KR102798155B1 - 토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법 및 이에 의해 제조된 소구경 흡수성 인공혈관 - Google Patents

Abstract

토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법 및 이에 의해 제조된 소구경 흡수성 인공혈관이 제공된다. 생체 흡수성 재료를 사용하여 인공 혈관을 토출하는 단계, 상기 토출된 인공 혈관을 물리적으로 가교하는 단계 및 상기 물리적으로 가교된 인공 혈관을 화학적으로 가교하는 단계를 포함한다.

Description

토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법 및 이에 의해 제조된 소구경 흡수성 인공혈관 {method for manufacturing small-diameter BIODEGRADABLE vascular grafts using an extrusion-based process and small-diameter BIODEGRADABLE vascular grafts manufactured therby}

본 기재는 토출방식으로 제작된 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법 및 이에 의해 제조된 소구경 흡수성 인공혈관에 관한 것이다.

인공혈관(vascular graft)는 회복이 불가능한 혈관을 대체하기 위한 인공장기를 말한다. 인공혈관 시술을 위한 혈관은 크게 대구경(>8mm), 중구경(4-8mm), 소구경(<4mm)으로 나뉠 수 있다. 대구경 혹은 중구경에 사용되는 인공혈관 재질은 주로 확장형 폴리테트라플루오로에틸렌(테프론, ePTFE)을 사용하고 있다. 하지만, 해당 재질은 비흡수성(비분해성)으로 평생 체내에 남게되므로, 혈전을 방지하기 위해, 항응고제나 항혈전제를 단독 또는 병행 복용해야 하는 문제가 있다. 또한 심각한 부작용 발생시 재수술을 해야하는 부담이 있다.

한편, 소구경 혈관은 혈류의 속도가 낮아 인공혈관 시술 시 조기 혈전형성 및 협착 가능성이 매우 높다. 따라서, 대부분의 소구경 혈관은 유리피판술, 청공지피판술 등 공여자의 다른 부위에서 혈관을 취득하여 자가혈관을 이식하거나, 미세혈관문합기를 이용하여 말초혈관 계통 정맥의 미세문합수술이 대부분이 이루어지고 있다. 이때, 미세혈관문합기를 사용하면 비흡수성 물질인 고밀도 폴리에틸렌(HDPE)과 스테인레스 핀(stainless steel pin)이 체내에 평생 삽입되는 문제가 있다.

종래에 돼지의 혈관으로부터 탈세포화(decellularization)된 인공혈관을 사용한 사례들이 있으나(Jun Chen et al., "Current Strategies for Engineered Vascular Grafts and Vascularized Tissue Engineering.”Polymers, Vol. 15, pp. 1-35 (2023, 4. 25)), 종간 격차로 시술 후 누수가 생기거나 원하는 크기의 인공혈관이 제공되지 않은 등 여러 부작용 사례가 보고되고 있다.

따라서, 자가혈관을 사용하거나 흡수성 소재가 체내에 평생 삽입되는 문제를 해결할 수 있는 혈관 대체형 흡수성 인공혈관이 필요하다. 또한 대체형 흡수성 인공혈관은 기존의 혈관과 유사한 물리적 특성을 지녀야 한다.

일 구현예는 토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제작 방법을 제공하려는 것이다.

다른 일 구현에는 물리적 가교와 화학적 가교를 순차적으로 진행하여 인공혈관과 유사한 특성을 구비하는 소구경 흡수성 인공혈관을 제공하려는 것이다.

일 구현예에 따르면, 생체 흡수성 재료를 사용하여 인공 혈관을 토출하는 단계, 상기 토출된 인공 혈관을 물리적으로 가교하는 단계 및 상기 물리적으로 가교된 인공 혈관을 화학적으로 가교하는 단계를 포함하는 토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법이 제공된다.

다른 구현예에 따르면, 콜라겐과 젤라틴의 물리적 가교 및 화학적 가교로 이루어진 중공형태의 쉘을 포함하는 인공혈관으로, 상기 인공혈관의 직경은 4mm 이하이고, 상기 쉘의 두께는 0.05~0.2mm 인 소구경 흡수성 인공혈관이 제공된다.

일 구현예에 따른 토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법은 코어-쉘 노즐의 크기 조합 및/또는 공압의 조절에 따라 원하는 크기와 두께로 인공혈관을 제조할 수 있다.

토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관의 제조방법은 물리적 가교와 화학적 가교를 순차적으로 진행하여 강도와 유연성을 개선시키고 ePTFE 소재와 유사한 강도 혹은 보다 높은 강도로 제조될 수 있다.

다른 구현예에 따른 소구경 흡수성 인공혈관은 독성이 낮은 식물성 가교제를 사용하기 때문에 안전성이 높은 장점이 있다.

도 1은 토출기반 소구경 흡수성 인공혈관 제작 공정도를 나타낸 것이다.
도 2는 코어-쉘 구조의 노즐을 포함하는 3D 프린터 헤드의 사진과 단면도이다.
도 3은 토출 직후 알간산이 가교된 토출 구조물의 사진과 예시적인 단면도이다.
도 4는 물리적 가교 후의 예시적인 단면도이다.
도 5는 코어 희생층이 제거된 인공혈관의 사진과 예시적인 단면도이다.
도 6은 코어 희생층 제거 후 유리관이 삽입된 상태의 인공혈관을 나타내는 사진이다.
도 7은 화학적 가교가 완료된 최종 산물 형태의 인공혈관의 사진과 예시적인 단면도이다.
도 8은 화학적 가교시 타닌산만을 처리할 경우, 제니핀만을 처리할 경우, 타닌산 처리 후 제니핀을 순차적으로 처리한 후에 형성된 인공혈관의 사진들이다.
도 9은 각 가교에 따른 인공혈관의 터짐압력 측정 결과이다.
도 10은 각 가교에 따른 인공혈관의 인장강도 측정 결과이다.
도 11은 각 가교에 따른 인공혈관의 변형률 측정 결과이다.

이하, 본 발명의 구현예에 대하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 구현예에 한정되지 않는다. 본 발명의 개념에 따른 실시예는 다양한 변경들을 가할 수 있고 여러 가지 형태들을 가질 수 있으므로 실시예를 도면에 예시하고 본 명세서에 상세하게 설명하고자 한다. 그러나 이는 본 발명의 개념에 따른 실시예를 특정한 개시형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 변경, 균등물, 또는 대체물을 포함한다.

본 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 '포함'한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 본 명세서 전체에서 단수형은 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.

본 명세서에서 수치적 값의 범위가 기재되었을 때, 이의 구체적인 범위가 달리 기술되지 않는 한 그 값은 유효 숫자에 대한 화학에서의 표준규칙에 따라 제공된 유효 숫자의 정밀도를 갖는다. 예를 들어, 10은 5.0 내지 14.9의 범위를 포함하며, 숫자 10.0은 9.50 내지 10.49의 범위를 포함한다.

이하 일 구현예에 따른 토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법에 대해 설명한다.

도 1은 토출기반 소구경 흡수성 인공혈관 제작 공정도이고, 도 2 내지 도 7은 제작 공정 단계별로 제조된 인공혈관의 사진과 단면도를 나타낸다.

도 1을 참조하면, 소구경 흡수성 인공혈관의 제조를 위해서 먼저 생체 흡수성 재료를 준비한다(S1).

생체 흡수성 재료는 쉘 형성용 재료와 희생층 형성용 재료를 포함한다.

쉘 형성용 재료는 콜라겐을 포함한다. 혈관의 주성분이 콜라겐이므로 쉘 형성용 재료를 콜라겐으로 하여 실제 혈관과 가장 유사하게 형성한다. 콜라겐으로는 아텔로콜라겐 또는 콜라겐 펩타이드가 사용될 수 있다.

쉘 형성용 재료는 젤라틴을 더 포함한다. 콜라겐만을 사용할 경우 인공혈관의 물리적 강도와 탄성이 부족하여 파열되기 쉽다. 따라서, 콜라겐에 젤라틴을 혼합해서 인공혈관에 높은 강도와 유연성(flexibility)을 제공한다.

쉘 형성용 재료는 알긴산을 더 포함한다. 알긴산은 혈관이 3D 프린터 노즐에서 토출되는 즉시 인-시츄로 가교되어 쉘의 구조를 즉각적으로 유지시키는 역할, 즉 형태를 잡아주는 역할을 한다. 알긴산은 2가 양이온인 칼슘(Ca²⁺), 바륨(Ba²⁺), 스트론튬(Sr²⁺), 마그네슘(Mg²⁺), 망간(Mn²⁺), 아연(Zn2+)과 이온 가교(ionic cross-linking)를 통해 쉽고 빠르게 하이드로겔화 된다. 따라서, 알지네이트는 프린팅 직후 이온 가교를 통해 즉시 가교되어 쉘의 초반 구조를 형성하기 위해 사용한다.

콜라겐은 3 내지 10 wt/v%, 젤라틴은 5 내지 20 wt/v%, 알긴산은 2 내지 10 wt/v% 의 농도로 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는, 콜라겐은 3 내지 5wt/v%, 젤라틴는 10 내지 15 wt/v%, 알긴산은 5 내지 8 wt/v%의 농도로 사용될 수 있다. 콜라겐이 5wt/v%를 초과하는 경우 다른 물질들과 혼합이 어려워 변성을 야기할 수 있다. 젤라틴이 15 wt/%를 초과하는 경우 물리적으로 가교되는 시간이 짧아져 다른 물질들과 혼합이 어려울 수 있다. 알긴산이 8 wt/v%를 초과하는 경우 점도가 높아 다른 물질들과 혼합이 어려울 수 있다.

희생층 형성용 재료는 특정 온도 이상에서 액상으로 변해서 제거되어 중공 구조를 형성할 수 있는 재료를 사용할 수 있다. 예를 들면 플루로닉(pluronic) F-127, 젤라틴 등을 사용할 수 있다. 하지만 희생층 형성용 재료가 온도 감응성 재료에만 국한되는 것은 아니다. 예를 들면 희생층 형성용 재료로 알긴산을 사용하고 인공혈관 제조후 세척을 반복하여 제거할 수 있다.

플루로닉 F-127은 20 내지 60 wt/v% 의 농도로 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는 40 내지 50 wt/v%의 농도로 사용될 수 있다. 이보다 농도가 낮은 경우 점도가 너무 낮고 이보다 농도가 높은 경우 점도가 너무 높아 다른 물질들과 동시 토출이 어려울 수 있다.

이어서 쉘 형성용 재료를 배합한다(S2).

콜라겐 : 젤라틴은 2~6 : 4~8 의 비율로 혼합하여 혈관 고유의 특성과 탄성 특성을 모두 달성할 수 있도록 한다.

알긴산은 인공혈관 제조시 초기 형상을 유지하는 용도로 사용되며 체내에서 빠르게 분해되기 때문에 낮은 농도로 사용되는 것이 바람직하다.

콜라겐과 젤라틴의 혼합물 : 알긴산은 8~9 : 1~2 의 비율로 혼합하여 사용해야 알긴산의 사용을 최소화 하여 토출할 수 있다.

준비된 재료를 3D 프린터에 주입한다(S3).

3D 프린터는 코어-쉘(core-shell) (중공축(co-axial) 이라고도 함) 구조의 노즐을 포함한다.

배합된 쉘 형성용 재료를 시린지에 넣어 코어-쉘(core-shell) 노즐의 쉘 부분과 결합하여 쉘에 로딩하고, 희생층 형성용 재료를 시린지에 넣어 코어 부분과 결합하여 코어에 로딩한다.

노즐로부터 상기 쉘 형성용 재료와 희생층 형성용 재료를 토출한다(S4).

토출은 쉘 노즐과 코어 노즐을 동시에 구동하여 쉘과 코어부에서 동시에 토출한다.

도 2의 좌측에는 코어-쉘 구조의 노즐을 포함하는 3D 프린터 헤드의 사진이 우측에는 단면도가 예시되어 있다. 코어 노즐의 내경은 14 ~ 26 G, 쉘 노즐의 내경은 16 ~ 28 G 일 수 있다. 코어 노즐의 외경과 쉘 노즐의 내경 간격이 최소 0.1 mm 이상인 것이 바람직하다. 간격이 0.1 mm 미만인 경우 너무 많은 토출력이 요구되어 토출이 어려운 문제가 있다.

노즐을 2가 양이온인 칼슘(Ca²⁺), 바륨(Ba²⁺), 스트론튬(Sr²⁺), 마그네슘(Mg²⁺), 망간(Mn²⁺), 아연(Zn2+)을 제공할 수 있는 용액에 담지한 후 토출한다. 예를 들면 염화칼슘 용액에 담지할 수 있다.

토출시 공압은 쉘 노즐은 40~300 kPa로 코어 노즐은 30~500kPa로 동시에 토출하는 것이 튜브형태의 구조물을 안정적으로 제조하는데 바람직하다. 토출 방식은 다양한 소재 및 소재의 농도를 토출력을 조절하여 쉽게 토출할 수 있는 장점이 있다.

노즐 내경 및 공압을 제어함으로써 원하는 크기의 인공혈관을 제조할 수 있다. 예를 들면, 공압이 낮은 경우 토출속도가 낮아 노즐보다 큰 인공혈관이 제조되며 공압이 높은 경우 토출속도가 빨라 노즐보다 큰 인공혈관이 제조될 수 있다. 또한, 코어부의 공압을 높이면 보다 작은 내강 구조를 제작할 수 있고 공압을 낮게 하면 보다 큰 내강 구조를 제작할 수 있다.

토출된 구조물의 쉘을 구성하는 알긴산은 담지 용액 내의 2가 양이온(예., 칼슘 이온)과 결합하여 즉시 가교된다. 가교가 확실하게 진행되도록 하기 위해서 2가 양이온을 포함하는 담지 용액 내에 1 내지 60 분간 담지하여 알긴산의 가교 반응을 진행한다. 이 후 가교 반응을 멈추기 위하여 토출된 구조물을 일차 증류수로 세척하여 토출된 구조물로부터 2가 양이온을 제거한다. 가교시간이 길어질수록 보다 높은 강도의 인공혈관을 제조할 수 있고 순차적인 물리화학적 가교전에 작업자가 보다 수월하게 인공혈관을 핸들링할 수 있다. 예를 들면, 인공혈관을 핀셋으로 잡아 다른 작업대로 옮기는 것이 가능하다. 즉, 가교시간이 너무 짧으면 핸들링 시 인공혈관이 파열될 수 있다.

알긴산이 가교된 토출 구조물이 도 3에 예시되어 있다. 도 3의 좌측은 토출 직후 쉘의 알긴산이 가교된 형태의 인공혈관의 사진이고, 우측은 단면도이다.

이어서, 물리적 가교를 진행한다(S5)

쉘의 주성분인 콜라겐을 물리적으로 겔화하는 공정을 진행한다. 콜라겐은 섭씨 25 내지 37 도 에서 겔화하는 성질이 있다. 바람직하게는 약 37도의 온도의 생리식염수 내에서 겔화를 진행할 수 있다. 겔화 온도에서 30 내지 60 분동안 겔화를 진행하여 물리적 가교가 일어나도록 한다. 그 결과물의 예시적인 단면도가 도 4에 도시되어 있다. 도 4에 도시된 바와 같이 물리적 가교시 사용하는 생리식염수로 인해 가교된 알긴산은 분해되게 된다.

이어서 희생 코어부를 제거한다(S6).

희생 코어부를 구성하는 플루로닉(Pluronic) F-127은 온도 감응성 소재로 약 4도의 온도에서 액상으로 변한다. 따라서 약 4도의 일차 증류수나 생리식염수를 이용해 1 ~ 5 분간 2 내지 5회 세척함으로써 제거할 수 있다. 이때, 쉘을 구성하는 젤라틴이 물리적으로 가교될 수 있다.

도 5의 좌측에는 희생 코어부가 제거되어 쉘만 남은 인공혈관의 사진이 우측에는 단면도가 예시되어 있다.

이어서 희생 코어부가 제거된 중공형태의 인공혈관을 물리적으로 고정한다(S7).

본 단계는 인공혈관의 형태를 고정하여 후술하는 화학적 가교시 형태가 유지되어 인공혈관의 직경과 쉘의 두께가 균일하게 유지되고 중공의 크기가 수축되는 것을 방지하기 위한 것이다.

물리적으로 고정하는 방법은 인공혈관 전체에 걸쳐 유리관을 삽입하거나, 상기 중공형태의 인공혈관의 양말단의 일부에 관을 삽입하거나, 상기 중공형태의 인공혈관의 양말단을 상기 중공형태의 인공혈관의 내부로 유체를 흘려줄 수 있는 순환펌프의 배관에 연결하는 것 중에서 선택된 어느 하나에 의해 진행할 수 있다.

3D 프린터 장치내에서 인공혈관의 토출 후 인공혈관을 물리적으로 고정시키는 것을 자동으로 수행할 수 있도록 구조화된다면 추가로 물리적으로 고정하는 단계를 생략할 수도 있어서 도 1에서 S7은 점선으로 도시되어 있다.

세척된 중공형태(튜브형태)의 인공혈관에 유리관을 삽입한 뒤 50~200 mM의 칼슘용액에 1 ~ 2 시간동안 담지하였다.

도 6에는 인공혈관에 유리관을 삽입하여 칼슘 용액에 담지함으로써 긴 일자형태의 인공혈관을 수득한 결과가 예시되어 있다.

앞단에서 실시한 물리적 가교만으로는 인공혈관의 인강강도와 터짐압력을 달성할 수 없기 때문에 화학적 가교를 실시한다. 화학적 가교는 강도와 연성을 모두 충족시키기 위하여 1차와 2차에 걸쳐서 수행한다. 2차 가교에 의해 형성되는 체인의 길이가 1차 가교에 의해 형성되는 체인의 길이보다 짧도록 하는 제1 가교제와 제2 가교제를 사용하여 진행할 수 있다.

먼저 화학적 1차 가교는 인공혈관의 강도를 높이기 위해서 수행한다(S8).

화학적 1차 가교는 0.1~ 5 wt/v%의 타닌산(tannic acid) 용액을 사용하여 수행한다. 구체적으로 섭씨 4 ~ 37 도에서 6 ~ 24 시간동안 타닌산을 처리하여 화학적 1차 가교를 진행한다. 가교 온도가 높을수록 가교가 활발해지므로 가교시간이 단축될 수 있다. 또 가교제의 농도가 높을수록 가교가 활발해지므로 가교시간이 단축될 수 있다.

화학적 2차 가교는 인공혈관의 연성을 향상시키기 위해서 수행한다(S9)

화학적 1차 가교후 일차증류수로 수회 세척한 뒤 화학적 2차 가교를 진행한다. 화학적 2차 가교는 0.1~ 5 wt/v%의 제니핀(Genipin) 용액을 사용하여 수행한다. 구체적으로 섭씨 4 ~ 37 도에서 6 ~ 24 시간동안 제니핀을 처리하여 화학적 2차 가교를 진행한다. 가교 온도가 높을수록 가교가 활발해지므로 가교시간이 단축될 수 있다. 또 가교제의 농도가 높을수록 가교가 활발해지므로 가교시간이 단축될 수 있다.

토출단계(S4) 에서 화학적 2차 가교단계(S9)까지는 각 단계가 수동으로 이루어질 수도 있고, 일부는 3D 프린터내에서 자동으로 연속 배스 공정으로 이루어질 수도 있으며, 이는 3D 프린터 장치의 다양한 변형 및 제조 공정의 효율 향상 관점에서 다양하게 변화될 수 있다.

도 7의 좌측에는 화학적 가교가 완료된 최종 산물 형태의 인공혈관(700)의 사진이 우측에는 단면도가 예시되어 있다.

토출방식을 이용하여 제조한 소구경 인공혈관(700)은 약 4mm 이하의 직경(d)을 가진다. 인공혈관 쉘의 두께(t)는 0.05 ~ 0.2 mm 일 수 있다. 또한, 제조된 인공혈관(700)의 길이는 1 ~ 50 cm 일 수 있다

인공혈관(700) 쉘은 가교화된 콜라겐과 젤라틴을 포함한다. 따라서, 인체내에 삽입된 후 약 4주 이후부터는 체내에서 생분해되어 체내에 흡수될 수 있다.

인공혈관(700) 쉘은 가교화된 콜라겐과 젤라틴만을 포함하기 때문에 인공혈관(700)을 혈관에 이식할 경우 내피세포의 내피화가 효과적으로 일어날 수 있다. 이는 콜라겐을 주성분으로 하는 인공혈관에서 내피세포의 내피화가 매우 빠른 것을 확인한 논문(Li, Xuanyue, et al. "Generation, endothelialization, and microsurgical suture anastomosis of strong 1-mm-diameter collagen tubes." Tissue Engineering Part A 23.7-8 (2017): 335-344.) 으로부터 알 수 있다.

인공혈관(700)은 콜라겐이 함유된 의료기기 평가 가이드라인과 3D 프린터를 이용하여 제조되는 혈관재생용 생분해성 지지체의 안전성 및 성능시험 가이드라인을 충족시켜야 한다.

따라서, 인공혈관(700)은 최소한 돼지의 정맥 또는 동맥과 유사한 터짐압력을 가질 수 있다. 인공혈관(700)의 한쪽에는 유량 펌프를 연결하고 다른 한쪽에는 디지털 압력계를 설치하여 일차 증류수를 순환시키면서 인공혈관이 터질 때의 압력을 터짐압력으로 측정한다. 예를 들면, 터짐압력은 900 mmHg 이상의 값을 나타낼 수 있다. 인공혈관(700)의 화학적 가교에 사용된 가교제의 조합을 조절함으로써 터짐압력은 2000 mmHg 이상을 나타낼 수도 있다.

인공혈관(700)의 인장강도 및 변형율은 반응시험기를 이용하여 50 kgf의 힘과 10 mm/min 이송속도로 시편을 연신하여 인장강도 및 변형율을 측정할 수 있다. 인장강도는 1 ~ 10 MPa 일 수 있다. 바람직하기로는 5 MPa 일 수 있다. 변형율은 1 ~ 30 mm/mm 일 수 있다.

인공혈관(700)의 혈관 개통률은 인공혈관 시편을 이식한 후 초음파 영상을 통해 측정할 수 있다. 인공혈관(700)의 혈관 개통률은 적어도 90% 이상으로 나타났다.

이하 실시예를 통하여 상술한 본 발명의 구현예를 보다 상세하게 설명한다. 다만 하기의 실시예는 단지 설명의 목적을 위한 것이며 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실험예 1 : 인공혈관 제조

재료 준비

동결건조된 아텔로콜라겐 1g을 0.001N HCL 10mL에 녹인 뒤 132mM Na2HPO4을 1:1로 혼합하여 5 wt/v% 아텔로콜라겐으로 중성화하였다. 중성된 아텔로콜라겐은 pH 미터를 이용하여 pH가 7.0 ~ 7.5로 적정되었는지 확인하였다.

알긴산 용액은 알지네이트를 일차 증류수에 희석하여 9 wt/v %로 제작하였다.

젤라틴 용액은 젤라틴을 일차 증류수에 희석하여 12 wt/v %로 제작하였다.

재료 배합

아텔로콜라겐, 알긴산 용액, 젤라틱 용액을 4:5:1 비율로 혼합하여 최종 바이오잉크를 제작하였다. 이후, 기포를 제거하기 위해 3,000 RPM으로 5분간 원심분리한 뒤 상단의 기포를 흡입 기기로 제거하였다.

희생용액으로 사용될 Pluronic F-127 용액은 일차 증류수에 희석하여 40 wt/v %로 제작하였으며 염화칼슘을 20mM로 적정하였다.

재료 주입

희생용액을 시린지에 넣어 코어-쉘(core-shell) 혹은 중공측(co-axial) 노즐의 코어 부분과 결합하고 바이오잉크를 시린지에 넣어 쉘 부분과 결합하였다.

토출

본 실시예에서는 코어 노즐 19G, 쉘 노즐 12G를 사용하였다. 노즐을 200mM 염화칼슘 용액에 담지한 뒤 쉘 부는 200 kPa로 코어 부는 100 kPa로 동시에 토출하였다. 200mM 염화칼슘에서 10분 동안 가교되었다. 이때, 바이오잉크의 구성성분인 알긴산 용액이 칼슘 이온과 결합하여 즉시 가교된다. 이후 가교 반응을 멈추기 위하여 일차 증류수로 3회 세척하였다.

물리적 가교

다음, 바이오잉크의 구성성분인 온도 감응성 소재 아텔로콜라겐을 물리적으로 겔화하기 위하여 섭씨 37 도에서 1시간 동안 가교 하였다.

희생층 제거 및 물리적 고정(관 삽입)

이후, 희생용액인 온도 감응성 소재 Pluronic F-127을 제거하기 위하여 섭씨 4도의 일차증류수를 이용해 10분간 3회 세척하였다.

세척된 중공형태(튜브형태)의 인공혈관을 유리관에 삽입한 뒤 200mM의 칼슘용액에 3시간 동안 담지하였다. 이로써, 긴 일자형태의 인공혈관을 수득할 수 있다.

화학적 1차 가교

이후, 일차증류수에 3회 세척한 뒤, 인공혈관의 물리적 강도를 향상시키기 위하여 5 wt/v% 타닌산(tannic acid) 용액에 12시간 동안 37도에서 화학적 가교(chemical cross-linking)하였다.

화학적 2차 가교

이후, 일차증류수에 3회 세척한 뒤, 인공혈관의 연성을 향상시키기 위하여 0.5 wt/v% 제니핀(Genipin) 용액에 12시간 추가적으로 화학적 가교를 시행하였다.

실험예 2 : 인공혈관의 터짐압력 측정

터짐압력을 측정하기 위해서 직경 1.5mm의 인공혈관을 타닌산에 12시간 처리한 그룹, 제니핀에 12시간 처리한 그룹 그리고 타닌산에 12시간 처리 후 제니핀에 12시간 처리한 3가지 그룹을 300 mm로 잘라 준비하였다. 각 조건별로 형성된 인공혈관의 사진이 도 8에 도시되어 있다.

인공혈관의 한쪽에는 유량 펌프를 연결하고 다른 한쪽에는 디지털 압력계를 설치하여 일차 증류수를 순환하였다. 이때, 인공혈관의 양 끝단은 시아노아크릴레이틀 이용하여 고정하여 누수가 없도록 설치하였다. 인공혈관이 터질때까지의 압력을 측정하고 최대 압력을 터짐압력으로 산출하여 도 9에 그래프로 도시화하였다.

도 9의 결과로부터 타닌산과 제니핀을 따로 처리한 그룹보다 타닌산 이후에 제니핀을 순차적으로 처리한 그룹의 터짐압력이 더 높아서 터짐압력(강도)를 개선할 수 있음을 확인할 수 있었다.

흡수성 인공혈관, ePTFE 비흡수성 인공혈관, 돼지의 인공혈관을 비교하기 위하여 각각의 터짐압력력을 측정하였다. 돼지의 경우 다양한 정맥과 동맥으로부터 혈관을 추출하여 측정하였다. 이때, 흡수성 인공혈관은 타닌산과 제니핀을 순차적으로 5 시간씩 처리한 후 터짐압력을 측정하였다.

그 결과가 아래 표 1에 기재되어 있다. 표 1의 결과로부터 돼지의 정맥 및 동맥과 유사한 터짐압력을 갖는 인공혈관을 제작할 수 있음을 확인할 수 있다.

	인공혈관	ePTFE	Farm Pig Femoral Artery	Farm Pig Carotid Artery (L)	Micro Pig #4 Vein (R)	Micro Pig #4 Carotid Artery (R)	Micro Pig #5 Vein	Micro Pig #5 Carotid Artery (R)
혈관직경 (mm)	1.0 mm	1.0 mm	1.0 mm	1.3 mm	4.1 mm	1.25 mm	6.1 mm	1.15 mm
터짐 압력(KPa)	145 kPa	266 kPa	100 kPa	118 kPa	150 kPa	121 kPa	148 kPa	123 kPa
터짐 압력(mmHg)	1087	2500	750	885	1125	907	1110	922

실험예 3 : 인공혈관의 인장강도 및 변형률 측정

인장강도 및 변형률을 측정하기 위해 직경 1.5mm의 인공혈관을 타닌산에 12시간 처리한 그룹, 제니핀에 12시간 처리한 그룹 그리고 타닌산에 12시간 처리 후 제니핀에 12시간 처리한 3가지 그룹을 300 mm로 잘라 준비하였다. 이후 반응시험기(QM100S, QMESYS, Gunpo, Korea)를 이용하여 50 kgf의 힘과 10 mm/min 이송속도로 시편을 연신하여 인장강도 및 변형율을 측정하였다. 변형율과 인장강도는 제조사의 소프트웨어 Qm_Tester를 통하여 산출되었다.

도 10에 인장강도가 도 11에 변형율이 도시되어 있다. 앞의 터짐압력(도 9)의 결과와 함께 보면 타닌산을 처리한 그룹의 터짐압력(도 9)과 인장강도(도 10)는 제니핀을 처리한 그룹보다 높았으나 변형율(도 11)은 오히려 제니핀을 처리한 경우에 높게 나왔다. 따라서, 타닌산이 처리된 그룹의 강도가 더 높지만 연성은 낮다고 볼 수 있다. 다음, 이종의 재료를 순차적으로 처리(타닌산 처리 후 제니핀 처리)한 그룹의 경우 터짐압력과 인장강도와 터짐압력이 다른 두 그룹보다 모두 개선되었으며, 변형률의 경우 타닌산을 처리한 그룹보다 높았지만 제니핀을 처리한 그룹보다는 낮았다. 따라서, 이 실험 결과에 따라 순차적인 가교를 통해 인장강도와 변형률을 모두 개선시킬 수 있는 것을 확인하였다.

이상에서 본 발명의 바람직한 실시예들에 대하여 상세하게 설명하였지만 본 발명의 권리 범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구 범위에서 정의하고 있는 본 발명의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본 발명의 권리 범위에 속하는 것이다.

Claims (12)

1. 콜라겐, 젤라틴 및 알긴산을 포함하는 쉘 형성용 재료는 쉘 노즐에 희생층 형성용 재료는 코어 노즐에 로딩하는 단계;
   상기 쉘 노즐과 코어 노즐을 동시에 구동하여 쉘과 그 내부를 채우는 희생 코어부를 포함하는 토출물이 2가 양이온을 포함하는 용액 내로 토출되도록 하여, 상기 쉘 내의 알긴산이 상기 2가 양이온과 결합하여 즉시 가교되도록 하여 상기 쉘의 구조가 토출과 동시에 즉각적으로 유지되도록 하는 단계;
   상기 쉘 형성용 재료인 상기 콜라겐이 겔화하는 온도에서 상기 콜라겐이 겔화되도록 하여 물리적으로 가교하는 단계;
   상기 희생 코어부를 제거하여 중공형태의 인공혈관을 형성하는 단계; 및
   상기 중공형태의 인공혈관의 강도와 연성을 향상시키기 위해 상기 물리적으로 가교된 쉘을 화학적으로 가교하는 단계를 포함하는 토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법.
2. 제1 항에 있어서,
   상기 화학적 가교 단계 전에 상기 중공형태의 인공혈관을 물리적으로 고정하여 형태를 잡는 단계를 더 포함하는 토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법.
3. 제1 항에 있어서,
   상기 화학적으로 가교하는 단계는 상기 인공 혈관의 강도를 향상시키기 위한 제1 가교제를 사용하는 제1차 화학적 가교 단계; 및
   상기 인공 혈관의 연성을 향상시키기 위한 제2 가교제를 사용하는 제2차 화학적 가교 단계를 포함하는 포함하는 토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법.
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5. 제1 항에 있어서,
   상기 코어 노즐과 상기 쉘 노즐의 내경 간격은 최소 간격이 0.1mm 이어서 상기 토출이 가능하도록 하는 토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법.
6. 제1 항에 있어서,
   상기 토출시 상기 쉘 노즐의 내경은 14~26G이고 공압은 40~300 kPa이고 상기 코어 노즐의 내경은 16~28G이고 공압은 30~500 kPa이고,
   상기 토출은 쉘 노즐과 코어 노즐을 동시에 구동하여 상기 쉘과 코어부에서 동시에 토출하는 토출방식을 이용한 소구경 흡수성 인공혈관 제조방법.
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