "약학적으로 허용가능한"은 적절한 의학적 판단의 범주 내에서, 합리적인 유익/유해 비율에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증의 유발 없이 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 그러한 화합물, 재료, 조성물, 및/또는 투약 형태를 지칭한다.
용어 "담체"는 약학적으로 허용가능한 담체를 지칭한다. 어구 "약학적으로 허용가능한 담체"는 셀레늄-함유 화합물, 유사체 또는 유도체를 하나의 장기 또는 신체 부위로부터 또 다른 장기 또는 신체 부위로 운반하거나 수송하는데 관여하는, 약학적으로 허용가능한 재료, 조성물 또는 대조군, 예컨대 액체 또는 고체 충진제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 재료를 지칭한다. 담체는 제형의 다른 성분들과 상용성이고 환자 또는 대상체에게 해롭지 않는다는 측면에서 허용 가능해야만 한다.
약학적으로 허용가능한 담체로 작용할 수 있는 재료의 일부 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만: (1) 락토스, 글루코스 및 수크로스와 같은 당; (2) 옥수수 전분 및 감자 전분과 같은 전분; (3) 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트와 같은 셀룰로스, 및 그의 유도체; (4) 분말화 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 코코아 버터 및 좌약 왁스와 같은 부형제; (9) 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유와 같은 오일; (10) 프로필렌 글리콜과 같은 글리콜; (11) 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리올; (12) 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트와 같은 에스테르; (13) 한천; (14) 마그네슘 히드록사이드 및 알루미늄 히드록사이드와 같은 완충제; (15) 알긴산; (16) 발열성 물질이 제거된 물; (17) 등장 식염수; (18) 링거 용액; (19) 에틸 알코올; (20) 포스페이트 완충액; 및 (21) 약학적 제형에 이용되는 다른 무독성 상용성 물질이 포함된다.
용어 "전구약물"은 약학적 활성인 화합물을 지칭한다. 더욱 전형적으로는, "전구약물"은 대사적 전환에 의해 약리학적으로 활성인 제제로 전환되는 비활성 화합물을 지칭한다. 본원에 기술된 화합물 또는 조성물의 전구약물은 상기 화학식 중의 임의의 화합물에 존재하는 관능기를 변형시킴으로써 제조되는데, 상기 변형물은 생체 내에서 절단되어 원래 화합물을 방출하게 하는 그러한 방식이다. 전구약물은 생리학적 조건 (예를 들면, 가수분해 또는 효소 촉매반응) 하에서 생체내 화학 변화를 용이하게 이행할 수 있으며, 그 결과, 약리학적으로 활성인 제제가 유리된다. 전구약물에는 본원에서 기술된 화학식의 임의의 화합물이 포함되는데, 여기서 히드록시, 아미노, 또는 카르복시 기는 생체 내에서 절단되어 유리 히드록실, 아미노 또는 카르복시 기를 각각 재생할 수 있는 임의의 기에 결합되어 있다. 전구약물의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 상기 화학식 중의 임의의 화합물의 에스테르 (예를 들면, 아세테이트, 포르메이트 및 벤조에이트 유도체) 또는 생리학적 pH에 도달하게 될 때 또는 효소 작용을 통해 원래의 활성 약물로 전환되는 임의의 다른 유도체가 포함된다. 적합한 전구약물 유도체의 선별 및 제조를 위한 통상적인 과정이 당해 분야에 기술되어 있다 (예를 들어, Bundgaard. Design of Prodrugs. Elsevier, 1985 참고).
용어 "정제된" 또는 "실질적으로 정제된"은 조성물의 10% 또는 미만 (예를 들면, 10% 또는 미만, 9% 또는 미만, 8% 또는 미만, 7% 또는 미만, 6% 또는 미만, 5% 또는 미만,4% 또는 미만, 3% 또는 미만, 2% 또는 미만, 1% 또는 미만)이 비활성 성분, 화합물, 또는 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 정도로, 조성물로부터 비활성 또는 억제 성분 (예를 들면, 오염물)의 제거를 지칭한다.
용어 "염"은 약학적으로 허용가능한 산 부가염 또는 유리 염기의 부가염을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 산 부가염을 형성하는데 사용될 수 있는 산의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 질산, 인산, 황산, 또는 브롬화수소산, 염산, 플루오르화수소산, 아인산과 같은 비독성 무기산으로부터 유래한 염뿐만 아니라, 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알카노산, 히드록실 알카노산, 알칸디오산, 방향족산, 지방족 및 방향족 설폰산, 및 아세트산, 말레산, 석신산, 또는 시트르산과 같은 비독성 유기산으로부터 유래한 염이 포함된다. 이러한 염의 비-제한적인 예시에는 나파디실레이트, 베실레이트, 설페이트, 피로설페이트, 비설페이트, 설파이트, 비설파이트, 니트레이트, 포스페이트, 모노히드로겐포스페이트, 디히드로겐포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트, 클로라이드, 브로마이드, 요오다이드, 아세테이트, 트리플루오로아세테이트, 프로피오네이트, 카프릴레이트, 이소부티레이트, 옥살레이트, 말로네이트, 석시네이트, 수베레이트, 세바케이트, 푸마레이트, 말레에이트, 만델레이트, 벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 프탈레이트, 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트, 페닐아세테이트, 시트레이트, 락테이트, 말레에이트, 타르트레이트, 메탄설포네이트 등이 포함된다. 이로 제한되는 것은 아니지만, 아르기네이트, 글루코네이트, 갈락투로네이트와 같은 아미노산의 염, 및 이로 제한되는 것은 아니지만, Berge, etal.("Pharmaceutical Salts," J.Pharma.Sci. 1977; 66: 1-19)에 개시된 것들과 같은 다른 염이 또한 고려된다.
용어 "약학적으로 허용가능한 염"에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 당해 분야의 기술자에게 잘 알려진 염이 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 모노-염 (예를 들면, 알칼리 금속 및 암모늄 염) 및 폴리-염 (예를 들면, 이- 또는 삼-염)이 포함된다. 예를 들면, --OH, --NH--, 또는 --P(=O)(OH)모이어티에서 수소와 같은 교환가능 기를 약학적으로 허용가능한 양이온 (예를 들면, 나트륨, 칼륨, 또는 암모늄 이온)으로 대체하여, 예를 들어 적합한 염기와의 반응에 의해 본원에 기술된 상응하는 화합물로부터 통상적으로 제조될 수 있는 경우에, 본 발명의 화합물의 약학적으로 허용가능한 염이 제조된다.
화합물이 안정한 비독성 산 또는 염기 염을 형성하기에 충분히 염기성 또는 산성인 경우에, 화합물을 염으로 투여하는 것이 적합할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염의 예시는 생리학적 허용가능한 음이온, 예를 들어, 토실레이트, 메탄설포네이트, 아세테이트, 시트레이트, 말로네이트, 타르타레이트, 석시네이트, 벤조에이트, 아스코르베이트, 알파-케토글루타레이트, 및 알파-글리세로포스페이트를 형성하는 산을 이용해 형성된 유기산 부가염이다. 히드로클로라이드, 설페이트, 니트레이트, 비카보네이트, 및 카보네이트 염을 비롯한 적합한 무기 염이 또한 형성될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염은 당해 기술분야에 잘 알려진 표준 과정을 이용하여, 예를 들어 아민과 같은 충분히 염기성인 화합물을 생리학적으로 허용가능한 음이온을 제공하는 적합한 산과 반응시킴으로써 수득될 수 있다. 카르복실산의 알칼리 금속염 (예를 들어, 나트륨, 칼륨 또는 리튬) 또는 알칼리 토금속염 (예를 들어, 칼슘) 이 또한 제조될 수 있다.
용어 "셀레늄-풍부 효모" 및 "셀렌화된 효모"는 무기 셀레늄 염과 같은 셀레늄원을 함유하는 배지에서 배양된 임의의 효모 (예를 들면, 사카로마이세스 세레비지에)를 지칭한다. 제조된 산물 내의 잔류 무기 셀레늄 염의 양은 일반적으로 매우 낮다 (예컨대, 2% 미만).
모이어티와 관련되어 용어 "치환된"은 그 모이어티 위의 허용가능한 임의의 위치에 부착된 추가의 치환기를 지칭한다. 달리 지시되지 않는 한, 모이어티는 탄소, 질소, 산소, 황, 또는 임의의 다른 허용가능한 원자를 통해 결합할 수 있다. 치환기의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 아민, 알코올, 티올, 에테르, 알켄, 알킨, 에폭시드, 아지리딘, 옥시란, 아제티딘, 디히드로퓨란, 피롤리딘, 피란, 피페리딘, 알데히드, 케톤, 에스테르, 카르복실산, 카르복실레이트, 이민, 이미드, 아지드, 아조 기, 엔아민, 알킬 할라이드, 알케닐 할라이드, 알키닐 할라이드, 아릴 할라이드, 포스핀, 포스핀 옥사이드, 포스피나이트, 포스포나이트, 포스파이트, 포스포네이트, 포스페이트, 설페이트, 설폭사이드, 설포닐 기, 설폭실 기, 설포네이트, 니트레이트, 니트라이트, 니트릴, 니트로 기, 니트로소 기, 시아네이트, 티오시아네이트, 이소티오시아네이트, 카보네이트, 아실 할라이드, 퍼옥사이드, 히드로퍼옥사이드, 헤미아세탈, 헤미케탈, 아세탈, 케탈, 오르토에스테르, 오르토카보네이트 에스테르, 설파이드, 디설파이드, 설폰산, 설폰산, 티온, 티알, 포스포디에스테르, 보론산, 보론산 에스테르, 보론산 및 보론산 에스테르가 포함된다.
용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는, 비정상이었거나 비정상이 되어가는 파라미터, 수치, 기능, 메트릭 또는 결과의 감소로 인해, 원하지 않은 생리학적 병태의 개시를 지연시키는 (예컨대, 약화시키거나 또는 지연시키는) 것, 현존하는 장애 또는 질환의 증상을 감소시키는 것, 또는 부분적 또는 전체적인 회복이나 억제 등의 유익하거나 원하는 결과를 얻는 것을 목적으로 하는 치료적 처치를 지칭한다. 유익하거나 원하는 결과에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 증상의 완화; 병태, 장애 또는 질환에서 발병 정도 또는 활력 또는 속도의 감소; 병태, 장애 또는 질환에서 상태의 안정화 (즉, 악화되지 않음); 병태, 장애 또는 질환에서 개시 지연 또는 진전의 둔화; 병태, 장애 또는 질환 상태의 개선; 및 경감 (부분적이든 전체적이든)이 포함되는데, 실제 임상 증상의 즉각적인 약화 또는 병태, 장애 또는 질환의 향상 또는 개선으로 해석 여부와는 무관하다.
용어 "유전자 발현을 특이적으로 검출할 수 있는 시약(들)"은 본원에 상세히 기술된 다양한 유전자의 발현을 검출할 수 있거나 이를 검출하기에 충분한 시약을 지칭한다. 적합한 시약의 예시에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, mRNA 또는 cDNA에 특이적으로 혼성화할 수 있는 핵산 프라이머 또는 프로브, 및 항체 (예를 들면, 모노클로날 또는 폴리클로날 항체)가 포함된다.
용어 "독성"은 독성제의 투여 전에 동일한 세포 또는 조직과 비교하여 대상체, 세포, 또는 조직에 대한 어떠한 해롭거나 유해한 효과를 지칭한다.
화합물 및 조성물
본 발명은 셀레노유기 화합물, 조성물, 및 상기 화합물 및 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 본원에 개시된 화합물 및 조성물은 다양한 생물학적 경로에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하고, 또는 글루코스 대사를 조절할 수 있다. 본 발명의 조성물, 화합물 및 방법은 간세포에서의 글루코스 대사에 역효과를 주는 것으로는 보이지 않으며, 따라서 이들은 또한 인슐린-비의존성 (II형) 진성 당뇨병을 치료하거나 방지할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태는 하기 화학식(I)에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 조성물에 관한 것이다:

상기식에서,
R1은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R3은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 R4 및 이들이 부착되는 원자와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R4는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 R4 및 이들이 부착되는 원자와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성한다.
R5는 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택된다.
R6는 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택된다.
R7은 C3-C16알킬, 여기서 C3-C16알킬은 카르복실기 및 아미노기를 둘 모두 갖는 치환된 알킬기는 아님, 알케닐, 알키닐, 케톤, 아미노알콜, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, OR', Se-R', S-R'이고, 여기서 OR'에서의 R'은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, Se-R'에서의 R'은 H, C3-C16알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, S-R'에서의 R'은 H, C3-C16알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고; 및
R8은 수소, 아지도, 알킬, 알케닐, 알키닐이다.
본원에서 기술된 조성물의 부가적 실시양태는 5'-메틸셀레노아데노신 ("화합물 C"), 및 이의 임의의 유사체, 유도체 및/또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진다. 화합물 C는 (2R,4S,5S)-2-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-5-((메틸셀라닐)메틸)테트라히드로퓨란-3,4-디올 (CAS 등록 번호 5135-40-0) 이고, 이의 임의의 유사체, 유도체 및/또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

본 발명의 조성물은 화학식 (I)의 화합물, 화합물 C 및 이들의 조합을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 본 출원의 하나의 측면은 5'-메틸셀레노아데노신, 화학식 (I)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 함유하는 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 이들 화합물 중 하나 이상은 합성적이고, 단리되고/되거나 정제될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 5'-메틸셀레노아데노신 및 하나의 다른 화합물을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진다. 다른 실시양태에서, 상기 다른 화합물은 셀레늄-함유 화합물이다. 추가의 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신 대 다른 화합물 (예컨대, 셀레늄-함유 화합물)의 비율이 적어도 1:1 내지 100:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 6:1, 또는 1:1 내지 3:1인 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 조성물이 제공되고, 여기서 R1, R3, R4 및 R8는 각각 H이고; R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', 또는 C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; R5 및 R6은 각각 부재이고; R7은 C3-C16알킬, 여기서 C3-C16알킬은 카르복실기 및 아미노기를 둘 모두 갖는 치환된 알킬기는 아님, 알케닐, 알키닐, 케톤, 아미노알콜, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, OR', Se-R', S-R'이고, 여기서 OR'에서의 R'은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, Se-R'에서의 R'은 H, C3-C16알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, S-R'에서의 R'은 H, C3-C16알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정의 실시양태에서, 적어도 약 0.033% (w/v) 내지 적어도 약 0.1% (w/v)의 화학식 (I)에 따른 화합물, 또는 5'-메틸셀레노아데노신 ("화합물 C"), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나 또는 이로 필수적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 조성물이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-셀레노아데노실 호모시스테인 및/또는 감마-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인을 제외한다. 또 다른 추가의 실시양태에서, 조성물은 5'-메틸티오아데노신, S-아데노실-L-호모시스테인, 및 감마-글루타밀-메틸-시스테인 중 하나 이상을 제외한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 (I)에 따른 화합물, 또는 5'-메틸셀레노아데노신 ("화합물 C"), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하는데, 다만, 5'-메틸티오아데노신, 감마-글루타밀-메틸-시스테인, 또는 아데노실 호모시스테인, 호모시스테인 또는 메티오닌 중 하나 이상은 제외된다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하는 조성물이 제공되며, 여기서 R1, R3, R4 및 R8는 각각 H이고; R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', 또는 C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되고; R5 및 R6은 각각 부재이고; 및 R7은 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, 이소-펜틸, 네오-펜틸, 헥실, 이소-헥실, 3-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸, neo-헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 및 헥사데실로 이루어진 군으로부터 선택되는 알킬, 또는 아미노산이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I)에 따른 화합물, 또는 5'-메틸셀레노아데노신 ("화합물 C") 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 이로 이루어진 조성물이 제공되며, 여기서 R1, R3, R4 및 R8는 각각 H이고; R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되고; R5 및 R6은 각각 부재이고; R7은 알킬, 또는 아미노산이며; 단, 5'-셀레노-아데노실 메티오닌, 데히드록시 5'-메틸셀레노아데노신, 에틸셀레노아데노신, 셀레노(히드록실)-셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), 알릴셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀렌옥사이드, 아데노실-히드록시 셀렌옥사이드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), 아데노실-히드록시 셀렌옥사이드, 및 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀렌옥사이드는 조성물로부터 각각 제외될 수 있다.
본 출원의 일부 실시양태에서, 화학식 (I)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나 이로 필수적으로 이루어지거나 또는 이로 이루어진 조성물이 제공되며, 여기서 R7은 이소-프로필, 부틸, iso-부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸, iso-펜틸, neo-펜틸, 헥실, iso-헥실, 3-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸, neo-헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 및 헥사데실로 이루어진 군으로부터 선택되는 알킬, 알케닐, 알키닐, 케톤, 아미노알콜, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, OR', Se-R' 이고, 여기서 R'은 이소-프로필, 부틸, 이소-부틸, sec-부틸, 터트-부틸, 펜틸, 이소-펜틸, 네오-펜틸, 헥실, 이소-헥실, 3-메틸펜틸, 2,3-디메틸부틸, 네오-헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실, 운데실, 도데실, 트리데실, 테트라데실, 펜타데실, 및 헥사데실로 이루어진 군으로부터 선택되는 알킬, 시클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로시클릴이고; 및 R8은 수소, 아지도, 알킬, 알케닐, 알키닐이다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 화학식(I)에 따른 화합물, 5'-메틸셀레노아데노신 ("화합물 C"), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지는데, 단 , 5'-셀레노아데노실 메티오닌, 데히드록시 5'-메틸셀레노아데노신, 에틸셀레노아데노신, 셀레노(히드록실)셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀렌옥사이드, 아데노실-히드록시 셀렌옥사이드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), 아데노실-히드록시 셀렌옥사이드, 및 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀렌옥사이드는 조성물로부터 각각 제외될 수 있다.
다른 실시양태에서, 화학식 (I)에 따른 화합물 또는 5'-메틸셀레노아데노신 ("화합물 C") 중 하나 이상을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어지는 조성물이 제공되는데, 여기서 하기 화합물들 각각은 셀레늄 독성을 최소화하고, 비활성 또는 억제 화합물을 제거하고/하거나 조성물의 치료 지수를 최대화하기 위하여 조성물로부터 제외되며, 상기 제외되는 화합물은 γ-글루타모일 셀레노시스테인-γ-글루타모일 시스테인, γ-글루타모일시스테인-2,3-DHP-셀레노시스테인, 디-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타치온-γ-글루타모일시스테인, γ-글루타모일 셀레노시스테인-γ-글루타모일 시스테인, γ-글루타모일시스테인-2,3-DHP-셀레노시스테인, 디-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타치온-γ-글루타모일시스테인, 데히드록시 5'-메틸셀레노아데노신, 에틸셀레노아데노신, 셀레노(히드록실)-셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀렌옥사이드, 아데노실-히드록시 셀렌옥사이드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), 아데노실-히드록시 셀렌옥사이드, 및 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀렌옥사이드이다.
본 발명의 조성물의 또 다른 실시양태는 화학식(II)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다:

상기식에서,
R1은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴임; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R3은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 R4 및 이들이 부착되는 원자와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R4는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 사이클로알킬, 카르복실, 또는 C-아미도이거나; 또는 R3은 R4 및 이들이 부착되는 원자와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R5는 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고;
R6은 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고;
R8은 수소, 아지도, 알킬, 알케닐, 알키닐이고;
R9는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R9는 R10과 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R10은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴이거나; 또는 R9는 R10과 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고; 및
R11은 OR, 알콕시, 아르알콕시 또는 아미노이고, 여기서 R은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 또는 약학적으로 허용가능한 염, 또는 내부 염으로부터 선택된다.
본원에서 기술된 조성물의 부가적 실시양태는 5'-셀레노아데노실 호모시스테인 ("화합물 D")를 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지며, 또한 이의 임의의 유사체, 유도체 및/또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. "화합물 D"는 (2R)-2-아미노-4-((((2S,3S,5R)-5-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-3,4-디히드록시테트라히드로퓨란-2-일)메틸)셀라닐)부타노산 (CAS 등록 번호 4053-91-2)이고, 이의 임의의 유사체, 유도체 및/또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.

본 발명의 조성물은 화학식 (II)에 따른 화합물, 화합물 D 및 이들의 조합을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 본 출원의 하나의 측면은 5'-셀레노아데노실 호모시스테인, 화학식 (II)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 함유하는 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 이들 화합물 중 하나 이상은 합성적이고, 단리되고/되거나 정제될 수 있다.
화학식 (II)의 일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 5'-셀레노아데노실 호모시스테인 ("화합물 D") 및 하나의 다른 화합물을 포함하거나, 이들로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어진다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-셀레노아데노실 호모시스테인 대 하나의 다른 셀레늄 함유 화합물의 비율이 적어도 1:1 내지 100:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 6:1, 또는 1:1 내지 3:1인 것을로 포함한다. 실시양태에서, 상기 다른 화합물은 5'-메틸셀레노아데노신이다. 실시양태에서, 상기 다른 화합물은 γ-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인이다.
일부 실시양태에서, 화학식 (II)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 조성물이 제공되는데, 여기서 R1, R3, R4, R8및 R9은 각각 H이고; R2는 H, 아실, 알킬, 카르복실, C(O)R', 또는 C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되고; R5 및 R6은 부재하고; R10은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되고; R11은 OR, 알콕시, 아르알콕시, 또는 아미노이고, 여기서 R은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 또는 약학적으로 허용가능한 염, 또는 분자내 염으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 화학식 (II)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 조성물이 제공되는데, 여기서 R1, R2, R3, R4, R8, R6, R7, R8, R9, R10은 상기에 정의된 바와 같고, 여기서 R11은 OR이고, 여기서 R은 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸로부터 선택된다.
특정 측면에서, 화학식 (II)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물, 5'-셀레노-아데노실 호모시스테인 (화합물 "D"), 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 (II)에 따른 화합물, 셀레노아데노실 호모시스테인, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지는데; 단, 아데노실 호모시스테인, 5'-셀레노아데노실 메티오닌, 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 및 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인 중 하나 이상은 이 조성물로부터 각각 제외될 수 있다. 실시양태에서, 조성물은 하나 이상의 화합물, 5'-메틸티오아데노신, 감마-글루타밀-메틸-시스테인, 또는 아데노실 호모시스테인, 호모시스테인 또는 메티오닌 중 하나 이상을 제외한다.
본 발명의 조성물의 추가 실시양태는 하기 화학식 (III)에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다:

상기식에서,
R1은 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴임; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R2는 H, 아실, 알킬, 알케닐, 알키닐, 아르알킬, 카르복실, 사이클로알킬, C(O)R', C(O)OR'이고, 여기서 R'은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 또는 헤테로사이클릴로부터 선택되거나; 또는 R1은 R2와 함께 산소 또는 질소로부터 선택된 적어도 하나의 헤테로원자와 함께 4 내지 8개 고리 요소를 갖는 헤테로사이클릭 고리를 형성하고;
R3은 OH, OR, 알콕시, 아르알콕시, 또는 아미노이고, 여기서 R은 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 또는 약학적으로 허용가능한 염, 또는 내부 염으로부터 선택되고;
R4는 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 헤테로사이클릴, 또는 약학적으로 허용가능한 염, 또는 내부 염이고;
R5는 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고;
R6은 옥소, 히드록실, 알킬, 알케닐, 알키닐, OR'이거나 또는 부재하고; 여기서 R'은 알킬, 알케닐, 알키닐, 사이클로알킬, 아릴 또는 아르알킬로부터 선택되고; 및
R7은 C3-C16알킬, 여기서 C3-C16알킬은 카르복실기 및 아미노기를 둘 모두 갖는 치환된 알킬기는 아님, 알케닐, 알키닐, 케톤, 아미노알콜, 아르기닌, 히스티딘, 리신, 아스파르트산, 글루탐산, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 셀레노시스테인, 글리신, 프롤린, 알라닌, 발린, 이소류신, 류신, 메티오닌, 페닐알라닌, 티로신, 및 트립토판으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아미노산, OR', Se-R', S-R'이고, 여기서 OR'에서의 R'은 H, 알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, Se-R'에서의 R'은 H, C3-C16알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, S-R'에서의 R'은 H, C3-C16알킬, 사이클로알킬, 아릴, 아르알킬, 및 헤테로사이클릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
본원에 기술된 조성물의 부가적 실시양태는 감마(γ)-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인 ("화합물 E")을 포함하거나, 이로 이루어지거나, 또는 이로 이루어지며, 또한 이의 임의의 유사체, 유도체, 및/또는 약학적으로 허용가능한 염이 포함된다. 화합물 E는 N5-(1-카르복시-2-(메틸셀라닐)에틸)-L-글루타민이고, 이의 임의의 유사체, 유도체, 및/또는 약학적으로 허용가능한 염이 포함된다.

본 출원의 조성물은 화학식 (III)의 화합물, 화합물 E, 및 이들의 조합을 포함하거나, 이들로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이들로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 본 출원의 하나의 측면은 감마(γ)-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 추가의 실시양태에서, 이들 화합물 중 하나 이상은 합성적이고, 단리되고/되거나 정제될 수 있다.
본 출원의 하나의 측면은 감마-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 이들 화합물 중 하나 이상은 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 실시양태에서, 조성물은 적어도 0.033% (w/v)의 상기 화합물들 중의 하나를 포함한다.
실시양태에서, 조성물은 적어도 감마-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인 및 하나의 다른 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 감마-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인 대 하나의 다른 셀레늄 함유 화합물의 비율을 적어도 1:1 내지 100:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 6:1, 또는 1:1 내지 3:1인 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 다른 화합물은 5'-메틸셀레노아데노신이다. 실시양태에서, 상기 다른 화합물은 감마(γ)-L-글루타밀-메틸-L-셀레노시스테인이다.
특정 측면에서, 화학식 (III)에 따른 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물, 감마-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인 ("화합물 E"), 또는 이들의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을, 하나의 다른 셀레늄 함유 화합물과 적어도 1:1의 비율로 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 (III)에 따른 화합물, 감마-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하는데; 단, γ-글루타모일 셀레노시스테인-γ-글루타모일 시스테인, γ-글루타모일시스테인-2,3-DHP-셀레노시스테인, 디-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타치온-γ-글루타모일시스테인,γ-글루타모일 셀레노시스테인-γ-글루타모일 시스테인, γ-글루타모일시스테인-2,3-DHP-셀레노시스테인, 디-γ-글루타모일셀레노시스테인 및 셀레노글루타치온-γ-글루타모일시스테인 중 하나 이상은 조성물로부터 각각 제외될 수 있다.
일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 (III)에 따른 화합물, 감마-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함하는데; 다만, 5'-메틸티오아데노신, 감마-글루타밀-메틸-시스테인, 또는 아데노실 호모시스테인, 호모시스테인 또는 메티오닌 중 하나 이상은 제외된다.
본 출원의 또 다른 측면은 본원에서 기술되는 생물학적으로 활성인 셀레늄-함유 화합물, 예를 들면 화학식 (I), (II), 및 (III)의, 유사체 또는 유도체를 제공한다. 셀레늄-함유 화합물의 유사체 및/또는 유도체는 합성적으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 화학식 (I), (II), 및 (III)의 하나의 실시양태는 그의 임의의 유사체, 유도체 또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 본 조성물의 또 다른 실시양태는 화학식 (I), (II), 및 (III)의 화합물 및 이의 조합을 포함한다.
본 발명의 조성물의 추가 실시양태는 본원에서 기술된 화합물들의 혼합물을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어질 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 조성물의 하나의 실시양태는 "화합물 CDE"이다. 화합물 CDE는 화합물 C, 화합물 D 및 화합물 E의 혼합물, 및 이의 임의의 유사체, 유도체 및/또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 화합물 CE는 화합물 C 및 화합물 E의 혼합물, 및 이의 임의의 유사체, 유도체 및/또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 화합물 DE는 화합물 D 및 화합물 E의 혼합물, 및 이의 임의의 유사체, 유도체 및/또는 약학적으로 허용가능한 염을 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 출원의 조성물은 적어도 약 0.033% (w/v) 내지 적어도 약 0.1% (w/v)의 다음 화합물들 중의 하나, 즉 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 CDE, 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III), 또는 이들의 혼합물을 포함하거나, 이로 필수적으로 이루어지거나, 또는 이로 이루어진다. 예를 들면, 조성물은 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III)에 따른 하나의 화합물, 화합물 CDE, 또는 이들의 혼합물을 적어도 0.033% (w/v), 적어도 0.05% (w/v), 적어도 0.1% (w/v), 적어도 약 0.033% (w/v), 적어도 약 0.05% (w/v), 적어도 약 0.1% (w/v), 적어도 약 0.033% (w/v) 내지 적어도 약 0.1% (w/v) 또는 적어도 약 0.05% (w/v) 내지 적어도 약 0.1% (w/v) 포함할 수 있다.
예를 들면, 일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III), 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 CDE 중의 하나의 화합물 또는 이들의 혼합물을 적어도 약 0.033% (w/v) 내지 적어도 약 0.035% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.040% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.045% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.050% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.055% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.060% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.065% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.070% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.075% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.080% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.085% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.090% (w/v), 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.095% (w/v), 또는 적어도 약 0.033% 내지 적어도 약 0.1% (w/v), 및 그 사이의 모든 백분율 범위 수치로 포함한다.
예를 들면, 일부 실시양태에서, 조성물은 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III), 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 CDE 중의 하나의 화합물, 또는 이들의 혼합물을, 적어도 약 0.05% 내지 적어도 약 0.060% (w/v), 적어도 약 0.05% 내지 적어도 약 0.065% (w/v), 적어도 약 0.05% 내지 적어도 약 0.070% (w/v), 적어도 약 0.05% 내지 적어도 약 0.075% (w/v), 적어도 약 0.05% 내지 적어도 약 0.080% (w/v), 적어도 약 0.05% 내지 적어도 약 0.085% (w/v), 적어도 약 0.05% 내지 적어도 약 0.090% (w/v), 적어도 약 0.05% 내지 적어도 약 0.095% (w/v), 또는 적어도 약 0.05% 내지 적어도 약 0.1% (w/v), 및 그 사이의 백분율 범위 수치로 포함한다.
다른 실시양태에서, 조성물은 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III) 중의 하나의 화합물, 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 CDE, 또는 이들의 혼합물을약 0.033% (w/v) 내지 약 99.9% (w/v), 약 0.033% 내지 약 90% (w/v), 약 0.033% 내지 약 80% (w/v), 약 0.033% 내지 약 70% (w/v), 약 0.033% 내지 약 60% (w/v), 약 0.033% 내지 약 50% (w/v), 약 0.033% 내지 약 40% (w/v), 약 0.033% 내지 약 30% (w/v), 약 0.033% 내지 약 20% (w/v), 약 0.033% 내지 약 10% (w/v), 약 0.033% 내지 약 5% (w/v), 또는 약 0.033% 내지 약 1% (w/v), 및 그 사이의 모든 백분율 범위 수치로 포함한다.
다른 실시양태에서, 조성물은 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III) 중의 하나의 화합물, 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 CDE, 또는 이들의 혼합물을 약 0.05% (w/v) 내지 약 99.9% (w/v), 약 0.05% 내지 약 90% (w/v), 약 0.05% 내지 약 80% (w/v), 약 0.05% 내지 약 70% (w/v), 약 0.05% 내지 약 60% (w/v), 약 0.05% 내지 약 50% (w/v), 약 0.05% 내지 약 40% (w/v), 약 0.05% 내지 약 30% (w/v), 약 0.05% 내지 약 20% (w/v), 약 0.05% 내지 약 10% (w/v), 약 0.05% 내지 약 5% (w/v), 또는 약 0.05% 내지 약 1% (w/v), 및 그 사이의 모든 백분율 범위 수치로 포함한다.
추가 실시양태에서, 조성물은 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III) 중의 하나의 화합물, 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 CDE, 또는 이들의 혼합물을 약 0.1% (w/v) 내지 약 99.9% (w/v), 약 0.1% 내지 약 90% (w/v), 약 0.1% 내지 약 80% (w/v), 약 0.1% 내지 약 70% (w/v), 약 0.1% 내지 약 60% (w/v), 약 0.1% 내지 약 50% (w/v), 약 0.1% 내지 약 40% (w/v), 약 0.1% 내지 약 30% (w/v), 약 0.1% 내지 약 20% (w/v), 약 0.1% 내지 약 10% (w/v), 약 0.1% 내지 약 5% (w/v), 또는 약 0.1% 내지 약 1% (w/v) 및 그 사이의 모든 백분율 범위 수치로 포함한다.
다른 실시양태에서, 조성물은 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III) 중의 하나의 화합물, 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 CDE, 또는 이들의 혼합물을적어도 약 0.033% (w/v) 내지 적어도 약 0.1% (w/v) 또는 적어도 약 0.05% (w/v) 내지 적어도 약 0.1% (w/v) 포함한다.
실시양태에서, 조성물은 적어도 5'-메틸셀레노아데노신 및 하나의 다른 화합물을 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신 대 하나의 다른 셀레늄 함유 화합물의 비율가 적어도 1:1 내지 100:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 6:1, 또는 1:1 내지 3:1인 것을 포함한다. 실시양태에서, 상기 다른 화합물은 5'-셀레노아데노실 호모시스테인이다. 다른 실시양태에서, 상기 다른 화합물은 L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인이다.
다른 실시태양에서, 조성물은 5'-메틸티오아데노신 ("화합물 H"), S-아데노실-L-호모시스테인 ("화합물 I"), 감마-글루타밀-메틸-시스테인 ("화합물 J"), 감마-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인, Se-아데노실호모시스테인, 또는 글루타밀 셀레노시스테인 중 하나 이상을 제외할 수 있는데, 이들 화합물들 하나 이상은 그 조성물에 불필요하거나 그 조성물중에서 다른 화합물들을 억제할 수 있기 때문이다.
본 출원의 하나의 측면은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물, 화학식(III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 화합물을 포함하는 조성물을 제공한다. 추가 실시양태에서, 이들 화합물 중 하나 이상은 합성적이고, 단리되고/되거나 정제될 수 있다.
본 출원의 하나의 측면은 5'-메틸셀레노아데노신 ("화합물 C"), Se-아데노실-L-호모시스테인("화합물 D"), L-글루타밀-Se-메틸-1-셀레노시스테인("화합물 E") 및 그의 유사체에 관한 것이다. 일부 실시양태는 화학식 (I), 화학식 (II) 및/또는 화학식 (III)의 화합물 및 이의 혼합물, 및 담체를 포함하는 조성물을 포함한다.
다른 실시양태에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개의 상이한 화합물을 포함한다. 더욱 추가 실시양태에서, 상기 조성물은 이들 화합물들 중의 적어도 하나를 적어도 약 0.033% (w/v)로 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 이들 화합물들 중의 2개를 각각 적어도 약 0.05% (w/v)로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 조성물은 이들 화합물들 중의 3개를 각각 적어도 약 0.033% (w/v)로 포함한다.
추가 실시양태에서, 화학식 (I), 화학식 (II) 및 화학식 (III)의 화합물들 중 하나 이상은 합성적이고, 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 실시양태에서, 화학식(I), 화학식 (II) 및 화학식 (III)의 화합물들을 포함하는 조성물은 물, 생리학적 식염수, 계면활성제 및 안정화 아미노산을 포함하는 생리학적 완충제와 같은 담체를 더욱 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III) 중 하나 이상에 따른 하나 이상의 화합물, 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 CDE, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 조성물이 제공되는데, 여기서 하기 화합물들 각각 중 하나 이상은 셀레늄 독성을 최소화하고, 비활성 또는 억제 화합물을 제거하고/하거나, 조성물의 치료 지수를 최대화하기 위해 조성물에서 제외되고, 상기 제외되는 화합물은 γ-글루타모일 셀레노시스테인-γ-글루타모일 시스테인, γ-글루타모일시스테인-2,3-DHP-셀레노시스테인, 디-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타치온-γ-글루타모일시스테인, γ-글루타모일 셀레노시스테인-γ-글루타모일 시스테인, γ-글루타모일시스테인-2,3-DHP-셀레노시스테인, 디-γ-글루타모일셀레노시스테인, 셀레노글루타치온-γ-글루타모일시스테인, 데히드록시 5'-메틸셀레노아데노신, 에틸셀레노아데노신, 셀레노(히드록실)-셀레노펜-(3'-데옥시-아데노신), 알릴셀레노아데노실 호모시스테인, 셀레노-아데노실 호모시스테인, 셀레노-히드록시 아데노실 호모시스테인, 셀레노 아데노신, 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀렌옥사이드, 아데노실-히드록시 셀렌옥사이드, 에틸 셀레노아데노신, 셀레노-(히드록시)-셀레노펜-(3'-데스옥시-아데노신), 아데노실-히드록시 셀렌옥사이드, 및 셀레노-아데노실-Se(메틸)-셀렌옥사이드이다.
일부 실시양태에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 및 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 화합물을 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 2개의 상이한 화합물들; 및 담체를 포함한다. 실시양태에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신 및 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인을 포함한다. 실시양태에서, 2개의 화합물의 각각은 적어도 약 0.033% (w/v)로 조성물에 존재한다.
다른 실시양태에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 및 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개의 상이한 화합물들; 및 담체를 포함한다. 다른 실시양태에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 3개의 상이한 화합물들; 및 담체를 포함한다. 실시양태에서, 3개의 화합물의 각각은 적어도 약 0.033% (w/v)로 조성물에 존재한다.
일부 실시양태에서, 본원에 기술된 본 출원의 임의의 화합물들은 반감기를 연장하기 위해 전구약물을 사용하여 변형될 수 있다. 전구약물은 또한 화합물을 산화로부터 보호하고, 화합물을 조직에 표적화하거나, 또는 화합물의 혈액 뇌 장벽 통과를 가능케 할 수 있다.
일부 실시양태에서, 전구약물은 셀레노글리코시드를 포함한다. 글리코시드에는 단당류, 이당류 및 올리고당류가 포함된다. 당류에는 리보스, 글루코스, 갈락토스, 또는 만노스가 포함된다. 예를 들어, 셀레늄 모이어티에 접합된 갈락토스는 화합물을 간에 표적화할 수 있다.
다른 실시양태에서, 전구약물은 셀레나졸리딘을 포함한다. 이들 화합물은 화합물에 서방성을 제공한다.
또 다른 추가의 실시양태에서, 전구약물은 셀레노유기 화합물의 비타민 C 또는 비타민 E와 같은 비타민에의 접합을 포함한다. 이들 전구약물 접합체는 향상된 보호 효과를 갖는다.
또 다른 실시양태에서, 전구약물은 사이클릭 포스페이트 또는 포스포네이트와 같은 시토크롬 P450 활성화 전구약물일 수 있다. 시토크롬 P450 활성화 전구약물의 다른 실시양태는 생체이용률을 향상시킨다. 특히, 뉴클레오시드는 이들 분자를 이용해 변형되어 있고 간으로의 분자 표적화를 제공한다. 예시적인 전구약물에는 HepDirect 전구약물이 포함된다. 시토크롬 P450 활성화 전구약물의 다른 실시양태는 생체이용률을 향상시키는데, 문헌 [Huttunen et al., Current Medicinal Chemistry 2008 15: 2346]에 기술되어 있다.
실시양태에서, 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III)의 임의의 화합물, 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 또는 화합물CDE은 셀레늄의 산화를 감소시키도록 변형될 수 있다. 실시양태에서, 화합물들은 셀레늄 원자들 사이의 연결을 통해 이량체를 형성할 수 있다.
실시양태에서, 화학식 (I), 화학식 (II), 화학식 (III)의 화합물, 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 또는 화합물CDE의 임의의 것은 상기 화합물의 반감기를 증가시키기 위한 조직 표적화제 또는 기타 제제에의 연결에 의해 변형될 수 있다. 조직 표적화제에는 당해 분야에 공지된 임의의 제제가 포함될 수 있는데, 이로 제한되는 것은 아니지만, 조직 특이적 항원, 트렌스페린 수용체, 또는 본원에 기술된 바와 같은 전구약물에의 결합에 특이적인 항체를 포함한다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 조성물은 혈액 뇌 장벽을 횡단하도록 제형화된다. 본 발명의 조성물은 중합체성 생분해성 임플란트 또는 담체와 같이, 뇌로의 전달에 적합한 임플란트 재료와 조합될 수 있다. 이러한 중합체성 담체에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리락타이드, 폴리글리코라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리비닐 피롤리돈, 및 폴리비닐 알코올, 그리고 에틸렌-코-비닐아세테이트가 포함된다.
다른 실시양태에서, 상기 화합물들은 조성물을 뇌로 전달하고 다른 조직 표적화를 제공하기 위해 나노입자 담체에 연결되거나 조합될 수 있다. 다른 나노입자에는 인지질, 키토산, 락트산, 및 덱스트란이 포함된다.
미소구 및 리포좀은 본 발명에서 사용될 수 있는 추가적인 담체이다. 예를 들면, 미소구 및 리포좀에는, 이로 제한되는 것은 아니지만, 폴리(락트-코-글리코)산 또는 PLGA 담체가 포함된다. 다른 실시양태에서, 뇌 또는 다른 신체 조직으로 조성물의 담체 전달은 항체, 트랜스페린 수용체 또는 전구약물을 표적화제로서 포함하는 리포좀 또는 미소구를 사용함으로써 표적화될 수 있다. 조직 표적화는 인슐린 수용체 또는 트랜스페린 수용체와 같이, 수용체 매개 수송을 개입시킬 수 있다. 이들 수용체는 본원에 기술된 바와 같은 조성물을 또한 포함하는 리포좀 또는 미립구 내로 또한 통합될 수 있다.
지질 전구약물이 또한 본 발명의 화합물과 함께 사용하기에 적합하다. 비제한적인 예시로서, 특정 지질 전구약물은 문헌 [Hostetler et al., 1997 Biochem. Pharm. 53:1815-1822, 및 Hostetler et al., 1996 Antiviral Research 31:59-67]에 기술되어 있는데, 이들 둘 모두는 그 전체가 본원에서 참조로 포함된다. 적합한 전구약물 기술의 추가적인 예시가 WO 90/00555; WO 96/39831; WO 03/095665A2; 미국특허 제5,411,947호; 제5,463,092호; 제6,312,662호; 제6,716,825호; 및 미국공개특허출원 제2003/0229225호 및 제2003/0225277호에 기술되어 있고, 이들 전체는 각각 본원에서 참조로 포함된다. 이러한 전구약물은 또한, 이들 각각은 그 전체가 본원에서 참조로 포함되는, 문헌 [Erion et al., 2004 J. Am. Chem. Soc. 126:5154-5163; Erion et al., Am. Soc. Pharm. & Exper. Ther. DOI:10.1124/jept.104.75903 (2004)]; WO 01/18013 A1; 미국특허 제6,752,981호에 기술된 바와 같이, 환자 내부의 특정 조직, 예를 들어 간으로 약물 화합물을 표적화시키는 능력을 보유할 수 있다.
이러한 전구약물은 또한, 이들 각각은 그 전체가 본원에서 참조로 포함되는, 문헌 [Erion et al., 2004 J. Am. Chem. Soc. 126:5154-5163; Erion et al., Am. Soc. Pharm. & Exper. Ther. DOI:10.1124/jept.104.75903 (2004)]; WO 01/18013 A1; 미국특허 제6,752,981호에 기술된 바와 같이, 환자 내부의 특정 조직, 예를 들어 간으로 약물 화합물을 표적시키는 능력을 가질 수 있다. 비제한적인 예시로서, 본 발명의 화합물과 사용하기에 적합한 다른 전구약물이 WO 03/090690; 미국특허 제6,903,081호; 미국특허출원 제2005/0171060A1호; 미국특허출원 제2002/0004594A1호; 및 문헌 [Harris et al., 2002 Antiviral Chem & Chemo. 12:293-300; Knaggs et al., 2000 Bioorganic & Med. Chem. Letters 10:2075-2078]에 기술되어 있고, 이들 각각은 그 전체가 본원에서 참조로 포함된다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I)에 따른 하나 이상의 화합물을 각각 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 측면에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물; 및 5'-셀레노아데노실 호모시스테인, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (III)에 따른 하나 이상의 화합물을 각각 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 측면에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물; 5'-셀레노아데노실 호모시스테인, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물; 및 감마-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물; 및 감마-L-글루타밀-Se-메틸-L-셀레노시스테인, 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 포함한다.
일부 실시양태에서, 화학식 (I) 및 화학식 (II)에 따른 하나 이상의 화합물을 각각 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 화학식 (II) 및 화학식 (III)에 따른 하나 이상의 화합물을 각각 포함하는 조성물이 제공된다.
실시양태에서, 본원에서 기술된 조성물 중의 임의의 것은 글루코스 대사를 조절하거나 당뇨병을 치료하기 위한 다른 치료제를 더욱 포함할 수 있다.
일부 실시양태에서, 상기 상이한 치료제는 인슐린 또는 그의 유사체이다. 인슐린 유사체에는 속효성 인슐린 유사체 및 지속성 인슐린 유사체가 포함된다. 인슐린 유사체는 하나 이상의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 속효성 인슐린 유사체에는 아스파르트(Aspart), 글루리신(Glulisine) 및 리스프로(LisPro)가 포함된다. 지속성 인슐린에는 NPH 인슐린, 인슐린 디터머(Insulin detemir), 데글루덱(Degludec) 인슐린 또는 인슐린 글라진 (Insulin glargine)이 포함된다.
하나의 실시양태에서, 조성물은 글루코스 대사를 조절하거나 당뇨병을 치료하기 위한 다른 치료제를 더욱 함유한다. 일부 실시양태에서, 상기 상이한 치료제는 인슐린 또는 그의 유사체이다. 일부 실시양태에서, 상기 상이한 치료제는 인슐린 증감제, 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 모방제이다. 당뇨병을 치료하기 위해 사용될 수 있고 본 발명 조성물에서 효과적인 다른 예시적 치료제에는 메트포르민, 설포닐우레아, 메글리티나이드, D-페닐알라닌 유도체, 티아졸리딘디온, DPP-4 억제제, 알파글루코시다아제 억제제, 담즙 격리제 및 이들의 혼합물이 포함된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 약학적 조성물은 치료적 유효량의 하나 이상의 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염, 수화물, 또는 전구약물을 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체와 함께 포함한다. 본 발명의 예시적인 희석제 및 담체는 본 출원의 정의 섹션에 상세히 기술되어 있다. 예를 들면, 일부 실시양태에서, 담체에는 물, 생리학적 식염수, 및 계면활성제 또는 히스티딘 또는 글리신 등의 안정화 아미노산을 함유하는 완충 수용액이 포함될 수 있다. 본 출원의 하나의 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 약학적으로 비활성이다.
본 출원의 일부 실시양태에서, 셀레늄을 포함하는 조성물 및/또는 제형은 대상체에 단독으로, 또는 셀레늄의 다른 형태, 약물, 소분자와 조합하여, 또는 부형제(들) 또는 다른 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 다른 실시양태에서, 본 출원의 조성물은 당해 분야에 잘 알려진 약학적으로 허용가능한 담체를 사용하여 경구 투여에 적합한 투약량으로 제형화될 수 있다. 이러한 담체는 약학적 조성물을 정제, 알약, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서, 또는 치료되는 환자에 의한 경구 또는 경비 섭취용으로 제형화되는 것을 가능케 할 수 있다. 또한, 이로 제한되는 것은 아니지만, 5'-메틸셀레노아데노신, 화학식 (I)의 화합물, 및 이들의 조합을 포함한 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물은 생리학적 식염수와 같은 약학적으로 허용가능한 담체 중에서 정맥내로 대상체 (예컨대, 환자)에 투여될 수 있다.
조성물은 임의의 투여 경로, 특히 경구, 직장, 경피, 피하, 정맥내, 근육내 또는 비강내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 조성물은 임의의 통상적인 형태, 예를 들어, 정제, 캡슐, 캐플릿, 용액, 현탁액, 분산액, 시럽, 겔, 좌약, 패치 및 에멀젼으로 제형화될 수 있다.
의학 분야에 잘 알려진 바와 같이, 임의의 한 대상체에 대한 투약량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 기간 및 경로, 일반적인 건강상태, 및 동시에 투여되는 다른 약물과 상호작용을 포함하는, 다수의 요인에 좌우된다. 치료에 의해 변화를 주고자 하는 표적에 따라서, 약학적 조성물은 제형화되어 전신 또는 국소에 투여될 수 있다.
치료 화합물들의 제형 및 투여를 위해 당해 분야에 알려진 기술들은 본 발명의 화합물 및 조성물을 투여하기에 충분한데, "Remington's Pharmaceutical Sciences" (Mack Publishing Co, Easton Pa.)의 최신판에서 찾아볼 수 있다. 본 출원의 조성물은 임의의 투여 경로, 특히 경구, 직장, 경피, 피하, 정맥내, 근육내 또는 비강내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 적합한 투여 경로는, 예를 들면, 경구 또는 경피 투여; 뿐만 아니라 근육내, 피하, 골수내, 척수내, 심실내, 정맥내, 복강내, 또는 비강내 투여를 비롯한 비경구 전달을 포함할 수 있다.
주입을 위해, 본 출원의 조성물 (예를 들면, 셀레늄-함유 조성물)은 수성 용액에서, 예를 들면 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적으로 완충화된 식염수와 같은 생리학적으로 상용성인 완충액에서 제형화될 수 있다. 조직, 기간, 또는 세포 투여를 위해, 침투시킬 특정 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 당해 분야에 일반적으로 알려져 있다.
본 출원에 사용하기에 적합한 약학적 조성물에는, 활성 성분 (예를 들면, 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합)을 의도된 목적을 달성하기 위한 유효량으로 함유하는 조성물이 포함된다. 예를 들어, 바람직한 실시양태에서, 약학적 조성물의 유효량은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물의 양을 포함한다. 유효량의 결정은 본원에 제공된 설명에 비추어 충분히 당해 분야의 기술자의 능력 범위 내이다.
일부 셀레늄-함유 화합물은 또한 합성적으로 제조되고, 정제되고, 생체활성 분석에서 스크리닝되고 있다. 셀렌화된 효모 또는 이의 수 추출물에서 발견되는 성분 및 화합물은 이러한 효모로부터 수득되는 경우 모두가 생물학적 활성을 갖는 것은 아니며, 실제로는 세포에 독성이 될 수도 있다.
본 출원의 조성물은 임의의 투여 경로, 특히 경구, 직장, 경피, 피하, 정맥내, 근육내 또는 비강내 투여를 위해 제형화될 수 있다. 적합한 투여 경로는, 예를 들면, 경구 또는 경피 투여; 뿐만 아니라 근육내, 피하, 골수내, 척수내, 심실내, 정맥내, 복강내, 또는 비강내 투여를 비롯한 비경구 전달을 포함할 수 있다.
주사용의 경우, 본 출원의 조성물 (예를 들면, 셀레늄-함유 조성물)은 수성 용액에서, 예를 들면 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적으로 완충화된 식염수와 같은 생리학적으로 상용성인 완충액에서 제형화될 수 있다. 조직 또는 세포 투여를 위해, 침투시킬 특정 장벽에 적합한 침투제가 제형에 사용된다. 이러한 침투제는 당해 분야에 일반적으로 알려져 있다.
실시양태에서, 합성적으로 생산된 화합물을 함유하는 조성물은 셀레늄-함유 성분 각각을 동일한 양으로, 예를 들어 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인 대 5'-메틸셀레노아데노신 대 Se-아데노실-L-호모시스테인을 적어도 1:1:1의 비율로 포함할 수 있다. 다른 실시양태에서, 조성물은 적어도 2가지 성분을 1:1 내지 100:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 6:1, 1:1 내지 3:1의 비율로 포함할 수 있다.
5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합을 비롯한 하나 이상의 화합물을 포함하는 조성물은 생리학적 식염수와 같은 약학적으로 허용가능한 담체에서 정맥내로 대상체 (예컨대, 환자)에 투여될 수 있다. 화합물의 세포내 전달을 위한 표준 방법이 사용될 수 있다 (예컨대, 리포좀을 통한 전달). 이러한 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에 잘 알려져 있다.
셀레늄을 포함하는 조성물은 정맥내 투여뿐만 아니라 정맥내, 피하, 근육내, 및 복강내와 같은 비경구 투여에 적합하다. 주사용의 경우, 본 출원의 셀레늄을 포함하는 조성물 (예컨대, 약학적 조성물)은 수성 용액, 바람직하게는 행크 용액, 링거 용액, 또는 생리학적으로 완충 식염수와 같은 생리학적으로 상용성인 완충제에서 제형화될 수 있다. 조직 또는 세포 투여를 위해, 침투되는 특정 장벽에 적합한 침투물이 제형에 사용된다. 이러한 침투물은 당해 분야에 일반적으로 알려져 있다.
일부 실시양태에서, 약학적 제형은 붕해제, 젤화틴화 전분 및 코팅을 함유할 수 있다. 실시양태에서, 붕해제에는 교차결합된 폴리비닐 피롤리돈, 검, 젤화틴화 전분을 비롯한 전분 및 셀룰로스 제품이 포함된다. 실시양태에서, 코팅에는 폴리비닐 알코올, 셀룰로스 유도체 및 메타크릴산 유도체가 포함된다.
본 출원의 일부 실시양태에서, 셀레늄을 포함하는 조성물 및/또는 제형은 대상체에 단독으로, 또는 셀레늄의 다른 형태, 약물, 소분자와 조합하여, 또는 부형제(들) 또는 다른 약학적으로 허용가능한 담체와 혼합된 약학적 조성물로서 투여될 수 있다. 실시양태에서, 조성물은 독성을 최소화하기 위하여 하나 이상의 아미노산 또는 셀레노 아미노산, 예컨대 메티오닌, 시스테인, 또는 셀레노시스테인을 포함할 수 있다. 본 출원의 하나의 실시양태에서, 약학적으로 허용가능한 담체는 약학적으로 비활성이다. 본 출원의 다른 실시양태에서, 셀레늄을 포함하는 조성물은 글루코스 대사와 연관된 질환 또는 병태에 걸리거나, 위험에 처하거나, 고통받는 개인들에게 단독으로 투여될 수 있다.
조성물은 임의의 통상적인 형태로, 예를 들면 정제, 캡슐, 캐플릿, 용액, 현탁액, 분산액, 시럽, 스프레이, 겔, 좌약, 패치 및 에멀젼으로 또한 제형화될 수 있다. 본 출원의 조성물, 특히 5'-메틸셀레노아데노신, 화학식 (I)의 화합물, 및 이들의 조합을 포함하는 조성물은 일상 소비를 위한 영양 음료 또는 식품 (예컨대, ENSURE, POWERBAR, 등), 멀티-비타민, 영양 제품 등에 첨가될 수 있다.
화합물 및 조성물의 사용 방법
본 발명의 화합물 및 조성물은 생물학적 과정 및 전사 활성화/비활성화에 관련있는 유전자들의 유전자 발현에 관하여 조직 특이성을 나타낸다. 예를 들면, 본 출원은 대상체의 다양한 생물학적 경로에서 인슐린을 대체하고, 인슐린 활성을 증강시키고, 글루코스 생산을 억제하거나, 또는 글루코스 대사를 조절하기 위해 본원에 기술된 화합물 및 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다. 따라서, 셀레늄을 포함하는 조성물 및 화합물은 본원에서 기술된 유전자들의 수차(aberration) 와 관련된 질환 또는 병태에 걸리거나, 위험에 처하거나, 고통받는 개체에게 단독으로 또는 조합으로 투여될 수 있다. 예를 들면, 본 출원의 방법은 인슐린-비의존성 (II형) 진성 인슐린 (DM)과 관련된 병태를 갖는 대상체를 진단하거나 (예를 들어 예방적으로 또는 치료적으로) 처리하는 용도가 있을 수 있다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 대상체에서 인슐린을 대체하는 방법은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 다른 화합물들을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체의 간세포에 비하여 대상체의 간세포에서 인슐린을 대체한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 다른 화합물들을 포함한다. 실시양태에서, 상기 조성물은 2가지 화합물을 각각에 대해 적어도 0.05% (w/v) 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3가지 화합물을 각각에 대해 적어도 0.033% (w/v) 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 대상체에서 인슐린 활성을 증강시키는 방법은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 다른 화합물들을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체에 비하여 대상체의 간세포에서 인슐린 활성을 증강한다.
또 다른 실시양태에서, 대상체에서 인슐린 활성을 증강시키는 방법은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 다른 화합물들을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체에 비하여 대상체의 간세포에서 인슐린 활성을 증강시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 다른 화합물들을 포함한다. 실시양태에서, 상기 조성물은 2가지 화합물의 각각을 적어도 0.05% (w/v) 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3가지 화합물의 각각을 적어도 0.033% (w/v) 포함한다. 대상체에서 인슐린 활성을 증강시키는 방법의 추가적인 실시양태는 인슐린 또는 그의 유사체 또는 유도체를 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
추가의 또 다른 실시양태에서, 대상체에서 글루코스 생산을 억제하는 방법은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 다른 화합물들을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체의 간세포에 비하여 대상체의 간세포에서 글루코스 생산을 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식(I)의 화합물, 화학식(II)의 화합물, 화학식(III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 실시양태에서, 상기 조성물은 2가지 화합물의 각각을 적어도 0.05% (w/v) 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3가지 화합물의 각각을 적어도 0.033% (w/v) 포함한다.
또 다른 실시양태에서, 대상체에서 FOXO3 및/또는 FOXO4 인산화를 증가시키는 방법은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 다른 화합물들을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체의 간세포에 비하여 대상체의 간세포에서 FOXO3 및/또는 FOXO4 인산화를 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 실시양태에서, 상기 조성물은 2가지 화합물을 각각에 대해 적어도 0.05% (w/v)씩 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3가지 화합물의 각각을 적어도 0.033% (w/v)씩 포함한다.
실시양태에서, 대상체에서 글루코스 대사를 조절하는 방법은 유효량의 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은, 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체의 간세포에 비하여, 대상체의 간세포에서 글루코스 대사를 조절한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 실시양태에서, 상기 조성물은 2가지 화합물의 각각을 적어도 0.05% (w/v) 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3가지 화합물의 각각을 적어도 0.033% (w/v) 포함한다.
실시양태에서, 대상체에서 글루코스 감수성을 증가시키는 방법은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은, 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체의 간세포에 비하여, 대상체의 간세포에서 글루코스 감수성을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 실시양태에서, 상기 조성물은 2가지 화합물의 각각을 적어도 0.05% (w/v) 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3가지 화합물의 각각을 적어도 0.033% (w/v) 포함한다.
실시양태에서, 대상체에서 당뇨병을 치료하는 방법은 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하며, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은, 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체의 간세포에 비하여, 대상체의 간세포에서 당뇨병을 치료한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 실시양태에서, 상기 조성물은 2가지 화합물의 각각을 적어도 0.05% (w/v) 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3가지 화합물의 각각을 적어도 0.033% (w/v) 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 G6PC의 발현을 억제하기 위한 사용방법으로서, 상기 조성물이 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함하는 사용방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은, 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체의 간세포에 비하여, 대상체의 간세포에서 G6PC의 발현을 억제한다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 실시양태에서, 상기 조성물은 2가지 화합물의 각각을 적어도 0.05% (w/v) 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3가지 화합물의 각각을 적어도 0.033% (w/v) 포함한다.
일부 실시양태에서, G6PC의 감소는, 상기 화합물로 처리되지 않은 동일한 유형에 비해, 대략 50% 증가 또는 감소 내지 500% 증가 또는 감소의 범위이다. G6PC 반응의 규모는 세포 유형, 특정 화합물, 및 세포와 접촉한 시간에 좌우된다.
일부 실시양태에서, 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 대상체에서 인슐린 수용체 (INSR)의 발현을 증가시키는 방법으로서, 상기 조성물이 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함하는 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은, 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체의 간세포에 비하여, 대상체의 간세포에서 인슐린 수용체의 발현을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 실시양태에서, 상기 조성물은 2가지 화합물의 각각 적어도 0.05% (w/v) 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3가지 화합물의 각각 적어도 0.033% (w/v) 포함한다.
일부 실시양태에서, 조성물을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 대상체에서 인슐린-유사 성장인자 수용체 (IGF1R)의 발현을 증가시키는 방법 또는 용도로서, 상기 조성물이 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함하는 방법 또는 용도가 제공된다. 또 다른 실시양태에서, 유효량의 조성물은, 상기 조성물로 처리되지 않은 대상체의 간세포에 비하여, 대상체의 간세포에서 인슐린-유사 성장인자 수용체 (IGF1R)의 발현을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 상기 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함한다. 실시양태에서, 상기 조성물은 2가지 화합물의 각각을 적어도 0.05% (w/v) 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 조성물은 3가지 화합물의 각각을 적어도 0.033% (w/v) 포함한다.
본원에서 기술된 방법들 중의 어느 하나에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 본원에서 기술된 방법들 중의 어느 하나에서, 조성물은 5'-메틸셀레노아데노신을 적어도 약 0.1% (w/v) 포함할 수 있다.
본원에서 기술된 방법들 중의 어느 하나에서, 조성물은 건조 또는 캡슐 형태일 수 있다. 본원에서 기술된 방법들 중의 어느 하나에서, 조성물은 인슐린 또는 그의 유사체 또는 유도체를 더욱 포함할 수 있다. 본원에서 기술된 방법들 중의 어느 하나에서, 조성물은 인슐린 증감제, 인슐린 분비촉진제 또는 인크레틴 모방제를 더욱 포함할 수 있다.
본원에서 기술된 방법들 중의 어느 하나에서, 조성물은 5'-메틸티오아데노신, S-아데노실-L-호모시스테인 또는 감마-글루타밀-메틸-시스테인 중 하나 이상을 제외할 수 있다. 본원에서 기술된 방법들 중의 어느 하나에서, 조성물은 경구로 투여될 수 있다.
본원에서 기술된 방법들 중의 어느 하나에서, 조성물은 대상체의 하나 이상의 간세포에 투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 본원에서 기술된 방법들 중의 어느 하나는 인슐린 또는 그의 유사체를 투여하는 단계를 더욱 포함하거나, 또는 글루코스 대사 조절용 또는 당뇨병 치료용의 다른 치료제를 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
본 출원의 방법의 실시양태에서, 대상체에서 인슐린을 대체하거나 인슐린 활성을 증강시키기 위한, 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 상이한 화합물들을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 실시양태에서, 상기 용도는 인슐린 또는 그의 유사체를 더욱 포함한다. 실시양태에서, 상기 용도는 글루코스 대사를 조절하거나 또는 당뇨병을 치료하기 위한 다른 치료제를 더욱 포함한다. 본 출원의 다른 실시양태에서, 간에서 G6PC를 억제하기 위한, 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인, 화학식 (I)의 화합물, 화학식 (II)의 화합물, 화학식 (III)의 화합물 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 3개의 다른 화합물들을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다.
셀레늄 함유 화합물은 신경 세포와는 다르게 간세포에서 유전자 발현에 영향을 준다. 화합물 및 조성물이 본원에서 기술된 바와 같이 간세포에 대해 가지고 있는 효과와 대조적으로, 동일 또는 유사한 조성물은 반대 방식으로 신경 세포에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 본원에서 기술된 조성물은 본 발명의 방법에서 명시된 바와 같이 FOXO3 또는 FOXO4 발현을 증가시키기 보다는, 신경세포에서 FOXO3 및/또는 FOXO4의 인산화를 저하시킨다.
본 발명의 방법의 추가적인 실시양태에서, 본원에서 기술된 바와 같이 화합물 및 조성물의 유효량은 세포에 독성을 나타내지 않으면서 G6PC의 발현을 억제하고, 간세포에서 글루코스 대사를 저하시키거나, 또는 간세포에서 FOXO 인산화를 증가시키기에 효과적인 양이다. 선택된 화합물의 유효량은 마우스 근골격 세포, 인간 신경 세포, 또는 마우스 간세포을 비롯한 예시된 어느 세포에서도 독성을 나타내지 않는다. 또한, 본원에 기술된 화합물을 포함하는 조성물은 간세포에서 글루코스 대사에 역효과를 주지 않는다.
대상체의 세포에서 유전자 발현을 결정하는 방법에는 당해 분야의 기술자에게 알려져 있으며, 어레이 상에서 또는 PCR방법에 의한 것과 같이 프라이머 및/또는 프로브를 이용한 혼성화가 포함될 수 있다. 유전자 발현을 결정하기 위한 어레이 및/또는 프라이머는 상업적으로 입수가능하다. 프라이머 및 어레이 또는 마이크로어레이는 G6PC, FOXO3, FOXO4, INSR, 및 IGF1R와 같이 본원에서 기술된 유전자에 대해 공중이 입수가능한 서열을 사용하여 용이하게 설계될 수 있다. 예를 들어, 예시적인 서열은 G6PC 에 대해서는 NM_000151.3, GI:393537030, Gene ID: 2538에서 확인되고; FOXO3 에 대해서는 NM_001455.3, GI:146260266, Gene ID: 2309 에서 확인되고; FOXO4 에 대해서는 NM_001170931.1, GI:283436082, Gene ID: 4303 에서 확인되고; INSR에 대해서는 NM_000208.2, GI:119395735, Gene ID: 3643 에서 확인되고; 및 IGF1R 에 대해서는 XM_011521513.1 , GI:767983996, Gene ID: 3480 에서 확인된다. 간세포에서 유전자 발현의 조절은 본원에 기술된 조성물에 따라서 처리된 대상체로부터 수집된 시료에 대한 다수의 분석을 이용하여 본원에 기술된 바와 같이 결정될 수 있다.
의학 또는 연구 분야에 잘 알려진 바와 같이, 대상체에의 투약량은 환자의 크기, 체표면적, 연령, 투여되는 특정 화합물, 성별, 투여 기간 및 경로, 일반적인 건강상태, 및 동시에 투여되는 다른 약물과 상호작용을 비롯하여 다수의 요인들에 좌우된다. 실시양태에서, 조성물의 용량은 효능에 따라서 또는 대상체에게서 명확한 셀레늄 중독 징후가 관찰되면 조절될 수 있다. 셀레늄 중독증은, 이로 제한되는 것은 아니지만, 마늘 냄새나는 호흡, 탈모, 또는 벗겨지는 손톱을 포함하는 증상에 의해 나타날 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 조성물의 용량은 혈액에서 원소 셀레늄의 정상 상태 (steady state)를 달성하기 위한 기간 동안에 적어도 매일 1회 투여된다. 더욱 다른 실시양태에서, 본 발명 조성물의 용량은 대상체가 질환 또는 장애의 증상을 경험하는 동안에 투여될 수 있다.
실시예 I
5'-메틸셀레노아데노신 ("C")의 합성 및 특성화
실시예
하기 실시예는 본 발명의 조성물, 화합물 및 제조방법의 예시적인 실시예 또는 실시양태를 제공한다. 본 발명의 조성물, 화합물 및 제조방법의 예시적인 실시예 또는 실시양태는 본원에 실시예에 의거하여 제공된다. 본 발명의 개념 및 기술은 다양한 변경 및 대체가 가능하지만, 이의 특정 실시양태는 도면에서 예시로서 나타나 있고 본원에서 상세히 기술될 것이다. 그러나, 본 출원의 개념을 개시된 특별한 형태들로 한정하고자 하는 의도는 없고, 그 반대로, 본 출원 및 첨부된 청구범위에 부합하는 모든 변경, 균등물 및 대체물을 포함한다는 점이 이해되어야 한다.
본원에 기재된 기술은 광범위한 용도를 갖는 것으로 이해될 것이다. 전술한 실시양태들은 기술의 원리 뿐만 아니라 실제 응용을 예시하기 위하여 선택하여 기술하였다. 어떤 실시양태는 여기서 설명되고/되거나 예시되었지만, 그들의 상당히 변경 및 변형이 가능한 것으로 고려된다.
실시예 1 : 5'-메틸셀레노아데노신 ("화합물 C")의 합성 및 특성화
화합물 C를 제조하기 위한 합성 모식도 및 방법은 하기와 같다:
자석 교반기 내에 장착되고 얼음 냉각조에 놓여진, 20 mL의 무수 에틸 알코올을 함유하는 200 mL 둥근-바닥 플라스크에 수소화붕소나트륨 (227 mg, 6.0 mM, Aro하)을 넣었다. Ar 흐름 하에서 냉각 및 교반하면서 디메틸디셀레나이드 (190 uL, 376 mg, 2.0 mM)를 플라스크에 첨가하였다. 노르스름한 용액의 형성 후, 고체 5'-클로로-5'-데옥시아데노신 (1,143 g, 4.0 mM)을 첨가하였다. 100 mL의 에틸 알코올을 첨가하여 침전물을 용해시켰다. 혼합물을 실온에서 이후 4일간 교반하였다. 질량 분광분석법을 사용하여, 5일 후 대략 75% 전환을 달성하였음을 모니터링하였다. 용매를 증발시켰고, 3.22 g의 생성물 (출발물질(SM)의 대략 20%의 수율)을 수집하고 역상 (C-8) 분취용 크로마토그래피로 정제하였다. 순수 생성물 1.1g을 수집하고, 분자량을 질량 분광분석법으로 확인하였다.
실시예 2: Se-아데노실-L-호모시스테인의 합성 및 특성화 ("화합물 D")
화합물 D를 제조하기 위한 합성 도식 및 방법은 하기 단계 1-6로 나타낸다:
5'-클로로-5'-데옥시아데노신 (639-62)
적하 깔대기, 교반기, 가스 투입구/배출구 및 온도계가 장착된, 오븐 건조된 2L, 4-목 플라스크에 89 g (0.366 mole, 1 당량) 아데노신, 59.3 mL (58, 1.833 mole, 2 당량) 무수 피리딘 및 1 L 무수 아세토니트릴을 넣었다. 반응 세트를 얼음/소금 욕조에 넣고, 교반을 개시하였다. 용액의 온도가 3℃ 미만으로 떨어지면 염화티오닐을 천천히 첨가하였다. 반응 혼합물의 온도는 염화티오닐 첨가 동안 및 추가의 4시간 동안 5℃ 미만으로 유지하였다 (이때 용액은 바닥에 백색-황색 침전을 갖는 노란색이다). 반응을 실온에서 밤새 방치하였다.
다음날 아침에 다량의 침전물을 소결된 유리 필터를 사용하여 여과하고 필터 위에서 300 ML 부피의 건조 아세토니트릴로 세척하였다. 그 사이에, 침전물 색깔은 흰색으로 변하였다. 이어서 습윤 침전물을 800 ML의 메탄올 및 160 ml의 물의 혼합물을 함유하는 2 L 반응 플라스크 내로 다시 옮겼다. 80 밀리리터(80 ML)의 농축 암모늄 히드록사이드 용액을 중탕기에서 기계적 교반 및 냉각 하면서 한 방울씩 첨가하였다. 혼합물을 상온에서 45분간 교반하고 형성된 백색 침전물을 진공 여과에 의해 액체로부터 분리하였다.
여과액을 진공 로터리-증발기를 사용하여 건조 상태로 농축하는 반면, 침전물을 대략 560 ML 열수로부터 결정화하였다. 침전물을 얼음-중탕기에서 냉각시키고, 결정체의 첫 번째 생성물을 여과하고 동결-건조시킨다. 이 여과액을 첫 번째 여과액의 로터리 증발로부터 생기는 고체의 결정화를 위한 용매로 사용하여 산물의 두 번째 생성물을 얻었다. 상기 산물의 두 번째 생성물을 2일 동안 동결-건조시켰다. 마지막으로 결정체의 생성물 둘 모두를 진공 건조기 내 오산화인 상에서 2일간 건조시켰다. 84 g의 백색 결정체를 80.5% 수율로 수득하였다. MS (286-M+H), 융점 187℃.
셀레노-아데노실호모시스테인 (655-40)
L-셀레노메티오닌 (9.806 g, 50 mM, 1 당량)을 온도계, 대형 냉각 핑거 (cooling finger) (배출구에 거품-계량기 구비), 암모니아 가스 주입구 (플라스크의 바닥에 닿음) 및 자석 교반 막대를 갖춘 2 L, 3-목 플라스크 내로 충전하고 CO2-아세톤 함유 2.5 L 이중 용기 냉각조 내에 넣었다. Aro을 아세톤 중탕 및 냉각 핑거에 고체 CO2를 첨가하기 전에 플라스크를 통과시켰다. 플라스크의 내부 온도가 -35℃ 미만으로 내려가면 무수 암모니아 (가스)의 흐름을 개시하고 액체 암모니아 수준이 800 ML의 부피에 도달하면 가스 흐름을 중단하였다.
이때 용액의 청자색 착색이 대략 30초 동안 지속할 때까지 작은 금속성 나트륨 조각을 잘 교반된 용액에 첨가하였다. 총 2.645 g (115 mM, 2.3 당량)의 나트륨을 45분 이내에 첨가하였다. 교반 및 냉각을 30분 이상 유지하였다. 이때 모든 성분은 용액으로 있었다. 무수 5'-클로로-5'-데옥시아데노신(14.856 g, 52 mM, 1.04 당량)을 단일 분획으로 첨가하고 반응 혼합물을 교반하면서 매우 낮은 Aro흐름 하에 밤새 방치하였다.
다음날 아침 350ML의 무수 메탄올을 플라스크 내에 존재하는 백색 고체에 첨가하였다. 플라스크를 오일 욕조에 넣고, 환류 응축기를 장착하고, Aro가스 흐름을 유지시키고, 오일 욕조를 이후 24시간 동안 50℃로 가열하였다. 1 밀리미터(1 ML)의 용액을 몇 방울의 0.1N HCl을 사용하여 pH 3.5로 산성화하고, 시료를 질량 분광분석법을 사용하여 기질의 존재에 대해 분석하였다.
5% 미만인 경우에는, 혼합물을 1N HCl을 사용하여 pH 3.5로 산성화하고, 염으로부터 여과하고, 진공 로터리-증발기를 사용해 건조 상태로 농축할 수 있으며, 조생성물을 물-에탄올 혼합물로부터 결정화에 의해 정제할 수 있다. 셀레노-아데노실호모시스테인 결정의 첫 번째 산물은 15.98 g의 생성물을 74% 수율로 산출하였다. 또한, 생성물의 대략 95%는 깨끗하였으며, 추가의 정제 없이 생물학적 연구에 사용될 수 있었다.
실시예 3: 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인 (화합물 "E")의 합성 및 특성화
화합물 E를 제조하기 위한 합성 도식 및 방법은 하기 단계 1-4로 나타낸다:
N-Boc-(O-tBu)-1-Glu-OSu (655-90)의 합성
N-Boc-(O-tBu)-1-Glu-OH (303 mg, 1.0 Mmol), N-히드록시석신이미드 (121 mg, 1.05 Mmol) 및 디사이클로헥실 카르보디이미드 (227 mg, 1.1 Mmol)를 15 ML의 무수 에틸 에테르에 현탁/용해시키고 10 μL의 디메틸에틸벤질아민을 주사기로부터 반응 혼합물 내로 첨가하였다. 실온 (22℃)에서의 교반을 48시간 동안 유지하였다. 혼합물을 여과하고 침전물을 10 x 10 mL의 에틸 에테르로 세척하였다. 여과액을 농축하고 고진공 하에 건조시켜 백색 결정 산물을 수득하였다 (570 mg, ~90% 수율). MS (M+Na+)=423.17;
N-Boc-(O-tBu)-1-Glu-MeSe-Cys-OH (655-90)의 합성
N-Boc-(O-tBu)-1-Glu-OSu (570 mg, 0.9 Mmol), 메틸셀레노시스테인 (175 mg, 0.8 Mmol), 트리에틸아민 (152 mg, 209 μL, 1.5 Mmol)을 6 mL의 1,4-디옥산과 2 mL의 물의 혼합물 내로 첨가하였다. 반응 혼합물의 자석 교반을 100시간 동안 유지시켰다. 그 후, 1.21M HCl (1.65 mL)을 첨가하고 반응-후의 혼합물을 20 mL의 에틸 에테르로 3회 (3x) 추출하였다. 추출물을 진공-로터리 증발기를 사용하여 건조 상태로 농축하여 649 mg의 왁스상 산물을 수득하였고 이를 분취용 HPLC에 적용하였다. 283 밀리그램(283 mg)의 산물을 75.6%의 수율로 수집하였다. 질량 스펙트럼으로 생성물의 분자량 및 그 내부의 단일 Se 원자의 존재를 확인하였다. 질량 계산치 C18H32N2O7Se에 대해 계산된 질량 = 468.42; 실측치 469.24 m/e (M+H+)및 491.24 m/e (M+Na+).
γ-글루타밀-메틸셀레노시스테인 (655-92)의 합성
283 mg (0.6 Mmol)의 N-Boc-(O-tBu)-1-Glu-MeSe-Cys-OH, 2 mL의 티오아니솔 및 5 mL의 트리플루오로아세트산의 혼합물을 오일조에서 자석 교반하면서 6시간 동안 63℃로 가열하였다. 혼합물을 상온 (22℃)에서 밤새 방치하였다. 반응 혼합물을 격렬하게 교반되는 에틸 에테르 (20 ML) 내로 한 방울씩 첨가하였다. 형성된 침전물을 20 mL의 에틸 에테르로 2회 (2x) 세척하였다. 생성물은 138.3 mg의 크림상 침전물을 산출하였고, 이를 그 후에 분취용 HPLC로 정제하였다.
실시예 4:
개별 합성 셀레노유기 화합물, 개별 셀레노유기 화합물들의 조합 및 이들의 황 유사체를 본원에서 기술된 실시양태에서의 세포 생존 또는 생존력에의 효과에 대해 세포 배양액 (시험관내)에서 검사하였다. 특히, 검사된 세포는 마우스 AML-12 간세포이었다.
재료 및 방법
세포주 및 화합물
마우스 간세포주 AML-12 및 인간 신경모세포 IMR-32 세포는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC, Manassas, Virginia)으로부터 구입하였다. AML-12 세포를 10% 소태아혈청 (FBS), 40 ng/ml 덱사메타손 (Dex, Sigma) 및 1X ITS (0.01 mg/ml 소 인슐린, 0.0055 mg/ml 인간 트랜스페린, 5 ng/ml 소듐 셀레늄을 함유함) 용액 (Sigma)이 보충된 둘베코 변형 이글 (Dulbecco's modified Eagle's) 배지 및 Ham's F12 (DMEM/F12) 배지에서 증폭시켰다. IMR-32 세포를 10% FBS가 보충된 이글 최소필수 배지 (Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM))에서 배양하였다.
화합물 C (5'-메틸셀레노아데노신), 화합물 D (Se-아데노실-L-호모시스테인), 및 화합물 E (감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인), 및 이들의 황 유사체인 화합물 H (5'-메틸티오아데노신), 화합물 I (S-아데노실-L-호모시스테인), 및 화합물 J (감마-글루타밀-메틸-시스테인)을 합성하거나 상업적 공급원 (입수 가능한 경우)으로부터 입수하였다. 시험된 모든 화합물의 순도는 질량 분광분석법에 의해 측정시 ≥ 99%인 것으로 확인되었다. 상기 합성된 화합물의 3개의 배치를 하기 실험에서 사용하였다.
본원의 실시예에서 나타낸 ppb 값은 셀레늄 함유 화합물 중의 셀레늄의 ppb 또는 황 함유 화합물 중의 황의 ppb를 지칭하는데, 이는 실험에서 검사될 셀레늄 또는 황의 등가량을 확보하기 위해서이다.
셀레늄 기준의 ppb를 화합물의 ppb로 변환하기 위해서는, 셀레늄의 원자량을 해당 화합물의 분자량으로 나누고 피제수(dividend)에 100을 곱하여 화합물 중의 Se의 %를 계산한다. 황 기준의 ppb를 화합물의 ppb로 변환하기 위해서는, 황의 원자량을 해당 화합물의 분자량으로 나누고 피제수에 100을 곱하여 화합물 중의 Se의 %를 계산한다.
예를 들면, 셀레늄의 원자량 78.96을 화합물 C의 분자량 344로 나누고 그 결과에 100을 곱하면, 화합물 C중의 셀레늄 %가 23%로 된다. 마찬가지로, 화합물 D에 대해, 셀레늄의 원자량 78.96을 화합물 D의 분자량 432로 나누고 그 결과를100으로 곱하면, 화합물 D중의 셀레늄 %가 18%로 된다. 화합물 E에 대해, 셀레늄의 원자량 78.96을 화합물 E의 분자량 311로 나누고 그 결과를 100으로 곱하면, 화합물 D중의 셀레늄 %가 25%로 된다.
이들 % Se 값은 셀레늄의 ppb를 화합물의 ppb로 전환하기 위한 인자들을 유도하는데 사용된다. 이들 인자들은 화합물 C의 경우 4.35, 화합물 D의 경우 5.46, 및 화합물 E의 경우 3.94이다. 셀레늄 기준의 ppb를 화합물의 ppb로 변환하기 위해서는, 표시된 셀레늄의 ppb를 하기 표에 나타낸 각 화합물의 인자로 곱한다. 예를 들면, 하기 실험들에서 150 ppb의 화합물 C는 150 ppb의 셀레늄을 지칭하며 653 ppb의 화합물 C와 동등하다.
황 화합물에 대해서는, 황의 원자량 32를 화합물 H의 분자량 297로 나누고 그 결과를 100으로 곱하면, 화합물 H중의 황 %가 11%로 된다. 마찬가지로, 화합물 I에 대해, 황의 원자량 32를 화합물 I의 분자량 384로 나누고 그 결과를 100으로 곱하면, 화합물 I중의 황 %가 8%로 된다. 화합물 J에 대해, 황의 원자량 32를 화합물 J의 분자량 264로 나누고 그 결과를 100으로 곱하면, 화합물 J중의 황 %가 12%로 된다.
이들 % S 값은 황의 ppb를 화합물의 ppb로 전환하기 위한 인자들을 유도하는데 사용된다. 이들 인자들은 화합물 H의 경우 9.28, 화합물 I의 경우 12.00, 및 화합물 J의 경우 8.25이다. 황 기준의 ppb를 화합물의 ppb로 변환하기 위해서는, 표시된 황의 ppb를 하기 표에 나타낸 각 화합물의 인자로 곱한다. 예를 들면, 하기 실험들에서 150 ppb의 화합물 H는 150ppb의 황을 지칭하며 1392 ppb의 화합물 H와 동등하다.
세포 생존력 분석
배양된 AML-12의 세포 생존력은 셀타이터96® 아쿠어스 원 용액 세포 증식 분석 키트 (CellTiter96® AQueous One Solution Cell Proliferation Assay kits, Promega)를 사용하여, 제조사의 프로토콜 및 지침서에 따라 결정하였다. 간략히, AML-12 (1X104세포/웰)를 96-웰 투명 플레이트 (VWR)에 접종하고 10% FBS, 1X ITS 및 40 ng/ml Dex를 함유하는 DMEM/F12 배지에서 밤새 배양하였다. 그 후에, 세포를 4시간 동안 10% FBS와 40 ng/ml Dex를 함유하는 ITS-무함유 DMEM/F12 배지에서 대조군 (물) 또는 화합물들로 처리하였다.
배양된 세포를 아쿠어스 원 용액 (100 μl/웰)과 함께 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하고, 각 시료에서 OD490 nm의 흡광도를 바이오-테크 마이크로플레이트 판독기로 결정하였다. 배양 세포의 세포 생존력은 배양된 세포에서의 OD490 nm에서 순수한 배양 배지 (세포의 접종 부재)에서의 OD490 nm을 공제함으로써 결정하였다. 각 처리당 8개 시료를 상기 분석에 대해 조사하였다. 데이터를 8개 시료의 평균±표준편차로 나타내었다.
RNA 및 단백질 분석을 위한 세포 처리
인슐린 수용체 (Insr), 인슐린 유사 성장 인자 수용체 (Igf1r), 및 글루코스-6-포스포타제 (G6pc)의 RNA 분석을 위해, AML-12 세포를 ITS, Dex 및 FBS-함유 DMEM/F12 배지에서 증폭시키고, Dex의 존재 또는 부재하에 10% FBS ITS-무함유 DMEM/F12 배지에서 24-웰 (6.7 X 104 세포/웰) 플레이트 상에서 하룻밤 배양하였다. 이들 세포들을 6 시간, 24 시간 또는 48 시간 동안 대조군(물) 또는 다양한 화합물 (Dex의 존재 또는 부재하에 10% FBS ITS-무함유 DMEM/F12 배지에 희석됨)으로써 처리하였다.
일부 실험에서, AML-12 세포를 24시간 동안 화합물 처리 후에 PBS로써 두번 세척하였으며, 그 후에 또 다른 6시간 동안 20 mM 락토스 및 2 mM 피루베이트, 및 15 mM HEPES (글루코스-생산 배지)로 보충된 혈청-무함유, 글루코스/페놀 레드-무함유 DMEM 배지에서, 인슐린 (10 또는 100 nM), 0.1 mM 8-CPT (Sigma), 또는 0.5 μM Dex 의 존재 또는 부재 하에, 셀레늄 화합물 (150 또는 300 ppb의 각 화합물)과 함께 인큐베이션하였다. 처리 후에, 세포 배지를 수집하여, 압캄(Abcam) 글루코스 분석 키트를 사용하고 제조사의 프로토콜에 따라 글루코스 분석에 적용하였다. 세포들은 G6pc, Insr 및 Igf1r 의 RNA 단리 및 PCR 분석을 위해 용해 및 수집하였다.
단백질 발현 연구를 위해, AML-12 세포를 ITS, Dex 및 FBS-함유 DMEM/F12 배지에서 증폭시키고, 6-웰 (3.33 X 105세포/웰) 플레이트 상에서 Dex의 존재 또는 부재하에 10% FBS ITS-무함유 DMEM/F12 배지에서 하룻밤 배양하였다. 이들 세포들을 6시간 및 24시간 동안 혈청 함유 (Dex로 보충된 10% FBS ITS-무함유 DMEM/F12 배지) 또는 혈청-무함유 (ITS/Dex-무함유 DMEM/F12 배지) 중의 어느 하나에서 대조군(물) 또는 다양한 화합물로 처리하였다. 또한, 인간 신경모세포 IMR-32 세포는 10% FBS EMEM 배지에서 배양하고, 그 후 6시간 및 24시간 동안 동일한 혈청-함유 배지에서 대조군(물), 셀레늄 화합물 및 이들의 황 유사체로써 처리하였다.
RNA 단리 및 실시간 PCR 분석
이들 세포들로부터 전체 RNA를 트리졸 (Trizol, Invitrogen)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 단리하고, 그 후에 DNase I과 함께 인큐베이션하여 임의의 잠재적인 오염된 게놈 DNA를 제거하였다. RNA 시료를 앞서 기술된 바와 같이 (Lan et al EMBO J 2003), 어플라이드-바이오사이언스(Applied-Bioscience)의 RT 키트 및 미리 설계된 태크만 (Taqman) 프로브 (Invitrogen)를 사용하여 실시간 PCR 분석에 적용하였다. 3 내지 6개 시료를 각 처리 그룹에서 분석하였다. 데이터를 각 시료 내 액틴 B (Actb) mRNA 수준으로 표준화하였고, 3-6개 시료의 평균±표준편차로 나타내었다.
단백질 제조 및 웨스턴 블롯 분석
AML-12 간세포 또는 IMR-32 신경세포를 6-웰 플레이트에 접종한 후, 본원에 기술된 바와 같이, 6 시간 및 24 시간 동안 비히클 및 다양한 화합물로 처리하였다. 처리 후, 세포를 얼음-냉각된 PBS로 헹구고, 30분 동안 얼음 상에서 완전 프로테이나제 및 포스파타제 억제제 (Themo-Fisher Scientific, Waltham, MA)를 함유하는 얼음-냉각된 RIPA 완충제에 용해하였다. 세포 용해물을 세포 스크레퍼 및 전달 피펫(transfer pipette)을 사용해 수집한 후, 4℃에서 30분 동안 12000xg로 원심분리하여 DNA 펠렛을 제거하고 단백질 추출물을 수득하였다. 이들 세포 용해물의 상청액 내 단백질 수준을 피어스 마이크로-BCA (Pierce Micro-BCA) 단백질 분석 키트 (Themo Scientific-Piece Biotechnology, Rockford, IL)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 결정하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 대조군- 및 화합물(들)-처리된 세포에서 전체 단백질 중의 5 마이크로그램을 SDS-PAGE 겔 분리에 적용한 후, 앞서 기술된 바와 같이 (Reddy, Liu et al. 2008 Science), PVDF 막으로 옮겼다. 막을 5% (w/v)의 소 혈청 알부민 (Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 중에서 차단하고, 특이적 일차 항체와 함께 인큐베이션하였다. 그 후, 상기 막을 HRP-접합 항-마우스 또는 항-토끼 이차 항체 (1:5000 희석, Cell Signaling Inc.)와 함께 인큐베이션하였다. Actb (Li-COR, Lincoln, Nebraska), Elf2be 및 pElf2be (Abcam, Cambridge, MA)를 제외한 모든 일차 항체들은 셀 시그날링(Cell Signaling Inc.)로부터 구입하였다. 멤브레인 블롯 상의 양성 신호는 아머샴(Amersham)의 증강된 화학발광 웨스턴 블롯팅 프라임 검출 시약 (GE healthcare Lifescience, Pittsburgh, PA)을 사용하여 검출하였다. 멤브레인 블롯 상의 이들 발광 신호의 이미지를 LI-COR 오딧세이 Fc 이미지 시스템 (Lincoln, Nebraska)을 사용하여 캡쳐하였다. 동일한 멤브레인 블롯을 벗겨내고 GE WB ECL-프라임-검출 프로토콜 (GE healthcare Lifescience, Pittsburgh, PA)에 기술된 바와 같이 또 다른 항체를 사용하여 재-블롯팅하였다. 웨스턴 블롯에서의 단백질 밴드 밀도를 Li-COR 이미지 스튜디오 소프트웨어 또는 NIH 이미지J 소프트웨어를 사용하여 결정한 후, 각 시료에서의 Actb 수준으로 표준화하였다. 데이터는 각 그룹당 3개 시료의 평균±표준편차로 나타내었다.
통계학적 분석
적용된다면, 식염수-처리 그룹 및 화합물 CDE-처리 그룹 사이의 차이의 통계학적 유의성을 결정하기 위하여 0.05 미만의 p값을 사용하여 스튜던츠 t-검정을 수행하였다.
결과 및 논의
AML-12 세포의 생존력에 대한 화합물 CDE의 효과
AML-12 세포의 생존에 대한 셀레늄 화합물의 독성 효과가 있는지 여부를 검사하기 위하여, 세포 생존력 분석을 간세포에 대해 수행하였다. AML-12 세포를 48 시간동안 물 대조군 또는 150ppb의 개별 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 화합물 H, 화합물 I 및 화합물 J; 화합물 I 및 J의 조합 ("화합물 IJ"); 화합물 D 및 화합물 E의 조합 ("화합물 DE"); 및 화합물 C, 화합물 D, 및 화합물 E의 조합 ("화합물 CDE")으로 처리하였다.
단일 화합물 및 화합물 조합을 포함하여 어떠한 화합물 처리에서도 대조군과 비교할 때, AML-12 세포에서 세포 생존력의 유의미한 감소 (OD490 nm으로 표시됨)를 초래하지 않았다 (도 1). 이들 결과는 셀레늄 화합물 CDE는 AML-12 세포에서 생존 또는 생존력에 어떠한 나쁜 영향을 미치지 않는다는 것을 입증하였다.
ITS 부재 하의 FBS- 및 Dex-함유 배지에서 배양된 AML-12 세포에서 화합물 CDE에 의한 G6pc mRNA 발현의 억제
간은 혈액 흐름에서 정상 글루코스 수준을 유지하기 위해 글루코스를 생산하는 주요 기관이다. 글루코스-6-포스파타제 촉매적 서브유닛 (G6pc)은 간에서 글루코스신합성을 위한 필수 효소이다. 간에서 화합물 CDE의 잠재적 기능을 탐구하기 위하여, 본원에서 기술된 다양한 조건하에 배양된 AML-12 세포에서 QRT-PCR 분석에 의해 G6pc 발현을 검사하였다.
AML-12 세포는 혈청-, 인슐린-트랜스페린-소듐셀레나이트 보충물 (ITS) 및 덱사메타손(Dex)을 함유하는 배지에서 배양되거나 또는 증폭되어야 함이 권장된다. ITS 중의 인슐린 및 소듐셀레나이트가 AML-12 세포에서의 시험 셀레늄 화합물의 작용을 방해할 수 있다는 가능성을 배제하기 위하여, FBS 및 Dex를 함유하지만 ITS-무함유 배지에서 배양된 AML-12 세포에서의 G6pc 발현을 조사하였다. 간략히, AML-12 세포를 완전 증폭 배지 (10% FBS, ITS- 및 Dex-함유 DMEM/F12)에서 배양/증폭하고, 배양 플레이트 상에 접종하고, ITS-무함유 FBS- 및 Dex-함유 배지에서 밤새 배양하였다. 이들 세포를 대조군 (물), 각 화합물의 150 ppb의 용량으로 셀레늄 개별 화합물들: 화합물 C, 화합물 D, 화합물 E, 및 황 개별 화합물들: 화합물 H, 화합물 I, 화합물 J로 처리하였다. 또한, 화합물 CDE의 조합 및 화합물 HIJ의 조합을 세포에 대해 48시간 동안 시험하였다. 이들 처리 후에, 세포를 수집하여 QRT-PCR 분석을 행하였다.
도 2A에 나타낸 바와 같이, 화합물 HIJ 황 유사체 조합이 아니라 화합물 CDE 조합을 사용한 AML-12 간세포의 처리는, 실험 조건 하에 간세포에서 G6pc 발현에서 매우 유의미한 (대략 50%) 저하를 초래하였다. 또한, G6pc 발현은 개별 화합물들 모두를 사용하여 처리한 후에 AML-12 세포에서 더욱 검사되었다 (도 2B 참조). G6pc 발현에서 어떠한 유의미한 변화 (예를 들어, 증가 또는 감소)도 관찰되지 않았다. 데이터는 4개 시료의 평균±표준편차로 나타내었다.
화합물 CDE 조합에 반응하여 G6pc 발현 저하의 효과가 상이한 배치의 세포를 사용한 3회 반복 실험에서 관찰되었다 (데이터 미제시). 화합물 CDE는 동일한 실험 조건 하에서 AML-12 세포의 생존력에 영향을 주지 않았기 때문에, 상기 효과는 세포 생존에 대한 셀레늄 화합물의 잠재적 독성 효과로 인한 것이 아니었다 (도 1 참조). 이들 결과는, 개별 화합물 또는 이들의 황 유사체가 아니라 조합된 화합물 CDE가 배양 배지에서의 FBS 및 Dex 존재 하에 AML-12 세포에서의 G6pc 발현을 억제할 수 있다는 것을 입증한다.
화합물 CDE의 조합은 24 시간 동안 FBS 존재 하의 ITS- 및 Dex-무함유 배지에서, 이어서 6시간 동안 혈청-무함유 배지에서 AML12 세포 중의 G6pc 발현을 억제함
Dex가 간에서 G6pc 발현을 조절할 수 있는 것으로 보고되었다.ITS/Dex-무함유 배양 조건하에 AML-12 세포에서 화합물 CDE의 효과를 조사하였다. 24시간 및 48시간 동안 혈청-무함유 조건하에 배양된 AML-12 간세포는 일부 비정상적인 세포 형상을 나타내었다. 그러나, 혈청-무함유 배지에서 6시간 배양 후에 AML-12 세포에서는 어떠한 전체적인 형태적 변화도 관찰되지 않았다 (데이터 미제시). 따라서, AML-12 세포를 24시간 동안 혈청-함유, 그러나 ITS/Dex-무함유 배지에서 화합물 CDE로 전처리하고, 이어서 6시간 동안 혈청/ITS/Dex-무함유 배지에서 상기 화합물로 재처리하여, G6pc 발현에 대한 화합물 CDE의 효과를 더욱 조사하였다.
간략히, AML-12 세포를 24시간 동안 150 또는 300 ppb의 화합물 CDE 조합 (10% FBS, ITS/Dex-무함유 배지에 희석됨)로 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 PBS로 두번 세척하여 잔류 FBS를 제거하고, 6시간 동안 10 또는 100 nM 인슐린 (FBS/ITS/Dex-무함유 배지에 희석됨)의 존재 또는 부재 하에 동일한 용량의 상기 셀레늄 화합물들과 함께 인큐베이션하였다. 화합물 CDE의 효과의 효능 및 화합물 CDE과 인슐린 사이의 잠재적인 부가적 또는 상승적 작용을 비교하기 위해, 인슐린 단독 처리를 포함시켰다.
도 3에 나타낸 바와 같이, 두 가지 용량의 인슐린 (10 및 100 nM)의 처리는 G6pc 발현을 유의미하게 억제하였는데, 이것은 예상된다. 150 ppb의 용량에서 화합물 CDE의 단독 처리는 G6pc 발현에서 감소 경향을 초래하였다 (도 3). 더욱 극적으로, 300 ppb의 용량으로 화합물 CDE 처리는, 100 nM 인슐린에 적어도 필적하는 효능과 함께, AML-12 간세포에서 G6pc 발현에 확고하고 유의미한 감소를 초래하였다 (도 3). 또한 150 또는 300 ppb 화합물 CDE와 인슐린의 조합의 시험된 처리는, 대조군과 비교할 때, G6pcm RNA 발현의 유의미한 감소를 또한 초래하였다 (도 3). 상기 결과는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여 AML-12 세포에서 G6pc 발현을 억제할 수 있고 300ppb 화합물 CDE의 유효 용량은 100 nM 인슐린에 필적한다는 점을 명백하게 입증한다.
시뮬레이션된 당뇨병 조건 (cAMP 및 Dex 둘 모두에 의해 자극됨) 하에 배양된 AML-12 세포에서 화합물 CDE에 의한 G6pc 발현의 억제 및 이러한 G6pc 발현 조절에 있어 인슐린 작용의 향상
G6pc 발현에 대한 화합물 CDE의 효과를 더욱 조사하기 위하여, 세포-투과성 8-(4-클로로페닐티오) cAMP (8-CPT) 및 덱사메타손 (Dex)으로 병용 처리된 AML-12 세포에서 G6pc mRNA 발현을 검사하였다. 사이클릭 AMP (8-CPT) 및 Dex는 간에서 G6pc 발현 및 글루코스 생산의 잘 알려진 자극물인데, 이것은 생체 내의 당뇨병 상태를 모방한다. 간략히, AML-12 간세포를 24시간 동안 10% FBS, 그러나 ITS/Dex-무함유 배지에서 물 (대조군) 또는 150 ppb 또는 300 ppb의 화합물 CDE 조합으로 전처리하였다. 상기 초기 처리에 이어서, 10 nM 또는 100 nM 인슐린, 0.1 mM 8-CPT, 및 0.5 μM Dex의 존재 또는 부재하에 혈청-무함유 배지에서 6시간 동안 상기 셀레늄 화합물로 재처리하였다. 이러한 처리 후에, 세포들을 수집하여 QRT-PCR 분석을 행하였다. 데이터는 각 그룹당 4개 시료의 평균±표준편차로 도 4에 나타내었다. 도 4에서 다른 문자들(a 대 b, a' 대 b' 대 c', a" 대 b" 대 c") 은 이들 두 그룹들 사이의 유의미한 차이를 의미한다.
도 4에 나타난 바와 같이, 8-CPT/Dex를 사용한 AML-12 세포의 처리는, G6pc mRNA의 발현에서 크다란 증가를 보여주었다. 인슐린을 사용한 처리는 두가지 용량 둘 모두에서 AML-12 세포에서의 8-CPT/Dex-유도성 G6pc 발현을 유의미하게 저하시켰다 (도 4에서 막대 그래프로 된 8-CPT/Dex 그룹에 대비하는 경우). 더욱 중요하게는, 150 ppb의 용량에서의 화합물 CDE는 8-CPT/Dex-유도성 G6pc 발현을 또한 유의미하게 감쇠시켰다. 8-CPT/Dex 및 화합물 CDE의 조합을 더높은 용량 (300ppb)으로 처리한 후에 AML-12 세포에서 G6pc 발현의 평균 수준은, 상기 처리 그룹에서 G6pc 발현의 높은 편차로 인해 P 값은 (8-CPT/Dex 그룹과 대비될 때) 0.05보다 컸지만, 더욱 감소되었다. 그에 개의치 않고, 이들 연구는, 시험된 용량의 화합물 CDE는 단독으로도, 인슐린처럼, G6pc 발현을 억제(8-CPT/Dex 그룹에 비하여 약 40-48% 감소)시킬 수 있다는 것을 입증하였다.
또한, 8-CPT/Dex와 함께 10 nM 인슐린과 조합하여 150ppb 용량의 화합물 CDE로 처리하면, 10nM 인슐린 및 8-CPT/Dex 그룹에 비하여, AML-12 세포에서 G6pc 발현이 더욱 억제되었다 (도 4의 막대 그래프에서 a' 대 b'에 의해 표시됨). 또한, G6pc mRNA 수준의 평균수준은 10 nM 인슐린, 8-CPT/Dex 및 더높은 용량의 화합물 CDE로 처리한 후의 AML-12 세포에서 더 낮았다 (10 nM 인슐린/8-CPT/Dex/300ppb 화합물 CDE 그룹 대 10 nM 인슐린/8-CPT/Dex/150ppb 화합물 CDE 그룹). 그러나 이들 두 그룹들 사이에서 통계적인 차이는 없었다.
더욱 극적으로, 인셋 막대 그래프에 나타난 바와 같이, 8-CPT/Dex의 존재와 함께 100 nM 인슐린과 조합된 300 ppb의 화합물 처리는, AML-12 세포 중의 G6pc 발현은 100 nM 인슐린 및 8-CPT/Dex 그룹에 비하여 더욱 유의미하게 억제시켰다 (도 4에서 막대그래프의 a" 대 b"로 표시됨). 더구나, 100nM 인슐린, 8-CPT/Dex 및 300ppb의 화합물 CDE로 처리한 후에 AML-12 세포 중의 G6pc mRNA 수준은 100nM 인슐린/8-CPT/Dex/150ppb 화합물 CDE 그룹에서보다 유의미하게 더 낮았다 (도 4에서 인셋 그래프 참조).
종합하면, 상기 결과에 따르면, 인슐린과 화합물 CDE의 조합이 8-CPT/Dex 처리로 인해 G6pc의 증가된 발현을 억제하는데 인슐린 단독 또는 화합물 CDE 단독보다 훨씬 더 효과적임이 입증된다.
상기 처리 후의 AML-12 세포의 배양 배지에 대해 글루코스 분석을 또한 수행하였다. 불행히도, AML-12 세포에 의해 생성된 글루코스의 수준은 심지어 8-CPT/Dex 자극 후에도 너무 낮아서 민감 형광 글루코스 분석(Abcam)으로 검출되지 않았다 (데이터 미제시).
요약하면, 상기 기술된 배양 조건하에 배양된 AML-12 세포에 대한 상기 결과에 따르면, 화합물 CDE는 인슐린을 모방하여 정상 모델과 병리학적 또는 당뇨병적 조건 (예를 들면, 8-CPT/Dex로써 세포의 처리)의 시험관내 모델 둘 모두에서 G6pc 발현을 억제할 수 있음이 입증된다. 또한, 화합물 CDE는 인슐린 작용을 향상시켜 시뮬레이션된 당뇨병 조건에서AML-12 세포에서 G6pc 발현을 억제할 수 있다. 상기 결과들은 화합물 CDE가 I형 및/또는 II형 당뇨병에서 과도한 글루코스 생산을 억제하는 잠재력을 가지고 있다는 분자적 증거를 제공한다.
화합물 CDE로 처리한 후 AML-12 세포에서 Insr 및 Igf1r 의 발현의 상향조절
인슐린 수용체 (Insr) 및 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체 1 (Igf1r)는 G6pc 발현 및 이어서 간에서 글루코스 생산을 제어하기 위한 인슐린 및 IGF1 작용에 필수적이다. 화합물 CDE 조합이 수용체-의존성 방식으로 간세포에서 인슐린 또는 IGF1 민감성을 조절할 수 있는지 조사하기 위해, 인슐린 및 IGF1 수용체의 발현을 QRT-PCR 분석에 의해 결정하였다.
AML-12 세포를 먼저 24시간 동안 FBS-/Dex-함유 그러나 ITS-무함유 배지에서 물 대조군 (대조군, n=4), 셀레늄 화합물 CDE 및 이의 황 유사체 화합물 HIJ (n=4)로 처리하고, 이어서 Insr 및 Igf1r의 QRT-PCR 분석을 행하였다. 도 5A에 나타낸 바와 같이, Insr mRNA 수준은 화합물 CDE 처리 후 확실히 2.78배 증가되었다. 유사하게, Igf1r 발현도 화합물 CDE로 자극되어 약 2.2배로 유의미하게 증가되었다 (도 5B). 그러나, 황 유사체 화합물 HIJ는 AML-12 세포에서 Insr 및 Igf1r 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 5A 및 5B 참조).
화합물 CDE는 Insr 및 Igf1r 발현을 증강시킬 수 있다는 것을 더욱 확인하기 위하여, AML-12 세포를 24시간 동안 FBS-함유 그러나 ITS/Dex-무함유 배지에서 두가지 용량의 화합물 CDE로 처리하였다. 그 후, 상기 세포를 6시간 동안 FBS/ITS/Dex-무함유 배지에서 8-CPT/Dex의 존재 또는 부재하에 동일한 용량의 화합물 CDE로 재처리하였다. 또한, 이들 세포를 6시간 동안 인슐린으로 처리하여, Insr 및 Igf1r 발현을 제어하는데 인슐린과 화합물 CDE 사이에 어떤 차이가 있는지를 살펴보았다.
도 5C 및 5D에 나타난 바와 같이, 150 ppb 및 300 ppb 용량으로 화합물 CDE의 처리는, 대조군 (즉, 0 ppb CDE/인슐린 무함유 및 8-CPT/Dex 무함유) 그룹과 비교할 때, 8-CPT/Dex의 병행처리없이 AML-12 세포에서 Insr 및 Igf1r 발현을 유의미하게 증강시켰다. 그러나, 인슐린 단독은 AML-12 세포에서 Insr 및 Igf1r을 증가시키지 않았다 (도 5B 및 5C 참조). 유사하게, 인슐린이 아니라 300 ppb 용량으로 화합물 CDE의 처리는, 8-CPT/Dex로 동시처리된 AML-12 세포에서 Insr 및 Igf1r 발현을 또한 유의미하게 증강시켰다 (도 5C 및 5D에서 검은 막대 참조).
이들 결과들은 화합물 CDE가 시험 조건에서 AML-12 세포에서 Insr 및 Igf1r 발현을 자극할 수 있음을 입증한다. 또한, 이들 데이터는 AML-12 세포에서 유전자 발현을 조절하는데 인슐린과 화합물 CDE 작용 사이에 차이가 존재함을 보여준다. 또한, 이들 결과는 화합물 CDE는 인슐린 민감도를 향상시킴으로써 I형 및 II형 당뇨병을 치료하는데 유용할 수 있음을 제안한다.
종합하면, 상기 유전자 발현 연구 (도 2-4)는 개별 화합물이나 이들의 황 유사체가 아니라, 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여 G6pc 발현을 유의미하게 약화시킬 수 있음을 입증하고, 그로써 간 글루코스 생성을 감소시키는 새로운 방식을 나타낸다. 이들 데이터는 화합물 CDE가 8-CPT/Dex와 같은 글루코스 생산 자극제의 존재 하에서도 마우스 간세포에서 G6pc 발현의 억제에 인슐린이 하는 것과 유사한 방식으로 작용할 수 있다는 분자적 증거를 또한 제공한다 (도 3-4).
또한, 화합물 CDE 조합은 8-CPT/Dex-자극된 AML-12 세포에서 인슐린 작용을 또한 향상시켜 G6pc 발현을 더욱 억제시킨다 (도 4). 화합물 CDE 조합은 Insr 및 Igf1r 발현을 자극할 수 있는데 (도 5), 이것은 간에서 글루코스 생산을 위한 G6pc 발현의 감소에 기여하고 아울러 인슐린/Igf1r 감수성 및 글루코스 통행을 증강시킨다. 게다가, 화합물 CDE 조합은 간세포의 생존력에 대한 독성 효과를 갖지 않았다 (도 1). 요컨대, 이들 결과들은, 화합물 CDE 조합이 마우스 간 AML-12 세포에서 세포 생존 또는 생존력에 대해 어떠한 독성효과도 없이 인슐린을 모방하여 G6pc 발현을 억제하고, 그 과정에서 Insr 및/또는 Igf1r 발현의 자극을 통해 인슐린 작용을 또한 향상시킨다는 것을 입증한다.
실시예 5: 화합물 CDEE는 AML-12 세포에서 Foxo3 및 Foxo4 인산화를 표적화한다
포크헤드 전사인자 패밀리 서브클래스 O (FOXO)는 간에서 대사, 글루코스신합성 및 인슐린 민감성에 결정적인 역할을 한다. FOXO 유전자의 세포내 활성은 번역후 변형에 의해 엄격하게 조절된다. 특히, FOXO의 인산화는 핵으로부터 이것을 제외시켜서 그의 목표 유전자에 접근하는 것을 차단한다. 인슐린-내성 또는 당뇨병 개체에서는, 핵으로부터 FOXO를 제외시키라는 어떠한 신호도 없고, 따라서 이것은 핵에 잔류하여 존재하고 G6pc의 전사를 자극한다. 증가된 G6pc 발현은 글루코겐분해를 유도하고, 고혈당을 유발한다. 또한 인슐린-유사 성장 인자 (IGFs)는 인슐린 작용을 조정하여, 간에서 글루코스 생산을 위한 FOXO-매개된 G6pc 발현을 제어할 수 있다.
앞서 기술된 바와 같이, AML-12 간 세포는 화합물 CDE 조합이 G6pc 발현을 억제하는 인슐린 작용을 모방할 수 있고, 그 과정에서 인슐린 작용을 향상시킬 수 있음을 입증하였다. FOXO는 간에서 글루코스신합성 및 인슐린 민감성의 주요 신호전달 분자이기 때문에, 화합물 CDE가 인슐린처럼 FOXO 및 AML-12 세포의 다른 관련 신호분자를 표적화하는가에 대한 의문을 검사하였다.
화합물 CDE는 혈청-함유 배지에서 AML12 세포의 Foxo3 및 Foxo4 인산화를 표적화한다
화합물 CDE 조합이 간에서 FOXO 인산화를 조절할 수 있는지를 결정하기 위해서, AML-12 세포를 6시간 동안 혈청- 및 Dex-함유 배지에서, 그러나 ITS의 부재하에 대조군, 그리고 150ppb의 셀레늄 화합물 CDE, 및 150ppb의 이들의 황 유사체인 화합물 HIJ로 처리하였다. 처리된 세포들은 웨스턴 블롯 분석에 적용하였다. 웨스턴 블롯에서 단백질 발현의 정량적 데이터는 3개 시료의 평균±표준편차로 나타낸다. 막대 그래프에서 상이한 문자들은 이들 두 그룹 사이의 유의미한 차이 (P<0.05)를 의미한다.
도 6A는, 6시간 동안 물, 및 혈청- 및 Dex-함유 배지 (단 ITS 불함유)에서 150ppb의 화합물 HIJ 및 150ppb의 화합물 CDE로 처리한 후 AML-12 세포에서, 인산화된 Foxo3T32 (트레오닌 32; pFoxo3T32), 인산화된 Foxo T28 (트레오닌 28; pFoxo4T28), 인산화된 PDK1 (pPDK1), 인산화된 AKT T308 (트레오닌 308; pAKTT308), 인산화된 AKT S473 (세린 473; pAKTS473), AKT, 인산화된 Gsk3a S21 (세린 21; pGsk3bS21), 인산화된 Gsk3b S9 (세린 9; pGsk3bS9), Gsk3a, Gsk3b, 인산화된 4EBP1 T37/46 (트레오닌 37 및 트레오닌 46; p4EBP1T37T46), 인산화된 Elf2beS539 (세린 530; pElf2beS530) 및 Elf2be를 비롯한 다양한 신호전달 분자들의 단백질 발현을 나타낸다. Foxo3 (예컨대, 트레오닌 32의 pFoxo3, pFoxo3T32) 및 Foxo4 (예컨대, 트레오닌 28의 pFoxo4, pFoxo4T28) 단백질의 인산화된 형태는 6시간 동안의 화합물 CDE 처리 후 AML-12 세포에서 가시적으로 상승되지만 화합물 HIJ는 그렇지 않은 것으로 밝혀졌다 (도 6A). 정량 분석을 통해 화합물 CDE-처리된 AML-12 세포에서 pFoxo3T32 의 대략 2.5배 증가와 pFoxo4T28의 약 3.2배 증가가 있는 것으로 나타났다 (도 6B 및 6C). 다수의 인산화된 Foxo1 (pFoxo1) 항체들도 검사하였지만, 이들 항체들에 의한 웨스턴 블롯 상의 특이 pFoxo1 단백질 밴드는 검출되지 않았다 (데이터 미제시). 상기 결과는 AML-12 세포에서 pFoxo1 발현이 매우 낮을 가능성을 제안한다.
상기 기술된 바와 동일한 처리 후에 AML-12 세포의 Foxo1, Foxo3, 및Foxo4 단백질 수준의 QRT-PCR 분석을 수행하였다. Foxo1, 3, 또는 4 mRNA 발현의 어떠한 유의미한 변화도 관찰되지 않았으며 (데이터 미제시), 인산화된 Foxo3 및 Foxo4의 증가 (도 6 참조)가 관찰되었지만 이는 화합물 CDE에 의해 AML-12 세포에서 Foxo3/4 발현의 잠재적 증가에 기인하는 것은 아니다. 실제로, 전체 Foxo3 및 Foxo4 단백질 수준은 혈청-무함유 조건에서 배양된 AML-12 세포에서 화합물 CDE에 영향받은 것이 아니었다 (도 7A).
또한, 6시간 및 24시간 동안 상기 동일한 배양 조건 (혈청-함유 배지)에서 Foxo3/4 인산화에 대한 영향을 결정하기 위하여 AML-12 세포에서 개별 화합물 C, 화합물 D 및 화합물 E를 각각 150 ppb 용량에서 검사하였다. 개별 화합물 C, 화합물 D 및 화합물 E에 의한 처리 후에 pFoxo3T32 및 pFoxo4T28 단백질 수준에는 어떠한 변화도 관찰되지 않았으며 (데이터 미제시), AML-12 세포의 Foxo3 및 Foxo4의 인산화로 유도하는 화합물 C, 화합물 D 및 화합물 E의 조합 중에서 상승효과가 있음을 나타낸다.
종합하면, 이들 결과들은 혈청-함유 배지에서 배양할 경우 개별 화합물 또는 이들의 황 유사체가 아니라 화합물 CDE가 AML-12 세포에서 Foxo3 및 Foxo4를 증강시킬 수 있는 것을 입증하였다. FOXO의 인산화가 이들 전사 인자들의 핵제외를 초래하므로, 이들 결과들은 화합물 CDE가 AML-12 간세포에서 Foxo3 및 Foxo4 불활성제로서 기능할 것임을 제안한다.
포스파티딜이노시톨 3-키나제 (PI3K)/포스포이노시타이드-의존성 단백질 키나제 1 (PDK1)/단백질 키나제 B (AKT)는 간에서 글루코스 생산의 인슐린-매개 제어를 위한 FOXO 상류의 주된 신호전달 경로이기 때문에, 이들 화합물-처리된 AML-12 세포에서 인산화된 PDK1 (pPDK1) 및 AKT (pAKT)의 수준에서 임의의 변화가 있는지 여부를 평가하였다. 놀랍게도, 시험된 6시간의 처리에서, 화합물 CDE는 PDK1 및 AKT의 인산화 또는 전체 AKT 수준에 영향을 주지 않았다 (도 6A). 이는 더 이른 시점 (검사된 시험 6시간 시점 이전)에 AML-12 세포에서 발생하는 PDK1 및 AKT의 활성화에 대한 화합물 CDE의 잠재적인 일시적 효과에 기인한 것일 수 있다.
또한, AKT에 의해 직접 제어되는 2개의 다른 하류 신호전달 분자인, 인산화된 GSk3a 및 GSK3b의 수준은 이들의 단백질 수준에서 임의의 변화를 갖는 것으로 관찰되지 않았다 (도 6A). 인슐린-유도성 단백질 합성 또는 번역에 핵심적인 인산화된 4EBP1 (AKT/mTOR 신호전달의 하류 분자 표적) 및 pelf2bεS539 (Gsk3의 하류 분자 표적)의 수준 역시 영향을 받지 않았다 (도 6A). 이들 결과는 화합물 CDE가 앞서 기술한 바와 같이 AML-12 세포 증식 또는 생존에 독성 효과를 갖지 않는다는 추가의 직접적인 분자적 증거를 제공한다 (도 1).
종합하면, 이들 결과는 화합물 CDE가 배양 배지에서 혈청의 존재하에 AML-12 세포에서, 상기에 기술된 Foxo3 및 Foxo4를 제외하고, Gsk3a, Gsk3b, p4EBP1 및 pElf2be S539를 비롯한 여러 AKT-직접 또는 -간접 하류 신호전달 분자에 영향을 미치지 않았음을 제안한다. 다시 말하면, 화합물 CDE는 AML-12 간세포에서 인산화를 증강시킴으로써 FOXO를 선택적으로 불활성화시킬 수 있다.
화합물 CDE는 혈청-무함유 조건에서 배양된 AML-12 세포의 Foxo3/4 인산화를 표적화한다
앞서 언급한 바와 같이, AML-12 세포는 짧은 시간 기간 (즉, 6시간) 동안 혈청-무함유 배지에서 명확한 형상학적 결함없이 배양될 수 있다 (미도시). 따라서, 혈청-무함유 조건에서 배양된 AML-12 세포 중의 인산화된 Foxo3 및 Foxo4 단백질의 단백질 수준을 검사하였다.
간략히, AML-12 세포를 6시간 동안 혈청-무함유, ITS-무함유 및 Dex-무함유 배지에서 대조군 (물), 화합물 CDE (각 화합물의 셀레늄 150ppb), 화합물 CE (각 화합물의 셀레늄 150ppb) 또는 화합물 DE (각 화합물의 셀레늄 150ppb)로써 처리하고 웨스턴 블롯 분석 및 정량 분석을 행하였다. 정량적 데이터는 Actb 단백질 수준으로 표준화하였으며 3개의 시료의 평균±표준편차로 나타내었다. 도 7B 및 7C의 막대 그래프에서 상이한 문자들은 이들 두 그룹 사이의 유의미한 차이 (P<0.05)를 의미한다.
도 7A에 나타난 바와 같이, Foxo3 (트레오닌 32의 pFoxo3) 및 Foxo4 (트레오닌 28의 pFoxo4)의 인산화된 단백질 수준은 혈청-무함유 배지에서 6시간 동안 화합물 CDE 및 화합물 CE로 처리한 후 AML-12 세포에서 증강되는 것으로 나타났지만, 화합물 DE는 그러지 않았다. 셀레늄 화합물로 처리한 후 전체 Foxo3 및 Foxo4 단백질 수준에는 어떠한 명백한 변화도 없었다 (도 7A). 이들 단백질 시료에 대해 다수의 특이성 Foxo1 (pFoxo1) 항체를 사용하였지만 pFoxo1의 어떠한 특이성 밴드도 검출되지 않았다 (데이터 미제시).
정량분석은 화합물 CDE-처리된 및 화합물 CE-처리된 AML-12 세포에서 pFoxo3T32 (도 7B)가 약 1.8배 증가하고 pFoxo4T28 (도 7C) 수준이 약 6배 증가하였음을 보여주었다. pPdk1, pAkt, pGsk3a, pGsk3b, 및 p4ebp1과 같은 모든 다른 시험 분자들은 화합물 CDE에 의해서는 명백하게 변화되지 않았다 (도 7A). 화합물 CDE에 의해 혈청-무함유 조건에서 배양된 AML-12 세포로부터 얻어진 상기 결과들은 혈청-함유 배지에서 배양된 AML-12 세포로부터의 발견과 일치한다 (도 6). AML-12 세포에서 화합물 CDE에 의한 Foxo3 및 Foxo4 인산화의 증강은 FBS, 성장인자 또는 인슐린에 완전히 비의존성인데, 인슐린 또는 FBS는 이 실험에서 세포들의 배양 배지에 첨가되지 않았기 때문이다. 다시 말하면, 화합물 CDE는 인슐린 또는 성장 인자들을 우회하여 간세포에서 Foxo3 및 Foxo4를 불활성화할 수 있다.
요컨대, 상기 결과들은 화합물 CDE가 혈청-함유 배지 (도 6) 및 혈청-무함유 배지 (도 7) 둘 모두에서 배양된 AML-12 세포에서 Foxo3 및 Foxo4 인산화를 특이적으로 표적화할 수 있음을 입증한다. 따라서, 화합물 CDE는 신규 FOXO 불활성화제이고 화합물 CDE에 의한 이들 FOXO 분자들의 불활성화는 마우스 간세포에서 인슐린-, FBS- 및 다른 성장 인자-비의존성이라는 것을 상기 연구로부터 결론내릴 수 있다.
AML-12 세포에서 FOXO4 인산화의 관찰된 증가가 포유동물에서 화합물 CDE 조합의 일반적인 효과인지를 시험하기 위하여, AML-12 간세포와 동일한 실험 조건하에 동일한 시간으로 간이 아닌 IMR-32 신경세포주의 pFOXO4 수준을 검사하였다. 도 8에 나타낸 바와 같이, FOXO4 인산화의 증가는 화합물 CDE-처리된 IMR-32 신경세포에서 관찰되지 않았다. 인산화된 FOXO1 및 FOXO3의 단백질 수준도 또한 검사되었는데 인산화된 FOXO3는 간신히 검출되었고 인산화된 FOXO1는 그들의 특이 항체에 의해 IMR-32 세포에서 미검출되었다 (데이터 미제시). 그에 개의치 않고, 화합물 CDE에 의해 IMR-32 세포에서 FOXO4의 증가된 인산화의 부재는, 화합물 CDE 조합이 신경 세포에 어떠한 독성 효과도 갖지 않을 것 같다는 것을 보여준다. 따라서, 본 발명자들은 화합물 CDE에 의해 개선된 FOXO 인산화는 간-세포 특이성일 것이라는 결론을 내릴 수 있다.
종합하면, 상기 결과들은 개별 화합물 또는 이들의 황 유사체가 아니라 화합물 CDE가 새로운 간세포-특이성 FOXO 불활성화제로서 기능할 것이라는 점과 마우스 간세포에서 화합물 CDE에 의한 이들 FOXO 분자들의 비활성화가 인슐린 및 임의의 다른 성장 인자들에 비의존성이라는 점을 제안한다.
본원에 기술된 이전의 데이터는 화합물 CDE가 인슐린 작용을 모방하여 AML-12 세포에서 G6pc 발현을 억제하고 인슐린 작용을 향상시킬 수 있다는 것을 입증하였다 (도 3-4). 후자 (도 4)는, 앞서 논의된 바와 같이, Insr 및 Igf1r 발현 증가에 또한 기인한 것일 수 있다(도 5). 상기 모든 사건들은 인슐린 / 성장 인자 / 화합물 CDE에 의한 Foxo3 및 Foxo4의 FBS-비의존성 불활성화로 인한 것일 가능성이 큰데 (도 6-7), 이는 G6pc는 인간 간에서 잘 알려진 FOXO 표적 유전자이고, 반면 Insr 및 Igf1r는 이들의 유전자 프로모터에 존재하는 많은 Foxo 결합 모티프들로 인해 2개의 잠재적 Foxo3/4 표적 유전자이기 때문이다 (데이터 미제시). 화합물 CDE에 의한 증강된 Insr 및 Igf1r (도 5)는 인슐린 작용을 더욱 증강시키거나 인슐린 감수성을 향상시켜 Foxo3/4 인산화를 더욱 자극하고 G6pc 발현을 억제하게 된다.
그에 개의치 않고, 상기 결과들은 화합물 CDE의 조합이 AML-12 간세포에서 잠재적인 인슐린-비의존성 또는 다른 성장인자-비의존성 FOXO 불활성화제로서 특이적으로 작용하여 G6pc 발현을 억제할 수 있고 간 글루코스 산출을 가능성 높게 저하시킬 것임을 제안한다. 또한, G6pc 발현을 제어하여 간 글루코스 생산을 저하시킨다는 맥락에서, 화합물 CDE의 투여는 인슐린-내성이 되어가는 간세포의 생리학적 결과를 가능성 높게 완화시킬 것이다. 인슐린을 우회하여 화합물 CDE에 의해 Foxo 인산화를 증강시키는 것은, 여전히 FOXO-매개된 G6pc 발현의 조절을 통해 글루코스 항상성을 제어할 수 있다고 하더라도, 일반적으로 당뇨병 치료를 위한 다수의 치료적 가능성을 열어 둔다. 결론적으로, 당뇨병 치료는 외인성 인슐린의 편향된 투여에, 또는 인슐린 수용체의 정확한 기능에 덜 의존성이게 된다.
실시예 6
화합물 CDE 조합은 G6pc 발현 및 글루코스 생산의 억제에서 인슐린 작용을 향상시키고 인슐린을 우회시켜 마우스 일차 간세포에서 Pdk1/Akt/Foxo1/3/4 신호전달을 세포에의 독성없이 조절한다.
3종의 합성 셀레노유기 화합물들의 조합, 화합물 CDE를 글루코스 생산, G6pc 발현 및 Foxo1/3/4 인산화에 대한 효과에 대해 마우스 일차 간세포의 세포 배양액 중에서 조합하여 검사하였다.
재료 및 방법
마우스 일차 간세포 단리 및 화합물
마우스 일차 간세포는 트라이앵글 리서치 랩 (Triangle Research Labs, LLC) (Research Triangle Park, North Carolina)으로부터 구매하였다. 상기 마우스 일차 간세포를 성숙하고 건강한 정상 C57BL6 마우스로부터 단리하여, 트라이앵글 리서치 랩 (TRK)에서 24시간 동안 콜라겐-코팅된 12-웰 또는 24-웰 플레이트 상에서 배양한 후에, 실험을 위해 본 발명자들의 연구소로 이송하였다.
화합물 C (5'-메틸셀레노아데노신), D (Se-아데노실-L-호모시스테인) 및 E (감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인)을 알테크 (Alltech, Inc)의 화학 연구실에서 합성하였다. 모든 시험 화합물의 순도는 질량 분광분석법에 의해 결정되는 바와 같이, ≥ 99%인 것으로 확인되었다.
세포 배양 및 처리
12-웰 또는 24-웰 콜라겐-코팅된 배양 플레이트 상에서 성장한 마우스 일차 간세포를 마우스로부터 간세포의 단리 후 3일째에 트라이앵글 리서치 랩 (TRL)으로부터 받아서, TRL 추천 절차 (Research Triangle Park, NC)에 따라, 37℃에서 5% CO2 인큐베이터 내 간세포 유지 배지 (TRL)에서 배양하여 8시간 동안 또는 밤새 간세포를 순응시켰다.
밤새-순응된 간세포를 PBS로 2회 세척하여 TRL 간세포 유지 배지 중의 임의의 잔류 FBS 및 다른 첨가물들을 제거하고, 10% 소태아혈청 (FBS)으로 보충된 DMEM/F12 배지에서 24시간 동안 대조군 (물) 또는 셀레늄 화합물 CDE (각 셀레늄 화합물 150 또는 300 ppb)로 전처리하였다. 그런 후에, 이들 세포를 PBS로 2회 세척하고, 추가 6시간 동안 20 mM 락토스 (Sigma) 및 2 mM 피루베이트 (Sigma) 및 15 mM HEPES (Sigma)로 보충된 혈청-무함유 및 글루코스-무함유 DMEM 배지 (Invitrogen)에서 인슐린 (10 또는 100 nM, Sigma), 0.1 mM 8-CPT (Sigma) 또는 0.5 μM Dex (Sigma)의 존재 또는 부재하에 동일한 용량의 셀레늄 화합물 CDE (150 또는 300 ppb)와 인큐베이션하였다. 처리 후에, 세포 배지를 수집하여 글루코스 분석 및 락테이트 데히드로게나제 (LDH)의 독성 연구를 행하였으며, RNA 및 단백질 분석을 위해 세포를 수집하였다.
혈청-완전 무함유 배양 조건에서 마우스 일차 간세포에 대한 화합물 CDE의 연구를 위해, 간세포를 8시간 동안 간세포 유지 배지 (TRL)에서 순응시키고, PBS로 2회 세척하여 (배양 접시 중의 임의의 잔류 FBS 및 다른 첨가물들 제거하고), 이어서 하룻밤 동안 혈청-무함유 DMEM/F12 배지에서 절식시켰다. 이들 혈청-결핍된 간세포들 중의 일부를 6시간 동안 20 mM 락토스 및 2 mM 피루베이트 및 15 mM HEPES로 보충된 혈청-무함유, 글루코스/페놀 레드-무함유 DMEM 배지에서 인슐린 (10 또는 100 nM), 0.1 mM 8-CPT (Sigma) 또는 0.5 μM Dex (Sigma)의 존재 또는 부재하에 대조군(물), 셀레늄 화합물 (각 화합물 150 또는 300 ppb)로 처리하였다. 처리 6시간 후에, 배양 배지는 글루코스 분석 및 LDH 활성도를 모니터링하는 독성 연구를 위해 수집하고, 배양된 세포는 단백질 분석을 위해 단리하였다. 또한, 일부 혈청-결핍된 간세포를 0, 5, 30, 60, 120 및 180분 동안 평범한 DMEM/F12 배지에서 화합물 CDE (각 화합물 300 ppb)로 처리하였으며, 세포들은 다양한 신호전달 분자들의 시간경과 단백질 분석을 위해 수집하였다.
RNA 단리 및 실시간 PCR 분석
이들 세포들의 전체 RNA를 트리졸(Trizol, Invitrogen)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라서 단리한 후에, 임의의 잠재적인 오염된 게놈 DNA를 제거하기 위하여 DNase I과 함께 인큐베이션하였다. 그런 후에, RNA 시료를 앞서 기술된 바와 같이 (Lan et al EMBO J 2003), 어플라이드-바이오사이언스의 RT 키트 및 미리 설계된 태크만 프로브 (Invitrogen)를 사용하여 실시간 PCR 분석을 행하였다. 3 내지 시료를 각 처리 그룹에서 분석하였다. 데이터를 각 시료 내. ctb mRNA 수준으로 표준화하였고, 3-4개 시료의 평균±표준편차로 나타내었다.
단백질 제조 및 웨스턴 블롯 분석
상술한 처리 후에, 마우스 일차 간세포를 얼음-냉각된 PBS로 세정하고, 30분 동안 얼음 상에서 완전 프로테이나제 및 포스파타제 억제제 (Themo-Fisher Scientific, Waltham, MA)를 함유하는 얼음-냉각된 RIPA 완충제에 용해하였다. 세포 용해물을 세포 스크레퍼 및 전달 피펫 (transfer pipette)을 사용해 수집한 후, 4℃에서 30분 동안 12000xg로 원심분리하여 DNA 펠렛을 제거하고 단백질 추출물을 수득하였다. 이들 세포 용해물의 상청액 내 단백질 수준을 피어스 마이크로-BCA (Pierce Micro-BCA) 단백질 분석 키트 (Themo Scientific-Piece Biotechnology, Rockford, IL)를 사용하고 제조사의 프로토콜에 따라서 결정하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해, 이전에 기술된 바와 같이 (Reddy et al. 2008 Science), 대조군- 및 화합물(들)-처리된 세포에서 전체 단백질 중의 5 μg 을 SDS-PAGE 겔 분리에 적용한 후, PVDF 막으로 옮겼다. 막을 5% (w/v)의 소 혈청, 알부민 (Sigma, St. Louis, MO)을 함유하는 포스페이트-완충 식염수 (PBS) 중에서 차단하고, 특이적 일차 항체와 함께 인큐베이션하고, 이어서 HRP-접합 항-마우스 또는 항-토끼 이차 항체 (1:5000 희석, Cell Signaling Inc.)와 함께 인큐베이션하였다.
Actb (Li-COR, Lincoln, Nebraska)를 제외한 모든 일차 항체들은 셀 시그날링(Cell Signaling Inc.)로부터 구입하였다. 멤브레인 블롯 상의 양성 신호는 아머샴(Amersham)의 증강된 화학발광 웨스턴 블롯팅 프라임 검출 시약 (GE healthcare Lifescience, Pittsburgh, PA)을 사용하여 검출하였다. 멤브레인 블롯 상의 이들 발광 신호의 이미지를 LI-COR 오딧세이 Fc 이미지 시스템 (Lincoln, Nebraska)을 사용하여 캡쳐하였다. 동일한 멤브레인 블롯을 벗겨내고 GE WB ECL-프라임-검출 프로토콜 (GE healthcare Lifescience, Pittsburgh, PA)에 기술된 바와 같이 또 다른 항체를 이용하여 재-블롯팅하였다. 웨스턴 블롯에서의 단백질 밴드 밀도를 NIH 이미지J 소프트웨어를 사용하여 결정한 후, 각 시료에서의 Actb 수준으로 표준화하였다. 데이터는 각 그룹당 3개 시료의 평균± 표준편차로 나타내었다.
글루코스 생산의 분석
상기 기술된 처리에서의 세포 배양 배지를 수집하고 5분 동안 300 x g에서 원심분리하여 임의의 잠재적인 이동된 간세포를 제거하고 글루코스 비색 분석 키트 (Abcam)를 사용하여 제조사 프로토콜에 따라 글루코스 분석을 적용하였다. 시료와 다양한 농도의 글루코스 표준의 OD570 nm에서의 흡광도를 바이오-테크 마이크로플레이트 판독기로 결정하고, 각 시료의 배지 중의 글루코스 농도를 글루코스 표준곡선으로부터 수득한 후에, 피어스 마이크로-BCA (Pierce Micro-BCA) 단백질 분석 키트 (Themo Scientific-Piece Biotechnology, Rockford, IL)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 결정된 부착 세포에서의 단백질 수준으로 표준화하였다. 각 처리 그룹에서 글루코스 수준은 대조군 (화합물 CDE, 인슐린, 8-CPT/Dex 및 Dex로 처리하지 않음)에서의 평균 수준으로 나누어 상대 글루코스 수준을 수득하였다. 데이터를 3-4개 시료의 평균 ± 표준편차로 나타내었다.
배양 배지에서 LDH 수준의 검사에 의한 독성 연구
상기 글루코스 분석과 유사하게, 상기 기술된 처리로부터 세포 배양 배지를 수집하고 5분 동안 300x g에서 원심분리하여 임의의 잠재적인 분리된 간세포를 제거하고 글루코스 비색 분석 키트 (Abcam)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라서 LDH 분석을 행하였다. 간략히, LDH 기질과의 인큐베이션 후 LDH 표준품 및 배양 배지 시료에서 OD450 nm에서의 흡광도를 매 2분 마다 40분까지 바이오-테크 마이크로플레이트 판독기를 사용하여 결정하였다. 각 시료의 배지 중의 LDH 농도를 제조사의 프로토콜에 따라서, 흡광도의 선형 범위 내의 OD450 판독값을 공제하고, 이어서 LDH 표준 곡선을 사용하여 수득하였다. 그 후에 각 시료의 배지수득된 LDH 수준을 부착 세포에서 이의 단백질 수준으로 표준화하였다. 각 처리 그룹의 LDH 수준을 대조군 (화합물 CDE, 인슐린, 8-CPT/Dex 및 Dex로 처리하지 않음)의 평균값으로 더 표준화하여 각 그룹에서 상대적인 LDH 수준을 수득하였다. 데이터를 3-4개 시료의 평균± 표준편차로 나타내었다.
통계학적 분석
적용된다면, 두 그룹 사이의 차이의 통계학적 차이를 결정하기 위하여 스튜던츠 t-검정을 수행하였다. 0.05 미만의 P-값이 유의미한 것으로 간주하였다.
결과 및 논의
화합물 CDE 조합이 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산 및 G6pc 발현을 억제한다
AML-12 세포에서 본원에서 기술된 이전의 연구들을 통해, 화합물 CDE는 인슐린을 모방하여 G6pc 발현을 억제하지만 (도 3-4) AML-12 세포 생존력에 대해 어떠한 독성 효과도 갖지 않는 것 (도 1)이 입증된다. 그러나, 화합물 CDE가 AML-12 세포에서 글루코스 생산을 제어할 수 있는지의 여부는 확정할 수 없었는데, AML-12 세포에 의해 생산된 배양 배지 중의 글루코스 수준이 너무 낮아 민감 형광 글루코스 분석 키트 (Abcam, 데이터 미제시)로는 검출할 수 없었기 때문이다. 따라서, 마우스 일차 간세포를 사용하여 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여 글루코스 생산을 억제할 수 있는지를 조사하였으며, G6pc 발현에 대한 화합물 CDE의 억제된 효과가 있지만 AML-12 세포에서 관찰된 세포 생존에 대해서는 독성 효과가 없음을 더욱 확인하였다.
AML-12 세포에 대한 연구와 유사하게, 마우스 일차 간세포를 24시간 동안 혈청-함유 DMEM/F12 배지에서 대조군(물) 또는 150 또는 300 ppb 용량의 셀레늄 화합물 CDE로 전처리하였다. 상기 처리에 이어서, 6시간 동안 인슐린 (10 또는 100 nM)의 존재 또는 부재 하의 상기 셀레늄 화합물로 또는 인슐린 단독으로 재처리하였다. 또한, 세포-투과성 cAMP, 8-CPT 및 Dex를 일부 대조군-재처리된 간세포에 6 시간동안 첨가하여 마우스 일차 간세포가 간세포에서 글루코스 생산의 잘 알려진 이들 자극물에 반응하여 기능하고 있는지의 여부를 확인하였다. 상기 기술된 처리 후에, 글루코스 분석 및 독성 분석 (LDH 수준을 측정하에 의함)을 위해 세포 배양 배지를 수집하였다. 부착된 세포들을 단백질 분석에 적용하여 시료 내의 전체 세포를 반영하는 각 웰단백질 수준을 결정하였다. 그 후, 배양 배지에서 수득된 글루코스 수준을 각 시료 중의 단백질 수준으로 표준화하였다. 데이터는 4개의 시료의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 도 9C에서, * P<0.05 는 비히클 처리 그룹 (그래프에서 첫 번째막대)에 대한 것이다. 도 9C에서, 모든 처리 그룹 대 대조군 처리 그룹첫번째 막대)에서 유의미한 증가가 없다.
도 9A에 나타낸 바와 같이, 8-CPT/Dex의 처리는 일차 간세포의 글루코스 생산의 유의미한 증가를 초래하였으며, 이들 일차 간세포가 마우스 간에서 최초 단리된 때로부터 5일 동안 가공처리, 수송 및 배양된 후에도 생물학적으로 기능성임을 나타내었다. 상기 발견을 더욱 뒷받침하기 위하여, 10 nM 및 100 nM 용량으로 인슐린 단독으로 처리하여도 글루코스 생산의 유의미한 저하를 초래하였다 (수-처리된 대조군 그룹에 비해 약 25-30% 저하; 도 9A).
더욱 중요하게는, 두가지 용량 (150 ppb 및 300 ppb)으로 화합물 CDE로 처리하면 수-처리된 대조군 그룹에 비해 약 20-28% 저하로 글루코스 생산을 유의미하게 감소시켰다 (도 9A). 화합물 CDE와 인슐린과의 병용 처리도 대조군 그룹에 비해 검사된 처리에서 약 32-38% 만큼 글루코스 생산을 또한 유의미하게 억제하였다 (도 9A).
시험 용량 둘 모두에서 화합물 CDE에 의한 글루코스 생산의 저하 정도는 인슐린 (10 또는 100 nM)에 필적하였음이 강조되어야 하며, 시험 용량에서의 화합물 CDE는 100 nM의 농도의 인슐린만큼 효과적으로 글루코스 생산을 억제한다는 것을 제안한다. 본원의 데이터는 인슐린, 화합물 CDE 또는 이들 둘 모두에 의한 최대로 달성가능한 글루코스 생산 저하가 이들 간세포에서 20 내지 38% 임을 또한 나타낸다. 그에 개의치 않고, 본원의 데이터는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산을 억제한다는 것을 입증한다.
G6PC는 간에서 글루코스 생산에 필수적이다. 따라서 동일한 배치의 간세포에서 동일한 처리 후에 G6pc 발현을 검사하였다. 간략히, 두 세트의 일차 간세포를 혈청-함유 DMEM/F12 배지에서 대조군(물) 또는 150 및 300 ppb 용량의 셀레늄 화합물 CDE로써 전처리하고, 이어서 6시간 동안 인슐린 (10 및 100 nM)의 존재 또는 부재 하에 상기 셀레늄 화합물로 재처리하였다. 이들 처리 후에, 간세포를 수집하고, RNA 단리 및 이어서 G6pc 및 Actb의 QRT-PCR 분석을 행하였다.
도 9B에 나타낸 바와 같이, 인슐린은 단독으로 또는 두가지 용량의 화합물 CDE의 존재 하에 G6pc 발현을 유의미하게 억제하였다. 화합물 CDE도 150 ppb에서, 비록 제한된 시료 개수로 인해 통계적으로 유의미하지 않을 가능성이 높지만, G6pc 발현의 저하 (약 31% 저하, 도 9B)를 또한 초래하였다. 그러나, G6pc mRNA 수준의 유의미한 저하 (42% 저하)가 300 ppb의 화합물 CDE 단독으로 처리한 후에 간세포에서 관찰되었다 (도 9B). 상기 결과들은 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여, 비록 100 nM 용량의 인슐린보다 약간 덜 효과적이지만, 마우스 일차 간세포에서 G6pc 발현을 또한 억제할 수 있다는 것을 입증한다. 이들 발견은 AML-12 세포에서의 G6pc 발현의 억제 (도 3)와 상기 기술된 마우스 일차 간세포에서 화합물 CDE에 의한 약화된 글루코스 생산 (도 9A)과 일치한다.
락테이트 디히드로게나제 (LDH)는 간세포에서 화합물 독성의 연구를 위한 의약품 개발에 널리 사용된다. 화합물 처리에 의해 배양 배지 중의 LDH 수준 (배양 세포 중의 단백질 수준으로 표준화된 후)의 증가는 그 화합물이 세포질 LDH를 배양 배지 내로 방출하는 세포 파괴 또는 세포막 누출로 인해 간세포에 독성이 될 것임을 제안한다. 화합물 CDE가 마우스 일차 간세포에 독성인지의 여부 및 화합물 CDE에 의해 글루코스 생산 및 G6pc 발현에서 관찰된 저하 (도 9A 및 9B)가 독성인지의 여부를 조사하기 위하여, 상기 글루코스 분석에서 기술된 바와 같이 화합물 CDE로 처리한 후에 마우스 일차 간세포의 배지 중의 LDH 수준을 검사하였다.
간략히, 마우스 일차 간세포를 혈청-함유 DMEM/F12 배지에서 대조군(물) 또는 150 및 300 ppb 용량에서의 셀레늄 화합물 CDE로써 전처리하고, 이어서 6시간 동안 인슐린 (10 및 100 nM)의 존재 또는 부재 하에 상기 셀레늄 화합물로 재처리하였다. 그 후에, LDH의 독성 분석을 위해 세포 배양 배지를 수집하고 부착된 세포들을 단백질 분석에 적용하여 각각에서 단백질 수준을 결정하였다. 배양 배지에서 수득한 LDH 수준은 각 시료 중의 단백질 수준으로 표준화하였다.
도 9C에 나타낸 바와 같이, 화합물 CDE, 인슐린 또는 둘 모두로의 처리는 배지 중의 LDH 수준의 유의미한 증가를 초래하지 않았다. 대신, LDH 수준은 인슐린의 존재 또는 부재의 어느 쪽이든 300 ppb 용량의 화합물 CDE로 처리한 후에 간세포에서 약간 저하된 것으로 보이고, 화합물 CDE가 더 높은 용량에서는 세포 파괴에 대한 보호 효과에 더욱 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
이와 같이, 상기 결과들은 화합물 CDE가 마우스 일차 간세포에 독성을 갖지 않음을 입증하는데, 이것은 AML-12 세포의 생존력에 대한 화합물 CDE의 무독성 효과 (도 1)와 일치한다. 또한, 상기 결과들은 글루코스 생산 및 G6pc 발현에서 상기 관찰된 저하 (도 9A 및 9B)가 화합물 CDE로 처리 후의 일차 마우스 간세포에서 덜 건강한 세포들에 의해 초래되는 가능성을 또한 배제한다.
종합하면, 상기 연구는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여 마우스 간세포에서 세포에의 독성이지 않으면서도 G6pc 발현 및 더욱 중요하게는 글루코스 생산을 억제할 수 있다는 것을 입증한다. 이들 결과는 안정한 마우스 간 AML-12 세포에서 관찰된 바 있는 인슐린-비의존성 G6pc 발현 억제 및 세포 생존에의 비독성과 일치한다 (도 1 및 도 3).
시뮬레이션된 당뇨병 조건 (8-CPT 및 Dex 둘 모두에 의해 시뮬레이션됨) 하에 화합물 CDE에 의한 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산과 G6pc 발현의 억제 및 이들 과정에서 인슐린 작용의 향상
본원에 기술된 연구들을 통해 화합물 CDE 조합은 인슐린을 모방하여 8-CPT/Dex의 자극 하에 AML-12 세포에서 G6pc 발현을 억제하고 인슐린 작용을 향상시킬 수 있음이 입증된다 (도 4). 화합물 CDE의 효과를 더 조사하기 위하여, 간에서 글루코스 생산 및 G6pc 발현의 2개의 잘 알려진 자극제인 cAMP 및 Dex로 병용 처리된 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산 및 G6pc mRNA 발현을 검사하였다.
간략히, 마우스 일차 간세포를 24시간 동안 10% FBS DMEM/F12 배지에서 대조군(물) 또는 150 또는 300 ppb 화합물 CDE로 전처리하고, 이어서 6시간 동안 혈청-무함유 배지에서 10 및 100 nM 인슐린, 0.1 mM 8-CPT 및 0.5 μM Dex의 존재 또는 부재 하에 상기 셀레늄 화합물로써 재처리하였다. 처리 후에, 앞서 기술된 바와 같이 글루코스와 LDH의 분석을 위해 배양 배지를 수집하였다. 또한 한쌍의 마우스 일차 간세포 (동일한 배치의 간세포로부터)를, 상기 기술된 바와 동일한 처리 후에, G6pc 발현의 QRT-PCR 분석에 적용하였다. 데이터를 3-4개 시료의 평균±표준편차로 나타내었다. 도 10A-10B에서, 상이한 문자들(a 대 b, a' 대 b' 대 c', a" 대 b" 대 c")은 이들 두 그룹 사이에 유의미한 차이를 의미한다. 도 10C에서, *는 비히클 처리 그룹 (그래프에서 첫 번째 막대)에 대해 P<0.05이다.
도 10A에 나타낸 바와 같이, 8-CPT/Dex로써의 처리는 대조군 만의 처리 그룹과 비교할 때 글루코스 생산에서 유의미한 증가를 초래하였다. 상기 데이터는 배양된 마우스 일차 간세포가 기능하고 있음을 나타내었다. 인슐린으로의 처리는 두가지 용량 모두에서 간세포에서 8-CPT/Dex-유도성 글루코스 생산을 8-CPT/Dex 그룹에 비하여 유의미하게 저하시켰다 (도 10A). 중요하게도, 150 ppb의 용량의 화합물로써 처리하면 간세포에서 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산이 억제되는 경향이 있었다. 더욱 극적인 것은, 화합물 CDE는 300 ppb의 용량에서 간세포 중의 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산을 유의미하게 억제하였으며 글루코스 생산의 저하 정도는 100 nM 인슐린의 효과와 거의 동일하였다. 상기 결과는 화합물 CDE가 300 ppb에서 당뇨병 조건에 유사한 조건 하에서도 일차 간세포 중의 글루코스 생산을 억제하기에는 100nM 농도의 인슐린 만큼 효과적임을 제안한다. 상기 결과는 무-8-CPT/Dex-병용처리된 마우스 일차 간세포에서 관찰된 발견들과 일치하며 (도 9A), 또한 화합물 CDE 조합은 인슐린을 모방하지만 인슐린-비의존성 방식으로 글루코스 생산을 억제한다는 것을 더욱 제안한다.
또한, 화합물 CDE는 10 nM 또는 100 nM 인슐린과 조합하여 시험 용량 둘 모두에서 마우스 일차 간세포에서 8-CPT/Dex-유도성 글루코스 생산을 8-CPT/Dex 처리 그룹에 비하여 유의미하게 억제하였을 뿐만 아니라, 상기 시험 용량에서의 화합물 CDE 또는 인슐린 단독 보다 해당 과정에서 더많은 유효성을 나타내었다 (도 10A). 예를 들면, 150 ppb의 화합물 CDE 및 10 nM 인슐린의 조합으로 처리한 후에 간세포에서의 8-CPT/Dex-유도성 글루코스 생산의 저하 정도는 150 ppb의 화합물 CDE 또는 10 nM 인슐린 단독 보다 더욱 뚜렷하였다. 더욱 분명하게, 비록 300 ppb의 화합물 CDE 또는 100 nM 인슐린을 단독으로 사용하면 8-CPT/Dex-유도성 글루코스 생산의 억제에 매우 효과적이지만 (도 10A), 300 ppb의 화합물 CDE 및 100 nM 인슐린으로 처리하면 글루코스 생산은 간세포에서 더욱 저하되었다 (대조군-시험된 세포 그룹의 수준 이하로 저하). 10 nM 인슐린 및 150 ppb 또는 300 ppb의 화합물 CDE의 조합 및 100 nM 인슐린 및 150 ppb의 화합물 CDE의 조합은 8-CPT/Dex-유도성 글루코스 생산을 거의 완전히 억제하였다 (8-CPT/Dex 처리 없는 대조군 세포의 수준에 근접하는 저하). 상기 결과는 화합물 CDE가 인슐린 작용을 대체하거나 향상시키는 어느 하나에 의해 마우스 일차 간세포에서 8-CPT/Dex-유도성 글루코스 생산을 억제할 수 있음을 입증한다.
앞서 기술된 바처럼, 화합물 CDE 조합은 AML-12 세포에서 인슐린을 모방하여 8-CPT/Dex-유도성 G6pc 발현을 억제하고 해당 과정에서 인슐린 작용을 향상시킬 수 있는 것으로 나타났다 (도 4). G6pc 발현의 억제는 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산의 억제로 이끌 수 있었다. 따라서, 마우스 간세포를 24시간 동안 10% FBS DMEM/F12 배지에서 대조군(물) 또는 150 또는 300 ppb 화합물 CDE 조합으로써 전처리하고, 이어서 6시간 동안 혈청-무함유 배지에서 10 또는 100 nM 인슐린, 0.1 mM 8-CPT 및 0.5 μM Dex의 존재 또는 부재 하에 상기 셀레늄 화합물로 재처리하였다. 상기 처리 후에, 세포들을 수집하여 G6pc 발현의 QRT-PCR 분석에 적용하였다.
도 10B에 나타낸 바와 같이, 8-CPT/Dex는 G6pc mRNA의 발현에 중대한 증가 (약 130배 증가)를 초래하였다. 상기 데이터는 간세포가 올바르게 기능하고 있음을 더욱 확인해준다. 인슐린으로써의 처리는 두 가지 용량 모두에서 마우스 일차 간세포의 8-CPT/Dex-유도성 G6pc 발현을 8-CPT/Dex 그룹에 비하여 (도 10B의 막대 그래프에서 8-CPT/Dex 그룹과 비교할 때) 유의미하게 감소시켰다. 상기 글루코스 연구와 유사하게, 화합물 CDE 처리는 150 ppb의 용량에서 간세포에서 8-CPT/Dex-자극된 G6pc를 비록 유의미하지 않지만 억제하는 경향을 보여주었다 (도 10B). 그러나, 화합물 CDE는 300 ppb 용량에서 8-CPT/Dex-유도성 G6pc mRNA 발현을 유의미하게 억제하였지만, 이것은 시험 용량의 인슐린 만큼 효력이 있지 않았다 (도 10B). 이들 결과는 화합물 CDE가 AML-12 세포에서 얻어진 결과 (도 4)와 유사하게 인슐린-비의존성 방식으로 8-CPT/Dex-유도성 G6pc 발현을 억제할 수 있음을 명확하게 입증한다.
10 nM 또는 100 nM 인슐린과 조합하여 300 ppb의 화합물 CDE로 처리하면 10 nM 또는 100 nM 인슐린 또는 300 ppb 화합물 CDE 처리에 비해 간세포에서 8-CPT/Dex-자극된 G6pc 발현을 더욱 유의미하게 억제하였다. 이들 결과는 도 10B에서 막대 그래프의 a' 대 b' 또는 a" 대 b"에 의해 나타내어진다. 이들 결과는 인슐린과 300 ppb의 화합물 CDE의 조합이 8-CPT/Dex에 의한 증가된 G6pc 발현을 억제하는데 훨씬 더 효과적임을 나타낸다.
이들 연구는 화합물 CDE가 특히 300 ppb의 용량에서 인슐린을 모방하여 비록 인슐린에 비해서는 덜 효과적이지만 8-CPT/Dex-유도성 G6pc 발현을 억제하고, 마우스 일차 간세포 중의 해당 과정에서 인슐린 작용을 향상시킬 수 있음을 입증한다. 이들 결과는 AML-12 세포에서 관찰된 발견과 부분적으로 일치한다 (도 4). G6pc는 글루코스 생산을 위해 요구되기 때문에, 화합물 CDE에 의한 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산의 상기 관찰된 억제 (도 10A)는 적어도 부분적으로는 마우스 일차 간세포에서 G6pc 발현의 하향조절에 기인한다 (도 10B).
상기 처리된 간세포의 배양 배지 중의 LDH 수준을 검사하여, 화합물 CDE가 8-CPT/Dex의 존재 하에 배양된 일차 간세포에 독성인지의 여부와 화합물 CDE에 의한 글루코스 생산 및 G6pc 발현에서 관찰되는 상기 저하 (도 10A-B)가 간세포에서 화합물 CDE의 (배지에서 상승된 LDH 수준으로 나타나는) 잠재적 독성으로 인한 것인지의 여부를 더욱 조사하였다.
도 10C에 나타낸 바와 같이, 8-CPT/Dex의 처리는 인슐린의 부재 또는 존재의 어느 하나에서 비히클 대조군에 비하여 LDH 수준을 약간 증강시켰다. 그러나, 인슐린의 부재 또는 존재 하에 시험 용량 둘 모두의 화합물 CDE와 함께 8-CPT/Dex로 처리한 후의 간세포 중의 LDH 수준에서는 유의미한 증가는 없었다 (도 10C 참조). 또한, 8-CPT/Dex 및 인슐린으로 처리 후에 간세포에서 약간 증가된 LDH 수준은 두가지 시험 둘 모두에서의 화합물 CDE로써 병용 처리하여도 관찰되지 않았다 (도 10C).
이들 결과는 화합물 CDE가 8-CPT/Dex의 존재 하에 배양된 일차 간세포에 독성이지 않음을 더욱 나타낸다. 또한, 상기 결과는 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산 및 G6pc 발현에서 관찰되는 상기 감소 (도 10A 및 10B)가 화합물 CDE 처리 후의 마우스 일차 간세포에서 덜 건강한 간세포에 의해 초래될 가능성을 배제한다.
요약하면, 상기 연구는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여, 심지어 당뇨병 조건 (8-CPT/Dex에 의해 자극됨)에 유사한 조건 하에서도 마우스 일차 간세포에 어떠한 독성 없이 글루코스 생산 및 G6pc 발현을 억제하고 해당 과정들에서 인슐린 작용을 향상시킬 수 있음을 입증한다.
(상기 기술된) 화합물 CDE에 의한 글루코스 생산의 억제는 혈청-함유 배지에서 본 발명의 화합물로 전처리된 마우스 일차 간세포로 특징된다. 화합물 CDE가 인슐린-비의존성 및 성장인자-비의존성 방식으로 인슐린을 모방할 수 있음을 더욱 확인하기 위하여, 혈청-완전 무함유 배양 조건을 사용하여 FBS 중의 임의의 잠재적 미량 인슐린 또는 다른 성장인자를 제거하였다. 혈청-무함유 조건하에 배양된 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산에 대한 화합물 CDE의 효과 뿐만 아니라 그의 잠재적 독성 효과 (즉 배양 배지LDH 수준)을 검사하였다.
간략히, 마우스 일차 간세포를 하룻밤 혈청-결핍시켰다. 그 후, 세포들을 짧은 시간 (즉, 6시간) 동안 완전 혈청-무함유 배지에서 인슐린, 8-CPT 및 Dex의 존재 또는 부재하에 대조군(물) 또는 150 또는 300 ppb의 화합물 CDE로 처리하였다. 그 후, 배지를 수집하여 글루코스 및 LDH 분석에 적용하였으며, 배양된 세포는 글루코스 생산 및 LDH 수준의 표준화를 위해 단백질 분석에 적용하였다. 데이터는 3개의 시료의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 도 11A에서, # P<0.05는 기저 대조군 그룹 (그래프에서 첫째 막대)에 대비된 것이고, * P<0.05는 8-CPT/Dex 처리 그룹 (그래프에서 첫째 검은색 막대)에 대비된 것이다.
8-CPT/Dex의 병행 처리가 없는 마우스 간세포에서 글루코스 생산에 대한 화합물 CDE의 효과를 조사하였다 (도 11). 도 11A에 나타낸 바와 같이, 두가지 용량의 인슐린의 단독 처리는 마우스 일차 간세포에서 약 40-47% 저하만큼 글루코스 생산을 유의미하게 억제하였다. 상기 결과는 상기 배치의 마우스 일차 간세포가 생물학적으로 기능되고 있음을 가르킨다.
더욱 중요하게는, 150 ppb에서 화합물 CDE의 처리는 100 nM 인슐린만큼 효과적으로 마우스 일차 간세포글루코스 생산에서 유의미한 저하를 초래하였으며, 반면 300 ppb에서 화합물 CDE는 글루코스 생산의 억제에 100 nM 인슐린보다 훨신 더 효과적이었다 (도 11A). 화합물 CDE 및 인슐린 둘 모두의 병행 처리는 글루코스 생산을 또한 유의미하게 억제하였지만, 이들 일차 간세포에서 인슐린 및 화합물 CDE 사이의 어떠한 부가적 또는 상승적 작용은 없었다. 이들 결과들은 FBS-함유 배지에서 화합물 CDE로 전처리된 간세포로부터 얻어진 결과와 일치하였다 (도 9A). 종합하면, 이들 결과는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여, 100 nM의 농도의 인슐린보다 효과적으로 또는 훨씬 더 효과적으로, 글루코스 생산을 인슐린- 및 성장인자-비의존성 방식으로 억제할 수 있음을 명확하게 입증한다. 화합물 CDE는, 인슐린과 유사하게, 비교적 짧은 처리 기간 (즉 6시간) 후에 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산을 억제하는데 효과적인 것으로 또한 결론내릴 수 있다.
8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산이 혈청-무함유 배양 조건 하에 마우스 간세포에서 억제되는지의 여부를 알아보기 위해 화합물 CDE를 또한 시험하였다. 도 11A에 나타낸 바와 같이, 8-CPT/Dex의 처리는 기저 대조군 그룹 (비히클 처리)에 비하여 글루코스 생산에서 유의미한 증가를 초래하였으며, 상기 배치의 마우스 일차 간세포는 생물학적으로 기능하고 있음을 추가로 나타낸다. 비록 100 nM 인슐린의 처리 후에는 간세포 중의 글루코스 생산이 저하된다는 경향만이 있었지만, 10nM 인슐린의 처리는 글루코스 생산을 유의미하게 억제하였다. 앞의 것은 작은 갯수 (n=3)의 시험 시료로 인한 것일 수 있는데, 한 시료에서 글루코스 생산이 동일한 그룹의 다른 두 개의 시료에 비해 상당히 컸었다 (데이터 미제시).
더욱 중요하게는, 150 ppb에서 화합물 CDE의 처리는 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산을 억제하는 경향을 보여주었으며, 반면 화합물 CDE는 농도 300 ppb에서 인슐린-비의존성 또는 다른 성장인자-비의존성 방식으로 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산을 유의미하게 억제하기에는 10 nM에서의 인슐린만큼 효과적이었다 (도 11A). 화합물 CDE는 농도 300 ppb에서 8-CPT/Dex의 자극성 효과를 거의 완전히 폐지하는 것을 유의해야 하는데, 이는 상기 처리 그룹에서 글루코스 수준이 8-CPT/Dex 자극이 없는 기저 대조군 그룹에 필적할 수 있기 때문이다.
유사하게, 화합물 CDE 및 인슐린의 병행 처리는 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산을 유의미하게 억제하였다 (도 11A). 또한, 150 ppb 화합물 CDE 및 100 nM 인슐린의 조합에 의해서는 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산에서 150 ppb 화합물 CDE 또는 100 nM 인슐린 단독보다 더욱 현저한 저하가 있었다. 상기 결과는 해당 과정에서 화합물 CDE 및 인슐린 사이에 부가적인 작용이 존재한다는 것을 나타낸다 (도 11A).
상기 혈청-무함유 배양 마우스 일차 간세포에서 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산을 억제하는 화합물 CDE의 효과는 혈청-함유 배지에서 화합물 CDE로 전처리된 간세포에서 관찰되는 발견과 일치한다 (도 10A). 간세포는 혈청-완전 무함유 조건에서 혈청-결핍되고 화합물 CDE로 처리되었기 때문에, 상기 데이터는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여, 100 nM 인슐린만큼 적어도 효과적으로, 인슐린- 및 성장인자-비의존성 방식으로 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산을 억제할 수 있음을 명료하게 입증한다. 본원에서 기술된 화합물들은 급속히 활동하여 비교적 매우 짧은 처리시간 후에, 인슐린 작용과 유사하게, 혈청-무함유 배양 마우스 일차 간세포 중의 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산을 억제한다고 또한 결론내릴 수 있다. 혈청-무함유 배양 마우스 일차 간세포에서 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산의 억제에 대해, 화합물 CDE 및 인슐린 사이에, 적어도 150 ppb 화합물 CDE 및 100 nM 인슐린 용량 사이에 부가적 또는 상승 작용이 또한 존재한다 (도 11A).
마지막으로, 화합물 CDE는 혈청-무함유 조건에서 배양된 마우스 일차 간세포에 대해 임의의 독성을 결정하기 위해 시험하였다. 상기 처리 후에 마우스 일차 간세포에서 배양 매질 중의 LDH 수준을 검사한 다음 그들의 단백질 수준으로 표준화하였다. 도 11B에 나타낸 바와 같이, 물 비히클-처리된 그룹을 함유하는 기저 대조군 그룹 (즉, 도 11B에서 첫째 막대)과 비교할 때, 상기 모든 처리 후의 간세포 중의 LDH 수준에는 어떠한 유의미한 증가도 없었다. 상기 결과는 화합물 CDE에 노출 후에 간세포 중의 세포 손상 또는 세포막 누출이 없었음을 나타내었다. 대신, LDH 수준의 유의미한 저하가 300 ppb 고용량의 화합물 CDE의 처리 후에 간세포에서 관찰되었다 (도 11B). 따라서, 상기 결과는 화합물 CDE가 일차 간세포에 독성이지 않으며, 대신 더높은 용량에서 이들 세포에서 세포막 누출에 대한 어떤 보호효과를 가질 수도 있음을 제안한다. 또한, 상기 결과는 기저 및 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산에서 관찰되는 상기 억제(도 11A)가 화합물 CDE 처리 후의 마우스 일차 간세포 중의 덜 건강한 간세포에 의해 초래된다는 가능성을 배제한다.
결론적으로, 혈청-무함유 배양 마우스 일차 간세포에 대한 상기 연구를 통해, 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여 FBS-비의존성으로, 더욱 구체적으로는 인슐린- 및 성장인자-비의존성 방식으로 기저 및 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산을 둘 모두 억제할 수 있음이 입증된다. 또한, 상기 결과는 화합물 CDE가 간세포에 대한 독성을 갖지 않음을 추가로 제안한다.
화합물 CDE : 마우스 일차 간세포에서 Foxo1/3/4 인산화를 증강시키기 위한 PI3K/Pdk1/Akt 신호전달의 인슐린-비의존성 활성화
AML-12 세포에 관한 앞서의 우리 연구는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여 Foxo3 및 Foxo4 인산화를 증강시키고, 글루코스 생산용 G6pc 발현의 억제로 결과될 수 있다는 것을 제안한다 (도 6-7). 인슐린은 간세포에서 빨리 작용하여 불활성 Foxo1, Foxo3, 및 Foxo4 전사 인자로의 PI3k/Pdk1/Akt 신호전달을 활성화하고, 이것은 글루코스 생산을 신속하게 저하시킨다고 잘 입증되어 있다.
화합물 CDE가 인슐린을 모방하지만 인슐린-비의존성 방식으로 작용하여 Pdk1/Akt 신호전달을 활성화시키고, 계속해서 글루코스 생산의 억제를 위한 FOXO 인산화를 증강시키는 지의 여부를 더욱 조사하기 위하여, 글루코스신합성을 위한 핵심인 이들 신호전달 분자들의 인산화 상태를 두개의 상이한 배양/처리 조건 하에 마우스 일차 간세포에서 조사하였다.
화합물 CDE는 24시간 동안 혈청-함유 배지에서 이어서 6시간 동안 혈청-무함유 배지에서 화합물 CDE로 전처리된 마우스 일차 간세포Foxo1/3/4 인산화를 표적화한다
화합물 CDE 조합이 인슐린을 모방하여 PI3k/Pdk1/Akt/Foxo1/3/4 신호전달을 조절할 수 있는지를 결정하기 위해서, 마우스 일차 간세포를 24시간 동안 혈청-함유 DMEM/F12 배지에서 대조군(물) 또는 150 ppb 및 300 ppb 용량의 셀레늄 화합물 CDE로 전처리하였다. 상기 처리에 이어서, 상기 셀레늄 화합물 CDE을 150 ppb 및 300 ppb의 용량으로 사용하여 6시간 동안 재처리하였다. 대조군-전처리된 간세포를 또한 6시간 동안 100 nM 인슐린과 함께 인큐베이션하였다. 이들 처리 후에, 도 9에 상세히 나타낸 바처럼 글루코스 및 LDH 분석을 위해 배양 배지를 수집하였다. 세포들은 수집하고 단백질 분석을 행하여 다양한 PI3k/Pdk1/Akt/Foxo1/3/4 신호전달 분자들의 웨스턴 블롯 분석을 위해 총 단백질 수준을 결정하였다. 이들 신호전달 분자들의 단백질 발현 수준은 Actb 단백질 수준으로 표준화하였으며 도 12B-F에서 3개 시료의 평균±표준편차(SEM)로 나타낸다. 도 12B-F에서 막대 그래프에서 상이한 문자들은 이들 두 그룹 사이의 유의미한 차이 (P<0.05)가 있음을 의미한다.
도 12A에 나타낸 바와 같이, 인슐린 처리는 세린 잔기 473에서의 Akt, 트레오닌 24에서의 Foxo1 (pFoxo1T24), 트레오닌 32에서의 Foxo3 (pFoxo3T32)의 인산화된 형태의 유의미한 증가를 초래하였지만, 세린 9에서의 Gsk3b (pGsk3bS9)는 아니었으며, 이동안 인슐린 처리 후의 이들 세포에서 트레오닌 28에서 인산화된 Foxo4 (pFoxo4T28)의 수준은 거의 검출되지 않았다. 상기 결과는 인슐린이 PI3k/Pdk1/Akt 신호전달을 조절하여, 상술한 실험 조건 하에 이들 간세포에서 Foxo1 및 Foxo3를 비활성화시킬 수 있는 것을 제안한다. 더욱 중요하게도, pGsk3bS9이 아니라 pPdk1, pAktS473, pFoxo1T24 및 pFoxo3T32의 단백질 수준이 두가지 용량의 화합물 CDE의 처리 후에 이들 간세포에서 가시적으로 상승되었다 (도 12A). 또한, pFoxo4T28 수준은 300 ppb에서의 화합물 CDE의 처리 후에 간세포에서 확고하게 증가되었다 (도 12A).
정량분석은 화합물 CDE-처리된 마우스 일차 간세포에서, pPdk1의 대략 1.5-배 증가, pAktS473의 2.2-3배 증가, pFoxo1T24의 3-4배 증가가 있지만 pGsk3bS9는 증가가 없음을 보여주었다 (도 12-F). 비록 pPdk1 및 pAkt 증강은 6시간 동안의 화합물 CDE 처리된 AML-12 세포에서 관찰되지 않았지만 (도 6-7), 마우스 일차 간세포에서 화합물 CDE에 의한 pFoxo3T32 및 pFoxo4T28의 발현 증가는 AML-12 세포에서 우리가 앞서 관찰한 것과 일치하였다 (도 6-7).
인슐린 및 시험 용량 둘 모두에서의 화합물 CDE에 의해 초래된 상기 간세포에서 증강된 pPdk1 및 pAkt 단백질 수준은 화합물 CDE가 인슐린처럼 Pdk1/Akt 신호전달을 활성화시킬 수 있음을 나타낸다. 비록 화합물 CDE에 의한 pAkt/Foxo1/3 인산화의 증가 정도는 100 nM 인슐린만큼 강하지는 않았지만, 화합물 CDE는 시험 용량 둘 다에서 100 nM 인슐린만큼 효과적으로 동일한 실험 조건 하에 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산을 억제하였다 (도 9A). 따라서, 화합물 CDE에 의해 대략 3.4배 증가된 pFoxo1T24 및 pFoxo3T32 (도 12D-E)는 Foxo1 및 Foxo3을 불활성화시키기에 충분하여, 상기 마우스 일차 간세포에서 G6pc 발현 및 글루코스 생산을 억제하도록 유도하는 것으로 보여진다. 우리의 결과는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여, 상기 기술된 배양 및 처리 조건 하에 마우스 일차 간세포에서 PI3k/Pdk1/Akt 신호전달을 활성화하여 Foxo1/3/4 인산화를 증강시킬 수 있음을 입증한다.
화합물 CDE는 신속히 작용하여 혈청-무함유 조건 하에 마우스 일차 간세포에서 Pdk1/Akt 신호전달을 순차적으로 활성화시키고 Foxo1/3 인산화를 표적화함
화합물 CDE 조합이 인슐린을 모방하여 PI3k 신호전달을 활성화하여 Foxo1/3 인산화를 증강시키는지의 여부를 더욱 조사하기 위해서, 혈청-무함유 조건하에 마우스 일차 간세포에서 이들 신호전달 분자들의 시간경과 발현 연구를 수행하였다. 간략히, 마우스 일차 간세포를 하룻밤 혈청-결핍시킨 후에, 0분, 5분, 30분, 1시간, 2시간 및 3시간 동안 혈청-무함유 DMEM/F12 배지에서 300 ppb 용량의 셀레늄 화합물 CDE과 함께 인큐베이션하였다. 처리 후에, 간세포를 수집하고 웨스턴 블롯을 행하였다.
도 13A-B에 나타낸 바와 같이, 인산화된 Pdk1 수준은 화합물 CDE로 처리 후의 5분에서 상기 혈청-무함유 배양 간세포에서 증가하는 경향이 있다. 화합물 CDE 처리 30분 후에, 상기 간세포 내의 Pdk1 수준에는 확고하고 유의미한 증가가 있었다 (도 13A-B). 상기 결과는 화합물 CDE가 간세포 내의 PI3k/Pdk1 신호전달을 신속히 활성화하는 것을 제안한다. Pdk1의 활성화에 계속하여, 화합물 CDE 처리 30분에 간세포에서 pAktT308 수준이 증가하는 경향이 있으며, 더욱 중요하게는, 화합물 CDE 처리 1시간 후에 pAktT308가 확고하고 유의미하게 증가하였다 (도 13A,C). 상기 결과는 화합물 CDE가 Akt를 순차적으로 활성화시킬 수 있다는 것을 제안한다.
활성화된 PI3k/Pdk1/Akt 신호전달의 하류 표적인 pFoxo1T24 및 pFoxo3T32 둘 모두의 수준은 인큐베이션 30분 이전의 간세포에서 화합물 CDE에 의해 영향을 받지 않는다 (도 13A, D). 화합물 CDE의 처리 1시간째에, 간세포에서 Foxo1 및 Foxo3의 인산화가 증가하는 하는 경향이 있었다 (도 13D). 처리 2 및 3시간째에, 화합물 CDE는 혈청-무함유 조건하에 배양된 마우스 일차 간세포에서 Foxo1 및 Foxo3 둘 모두의 인산화를 유의미하게 증강시켰다 (도 13A, D). 따라서, 상기 간세포에서 Pdk1 및 Akt의 순차적 활성화 및 이어서 화합물 CDE에 의한 증강된 Foxo1 및 Foxo3 인산화가 존재하며, 이들 사건들은 인슐린 작용에 매우 유사한 양식으로 화합물 CDE의 처리 후 2시간 보다 작게 발생한다. 평범한 DMEM/F12 배지에는 어떠한 인슐린 또는 성장인자도 없고 어떠한 FBS도 상기 실험의 배양 배지에 첨가되지 않았다는 것을 고려하면, 상기 간세포에서 화합물 CDE에 의한 Pdk1, Akt, Foxo1 및 Foxo3의 인산화의 증강은 FBS, 성장인자 또는 인슐린에 비의존성이다. 다시 말하면, 화합물 CDE는 인슐린 또는 성장인자 작용을 우회하여 PI3k/Pdk1/Akt 신호전달을 신속히 활성화시키고, 순차적으로 마우스 일차 간세포Foxo1 및 Foxo3 (증강된 Foxol/3 인산화)를 비활성화시킬 수 있다.
요약
우리의 연구는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여, 간세포에 독성이지 않고 인슐린-비의존성으로 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산을 억제할 수 있음을 입증한다. 상기 발견은 3가지 상이한 조건 하에 배양된 마우스 일차 간세포에서의 연구로부터 분명하게 확립되었다. 첫째, 글루코스 생산은 24시간 동안 혈청-함유 배지에서 화합물 CDE로써 전처리한 다음 6시간 동안 혈청-무함유 배지에서 상기 화합물로 재처리함으로써 현저하게 저하될 수 있고, 그 효과는 100 nM 용량의 인슐린에 필적하는 것으로 또한 밝혀졌다 (도 9A). 다음으로, 글루코스 생산은, 24시간 동안 혈청-함유 배지에서 화합물 CDE로써 전처리하고 이어서 6시간 동안 8-CPT/Dex (당뇨병 조건을 모방하기 위한 글루코스 생산의 자극물)의 존재 하에 혈청-무함유 배지에서 상기 화합물로 재처리함으로써 마우스 일차 간세포에서 유의미하게 억제되는 것으로 밝혀졌으며, 해당 과정에서 300 ppb의 화합물 CDE의 효과는 100 nM 농도의 인슐린에 필적하였다 (도 10A). 마지막으로, 혈청-무함유 배양 기법을 채택하여 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여, 짧은 처리 시간 (6시간 처리) 후에 FBS-비의존성 또는 더욱 상세하게는 인슐린- 및 성장인자-비의존성 방식으로, 기저 및 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산을 둘 모두 억제할 수 있는 것을 입증하였다. (도 11A). 또한, 글루코스 생산 억제에 있어서 화합물 CDE의 효과는 적어도 10 nM 용량의 인슐린에 필적하였다 (도 11A). 또한, 화합물 CDE로써의 처리 후에 배양 배지에서는 어떠한 유의미한 LDH 증가도 없기 때문에, 화합물 CDE를 사용한 처리는 상기 기술된 3가지 상이한 조건들 하에 배양된 마우스 일차 간세포의 건강에 독성 효과 (예를 들면, 세포막 누출을 유발함)를 갖지 않았다 (도 9C, 10C, 11B).
상기 연구에서 관찰된 감소된 글루코스 생산은 마우스 일차 간세포에서 화합물 CDE에 의한 G6pc 발현의 억제에 적어도 일부가 기인한다. 300 ppb의 화합물 CDE는 간세포G6pc mRNA 수준의 유의미한 저하 (42% 저하)를 초래하지만, 반면 G6pc 발현이 저하하는 경향 (비록 통계적으로 유의미하지 않지만, 약 31% 저하)이 150 ppb의 화합물 CDE로써의 처리 후에 간세포에서 또한 관찰되었던 것으로 밝혀졌다 (도 9B). 유사한 결과들이 8-CPT/Dex로 자극된 마우스 일차 간세포에서 또한 얻어졌다 (도 10B). 따라서, 상기 결과는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여 인슐린-비의존성 방식으로 8-CPT/Dex의 존재에서도 마우스 일차 간세포 중의 G6pc 발현을 억제할 수 있음을 명백하게 입증한다. 이들 결과는 AML-12 세포에서 관찰된 발견들과 일치한다 (도 3-4).
더높은 시험 용량의 화합물 CDE에 의한 G6pc 발현의 감소 정도는 상기 기술된 2개의 배양 조건 (즉, 8-CPT/Dex의 병용처리 유무) 하에 마우스 일차 간세포에서 인슐린 (10nM)보다 더 작은 것을 유의해야 하는데, 반면 화합물 CDE는 간세포에서 기저 및 8-CPT/Dex-자극된 글루코스 생산을 억제하는데 적어도 10 nM 용량의 인슐린만큼 효과적이었다 (도 9A, 10A, 11B). 따라서, G6pc 이외에, 화합물 CDE는 다른 분자들을 조절하여 배양된 마우스 간세포 중의 글루코스 수준을 저하시킬 수 있다는 것이 가능하다. 그에 개의치 않고, 우리의 결과는 마우스 일차 간세포에서 화합물 CDE에 의한 글루코스 생산의 억제는 적어도 부분적으로 G6pc 발현의 억제에 기인하는 것을 제안한다.
또한, 상기 결과들은 화합물 CDE가 인슐린 작용을 향상시키거나 증대시켜 시뮬레이션된 당뇨병 조건 (8-CPT/Dex 사용) 하에 마우스 일차 간세포 내의 글루코스 생산 및 G6pc 발현을 억제할 수 있다는 것을 입증하였다 (도 10A-B, 11A). 이들은 하기 관찰에 의해 지지되었다:
(1) 150 ppb 화합물 CDE 및 10 nM 인슐린의 조합은 150 ppb 화합물 CDE 또는 10 nM 인슐린 단독 보다 간세포 내의 8-CPT/Dex-유도성 글루코스 생산을 더욱 뚜렷하게 저하시킴 (도 10A);
(2) 300 ppb 화합물 CDE 및 100 nM 인슐린의 조합은 300 ppb 화합물 CDE 또는 100 nM 인슐린 단독 보다 간세포 내의 8-CPT/Dex-유도성 글루코스 생산을 추가로 저하시킴 (도 10A);
(3) 150 ppb 화합물 CDE 및 100 nM 인슐린의 조합은 150 ppb 화합물 CDE 또는 100 nM 인슐린 단독 보다 혈청-무함유 조건에서 간세포 내의 8-CPT/Dex-자극성 글루코스 생산을 더욱 뚜렷하게 저하시킴 (도 11A); 및
(4) 300 ppb 화합물 CDE 및 인슐린 (10 nM 및 100 nM)의 조합은 300 ppb 화합물 CDE 또는 10 또는 100 nM 인슐린 단독 보다 간세포 내의 8-CPT/Dex-유도성 G6pc 발현을 더욱 뚜렷하게 저하시킴 (도 10B).
8-CPT/Dex-유도성 G6pc 발현은 화합물 CDE 또는 인슐린 단독보다 화합물 CDE 및 인슐린의 조합에 의해서 더욱 뚜렷하게 억제되는 것이 AML-12 세포에서 관찰되었다 (도 4). 종합하면, 우리의 결과는 화합물 CDE가 인슐린 작용을 향상시켜 마우스 일차 간세포에서 8-CPT/Dex-유도성 글루코스 생산 및 G6pc 발현을 억제할 수 있음을 입증한다.
추가로, 신호전달 분자의 분석은 화합물 CDE가 인슐린을 모방하여 PI3K/Pdk1/Akt 신호전달을 재빨리 활성화하고 마우스 일차 간세포에서 Foxo1, 3 및 4의 인산화를 증강시킬 수 있음을 입증한다. 24시간 동안 혈청-함유 배지에서 화합물 CDE로써 전처리하고 이어서 6시간 혈청-무함유 배지에서 상기 화합물로 재처리하거나 (도 12), 또는 5 내지 180분 동안의 짧은 시간 동안 완전 혈청-무함유 조건에서 상기 화합물로 처리한 (도 13) 마우스 간세포에서, 상기 분자들의 인산화된 단백질을 웨스턴 블롯 분석하여 상기 결론을 뒷받침한다.
AML-12 세포에서, 비록 Pdk1 및 Akt의 증가된 인산화가 시험 기간 (화합물 CDE 처리후 6시간)에서 관찰되지 않았지만, 화합물 CDE는 Foxo3/4를 표적하여 그들의 인산화를 증강시킬 수 있음이 또한 밝혀졌다 (도 6-7). 앞의 결과는 더빠른 시점 (6시간 이전)에 발생할 수도 있는 화합물 CDE에 의한 Pdk1/AKT의 잠재적인 일시적 활성화로 인한 것일 수 있다.
그에 개의치 않고, 마우스 일차 간세포에서의 연구는 화합물 CDE는 인슐린 또는 임의의 성장인자를 우회하여 PI3k/Pdk1/Akt 신호전달을 신속히 활성화시키고, 계속해서 Foxo1/3/4 인산화를 증강시키는 것을 명백하게 입증한다. FOXO 단백질, 특히 Foxo1은 간에서 G6pc 발현 및 글루코스 생산의 조절을 위해 중요하기 때문에, 마우스 일차 간세포에서 상기 관찰된 화합물 CDE에 의한 글루코스 생산 및 G6pc 발현의 억제는, Pdk1/Akt 신호전달의 인슐린-비의존성 활성화 및 이후에 증강된 Foxo1/3/4 인산화를 초래하는, Foxo1/3/4의 불활성화에 의해 원인이 되었을 가능성이 높다. 또한, 상기 과정에서 인슐린 작용의 향상은 화합물 CDE 및 인슐린에 의한 Foxo1/3/4 인산화의 추가적인 증강 효과로 인한 것일 수 있다.
요컨대, 본 발명자들은 글루코스 생산을 위한 당뇨병성 자극물의 존재 하에서도 간세포에 독성이지 않으면서 인슐린 작용을 우회하여 마우스 일차 간세포에서 글루코스 생산 및 G6pc 발현을 억제할 수 있는 셀레늄 화합물 조합을 밝혀냈다. 또한, 상기 화합물 조합인 화합물 CDE는 인슐린 작용을 향상시켜 마우스 일차 간세포에서 당뇨병 자극물-유도성 글루코스 생산 및 G6pc 발현을 더욱 억제할 수 있다. 더욱이, 상기 화합물 조합은 인슐린을 모방하지만 우회하여 PI3k/Pdk1/Akt 신호전달을 신속히 활성화하고, 연속적으로, 간세포 oxo1/3/4 인산화를 증강시킬 수 있다. 따라서, 상기 화합물 조합은 잠재적 인슐린-대체 약물로서 뿐만 아니라 인슐린-강화 약물으로서 I형 및 II형 당뇨병의 치료를 위해 사용될 수 있다. 화합물 CDE 조합은 인슐린을 우회시켜 간의 해당 과정들에서 Foxo1/3/4의 인슐린-비의존성 불활성화, FOXO-매개된 G6pc 발현 및/또는 인슐린 작용의 향상을 통해 간성 글루코스 산출을 감소시킴으로써 비만 치료에 유용할 수 있거나, 간세포가 인슐린-내성이 되는 것을 예방하기 위해 투여될 수 있다.
실시예 7: 인슐린-내성 및 당뇨병성 렙틴 수용체 ( Lepr ) 자연 널 (null) 돌연변이 마우스에서 화합물 CDE와의 조합 치료에 대한 반응으로 혈류 중의 글루코스 수준의 감소 및 향상된 글루코스 내성
물질 및 방법
화합물
화합물 C (5'-메틸셀레노아데노신), 화합물 D (Se-아데노실-L-호모시스테인) 및 화합물 E (감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인)은 알테크 (Alltech, Inc)의 화학 연구실에서 합성되었다. 모든 시험 화합물의 순도는 질량 분광분석법에 의해 결정되는 바와 같이, ≥ 99%인 것으로 확인되었다.
동물 및 처리
성인 이형접합형 당뇨병성 자연 돌연변이 (렙틴 수용체 돌연변이) Lepr db/+ 마우스 (C57BL/6J 종)를 잭슨 연구소 (Jackson Laboratory) (Bar Harbor, Maine)에서 구입한 후에, 이종교배하여 동형접합성 Lepr db/db 마우스 (마우스 유전형분석에 의해 결정됨)를 생성하였다. 마우스 꼬리 유전형분석을 이유 시점 (출생 21일째)에 잭슨연구소의 프로토콜에 따라서 수행하였다. 이들 생후 27일째의 Lepr db/db 마우스에 생리학적 식염수 (0.09% NaCl) 또는 화합물 CDE를 복강 내로 주입하였다. 화합물 CDE는 연령 3.5개월까지 매일 화합물 C, 화합물 D 및 화합물 E를 조합으로 포함하고 (주입 당 각 셀레늄 화합물 5 ppb와 동등한, 체중 kg 당 각 화합물의 셀레늄 5 μg)고, 그 후에 글루코스 분석 및 글루코스 내성 분석에 적용되었다. 상기 처리된 마우스의 체중은 저울을 사용하여 매주 기록하였고, 임의의 가시적인 비정상적 동물의 총체적 형태 및 보행 양상을 매일 모니터링하였다.
5주령 숫컷 Lepr db/db 마우스를 잭슨 연구소 (Jackson Laboratory)에서 추가로 구입하고 생리학적 식염수 (0.09% NaCl) 또는 화합물 CDE를 매일 복강 내로 주입하였다. 화합물 CDE는 멸균된 생리학적 식염수로 희석됨) 출생 38일째에 시작하여 28일 동안 화합물 C, 화합물 D 및 화합물 E를 조합(체중 kg 당 각 화합물의 셀레늄 5 μg)으로 포함한다. 이 실험은 급성 당뇨병 치료로서 이들 화합물의 잠재적 사용을 시험하기 위해 설계되었다 (> 35일령의 Lepr db/db 마우스는 고혈당증을 갖고 있거나 곧 발병하게 된다). 더 오랜 기간동안 주입된 더 어린 마우스들을 시험하는 것은 전-당뇨병성 또는 위험군에 속한 환자를 위한 예방적 제제로서 화합물을 더많이 평가하기 위한 의도이다. 또한, 상기 처리된 마우스의 체중은 저울을 사용하여 매주 기록하였고, 임의의 가시적인 비정상적 동물의 총제적 형태 및 보행 양상을 매일 모니터링하였다.
혈액 글루코스 분석
생리학적 식염수 또는 화합물 CDE의 마지막 주입 후에, 마우스를 밤새 금식시켰다. 그 후에 마우스 꼬리 팁을 절취함으로써 이들 마우스로부터 작은 혈액 방울을 채취하였으며, 혈액 글루코스 수준을 600 mg/L의 최대 글루코스 측정 성능을 갖는 혈당측정기 (Glucometer)를 사용하여 결정하였다.
글루코스 내성 시험 및 곡선하면적 (AUC)의 정량
글루코스 내성 시험은 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (Li et al, Int J Biol Sci 2008; 4:29-36). 간단히, 식염수 또는 화합물 CDE 처리 후 밤새-금식된 Lepr db/d 마우스에 2 g/kg 체중의 20% D-글루코스를 복강 내로 주입하였다. 시점 0 (글루코스 주입 직전), 0.25, 0.5, 1 및 2시간째에서의 혈액 글루코스 수준을 600 mg/L의 최대 글루코스 측정 성능을 갖는 혈당측정기를 사용하여 결정하였다. 이로 인해, 600 mg/L를 초과하는 혈액 글루코스 수준은 본 발명의 데이터 분석에서 600 mg/L으로 산정되었다. 상기 글루코스 시험 분석에서 각 마우스의 곡선하면적 (area under the curve, AUC)을 마이크로소프트 엑셀을 사용하여 계산하였다.
통계학적 분석
적용된다면, 식염수- 및 화합물 CDE-처리 그룹 사이의 차이의 통계학적 유의성을 결정하기 위하여 0.05 미만의 P 값을 사용하여 스튜던츠 t-검정을 수행하였다. 데이터는 도면에서 지정된 갯수의 평균±표준편차로 나타내었다.
결과 및 논의
Lepr db/db 마우스는 렙틴 수용체 유전자 (Lepr)의 모든 공지의 이소형이 결핍된다. 상기 동형접합형 마우스 모델은 손상된 글루코스 내성, 감소된 인슐린 감수성, 고혈당증 및 고인슐린혈증을 갖는 공격적인 II형 당뇨병 마우스 모델이다. 이들 마우스는 연령 3 내지 4주 정도에서 전반적 비만, 10 내지 14일째에 시작하는 혈장 인슐린의 상승 및 연령 4 내지 8주에 고혈당증 (즉, 높은 혈액 당 수준)을 나타낸다 (Coleman DL. 1978 Diabetologia 14: 141-8).
본원에 기술된 AML-12 세포 및 마우스 일차 간세포에 대한 연구는 화합물 CDE가 인슐린을 모방하지만 인슐린을 우회하여 간세포에서 Foxo1, Foxo3 및 Foxo4를 불활성화시킬 수 있음을 나타낸다. 또한, 화합물 CDE는 Foxo-매개된 G6pc 발현을 억제하여 이들 간세포에 독성이지 않으면서 글루코스 생산을 저하시킬 수 있다 (도 1-4, 6-7, 및 9-13). 또한, 이들 시험관내 연구는 화합물 CDE가 인슐린 작용을 향상시켜 시뮬레이션된 당뇨병성 조건하에 간세포에서 글루코스 생산 및 G6pc 발현을 저하시킬 수 있음을 보여준다 (도 4, 10-11). 따라서, Lepr db/db 마우스 모델은 잠재적으로 혈류에서 글루코스의 저하 및 당뇨병에 대한 인슐린 감수성 및 글루코스 내성의 향상에 있어 이러한 신규 화합물 조합의 용도를 조사하기 위한 이상적인 모델이다.
고혈당증의 발병 전후의 둘 모두에서 화합물 CDE의 투여 후에 Lepr db/db 마우스 중의 혈액 글루코스 수준의 감소
화합물 CDE의 두가지 투여법을 이용하여 Lepr db/bd 마우스에서 나타난 고혈당증의 예방 및 치료에서 화합물 CDE의 잠재적 역할을 조사하였다. 본원에 기술된 화합물들을 조사하여 Lepr db/bd 마우스에서 4 내지 8주 연령에 발병하는 고혈당증의 발병의 예방에 그들이 어떠한 효과를 가지고 있는지를 결정하였다. 마우스들을 고혈당증 발병 직전에 화합물 CDE를 복강내 투여함으로써 처리하였다.
요컨대, 연령 27일의 소아 Lepr db/db 마우스는 화합물 CDE (각 마우스에 주입 당 각 화합물 5 ppb에 등가인, 체중 kg 당 각 화합물의 셀레늄 5μg) 또는 생리학적 식염수로써 격일로 마우스가 연령 3.5개월에 도달할 때까지 복강내 주입되었다. 처리가 끝나면, 상기 마우스를 하룻밤 금식하고, 글루코스 분석에 적용하였다. 상기 처리된 마우스의 체중을 저울을 사용하여 격일로 기록하여 상기 처리 기간 동안 체중 획득량에 상기 화합물의 효과가 있는지를 시험하였다. 데이터는 도 14A에서 막대 그래프 아래에 지정된 마우스 숫자의 평균 ± 표준편차로서 나타낸다.
화합물 CDE에 의한 처리는 상기 돌연변이 마우스에서 체중 획득량에 영향을 미치지 않은 것으로 나타났으며 (데이터 미제시), 화합물 CDE가 Lepr db/db 마우스에서 나타난 식량 소모에 대해 비정상적으로 증가된 식욕에 대해서는 억제 효과를 거의 또는 전혀 갖지 않은 것으로 보인다는 것을 나타낸다. 또한, 상기 처리 기간 동안 염수-처리된 (대조군) 및 화합물 CDE-처리된 Lepr db/db 마우스 사이에 동물 전체 형태 및 보행 행태에는 어떠한 가시적 차이가 없었다. 상기 결과들은 화합물 CDE가 시험 용량에서 동물 행태 또는 활동성에 어떠한 영향도 없음을 나타낸다.
그러나, 비록 화합물 CDE-처리된 Lepr db/db 마우스 중의 혈액 글루코스 수준은 동등한 연령의 정상 야생형 마우스 보다 여전히 더높았지만 (약 100 mg/dL, 데이터 미제시), 화합물 CDE의 처리는 Lepr db/db 마우스의 혈류 중의 글루코스 수준을 대조군과 비교할 때 약 40% 감소시켜 유의미한 저하를 초래하였다 (도 14A). 비록 화합물 CDE는 시험 용량으로 Lepr db/db 마우스에서의 고혈당증의 발병을 완전히 예방하지는 않았지만, 상기 결과들은 화합물 CDE가 상기 심한 II형 당뇨병 마우스 모델의 혈류 중의 글루코스 수준을 유의미하게 저하시킬 수 있음을 명백하게 입증하는데, 고혈당증의 예방용으로 화합물 CDE의 잠재력을 나타낸다.
상기 당뇨병 Lepr db/db 마우스 중의 글루코스 산출을 저하시킴에 있어 화합물 CDE의 역할을 더욱 조사하기 위하여, 화합물 CDE를 Lepr db/db 마우스에서 고혈당증발병 후 또는 그 동안 복강내 주입하는 또 다른 투여 방식을 채택하여 상기 마우스 중의 혈액 글루코스 수준을 검사하였다. 요컨대, 연령 38일의 Lepr db/db 마우스에게 염수 또는 화합물 CDE (kg 체중 당 각 화합물의 셀레늄 5 μg)를 매일 28일 동안 복강내 주입하였다. 마우스 체중 및 임의의 비정상 형태 또는 보행행태를 매일 기록 및 모니터링하였다.
상기 처리 후에, 동물들을 하룻밤 금식시키고, 그런 후 혈액 글루코스 분석에 적용하였다. 상기 동물 연구에 유사하게, 화합물 CDE의 처리는 상기 처리 기간 동안 Lepr db/db 마우스에서 체중 획득량, 동물 전체 형태 및 보행 행태에 영향을 미치지 않았다 (데이터 미제시). 그렇지만, 화합물 CDE로써의 처리는 염수-처리된 마우스와 비교할 때 상기 Lepr db/db 마우스 중의 혈액 글루코스 수준의 유의미한 저하 (약 25% 감소)를 초래하였다 (도 14B). 이들 결과는 화합물 CDE가 상기 심한 II형 당뇨병 마우스 중의 글루코스 산출을 저하시킬 수 있음을 더욱 입증하는데, 고혈당증의 치료용으로 상기 화합물의 잠재력을 나타낸다.
요약하면, 이들 결과는 화합물 CDE가 Lepr db/db 마우스 중의 글루코스 산출을 상기 돌연변이 동물에서 고혈당증 발병 전후 둘 모두에 또는 그 동안 상기 화합물의 복강내 주입에 의해 저하시킬 수 있음을 입증한다.
또한, 상기 기술된 주입법으로 이들 화합물을 처리한 후에 Lepr db/db 마우스에서 형태학적 또는 보행거동에는 어떠한 가시적인 변화도 없었다. 사실, 정상 야생형 C57BL/6 마우스에서 동물 건강에 대한 화합물 CDE의 급성 효과를 검사하였지만, 고용량 (체중 kg 당 각 화합물의 셀레늄 500 μg, 데이터 미제시)의 화합물의 복강내 주입후 1주일 동안 비정상적인 전체 형태 및 보행 행태 이상이 관찰되는 경우는 발생하지 않았다. 따라서, 화합물 CDE는 상기 마우스에 독성 효과가 거의 또는 전혀 없다.
종합하면, 상기 결과들은 화합물 CDE가 공격적인 II형 당뇨병의 마우스 모델에서 혈액 글루코스 수준을 유의미하게 저하시킬 수 있음을 입증한다. 상기 결과는 화합물 CDE의 잠재력이 당뇨병 대상체에서 고혈당증의 예방 및 처리 둘 모두임을 나타낸다.
고혈당증 발병 전에 화합물 CDE의 투여 후 당뇨병성 Lepr db/db 마우스에서 증강된 글루코스 내성
글루코스 내성 테스트는 높고 신속한 혈당 상승 후에 (예를 들어, 보통 식사 후에) 신체가 글루코스를 다루는 방식에서의 이상을 동정하는 것이다. 인슐린은 간에서 글루코스 생산의 억제뿐만 아니라 근육, 간 및 지방세포에서 글루코스 섭취, 저장 및 대사에 결정적 역할을 하여, 혈류에서 더 낮은 글루코스 수준을 초래한다.
당뇨병 환자들은 글루코스 항상성을 유지하기 위해 효과적으로 인슐린을 생산하거나 인슐린에 반응할 수 없음으로 인해 매우 낮은 글루코스 내성을 갖고 있다. 본원에서 기술된 시험관내 연구들은 화합물 CDE가 인슐린을 모방할 뿐만 아니라 인슐린을 우회하고 인슐린 작용을 향상시켜 간세포에서 글루코스 생산, 및/또는 글루코스 생산을 위한 핵심 유전자인, G6pc의 발현을 억제할 수 있다 (도 2-4, 9-11). Lepr db/db 마우스는, 손상된 글루코스 내성 및 인슐린-내성이 상기 돌연변이 마우스에서 나타나는 것을 고려하면, 글루코스 항상성을 유지함에 있어서 화합물 CDE의 역할을 조사하기 위한 이상적인 마우스 II형 당뇨병 모델이다. 따라서, 연령 27일째부터 3.5개월까지 마우스 내로 화합물 CDE의 복강내 주입 후에 Lepr db/db 마우스에서 향상된 글루코스 내성에 대한 화합물 CDE의 효과를 조사하였다.
상기 기술된 연구와 유사하게, 연령 27일의 Lepr db/db 마우스는 생리학적 식염수 또는 화합물 CDE 조합 (각 마우스에 주입 당 각 화합물 5 ppb에 동등한, 체중 kg 당 각 화합물의 셀레늄 5μg)으로써 격일로 마우스가 연령 3.5개월에 도달할 때까지 복강내 주입되었다. 처리가 끝나면, 상기 마우스를 하룻밤 금식하고, 글루코스 (2 g/kg 체중)을 주입하고, 글루코스 주입후 0.25 시간 (15 분), 0.5 시간 (30 분), 1 시간 (60 분), 및 2 시간 (120 분)에 혈액 글루코스 수준을 측정하였다. 글루코스 주입 직전 (제로 시점으로 칭함)의 혈액 글루코스 수준을 또한 기록하였다. 평균 ± 표준편차. 도 15에서 *는 식염수-처리된 그룹과 동일 시점에 비교할 때 P 가 적어도 <0.05를 지칭함을 나타낸다.
도 15A에 나타난 바와 같이, 식염수-처리된 Lepr db/db 마우스에서 혈액 글루코스 수준에서 유의미한 증가가 글루코스 주입후 0.25 시간에 시작하여 이후 모든 시험 시점에서 관찰되었다. 상술한 바처럼, 상기 분석을 위해 이용된 혈당측정기의 글루코스 측정 한계는 600 mg/dL이었다. 상기 한계를 초과하는 글루코스 수준은 600 mg/dL로 기록되었다. 이것을 언급한 이유는 특히 염수-처리된 동물에 대한 측정은 실제 혈액 글루코스 농도보다 과소평과되어 잘 나타날 수 있다는 것을 지적하기 위해서이다.
화합물 CDE-처리된 Lepr db/db 마우스에 있어서, 혈액 글루코스 수준은 글루코스 주입 전에는 염수-처리된 마우스보다 유의미하게 더 낮았다. 염수-처리된 마우스에 유사하게, 6마리의 시험 화합물-처리된 마우스 중의 5마리가 글루코스 주입 후 0.5 시간 및 1시간에 600 mg/dL에 가깝거나 이보다 높은 혈액 글루코스 수준을 가졌다 (도 15A). 그렇지만, 화합물 CDE로 처리 후에 6마리의 시험 Lepr db/db 마우스 모두에서의 혈액 글루코스 수준은 글루코스 주입 후 2시간 째에 염수-처리된 동복체보다 유의미하게 낮았다 (도 15A).
도 15A에 나타난 상기 그래프의 곡선밑면적 (AUC)의 정량 분석을 통해, 염수-처리된 마우스와 비교할 때, 화합물 CDE-처리된 Lepr db/db 마우스에서 글루코스 주입 후의 시험 기간 동안 혈액 글루코스의 유의미한 저하가 또한 있었음이 입증된다 (도 15B). 그렇지만, 다시 한번 혈당측정계의 측정 한계로 인하여, 상기 저하는 도 15B에 나타난 것보다 더욱 극적인 것으로 보인다. 그럼에도 불구하고, 상기 저하가 여전히 유의미하게 상이하다는 점이 강조되어야 한다.
글루코스 주입 2시간 후의 화합물 CDE-처리된 Lepr db/db 마우스 중의 글루코스 수준은 글루코스 주입 전의 글루코스 수준보다 여전히 더 높다는 점도 주목되었다 (도 15A 참조). 상기 결과는 Lepr db/db 마우스의 혈류 내의 투여된 글루코스의 화합물 CDE에 의한 완벽한 소거에는 본 실험에서 이용된 2시간 모니터링 기간보다 더 길게 걸릴 수도 있음을 제안한다.
요컨대, 상기 연구를 통해 화합물 CDE가 시험 용량에서 Lepr db/db 마우스 중의 글루코스 내성을 유의미하게 향상시킬 수 있는 것이 입증된다. 상기 화합물들의 작용은 간 뿐만 아니라 근육 및 지방 조직과 같은다른 장기에서 글루코스의 소거에서의 인슐린 감수성의 향상을 통해 매개되었을 가능성이 높다.
요약
상기 결과는, 화합물 CDE가 공격적인 II형 당뇨병 마우스 모델에서 공복 글루코스 수준 (도 14)을 저하시킬 뿐만 아니라 글루코스 내성을 향상시킬 수 있음 (도 15)을 최초로 입증한다. 광범위한 세포 배양 작업을 토대로, 상기 동물에서 화합물 CDE의 가능성 높은 작용 방식은 (1) 마우스 일차 간세포 및 AML-12 간세포에서 입증된 바와 같이 (도 2-4, 6-7, 9-13 참조), 인슐린을 우회하여 Foxo1, Foxo3, Foxo4를 불활성시키고, 그로써 간세포에서 감소된 G6pc 발현 및 글루코스 생산을 초래하고; (2) 또한 배양된 간세포에 대한 연구에 의해 나타낸 바와 같이 (도 4, 10-11), 간에서 Foxo1, Foxo3, Foxo4-매개된 G6pc 발현 및 글루코스 생산의 억제에 의해 인슐린 감수성을 향상시키고/시키거나; (3) 도 15에 제안된 바와 같이, 인슐린 작용을 향상시키거나 인슐린을 우회하여 간, 근육 또는 지방 세포에서 글루코스의 섭취 및/또는 대사를 증강시키는 것이다. 또한, 마우스 AML-12 간세포에 대한 연구에 의해 나타낸 바와 같이, 인슐린 감수성의 향상은 화합물 CDE에 의한 Insr 및 Igf1r 발현의 증강으로 인한 것일 수 있다 (도 5).
그에 개의치 않고, 본 발명의 연구는 화합물 CDE가 인슐린-내성인 당뇨병 마우스 모델에서 글루코스 생산을 억제하고 글루코스 내성을 향상시킬 수 있음을 입증한다. 상기 결과는 화합물 CDE가 당뇨병 환자에서 고혈당증 및 인슐린-감수성의 치료용으로 개발될 수 있음을 제안한다. 그 외에도, 화합물 CDE는 또한, 고혈당증의 위험이 있는 환자에게 그의 발병 이전에 투여된다면 혈류 중의 글루코스 생산을 저하시킬 수 있는 그의 능력에 의해, 전-당뇨병성 (pre-diabetic) 대상체에서 고혈당증의 발병을 예방하는데 사용될 수 있다. 또한, 화합물 CDE는 혈류 중의 글루코스 수준을 저하시키는 그의 능력에 의해 비만 치료용으로 또한 유용할 수 있다.
본 출원에 언급된 모든 문헌 및 특허는 본원에 참고로서 포함된다. 본 출원의 기술된 방법 및 조성물의 다양한 변형 및 변화가 본 출원의 범주 및 요지를 벗어나지 않으면서 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 본 출원이 특정의 바람직한 실시양태와 관련되어 기술되었다고 하더라도, 청구된 바와 같은 본 출원이 이러한 특정 실시양태로 부당하게 제한되지 않아야 하는 것으로 이해되어야만 한다. 실제로, 관련 분야의 통상의 기술자에게 자명한 본 출원을 실시하기 위해 기술된 방식의 다양한 변형은 하기 청구범위의 범주 내에 포함되는 것으로 의도된다.

Claims (34)

  1. 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 및 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인; 및 담체를 포함하고, 대상체에서 인슐린을 대체함으로써 당뇨병, 고혈당증, 또는 비만을 치료 또는 예방하는 방법에 이용하기 위한 약학적 조성물.
  2. 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 및 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인; 및 담체를 포함하고, 대상체에서 인슐린 활성을 증강시킴으로써 당뇨병, 고혈당증, 또는 비만을 치료 또는 예방하는 방법에 이용하기 위한 약학적 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 방법은 인슐린을 대상체에 투여하는 단계를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  4. 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 및 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인; 및 담체를 포함하고, 대상체에서 글루코스 생산을 억제함으로써 당뇨병, 고혈당증, 또는 비만을 치료 또는 예방하는 방법에 이용하기 위한 약학적 조성물.
  5. 5'-메틸셀레노아데노신, Se-아데노실-L-호모시스테인, 및 감마-글루타밀-메틸셀레노-시스테인; 및 담체를 포함하고, 대상체에서 글루코스 대사를 조절함으로써 당뇨병, 고혈당증, 또는 비만을 치료 또는 예방하는 방법에 이용하기 위한 약학적 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 적어도 0.1%(w/v)의 5'-메틸셀레노아데노신을 포함하는 약학적 조성물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 인슐린을 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 5'-메틸티오아데노신, S-아데노실-L-호모시스테인 또는 감마-글루타밀-메틸-시스테인 중 하나 이상을 제외하는 약학적 조성물.
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