KR102936498B1 - 보론산-함유 시클로 rgd 유도체 및 이의 용도 - Google Patents

보론산-함유 시클로 rgd 유도체 및 이의 용도

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Abstract

본 발명은 보론산-함유 시클로 RGD 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것으로서,
본 발명에 의해 종양에 대한 결합 친화도가 높은 붕소중성자포획치료 및 중성자포획치료를 기대할 수 있다.

Description

보론산-함유 시클로 RGD 유도체 및 이의 용도{Boronic acid-containing cyclo RGD derivatives and uses thereof}
본 발명의 일예는, 보론산-함유 시클로 RGD 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 관한 것이다.
중성자 포획 치료법(Neutron Capture Therapy, NCT)은 정상세포의 손상을 최소화하고 암세포만을 선택적으로 사멸시키는 차세대 암치료기술로서, 암세포뿐만 아니라 정상세포까지 손상을 입히는 항암치료의 부작용을 해결하기 위해 도입된 치료법이다. 열중성자는 에너지가 낮아 약물이 축적된 세포에만 선택적으로 핵분열 반응을 일으키기 때문에, 중성자 포획 치료법은 기존의 방사선 요법에 비해 암 치료에 매우 효과적인 기술이다. 그러므로 암세포에 선택적으로 많은 양의 약물이 축적되게 하는 것이 중성자 포획 치료 기술의 핵심이다.
중성자를 포획하여 종양치료용 방사선을 방출하는 원자는 가돌리늄(Gd)과 붕소(B)가 대표적이다. 붕소의 경우는 중성자 포획 반응 후 알파입자를 발생시키는데 비정거리가 약 5~7 ㎛ 정도로 붕소약물에 인접한 암세포를 죽인다. 가돌리늄의 경우는 중성자 포획 반응 후 고에너지 감마선과 전자를 발생시키는데 비정거리가 10 cm 정도로 주변의 암세포까지 파괴할 수 있다.
10B를 함유한 표지체가 최상의 치료 효과를 나타내기 위해서는 여러 기준을 충족해야 한다. 예를 들어, 표지체는 종양 세포 내에서 오랜 시간 유지되어야 하며, 종양 조직에 특이성을 보여야 건강한 세포에 비해 종양 세포 내에서 높은 농도를 달성할 수 있다. 더불어, 체내 독성이 무시할 만큼 낮아야 하고 높은 수용성을 가져야 한다. 마지막으로, 종양 내에서 10B 농도가 최고치에 도달할 때 매우 정밀한 열 중성자가 조사되어야 한다.
현재 임상 시험 중인 BNCT 약물은 L-boronophenylalanine (L-BPA)과 disodium mercaptoundecahydro-closo-dodecaborate (BSH) 두 가지 뿐인데, 두 붕소 전구체 모두 특이성이 낮고 주사 후 빠르게 씻겨나가는 특성 때문에 표적 종양 전체에 치료용량의 10B를 효과적으로 전달하는 데에 최적이 아니었다. 따라서 보다 정교한 종양 특이적인 10B 함유 제제를 개발하는 것이 매우 중요하다.
종양 세포에 선택적으로 축적되는 약물을 만들기 위해 종양 세포에 특이적으로 많이 발현되는 세포 표면의 수용체(receptor)를 이용할 수 있다. 그 중 하나인 인테그린 단백질은 세포의 고착(adhesion)이나 이동 등에 관여하는 α 및 β 서브유닛으로 구성된 단백질 복합체로서, 세포 사이의 상호작용을 매개한다. 또한 세포 조직의 초기 발달에도 관여하며, 염증, 혈액 응고, 세포 운동 등에도 인테그린 단백질의 기능이 필요하며, 세포에 따라 여러 가지 종류가 존재한다.
최근 인테그린의 활용을 통해 암 진단 및 치료 분야에서 상당한 진전이 이루어지고 있는데, 인테그린 중에서 αvβ3는 여러 종양에서 혈관 신생 중 초기 내피 세포에서 과발현되기 때문에 주요 표적으로 주목받고 있다.
비트로넥틴 수용체(vitronectin receptor)라고 불리는 αvβ3 인테그린은 정상 혈관내피세포에서는 거의 발현되지 않고 암세포의 신생혈관 형성시에 발현되며 RGD(Arg-Gly-Asp) 시퀀스를 가지는 펩타이드와 결합하는 특징이 있다. 종양 선택성 펩타이드인 RGD는 종양혈관에 선택적으로 결합하는 특성으로 인해 종양 치료에 적용하는 연구가 발표된 바 있다.
치료에 쓰이기 이전에 약물의 체내 동태를 파악하기 위한 목적으로 방사성동위원소를 결합시켜 사용할 수 있다. 이 때 양전자방출단층촬영기(Positron Emission Tomography, PET)가 이용될 수 있고, PET에 사용되는 방사성동위원소는 [18F]불소(fluoride), [64Cu]구리(copper), [68Ga]갈륨(gallium), [124I]요오드(iodine) 등이 있다. 이 중에서 [64Cu]구리(양전자 방출율, 약 34%)는 농축 Ni-64에 사이클로트론에 의해 가속된 양성자들을 빔 형태로 조사시켜 Ni-64(p,n)Cu-64 핵반응으로 얻을 수 있으며, 임상적 사용을 위해 분리, 정제된 Cu-64는 음전하를 지닌 킬레이트와 쉽게 배위 결합할 수 있다. 또한 Cu-64의 물리적 특성상 12.7 시간의 반감기를 가지므로 기존의 2 시간 이내의 단반감기 방사성동위원소 표지 방사성의약품으로서는 얻을 수 없었던 주사 후 오랜 시간 경과 후의 영상을 얻을 수 있는 장점이 있다.
약물의 체내 동태를 파악하기 위한 목적으로 가돌리늄을 결합시켜 사용할 경우 자기공명영상(Magnetic Resonance Imaging, MRI)용 조영제로 이용될 수 있다.
1. Darshan Vyas, Mital Patel, Sarika Wairkar, Strategies for active tumor targeting-an update. Eur. J. Pharmacol., 2022, 915, 174512.
이에, 본 발명은
하기 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 2에서, 리간드는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DTPA(Diethylene triamine penta acetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA(1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecaneN,N',N'',N'''-tetraacetic acid), TE3A(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid), TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid), 사이클렌(Cyclen) 및 DFOM(Deferrioxamine)으로 이루어진 군에서 선택된다.
또한, 본 발명은
하기 화학식 3의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 진단용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에서, 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 M은 64Cu2+, Gd, 68Ga, 89Zr으로 이루어진 군에서 선택된다.
또한, 본 발명은
하기 화학식 3의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에서, 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 M은 64Cu2+, 67Cu, 177Lu, 90Y로 이루어진 군에서 선택된다.
또한, 본 발명은
상기 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는, 붕소중성자포획치료용 의약품을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은
상기 종양의 진단용 약학 조성물을 포함하는, 종양의 진단용 조영제를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은
아르기닌, 글리신, 아스파르트산, 라이신 및 NH2-Phe(4-Bpin)-OH hydrochloride를 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 1]
또한, 본 발명은
상기 제조방법에 의해 제조된 화학식 1의 화합물에, DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되는 리간드와 아미드 결합 반응시키는 단계를 더 포함하는, 하기 화학식 2의 화합물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 2]
또한, 본 발명은
상기 제조방법에 의해 제조된 화학식 2의 화합물을 64Cu2+ 용액과 반응시키는 단계를 더 포함하는, 하기 화학식 3의 화합물의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
[화학식 3]
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은
하기 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 2에서, 리간드는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DTPA(Diethylene triamine penta acetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA(1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecaneN,N',N'',N'''-tetraacetic acid), TE3A(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid), TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid), 사이클렌(Cyclen) 및 DFOM(Deferrioxamine)으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 화학식 2의 상기 리간드는 라이신과 아미드 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 종양은 뇌 종양일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 붕소중성자포획치료용 의약품으로 사용되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은
하기 화학식 3의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 진단용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에서, 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 M은 64Cu2+, Gd, 68Ga, 89Zr으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 화학식 3의 상기 리간드는 라이신과 아미드 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 종양은 뇌 종양일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 M이 64Cu2+인 경우 핵의학영상용 조영제로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 M이 Gd인 경우 자기공명영상용 조영제로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 M이 68Ga 또는 89Zr인 경우 양전자방출단층촬영용 조영제로 사용되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은
하기 화학식 3의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에서, 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 M은 64Cu2+, 67Cu, 177Lu, 90Y로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 화학식 3의 상기 리간드는 라이신과 아미드 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 종양은 뇌 종양일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 붕소중성자포획치료용 의약품으로 사용되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은
상기 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는, 붕소중성자포획치료용 의약품을 제공한다.
또한, 본 발명은
상기 종양의 진단용 약학 조성물을 포함하는, 종양의 진단용 조영제를 제공한다.
또한, 본 발명은
아르기닌, 글리신, 아스파르트산, 라이신 및 NH2-Phe(4-Bpin)-OH hydrochloride를 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
또한, 본 발명은
상기 제조방법에 의해 제조된 화학식 1의 화합물에, DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되는 리간드와 아미드 결합 반응시키는 단계를 더 포함하는, 하기 화학식 2의 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 2]
또한, 본 발명은
상기 제조방법에 의해 제조된 화학식 2의 화합물을 64Cu2+ 용액과 반응시키는 단계를 더 포함하는, 하기 화학식 3의 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 3]
본 발명의 보론산-함유 시클로 RGD 유도체, 이의 제조방법 및 이의 용도에 의하여, 종양에 대한 결합 친화도가 높은 붕소중성자포획치료 및 중성자포획치료를 기대할 수 있다.
본 발명의 효과는 이상에서 언급한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 할 것이다.
도 1은 Cyclic RGD(BPA)K의 합성을 위해, NH2-D-Phe(4-Boronic acid)-OH로부터 Fmoc-D-Phe(4-Boronic acid)-OH를 거쳐 Fmoc-Phe(4-Bpin)-OH를 합성하는 경로를 나타낸 것이다.
도 2는 Fmoc-Phe(4-Bpin)-OH로부터 Cyclic RGD(BPA)K (화학식 1)을 합성하는 경로를 나타낸 것이다.
도 3은 Cyclic RGD(BPA)K의 합성 여부를 확인하기 위한 HPLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Cyclic RGD(BPA)K의 ESI 질량 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 Cyclic RGD(BPA)K로부터 Cyclic RGD(BPA)K(DOTA) (화학식 2)을 합성하는 경로를 나타낸 것이다.
도 6은 Cyclic RGD(BPA)K(DOTA)의 합성 여부를 확인하기 위한 HPLC 분석 결과이다.
도 7은 Cyclic RGD(BPA)K(DOTA)로부터 Cyclic RGD(BPA)K(DOTA)-64Cu (화학식 3)을 합성하는 경로를 나타낸 것이다.
도 8은 Cyclic RGD(BPA)K(DOTA)-64Cu의 합성 여부를 확인하기 위한 TLC 이미지이다.
도 9는 Cyclic RGD(D-BPA)K에 대하여 장기 및 종양별 붕소농도를 대조군(L-BPA-fructose)와 비교측정한 결과이다.
도 10은 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu 투여 후 얻은 시간별 PET/CT 영상 결과이다.
도 11은 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu의 종양에 축적되는 표적성을 대조군(Cyclic RGDyK(DOTA)-64Cu)과 비교하여 측정한 결과이다.
이하, 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명은
하기 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 1]
[화학식 2]
상기 화학식 2에서, 리간드는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DTPA(Diethylene triamine penta acetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA(1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecaneN,N',N'',N'''-tetraacetic acid), TE3A(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid), TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid), 사이클렌(Cyclen) 및 DFOM(Deferrioxamine)으로 이루어진 군에서 선택된다.
상기 용어 "입체 이성질체"란, 화합물과 동일한 분자식을 갖고 동일한 원자 서열 등을 갖지만 공간에서 원자의 3차원 방향이 다른 이성질체인 것을 의미한다. 상기 입체 이성질체는 부분 입체 이성질체(diasteromer) 또는 거울상 이성질체(enantiomer)일 수 있다. 부분 입체 이성질체는 거울상 관계가 아닌 입체 이성질체를 말하고, 원자의 공간 배열이 달라 생기는 시스(cis)-트랜스(trans) 이성질체로 나뉠 수 있다. 거울상 이성질체는 왼손과 오른손의 관계처럼 그 거울상과 겹쳐지지 않는 이성질체를 말하고, 광학 이성질체(optical isomer)라고도 한다. 거울상 이성질체는 키랄 중심 탄소에 4개 이상의 치환기가 서로 다른 경우 R(Rectus: 시계방향) 및 S(Sinister: 반시계 방향)로 구분한다.
상기 용어 "염"이란, 무기 및/또는 유기 산 및 염기로 형성된 산성 및/또는 염기성 염 형태를 의미한다. 일 구현예에 따라, 화합물의 염은 염이 침전하는 것과 같은 매질에 또는 수성 매질에서 본 발명의 화합물을 동등량과 같은 산또는 염기의 양과 반응시켜 형성될 수 있다.
상기 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"이란, 화합물의 원하는 생물학적 활성을 유지하고 최소를 나타내거나 원하지 않는 독성학적 효과를 나타내지 않는 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염, 수화물, 용매화물 또는 전구약물(프로드럭)을 의미할 수 있다.
상기 용어 "종양"이란, 인체의 세포가 여러 원인으로 인해 정상적인 통제에서 벗어나 비정상적으로 증식을 계속하여 자라는 것을 의미한다. 종양에는 양성 종양과 악성 종양(암)이 있는데, 악성 종양이 암을 의미한다.
상기 용어 "영상화"란, X-선, 자기 공명 영상, 초음파 등을 사용하여 화합물이나 약물의 분자 구조, 환자의 내부 상태를 시각적으로 보여주는 것을 의미한다. 이는 질병의 진단 및 치료 계획 수립에 중요한 과정 중 하나이다.
상기 용어 "리간드(Ligand)"란, 화학적으로 금속 이온과 결합하여 복합체를 형성하는 분자로서, 특정 수용체와 결합하여 다양한 생리 활성을 조절하며, 이들 간의 세포 간 정보 교환을 통해 개체 발생, 성장 신호 전달, 면역 및 내분비 조절, 개체의 항상성 유지 등 생리 반응이 조절한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 화학식 2의 상기 리간드는 라이신과 아미드 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 종양은 뇌 종양일 수 있다.
상기 용어 "뇌 종양"이란, 두개골 안에서 만들어지는 종양으로, 뇌나 척주관 안의 종양을 두루 가리키며 뇌질과 뇌막에 발생하는 종양의 총칭이다. 이는 뇌세포에서 자란 종양, 혈관을 비롯한 신경, 뇌막 등에서 발생하여 두개골 내에서 발육하는 신생물을 모두 포괄한다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 붕소중성자포획치료용 의약품으로 사용되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은
하기 화학식 3의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 진단용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에서, 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 M은 64Cu2+, Gd, 68Ga, 89Zr으로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 화학식 3의 상기 리간드는 라이신과 아미드 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 종양은 뇌 종양일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 M이 64Cu2+인 경우 핵의학영상용 조영제로 사용되는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 M이 Gd인 경우 자기공명영상용 조영제로 사용되는 것일 수 있다.
상기 용어 "자기공명영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging)"이란, 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용해 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보를 영상으로 얻는 방법으로서 현재 살아있는 사람이나 동물의 신체기 관을 비침습적이며 실시간 영상화할 수 있는 현재까지 가장 뛰어난 영상 진단 장비중의 하나이다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 M이 68Ga 또는 89Zr인 경우 양전자방출단층촬영용 조영제로 사용되는 것일 수 있다.
상기 용어 "양전자방출단층촬영(Positron Emission Tomography, PET)"이란, 핵의학 검사 방법 중 하나로서, 양전자를 방출하는 방사성 동위원소를 결합한 의약품을 체내에 주입하고 양전자 방출 단층 촬영기를 이용하여 이를 추적하여 체내 분포를 알아보는 방법이다.
양전자 방출 단층 촬영의 가장 큰 장점은 뇌 조직에 혈액 공급 상태와 산소 및 포도당 대사를 볼 수 있다는 점과, 뇌의 영역별 활동량을 짧은 시간 동안 측정할 수 있다는 점이 있다.
또한, 본 발명은
하기 화학식 3의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
[화학식 3]
상기 화학식 3에서, 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되고,
상기 M은 64Cu2+, 67Cu, 177Lu, 90Y로 이루어진 군에서 선택된다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 화학식 3의 상기 리간드는 라이신과 아미드 결합되어 있는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 구현예로, 상기 종양은 뇌 종양일 수 있다.
본 발명의 또 다른 구현예로, 상기 조성물은 붕소중성자포획치료용 의약품으로 사용되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은
상기 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 포함하는, 붕소중성자포획치료용 의약품을 제공한다.
또한, 본 발명은
상기 종양의 진단용 약학 조성물을 포함하는, 종양의 진단용 조영제를 제공한다.
또한, 본 발명은
아르기닌, 글리신, 아스파르트산, 라이신 및 NH2-Phe(4-Bpin)-OH hydrochloride를 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 1]
상기 용어 "Fmoc 고체상 합성법"이란, 펩타이드 및 단백질의 합성에 사용되는 합성방법으로서, Fmoc은 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐(9-fluorenylmethylcarbonyl, Fmoc)의 약어로, 아미노산의 N-끝에 보호기로 사용된다.
Fmoc 고체상 합성법의 주요 단계는 다음과 같다.
ⅰ) 고체상 지지체에 Fmoc으로 보호된 첫 번째 아미노산을 고정한다.
ⅱ) 다음 아미노산을 추가하기 전에, Fmoc 보호기를 제거하여 자유 아미노기를 노출시킨다.
ⅲ) Fmoc으로 보호된 새로운 아미노산을 추가한다. 이 아미노산은 이미 지지체에 결합된 아미노산의 카르복시기와 결합한다.
ⅳ) 반복적으로 Fmoc 보호기를 제거하고 Fmoc으로 보호된 새로운 아미노산을 추가하여 원하는 길이의 펩타이드를 형성한다.
ⅴ) 마지막 아미노산을 추가한 후에는 펩타이드를 지지체에서 분리하고 보호기를 제거하여 최종 제품을 얻는다.
이 방법은 반응이 고체상에서 진행되기 때문에 반응의 균일성이 높으며, 반응물을 철저히 세척하고 정제할 필요가 없고, 자동 합성기와 함께 사용될 수 있어 자동화된 합성 프로세스를 가능하게 한다는 장점이 있다.
또한, 본 발명은
상기 제조방법에 의해 제조된 화학식 1의 화합물에, DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되는 리간드와 아미드 결합 반응시키는 단계를 더 포함하는, 하기 화학식 2의 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 2]
또한, 본 발명은
상기 제조방법에 의해 제조된 화학식 2의 화합물을 64Cu2+ 용액과 반응시키는 단계를 더 포함하는, 하기 화학식 3의 화합물의 제조방법을 제공한다.
[화학식 3]
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명하기로 한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 발명이 속하는 기술분야에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
[실시예]
실시예 1. 실험재료 및 방법
(1) 실험 일반
모든 화학 시약은 Sigma-Aldrich (St, Louis, MO, USA) 또는 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan)에서 구입하였으며 추가 정제 없이 사용하였다.
모든 작업에는 이온교환수 처리된 (Deionized, DI) 정제수가 사용하였다.
1H 핵자기 공명(NMR) 스펙트럼은 Advance Neo 400 MHz 분광계(Bruker)를 사용하여 측정하였다.
전기분무 이온화 질량 분석( Electrospray ionization mass spectrometry, ESI-MS)은 ISQ EM 모델(Thermo Scientific) 질량 분석기를 사용하여 수행하였다.
정제 및 분석은 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC, Waters) 시스템을 사용하여 수행하였다. DOTA-cRGD(D-BPA)K의 정제 방법은 0.1 % 트리플루오로아세트산(Trifluoroacetic acid, TFA)과 아세토니트릴(Acetonitrile, MeCN)을 포함하는 용리액을 사용하였으며, 0-3분 동안 0에서 5% MeCN; 3-20분 동안 5에서 65% MeCN의 그라디언트를 사용하였다. 흐름 속도는 12 mL/분이며, 220 nm 파장에서 검출되었다. Merck LiChroCART C18 칼럼(20 x 250 mm, 입자 크기 5 um)을 사용하였다.
[64Cu]Cu-DOTA-cRGD(D-BPA)K의 정제 방법은 동일하며, 1 mL/분의 흐름 속도와 gamma 검출기에서 검출되었다. YMC-Pack C18 칼럼(4.6 x 250 mm, 입자 크기 5 um)을 사용하여 동일한 그라디언트와 흐름 속도 1 mL/분으로 동일한 화합물의 순도 테스트를 수행하였다.
방사성 라벨링된 화합물의 in vitro 안정성은 Eckert & Ziegler radio-thin-layer-chromatography (TLC) scanner (model: AR-2000)를 사용하여 모니터링하였다.
바이오 분포 연구는 DooYeol Biotech(대한민국, 서울)에서 제공한 U87MG 종양을 가진 투명쥐에서 수행하였다. 각 장기에 축적된 방사능은 PerkinElmer automatic gamma counter (model: 2480 automatic gamma counter)를 사용하여 정량하였다.
PET 이미지는 Mediso nanoScan PET 시스템을 사용하여 촬영하였다.
ICPMS 데이터는 Agilent 7900 ICP-MS를 사용하여 획득하였다.
모든 동물 실험은 KIRAMS 동물 복지 위원회에서 승인되었으며 대한민국 동물 보호법에 명시된 지침을 완전히 준수하여 수행하였다.
(2) L-BPA-fructose 용액의 제조
L-BPA-fructose 용액은 종래 알려진 방법을 따라 제조하였다. L-BPA (50 mg)와 D-(-)-fructose (65 mg)를 DI 정제수에 용해하고, 1 M NaOH 용액 276 μL을 첨가하였다. 완전히 용해될 때까지 저어가며, pH는 1 M HCl 용액을 사용하여 7.6으로 조절되었다. 원액은 0.22 μM 주사 필터를 통해 여과되었고, 추가적인 물이 첨가되어 최종 농도가 30 mg/mL이 되도록 조절되었다.
(3) in vitro 안정성 평가 64Cu-1
in vitro 안정성을 평가하기 위해 정제된 64Cu-1 샘플 (750 kBq / 10μL)을 500 μL의 PBS, 인간 혈청 (90 %), 및 마우스 혈청 (90 %)에 37 ℃에서 24 시간 동안 첨가하였다. 방사성 라벨링된 화합물의 안정성은 다양한 시간 간격으로 방사성-박층크로마토그래피 시스템을 사용하여 평가하였다(n = 3). 결과는 시간에 따른 방사성 안정성의 백분율로 표시하였다.
(4) 세포 배양 및 세포 독성 시험
인간 뇌종양 세포 U87MG(Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Corning, VA, USA)에 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS, JR Scientific Inc., USA) 및 1% 항생제-항균제(Gibco, USA)를 첨가하여 배양하였다. 세포는 37 ℃에서 5 % CO2 하에서 배양되었다. 세포 독성을 평가하기 위해, U87MG 세포를 성장 배지에 1 x 104 개의 밀도로 96구 플레이트에 파종하고 하룻밤 동안 배양하였다. 성장 배지를 제거하고 cRGD(D-BPA)K (다양한 농도 : 0, 10, 50, 100, 200 및 400 μM)를 첨가하고 세포와 함께 세중 배양된 DMEM에서 22 시간 동안 체내 배양하였다. 세포 생존률은 제조업체의 규약에 따라 e CCK-8 kit (Dong-In Biotech Co. Ltd., Seoul, South Korea)를 사용하여 측정하였다. 각 웰에 CCK-8 용액 (10 uL)을 첨가하고 2 시간 동안 추가로 배양하였다. 샘플의 흡광도는 450 nm에서 검출되었다.
(5) 세포 흡수 시험
수확된 U87MG 세포 (1 x 106)는 64Cu-1 (0.0124 μg, 0.0120 nmol, 462 kBq) 또는 64Cu-DOTA-cRGDyK (0.0120 μg, 0.0119 nmol)가 첨가된 DMEM 혈청 감소 배지에 첨가되었다. 각 시간 지점 (배양 후 30 분 및 2 시간)에서 세포는 차가운 PBS로 세 번 씻어내고, 분리된 세포의 방사능을 감마 카운터로 측정하였다. 세포 내 64Cu 라벨된 펩타이드의 흡수는 % ID (세포 내 카운트 / 총 카운트)로 표시되었다. 결과는 평균 ± 표준 편차로 표시되었다 (n = 3).
(6) U87MG 이식 모델의 준비
모든 동물 실험은 한국 방사선의학과 의학 연구원의 기관 지침에 따라 수행되었다 (승인 번호 : KIRAMS2022-0145). U87MG 세포는 무세럼 MEM 배지에 다시 분주되었다. Balb/c 투명 마우스 (6 주령, 수컷, 체중 20-22 g)는 2 % 이소플루란으로 마취되고 오른쪽 허벅지에 7 x 106 개의 세포가 피하 내로 주입되었다. 접종 후 2-3 주 후에 마우스가 in vivo 평가에 사용되었다.
(7) In vivo PET 이미징
동물 PET 이미지는 ananimal PET scanner (nanoScan; Mediso, Hungary)를 사용하여 획득하였다. U87MG 종양을 가진 마우스 (n=4)에게 꼬리 정맥을 통해 64Cu-1 (7.4 MBq/100 uL 생리식염수)를 주입하였다. 주사 후 0.5, 1, 3, 5, 7 및 20 시간 후에 30분 간의 정적 PET 스캔이 수행되었으며, 이후 3D-OSEM 알고리즘을 사용하여 4 회 반복 및 6 개 하위 그룹을 사용하여 재구성되었다. 주입 당 그램당 주입된 용량 (%ID/g)은 Inter View FUSION 소프트웨어를 사용하여 뇌, 간, 신장, 근육 및 종양의 관심 영역(ROI)에서 분석되었다.
(8) In vivo 생체 분포
각 시간 그룹 (n = 4)의 U87MG 종양을 가진 마우스에게 cRGD(D-BPA)K 또는 L-BPA-fructose (0.04 mmol/ 마우스)를 정맥주사로 주입하였다. 1 시간 후, 마우스를 마취하였고 심장 절개를 통해 혈액을 채취하였다. 그 후 뇌, 간, 신장, 근육 및 종양을 제거하였다. 혈액과 각 장기는 HNO3 (70 %)로 소화되어 100 ℃에서 1 시간 동안 처리되었으며, HNO3 (3 %) 용액으로 희석되었다. 각 장기의 보론 농도는 플라즈마 질량 분광법 (ICP-MS)을 사용하여 측정하였다.
실시예 2. 화학식 1의 Cyclic RGD(BPA)K 합성
(1) Fmoc-D-Phe(4-Bpin)-OH의 합성
Cyclic RGD(BPA)K의 합성을 위해, NH2-D-Phe(4-Boronic acid)-OH로부터 Fmoc-D-Phe(4-Boronic acid)-OH를 거쳐 Fmoc-Phe(4-Bpin)-OH를 합성하였으며, 그 합성경로를 도 1에 나타내었다.
1) Fmoc-D-Phe(4-Boronic acid)-OH의 합성
NH2-D-Phe(4-Boronic acid)-OH (820 mg, 3.92 mmol), sodium carbonate (624 mg, 5.88 mmol)을 water (30 mL)에 녹이고, Fmoc-OSu (1.46 g, 4.32 mmol)을 1,4-dixoane (30 mL)에 녹인 용액을 천천히 넣었다. 실온에서 18 시간동안 교반한 후, 감압하에서 1,4-dioxane을 농축하였다. 물층을 diethyl ether로 washing한 후에 2N HCl(aq.)로 pH를 3~4로 조정하였다. 물층을 Ethyl acetate로 추출 후, Na2SO4로 건조하였다. 유기층을 감압 하에서 농축하여 white solid의 Fmoc-Phe(4-Boronic acid)-OH (1.24 g, 73%)을 얻었고, 추가 정제 없이 다음 스텝에 사용하였다. 1H NMR(400 MHz, MeOH-d4)δ 7.80 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.61 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.34 - 7.24 (m, 4H), 4.52-4.44 (m, 1H), 4.36-4.15 (m, 3H), 3.25 (dd, J = 4.8, 14.0 Hz, 1H), 3.02-2.94 (m, 1H); ESI-MS (ESI+) m/z 454.3 [M+Na]+.
2) Fmoc-D-Phe(4-Bpin)-OH의 합성
Fmoc-Phe(4-Boronic acid)-OH (1.065 g, 2.5 mmol)에 THF/Toluene (6 mL, 1/3 (v/v))에 넣고, pinacol (321 mg, 2.7 mmol)을 THF/Toluene (2 mL, 1/3 (v/v))에 녹인 용액을 넣었다. 반응 혼합물을 40 ℃에서 15 분간 가열한 후, 감압 하에서 농축하였다. THF/Toluene (6 mL, 1/3 (v/v))에 녹인 반응혼합물을 40 oC에서 10분간 가열, 농축과정을 두 번 더 반복한 후, 최종 반응혼합물을 high-vacuum에서 4 시간 동안 건조하였다. 얻어진 Curde는 CO2H silica-gel column chromatography (3% MeOH/Dichloromethane)하여 white foamy solid (1.176 g, 93%)로서 Fmoc-D-Phe(4-Bpin)-OH을 얻었다. 1H NMR (400MHz, CDCl3) δ 7.80-7.73 (m, 4H), 7.54 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.40 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 7.34 - 7.27 (m, 2H), 7.22-7.16 (m, 2H), 5.50 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.47 (q, J = 6.0 Hz, 1H), 4.50-4.30 (m, 2H), 4.25-4.10 (m, 1H), 3.20 (ddd, J = 5.6, 14.0, 36.8 Hz, 2H), 1.34 (s, 12H); ESI-MS (ESI+) m/z 514.4 [M+H]+.
(2) Cyclic RGD(BPA)K의 합성
Fmoc-Phe(4-Bpin)-OH로부터 Cyclic RGD(BPA)K을 합성하였으며, 그 합성경로를 도 2에 나타내었다.
1) Solid phase peptide synthesis
2-Chlorotrityl chloride resin (0.968 mmol/g, 100~200 mesh)을 사용하여 순차적으로 펩타이드를 합성하였고, 모든 coupling은 3 당량의 N-Fmoc protection된 아미노산과 TBTU, HOBt, DIPEA를 사용하여 수행하였다. 각 coupling 반응은 Kaiser test로 모니터링하였고, Fmoc deprotection은 20 % piperidine/DMF로 진행하였다. Coupling과 deprotection 반응 후, Resin을 DMF와 DCM으로 철저히 washing하였고, Resin으로부터의 cleavage는 cocktail solution (AcOH/TFE/DCM = 3/1/16)으로 수행하였다. Cleavage된 H-Asp(OtBu)-D-Phe(4-Bpin)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-OH는 추가 정제없이 다음 스텝에 사용하였다.
2) Cyclic Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe(4-Bpin)-Lys(Boc)
Crude의 H-Asp(OtBu)-D-Phe(4-BPin)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Gly-OH acetate (2.47 g, 2 mmol)을 DMF (400 mL, 5 mmol/L)에 녹인 후, NaHCO3(853 mg, 5 mmol), DPPA(1.32 mL, 3 mmol)을 순차적으로 넣고 실온에서 20 시간 동안 교반하였다. Water (200 mL)을 넣어 반응을 quenching하고, 감압 하에서 농축하였다. 농축된 반응 혼합물에 water를 넣어 생성된 고체를 필터하고 얻어진 고체는 silica-gel column chromatography (10 % MeOH/Dichloromethane)하여 옅은 노란색 고체로서 Cyclic Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-Phe(4-Bpin)-Lys(Boc) (1.368 g)을 얻었다. 1H NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ 7.67 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.50-6.40 (m, 1H), 4.77-4.70 (m, 1H), 4.60-4.54 (m, 1H), 4.25-4.16 (m, 2H), 3.96 (dd, J = 4.0, 6.4 Hz, 1H), 3.35-3.30 (m, 2H), 3.20-3.10 (m, 2H), 3.05-2.85 (m, 8H), 2.74 (dd, J = 8.0, 16.0 Hz, 1H), 2.56 (s, 3H), 2.50 (s, 3H), 2.55-2.45 (m, 1H), 2.08 (s, 3H), 1.90-1.55 (m, 6H), 1.48-1.38 (m, 24 H), 1.33 (s, 12H); ESI-MS (ESI+) m/z 1138.8 [M+H]+.
3) Cyclic RGD(D-BPA)K (Cyclic Arg-Gly-Asp-BPA-Lys)
Cyclic Arg(Pbf)-Gly-Asp(OtBu)-D-Phe(4-Bpin)-Lys(Boc) (1.36 g, 1.2 mol)을 TFA/water (80 mL, 95/5)에 녹인 후, 실온에서 18 시간동안 교반하였다. 감압 하에서 농축한 후, 과량의 diethyl ether를 넣어 생성된 고체를 필터하였다. 얻어진 고체는 C18 silica-gel column chromatography (5 ~ 10 % Acetonitrile/Water, 0.1 % TFA)로 정제 후, 동결건조하여 흰색의 고체로서 Cyclic RGD(D-BPA)K trifluoroacetate (856 mg)을 얻었다. ESI-MS (ESI+) m/z 648.6 [M+H]+.
Cyclic RGD(BPA)K의 합성 여부를 확인하기 위해 HPLC를 수행하였고, 도 3에 나타낸 바와 같이, 성공적으로 합성 및 분리된 것을 확인하였다.
시료 내의 Cyclic RGD(BPA)K의 존재 여부를 확인하기 위해 ESI 질량분석을 수행하였고, 도 4에 나타낸 바와 같이, Cyclic RGD(BPA)K이 가장 많은 비중을 차지하는 것을 확인하였다.
실시예 3. 화학식 2의 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)의 합성
Cyclic RGD(BPA)K로부터 Cyclic RGD(BPA)K(DOTA)을 합성하였으며, 그 합성경로를 도 5에 나타내었다.
Cyclic RGD(D-BPA)K (28 mg, 37 umol)을 DMF (1.5 mL, anhydrous) 에 녹인 후, DIPEA (46 uL, 265 umol)을 넣는다. DOTA-NHS ester (42 mg, 55 umol)을 DMF (1 mL)에 녹인 용액을 천천히 가한 후, 실온에서 2 시간동안 교반하였다. HPLC, ESI-MS 로 monitoring 하여 cyclic RGD(D-BPA)K 가 사라진 것을 확인 후에, water (0.1% TFA) 2.5 mL을 넣어 반응을 종결하였다. 감압 하에서 용매를 제거한 후, diethyl ether를 넣어 침전을 유도한 후, centrifuge하여 고체를 얻었다. 얻어진 고체는 prep-HPLC로 정제 및 동결건조하여 흰색의 고체로 cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA) (22 mg)을 얻었다. ESI-MS (ESI+) m/z = 1034.8 [M+H]+, 1056.7 [M+Na]+.
Cyclic RGD(BPA)K(DOTA)의 합성 여부를 확인하기 위해 HPLC를 수행하였고, 도 6에 나타낸 바와 같이, 성공적으로 합성 및 분리된 것을 확인하였다.
실시예 4. 화학식 3의 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)- 64 Cu 의 합성
Cyclic RGD(BPA)K(DOTA)로부터 Cyclic RGD(BPA)K(DOTA)-64Cu을 합성하였으며, 그 합성경로를 도 7에 나타내었다.
사이클로트론으로부터 생산된 64Cu를 실험에 필요한 방사능량에 따라 적절하게 취득한 뒤(0.1 mCi 이상) 64Cu 용액을 적절한 유리용기에 담아 질소를 가해주면서 100 ℃에서 건조시켰다. 건조된 64Cu는 0.01 M 의 HCl solution 에 녹이고, cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)를 0.1 M 의 NaOAc solution (pH 5-6) 에 녹여 100 μg/0.1 mL 정도를 취득하여 상기 64Cu 용액에 혼합시켜 80 ℃에서 15분간 표지 반응을 진행시켰다. 반응 이후에 표지되지 않은 64Cu 및 반응 중 발생한 불순물을 제거하기 위해 C18 카트리지를 통과시킨 후 얻어진 상기 최종 물질인 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu를 박막 크로마토그래피에 흡착시켜 전개액(0.1 M 시트레이트 버퍼용액)으로 충분히 전개하였고, 그 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 방사화학적인 순도 100%를 확인하였다.
실시예 5. 화학식 1의 Cyclic RGD(D-BPA)K의 종양 축적량 확인
Cyclic RGD(D-BPA)K의 체내 분포 양상을 확인하기 위하여 인간 신경교모세포종(U87MG) 종양을 가진 마우스의 꼬리정맥을 통해 Cyclic RGD(D-BPA)K (0.04 mmol/mouse)를 주입하여 주사 후 1시간에 각 장기별 붕소 농도를 ICP-MS (350D, Perkin Elmer) 장비를 이용하여 확인하였다.
Tumor/blood(혈액 대비 종양에서의 축적 비율) 및 Tumor/muscle(근육 대비 종양에서의 축적 비율) 값은 치료 중 정상 장기를 보호하는 데 중요한 역할을 하며, 일반적으로 2.5를 초과할 것이 요구된다.
Tumor/blood(혈액 대비 종양에서의 축적 비율) 및 Tumor/muscle(근육 대비 종양에서의 축적 비율) 값을 측정한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 대조군인 BPA-fructose의 Tumor/blood 및 Tumor/muscle 값은 각각 1.34 및 1.56으로 2.5에 미치지 못하지만, Cyclic RGD(D-BPA)K의 Tumor/blood 및 Tumor/muscle 값은 각각 2.46과 2.41로 요구되는 임계값에 근접하는 수치를 보임을 나타냈다.
이 결과는 대조군인 BPA-fructose과는 달리, Cyclic RGD(D-BPA)K은 인체에 안전하다는 것을 나타내는 결과이다.
또한, Tumor/brain(뇌 대비 종양에서의 축적 비율) 값은 13.40으로서, 대조군인 BPA-fructose의 3.57에 비하여 약 3.75배 높은 값을 보였고, 이 결과는 Cyclic RGD(D-BPA)K이 뛰어난 조영제로서의 효과를 가진다는 점을 나타내는 결과이다.
실시예 6. 화학식 3의 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)- 64 Cu의 in-vitro 혈청 안정성 (serum stability) 측정
Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu의 사람 혈청 및 마우스 혈청 내 안정성을 측정하였다. Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu (0.1 mCi)를 사람 혈청 및 마우스 혈청 (0.5 mL)에 섞고 37 ℃에서 배양하였다. 측정하고자 하는 시간대 (1.5 시간, 3 시간, 22 시간) 에 TLC를 실시하였다. 시간대별 혈청 내 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu의 안정성 측정 결과를 하기 [표 1]에 나타내었다.
1.5 h 3 h 22 h
Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu Human Serum 97.2 % 94.6 % 95.9 %
Mouse Serum 94.9 % 97.3 % 94.9 %
그 결과, 모든 실험 시간대에서 90 % 이상의 순도를 보인다는 점을 알 수 있고, 이는 사람 혈청 및 마우스 혈청에서 22 시간까지 안정함을 증명한 결과이다.
실시예 7. 화학식 3의 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)- 64 Cu 의 PET 영상
PET 영상은 다중 PET/CT 시스템 (nanoScan, Mediso Ltd)으로 촬영하였다. 악성 신경교종 세포주인 U87MG 세포를 누드마우스 우측 허벅지에 피하 주입하여 종양을 만들었다. 종양을 가진 마우스 (nude mouse, 20 g) 의 꼬리정맥을 통해 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu 0.2 mCi를 주사하여 PET/CT 영상을 획득하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다. CT 영상은 같은 위치에서 촬영하여 PET 영상에 접합하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu을 투여한 후에 종양 부위에서 30분째에 3.5±0.6, 1 시간째에 2.9±0.2, 3 시간째에 2.1±0.3 %ID/g 의 Cu-64 신호가 측정되는 것을 확인하였다.
또한, 비교실험데이터를 얻기 위하여, 대조군인 Cyclic RGDyK(DOTA)-64Cu 0.2 mCi를 종양을 가진 마우스 (nude mouse, 20 g) 의 꼬리정맥을 통해 주사하여 PET/CT 영상을 획득하였다. CT 영상은 같은 위치에서 촬영하여 PET 영상에 접합하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 실험군인 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu 와 대조군인 Cyclic RGDyK(DOTA)-64Cu 을 각각 투여하고 1시간 후에 획득한 PET 영상에서, 종양 부위에서 각각 2.9±0.2 와 2.3±1.5 %ID/g의 신호가 측정되는 것을 확인하였다.
이 결과는 대조군인 Cyclic RGDyK(DOTA)-64Cu에 비하여, BPA 구조를 포함시킨 본 발명의 화합물 Cyclic RGD(D-BPA)K(DOTA)-64Cu가 종양에 축적되는 표적성이 더 높다는 점을 나타내는 결과이다.
이러한 결과들을 통해, 본 발명의 화합물이 종양 특이적으로 축적 효율이 높아, 종양 특이적인 영상화/조영제로서 유용하게 이용될 수 있다는 점을 확인하였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1의 화합물, 화학식 2의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 1]

    [화학식 2]

    상기 화학식 2에서, 리간드는 DOTA(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7,10-tetraacetic acid), DTPA(Diethylene triamine penta acetic acid), DO3A(1,4,7,10-tetraazacyclododecane-1,4,7-triacetic acid), NOTA(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid), NODAGA(1,4,7-Triazacyclononane,1-glutaric acid-4,7-acetic acid), TETA(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecaneN,N',N'',N'''-tetraacetic acid), TE3A(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane-1,4,8-triacetic acid), TE2A(1,4,8,11-Tetraazabicyclohexadecane-4,11-diacetic acid), PCTA(3,6,9,15-tetraazabicyclo[9.3.1]pentadeca-1,11,13-triene-3,6,9,-triacetic acid), 사이클렌(Cyclen) 및 DFOM(Deferrioxamine)으로 이루어진 군에서 선택된다.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 화학식 2의 상기 리간드는 라이신과 아미드 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 종양은 뇌 종양인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 청구항 1에 있어서,
    상기 조성물은 붕소중성자포획치료용 의약품으로 사용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  5. 하기 화학식 3의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 진단용 약학 조성물.
    [화학식 3]

    상기 화학식 3에서, 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되고,
    상기 M은 64Cu2+, Gd, 68Ga, 89Zr으로 이루어진 군에서 선택된다.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 화학식 3의 상기 리간드는 라이신과 아미드 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 청구항 5에 있어서,
    상기 종양은 뇌 종양인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  8. 청구항 5에 있어서,
    상기 M이 64Cu2+인 경우 핵의학영상용 조영제로 사용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. 청구항 5에 있어서,
    상기 M이 Gd인 경우 자기공명영상용 조영제로 사용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  10. 청구항 5에 있어서,
    상기 M이 68Ga 또는 89Zr인 경우 양전자방출단층촬영용 조영제로 사용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  11. 하기 화학식 3의 화합물, 이의 입체 이성질체, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는, 종양의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
    [화학식 3]

    상기 화학식 3에서, 리간드는 DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되고,
    상기 M은 64Cu2+, 67Cu, 177Lu, 90Y로 이루어진 군에서 선택된다.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 화학식 3의 상기 리간드는 라이신과 아미드 결합되어 있는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  13. 청구항 11에 있어서,
    상기 종양은 뇌 종양인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  14. 청구항 11에 있어서,
    상기 조성물은 붕소중성자포획치료용 의약품으로 사용되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  15. 청구항 1 내지 4, 또는 청구항 11 내지 14 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 붕소중성자포획치료용 의약품.
  16. 청구항 5 내지 10 중 어느 한 항의 조성물을 포함하는, 종양의 진단용 조영제.
  17. 아르기닌, 글리신, 아스파르트산, 라이신 및 NH2-Phe(4-Bpin)-OH hydrochloride를 Fmoc 고체상 합성법에 의해 펩티드 결합 반응시키는 단계를 포함하는, 하기 화학식 1의 화합물의 제조방법.
    [화학식 1]

  18. 청구항 17의 제조방법에 의해 제조된 화학식 1의 화합물에, DOTA, DTPA, DO3A, NOTA, NODAGA, TETA, TE3A, TE2A, PCTA, 사이클렌 및 DFOM으로 이루어진 군에서 선택되는 리간드와 아미드 결합 반응시키는 단계를 더 포함하는, 하기 화학식 2의 화합물의 제조방법.
    [화학식 2]

  19. 청구항 18의 제조방법에 의해 제조된 화학식 2의 화합물을 64Cu2+ 용액과 반응시키는 단계를 더 포함하는, 하기 화학식 3의 화합물의 제조방법.
    [화학식 3]

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손준호, "붕소 중성자 포획 치료를 위한 암세포 표적 리간드 매개 붕소 전달체 연구", 서울대학교 융합과학기술대학원 분자의학 및 바이오제약학과, 이학석사 학위논문, 2023년2월

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