KR102891237B1 - 글루타민 합성 효소 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드를 제조하는 방법 - Google Patents

글루타민 합성 효소 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드를 제조하는 방법

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Abstract

본 발명은 글루타민 합성 효소의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 가수분해 효소를 이용하여 대두 분리 단백질(Soy Protein Isolate)을 저분자 혼합 펩티드로 가수분해하는 단계; 및 이온교환크로마토그래피 기법으로 분획하는 단계;를 포함하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법으로 제조된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드는 GS 활성 저하로 인한 질환(우울증, 불안장애 또는 스트레스에 의한 질환)의 예방, 개선 또는 치료용 건강기능식품 또는 의약품으로 활용할 수 있을 것으로 예상된다.

Description

글루타민 합성 효소 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드를 제조하는 방법{Method for preparing hydrolytic peptide of soybean protein isolate with enhanced glutamine synthase activation efficacy and tyrosine content}
본 발명은 글루타민 합성 효소 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
단백질 가수분해물인 펩티드(peptide)는 아미노산의 중합체로서 소수의 아미노산이 연결된 형태를 펩티드라 부르고 많은 아미노산이 연결되면 단백질로 부르며, 이러한 펩티드 및 단백질 구조에서 아미노산 간의 연결은 아미드 결합 또는 펩티드 결합으로 이루어져 있다. 펩티드는 질소공급원으로서의 영양적 기능 이외에도 미각효과, 항산화 효과, 항균효과 등의 생리활성기능을 갖고 있으며, 면역조절기능, 호르몬 및 신경전달 물질로서의 기능 및 항고혈압 효과와 같은 생체조절 기능이 있어, 의약품과 식품산업 분야에서 주목을 받고 있다. 기능성 단백 가수분해물 소재는 천연단백질 식품 소재를 가수분해하여 제조한 천연식품 소재 유래의 가수분해물로서, 가수분해물의 제조 조건에 따라서 여러 가지 생리 기능성을 나타낸다. 기능성 가수분해물의 생산 방법은 단백질 분해효소를 이용한 효소 가수분해 방법 등이 있다. 효소 가수분해 방법은 식품원료를 이용하여 대량 생산이 가능하며 경제적이다.
한편, 대두는 중국을 중심으로 하는 동북아시아가 원산지로, 우리 나라는 약 1,500년 전부터 재배되고 있다. 대두의 구성은 가식부와 배아로, 가식부인 종실의 자엽(떡잎)이 약 90~92%를 구성하고 있으며, 단백질과 지방의 함량이 각각 40% 및 20% 정도 함유되어 있어 저렴하면서도 질 좋은 단백질의 공급원일 뿐만 아니라, 각종 성인병의 원인이 되는 혈중 콜레스테롤을 낮추고, 동맥경화, 심근경색, 뇌졸중 및 고혈압의 예방과 당뇨병, 간장병에 탁월한 효과를 나타내어 영양학적 가치와 생리활성물질로서의 중요성도 인정되고 있다. 이러한 대두는 발효제품(된장, 청국장, 고추장, 간장), 발아제품(콩나물), 기타 가공식품(두유, 두부, 식용유) 등의 식품으로 널리 애용될 뿐만 아니라 식품의 소재로써 탈지대두, 농축대두단백(soy protein concentrate), 대두 분리 단백질(soy protein isolate) 및 조직 대두 분리 단백질(textured soy protein)이 이용되고 있다. 대두 분리 단백질은 종류별로 각 기능 특성이 달라 식품소재의 기능성 및 생리활성 효과를 입증하려는 연구가 많이 시도되고 있는데 단백질의 기능특성을 개선하는 방법 중 가수분해 효소 처리를 통한 변형대두단백질을 제조하는 것이 현실적으로 가장 적용 가능성이 크다. 대두단백질의 효소분해물이 단순히 아미노산 집합체로만 설명할 수 없는 생리기능을 가지고 있는 것으로 밝혀졌으며, 주로 대두단백질의 가수분해물인 대두 펩타이드들이 콜레스테롤 저하효과, 항고혈압활성, 항암활성, 항산화활성, 항동맥경화성 등에 관여한다고 밝혀져, 영양공급과 기호성을 충족시키는 기본 목적 이외에 질병의 예방 및 기능적 효능을 갖춘 새로운 식품소재로서 재평가되고 있다.
대두 분리 단백질의 가수분해 관련 기술로, 한국식품영양과학회지(J Korean Soc Food Sci Nutr 39(1), 8~13(2010)에 분리대두단백질 가수분해물의 Angiotensin-Ⅰ Converting Enzyme 저해효과가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0555221호에 고 단백질 가수분해물의 제조 방법이 개시되어 있으나, 아직까지는 본 발명의 글루타민 합성 효소 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드를 제조하는 방법에 대하여 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 글루타민 합성 효소 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드를 제조하는 방법을 제공하고, 본 발명의 방법으로 제조된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드는 티로신 함량이 증진되었고, 글루타민 합성 효소를 활성화시키는 효능이 증진되었다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (1) 가수분해 효소를 이용하여 대두 분리 단백질(Soy Protein Isolate)을 저분자 혼합 펩티드로 가수분해하는 단계;
(2) 상기 단계 (1) 이후에, 가수분해 효소를 불활성화 시키고, 여과 및 건조시켜 대두 분리 단백질의 가수분해물을 획득하는 단계; 및
(3) pH3.0~3.4 또는 pH6.2~6.6의 조건에서 이온교환크로마토그래피 기법으로 상기 단계 (2)에서 획득한 가수분해물의 분획물을 획득하는 단계;를 포함하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 제조방법으로 제조된 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드를 제공한다.
본 발명은 글루타민 합성 효소의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 가수분해 효소를 이용하여 대두 분리 단백질(Soy Protein Isolate)을 저분자 혼합 펩티드로 가수분해하는 단계; 및 이온교환크로마토그래피 기법으로 분획하는 단계;를 포함하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법으로 제조된 펩티드는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 효과가 있다.
도 1은 반응 시간에 따른 단일 단백질분해효소의 가수분해 정도를 확인한 결과이다.
도 2는 반응 시간에 따른 복합 단백질분해효소의 가수분해 정도를 확인한 결과이다. A는 알칼라아제(Alcalase)이고, P는 프로타맥스(Protamex)이며, N은 뉴트라아제(Neutrase) 및 F는 플라보르자임(Flavourzyme)이다.
도 3은 반응 시간별 단일 단백질분해효소에 의한 가수분해물의 티로신 함량을 확인한 결과이다.
도 4는 반응 시간별 복합 단백질분해효소에 의한 가수분해물의 티로신 함량을 확인한 결과이다.
도 5는 알칼라아제 가수분해물의 단백질 함량에 대한 최적의 가수분해 조건을 확인한 결과이다.
도 6은 알칼라아제 가수분해물의 티로신 함량에 대한 최적의 가수분해 조건을 확인한 결과이다.
도 7은 복합 단백질분해효소의 단백질 함량에 대한 최적의 가수분해 조건을 확인한 결과이다.
도 8은 복합 단백질분해효소의 티로신 함량에 대한 최적의 가수분해 조건을 확인한 결과이다.
도 9는 알칼라아제 가수분해물 및 이의 pH 분획물(Alc3.2 및 Alc6.4)의 처리에 따른 글루타민 합성 효소 활성도 변화를 확인한 결과이다. PN은 과산화아질산염(peroxynitrite)을 의미한다.
본 발명은 (1) 가수분해 효소를 이용하여 대두 분리 단백질(Soy Protein Isolate)을 저분자 혼합 펩티드로 가수분해하는 단계;
(2) 상기 단계 (1) 이후에, 가수분해 효소를 불활성화 시키고, 여과 및 건조시켜 대두 분리 단백질의 가수분해물을 획득하는 단계; 및
(3) pH3.0~3.4 또는 pH6.2~6.6의 조건에서 이온교환크로마토그래피 기법으로 상기 단계 (2)에서 획득한 가수분해물의 분획물을 획득하는 단계;를 포함하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법에 관한 것이다.
상기 단계 (1)에서 가수분해 효소는 알칼라아제(Alcalase), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라아제(Neutrase) 및 플라보르자임(Flavourzyme) 중에서 선택된 하나 또는 두개의 복합 효소인 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 알칼라아제(Alcalase)이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 (1)에서 획득한 저분자 혼합 펩티드는 400kDa 이하의 저분자 혼합 펩티드인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 (1)에서 가수분해는 온도가 40~70℃이고, pH7~9인 조건으로 1~3시간 동안 가수분해하는 것이 바람직하고, 더 바람직하게는 온도가 60℃이고, pH8인 조건으로 2시간 동안 가수분해하는 것이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 단계 (3)에서 이온교환크로마토그래피 기법은 양이온 교환(cation exchange) 크로마토그래피인 것이지만 이에 한정하지 않는다.
바람직한 일례로는, (1) 대두 분리 단백질(Soy Protein Isolate)에 1~2%(w/v) 농도가 되도록 알칼라아제(Alcalase)를 첨가하여 40~70℃, pH7~9인 조건으로 1~3시간 동안 400kDa 이하의 저분자 혼합 펩티드로 가수분해하는 단계;
(2) 상기 단계 (1) 이후에, 가수분해 효소를 불활성화 시키고, 여과 및 건조시켜 대두 분리 단백질의 가수분해물을 획득하는 단계; 및
(3) pH3.0~3.4 또는 pH6.2~6.6의 조건에서 양이온 교환 크로마토그래피 기법으로 상기 단계 (2)에서 획득한 가수분해물을 시트르산과 함께 용출시켜 분획물을 획득하는 단계;를 포함하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법이지만 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드에 관한 것이다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[재료 및 방법]
1. 재료
실험에 사용한 대두 분리 단백질은 탈지 대두 100%를 원재료로 사용하여 산동위센바이오텍(주)(Shandong Yuxn Bio-Tech Co., Ltd, 중국)에서 제조한 대두 분리 단백질 20kg을 정우통산 주식회사(청주, 한국)에서 2022년 10월 구매하여 시료로 사용하였다. 가수분해를 위한 단백질 분해 효소인 알칼라아제(Alcalase) 2.4ℓ, 뉴트라아제(Neutrase) 0.8ℓ, 프로타맥스(Protamex) 및 플라보르자임(Flavourzyme) 500mg을 바이오시스(Biosis) 사(부산, 한국)에서 구매하여 사용하였다. 본 발명의 실시예에 사용한 모든 시약은 분석용을 사용하였다.
2. 가수분해물의 제조와 가수분해 조건의 최적화
가수분해 효소와 가수분해 시간을 설정하기 위해, 대두 분리 단백질 5g을 25mM Tris-Cl (pH 7.5)에 현탁하여 100㎖로 정용하였다. 15㎖ 용량의 코니칼튜브에 대두 분리 단백질 현탁물 5㎖를 가하고, 효소 대 기질 비가 2%(w/v 또는 v/v)가 되도록 효소용액 0.5㎖를 첨가하였다. 대두 분리 단백질과 효소 혼합물은 반응온도 50℃에서 120분 동안 반응시키면서 15분, 30분, 45분, 60분, 90분 및 120분에 시험관에 각각 반응액 1㎖를 취하고 최종농도가 4%가 되도록 20% TCA(Trichloroacetic acid) 용액을 첨가하여 효소반응을 중지시켰다. 반응 중지 혼합액을 10,000rpm에서 10분 동안 원심분리(MC-12, Benchmark Scientific Inc, NJ, USA)하여 얻은 상층액은 Biuret 법(Spies, 1957)으로 단백질 농도를 측정하였다. 상층액의 가수분해도는 다음 식으로 계산하였다(식 1).
(식 1) 가수분해도(DH, %)=(상층액의 단백질 함량/총단백질 함량)×100
한편 두 가지 종류의 효소 혼합물의 가수분해도를 확인하기 위하여, 대두 분리 단백질 현탁물에 1%(w/v, v/v)가 되도록 각각의 효소를 첨가하여 총 효소 대 기질 비가 2%가 되도록 첨가하여 동일한 반응온도와 시간에서 가수분해하여 다른 종류의 효소 혼합물의 가수분해 효과를 측정하였다.
가수분해 조건의 최적화를 위해 종속변수로서 효소 대 대두 분리 단백질 농도비(1~3%), 반응온도(50~70℃), pH(6~8)의 범위에서 Box-Benken법으로 실험설계를 수행하여 반응값으로 가수분해물의 단백질 농도와 가수분해물 중 티로신 함량을 측정하였다.
3. 티로신-풍부 분획의 스케일-업
가수분해물에서 다량의 티로신 또는 티로신을 포함하는 분획물을 분리하기 위해 가수분해물 제조공정을 스케일-업하였다. 대두 분리 단백질 15kg에 정제수 180ℓ (1:12, w/v)을 추출교반기(주문제작, 명보산업, 대한민국)에 넣고 1N HCl용액으로 pH8.0으로 조절하였다. 현탁액을 잘 혼합한 후, 가온하여 60℃가 되도록 온도를 조절하고, 대두 분리 단백질 중량의 1.5%가 되도록 225g의 가수분해효소 Alcalase®2.4LFG(Novozyme)를 투입하여 60℃에서 30rpm으로 교반하면서 2시간 동안 가수분해하였다.
가수분해 후 90℃에서 30분 동안 가열하여 효소를 불활성화하고, 실온으로 냉각하였다. 60메쉬 여과채로 여과한 여과물을 심온동결고에서 동결한 후 동결건조(LP100, 일신바이오베이스, 한국)한 동결건조물을 분획물 분리용 시료로 사용하였다. Batch 식 칼럼 크로마토그래피를 사용한 분획물 분리를 위해, 가수분해물 550g을 4ℓ의 0.01N HCl 용액에 현탁시키고 4,000rpm에서 20분 동안 원심분리(Supra R22, 한일과학, 한국)하여 상층액을 회수하였다. 상층액의 단백질 함량은 Biuret법으로 측정하였다. 칼럼(SAC-Bio-72-60G-20, LISUAE Science, China)에 SP SepFast 6HF 수지(BioToolomics Ltd, England) 2kg을 충진하였고, 25mM 시트르산 나트륨(sodium citrate)(pH 3.2)를 흘려 수지를 평행화시켰다. 수지 평행은 pH 종이를 사용하여 측정한 pH 값으로 확인하였다. 평행화된 칼럼에 가수분해물 1.8ℓ(110g, pH 2.0)를 로딩하여 수지에 아미노산 또는 펩티드를 결합시킨 후, 용출액으로 5ℓ의 시트르산 나트륨(pH 3.2)를 사용하여 20㎖/min으로 유속으로 용출하여 pH 3.2 분획물을 얻었다. 또한, 칼럼에 동일한 유속을 사용하여 5ℓ의 25mM 시트르산 나트륨(pH 6.4)를 사용하여 분획하여 pH 6.4 분획물을 얻었다.
분획 후 2.5ℓ의 0.1N NaOH 용액을 사용하여 용출하지 않은 물질을 용출하고 증류수를 사용하여 pH 7.0까지 수지를 세척한 후, 25mM 시트르산 나트륨(pH 3.2)으로 평행화시켜, 분획물 제조에 사용하였다.
4. 가수분해물과 분획물의 아미노산 조성
5mg의 동결건조 가수분해물 및 각각의 분획물 2㎖을 시험관에 넣고, 가수분해물에 6N HCl 용액 5㎖와, 분획물에 12N HCl 용액 2㎖를 가하여 질소를 충진하면서 완전히 밀봉하였다. 110℃의 가열 블록(HB-96D, Daihan Scientific Co., Ltd, 서울, 한국)에서 24시간 동안 가수분해하였다. 가수분해한 시료를 3G-글라스 필터로 여과하고 50℃ 이하에서 회전진공증발기(N-1110, Eyela, Tokyo, Japan)로 완전히 농축하였다. 5㎖의 아미노산 자동분석용 로딩 완충용액(pH 2.2)으로 정용하고 0.20㎛ 실린더형 필터로 여과한 후 아미노산 자동분석기(Biochrom 30, Biochrom, Cambridge, UK)에 40㎕를 주입하여 분석프로그램에 따라 아미노산 조성을 분석하였다.
5. in vitro 글루타민 합성 효소(GS) 활성화 효과 확인
생쥐의 mPFC lysate에 과산화아질산염(peroxynitrite; PN) 및 반응물들을 넣고 잘 섞은 후, 5분 동안 얼음에 그대로 두었다. 각 반응당 1㎕ 분해물+1㎕ PN(최종적으로 10배 농도) + 1㎕의 가수분해물(최종적으로, 10배 농도) + 7㎕의 GS 분해 완충용액(50mM 이미다졸, pH 6.8)의 반응물들을 혼합하였다. 5분 동안 혼합물을 얼음에서 반응시킨 뒤에 40㎕의 GS 분해 완충용액 및 50㎕의 GS 어세이 완충용액(50mM 이미다졸-HCl, pH 6.8, 25mM L-글루타민, 12.5mM 히드록실아민, 12.5mM 비산 나트륨(sodium arsenate), 1mM MnCl2 및 0.08mM ADP)를 넣고 30~60분 동안 37℃에서 반응시켰다. 100㎕ 정지 완충용액(90mM FeCl3, 1.8N HCl 및 1.45% TCA)를 넣어 반응을 끝내고, 마이크로 플레이트 리더기를 이용하여 560nm에서 흡광도를 측정하였다. GS 활성도는 최종 생산물인 γ-글루타밀하이드록사메이트(γ-glutamylhydroxamate)의 생성량으로 표현하였고, 단위는 μM/min/㎍ 단백질이다.
[통계분석]
표준편차, 분산분석, 회귀분석의 통계처리와 실험설계는 통계 프로그램JMP(ver. 12, SAS Institute, Cary, NC, USA)를 사용하여 수행하였다.
실시예 1. 가수분해물의 제조와 가수분해 조건의 최적화
가수분해 효소를 결정하기 위하여, 2단 가수분해 조건을 설정하여 반응시간 50℃, pH 7.5 및 반응시간 15~120분에서 대두 분리 단백질의 가수분해도와 가수분해물을 획득하였다. 이후, 흡광도를 이용한 피브린용해활성 시험(Anson 법)을 이용하여 상기 획득한 대두 분리 단백질의 가수분해물 중에서 티로신 또는 티로신 잔기를 포함하는 펩티드 함량을 측정하였다.
그 결과, 단일 효소를 사용하여 가수분해할 때 플라보르자임(Flavourzyme)을 제외한 알칼라아제(Alcalase), 프로타맥스(Protamex) 및 뉴트라아제(Neutrase)의 가수분해도는 큰 차이를 보이지 않았으나, 초기 가수분해도는 알칼라아제가 비교적 높았으며 60분 이후에는 감소하였다(도 1). 상기 결과는 알칼라아제의 최적 pH 범위는 pH 7-9의 범위로서 가수분해도가 증가함에 따라 가수분해물의 수소이온농도 증가로 최적 pH 범위 이하로 급격히 감소하기 때문인 것으로 추정하였다. 알칼라아제는 프로타맥스 가수분해도와 큰 차이를 보이지 않으나, 효소의 가격이 비교적 저렴하여 산업적으로 사용 빈도가 가장 높은 효소이다.
한편 2가지 효소를 혼합하여 가수분해도를 측정한 결과, 알칼라아제+프로타맥스 혼합효소(A+P)의 가수분해도가 상대적으로 높았으며, 뉴트라아제+플라보르자임 또는 뉴트라아제+알칼라아제의 가수분해도가 상대적으로 낮았다(도 2). 플라보르자임를 혼합했을 때, 가수분해도가 다른 혼합효소 군에 비하여 낮은 것은 플라보르자임이 엔도(endo)형 및 엑소(exo)형이기 때문인 것으로 판단하였다. 복합효소로서 플라보르자임을 포함시키는 경우는 가수분해 절편의 말단 아미노산을 절단하여 가수분해물 유래 쓴맛 제거의 용도로 사용하고 있다.
또한, Anson 법으로, 단일효소와 복합 효소를 사용하여 반응시간에 따른 티로신 함량을 측정하였다. 단일효소를 사용할 경우, 티로신 생성량은 알칼라아제와 프로타맥스를 사용하였을 때, 상대적으로 높은 생성량을 보이고, 플라보르자임을 사용한 경우는 상대적으로 티로신 생성량이 낮은 것으로 나타났다(도 3).
60분의 반응시간에서는 처리한 복합효소 조합에 따른 티로신 생성량은 알칼라아제+프로타맥스 및 알칼라아제+뉴트라아제 복합효소를 처리한 경우, 티로신 생성량이 현저하였으나, 120분의 반응시간에서는 복합효소 종류에 따른 티로신 생성량의 차이가 없었다(도 4).
한편, 뉴트라아제는 국내에서 거의 사용하지 않기 때문에 별도의 주문이 필요하였다. 복합효소를 사용하는 경우는 각 효소의 최적 온도와 pH를 적용할 필요가 있으므로, 2단 가수분해가 필요하게 되어 단위공정이 복잡하였으나, 가수분해 절편의 말단기 절단을 통해 맛을 개선할 필요가 있다면 플라보르자임을 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명의 궁극적 목적은 글루타민 합성효소(glutamine synthetase)의 활성화를 위하여, 티로신(Tyr)을 고함량으로 포함하는 저분자 펩티드를 생산하는 것이다. 따라서 티로신 생성량이 많고, 단위공정이 간단한 '알칼라아제' 단일 효소 및 가수분해물의 쓴맛을 제거하기 위하여, '알칼라아제+플라보르자임' 복합효소를 채택하여 가수분해 조건의 최적화를 실시하였다.
가수분해 조건의 최적화는 독립변수로서, 1-3%의 효소 대 기질비, 50-70℃의 온도범위, pH 6-8의 범위에서, 알칼라아제와 알칼라아제+플라보르자임 복합효소의 각각 60분 및 90분으로 설정하여 Box-Benken 법으로 표면반응 분석을 실시하였다(표 1 및 2).
Box-Benken 법에 따른 알칼라아제 가수분해물의 최적 가수분해를 위한 실험설계
실험번호 알칼라아제, % 온도, ℃ pH 단백질, g/100g Tyr, g/100g
1 1 50 7 10.24 0.72
2 1 60 6 10.36 0.69
3 1 60 8 11.17 0.84
4 1 70 7 10.37 0.68
5 2 50 6 9.76 0.57
6 2 50 8 10.60 0.85
7 2 60 7 9.98 0.74
8 2 60 7 9.84 0.70
9 2 60 7 9.79 0.70
10 2 70 6 9.19 0.58
11 2 70 8 11.47 1.01
12 3 50 7 8.89 0.62
13 3 60 6 8.98 0.57
14 3 60 8 10.92 0.82
15 3 70 7 9.72 0.68
Box-Benken 법에 따른 복합효소를 사용한 가수분해물의 최적 가수분해를 위한 실험설계
실험번호 알칼라아제+플라보르자임, % 온도, ℃ pH 단백질, g/100g Tyr, g/100g
1 1 50 7 11.23 0.69
2 1 60 6 11.32 0.57
3 1 60 8 11.76 0.87
4 1 70 7 11.25 0.73
5 2 50 6 11.40 0.66
6 2 50 8 11.28 0.95
7 2 60 7 11.23 0.68
8 2 60 7 11.13 0.69
9 2 60 7 11.40 0.69
10 2 70 6 11.15 0.38
11 2 70 8 11.46 0.91
12 3 50 7 10.50 0.66
13 3 60 6 10.86 0.61
14 3 60 8 11.22 0.94
15 3 70 7 11.28 0.70
알칼라아제 단독 가수분해물의 단백질 함량과 티로신 함량은 가수분해 조건에 따라 변화를 보였으나, 알칼라아제와 플라보르자임 복합효소를 사용한 가수분해물의 단백질 함량은 큰 차이를 보이지 않았다. 효소 대 기질 농도, 반응온도 및 pH 값 모두 반응 값인 가수분해물의 단백질 농도에 유의적인 상관관계를 보였다(p<0.05). 알칼라아제 농도 1%, 65℃, pH 8에서 단백질 농도는 11.33g/100g 이었다(도 5).
한편 반응값 티로신 함량에 대하여 알칼라아제 농도와 pH가 유의적인 상관을 보였다(p<0.05). 가수분해 최적조건은 알칼라아제 농도 1.5%, 반응온도 60℃, pH 8.0이었으며, 이때 티로신 함량은 0.88g/100g이었다(도 6).
알칼라아제와 플라보르자임 복합효소를 사용한 가수분해물은 복합효소 농도만 유의적인 상관을 보였고(p<0.05), 효소 농도 1%, 반응온도 65℃, pH 8.0에서 단백질 농도는 11.63g/100g 이었다(도 7).
한편 티로신 농도는 pH만 유의적인 상관을 보였고(p<0.05) 효소농도 1%, 반응온도 60℃, pH 8.0으로 반응온도에 차이가 있었다(도 8).
실시예 2. 스케일-업 표준 제조 공정
스케일-업 공정은 확인한 최적 가수분해 조건에서 가수분해 시간을 1시간에서 2시간으로 연장하였다(표 3).
대두 분리 단백질로부터 Tyr이 풍부한 분획물을 획득하기 위한 가수분해 및 분획의 조건
단계 단계별 과정(Unit process) 설명(Description)
가수분해 가공하지 않은 원료를 반응탱크에 투입 - 대두 분리 단백질 투입(SPI, 15kg)
- 정제수 투입(180kg)
가수분해 - 1.5%(v/v) 알칼라아제(alcalase) 첨가
- 60℃, pH8.0, 2시간 동안 30rpm으로 교반하여 혼합 반응시킴
비활성화 - 30분 동안 90℃에서 프로테아제 비활성화시킴
상온으로 냉각
여과 - 60 메쉬스크린으로 여과
건조
(동결 또는 스프레이)
티로신-풍부 분획 건조한 파우더(가수분해물) 칼럼에 장착 - SPI 가수분해물 준비: 110g 가수분해물/0.01M의 HCl 2ℓ
- 4000rpm/20분 원심분리하여 상등액 취함
- SP SepFast 6HF가 패킹된 칼럼에 상기 상등액 로딩함(pH3.2)
1차 용출 - 25mM 시트르산 나트륨(pH3.2)으로 pH3.2 분획물 용출
2차 용출 - 25mM 시트르산 나트륨(pH6.4)으로 pH6.4 분획물 용출
농축 -80℃에서 분획물 농축
건조
(동결 또는 스프레이)
상기한 바, 반응시간의 연장은 대형 반응조에서의 열전달 시간을 고려하였으며, 알칼라아제 가수분해물 제조 시에 반응시간이 1시간(60분)인데 대비하여, 반응시간이 2시간(120분) 일때, 단백질 함량과 티로신 함량은 다소 감소하였으나, 가수분해에 따른 산업화 공정의 단순화 및 경제성 측면에서 적절한 것으로 판단하였다.
실시예 3. 구성 아미노산의 조성비 분석과 GS 활성화 효능
(1) 구성 아미노산의 조성비 분석
대두 분리 단백질과 각 분획물의 아미노산 조성을 분석하였다. pH 3.2 분획물은 대두 분리 단백질 가수분해물에 비하여 프롤린(proline) 및 메티오닌(methionine)의 함량이 다소 증가한 반면, 글루탐산(glutamic acid), 류신(leucine), 리신(lysine) 및 아르기닌(arginine)은 다소 감소하였고, 티로신 함량이 크게 증가하였다.
한편, pH 6.4 분획물의 총 아미노산 함량은 pH 3.2 분획물에 비하여 약 10배에 해당하였다. 아미노산의 구성비를 비교해보면, pH 3.2 분획물에 비하여 염기성 아미노산의 구성비가 증가하였다.
대두분리 단백질의 가수분해물의 pH 분획에 따른 아미노산 조성비
아미노산 SPI 가수분해물 pH3.2 분획물 pH6.4 분획물
평균±표준편차(g/g) %(w/w) 평균±표준편차
(g/g)		 %(w/w) 평균±표준편차
(g/g)		 %(w/w)
Asp 0.080±0.000 10.53 0.080±0.000 10.66 0.627±0.000 8.09
Thr 0.032±0.000 4.23 0.037±0.000 5.00 0.319±0.001 4.12
Ser 0.043±0.000 5.61 0.036±0.000 4.82 0.368±0.001 4.75
Glu 0.143±0.000 18.84 0.117±0.001 15.70 1.111±0.003 14.34
Pro 0.050±0.000 6.60 0.076±0.001 10.12 0.686±0.008 8.86
Gly 0.033±0.000 4.41 0.037±0.000 5.02 0.327±0.000 4.22
Ala 0.033±0.000 4.36 0.036±0.000 4.76 0.337±0.000 4.35
1/2Cys 0.004±0.000 0.49 0.007±0.000 0.96 0.031±0.000 0.40
Val 0.031±0.000 4.09 0.024±0.001 3.24 0.281±0.000 3.36
Met 0.008±0.000 1.06 0.014±0.001 1.93 0.098±0.000 1.27
Ile 0.033±0.000 4.37 0.036±0.001 4.85 0.346±0.001 4.47
Leu 0.054±0.000 7.06 0.045±0.000 6.04 0.550±0.000 7.10
Tyr 0.023±0.000 3.08 0.039±0.000 5.20 0.363±0.002 4.69
Phe 0.042±0.000 5.57 0.046±0.000 6.11 0.504±0.011 6.51
His 0.023±0.000 3.07 0.025±0.000 3.29 0.363±0.002 4.68
Lys 0.051±0.000 6.69 0.031±0.000 4.20 0.541±0.010 6.99
NH3 0.011±0.000 1.45 0.006±0.000 0.84 0.088±0.000 1.14
Arg 0.065±0.000 8.49 0.055±0.000 7.31 0.806±0.001 10.40
Total 0.760±0.002 100.00 0.746±0.001 100.03 7.746±0.011 100.00
(2) 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 확인
2종의 굴가수분해물(PNY, TGPN) 및 4종의 대두 가수분해물(Alc/Alc, Alc/Fla, Alc 3.2 분획물, Alc 6.4 분획물)을 처리하여, GS 활성을 확인하였다(도 9).
분말 형태로 제공된 Alc/Alc 및 Alc/Fla는 20mM의 시트르산 완충용액(citrate buffer)에 녹였고, 모든 가수분해물들은 최종농도 0.39mg/ml로 실험을 수행하였다. 굴 가수분해물인 PNY, TGPN과 Alcalase 및 복합효소 Alcalase와 Flavourzyme 가수분해물은 GS 활성을 증가시키지 못했으나, Alcalase 가수분해물의 pH 3.2 및 6.4 분획물은 GS 활성을 크게 증가시켰다. 특히 pH 6.4 분획물(Alc6.4)은 1.0mM과 0.1mM PN 처리 군에서 펩티드 Tyr-Gln(YQ)의 활성에 상응하는 활성을 보였다.

Claims (7)

  1. (1) 가수분해 효소를 이용하여 대두 분리 단백질(Soy Protein Isolate)을 저분자 혼합 펩티드로 가수분해하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1) 이후에, 가수분해 효소를 불활성화 시키고, 여과 및 건조시켜 대두 분리 단백질의 가수분해물을 획득하는 단계; 및
    (3) pH3.0~3.4 또는 pH6.2~6.6의 조건에서 이온교환크로마토그래피 기법으로 상기 단계 (2)에서 획득한 가수분해물의 분획물을 획득하는 단계;를 포함하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 가수분해 효소는 알칼라아제(Alcalase), 프로타맥스(Protamex), 뉴트라아제(Neutrase) 및 플라보르자임(Flavourzyme) 중에서 선택된 하나 또는 두개의 복합 효소인 것을 특징으로 하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 획득한 저분자 혼합 펩티드는 400kDa 이하의 저분자 혼합 펩티드인 것을 특징으로 하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서, 상기 단계 (1)에서 가수분해는 온도가 40~70℃이고, pH7~9인 조건으로 1~3시간 동안 가수분해하는 것을 특징으로 하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 단계 (3)에서 이온교환크로마토그래피 기법은 양이온 교환(cation exchange) 크로마토그래피인 것을 특징으로 하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    (1) 대두 분리 단백질(Soy Protein Isolate)에 1~2%(w/v) 농도가 되도록 알칼라아제(Alcalase)를 첨가하여 40~70℃, pH7~9인 조건으로 1~3시간 동안 400kDa 이하의 저분자 혼합 펩티드로 가수분해하는 단계;
    (2) 상기 단계 (1) 이후에, 가수분해 효소를 불활성화 시키고, 여과 및 건조시켜 대두 분리 단백질의 가수분해물을 획득하는 단계; 및
    (3) pH3.0~3.4 또는 pH6.2~6.6의 조건에서 양이온 교환 크로마토그래피 기법으로 상기 단계 (2)에서 획득한 가수분해물을 시트르산과 함께 용출시켜 분획물을 획득하는 단계;를 포함하는 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드의 제조방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중에서 선택된 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 글루타민 합성 효소(GS)의 활성화 효능 및 티로신 함량이 증진된 대두 분리 단백질의 가수분해 펩티드.
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