KR102995657B1 - Pten 억제제를 포함하는 소포 및 이의 용도 - Google Patents

Pten 억제제를 포함하는 소포 및 이의 용도

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KR102995657B1
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Abstract

본 발명은 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 엑소좀으로 지칭되는 것을 포함하는 세포외 소포를 포함하는 막 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 세포외 소포를 사용하여 신경 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법이 제공된다. 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 단리된 세포외 소포가 또한 제공된다.

Description

PTEN 억제제를 포함하는 소포 및 이의 용도
본 발명은 PTEN 억제제가 로딩된 막 소포, 소포를 포함하는 약제학적 조성물, 및 신경 장애의 치료에서의 이들의 용도, 보다 특히 외인성 PTEN 억제제가 로딩된 (loaded) 세포-유래 세포외 소포, 이들을 포함하는 약제학적 조성물 및 척수 손상의 치료를 위한 이들의 용도에 관한 것이다.
척수에 대한 손상은 자율신경 기능장애, 감각 상실 또는 이동성 상실을 초래할 수 있다. 이러한 척수 손상 (SCI)은 외상, 종양, 허혈, 발달 장애, 신경퇴행성 질환, 탈수초성 질환 (demyelinative disease), 횡단 척수염 (transverse myelitis), 혈관 기형 (vascular malformation) 또는 기타 원인에 의해 발생된다. SCI의 결과는 손상의 특정한 성질 및 척수를 따른 이의 위치에 따라 좌우된다. 또한, SCI는 동적 과정이기 때문에, 모든 급성 척수 증후군 (acute cord syndrome)에서 초기에는 전체 손상 정도가 명확하지 않을 수 있다. 불완전한 척수 병변은 더 완전한 병변으로 발전할 수 있다; 보다 흔히, 손상 수준은 초기 사건 이후 수 시간 내지 수 일 동안 척추 수준을 1 내지 2 올린다. 병리생리학적 사건의 복잡한 캐스케이드가 이러한 임상적 악화를 설명한다.
SCI의 심리적 및 사회적 영향은 종종 대단히 파괴적이다. SCI와 관련된 일반적인 장애 상태 중 일부는 사지의 영구 마비, 만성 통증, 근육 위축, 방광 및 장에 대한 자발적 조절 상실, 성기능 장애 및 불임이다.
최근 신경과학의 발전은 SCI에 대한 연구에 상당한 관심을 끌었으며 훨씬 더 나은 치료 및 재활 옵션을 사용할 수 있게 만들었다. 예를 들면, 기능적 전기 자극 (Functional electrical stimulation; FES)은 신경 재생을 강화하고 SCI 후 기능 용량을 회복 및 개선하는데 있어 상당한 개선을 가능하게 하는 잠재력을 보여 주었다. 그러나, 척수 손상이 있는 모든 환자가 FES에 해당되는 것은 아니며 (척수의 완전한 병변이 있어야 함); 환자는 신경학적으로 안정한 상태에 있어야 하고; 외인성 전기 자극에 반응하려면 말초 신경이 손상되지 않아야 한다.
SCI 이후의 축삭 재생은 성숙한 뉴런의 본질적인 극히 제한된 성장 능력 및 또한 시간 경과에 따른 신경교 흉터 성숙 및 억제 분자와 같은 외인성 인자로 인해 제한된다. 외인성 인자를 수정하려는 시도가 있었지만, 성공은 제한적이다. 예를 들면, 세포외 억제 분자 제거, 신경영양 인자 전달, 또는 허용 기질 이식은 손상된 피질척수로 (corticospinal tract)의 강력한 재생을 유도하지 못했다.
포스파타제 및 텐신 동족체 (Phosphatase and tensin homolog; PTEN)는 고도로 보존된 이중-특이성 단백질 티로신 포스파타제이다. 단백질은 지질 2차 전달자 포스파티딜이노시톨 3,4,5-트리스포스페이트 [PI(3,4,5)P3] 및 포스파티딜이노시톨 3,4-비스포스페이트 [PI(3,4)P2]를 탈인산화하여 각각 포스파티딜이노시톨 4,5-비스포스페이트 [PI(4,5)P2] 및 포스파티딜이노시톨 4-포스페이트 [PI(4)P]를 생성한다. 이러한 독특한 활성이 PTEN을 주요 항상성 조절제 및 종양 억제제 단백질로 만들며, 이 기능은 체세포 변화의 결과로 매우 다양한 종양에서 부재하거나 결함이 있다. 세포 성장, 재생 및 생존에 있어서의 PI3K/AKT/mTOR 신호전달 경로의 중요한 역할이 PTEN의 치료적 표적화에 대한 근거를 뒷받침한다. 제안된 PTEN 억제-기반 치료 표적 중에는 손상 또는 부상 후 신경 성장 및 재생, 심장 허혈/재관류 및 관련 질환의 치료, 상처 복구, 및 불임이 있다 (문헌 참조; Pulido, 2018, Molecules, 23, 285). 흥미롭게도, PTEN이 암에 관여하는 주요 패러다임은 암 억제제로서이며, PTEN 억제가 뇌 전이에서 발생할 수 있는 것으로 나타났다 (Zhang et al., Nature, 2015, 527, 100-104).
PTEN은 성인 뇌의 뉴런에서 우선적으로 발현되며, 포유류 라파마이신 표적 (mammalian target of rapamycin; mTOR) 활성의 하향조절을 통해 피질척수 뉴런의 재생을 제어하는데 중요한 역할을 한다. mTOR 활성은 축삭절단된 성인 뉴런에서 심하게 억제되어, 지속적인 축삭 재생에 필요한 새로운 단백질 합성을 제한한다. 몇몇 공보들은 신경 재생의 억제에 있어서 PTEN의 관여를 언급하고 다른 공보들은 축삭 손상 또는 장애와 관련된 병태에 대한 PTEN 고갈의 긍정적인 효과를 보여주었다. PTEN의 효과적인 억제는 mTOR를 증가시켜 신경 재생을 촉진하는 후보자가 될 것이다.
제WO 2009/117389호는 신경퇴행성 장애를 치료하기 위한 PTEN의 억제제의 치료적 용도를 기술한다. 제WO 2015/066701호는 손상된 신경에서 또는 그 근처에서 PTEN 억제 펩티드를 투여함으로써 신경을 재생하거나 신경 퇴화를 약화시키는 방법을 기술한다. 제WO 2011/044701호는 특정 PTEN 억제 펩티드 및 중추 신경계의 질병 및 손상을 포함하여 세포독성 스트레스와 관련된 질병을 치료하는데 있어서의 이들의 용도를 기술한다.
그 중에서도 리포솜, 단백질 입자, 미셀, 및 지질 입자를 포함한 siRNA 분자를 전달하는데 유용한 것으로 제안된 수많은 비히클이 있다. Rungta 등 (Molecular Therapy- Nucleic Acids, 2013, 2, e136)은 지질 나노입자 (LNP)의 siRNA가 뉴런 유전자 발현을 효과적으로 침묵시킬 수 있음을 보여주었다.
세포외 막 소포 (EV)는 여러 유형의 세포에 의해 분비되는 막 소포이다. EV는 정상적인 생리적 조건하에서 혈액 순환에 존재하며 이들의 수준은 당뇨병 및 관련 혈관 합병증, 심혈관 질환, 혈액학적 악성 종양 및 고형 종양과 같은 다양한 질환에서 증가된다.
EV는 세 개의 하위집단으로 나눌 수 있다: (I) 30-100 nm의 직경을 갖고 엔도솜 구획으로부터 유도되는 엑소좀; (II) "소포형성 (vesiculation)"을 통해 세포 표면으로부터 방출되는 100nm-1μm의 직경을 갖는 미세소포; 및 (III) 1-5 μm의 직경을 갖고 세포사멸 세포로부터 방출되는 세포 사멸체. EV는 단백질, DNA 단편, 마이크로 RNA 및 mRNA를 포함한 모 세포의 여러 요소를 함유한다.
제EP 2254586호는 중간엽 줄기 세포로부터 단리된 엑소좀에 관한 것이며, 상기 엑소좀은 중간엽 줄기 세포의 적어도 하나의 생물학적 특성을 포함한다. 또한, 엑소좀은 소분자 및 비-코딩 RNA를 포함한 여러 약물의 운반체로서 제안되었다 (예를 들어, 참조; US 2017/0247708 and Ha et al., Acta Pharmaceutica Sinica B 2016;6(4):287-296). 전형적으로, siRNA는 전기천공에 의해 엑소좀에 도입된다.
본 출원의 발명자들 중 일부의 제WO2018/033911호는 신경학적 장애의 치료를 위한 중간엽 줄기 세포 유래 엑소좀을 교시한다.
일반적으로 신경세포의 부상 및 특히 척수 손상 (SCI)은 손상 자체에 뒤따르는 이차 사건의 길고 복잡한 캐스케이드를 수반한다. 캐스케이드의 복잡성은 제안된 치료의 효율에 영향을 미칠 수 있으며 SCI를 치료하기 위한 추가의 안전하고 효율적이며 편리한 방법을 개발해야 할 필요성이 여전히 충족되지 않은채 남아 있다.
하나의 측면에 따르면, 본 발명은 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 신경학적 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 추가의 측면에 따르면 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 막 입자의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여 신경학적 질환 또는 병태를 치료함을 포함하여, 이를 필요로 하는 대상체에서 신경학적 질환, 장애 또는 병태를 치료하는 방법이 제공된다. 일부 실시양태에 따르면, 막 입자는 세포로부터 유래된 세포외 소포이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 단리된 세포외 소포를 제공한다.
상기 측면들 중의 어느 하나에 따르면, 세포외 소포는 엑소좀, 미세소포, 막 입자, 막 소포, 엑토좀 및 외부소포 (exovesicles)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 기술된 실시양태의 추가의 특징에 따르면, 입자는 엑소좀을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 엑소좀과 미세소포의 조합이다. 일부 실시양태에 따르면, 엑소좀과 같은 세포외 소포는 중간엽 마커를 발현하는 부착 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에 따르면, 중간엽 마커를 발현하는 부착 세포는 중간엽 줄기 세포, 구강 점막 줄기 세포 또는 후각 초성 세포로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 엑소좀과 같은 세포외 소포는 신경 능선 세포로부터의 마커를 발현하는 부착 세포로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, 신경 능선 세포는 두개골 신경 능선 세포를 포함한다. 기술된 실시양태의 추가의 특징에 따르면, 두개골 신경 능선 세포는 치수 줄기 세포 (dental pulp stem cells; DPSCs), 탈락 유치 줄기 세포 (exfoliated deciduous teeth stem cells; SHED), 치주 인대 줄기 세포 (periodontal ligament stem cells; PDLSCs), 치근단 유두 줄기 세포 (apical papilla stem cells; SCAP) 및 치낭 전구 세포 (dental follicle progenitor cells; DFPCs)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 상기 측면 및 실시양태 중 어느 하나에 따르면, 세포외 소포는 단리된 세포외 소포이다. 일부 측면 및 실시양태에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 무세포 조성물이다.
상기 측면 및 실시양태 중 어느 하나에 따르면, PTEN 억제제는 PTEN 발현의 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 억제제를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 RNA 간섭 올리고뉴클레오티드이다. 일부 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 PTEN에 대해 지시된 siRNA이다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 인간 PTEN 단백질을 암호화하는 핵산에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드 억제제는 소수성 모이어티를 포함한다. 특정 실시양태에 따르면, 소수성 모이어티는 스테롤, 강글리오시드, 지질, 비타민, 지방산, 펩티드, 또는 이들의 조합이다. 일부 실시양태에 따르면, 소수성 모이어티는 스테롤이다. 일부 실시양태에 따르면, 스테롤은 콜레스테롤을 포함한다.
기술된 측면 또는 실시양태 중의 어느 하나의 추가의 특징에 따르면, PTEN 억제제는 펩티드 억제제를 포함한다.
일부 상기 측면 및 실시양태에 따르면, 신경학적 질환은 신경퇴행성 질환이다. 또 다른 측면 및 실시양태에 따르면, 신경학적 병태는 척수 손상이다. 일부 상기 측면 및 실시양태에 따르면, 척수 손상을 치료하는 것은 약제학적 조성물 또는 단리된 세포외 소포를 이를 필요로 하는 대상체에게 투여함을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 투여는 비강내 투여를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 치료는 치료적 유효량의 콘드로이티나제 ABC 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 대상체에게 투여함을 추가로 포함한다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및/또는 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 바와 유사하거나 동등한 방법 및 재료가 본 발명의 실시양태의 실시 또는 시험에 사용될 수 있지만, 예시적인 방법 및/또는 재료는 아래에 기술된다. 상충되는 경우, 정의를 포함한 특허 명세서가 우선할 것이다. 또한, 재료, 방법 및 실시예는 예시일 뿐이며 반드시 제한하려는 것은 아니다.
본 발명의 일부 실시양태는 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 본원에 기술된다. 이하 도면을 상세하게 구체적으로 참조하면, 나타낸 세부사항은 예로서 본 발명의 실시양태의 예시적인 논의를 목적으로 한다는 것이 강조된다. 이와 관련하여, 도면과 함께 취해진 설명은 본 발명의 실시양태가 어떻게 실행될 수 있는지를 당업계의 숙련가들에게 명백하게 한다.
도 1은 Cryo-TEM에 의한 MSC-Exo의 시각화를 보여준다.
도 2는 손상된 래트 (상부 패널) 및 건강한 래트 (하부 패널)에서 모든 CNS 조직의 마이크로-CT 스캐닝을 보여준다. 도면은 엑소좀이 혈액-뇌 장벽을 가로질러 척수 병변에 도달한다는 것을 보여준다.
도 3은 건강한 래트 및 손상된 래트에서 FAAS를 사용하여 CNS (좌측 패널) 및 주요 기관 (우측 패널)에서 유도 결합 플라스마 (ICP) 평가를 사용한 GNP-엑소좀의 비강내 투여시 금-나노입자 (GNP)의 정량화를 보여준다. *p<0.05, ***p<0.001.
도 4는 손상되지 않은 래트 및 손상된 래트에서 PKH26 표지된 엑소좀 (PKH26-Exo)을 사용한 T10 척수 분절에서 PKH26 평균 신호 강도의 정량화를 보여준다. **p<0.01.
도 5는 뉴런, 성상 세포 및 활성화된 소교 세포로 공동-국재화된 PKH26-Exo 신호의 정량화를 보여준다 (p<0.01)
도 6은 엑소좀과 함께 배양된 Cy3-태그된 자가-전달 가능한 MAPK-siRNA의 NanoSight 분석을 보여준다. 도면은 비-형광 엑소좀 (회색)과 Cy3-엑소좀 (흑색)의 크기 분포를 보여준다.
도 7은 대조군 (중간) (도 7a), 비-표적 대조군 siRNA (도 7b), MSC-Exo (도 7c), PTEN-siRNA (도 7d) 또는 ExoPTEN (도 7e)로 처리된 배근 신경절 (DRG) 뉴런의 대표적인 면역형광 염색 이미지를 보여준다. 기준자, 100 μm.
도 8은 모든 그룹에 걸친 분기 수준에 대한 분기점의 수를 보여준다. IMARIS 소프트웨어에 의해 정량된 중간 분기 수준에서의 분기점의 수를 그룹간에 비교하였다. 중간 분기 수준에서, PTEN-siRNA-엑소좀은 모든 다른 그룹보다 유의적으로 더 많은 수의 신경돌기 분기점 (neurite branch point)을 촉진시켰다.
도 9는 모든 그룹에서 측정되고 비교된 총 신경돌기 길이 (도 9a), 신경돌기 개수 (도 9b), 분기점의 수 (도 9c), 및 최대 분기 수준 (도 9d)을 보여준다.
도 10은 ExoPTEN의 비강내 투여시 SCI 부위 및 간에서의 단백질 및 mRNA 발현을 보여준다. 도 10a 및 10b는 비처리된 SCI 래트와 비교하여 엑소좀 (IN)-처리된 래트 및 ExoPTEN (IN)-처리된 래트에서 각각 척수 및 간에서의 PTEN 단백질 발현을 보여준다. 도 10c 및 10d는 내부 대조군으로서 GAPDH를 사용하여 비처리, 엑소좀 (IN)-처리 및 ExoPTEN (IN)-처리된 SCI 래트에서 척수 및 간에서의 PTEN mRNA 발현의 RT-qPCR 분석을 보여준다. 데이터는 Kruskal-Wallis 다중 비교를 사용하여 평균 ± SEM으로 표시된다. IL; 병변내; IN: 비강내.
도 11은 비강내 ExoPTEN 처리가 운동, 감각 및 방광 회복을 유도함을 보여준다. 도 11a는 SCI 래트의 주간 Basso, Beattie, 및 Bresnahan (BBB) 운동 점수를 보여준다: 비처리 (n=15, 흑색), 또는 PTEN-siRNA (IL) (n=3), ExoPTEN (IL) (n=4), 엑소좀 (IN) (n=10), 또는 ExoPTEN (IN) (n=7)로 처리; IL: 병변내; IN: 비강내. 이원 ANOVA에 이은 Tukey의 다중 비교 검정 (횡절개 대조군과 ExoPTEN (IN) 간의 ***p<0.001, ****p<0.0001). 엑소좀 (IN)과 ExoPTEN (IN) 간의 #p<0.05, ##p<0.01, ###p<0.001. 도 11b는 8주 기간에 걸친 그룹당 BBB 운동 점수의 분포를 보여준다. 각 그룹의 각 래트가 달성한 최고 점수가 표시된다. 주어진 점수를 가진 래트의 수와 각 그룹의 래트의 총 수의 비율이 표현된다. 도 11c는 횡절개 대조군 또는 PTEN-siRNA (IL), ExoPTEN (IL), 엑소좀 (IN) 또는 ExoPTEN (IN)으로 처리된 래트에서의 평균 주간 체중 (±SEM)을 보여준다. 이원 ANOVA에 이은 Tukey의 다중 비교 검정. 횡절개 대조군과 ExoPTEN (IN) 간의 *p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001. 엑소좀 (IN)과 ExoPTEN (IN) 간의 #p < 0.05, ##p<0.01, ###p<0.001. 도 11d는 8주차에 그룹당 BBB 점수와 관련된 체중을 보여준다. R2로 표시된 Pearson 상관 계수를 계산하였으며, 이는 모든 그룹에 대해 BBB 점수와 체중 간의 높은 상관 관계를 보였다. 도 11e는 처리후 0, 4, 8주에서의 감각 회복의 퍼센트를 보여준다. 도 11f는 처리 개시로부터 자발적인 뇨의 반사 (urinary reflex)를 달성하기까지의 시간 (일)으로서 반영된 방광 기능을 보여준다. 도 11g는 수술후 3일부터 8주까지의 횡절개 후 래트의 이미지를 보여준다: 비처리 (상부 패널), 엑소좀-처리 (중간 패널) 및 PTEN-siRNA-엑소좀 처리 (하부 패널).
도 12는 처리된 래트와 비처리된 래트의 병변 영역에서 MRI 및 전기생리학 매개변수의 측정을 보여준다: 도 12a 및 도 12b는 각각 손상 진원지에 대해 4 mm 주둥이측 및 꼬리측의 단면적을 보여주고; 도 12c는 병변 내의 평균 부분 이방성 (FA) 값을 보여주고; 도 12d 및 도 12e는 엑소좀 (IN), ExoPTEN (IN) 또는 건강한 래트에서 운동-유발 전위 (motor-evoked potential)의 진폭 (도 12d) 및 대기 (도 12e)를 보여준다.
도 13은 비처리된 래트, 엑소좀으로 처리된 래트 및 ExoPTEN으로 처리된 래트의 세 그룹에서 면역형광 마커의 정량화 및 비교를 보여준다. 마커는 β-III-튜불린 (도 13a), CD11b (도 13b), GFAP (도 13c), 및 CD31 (도 13d)이다. 데이터는 평균 ± SEM, 및 일원 ANOVA에 이은 Tukey의 다중 비교 검정으로 표시된다 (*p<0.05, **p<0.01, ****p<0.0001).
도 14는 비처리 (상부 패널, n=3), 엑소좀-처리 (중간 패널, n=3) 및 ExoPTEN-처리 (하부 패널, n=2) SCI 래트에서 BDA-추적된 피질척수로 축삭의 대표적인 이미지를 보여준다. 기준자, 500 μm. 상자는 선택한 영역의 더 높은 배율을 보여준다. 흰색 화살표는 진원지에 대해 꼬리측 BDA-양성 섬유를 나타낸다. 기준자, 100 μm. 횡절개 대조군 또는 엑소좀 처리와 비교하여 비강내 ExoPTEN 처리 (상단 패널) 후에 훨씬 더 많은 양의 축삭 성장이 관찰되었다.
본 발명은, 이의 일부 실시양태에서, 신경 장애의 치료를 위한 외인성 PTEN 억제제가 로딩된 소포, 보다 구체적이지만 배타적이지는 않게, 척수 손상의 치료를 위한 PTEN 억제제가 로딩된 세포-유래 소포에 관한 것이다. 본 발명의 적어도 하나의 실시양태를 상세하게 설명하기 전에, 본 발명은 그 적용에서 반드시 하기 설명에 제시되거나 실시예에 의해 예시된 세부사항으로 제한되는 것은 아님을 이해해야 한다. 본 발명은 다른 실시양태가 가능하거나 다양한 방식으로 실행 또는 수행될 수 있다.
구체적으로, 본 발명자들은 엑소좀에 콜레스테롤-접합된 siRNA가 효율적으로 로딩될 수 있음을 입증하였다 (도 6). 실시예에 나타낸 바와 같이, 1/3 이상의 엑소좀에서 검출 가능한 양의 siRNA가 관찰되었다. 또한, PTEN-siRNA-로딩된 엑소좀은 시험관내 배근 신경절 뉴런의 강력한 축삭 재생을 촉진하였다 (도 7). 생체내 연구로 이동했을 때, 전체 중추 신경계의 조직학적 및 microCT 영상은 비강내 투여된 엑소좀이 혈액 뇌 장벽을 통과하여 척수 병변으로 귀소하고 병변의 뉴런에 의해 내재화되었음을 확인시켜 주었다 (도 2). 더욱 현저하게도, 비강내 PTEN-siRNA-로딩된 엑소좀은 성상세포증 및 소교세포증 감소를 동반한 강력한 축삭 재생 및 혈관신생을 촉진하였다 (도 13). 또한, 비강내 ExoPTEN 처리는 부분적으로 전기생리학적 및 구조적 완전성을 회복시켰으며, 가장 중요하게도, 놀라운 기능적 운동 회복을 가능하게 하였다 (도 11).
본 발명의 교시에 따르면, PTEN의 발현 및/또는 활성을 하향조절할 수 있는 제제가 로딩된 엑소좀은 일반적으로 다른 신경 질환 또는 병태, 보다 구체적으로 병태의 퇴행성 신경 질환을 치료하는데 유용하다. 특히 활성의 억제, 및 특히 병변 부위에서의 PTEN 발현의 억제가 척수 손상을 효과적으로 치료한다는 것이 본 발명으로부터 자명하다.
본 발명의 하나의 측면에 따르면 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 입자를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
용어 "포스파타제 및 텐신 동족체" 및 "PTEN"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, EntrezGene ID:5728의 산물이며 UniProt Accession: P60484에 상응하는 아미노산 서열 조성을 가질 수 있는 인간 포스파타제 및 텐신 동족체 효소를 지칭한다. 또 다른 비인간 동족체는 알려진 방법, 예를 들어 BLAST 검색을 사용하여 쉽게 식별되며, 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. PTEN 단백질은 포스파타제로서 역할을 하여 포스파티딜이노시톨 (3,4,5)-트리스포스페이트 (PtdIns (3,4,5)P3 또는 PIP3)를 탈인산화한다. PTEN은 특히 PIP3에서 이노시톨 환의 3' 포스페이트의 탈인산화를 촉매하여, 비포스페이트 생성물 PIP2 (PtdIns(4,5)P2)를 생성한다. 이러한 탈인산화는 AKT 신호전달 경로를 억제하기 때문에 중요하다. 대표적인 PTEN 아미노산 서열이 서열 번호 1에 표시된다.
용어 "입자" 및 "소포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 활성제의 전달에 사용되는 별개의 실체를 지칭한다. 용어 "활성제" 및 "활성 모이어티"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 생물학적 활성, 약리학적 효과 및/또는 치료적 유용성을 갖는 제제를 지칭한다. 활성제의 비제한적인 예는 소분자, RNA, DNA, 펩티드 및 단백질이다. 일부 실시양태에 따르면, 활성제는 비-내인성 활성제이며, 즉 살아있는 세포에 자연적으로 존재하지 않는다. 하나의 실시양태에서, 비-내인성 (non-endogenous)은 활성제가 인체 및/또는 인간 세포에 존재하지 않는다는 의미를 갖는다.
입자는 지질 이중층에 의해 제한되는 소포 또는 편평한 구체를 포함할 수 있다. 입자는 40-100 nm의 직경을 포함할 수 있다. 입자는 엔도솜 막의 내부 발아에 의해 형성될 수 있다. 입자는 약 1.13-1.19 g/ml의 밀도를 가질 수 있으며 수크로스 구배에 따라 좌우될 수 있다. 입자는 콜레스테롤과 스핑고미엘린, 및 GM1, GM3, 플로틸린 및 src 단백질 키나제 Lyn과 같은 지질 뗏목 마커가 풍부할 수 있다. 입자는 중간엽 줄기 세포 또는 중간엽 줄기 세포 조절 배지 (MSC-CM)에 존재하는 하나 이상의 단백질, 예를 들어 MSC 또는 MSC-CM에 특징적이거나 특이적인 단백질을 포함할 수 있다. 이들은 RNA, 예를 들면 miRNA를 포함할 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 입자는 막 소포이다. 본원에 사용된 용어 "막 소포"는 지질 이중층으로 둘러싸인 액체를 포함하는 임의의 소포 구조를 지칭한다. 따라서 일부 실시양태에 따르면, 입자는 지질 이중층 인지질 막 소포이다. 일부 실시양태에 따르면, 막 소포는 세포외 소포, 리포솜, 엑토좀, 및 트랜스페로솜으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 따르면, 막 소포는 합성 막 소포이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 막 소포는 세포 유래 입자이다. 일부 실시양태에 따르면, 세포는 진핵 세포이다. 하나의 실시양태에 따르면, 막 소포는 리포솜이다.
하나의 실시양태에 따르면, 막 소포는 세포외 소포이다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 세포외 소포를 포함하며, 여기서 세포외 소포는 세포로부터 유래된다.
용어 "세포외 소포" 및 "EV"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 내부 공간을 둘러싸는 막을 포함하는 세포-유래 소포를 지칭한다. 일반적으로 세포외 소포는 직경이 30 nm 내지 1000 nm에 이르며, 내부 공간 내에, 세포외 소포의 외부 표면에 표시되고/되거나 막에 걸쳐있는 다양한 거대분자 적하물 (cargo)을 포함할 수 있다. 상기 적하물은 핵산, 단백질, 탄수화물, 지질, 소분자 및/또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 용어 세포외 소포는 용어 "엑소좀" 및 "미세소포"를 포함한다. 용어 "엑소좀" 및 "나노소포"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 직경이 30 내지 100 nm인 크기를 갖는 EV를 지칭한다. 전형적으로, 임의의 특정 이론에 제한됨이 없이, 엑소좀은 세포 내에서 형성되고 원형질막과 다소포체 (MVB)의 융합시 세포로부터 방출된다. 대안적으로, 엑소좀은 원형질막으로부터 직접 방출된다. 본원에 사용된 용어 "미세소포"는 직경이 100 내지 1000 nm인 크기를 갖는 EV를 지칭한다. 용어 "엑토좀"은 원형질막으로부터 직접 발아한 다양한 크기 (예를 들어, 직경 0.1-1 mm)의 소포를 지칭한다.
일부 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 엑소좀, 미세소포, 엑토좀, 외부소포 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
하나의 실시양태에 따르면, EV는 엑소좀이다. 엑소좀은 다음 특성 중 적어도 하나를 가질 수 있다: (a) 전자 현미경에 의해 결정된 바와 같이 50 nm 내지 100 nm의 크기를 갖거나; (b) <100 kDa의 단백질을 포함하는 분자량 > 100kDa의 복합체를 포함하거나; (c) <300 kDa의 단백질을 포함하는 분자량 >300 kDa의 복합체를 포함하거나; (d) 분자량 >1000 kDa의 복합체를 포함하거나; (e) 레이저 회절 또는 동적 광 산란에 의해 결정된 바와 같은 100nm 미만의 유체역학 반경. 하나의 실시양태에 따르면, 엑소좀은 50 내지 100 nm의 직경을 갖는다.
또 다른 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 미세소포이다. 하나의 실시양태에 따르면, EV는 미세소포이다. 하나의 실시양태에 따르면, 미세소포는 100 내지 1000 nm, 120 내지 800 nm, 150 내지 600 nm 또는 200 내지 400 nm의 직경을 갖는다. 또 다른 실시양태에 따르면, 미세소포는 100 내지 300 nm 또는 150 내지 250 nm의 크기를 갖는다. 일부 실시양태에 따르면, EV는 30 내지 250 nm 또는 50 내지 200 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에 따르면, EV는 70 내지 170 nm 또는 80 내지 150 nm의 직경을 갖는다.
EV는 2 nm 이상의 크기를 가질 수 있다. EV는 5 nm, 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm 또는 50 nm 이상의 크기를 가질 수 있다. EV는 100 nm 이상, 예를 들어 150 nm 이상의 크기를 가질 수 있다. EV는 실질적으로 200 nm 이상의 크기를 가질 수 있다.
EV는 2 nm 내지 20 nm, 2 nm 내지 50 nm, 2 nm 내지 100 nm, 2 nm 내지 150 nm 또는 2 nm 내지 200 nm와 같은 다양한 크기를 가질 수 있다. EV는 20 nm 내지 50 nm, 20 nm 내지 100 nm, 20 nm 내지 150 nm 또는 20 nm 내지 200 nm의 크기를 가질 수 있다. EV는 50 nm 내지 100 nm, 50 nm 내지 150 nm 또는 50 nm 내지 200 nm의 크기를 가질 수 있다. EV는 100 nm 내지 150 nm 또는 100 nm 내지 200 nm의 크기를 가질 수 있다. EV는 150 nm 내지 200 nm의 크기를 가질 수 있다. EV는 100 내지 600 nm, 150 내지 500 nm, 또는 200 내지 400 nm의 크기를 가질 수 있다.
크기는 다양한 수단에 의해 결정될 수 있다. 원칙적으로, 크기는 크기 분별 및 관련 크기 컷오프가 있는 막을 통한 여과에 의해 결정될 수 있다. 그후 입자 크기는 SDS-PAGE로 성분 단백질의 분리를 추적하거나 생물학적 분석에 의해 결정될 수 있다.
크기는 유체역학 반경을 포함할 수 있다. EV의 유체역학 반경은 100 nm 미만일 수 있다. 이것은 약 30 nm 내지 약 70 nm일 수 있다. 유체역학 반경은 약 40 nm 내지 약 60 nm, 예를 들어 약 45 nm 내지 약 55 nm일 수 있다. 유체역학 반경은 약 50 nm일 수 있다. EV의 유체역학 반경은 임의의 적절한 수단, 예를 들면, 레이저 회절 또는 동적 광 산란에 의해 결정될 수 있다.
추가의 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 엑소좀과 미세소포의 조합이다. 일부 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 단리된 세포외 소포이다. 또 다른 실시양태에 따르면, EV는 외부소포 또는 엑토좀이다.
상기한 바와 같이, 세포외 소포는 세포로부터 유래된다. 용어 "로부터 유래된 (derived　from)" 및 "로부터 기원한 (originated from)"은 본원에서 상호교환적으로 사용되며 특정 세포, 세포 유형 또는 세포 집단 내에서, 이에 의해 또는 이로부터 생성되는 소포를 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "모 세포 (parent cell)", "생산자 세포 (producer cell)" 및 "원 세포 (original cell)"는 세포외 소포가 유래되고 단리되는 임의의 세포를 포함한다. 이 용어는 또한 세포외 소포의 단백질, 지질, 당 또는 핵산 성분을 공유하는 세포를 포함한다. 예를 들면, "모 세포" 또는 "생산자 세포"는 세포외 소포의 공급원으로 작용하는 세포를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 세포는 진핵 세포이다.
세포외 소포 (EV)는 여러 수단 중 임의의 것에 의해, 예를 들면, 생물학적 세포로부터의 분비, 발아 또는 확산에 의해 생물학적 세포로부터 유래될 수 있다. EV는 중간엽 줄기 세포 (MSC), 신경 능선 세포 (NCC), 중간엽 줄기 세포 조절 배지 (MSC-CM) 또는 신경 능선 세포 조절 배지로부터 단리 가능한 것일 수 있다. EV는 MSC, NCC, NCC-CM 또는 MSC-CM과 같은 모 세포의 활성을 담당하거나 적어도 활성을 가질 수 있다. EV는 MSC, NCC, NCC-CM 또는 MSC-CM과 같은 모 세포 활성의 기능의 실질적인 대부분 또는 전부를 담당하고 수행할 수 있다. 예를 들면, EV는 MSC, NCC, NCC-CM 또는 MSC-CM의 대체물 (또는 생물학적 대체물)일 수 있다. 예를 들면, 세포외 소포는 생물학적 세포로부터 생산, 삼출, 방출 또는 배출될 수 있다. 생물학적 세포가 세포 배양물에 있는 경우, 입자가 세포 배양 배지로 분비될 수 있다.
EV가 유래될 수 있는 생물학적 세포의 예는 중간엽 줄기 세포, 구강 점막 줄기 세포 또는 후각 초성 세포, 성상 세포 및 신경 능선 세포와 같은 중간엽 마커를 발현하는 부착 세포를 포함한다. 따라서, 일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 외인성 PTEN 억제제가 로딩된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 세포외 소포는 중간엽 마커를 발현하는 부착 세포로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, 중간엽 마커를 발현하는 부착 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC), 구강 점막 줄기 세포 및 후각 초성 세포로부터 선택된다. 하나의 실시양태에 따르면, 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC)이다.
용어 "중간엽 줄기 세포"는 골아세포 (bone cells), 연골 세포 (cartilage cells), 근세포 (muscle cells) 및 지방세포 (fat cells)를 포함하는 당업계에 잘 알려진 바와 같은 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 다능성 간질 세포를 지칭한다.
다능성 상태에서, 중간엽 줄기 세포는 전형적으로 CD105, CD166, CD29, CD90, 및 CD73의 마커는 발현하고 CD34, CD45 및 CD133은 발현하지 않는다.
중간엽 줄기 세포는 골수, 지방 조직, 치수, 구강 점막, 말초 혈액 및 양수를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다양한 조직으로부터 단리될 수 있다. 하나의 실시양태에 따르면, 중간엽 줄기 세포는 골수로부터 단리된다. 하나의 실시양태에 따르면, 중간엽 줄기 세포는 골수, 지방 조직, 탯줄, 치수, 구강 점막, 말초 혈액 및 양수로부터 선택된 부위에서 기원한다. 일부 실시양태에 따르면, EV는 골수 기원 MSC로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에 따르면, EV는 지방 조직 기원 MSC로부터 유래된다. 일부 이러한 실시양태에 따르면, EV는 엑소좀, 미세소포 및 이의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 따르면, 세포는 CD105, CD166, CD29, CD90, 및 CD73 마커를 발현한다. 추가의 실시양태에 따르면, 세포는 CD105, CD166, CD29, CD90, 및 CD73을 발현하고, CD34, CD45 및 CD133을 발현하지 않는다. 일부 실시양태에 따르면, 세포는 치수 줄기 세포 (DPSCs), 탈락 유치 줄기 세포 (SHED), 치주 인대 줄기 세포 (PDLSCs), 치근단 유두 줄기 세포 (SCAP) 및 치낭 전구 세포 (DFPCs)로부터 선택된다.
EV는 특정 세포 유형, 예를 들어, 중간엽 줄기 세포 또는 신경 능선 세포에 의해 분비되는 하나 이상의 단백질, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. EV는 중간엽 줄기 세포 조절 배지 (MSC-CM)에 존재하는 하나 이상의 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, EV는 MSC 또는 신경 능선 세포로부터 유래된 miRNA를 포함할 수 있다.
예를 들면, EV는 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상 또는 70% 이상의 이러한 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. EV는 실질적으로 약 75%의 이러한 단백질 및/또는 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 단백질은 단백질 목록 또는 유전자 목록의 유전자 산물을 참조하여 정의될 수 있다.
EV는 중간엽 줄기 세포의 적어도 하나의 특성을 가질 수 있다. 입자는 생물학적 활성과 같은 생물학적 특성을 가질 수 있다. 입자는 MSC의 생물학적 활성 중의 어느 것을 가질 수 있다. 입자는 예를 들면 MSC의 치료 또는 회복 활성을 가질 수 있다.
중간엽 줄기 세포 (MSC)를 단리, 정제 및 확장하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌 [Caplan and Haynesworth in U.S. Pat. No. 5,486,359 and Jones E.A. et al., 2002, Isolation and characterization of bone marrow multipotential mesenchymal progenitor cells, Arthritis Rheum. 46(12): 3349-60]에 개시된 것들을 포함한다.
중간엽 줄기 세포 배양물은 BM 흡인물 (통상적으로 20 ml)을 동일한 용적의 행크 균형 염 용액 (HBSS; GIBCO Laboratories, Grand Island, NY, USA)으로 희석시키고 희석된 세포를 약 10 ml의 Ficoll 컬럼 (Ficoll-Paque; Pharmacia, Piscataway, NJ, USA) 위에 층상화함으로써 생성될 수 있다. 2,500 x g에서 30분의 원심분리 후, 단핵 세포층을 계면으로부터 제거하고 HBSS에 현탁시킨다. 그후 세포를 1,500 x g에서 15분 동안 원심분리하고 완전 배지 (MEM, 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드가 없는 α 배지; GIBCO); MSC의 급속 성장을 위해 선택된 로트로부터 유래된 20% 태아 송아지 혈청 (FCS) (Atlanta Biologicals, Norcross, GA); 100 단위/ml 페니실린 (GIBCO), 100 μg/ml 스트렙토마이신 (GIBCO); 및 2 mM L-글루타민 (GIBCO)에 재현탁시킨다. 재현탁된 세포를 10 cm 배양 접시 (Corning Glass Works, Corning, NY)에서 약 25 ml의 배지에 플레이팅하고 37℃에서 5% 가습된 CO2로 배양한다. 배양물에서 24시간 후, 부착되지 않은 세포는 폐기하고, 부착된 세포는 인산염 완충 염수 (PBS)로 2회 철저히 세척한다. 배지는 약 14일 동안 3 또는 4일마다 새로운 완전 배지로 교체한다. 그후 부착 세포를 0.25% 트립신 및 1 mM EDTA (트립신/EDTA, GIBCO)로 37℃에서 5분 동안 수확하고, 6-cm 플레이트에 재플레이팅하고 또 다른 14일 동안 배양한다. 그후 세포를 트립신화하고, 예를 들면, 혈구계 (Hausser Scientific, Horsham, PA)와 같은 세포 계수 장치를 사용하여 계수한다. 배양된 세포를 원심분리에 의해 회수하고 ml 당 1 내지 2 X 106개 세포의 농도로 5% DMSO 및 30% FCS로 재현탁시킨다. 각각 약 1 ml의 분취량을 천천히 동결시키고 액체 질소에 저장한다.
중간엽 줄기 세포 분획을 확장하기 위해, 동결된 세포를 37℃에서 해동시키고, 완전 배지로 희석하고 원심분리에 의해 회수하여 DMSO를 제거한다. 세포를 완전 배지에 재현탁시키고 약 5,000개 세포/cm2의 농도로 플레이팅한다. 배양물에서 24시간 후, 부착되지 않은 세포는 제거하고 부착된 세포는 트립신/EDTA를 사용하여 수확하고, 좁아진 파스퇴르 피펫을 통과시켜 분리하고, 바람직하게는 약 1.5 내지 약 3.0개 세포/cm2의 밀도로 재플레이팅한다. 이러한 조건하에서, MSC 배양물은 약 50 집단 배가 (population doubling)로 성장하고 약 2000배 확장할 수 있다 [Colter DC., et al. Rapid expansion of recycling stem cells in cultures of plastic-adherent cells from human bone marrow. Proc Natl Acad Sci USA. 97: 3213-3218, 2000].
본 발명의 일부 실시양태에 의해 이용되는 MSC 배양물은 이들의 형태학적 특징에 의해 정의되는 세 그룹의 세포를 포함한다: 작은 무과립 세포 (이하 RS-1이라고 함), 작은 과립 세포 (본원에서는 이하 RS-2라고 함) 및 크고 적당한 과립 세포 (본원에서는 이하 성숙 MSC라고 함). 배양물에서 이러한 세포의 존재 및 농도는, 예를 들면, 면역형광, 현장 혼성화, 및 활성 분석을 사용하여 다양한 세포 표면 마커의 존재 또는 부재를 확인함으로써 분석될 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, EV는 성상 세포로부터 유래되지 않는다. 따라서, 본 발명은 PTEN 억제제가 로딩된 입자를 포함하는 조성물을 고려하며, 단 입자는 성상 세포-유래 엑소좀이 아니다.
특정 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 신경 능선 세포로부터의 마커를 발현하는 세포로부터 유래된다. 특정 실시양태에 따르면, EV는 신경 능선 세포로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 신경 능선 세포는 두개골 신경 능선 세포이다. 일부 실시양태에 따르면, 두개골 신경 능선 세포는 치수 줄기 세포 (DPSCs), 탈락 유치 줄기 세포 (SHED), 치주 인대 줄기 세포 (PDLSCs), 치근단 유두 줄기 세포 (SCAP) 및 치낭 전구 세포 (DFPCs)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 일부 실시양태에 따르면 이러한 세포는 상기 정의된 바와 같은 중간엽 마커를 발현한다.
EV는 다양한 방법으로 생산되거나 단리될 수 있다. 이러한 방법은 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 신경 능선 세포 (NCC)로부터 EV를 단리함을 포함할 수 있다.
따라서, 본 발명의 EV는 단리된 EV이다. 따라서, 본 발명은 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 단리된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 세포외 소포는 세포로부터 단리된다. 일부 실시양태에 따르면, 세포는 인간 세포이다.
상기 실시양태들 중 어느 하나에 따르면, 세포외 소포는 단리된 세포외 소포이다. 본원에 사용된 용어 "정제한다", "정제된", "정제하는", "단리한다", "단리된" 및 "단리하는"은 상호교환적으로 사용되며 하나 이상의 정제 과정, 예를 들어 원하는 세포외 소포의 선택, 또는 대안적으로 잔류 생물학적 산물의 제거 또는 감소를 겪은 세포외 소포의 집단의 상태 (예를 들어, 다수의 알려지거나 알려지지 않은 양 및/또는 농도)를 지칭한다. 하나의 실시양태에 따르면, 잔류 모 세포에 대한 EV의 비율은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8 또는 10배 더 높거나, 특정 유리한 실시양태에서 초기 물질에서보다 적어도 50, 100 또는 1000배 더 높다. 일부 유리한 실시양태에서, 용어 "단리된"은 실질적으로 무세포이거나 무세포의 의미를 가지며, 이에 의해 대체될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에 따르면, 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 PTEN 억제제가 로딩된 단리된 세포외 소포를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 무세포 조성물이며, 즉 검출 가능한 양의 세포를 포함하지 않는다.
언급된 바와 같이 지질 이중층 인지질 막 소포, 예를 들어, 세포외 소포에 외인성 PTEN 억제제가 로딩된다.
본원에 사용된 용어 "외인성"은 세포외 소포와 같은 주어진 막 소포의 외부로부터 기원하고 소포에 자연적으로 존재하지 않는 분자 또는 물질 (예를 들어, 화합물, 핵산 또는 단백질)을 지칭한다. 세포외 소포와 관련하여, 용어는 세포외 소포가 유래되는 세포가 아니라 소포에 자연적으로 존재하지 않는 분자 또는 물질을 지칭한다. 일부 실시양태에 따르면, 용어 "외인성"은 합성 비천연 분자를 지칭한다. 일부 실시양태에 따르면, 물질은 세포외 소포 또는 세포외 소포가 유래되는 세포에 인위적으로 로딩된다. 펩티드, 단백질 및 핵산과 관련하여, 용어는 화합물이 세포외 소포 또는 소포가 유래되는 세포에 인위적으로 로딩되거나 소포가 유래된 세포 내에서 인위적으로 발현되지만 화합물이 모 세포에서 자연적으로 발현되지 않음을 의미한다.
용어 "로딩된 (loaded)"은 입자, 즉 막 소포가 억제제로 인위적으로 보충되거나 채워진다는 의미를 갖는다. 막 소포에 대한 억제제의 위치와 관련하여, 용어는 소포의 내부에 포획되고, 소포의 표면 (내부 및/또는 외부 표면)에 노출되거나 존재하고, 소포의 막 (외부 또는 내부 또는 그 사이)에 매봉된다는 의미를 갖는다. 하나의 실시양태에 따르면, 억제제는 소포의 외부 막 내에 포획된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 억제제는 소포의 내부 막 내에 포획된다. 추가의 실시양태에 따르면, 억제제는 소포의 액체 상 내에 포획된다.
하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 PTEN 활성을 억제하거나 하향조절한다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 PTEN 발현을 억제하거나 하향조절한다.
하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 단백질 또는 펩티드이다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 소분자이다. 단백질-기반 PTEN 억제제의 예는 미국 특허 출원 제20160074472호 및 제20160311857호에 개시된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 이들 둘 다의 내용은 본원에 참고로 포함된다. 일부 실시양태에 따르면, 단백질-기반 PTEN 억제제는 제WO 2011/044701호에 기술된 서열 1, 2, 5, 6으로부터 선택된 서열을 갖는 펩티드 및 제WO 2015/105957호에 기술된 서열 1-5를 갖는 것들을 포함한다.
본 발명의 단백질 기반 억제제는 예를 들어 표준 고체상 기술을 사용하여 생화학적으로 합성될 수 있다. 이러한 방법은 독점 고체상 합성, 부분 고체상 합성 방법, 단편 축합, 고전적인 용액 합성을 포함한다. 고체상 폴리펩티드 합성 과정은 당업계에 잘 알려져 있다. 합성 펩티드는 분취용 고성능 액체 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있으며 이의 조성은 아미노산 시퀀싱을 통해 확인될 수 있다.
재조합 기술이 또한 본 발명의 단백질 기반 억제제를 생성하는데 사용될 수 있다. 재조합 기술을 사용하여 본 발명의 폴리펩티드 억제제를 생산하기 위해, 본 발명의 펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 핵산 발현 벡터에 결찰시키며, 이것은 숙주 세포에서 본 발명의 폴리펩티드의 구성적, 조직 특이적 또는 유도성 전사를 지시하기에 적합한 시스-조절 서열 (예를 들어, 프로모터 서열)의 전사 제어하에 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 발현 벡터는 본원에서 아래에 추가로 기술된다.
숙주 세포에서 합성될 수 있을 뿐만 아니라, 본 발명의 펩티드는 또한 시험관내 발현 시스템을 사용하여 합성될 수 있다. 이러한 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며 시스템의 구성 요소는 상업적으로 이용 가능하다.
특정 실시양태에 따르면, 단백질 기반 억제제는 EV가 유래되는 세포에서 발현된다. 따라서, 예를 들면, 본 발명은 MSC의 집단에서 단백질 억제제를 발현한 다음 유전적으로 변형된 MSC로부터 EV를 수득하는 것을 고려한다.
일부 실시양태에 따르면, 외인성 PTEN 억제제는 PTEN 발현의 억제제이다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 발현의 억제제는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 억제제는 RNA 간섭 (RNAi) 올리고뉴클레오티드이다. 하나의 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 shRNA이다.
본원에 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 150개 초과의 뉴클레오티드를 포함하는 긴 핵산을 지칭한다. 본원에 사용된 용어 "올리고뉴클레오티드"는 리보핵산 (RNA), 데옥시리보핵산 (DNA) 또는 이의 모방체와 같은 핵산의 짧은 단일 가닥 또는 이중 가닥 서열을 지칭하며, 상기 핵산은 전형적으로 150개 이하의 뉴클레오티드를 갖는다. 일부 실시양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 2 내지 150, 10 내지 100, 또는 15 내지 50개 뉴클레오티드를 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드는 15 내지 40, 17 내지 35, 또는 18 내지 30개의 핵산을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 제제는 RNA 침묵제이다. 본원에 사용된 용어 "RNA 침묵"은 상응하는 단백질-코딩 유전자의 발현의 억제 또는 "침묵"을 초래하는 RNA 분자에 의해 매개되는 조절 메커니즘의 그룹 (예를 들어, RNA 간섭 (RNAi), 전사 유전자 침묵 (TGS), 전사후 유전자 침묵 (PTGS), 진압, 공동-억제 및 번역 억제)을 지칭한다. RNA 침묵은 식물, 동물 및 진균을 포함한 많은 유형의 유기체에서 관찰되었다.
본원에 사용된 용어 "RNA 침묵제", "RNA 침묵 분자" 및 "RNA 침묵 올리고뉴클레오티드"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 표적 유전자의 발현을 억제 또는 "침묵"시킬 수 있는 RNA를 지칭한다. 특정 실시양태에서, RNA 침묵제는 전사후 침묵 메커니즘을 통해 mRNA 분자의 완전한 처리 (예를 들어, 전체 번역 및/또는 발현)를 방지할 수 있다. RNA 침묵제는 비코딩 RNA 분자, 예를 들면, 쌍을 이룬 가닥을 포함하는 RNA 이중체 뿐만 아니라 이러한 작은 비코딩 RNA가 생성될 수 있는 전구체 RNA를 포함한다. 예시적인 RNA 침묵제는 siRNA, miRNA 및 shRNA와 같은 dsRNA를 포함한다. 하나의 실시양태에서, RNA 침묵제는 RNA 간섭을 유도할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, RNA 침묵제는 번역 억제를 매개할 수 있다.
RNA 간섭은 짧은 간섭 RNA (siRNA)에 의해 매개되는 동물에서의 서열-특이적 전사후 유전자 침묵의 과정을 지칭한다. 식물에서의 상응하는 과정을 일반적으로 전사후 유전자 침묵 또는 RNA 침묵이라고 하며 진균에서는 진압이라고도 한다. 전사후 유전자 침묵의 과정은 외래 유전자의 발현을 방지하는데 사용되는 진화적으로-보존된 세포 방어 메커니즘으로 생각되며 일반적으로 다양한 식물군 (flora) 및 문 (phyla)에 의해 공유된다. 외래 유전자 발현으로부터의 이러한 보호는 바이러스 감염으로부터 또는 동종 단일 가닥 RNA 또는 바이러스 게놈 RNA를 특이적으로 파괴하는 세포 반응을 통한 숙주 게놈으로의 트랜스포존 요소의 무작위 통합으로부터 유래된 이중 가닥 RNA (dsRNA)의 생산에 대한 반응으로 진화되었을 수 있다.
세포에서의 긴 dsRNA의 존재는 다이서 (dicer)라고 하는 리보뉴클레아제 III 효소의 활성을 자극한다. 다이서는 dsRNA를 짧은 간섭 RNA (siRNA)로 알려진 짧은 dsRNA 조각으로 처리하는데 관여한다. 다이서 활성으로부터 유래된 짧은 간섭 RNA는 전형적으로 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드 길이이며 약 19개 염기 쌍 이중체를 포함한다. RNAi 반응은 또한 siRNA 이중체의 안티센스 가닥에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥 RNA의 절단을 매개하는 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC)로 일반적으로 지칭되는 엔도뉴클레아제 복합체를 특징으로 한다. 표적 RNA의 절단은 siRNA 이중체의 안티센스 가닥에 상보적인 영역의 중간에서 발생한다.
따라서, 본 발명은 mRNA로부터 단백질 발현을 하향조절하기 위한 dsRNA의 사용을 고려한다. 하나의 실시양태에 따르면, dsRNA는 30 bp 이상이다. 긴 dsRNA (즉, 30 bp 이상의 dsRNA)의 사용은 이중 가닥 RNA의 이러한 보다 긴 영역이 인터페론 및 PKR 반응을 유도할 것이라는 믿음으로 인해 매우 제한되었다. 그러나, 긴 dsRNA의 사용은 세포가 최적의 침묵 서열을 선택할 수 있어 수많은 siRNA를 검사할 필요를 덜어준다는 점에서 수많은 이점을 제공할 수 있으며; 긴 dsRNA는 siRNA에 필요한 것보다 덜 복잡하게 라이브러리를 침묵시킬 수 있고; 아마도 가장 중요하게는, 긴 dsRNA는 치료제로 사용될 때 바이러스 탈출 돌연변이 (viral escape mutation)를 예방할 수 있다.
다양한 연구들이 긴 dsRNA가 스트레스 반응을 유도하거나 상당한 오프-타겟 효과를 유발하지 않으면서 유전자 발현을 침묵시키는데 사용될 수 있음을 입증한다.
특히, 본 발명은 또한 인터페론 경로가 활성화되지 않은 세포 (예를 들어, 배아 세포 및 난모세포)에서 유전자 침묵을 위한 긴 dsRNA (30개 이상의 염기 전사체)의 도입을 고려한다.
본 발명은 또한 유전자 발현을 하향조절하기 위해 인터페론 및 PKR 경로를 유도하지 않도록 특별히 설계된 긴 dsRNA의 도입을 고려한다. 예를 들면, Shinagwa 및 Ishii [Genes & Dev . 17 (11): 1340-1345, 2003]는 RNA 중합 효소 II (Pol II) 프로모터로부터 긴 이중 가닥 RNA를 발현하기 위해 pDECAP라고 불리는 벡터를 개발하였다. pDECAP로부터의 전사체에는 세포질로의 ds-RNA 엑스포트를 촉진하는 3'-폴리(A) 꼬리 및 5'-캡 구조가 둘 다 없기 때문에, pDECAP로부터의 긴 ds-RNA는 인터페론 반응을 유도하지 않는다.
포유 동물계에서 인터페론 및 PKR 경로를 회피하는 또 다른 방법은 형질감염 또는 내인성 발현을 통해 작은 억제성 RNA (siRNA)를 도입하는 것이다.
용어 "siRNA"는 RNA 간섭 (RNAi) 경로를 유도하는 작은 억제성 RNA 이중체 (일반적으로 18-30개 염기 쌍)를 지칭한다. 전형적으로, siRNA는 중심 19 bp 이중체 영역과 말단에 대칭 2-염기 3'-오버행을 가진 21mer로서 화학적으로 합성되지만, 25-30개 염기 길이의 화학적으로 합성된 RNA 이중체는 동일한 위치에 있는 21mer에 비해 효능에 있어 100배 만큼의 증가를 가질 수 있는 것으로 최근에 기술되었다. RNAi를 촉발하는데 더 긴 RNA를 사용하여 수득된 관찰된 효능 증가는 다이서에 생성물 (21mer) 대신 기질 (27mer)을 제공한 결과이며 이것이 siRNA 이중체가 RISC로 진입하는 속도 또는 효율을 개선시킨다는 이론을 세운다.
3'-오버행의 위치가 siRNA의 효능에 영향을 미치고 안티센스 가닥에 3'-오버행을 갖는 비대칭 이중체가 센스 가닥에 3'-오버행을 갖는 것보다 일반적으로 더 강력한 것으로 밝혀졌다. 이것은 안티센스 전사체를 표적화할 때 반대 효능 패턴이 관찰되기 때문에 RISC로의 비대칭 가닥 로딩에 기인할 수 있다.
PTEN의 억제를 위해 고려되는 예시적인 siRNA 서열은 5'-GUUAGCAGAAACAAAAGGAGAUAUCAA-3' (서열 번호 2; 센스); 5'-UUGAUAUCUCCUUUUGUUUCUGCUAAC-3' (서열 번호 3; 안티센스); 또는 5'-CAGCCGUUCGGAGGAUUAUUCGUCUTT-3' (서열 번호 4; 센스), 5'-AGACGAAUAAUCC UCCGAACGGCUGTT-3' (서열 번호 5; 안티센스)를 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 발현을 억제하는 siRNA는 핵산 서열 5'-GAGUUCUUCCACAAACAGAA-3' (서열 번호 10; 센스)를 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 발현을 억제하는 siRNA는 핵산 서열 5'-UUCUGUUUGUGGAAGAACUC-3' (서열 번호 11; 안티센스)를 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10 및 11을 포함하는 이중 가닥 siRNA이다.
PTEN siRNA가 표적화될 수 있는 하나의 예시적인 서열은 서열 번호 6 (5'-GAGTTCTTCCACAAACAGAA-3')에 제시되어 있다. PTEN siRNA가 표적화될 수 있는 또 다른 예시적인 서열은 서열 번호 7 (5'-GTATAGAGCGTGCAGATAA-3')에 제시되어 있다.　
따라서, 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 siRNA이다. 일부 실시양태에 따르면 siRNA는 소포 또는 세포의 막으로의 진입을 개선하는 다중 변형을 가질 수 있다.
하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 2 및/또는 3의 서열을 갖는 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 4 및/또는 5의 서열을 갖는 siRNA이다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6을 표적화하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 7을 표적화하는 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 10의 서열을 갖는 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 11의 서열을 갖는 siRNA이다. 추가의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 10 및 11의 서열을 포함하는 이중 가닥 siRNA이다.
또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵사 서열의 변이체인 siRNA이다. 하나의 실시양태에 따르면, 변이체는 원래 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 실시양태에 따르면, 변이체는 원래 서열과 적어도 80%, 85% 또는 90% 서열 동일성을 갖는다. 하나의 실시양태에 따르면, 변이체는 원래 서열의 활성을 갖는다.
용어 "동족체", "변이체", "DNA 변이체", "서열 변이체" 및 "폴리뉴클레오티드 변이체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 원래 서열과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는 DNA 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 변이체는 돌연변이가 개방형 해독특을 변경하지 않고 폴리뉴클레오티드가 모 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 펩티드 또는 단백질과 실질적으로 유사한 구조 및 기능을 갖는 펩티드 또는 단백질을 암호화하도록 결실, 부가 또는 치환과 같은 돌연변이를 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 변이체는 보존적 변이체이다. 본원에 사용된 용어 "보존적 변이체"는 주어진 코돈 위치에서의 하나 이상의 뉴클레오티드의 변화가 그 위치에서 암호화된 아미노산에 변화를 일으키지 않는 변이체를 지칭한다. 따라서, 보존적 변이체에 의해 암호화된 펩티드 또는 단백질은 모 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 펩티드 또는 단백질과 100% 서열 동일성을 갖는다. 일부 실시양태에 따르면, 변이체는 모 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 펩티드 또는 단백질의 보존적 유사체인 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 비보존적 변이체이다. 일부 실시양태에 따르면, 변이체는 원래 서열과 적어도 75%, 적어도 80% 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99% 서열 동일성을 갖는다.
또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 PTEN을 암호화하는 서열에 상보적이고 이의 발현 및/또는 번역을 억제하는 siRNA이다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6 및 7로부터 선택된 서열에 상보적이다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 PTEN 단백질을 암호화하는 핵산의 단편에 상보적인 서열을 포함하고 이의 발현을 억제한다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 1을 암호화하는 핵산의 단편에 상보적인 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, 이러한 siRNA는 상기 서열에 대해 85%, 88%, 90%, 92%, 95%, 98%, 99% 또는 100% 상보성을 갖는다.
하나 이상의 siRNA 제제가 표적 유전자를 하향조절하기 위해 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 따라서, 예를 들면, 본 발명은 PTEN를 표적화하는 적어도 두 개의 siRNA의 사용을 고려한다.
용어 "갖는다", "갖다", "갖는" 및 "포함하는"은 또한 "로 구성된" 및 "로 본질적으로 구성된"의 의미를 포함할 수 있으며, 이들 용어로 대체될 수 있다.
이중 가닥 간섭 RNA (예를 들어, siRNA)의 가닥이 연결되어 헤어핀 또는 줄기-루프 구조 (예를 들어, shRNA)를 형성할 수 있다. 따라서, 언급된 바와 같이 본 발명의 RNA 침묵제는 또한 짧은 헤어핀 RNA (shRNA)일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "shRNA"는 상보적 서열의 제1 및 제2 영역을 포함하는 줄기-루프 구조를 갖는 RNA 제제를 지칭하며, 영역의 상보성 및 배향 정도는 염기 쌍이 영역들 사이에서 발생하기에 충분하고, 제1 및 제2 영역은 루프 영역에 의해 연결되고, 루프는 루프 영역 내의 뉴클레오티드 (또는 뉴클레오티드 유사체) 사이의 염기 쌍 부족으로부터 야기된다. 루프의 뉴클레오티드의 수는 3 내지 23, 또는 5 내지 15, 또는 7 내지 13, 또는 4 내지 9, 또는 9 내지 11을 포함한 그 사이의 수이다. 루프의 뉴클레오티드 중의 일부는 루프의 다른 뉴클레오티드와의 염기-쌍 상호작용에 관여할 수 있다. 루프를 형성하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드 서열의 예는 5'-UUCAAGAGA-3' (서열 번호 8) 및 5'-UUUGUGUAG-3' (서열 번호 9)를 포함한다. 생성된 단일 사슬 올리고뉴클레오티드가 RNAi 기구와 상호작용할 수 있는 이중 가닥 영역을 포함하는 줄기-루프 또는 헤어핀 구조를 형성한다는 것은 당업계의 숙련가에 의해 인지될 것이다. 일부 실시양태에 따르면, shRNA는 핵산 서열 번호 2를 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, shRNA는 핵산 서열 번호 4를 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, shRNA는 핵산 서열 번호 2 및 3을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, shRNA는 핵산 서열 번호 4 및 5를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, shRNA는 핵산 서열 번호 10 또는 11을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, shRNA는 핵산 서열 번호 10 및 11을 포함한다.
또 다른 실시양태에 따르면 RNA 침묵제는 miRNA일 수 있다. MiRNA는 다양한 크기의 일차 전사체를 암호화하는 유전자로부터 만들어진 작은 RNA이다. 이들은 동물과 식물 모두에서 확인되었다. 일차 전사체 ("pri-miRNA"라고 함)는 다양한 핵산분해 단계를 통해 더 짧은 전구체 miRNA 또는 "pre-miRNA"로 처리된다. pre-miRNA는 최종 (성숙) miRNA가 이중체로 존재하도록 접힌 형태로 존재하며, 두 가닥을 miRNA (결국 표적과 염기 쌍을 이루는 가닥)라고 한다. pre-miRNA는 전구체로부터 miRNA 이중체를 제거하는 다이서의 한 형태에 대한 기질이며, 그 후 siRNA와 유사하게, 이중체는 RISC 복합체로 될 수 있다. miRNA는 유전자도입에 의해 발현될 수 있고 전체 일차 형태라기 보다는 전구체 형태의 발현을 통해 효과적일 수 있음이 입증되었다.
siRNA와는 달리, miRNA는 단지 부분적인 상보성을 갖는 전사체 서열에 결합하고 정상 상태 RNA 수준에 영향을 주지 않으면서 번역을 억제한다. miRNA와 siRNA는 모두 다이서에 의해 처리되고 RNA-유도 침묵 복합체의 구성 요소와 연관된다. miRNA 경로 대 siRNA 경로를 통한 유전자 조절은 표적 전사체에 대한 상보성의 정도에 의해서만 결정된다는 가설이 세워졌다. mRNA 표적과 단지 부분적 동일성을 가진 siRNA는 RNA 분해를 촉발하기보다는, miRNA와 유사하게, 번역 억제 기능을 할 것으로 추측된다.
본 발명의 RNA 침묵제는 RNA만을 함유하는 이들 분자에 제한될 필요는 없지만, 화학적으로 변형된 뉴클레오티드 및 비-뉴클레오티드를 추가로 포함함을 인지할 것이다.
PTEN을 하향조절할 수 있는 추가 제제는 리보자임, DNAzyme 및 CRISPR 시스템의 제제 (예를 들어, CRISPR/Cas)를 포함한다.
리보자임은 관심있는 단백질을 암호화하는 mRNA의 절단에 의한 유전자 발현의 서열-특이적 억제에 점점 더 많이 사용되고 있다. 임의의 특정 표적 RNA를 절단하도록 리보자임을 설계할 수 있는 가능성은 이들을 기본 연구 및 치료 응용 둘 다에서 유용한 도구로 만들었다. 치료 분야에서, 리보자임은 감염성 질환의 바이러스 RNA, 암의 우성 종양 유전자, 및 유전 질환의 특정 체세포 돌연변이를 표적화하는데 이용되었다. 가장 특히, HIV 환자를 위한 여러 리보자임 유전자 요법 프로토콜이 이미 1상 시험중에 있다. 보다 최근에, 리보자임은 유전자도입 동물 연구, 유전자 표적 검증 및 경로 규명에 사용되었다. 몇 가지 리보자임이 다양한 임상 시험 단계에 있다. ANGIOZYME®은 인간 임상 실험에서 연구된 최초의 화학적으로 합성된 리보자임이다. ANGIOZYME®은 혈관신생 경로의 핵심 구성요소인 VEGF-r (혈관 내피 성장 인자 수용체)의 형성을 특이적으로 억제한다. Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 뿐만 아니라 다른 회사들이 동물 모델에서 항-혈관신생 치료제의 중요성을 입증하였다. C형 간염 바이러스 (HCV) RNA를 선택적으로 파괴하도록 설계된 리보자임인 HEPTAZYME®은 세포 배양 분석에서 C형 간염 바이러스 RNA를 감소시키는데 효과적인 것으로 밝혀졌다 (Ribozyme Pharmaceuticals, Incorporated - WEB 홈페이지).
PTEN을 하향조절할 수 있는 또 다른 제제는 RNA-유도 엔도뉴클레아제 기술, 예를 들어, CRISPR 시스템이다.
세포에서 PTEN 유전자의 발현을 조절하는 추가의 방법은 삼중체 형성 올리고뉴클레오티드 (TFO)를 통해서이다. 연구에서는 서열-특이적 방식으로 이중-가닥 나선 DNA에서 폴리퓨린/폴리피리미딘 영역을 인식하고 이에 결합할 수 있는 TFO가 설계될 수 있는 것으로 나타났다. 올리고뉴클레오티드의 변형, 예를 들어 인터칼레이터 도입 및 골격 치환, 및 결합 조건 (pH 및 양이온 농도)의 최적화는 전하 반발 및 불안정성과 같은 TFO 활성에 대한 내재적 장애를 극복하는데 도움이 되었으며, 최근 합성 올리고뉴클레오티드가 특정 서열에 표적화될 수 있는 것으로 나타났다.
따라서 PTEN의 임의의 주어진 서열에 대해 삼중체 형성 서열이 고안될 수 있다. 삼중체-형성 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 적어도 15개, 보다 바람직하게는 25개, 더욱 더 바람직하게는 30개 이상의 뉴클레오티드 길이, 최대 50 또는 100 bp이다.
언급된 바와 같이, 본 발명의 세포외 소포는 PTEN 발현을 직접 억제하는 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 제제가 로딩될 수 있다.
막 소포 (예를 들어, 엑소좀) 로딩을 촉진하기 위해, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 적하물은 하나 이상의 소수성 변형을 함유할 수 있다. 소수성 변형은 천연 (변형되지 않은) RNA 또는 DNA와 비교하여 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 적하물의 소수성을 증가시킨다. 특정 실시양태에서, 소수성 변형은 천연 (변형되지 않은) RNA 또는 DNA에 비해 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 소수성을 적어도 두 자릿수 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 자릿수)까지 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 소수성 변형은 천연 (변형되지 않은) RNA 또는 DNA에 비해 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 소수성을 적어도 10 자릿수까지 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 소수성 변형은 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 비해 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 소수성을 적어도 두 자릿수 (예를 들어, 적어도 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 또는 그 이상의 자릿수)까지 증가시킨다. 또 다른 실시양태에서, 소수성 변형은 변형되지 않은 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 비해 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드의 소수성을 적어도 10 자릿수까지 증가시킨다. 소수성의 증가는 임의의 적절한 방법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들면, 소수성은 물과 같은 수성 용매에서의 용해도와 비교하여 옥탄올과 같은 유기 용매에서의 용해도 백분율을 측정함으로써 결정될 수 있다.
일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 적하물의 소수성 특성은 소수성으로 변형된 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 분자 내의 뉴클레오티드의 비율을 증가시킴으로써 증가될 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 분자 중의 뉴클레오티드의 20% 이상이 소수성으로 변형되고, 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 분자 중의 뉴클레오티드의 25% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 99% 이상 등이 소수성으로 변형된다. 하나의 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 분자 중의 뉴클레오티드의 100%가 소수성으로 변형된다. 예시적인 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 분자 중의 뉴클레오티드의 30% 이상은 소수성 변형을 함유한다. 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 분자 중의 소수성으로 변형된 뉴클레오티드의 비율을 증가시키는 것은, 예를 들면, 소수성 변형이 약한 소수성인 경우, 예를 들면 2'O-메틸 변형인 경우에 유용할 수 있다. 강한 소수성 변형, 예를 들면, 스테롤, 지질 등이 사용되는 실시양태에서, 단일 소수성 변형이 엑소좀 로딩을 촉진하기에 충분할 수 있다.
일부 실시양태에서, 소수성 변형은 공유 변형이다. 핵산 분자의 소수성 변형은, 예를 들면, 골격 변형, 당 변형, 염기 변형 및/또는 접합체 변형, 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
골격 변형은 핵산 분자의 포스페이트 에스테르 결합에 대한 변경을 포함한다. 적합한 골격 변형의 예는 포스포로티오에이트 변형, 포스포로디티오에이트 변형, p-에톡시 변형, 메틸포스포네이트 변형, 메틸포스포로티오에이트 변형, 알킬- 및 아릴-포스페이트 (여기서 하전된 포스포네이트 산소는 알킬 또는 아릴 그룹으로 대체됨), 알킬포스포트리에스테르 (여기서 하전된 산소 모이어티는 알킬화됨), 펩티드 핵산 (PNA) 골격 변형, 잠금 핵산 (LNA) 골격 변형 등을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 이러한 변형은 서로 조합하여 및/또는 포스포디에스테르 골격 결합과 조합하여 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 소수성 변형은 포스포로티오에이트 (PS) 변형이며, 여기서 비가교 포스페이트 산소 원자 중 하나가 황으로 대체되어 PS 그룹을 제공한다. 이러한 변형은 뉴클레아제 분해에 대한 상당한 내성을 제공하고 유리한 약동학적 특성을 갖는다. PS 결합은 고체상 올리고뉴클레오티드 합성과 같은 표준 기술을 사용하여 올리고뉴클레오티드 분자에 쉽게 포함될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 소수성 변형은 포스포네이트 변형이며, 여기서 하나의 비가교 산소가 알킬 그룹으로 대체된다. 또 다른 실시양태에서, 소수성 변형은 펩티드 핵산 (PNA) 변형이다. PNA는 천연 RNA 및 DNA의 고도로 하전된 당-포스페이트 골격과 비교하여 중성 전하를 가진 펩티드 골격을 갖는 올리고뉴클레오티드 모방체이다 (예를 들면, 참조. 또 다른 실시양태에서, 소수성으로 변형된 핵산 분자는 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고뉴클레오티드 (PMO)이다.
또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 적하 분자는 당 모이어티 (예를 들어, 리보스, 데옥시리보스 등)에서 소수성으로 변형될 수 있다. 당 변형은 종종 당 고리의 2' 위치에서 발생하며, 여기서, 예를 들면, 2' 모이어티는 할로, 알콕시, 아미노알콕시, 알킬, 아지도 또는 아미노 그룹과 같은 소수성 모이어티로 변형되거나 치환될 수 있다. 비제한적인 예에서, 당 변형은 O-메틸, F, 메톡시-에틸, 및 2'-플루오로-.베타.-D-아라비노뉴클레오티드 (FANA)를 포함할 수 있다. 또 다른 2' 변형은, 예를 들면, 2'O-알릴, 2'O-에틸아민, 및 2'O-시아노에틸 변형을 포함한다. 또한, 변형은 당의 4' 위치를 포함하는 다른 부위에서 이루어질 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 적하 분자는 소수성 염기 변형을 함유할 수 있다. 예시적인 실시양태에서, 이러한 변형은 페닐, 나프틸 및 이소부틸을 포함한다. 또 다른 실시양태는 C-5 프로피닐 변형된 염기, 5-메틸시토신, 2-아미노퓨린, 2-아미노-6-클로로퓨린, 2,6-디아미노퓨린 및 하이포크산틴을 포함한다.
올리고뉴클레오티드 적하물의 소수성 특성을 증가시키는 것 외에도, 전술한 골격, 당 및 염기 변형은 입자 (예를 들어, 엑소좀)의 존재하에 올리고뉴클레오티드의 안정성을 증가시키고 로딩 동안 발생할 수 있는 임의의 분해를 최소화한다.
일부 실시양태에 따르면, siRNA 또는 shRNA와 같은 RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 소수성 모이어티를 포함한다. 소수성 모이어티는 또한 이의 소수성 특성을 향상시키기 위해 올리고뉴클레오티드에 화학적으로 접합될 수 있다. 따라서, 하나의 실시양태에서, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 소수성 모이어티와 접합된다. 하나의 실시양태에 따르면, 상기 소수성 모이어티는 스테롤, 강글리오시드, 지질, 비타민, 지방산, 펩티드 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 스테롤과 접합된다. 예시적인 실시양태에서, 모이어티는 스테롤 콜레스테롤 분자이므로, 이러한 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 콜레스테롤과 접합된다. 일부 실시양태에 따르면, 이중 가닥 RNAi의 가닥 중 하나는 콜레스테롤과 같은 소수성 분자와 접합된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 이중 가닥 RNAi의 두 가닥은 콜레스테롤과 같은 소수성 분자와 접합된다. 또 다른 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 모노시알로테트라헥소실강글리오시드 (GM1), 지질, 비타민, 소분자, 펩티드 또는 이들의 조합으로부터 선택된 분자와 접합된다. 일부 실시양태에서, 모이어티는 지질이다. 예를 들면, 특정 실시양태에서, 모이어티는 팔미토일이다. 일부 실시양태에서, 모이어티는 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤이다. 추가의 소수성 모이어티는, 예를 들면, 인지질, 비타민 D, 비타민 E, 스쿠알렌 및 지방산을 포함한다. 또 다른 예시적 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 적하물은 미리스트산 또는 이의 유도체 (예를 들어, 미리스토일화된 올리고뉴클레오티드 적하물)에 접합된다. 일부 실시양태에서, 소수성 모이어티는 올리고뉴클레오티드 적하물의 말단에서 접합된다 (즉, "말단 변형"). 또 다른 실시양태에서, 소수성 모이어티는 올리고뉴클레오티드 분자의 다른 부분에 접합된다.
일부 특정 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4, 및 5로부터 선택되고 콜레스테롤과 같은 소수성 분자에 접합된 핵산 서열을 포함하는 siRNA 분자이다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6 및 7로부터 선택되고 콜레스테롤과 같은 소수성 분자에 접합된 핵산 서열을 표적화하는 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6 및 7로부터 선택되고 소수성 분자와 접합된 핵산 서열을 표적화하는 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 콜레스테롤과 접합된 서열 번호 10의 서열을 갖는 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 11과 함께 콜레스테롤과 접합된 서열 번호 10의 서열을 포함하는 이중 가닥 siRNA이다. 특정 실시양태에 따르면, siRNA는 PTEN 단백질을 암호화하는 핵산의 단편에 상보적인 서열을 포함하고 이의 발현을 억제하며, 여기서 siRNA의 서열 중 적어도 하나는 콜레스테롤과 같은 소수성 분자와 접합된다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 단백질은 서열 번호 1을 포함한다.
특수한 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드는 본원에 기술된 바와 같은 하나 이상의 골격 변형, 당 변형 및/또는 염기 변형의 삽입에 의해 안정화되고, 추가로 소수성 모이어티에 접합된다. 예를 들면, 특정 실시양태에서 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 적어도 30%, 적어도 35%, 적어도 40%, 적어도 45%, 적어도 50%, 적어도 55%, 적어도 60%, 적어도 65% 이상에 하나 이상의 골격 변형, 당 변형 및/또는 염기 변형을 함유할 수 있고, 추가로 본원에 기술된 바와 같이 소수성 모이어티에 접합되며, 예를 들어 스테롤, GM1, 지질, 비타민, 소분자, 또는 펩티드, 또는 이들의 조합에 접합된다. 예시적인 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 적하물은 스테롤, 예를 들어 콜레스테롤에 접합된다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 적하물은 GM1에 접합된다. 또 다른 예시적인 실시양태에서, 올리고뉴클레오티드 적하물은 미리스트산 또는 이의 유도체에 접합된다.
일부 실시양태에서, 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다. 예시적인 표지는 형광 표지 및/또는 방사성 표지를 포함한다. 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드가 형광 표지된 실시양태에서, 검출 가능한 표지는, 예를 들면, Cy3일 수 있다. 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드에 검출 가능한 표지를 부가하는 것은 엑소좀을 표지화하고 이들의 생물분류를 따르는 방법으로서 사용될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 검출 가능한 표지는, 예를 들면, 엑소좀 지질 및/또는 엑소좀 펩티드를 표지함으로써 엑소좀에 직접 부착될 수 있다.
핵산은 당업계에 공지된 임의의 수의 절차를 사용하여 합성될 수 있다. 다수의 자동 핵산 합성기가 이러한 목적을 위해 상업적으로 이용 가능하다. 일부 실시양태에서, 핵산 적하물은 합성 올리고뉴클레오티드이다. 또 다른 실시양태에서, 핵산은, 예를 들면, 제한 효소, 엑소뉴클레아제 또는 엔도뉴클레아제를 사용하여 제조될 수 있다.
상기 실시양태 중의 어느 하나에 따르면, 본 발명에 따르는 약제학적 조성물은 콘드로이티나제 ABC 리아제를 추가로 포함한다.
콘드로이틴 ABC 리아제 (EC 4.2.2.4, 콘드로이티나제, 콘드로이틴 ABC 엘리미나제, 콘드로이티나제 ABC)는 계통명 콘드로이틴 ABC 리아제를 갖는 효소이다. 이 효소는 다음의 화학 반응을 촉매한다:
1,4-베타-D-헥소사미닐 및 1,3-베타-D-글루쿠로노실 또는 1,3-알파-L-이두로노실 결합을 함유하는 다당류의 4-데옥시-베타-D-글룩-4-에누로모실 그룹을 함유하는 이당류로의 제거적 분해. 하나의 실시양태에서, 콘드로이티나제 ABC 리아제는 프로테우스 불가리스 (Proteus vulgaris)로부터 유래된다.
콘드로이티나제 ABC는 단백질 그 자체로서 제공되거나 담체, 예를 들어, 입자 (상기 본원에 기술된 바와 같음)에 제공될 수 있다. 하나의 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 외인성 PTEN 억제제 및 단백질로서의 콘드로이티나제 ABC가 로딩된 세포외 소포를 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 동일한 유형의 세포외 소포 (예를 들어, 중간엽 줄기 세포 유래 엑소좀)에 외인성 PTEN 억제제 및 콘드로이티나제 ABC가 로딩된 세포외 소포를 포함한다. 추가의 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 외인성 PTEN 억제제가 로딩된 세포외 소포 및 콘드로이티나제 ABC가 로딩된 다른 상이한 세포외 소포를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 상이한 세포외 소포는 동일한 유형 (예를 들어 중간엽 줄기 세포 유래 엑소좀) 또는 상이한 유형 (다른 세포 공급원으로부터 유래된 세포외 소포, 예를 들어 PTEN 억제제가 중간엽 줄기 세포 유래 엑소좀에 포함되고 콘드로이티나제 ABC는 치수 유래 엑소좀에 포함되거나 또는 그 반대)일 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 신경 장애를 치료하는데 유용한 부가 치료제를 추가로 포함한다. 이러한 활성제의 비제한적인 예는 강글리오시드; 항생제, 신경 전달 물질, 신경 호르몬, 독소, 신경돌기 촉진 분자; 및 항대사산물 소분자 제제 및 L-DOPA와 같은 신경 전달 물질 분자의 전구체이다. 추가로 또는 대안적으로, 추가의 치료제는 신경 질환의 적어도 하나의 증상을 완화시킬 수 있는 세포이다.
본원에 사용된 용어 "약제학적 조성물"은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 제형화된 외인성 PTEN 억제제, 특히 엑소좀과 같은 세포외 소포가 로딩된 막 소포를 포함하는 조성물을 지칭한다.
약제학적 조성물의 제형은 용도에 따라 조정될 수 있다. 특히, 약제학적 조성물은 포유동물에 투여 후 활성 성분의 신속, 연속 또는 지연 방출을 제공하도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 예를 들면, 제형은 플라스터, 과립, 로션, 도포제, 레모네이드, 방향수제, 분말, 시럽, 안과용 연고, 액체 및 용액, 에어로졸, 스프레이, 추출물, 엘릭시르, 연고, 유동 추출물, 에멀젼, 현탁액, 달임물, 주입물, 안과 용액, 정제, 좌제, 주사제, 증류주, 캡슐, 크림, 구내정, 팅크제, 페이스트, 환제, 및 연질 또는 경질 젤라틴 캡슐로부터 선택된 어느 하나일 수 있다.
본원에 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 담체" 또는 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 약제학적 투여와 상용성인 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 보존제, 항산화제, 코팅제, 등장성 및 흡수 지연제, 계면활성제, 충전제, 붕해제, 결합제, 희석제, 윤활제, 활택제, pH 조절제, 완충제, 강화제, 습윤제, 가용화제, 계면활성제, 산화방지제 등을 지칭한다. 약제학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 조성물은 보충, 추가 또는 강화된 치료 기능을 제공하는 다른 활성 화합물을 함유할 수 있다. 예를 들면, 락토스, 전분 또는 활석과 같은 고체 담체 또는 부형제 또는, 예를 들면, 물, 지방 오일 또는 액체 파라핀과 같은 액체 담체. 담체의 또 다른 예는 DMEM 또는 RPMI와 같은 배양 배지; 자유 라디칼을 제거하고, pH 완충, 종양/삼투 지지체, 에너지 기질 및 저온에서 세포내 상태의 균형을 맞추는 이온 농도를 제공하는 성분을 함유하는 저체온 저장 배지; 및 유기 용매와 물의 혼합물을 포함한다.
제한없이 부형제의 예는 알부민, 혈장, 혈청 및 뇌척수액 (CSF), 항산화제, 예를 들어 N-아세틸시스테인 (NAC) 또는 레스베라트롤을 포함한다. 전형적으로, 약제학적 담체는 적어도 24시간, 적어도 48시간 또는 심지어 적어도 96시간 동안 조성물에서 PTEN 억제제의 입자 수와 활성을 보존한다 (예를 들어, 양은 90% 이상 감소되지 않음).
상기 실시양태 중 어느 하나에 따르면, 약제학적 조성물은 비강내, 병변내, 척수강내, 정맥내, 근육내, 피하, 설하, 경구 및 뇌내 투여 경로로부터 선택된 투여 경로를 통한 투여용으로 제형화된다. 하나의 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 비강내 투여용으로 제형화된다. 일부 실시양태에 따르면, 이러한 약제학적 조성물은 액체 용액, 비강 점적, 스프레이, 측정된 스트레이 (measured stray)의 형태이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 주사용으로, 예를 들어 병변내, 척수강내 또는 정맥내 주사용으로 제형화된다. 이러한 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 멸균 주사 용액의 형태이다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 세포외 소포는 세포로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, EV는 엑소좀, 미세소포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 엑소좀이다. 일부 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 MSC로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 PTEN 발현의 억제제이다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 발현의 억제제는 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 발현의 억제제는 shRNA이다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 핵산 서열 번호 10을 포함하는 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 서열을 포함하는 이중 가닥 siRNA이다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6을 표적화하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 7을 표적화하는 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 PTEN 단백질을 암호화하는 핵산의 단편에 상보적인 서열을 포함하고 이의 발현을 억제한다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 1을 암호화하는 핵산의 단편에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 콜레스테롤과 접합된다. 일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 PTEN 발현을 억제할 수 있고 콜레스테롤과 접합된 siRNA 분자가 로딩된 엑소좀, 미세소포 또는 이들의 조합으로부터 선택된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 2 및 3의 핵산 서열을 갖는다. 다른 이러한 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 4 및 5의 핵산 서열을 갖는다. 또 다른 이러한 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 서열을 포함하는 이중 가닥 siRNA이다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6을 표적화하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 7을 표적화하는 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 1을 암호화하는 핵산의 단편에 상보적인 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 비강내 투여로부터 제형화된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 병변내 투여로부터 제형화된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 경구 투여로부터 제형화된다. 일부 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 콘드로이티나제 ABC와 공동-투여된다.
하나의 실시양태에 따르면, 본 발명은 엑소좀, 미세소포 및 이들의 조합으로부터 선택된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 상기 세포외 소포는 PTEN 발현을 억제할 수 있는 siRNA 또는 shRNA가 로딩되고 약제학적 조성물은 비강내 또는 척수강내 투여용으로 제형화된다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA 또는 shRNA는 콜레스테롤과 접합된다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 콜레스테롤과 임의로 접합된 서열 번호 10, 및 서열 번호 11 또는 이의 변이체(들)의 서열을 포함하는 이중 가닥 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA 또는 shRNA는 서열 번호 2 및/또는 3의 핵산 서열, 또는 이의 변이체를 포함한다. 추가의 실시양태에 따르면, siRNA 또는 shRNA는 서열 번호 4 및/또는 3의 핵산 서열, 또는 이의 변이체를 포함한다.
상기 실시양태 중의 어느 하나에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 신경 질환, 장애, 손상 또는 병태를 치료하는데 유용하다. 하나의 실시양태에 따르면, 신경학적 병태는 척수 손상이다.
하나의 실시양태에 따르면, 막 소포는 리포솜이다. 따라서, 하나의 실시양태에 따르면, 본 발명은 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 리포솜을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 용어 "리포솜"은 지질 이중층으로 둘러싸인 내부 상을 갖는 미시적 폐쇄형 소포를 지칭한다. 리포솜은 작은 단층 소포 (SUV)와 같은 작은 단일-막 리포솜, 큰 단층 소포 (LUV)와 같은 큰 단일-막 리포솜, 거대 단층 소포 (GUV)와 같은 훨씬 더 큰 단일-막 리포솜, 다층 소포 (MLV)와 같은 다중 동심 막을 갖는 다층 리포솜, 또는 다중 소포 (MVV)와 같이 불규칙하고 동심원이 아닌 다중 막을 갖는 리포솜일 수 있다. 하나의 실시양태에 따르면, 리포솜은 SUV이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 리포솜은 MLV이다.
하나의 실시양태에 따르면, 리포솜은 SUV이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 리포솜은 MLV이다. 하나의 실시양태에 따르면, 리포솜은 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레오일포스파티딜 콜린 (POPC), 스핑고인지질, 디스테아로일, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리포솜 형성 지질을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, 리포솜 형성 지질은 포스파티딜콜린이다. 하나의 실시양태에 따르면, 포스파티딜콜린은 수소화된 대두 포스파티딜콜린 (HSPC)이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 포스파티딜에탄올아민은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)이고, 상기 디스테아로일은 디스테아로일 글리콜 (DSG) 또는 옥시카보닐-3-아미노-1,2-프로판디올 디스테아로일에스테르 (DS)이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 리포솜은 폴리알킬에테르, 폴리시알산, 폴리락트산 및 폴리글리콜산과 같은 안정화 중합체 분자를 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, 리포솜은 PEG를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 리포솜은 콜레스테롤을 추가로 포함한다.
하나의 실시양태에 따르면, 리포솜에는 PTEN 억제제가 로딩된다. PTEN 억제제와 관련된 모든 용어 및 실시양태가 본원에 적용된다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 PTEN 발현의 억제제이다. 일부 실시양태에 따르면, PTEN 발현의 억제제는 RNA 간섭 (RNAi) 올리고뉴클레오티드이다. 하나의 실시양태에 따르면, RNAi 올리고뉴클레오티드는 siRNA 및 shRNA로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6을 표적화하는 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 7을 표적화하는 핵산 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에 따르면, siRNA 또는 shRNA와 같은 상기 RNAi 올리고뉴클레오티드는 소수성 모이어티와 접합된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 소수성 모이어티는 스테롤, 강글리오시드, 지질, 비타민, 지방산, 소수성 펩티드 및 이들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA 또는 siRNA는 콜레스테롤과 접합된다.
본 발명의 교시에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 대상체에서 신경 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 따라서, 일부 실시양태에 따르면, 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 입자를 포함하는 약제학적 조성물은 이를 필요로 하는 대상체에서 신경 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용된다. 일부 실시양태에 따르면, 입자는 막 소포이다. 일부 바람직한 실시양태에 따르면, 막 소포는 세포외 소포이다.
따라서, 일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 신경 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
용어 "신경 질환, 장애 또는 병태"는 뇌, 척추 및/또는 이들을 연결하는 신경의 질환, 장애 또는 병태를 지칭한다.
특정 실시양태에 따르면, 병태는 손상으로 인한 것이다. 하나의 실시양태에 따르면, 손상은 척수에 대한 것이며, 즉 척수 손상 (SCI)이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 신경 질환, 장애 또는 병태는 신경 손상이다.
용어 "척수 손상" 및 "SCI"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 척수에 대한 손상을 지칭한다. 하나의 실시양태에 따르면, 손상은 외상의 결과이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 손상 또는 부상은 퇴행 또는 질환의 결과이다. 척수와 신경근이 손상된 위치에 따라, 증상은 통증에서 마비 내지 실금에 이르기까지 매우 다양할 수 있다. 척수 손상은 다양한 수준의 "불완전"으로 설명되며, 이것은 환자에게 영향을 미치지 않는 것부터 전체 기능 상실을 의미하는 "완전한" 손상까지 다양할 수 있다. 척수 손상은 다수의 원인을 갖지만, 전형적으로 자동차 사고, 낙상, 스포츠 부상 및 폭력으로부터의 중증 외상과 관련된다. 따라서, 하나의 실시양태에 따르면, SCI는 완전 및 불완전 SCI로부터 선택된다. 일부 실시양태에 따르면, 척수 손상은 만성 또는 급성 SCI로부터 선택된다. 척수 손상은 신경교 흉터, 수초 억제, 탈수초화, 세포 사멸, 신경영양 지원 부족, 허혈, 자유-라디칼 형성 및 흥분독성을 포함하지만 이에 제한되지 않는 이차 조직 손상에 취약할 수 있다.
척수의 질환은 자가면역 질환 (예를 들어, 다발성 경화증 (multiple sclerosis)), 염증 질환 (예를 들어, 지주막염 (Arachnoiditis)), 신경퇴행성 질환, 소아마비, 이분 척추 (spina bifida) 및 척추 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 교시에 따라 치료될 수 있는 대상체는 인간, 마우스, 래트, 원숭이, 개 및 고양이와 같은 포유류 대상체를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 대상체는 인간 대상체이다.
병태 또는 환자를 "치료하는"이라는 용어는 임상 결과를 포함하여 유익하거나 원하는 결과를 수득하기 위한 조치를 취하는 것을 지칭한다. 유익하거나 원하는 임상 결과는 질환, 병태 또는 장애의 진행을 개선하거나, 제거하거나, 실질적으로 억제하거나, 늦추거나 역전시키고, 병태의 임상적 또는 심미적 증상을 실질적으로 개선 또는 완화하고, 질환, 병태 또는 장애의 임상적 또는 심미적 증상의 출현을 실질적으로 예방하고, 유해하거나 성가신 증상으로부터 보호함을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 치료는 추가로 다음 중 하나 이상을 달성함을 지칭한다: (a) 장애의 중증도 감소; (b) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상의 발달을 제한함; (c) 치료되는 장애(들)의 특징적인 증상 악화 제한; (d) 이전에 장애(들)를 앓았던 환자에서 장애(들)의 재발 제한; 및/또는 (e) 이전에 장애(들)에 대해 무증상이었던 환자에서 증상의 재발을 제한함. 일부 실시양태에 따르면, 용어 "치료하는"은 손상 부위에서의 신경 재생, 축삭 증식, 감소된 성상교세포증 및 미세아교세포증을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, 이 용어는 질환 또는 병태와 관련된 증상의 개선을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, 용어 "치료하는"은 운동 매개변수의 개선을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, 운동 매개변수의 개선은 치료되지 않은 대상체와 비교하여 운동 매개변수의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 또는 90%의 개선을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 치료는 손상 부위에서 성상교세포증 및/또는 미세아교세포증을 감소시킴을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, 성상교세포증 및/또는 미세아교세포증을 감소시킴은 치료되지 않은 대상체와 비교하여 성상교세포증 및/또는 미세아교세포증의 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 또는 80%의 감소를 포함한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 임의의 공지된 방법을 사용하여 투여될 수 있다. 물질, 화합물 또는 제제를 대상체에게 "투여하는" 또는 "투여"라는 용어는 당업계의 숙련가들에게 공지된 다양한 방법 중 하나를 사용하여 수행될 수 있다. 예를 들면, 화합물 또는 제제는 비강내 (예를 들어, 흡입에 의해), 척수강내 (척추관으로 또는 지주막하 공간으로), 동맥, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 안구, 설하, 경구 (섭취에 의해), 뇌내 및 경피 (예를 들어, 피부 도관을 통한 흡수에 의해)로 투여될 수 있다. 화합물 또는 제제는 또한 화합물 또는 제제의 연장 방출, 서방출 또는 제어 방출을 제공하는 재충전성 또는 생분해성 중합체 장치 또는 기타 장치, 예를 들어 패치 및 펌프, 또는 제형에 의해 적절하게 도입될 수 있다. 투여는 또한, 예를 들면, 한 번, 여러 번 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 조성물은 1일 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 조성물은 한 달에 1, 2, 3, 4, 5 또는 6회 투여된다. 일부 실시양태에서, 투여는 자가 투여를 포함한 직접 투여와 약물 처방 행위를 포함한 간접 투여 모두를 포함한다. 예를 들면, 본원에 사용된 바와 같이, 환자에게 약물을 자가 투여하도록 지시하거나 다른 사람이 약물을 투여하도록 지시하고/하거나 환자에게 약물 처방을 제공하는 의사는 약물을 환자에게 투여하고 있는 것이다. 하나의 실시양태에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 비강내 투여된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명의 약제학적 조성물은 병변내 투여된다. 하나의 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 경구 투여된다.
특정 실시양태에 따르면, 신경 질환은 신경계의 퇴행성 질환이다. 하나의 실시양태에 따르면, 신경계의 퇴행성 질환은 파킨슨병 (Parkinson's disease), 본태성 진전 (essential tremor), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), ALS 및 기질성 정신병 (organic psychosis)으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에 따르면, 질환은 기억 질환이다. 하나의 실시양태에서, 질환은 자폐증 (autism) 또는 조현병 (schizophrenia)과 같은 신경발달 장애이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 질환은 조현병 (schizophrenia), 주의력 결핍 과잉행동 장애 (attention deficit hyperactivity disorder), 자폐증 (autism), 투렛 증후군 (Tourette's syndrome), 강박 장애 (obsessive compulsive disorder) 및 신경행동 관련 증상과 같은 행동 질환이다. 특정 실시양태에 따르면, 신경 질환은 자폐 범주성 장애 (autism spectrum disorder; ASD)이다.
상기 실시양태 중의 어느 하나에 따르면, 본 발명은 대상체에서 신경세포의 손상 (neuronal injury) 또는 부상 (damage)을 치료하는데 사용하기 위한, 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 막 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 신경세포의 손상은 척수 손상이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 손상은 뇌의 신경 세포에 대한 손상이다. 하나의 실시양태에 따르면, 손상은 뇌 손상이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 손상은 신경퇴행성 질환으로 인한 것이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 신경퇴행성 질환은 파킨슨병 (Parkinson's disease), 본태성 진전 (essential tremor), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), ALS 및 기질성 정신병 (organic psychosis)으로부터 선택된다.
따라서, 일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 대상체에서 신경세포의 손상 또는 부상을 치료하는데 사용하기 위한, 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공하며, 여기서 세포외 소포는 세포로부터 유래된다.
하나의 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 엑소좀이다. 또 다른 실시양태에 따르면, EV는 미세소포이다. 하나의 실시양태에 따르면, EV는 엑소좀, 미세소포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 MSC로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, 외인성 PTEN 억제제는 PTEN 발현의 억제제이다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 발현의 억제제는 siRNA 또는 shRNA이다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6 및 7로부터 선택된 서열에 상보적이거나 이를 표적으로 한다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 PTEN 단백질을 암호화하는 핵산의 단편에 상보적인 서열을 포함하고 이의 발현을 억제한다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN은 서열 번호 1을 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 핵산 서열 10을 포함하는 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 서열을 포함하는 이중 가닥 siRNA이다. 추가의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 shRNA이다. 하나의 실시양태에 따르면, shRNA는 서열 번호 6 및 7로부터 선택된 서열을 표적으로 하거나 이에 상보적이다. 일부 특정 실시양태에 따르면, shRNA는 콜레스테롤과 접합된다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 척수 손상을 치료하는데 사용하기 위한, 콜레스테롤과 접합된 PTEN 발현을 억제할 수 있는 siRNA 올리고뉴클레오티드가 로딩된 엑소좀, 미세소포 또는 이들의 조합으로부터 선택된 EV를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 이러한 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 갖는다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 비강내 투여된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 병변내 투여된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 경구 투여된다.
상기 실시양태 중 어느 하나에 따르면, 치료는 본 발명의 약제학적 조성물을 콘드로이티나제 ABC 리아제와 공동-투여함을 포함한다.
하나의 실시양태에서, 콘드로이티나제 ABC 리아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 환자에게 제공된다 (즉, 유전자 요법을 통해). 콘드로이티나제 ABC 리아제를 발현하기 위한 발현 작제물은 아래에서 추가로 기술된다. 콘드로이티나제 ABC 리아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 입자에 업로딩될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 효소 자체가 환자에게 제공된다.
특정 실시양태에서, PTEN 억제제 및 콘드로이티나제 ABC 둘 다는 동일한 입자에 공동-제형화된다. 또 다른 실시양태에서, PTEN 억제제 및 콘드로이티나제 ABC는 동일한 입자 유형 (예를 들어, 중간엽 줄기 세포 유래 엑소좀)에 로딩되지만, 동일한 입자 자체는 아니다. 여전히 또 다른 실시양태에서, PTEN 억제제 및 콘드로이티나제 ABC는 상이한 입자 유형에 로딩된다 (예를 들어, PTEN 억제제는 중간엽 줄기 세포 유래 엑소좀에 포함되고 콘드로이티나제 ABC는 치수 유래 엑소좀에 포함되거나 그 반대도 가능함).
일부 실시양태에 따르면, 상기 용도는 신경 장애를 치료하는데 유용한 치료제, 예컨대 강글리오시드; 항생제, 신경 전달 물질, 신경 호르몬, 독소, 신경돌기 촉진 분자; 및 항대사산물 소분자 제제 및 L-DOPA와 같은 신경 전달 물질 분자의 전구체와 또는 신경 질환의 적어도 하나의 증상을 완화할 수 있는 세포와 공동-투여됨을 추가로 포함한다.
일부 실시양태에 따르면 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 입자는 상기 정의된 바와 같은 리포솜이다. 따라서, 일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 신경 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한, PTEN 억제제가 로딩된 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 병태는 척수 손상이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 막 소포의 치료적 유효량을 대상체에게 투여하여, 신경세포의 손상, 부상 질환 (damage disease) 또는 장애를 치료하는 것을 포함하는, 이를 필요로 하는 대상체에서 신경세포의 손상, 부상 질환 또는 장애를 치료하는 방법을 제공한다. 상기 실시양태 및 측면의 모든 용어는 여기서도 적용된다. 일부 실시양태에 따라, 막 소포는 상기 기재된 바와 같이 세포외 소포이다.
본 발명의 막 소포는 특성이 이식 부위에 따라 좌우되는 이식 접근법을 포함하여 상기 정의된 바와 같은 다양한 투여 경로를 사용하여 치료 개체에게 투여될 수 있다.
용어 또는 어구 "이식 (transplantation)", "세포 대체 (cell replacement)" 또는 "조직이식 (grafting)" 주사는 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 본 발명의 입자를 뇌, 회백질 등과 같은 표적 조직에 도입하는 것을 지칭한다. 입자가 입수되는 중간엽 줄기 세포는 수용자 (동종) 또는 비-동종 또는 이종 기증자로부터 유래할 수 있다.
막 소포는 척수에 직접 (척수강내), 정맥내, 뇌에 직접 이식되거나 뇌에 도달하도록 이들의 조합으로 이식될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 입자는 비-침습적으로, 예를 들어 비강내로 전달된다. 전신 투여와 같은 다른 투여 방식이 또한 고려된다.
치료 당 (예를 들어, 비강내) 투여될 수 있는 막 소포 (예를 들어, 엑소좀)의 예시적인 용량은 70 kg 인간의 경우 1 x 106 - 1 x 1020 및 또는 1 x 109 - 1 x 1015일 수 있다.
대상체에게 투여될 때 막 소포의 "치료적 유효량"이라는 용어는 의도된 치료 효과를 가질 것이며, 예를 들어 SCI와 같은 신경세포의 손상을 치료할 것이다. 완전한 치료 효과는 1회 용량의 투여로 반드시 발생하는 것은 아니며, 일련의 용량의 투여 후에만 발생할 수 있다. 따라서, 치료적 유효량은 1회 이상의 투여로 투여될 수 있다. 대상체에 필요한 정확한 유효량은, 예를 들면, 대상체의 크기, 건강 및 연령, 인지 장애의 성질 및 정도, 및 투여를 위해 선택된 치료제 또는 치료제의 조합, 및 투여 방식에 따라 좌우될 것이다. 숙련가는 일상적인 실험을 통해 주어진 상황에 대한 유효량을 쉽게 결정할 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, EV와 같은 막 소포는 비강내, 병변내, 비경구, 국소, 전신 또는 경구 투여된다.
본원에 기술된 활성 성분의 독성 및 치료 효능은 시험관내, 세포 배양 또는 실험 동물에서 표준 약제학적 절차에 의해 결정될 수 있다.
이러한 시험관내 및 세포 배양 분석과 동물 연구에서 수득된 데이터는 인간에서 사용하기 위한 다양한 투여량을 제형화하는데 사용될 수 있다. 추가 정보는 임상 연구로부터 수득될 수 있다 - 예를 들면, 문헌 [Salem HK et al., Stem Cells 2010; 28:585-96; and Uccelli et al. Lancet Neurol. 2011; 10:649-56]을 참조한다.
투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태를 고려하여 개별 의사에 의해 선택될 수 있다.
주사를 위해, 약제학적 조성물의 활성 성분은 수용액, 바람직하게는 행크액, 링거액 또는 생리학적 염 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액 및 본원에 상기 기술된 바와 같은 추가 제제로 제형화될 수 있다.
투여량 및 투여 간격은 신경 장애를 효과적으로 치료하기에 충분한 활성 성분의 수준으로 개별적으로 조정될 수 있다. 원하는 효과를 달성하는데 필요한 투여량은 개인의 특성과 투여 경로에 따라 좌우될 것이다.
치료할 병태의 중증도 및 반응성에 따라, 입자의 투여는 단일 또는 다중 투여일 수 있으며, 치료의 과정은 질병 상태의 감소가 달성되는 시기에 따라 수 일 내지 수 주 또는 수 개월간 지속된다.
투여되는 입자의 양은 물론 치료될 개인, 고통의 중증도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 따라 좌우될 것이다. 투여량 및 투여 시기는 개인의 변화 상태를 주의깊게 지속적으로 모니터링하는데 반응을 보일 것이다.
투여 후, 입자가 표적 부위에 도달했는지 확인하기 위해 입자를 추적할 수 있다. 이것은 예를 들어 금 나노입자를 사용하여 수행될 수 있다 - 제WO 2013/186735 A3호 참조.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에서 신경 질환, 장애 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한 약제의 제조에 사용하기 위한 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 세포외 소포를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 단리된 세포외 소포이다. 하나의 실시양태에 따르면, 신경학적 병태는 척수 손상이다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 지질 이중층 인지질 막 소포를 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 막 소포는 단리된 세포외 소포이다.
따라서, 일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 세포외 소포를 제공하며, 여기서 세포외 소포는 세포로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 세포외 소포, 리포솜, 엑토좀 및 트렌스페로솜으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 엑소좀, 미세소포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에 따르면, EV는 엑소좀이다. 하나의 실시양태에 따르면, EV는 미세소포이다. 하나의 실시양태에 따르면, 미세소포는 100 내지 1000 nm, 120 내지 800 nm, 150 내지 600 nm, 200 내지 400 nm의 직경을 갖는다. 또 다른 실시양태에 따르면, 미세소포는 100 내지 300 nm 또는 150 내지 250 nm의 크기를 갖는다. 일부 실시양태에 따르면, EV는 30 내지 250 nm 또는 50 내지 200 nm의 직경을 갖는다. 일부 실시양태에 따르면, EV는 70 내지 170 nm 또는 80 내지 150 nm의 직경을 갖는다.
상기 실시양태 중의 어느 하나에 따르면, EV는 세포로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, EV, 예를 들어, 엑소좀은 중간엽 마커를 발현하는 세포로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, 세포는 부착 세포이다. 일부 실시양태에 따르면, 세포는 중간엽 줄기 세포, 구강 점막 줄기 세포 및 후각 초성 세포로부터 선택된다. 일부 실시양태에 따르면, 세포는 중간엽 줄기 세포 (MSC)이다. 하나의 실시양태에 따르면, 중간엽 줄기 세포는 골수, 지방 조직, 탯줄, 치수, 구강 점막, 말초 혈액 및 양수로부터 선택된 부위로부터 기원한다. 일부 실시양태에 따르면, EV는 골수 기원 MSC로부터 유래된다. 또 다른 실시양태에 따르면, EV는 지방 조직 기원 MSC로부터 유래된다. 일부 이러한 실시양태에 따르면, EV는 엑소좀, 미세소포 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 따르면, 세포는 CD105, CD166, CD29, CD90, 및 CD73 마커를 발현한다. 추가의 실시양태에 따르면, 세포는 CD105, CD166, CD29, CD90, 및 CD73은 발현하고, CD34, CD45 및 CD133은 발현하지 않는다. 일부 실시양태에 따르면, 세포는 치수 줄기 세포 (DPSCs), 탈락 유치 줄기 세포 (SHED), 치주 인대 줄기 세포 (PDLSCs), 치근단 유두 줄기 세포 (SCAP) 및 치낭 전구 세포 (DFPCs)로부터 선택된다.
EV는 중간엽 줄기 세포의 적어도 하나의 특성을 가질 수 있다. 입자는 생물학적 활성과 같은 생물학적 특성을 가질 수 있다. 입자는 MSC의 생물학적 활성 중의 어느 것을 가질 수 있다. 입자는 예를 들면 MSC의 치료 또는 회복 활성을 가질 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, EV는 신경 능선 세포 (NCC)로부터의 마커를 발현하는 세포로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, 세포는 신경 능선 세포이다. 일부 실시양태에 따르면, 신경 능선 세포는 두개골 신경 능선 세포이다. 하나의 실시양태에 따르면, 두개골 신경 능선 세포는 치수 줄기 세포 (DPSCs), 탈락 유치 줄기 세포 (SHED), 치주 인대 줄기 세포 (PDLSCs), 치근단 유두 줄기 세포 (SCAP) 및 치낭 전구 세포 (DFPCs)로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 세포는 상기 정의된 바와 같은 중간엽 마커를 발현한다.
상기 실시양태 중의 어느 하나에 따르면, EV는 세포로부터 단리된다. 따라서, 일부 실시양태에 따르면, EV는 단리된 EV, 예를 들어 단리된 엑소좀 및/또는 미세소포이다. 하나의 실시양태에 따르면, 잔류 모 세포에 대한 EV의 비율은 초기 물질에서보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8 또는 10배 더 높거나, 특정의 유리한 실시양태에서, 적어도 50, 100 또는 1000배 더 높다. 일부 실시양태에 따르면, EV는 무세포 EV이다.
EV는 다수의 방식으로 생산되거나 단리될 수 있다. 이러한 방법은 중간엽 줄기 세포 (MSC) 또는 신경 능선 세포 (NCC)로부터 EV를 단리함을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 단리된 세포외 소포는 무세포이다.
상기 실시양태 중의 어느 하나에 따르면, 세포외 소포는 상기 측면 및 실시양태 중의 어느 하나에 정의된 바와 같은 PTEN 억제제를 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, 세포외 소포에는 PTEN 억제제가 로딩된다. 하나의 실시양태에 따르면, 단리된 세포외 소포에는 상기 PTEN 억제제가 로딩된다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 PTEN 활성을 억제하거나 하향조절한다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 PTEN 발현을 억제하거나 하향조절한다.
하나의 실시양태에 따르면, 외인성 PTEN 억제제는 단백질 또는 펩티드이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 외인성 PTEN 억제제는 소분자이다. 일부 실시양태에 따르면, 외인성 PTEN 억제제는 PTEN 발현의 억제제이다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 발현의 외인성 억제제는 폴리뉴클레오티드 제제 또는 올리고뉴클레오티드 제제이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 외인성 PTEN 억제제는 RNA 간섭 올리고뉴클레오티드이다. 하나의 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 shRNA이다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 siRNA이다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 갖는다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 10의 서열을 갖는 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제는 서열 번호 10 및 서열 번호 11의 서열을 포함하는 이중 가닥 siRNA이다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 PTEN 단백질을 암호화하는 핵산의 단편에 상보적인 서열을 포함하고 이의 발현을 억제한다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 1을 암호화하는 핵산의 단편에 상보적인 서열을 포함한다. 따라서, 하나의 실시양태에 따르면, 세포외 소포에는 서열 번호 2 및 3 또는 서열 번호 4 및 5의 핵산 서열을 갖는 siRNA가 로딩된다. 특정 실시양태에 따르면, 단리된 세포외 소포에는 서열 번호 10 및 11의 핵산 서열을 갖는 siRNA가 로딩된다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열의 변이체이고, 원래의 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, 단리된 세포외 소포에는 서열 번호 10 및 11로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 shRNA가 로딩된다. 하나의 실시양태에 따르면, shRNA는 서열 번호 2 및 3의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, shRNA는 서열 번호 4 및 5의 핵산 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6 또는 7의 서열에 상보적인 핵산을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, shRNA는 서열 번호 8 및 9로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드 억제제, 예를 들어, siRNA 또는 shRNA는 소수성 모이어티를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 소수성 모이어티는 스테롤, 강글리오시드, 지질, 비타민, 지방산, 펩티드 또는 이들의 조합이다. 하나의 실시양태에 따르면, 스테롤은 콜레스테롤이다.
하나의 특정 실시양태에 따르면, 본 발명은 PTEN 발현을 억제하는 siRNA 분자가 로딩된 중간엽 줄기 세포로부터 유래된 단리된 엑소좀을 제공한다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 콜레스테롤 모이어티를 포함하며, 예를 들어, 이것과 접합된다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 포함하고 콜레스테롤과 접합된다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10 및 11의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6을 표적화하는 핵산 서열을 포함하고 콜레스테롤과 접합된다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 7을 표적화하는 핵산 서열을 포함하고 콜레스테롤과 접합된다.
일부 실시양태에 따르면, 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된 단리된 세포외 소포는 신경 질환, 장애, 손상 또는 병태를 치료하는데 유용하다. 하나의 실시양태에 따르면, 신경학적 병태는 척수 손상이다. 따라서, 하나의 실시양태에 따르면, 본 발명은 척수 손상을 치료하는데 사용하기 위한 세포외 소포를 제공하며, 여기서 상기 막 소포에는 외인성 포스파타제 및 텐신 동족체 (PTEN) 억제제가 로딩된다. 특정 실시양태에 따르면, 신경 질환은 신경계의 퇴행성 질환이다. 하나의 실시양태에 따르면, 신경계의 퇴행성 질환은 파킨슨병 (Parkinson's disease), 본태성 진전 (essential tremor), 헌팅턴병 (Huntington's disease), 알츠하이머병 (Alzheimer's disease), 다발성 경화증 (multiple sclerosis), ALS 및 기질성 정신병 (organic psychosis)으로부터 선택된다. 하나의 실시양태에 따르면, 질환은 기억 질환이다. 하나의 실시양태에서, 질환은 자폐증 (autism) 또는 조현병 (schizophrenia)과 같은 신경발달 장애이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 질환은 조현병 (schizophrenia), 주의력 결핍 과잉행동 장애 (attention deficit hyperactivity disorder), 자폐증 (autism), 투렛 증후군 (Tourette's syndrome), 강박 장애 (obsessive compulsive disorder) 및 신경행동 관련 증상과 같은 행동 질환이다.
일부 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 콘드로이티나제 ABC 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, PTEN 억제제가 로딩된 EV는 콘드로이티나제 ABC 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함한다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 상기 실시양태 중 어느 하나에 따르는 단리된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 신경 질환, 장애, 손상 또는 병태를 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 하나의 실시양태에 따르면, 약제학적 조성물은 척수 손상을 치료하는데 사용하기 위한 것이다.
일부 실시양태에 따르면, 막 소포는 리포솜이다. 하나의 실시양태에 따르면, 리포솜은 SUV이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 리포솜은 MLV이다. 하나의 실시양태에 따르면, 리포솜은 포스파티딜콜린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜에탄올아민, 1-팔미토일-2-올레오일포스파티딜 콜린 (POPC), 스핑고인지질, 디스테아로일, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 리포솜 형성 지질을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, 리포솜 형성 지질은 포스파티딜콜린이다. 하나의 실시양태에 따르면, 포스파티딜콜린은 수소화 대두 포스파티딜콜린 (HSPC)이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 포스파티딜에탄올아민은 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 (DSPE)이고, 상기 디스테아로일은 디스테아로일 글리콜 (DSG) 또는 옥시카보닐-3-아미노-1,2-프로판디올 디스테아로일에스테르 (DS)이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 리포솜은 폴리알킬에테르, 폴리시알산, 폴리락트산 및 폴리글리콜산과 같은 안정화 중합체 분자를 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, 리포솜은 PEG를 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 리포솜은 콜레스테롤을 추가로 포함한다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 본 발명의 외인성 PTEN 억제제가 로딩된 세포외 소포의 제조방법을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 세포외 소포는 엑소좀이다. 또 다른 실시양태에 따르면, EV는 미세소포이다. 추가의 실시양태에 따르면, EV는 미세소포와 엑소좀의 조합이다. 엑소좀 및 미세소포는 상기 실시양태 및 측면 중의 어느 하나에 정의된 바와 같다. 일부 실시양태에 따르면, EV는 중간엽 마커를 발현하는 세포로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, 중간엽 마커를 발현하는 세포는 중간엽 줄기 세포, 구강 점막 줄기 세포 및 후각 초성 세포로부터 선택된다. 또 다른 실시양태에 따르면, EV는 신경 능선 세포, 예를 들어 두개골 신경 능선 세포로부터 유래된다. 하나의 실시양태에 따르면, 엑소좀과 같은 EV는 중간엽 줄기 세포로부터 유래된다. 일부 실시양태에 따르면, MSC는 골수, 지방 조직, 치수, 구강 점막, 말초 혈액 및 양수로부터 선택된 조직으로부터 단리한다. 일부 실시양태에 따르면, 중간엽 줄기 세포는 전형적으로 마커 CD105, CD166, CD29, CD90, 및 CD73은 발현하고, 마커 CD34, CD45 및 CD133은 발현하지 않는다.
상기 방법은 중간엽 줄기 세포 조절 배지 (MSC-CM) 또는 신경 능선 세포 조절 배지 (NCC-CM)로부터 EV를 단리함을 포함할 수 있다. EV는 예를 들면 EV의 임의의 특성에 기반하여 관련되지 않은 구성요소로부터 분리함으로써 단리될 수 있다. 예를 들면, EV는 분자량, 크기, 형태, 조성 또는 생물학적 활성에 기반하여 단리될 수 있다.
조절 배지는 분리 동안, 분리 전에 또는 분리 후에 여과되거나 농축되거나 둘 다 될 수 있다. 예를 들면, 이것은 막, 예를 들면 크기 또는 분자량 컷-오프를 갖는 막을 통해 여과될 수 있다. 이것은 접선 힘 여과 또는 한외여과에 적용될 수 있다.
예를 들면, 이 문서의 다른 곳에서 분자량에 대한 분석에 기술된 바와 같이 적합한 분자량 또는 크기 컷오프의 막을 사용한 여과가 사용될 수 있다.
임의로 여과되거나 농축되거나 둘 다된 조절 배지를 컬럼 크로마토그래피와 같은 추가 분리 수단에 적용할 수 있다. 예를 들면, 다양한 컬럼이 있는 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC)가 사용될 수 있다. 컬럼은 크기 배제 컬럼 또는 결합 컬럼일 수 있다.
입자의 하나 이상의 특성 또는 생물학적 활성을 사용하여 세포 조절 배지의 분별 동안 이의 활성을 추적할 수 있다. 예로서, 광 산란, 굴절률, 동적 광 산란 또는 UV-가시광선 검출기를 사용하여 입자를 추적할 수 있다. 예를 들면, 심장보호 활성과 같은 치료 활성이 분별 동안 활성을 추적하는데 사용될 수 있다.
하기 단락은 엑소좀과 같은 중간엽 줄기 세포 EV를 수득할 수 있는 방법에 대한 구체적인 비제한적인 예를 제공한다.
중간엽 줄기 세포 EV는 중간엽 줄기 세포를 배지에서 배양하여 이를 컨디셔닝함으로써 생산될 수 있다. 배지는 DMEM을 포함할 수 있다. DMEM은 페놀 레드를 포함하지 않는 것일 수 있다. 배지는 인슐린, 트랜스페린 또는 셀렌단백질 (ITS) 또는 이들의 조합으로 보충될 수 있다. 이것은 FGF2를 포함할 수 있다. 이것은 PDGF AB를 포함할 수 있다. FGF2의 농도는 약 5 ng/ml FGF2일 수 있다. PDGF AB의 농도는 약 5 ng/ml일 수 있다. 배지는 글루타민-페니실린-스트렙토마이신 또는 -머캅토에탄올, 또는 이들의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 또는 그 이상, 예를 들면, 3일 동안 배양될 수 있다. 조절 배지는 배지로부터 세포를 분리함으로써 수득될 수 있다. 조절 배지는 예를 들면 500g에서 원심분리될 수 있다. 이것은 막을 통한 여과에 의해 농축될 수 있다. 막은 >1000 kDa 막을 포함할 수 있다. 조절 배지는 약 50배 이상 농축될 수 있다.
조절 배지는 HPLC와 같은 액체 크로마토그래피에 적용될 수 있다. 조절 배지는 크기 배제에 의해 분리될 수 있다. 세파로스와 같은 임의의 크기 배제 매트릭스가 사용될 수 있다. 예로서, TSK Guard 컬럼 SWXL, 6 x 40 mm 또는 TSK 겔 G4000 SWXL, 7.8 x 300 mm가 사용될 수 있다. 용리제 완충액은 식염수와 같은 생리학적 매질을 포함할 수 있다. 이것은 pH 7.2에서 150 mM의 NaCl과 함께 20 mM 인산염 완충액을 포함할 수 있다. 크로마토그래피 시스템은 0.5 ml/min의 유속으로 평형화될 수 있다. 용리 모드는 등용매일 수 있다. 220 nm에서의 UV 흡광도를 사용하여 용리 진행을 추적할 수 있다. 분획은 준-탄성 광 산란 (QELS) 검출기를 사용하여 동적 광 산란 (DLS)에 대해 검사할 수 있다.
동적 광 산란을 나타내는 것으로 밝혀진 분획은 유지될 수 있다. 예를 들면, 상기한 바와 같은 일반적인 방법으로 생성되고 11-13분, 예를 들어 12분의 체류 시간으로 용리되는 분획은 동적 광 산란을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 이 피크에서 입자 rh는 약 45-55 nm이다. 이러한 분획은 엑소좀과 같은 중간엽 줄기 세포 EV를 포함한다.
하나의 실시양태에 따르면, 외인성 PTEN 억제제는 PTEN 발현의 억제제이다. 하나의 실시양태에 따르면, 외인성 PTEN은 RNA 간섭 올리고뉴클레오티드이다. 하나의 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 siRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 shRNA이다. 일부 실시양태에 따르면, RNAi 올리고뉴클레오티드는 소수성 모이어티와 접합된다. 하나의 실시양태에 따르면, 소수성 모이어티는 스테롤, 강글리오시드, 지질, 비타민, 지방산, 펩티드 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 일부 실시양태에 따르면, RNA 간섭 올리고뉴클레오티드는 콜레스테롤과 접합된다. 따라서, 하나의 실시양태에서, RNAi, 예를 들어, siRNA는 콜레스테롤과 접합된다.
폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA는 또한 EV에 직접 로딩될 수 있음을 인지할 것이다. 하나의 실시양태에서, EV에의 RNAi 올리고뉴클레오티드의 직접 로딩은 전기천공에 의해 및/또는 형질감염제의 사용으로 수행된다. 대안적인 실시양태에서, 로딩은 전기천공의 부재하에서 및/또는 형질감염제의 부재하에서 수행된다.
하나의 실시양태에 따르면, EV는 입자를 핵산 기반 억제제로 로딩하기에 충분한 시간 동안 RNAi 올리고뉴클레오티드 억제제와 함께 배양된다. 핵산 기반 억제제 적하물로 EV를 로딩하기에 충분한 시간의 지속기간은 특정 유형의 적하물에 대해 및 소수성 변형을 포함하도록 변형된 경우 변형 유형에 대해 최적화될 수 있다. 일반적으로, 약 1시간 이하의 배양이 입자를 핵산 적하물로 효율적으로 로딩하기에 충분하다. 다수의 경우에, 소수성으로 변형된 적하물은 매우 빠른 시간, 예를 들면 5분 이내에 엑소좀에 효율적으로 로딩된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 효율적인 로딩은 5분 이하, 예를 들어 1 내지 5분의 배양 기간 동안 발생한다. 예시적인 실시양태에서, 효율적인 로딩은 5분, 10분, 15분, 20분, 30분 등의 배양 기간 동안 발생한다. 또 다른 실시양태에서, 효율적인 로딩은 1시간 이내, 2시간 이내, 3시간 이내, 4시간 이내, 5시간 이내, 6시간 이내, 7시간 이내, 8시간 이내, 9시간 이내, 10시간 이내, 12시간 이내, 24시간 이내 등에서 발생할 수 있다.
EV를 올리고뉴클레오티드로 로딩하는 것은 매우 온도 의존적이지는 않다. 예시적인 실시양태에서, 엑소좀은 약 37℃ 또는 그 부근에서 로딩된다. 또 다른 실시양태에서, EV (예를 들어, 엑소좀)는 실온에서 또는 그 부근에서 로딩될 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 엑소좀은 4℃ 또는 그 부근에서 로딩될 수 있다.
일부 실시양태에 따르면, EV는 초원심분리를 사용하지 않고 로딩될 수 있다. 또 다른 실시양태에 따르면, 로딩은 초원심분리를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 제조방법은 로딩된 EV의 정제 또는 단리 단계를 추가로 포함한다. 하나의 실시양태에 따르면, 단리는 원심분리, 예를 들어 초원심분리에 의해 수행된다. 또 다른 실시양태에 따르면, 단리는 여과를 통해 수행된다. 하나의 실시양태에 따르면, 정제 후 잔류 모 세포에 대한 EV의 비율은 초기 물질에서보다 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 8 또는 10배 더 높거나, 특정의 유리한 실시양태에서, 적어도 50, 100 또는 1000배 더 높다. 일부 실시양태에 따르면, EV는 무세포 EV이다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 EV, 예를 들어, 엑소좀의 제조방법을 제공하며, 상기 방법은 EV를 25 내지 42℃의 온도에서 0.5 내지 5시간 동안 siRNA 또는 shRNA와 같은 콜레스테롤-접합된 RNAi 올리고뉴클레오티드와 배양함을 포함한다.
하나의 실시양태에 따르면, 상기 방법은 로딩된 EV를 원심분리, 예를 들어 초원심분리를 사용하여 단리하는 단계를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, 또 다른 소수성 모이어티가 콜레스테롤 대신에 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에 따르면, RNAi 올리고뉴클레오티드는 siRNA이다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 2의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 3의 핵산 서열을 포함한다. 특정 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 4의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 5의 핵산 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 10의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 11의 핵산 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6의 핵산 서열에 상보적이다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA는 서열 번호 6의 핵산 서열을 표적으로 한다. 일부 실시양태에 따르면, RNAi 올리고뉴클레오티드는 shRNA이다. 하나의 실시양태에 따르면, siRNA 또는 shRNA는 서열 번호 2 및 3의 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, siRNA 또는 shRNA는 서열 번호 4 및 5의 핵산 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에 따르면, siRNA 또는 shRNA는 서열 번호 10 및 11의 핵산 서열을 포함한다. 추가의 실시양태에 따르면, shRNA는 서열 번호 6 또는 7에 상보적인 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 실시양태에 따르면, shRNA는 서열 번호 8 및 9로부터 선택된 서열을 포함한다. 일부 실시양태에 따르면, shRNA 또는 siRNA는 PTEN 단백질을 암호화하는 핵산의 단편에 상보적인 서열을 포함하고 이의 발현을 억제한다. 하나의 실시양태에 따르면, PTEN은 아미노산 서열 번호 1을 포함한다.
일부 실시양태에서, 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드 적하물의 50% 이상이 본원에 기술된 방법을 사용하여 엑소좀에 로딩된다. 따라서, 일부 실시양태에서, 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드 적하물은 5 내지 40%의 효율로 엑소좀에 로딩된다. 따라서, 하나의 실시양태에서, 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드 적하물은 10 내지 35%, 15 내지 30% 또는 20 내지 25%의 효율로 엑소좀에 로딩된다. 예를 들면, 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드 적하물은 5% 이상, 10% 이상, 15% 이상, 20% 이상, 25% 이상, 30% 이상, 35% 이상, 40% 이상, 또는 50% 이상의 효율로 엑소좀에 로딩된다. 본원에 기술된 방법은 소수성으로 변형된 올리고 뉴클레오티드를 치료되는 모든 또는 거의 모든 엑소좀에 혼입한다. 예를 들면, 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드와 함께 배양된 엑소좀의 적어도 80%가 올리고뉴클레오티드로 로딩된다. 일부 실시양태에서, 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드 적하물은 올리고뉴클레오티드와 함께 배양된 엑소좀의 적어도 90%에 혼입된다. 따라서, 엑소좀의 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 이상에 올리고뉴클레오티드 적하물이 로딩된 엑소좀의 집단이 쉽게 수득될 수 있다. 하나의 실시양태에서 엑소좀의 적어도 99%에는 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드가 로딩된다.
EV (예를 들어, 엑소좀)는 입자 (예를 들어 엑소좀) 당 500개 이상의 올리고뉴클레오티드 분자, 예를 들어, 엑소좀 당 적어도 500, 적어도 600, 적어도 700, 적어도 800, 적어도 900, 적어도 1000, 적어도 1200, 적어도 1500, 적어도 2000, 적어도 2500, 적어도 3000개 또는 그 이상의 올리고뉴클레오티드로 로딩될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 엑소좀은 엑소좀 당 평균 약 500-3000개의 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 엑소좀은 엑소좀 당 평균 약 500-1000개의 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 엑소좀은 엑소좀 당 평균 약 1000-1500개의 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 엑소좀은 엑소좀 당 평균 약 1000-2000개의 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 엑소좀은 엑소좀 당 평균 약 1000-3000개의 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 또 다른 실시양태에서, 엑소좀은 엑소좀 당 약 3000개 이하의 올리고뉴클레오티드를 함유한다. 엑소좀에 로딩될 수 있는 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드 적하물의 양은 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드 적하물이 엑소좀 막의 상당 부분을 차지하는 엑소좀의 생산을 가능하게 한다. 예를 들면, 올리고뉴클레오티드 적하물이 입자의 표면적의 약 1-10%, 예를 들어, 입자의 표면적의 약 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 또는 10%를 차지하는 EV (예를 들어, 엑소좀)가 생산될 수 있다. 일부 실시양태에 따르면, 올리고뉴클레오티드 적하물은 RNAi 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA이다. 또 다른 실시양태에 따르면, 소수성으로 변형된 올리고뉴클레오티드는 소수성 모이어티, 예를 들어, 콜레스테롤 모이어티와 접합된 RNAi 올리고뉴클레오티드이다.
일부 실시양태에 따르면, 지질 이중층 인지질 막 소포는 리포솜이다. 이러한 실시양태에 따르면, 리포솜은 EV에 대해 기술된 바와 동일한 방법으로 로딩된다.
또 다른 실시양태에 따르면, PTEN RNAi 억제제가 로딩된 EV는 세포 내에서 상기 RNAi 억제제를 암호화하고 이를 발현 또는 생성할 수 있는 RNAi 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드가 인위적으로 로딩된 세포로부터 수득될 수 있다. 이 경우에, 폴리뉴클레오티드/올리고뉴클레오티드 제제는 구성적 또는 유도적 방식으로 제제의 발현을 지시할 수 있는 시스-작용 조절 요소 (예를 들어, 프로모터)의 제어하에 핵산 작제물에 결찰된다.
핵산 제제는 적절한 유전자 전달 비히클/방법 (형질감염, 형질도입 등)을 사용하여 전달될 수 있다. 임의로 적절한 발현 시스템이 사용된다. 적합한 작제물의 예는 pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, PzeoSV2 (+/-), pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto를 포함하지만, 이에 제한되지 않으며, 이들 각각은 Invitrogen Co로부터 상업적으로 이용 가능하다.
발현 작제물은 또한 바이러스일 수 있다. 바이러스 작제물의 예는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 백시니아 바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 폴리오마 바이러스 벡터, 알파바이러스 벡터, 랍도바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 헤르페스바이러스 벡터를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
레트로바이러스 작제물과 같은 바이러스 작제물은 적어도 하나의 전사 프로모터/인핸서 또는 유전자좌-정의 요소(들), 또는 대체 스플라이싱, 핵 RNA 엑스포트, 또는 메신저의 전사후 변형과 같은 다른 수단에 의해 유전자 발현을 제어하는 기타 요소를 포함한다. 이러한 벡터 작제물은 또한 바이러스 작제물에 이미 존재하지 않는 한 패키징 신호, 긴 말단 반복체 (LTR) 또는 이의 일부, 및 사용된 바이러스에 적합한 양성 및 음성 가닥 프라이머 결합 부위를 포함한다. 또한, 이러한 작제물은 전형적으로 펩티드가 위치하는 숙주 세포로부터의 펩티드의 분비를 위한 신호 서열을 포함한다. 바람직하게는, 이러한 목적을 위한 신호 서열은 포유동물 신호 서열 또는 본 발명의 펩티드 변이체의 신호 서열이다. 임의로, 작제물은 또한 폴리아데닐화를 지시하는 신호 뿐만 아니라 하나 이상의 제한 부위 및 번역 종결 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 작제물은 전형적으로 5' LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 신호, 제2 가닥 DNA 합성의 기원, 및 3' LTR 또는 이의 일부를 포함할 것이다.
바람직하게는 감염을 위한 바이러스 용량은 적어도 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015 또는 그 이상의 pfu 또는 바이러스 입자이다.
이중 가닥 RNA는 두 개의 대향하는 프로모터를 유전자 조각의 말단에 부가함으로써 합성될 수 있으며, 여기서 하나의 프로모터는 유전자에 바로 5' 위치에 있고 대향하는 프로모터는 유전자 조각에 바로 3' 위치에 있다. 그후 dsRNA는 적절한 중합 효소로 전사될 수 있다.
또 다른 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드 제제를 배양물에서 세포와 배양하여, 세포에 의한 핵산의 효율적인 흡수를 야기할 수 있다. 이러한 실시양태에 대해, 바람직하게는 핵산 제제는 아래에 본원에 추가로 기술된 바와 같이 소수성으로 변형된다.
본원에 기술된 핵산 제제로 입자를 로딩하는데 사용되는 방법에 관계없이, 세포를 그후 EV, 예를 들어 엑소좀 생산에 충분한 시간 동안 배양한다. 배양 배지로부터 단리된 엑소좀은 세포에 의해 흡수, 생산 또는 발현된 핵산 분자가 로딩된 엑소좀을 함유한다. 따라서, 하나의 실시양태에서, EV 생산 (예를 들어, 엑소좀 생산)이 가능한 세포를 올리고뉴클레오티드가 세포에 의해 내재화되기에 충분한 시간 동안 올리고뉴클레오티드와 배양하는 단계, 엑소좀 분비에 충분한 시간 동안 세포를 배양하는 단계, 및 배양 배지로부터 올리고뉴클레오티드가 로딩된 엑소좀을 단리하는 단계를 포함하여, EV를 올리고뉴클레오티드 적하물로 로딩하는 방법이 제공된다.
일부 실시양태에 따르면, 본 발명은 상기 실시양태 중의 어느 하나에 따라 제조된 단리된 세포외 소포를 제공한다. 또 다른 실시양태에 따르면, 본 발명은 상기 실시양태 중의 어느 하나에 따라 제조된 세포외 소포를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 일부 실시양태에 따르면, 이러한 단리된 세포외 소포 및 약제학적 조성물은 척수 손상과 같은 신경 질환 또는 병태를 치료하는데 유용하다.
본 발명의 입자 또는 약제학적 조성물은, 적어도 일부 실시양태에서, 바로 사용할 수 있는 시린지에 단위 투여 형태로 미리 포장될 수 있다. 시린지에는 입자의 명칭과 이들의 소스가 표지될 수 있다. 표지는 또한 입자의 기능과 관련된 정보를 포함할 수 있다. 시린지는 입자에 관한 정보가 또한 표지된 포장에 포장될 수 있다.
용어 "포함하는 (comprising)", "포함한다 (comprise(s))", "포함한다 (include(s))", "갖는 (having)", "갖다 (has)" 및 "함유한다 (contain(s))"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 "의 적어도 일부로 구성된 (consisting at least in part of)"의 의미를 갖는다. 본 명세서에서 "포함하는 (comprising)"이라는 용어를 포함하는 각 문장을 해석할 때, 그 이외의 특징 또는 그 용어로 시작되는 특징도 존재할 수 있다. "포함한다 (comprise)" 및 "포함한다 (comprises)"와 같은 관련 용어는 동일한 방식으로 해석되어야 한다. 용어 "갖는다 (have)", "갖다 (has)", "갖는 (having)" 및 "포함하는 (comprising)"은 또한 "로 구성된 (consisting of)" 및 "로 본질적으로 구성된 (consisting essentially of)"의 의미를 포함할 수 있으며, 이들 용어로 대체될 수 있다. 용어 "로 구성된 (consisting of)"은 구체적으로 설명되거나 나열되지 않은 모든 성분, 단계 또는 절차를 배제한다. 용어 "로 본질적으로 구성된 (consisting essentially of)"은 추가 구성분이 청구된 조성물 또는 방법의 기본 및 신규 특성을 실질적으로 변경하지 않는 경우에만 조성물 또는 성분이 추가 구성분을 포함할 수 있음을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "약"은, 양, 시간적 지속시간 등과 같은 측정 가능한 값을 언급할 때, 지정된 값으로부터 +/-10%, 또는 +/-5%, +/-1%, 또는 심지어 +/-0.1%의 변화를 포함함을 의미한다.
본원에서 사용된 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 달리 명시하지 않는 한 복수 대상을 포함한다. 예를 들면, 용어 "화합물 (a compound)" 또는 "적어도 하나의 화합물 (at least one compound)"은 이들의 혼합물을 포함하는 복수의 화합물을 포함할 수 있다.
본 출원 전반에 걸쳐, 본 발명의 다양한 실시양태가 범위 형식으로 제시될 수 있다. 범위 형식의 설명은 단지 편의성과 간결성을 위한 것이며 본 발명의 범위에 대한 융통성없는 제한으로 해석되어서는 안된다는 것을 이해해야 한다. 따라서, 범위에 대한 설명은 가능한 모든 하위범위 뿐만 아니라 해당 범위 내의 개별 수치를 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 예를 들면, 1 내지 6과 같은 범위의 설명은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 하위범위 뿐만 아니라 그 범위 내의 개별 숫자, 예를 들면, 1, 2, 3, 4, 5 및 6을 구체적으로 개시한 것으로 간주되어야 한다. 이것은 범위의 폭에 관계없이 적용된다.
수치 범위가 본원에 표시될 때마다, 이것은 표시된 범위 내의 임의의 인용된 숫자 (분수 또는 정수)를 포함함을 의미한다. 첫 번째 표시 숫자와 두 번째 표시 숫자 "에 이르는/사이의 범위 (ranging/ranges between)" 및 첫 번째 표시 숫자"로부터" 내지 두 번째 표시 숫자"까지" "에 이르는/범위 (ranging/ranges from)"는 본원에서 상호교환적으로 사용되며 첫 번째 및 두 번째 표시된 숫자 및 그 사이의 모든 분수와 정수를 포함함을 의미한다.
본원에 사용된 용어 "방법 (method)"은 화학, 약리학, 생물학, 생화학 및 의학 분야의 실무자에 의해 공지된 방식, 수단, 기술 및 절차에 대해 공지되거나 이로부터 쉽게 개발된 방식, 수단, 기술 및 절차를 포함하지만 이에 제한되지 않는 주어진 작업을 달성하기 위한 방식, 수단, 기술 및 절차를 지칭한다.
명확성을 위해 별개의 실시양태의 맥락에서 기술된 본 발명의 특정 특징이 또한 단일 실시양태에서 조합되어 제공될 수 있는 것으로 이해된다. 반대로, 간결함을 위해 단일 실시양태의 맥락에서 기술된 본 발명의 다양한 특징이 또한 본 발명의 임의의 다른 기술된 실시양태에서 개별적으로 또는 임의의 적절한 하위조합으로 또는 적절하게 제공될 수 있다. 다양한 실시양태의 맥락에서 기술된 특정 특징은 실시양태가 이러한 요소없이 작동하지 않는 한 이러한 실시양태의 필수 특징으로 간주되지 않는다.
상기 기술되고 청구범위 섹션에서 청구된 바와 같은 본 발명의 다양한 실시양태 및 측면은 하기 실시예에서 실험적으로 뒷받침된다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면 척수 손상을 치료하는데 사용하기 위한 신경 능선 세포로부터 유래된 엑소좀이 제공된다.
실시예
이제 상기 설명과 함께 본 발명의 일부 실시양태를 비제한적인 방식으로 예시하는 하기 실시예를 참조한다.
일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 본 발명에서 사용되는 실험실 절차는 분자, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA 기술을 포함한다. 이러한 기술은 문헌에 자세히 설명되어 있다.
재료 및 방법
중간엽 줄기 세포 제조
골수 유래 인간 MSC는 Lonza (Basel, Switzerland)로부터 구입하였다. 세포를 상기한 바와 같이 배양하고 확장하였다. 엑소좀 수집 전에, 세포를 엑소좀-비함유 혈소판에서 배양하고 3일 후 배지를 수집하였다. MSC-exo는 PKH26 (Sigma)로 5분 동안 표지하고 초원심분리 (100,000g, 2시간, 4℃)를 사용하여 세척하였다. 펠렛을 200 μl PBS로 재현탁시켰다.
엑소좀 정제 프로토콜
인간 MSC는 Lonza (Basel, Switzerland)로부터 구입하였다. 세포를 배양하고 확장하였다. 세포를 엑소좀-비함유 혈소판 용해물 (Rabin Medical Center, Israel)과 함께 배양하고 3일 후 배지를 수집하였다. 엑소좀은 배양액을 단리하고 300g에서 10분 동안 원심분리하는 표준 차동 원심분리 프로토콜을 사용하여 정제하였다. 상층액을 회수하고 2,000 g에서 10분 동안 원심분리한 다음 10,000 g에서 30분 동안 재원심분리하였다. 그후 상청액을 0.22 μm 필터에 통과시키고 100,000 g에서 70분 동안 원심분리하였다. 엑소좀과 단백질을 함유하는 펠렛을 PBS에서 세척한 다음 100,000 g에서 70분 동안 원심분리하였다. 펠렛을 200 μl 멸균 PBS에 재현탁시켰다. 모든 원심분리는 4℃에서 수행하였다. 엑소좀을 NanoSight 기술, 전자 현미경 및 칼넥신을 음성 마커로 하고 CD9와 CD81을 양성 마커로 한 웨스턴 블롯팅을 사용하여 특성화하였다.
중간엽 줄기 세포 엑소좀 ( MSC - Exo ) 형광 표지화
MSC-Exo를 PKH26/PKH67 (Sigma)로 5분간 표지한 다음 초원심분리 (100,000 g, 2시간, 4℃)를 사용하여 PBS로 세척하였다. 펠렛을 200 μl PBS에 재현탁시켰다. PTX 실험을 위해, MSC-Exo를 37℃에서 10분 동안 5 μl PTX로 현탁시킨 다음 PKH26으로 표지하고 100,000 g에서 2시간 동안 원심분리하였다. MSC-Exo+PKH67 및 MSC-Exo+PTX+PKH26을 함께 동일한 래트 (n=3)에 투여하였다.
금 나노입자 (GNP) 합성 및 접합
3.75 ml 리놀레산 (18%), 올레산 (65%), 팔미트산 (16%) 및 에탄올 (1%), 200 mg NaOH 및 15 ml 에탄올의 혼합물을 30 ml DDW에 첨가하였다. 용액을 5분 동안 교반하였다. 그후 50 밀리그램의 HAuCl4를 교반하면서 첨가한 다음 5 ml 아스코르브산 (0.05 M)을 첨가하고 추가의 분 동안 교반하였다. 그후 PEG7 용액 (2.26 Х 10-3 g)을 GNP 용액에 첨가하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 그후 pH를 NaOH를 사용하여 9로 조절하고, 용액을 추가의 시간 동안 교반하였다. 80 ml n-헥산을 첨가한 후, 용액을 1시간 동안 교반하였다. 그후 생성된 혼합물의 pH를 HCl 용액 (37%)을 사용하여 7로 조절하였다. 혼합물을 상 분리 (유기 및 수성)를 위해 깔때기에 넣었다. 수성 상을 진공을 사용하여 증발시켰다. 다음으로, 과량의 카보디이미드 (1.87 Х 10-3 g) 및 N-하이드록시석신이미드 (Thermo Fisher Scientific, Inc., Rockford, IL) (2.12 Х 10-3 g)를 용액에 첨가한 다음 2GF (Sigma-Aldrich, Israel Ltd.) (1.75 Х 10-3 g)를 첨가하였다. 총 2.8 Х1010 엑소좀 (1 ml 염수 중의 200 μl 엑소좀)을 글루코스-코팅된 GNP (35 mg/mL, 100 μl)와 함께 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 그후 엑소좀을 2시간 동안 원심분리하였다 (100,000 g, 4℃).
GNP 특성화
투과 전자 현미경 (JEM-1400, JEOL)을 사용하여 GNP의 크기와 형태를 측정하였으며, 자외선 가시광선 분광기 (UV-1650 PC; Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan), ζ-전위 (ZetaSizer 3000HS; Malvern Instruments, Malvern, UK), 및 동적 광 산란을 사용하여 추가로 특성화하였다.
GNP 정량화
화염 원자 흡수 분광법 (SpectrAA 140; Agilent Technologies, Santa Clara, CA)을 사용하여 여러 주요 기관 (심장, 폐, 폐, 신장 및 비장)에서 금의 양을 결정하였다. 절개된 조직을 1ml의 왕수산 (aqua regia acid) (질산과 염산의 1:3 혼합물)으로 용융시키고 증발되도록 한 다음 총 4 ml의 용적으로 되도록 희석시켰다. 0.45 nm 시린지 필터를 통해 샘플을 여과한 후, 금 농도는 알려진 금 농도를 가진 용액을 사용하여 제조된 검량선을 사용하여 결정하였다. 유도 결합 플라즈마 분광법 (ICP)을 사용하여 뇌 및 척수 병변에서의 금의 양을 결정하였다. 조직을 새로 추출하고 550℃에서 5시간 동안 연소시켰다. 그후 5 ml 1% HNO3를 용융된 조직에 첨가하고 0.45 μm 필터를 통해 여과시켰다. 샘플의 금 농도는 금 표준 곡선과의 상관관계로 결정하였다.
엑소좀 로딩
엑소좀 (40 μl, 약 1010 엑소좀)을 EPPENDORF® 튜브에서 0.1 nmol cy3-MAPK-siRNA (Advirna Company)로 로딩하고 37℃에서 1-3시간 동안 배양하였다. 그후, 현탁액을 Nanosight 분석에 적용하였다. 형광 대 비형광 엑소좀의 농도 비율을 로딩 효율로 정의하였다.
생체내 실험을 위해, 40 μl 엑소좀을 SCI 래트에 비강내 투여하기 전에 37℃에서 2-3시간 동안 0.1 nmol PTEN-siRNA (Advirna Company)로 로딩하였다. PTEN-siRNA가 로딩된 엑소좀을 ExoPTEN이라고 한다.
배근 신경절 ( DRG ) 뉴런에서의 축삭 성장
성체 스프래규-돌리 래트 (200-250g)의 흉부 및 요추 수준에서 배근 신경절을 절개하고 빙냉 행크 균형 염 용액 (HBSS)에 침지시켰다. DRG를 HBSS로 세척하고, 2.5 mg/ml 콜라게나제 II형 (Worthington) 4 ml를 함유하는 작은 접시에 옮겨 수술용 칼날을 사용하여 작은 조각으로 절개하고, 37℃에서 40분 동안 배양하였다. 용액을 200g에서 3분간 원심분리하여 콜라게나제를 제거하고, 1 ml 피펫 팁을 통해 ~20회 분쇄함으로써 F12 배양 배지 (Gibco, 11765), 10% 태아 소 혈청 (Gibco), 100U/ml 페니실린 (Biological Industries, Beit-Haemek, Israel), 100ug/ml 스트렙토마이신을 함유하는 2ml의 배양 배지에 재현탁시켰다. 세포를 웰당 5X104의 밀도로 5시간 동안 12-웰 플레이트 내에 라미닌 (Sigma, L2020)으로 예비코팅된 15 mm 커버슬립 당 플레이팅하였다. 그후 DRG 배지를 일반 DRG 배지, 40 μl 엑소좀, 0.1nmol 비-표적화 대조 (NTC) siRNA, 0.1nmol PTEN siRNA, 또는 40 μl 엑소좀이 로딩된 0.1 nmol PTEN siRNA를 함유하는 것으로 교체하였다.
siRNA로 표적화된 PTEN의 서열은 서열 번호 6 (5'-GAGTTCTTCCACAAACAGAA-3')에 제시된 바와 같다. 콜레스테롤과 접합된 핵산 서열 5'-GAGUUCUUCCACAAACAGAA-3' (서열 번호 10) 및 핵산 서열 5'-UUCUGUUUGUGGAAGAACUC-3' (서열 번호 11)를 포함하는 하나의 가닥을 포함하는 이중 가닥 siRNA를 사용하여 PTEN 발현을 억제하였다.
플레이팅한지 24시간 후, 세포를 4% 파라포름알데히드 (PFA)로 10분 동안 고정하고, PBS로 5분 동안 3회 세척하고, 0.3% Triton X-100에 10분 동안 침투시키고, PBS로 5분 동안 3회 세척하고, 5% 소 혈청에서 2시간 동안 차단하고, 4℃에서 5% 소 혈청에서 마우스-항-튜불린 (Promega, 1:500)과 함께 밤새 배양하였다. 그후, 샘플을 당나귀-항-마우스 Alexa488 (Invitrogen, 1:800) 및 DAPI (1:1000)와 함께 3시간 동안 배양하였다. PBS로 3회 세척한 후, 샘플을 장착하고 공초점 현미경 (LSM700) 하에서 관찰하였다. 이미지를 IMARIS 소프트웨어 (버전 8.20)를 사용하여 처리하여 신경돌기 분기 수준, 최대 분기 수준, 신경돌기의 수, 총 신경돌기 길이를 정량하였다. 매개변수를 다음과 같이 설정하고 모든 이미지에 적용하였다: 최대 직경 60 μm, 가장 얇은 직경 0.6 μm, 시작점 임계값 10 μm 내지 60 μm, 시드점 임계값 10 μm, 구 영역 직경이 24 μm인 시작점 주변의 시드점 제거, 최대 간격 길이는 60 μm로 되게 함.
뇌 및 척수의 생체외 CT 스캔:
뇌 및 척수 샘플을 제거하고 고정 3일 동안 4% 파라포름알데히드에 넣은 다음 다른 회백질 및 백질을 구별하기 위해 4℃에서 7일 동안 7.5% 파라포름알데히드로 희석된 150 mg/mL의 비이온성 요오드화 조영제 (lopamidol, Bayer Schering Pharma, Japan)에 침지시켰다. CT 이미징 전에, 샘플을 용액으로부터 제거하고, 건식 블롯팅하고, 이미징을 위해 샘플 홀더에 두었다. 샘플 홀더를 탈수를 방지하기 위해 플라스틱 필름으로 밀봉하였다. 샘플의 생체외 마이크로-CT 스캔은 공칭 해상도 35 μm, 0.2 mm 알루미늄 필터 및 45 kV의 튜브 전압을 갖는 마이크로-CT 스캐너 (Skyscan High Resolution Model 1176)를 사용하여 수행하였다. 재구성은 GPU로 가속화된 SkyScanNRecon 소프트웨어를 사용하여 수정된 Feldkamp 알고리즘으로 수행하였다. 링 아티팩트 감소, 가우스 평활화 (3%) 및 빔 경화 보정 (25%)이 적용되었다. 볼륨-렌더링된 3차원 (3D) 이미지는 SkyScan CT-Volume ("CTVol") 소프트웨어와 SkyScan CT-Voxel ("CTVox") 소프트웨어에서 RGBA 전달 함수를 사용하여 생성하였다.
면역형광 분석
척수를 절개하고, 밤새 4% PFA에 고정하고, 밤새 30% 수크로스 용액으로 동결보호하고, 최적의 절단 온도 화합물 (OCT)에 매봉하고 저온 유지 장치 (Leica CM1850, 독일)를 사용하여 세로로 절편화 (20 μm)하였다. 절편을 0.5% Tween 용액에 침투시키고 5% 소 혈청으로 차단한 다음 토끼-항-튜불린 (Abcam, 1:500), 토끼-항-GFAP (1:1000, Millipore), 마우스-항-CD11b (1:500, BioRad) 또는 마우스-항-CD31 (1:50, BD) 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 그후, 절편을 염소-항-토끼-Alexa647 (Invitrogen, 1:800) 및 DAPI (1:1000)와 함께 3시간 동안 배양하고, 커버슬립을 장착하고, 공초점 현미경 (LSM 700)을 사용하여 이미지화하였다.
척수 손상 모델
모든 동물 실험은 Technion-Israel Institute of Technology에 의해 승인된 프로토콜을 엄격하게 준수하여 수행되었다. 동물 무작위화는 처리에 대해 블라인드된 실험자에 의해 수행되었다. 성체 암컷 스프래규-돌리 래트를 수술 동안 자일라진 (10-15 mg/kg)과 케타민 (60-90 mg/kg)의 혼합물 및 유지 용량의 1-2% 이소플루란 (Harvard Apparatus, USA)으로 마취시켰다. 9-11번째 흉추 수준에서 추궁절제술 후, 마이크로가위 (Kent Scientific, USA)를 사용하여 T10 수준에서 척수를 완전히 절개하였다. 완전한 절개를 보장하기 위해 주둥이 및 꼬리 남은 부분을 들어 올리고, 생성된 틈 내부에 고리 (Kent Scientific, USA)를 원형으로 통과시켜 척추관의 바닥 부분에 섬유가 남아 있지 않음을 확인하였다. 이 연구에서 평가된 그룹을 횡절개 대조군 (n=15), 비강내 엑소좀 대조군 (n=10), 비강내 ExoPTEN (n=7), 병변내 PTEN-siRNA (n=3) 및 병변내 ExoPTEN (n=4)으로 지정하였다. 그후 근육 층 및 피부를 봉합하고 래트를 온도-조절 배양 챔버에 배치하였다. 비강내 처리를 위해, 래트에게 40 μl 염수, 40 μl 엑소좀 또는 40 μl ExoPTEN를 수술 후 2-3시간, 및 24시간마다 5일 동안 비강내 제공하였다. 병변내 처리를 위해, 척수 손상이 만들어졌을 때 래트에게 40 μl PTEN-siRNA (0.1 nmol) 또는 40 μl ExoPTEN을 한 번만 제공하였다. 방광 기능이 회복될 때까지 방광 마사지를 매일 2회 수행하였다. 항생제 (Cefazolin, 25 mg/kg, 1일 2 회)를 1주일 동안 매일 주사하였다. 부프레노르핀 (Bayer)을 수술 전 및 수술한지 3일 후에 0.01-0.05 mg/kg의 용량으로 투여하였다. 사이클로스포린 (10 mg/kg/d) (Novartis)을 모든 래트에게 1주 동안 투여하였다.
행동 분석
운동 회복은 Basso, Beattie 및 Bresnahan (BBB) 운동 척도 방법을 사용하여 맹검 실험자가 평가하고 점수를 매겼다. 측정은 이식 후 2-3일에 이루어진 다음 7일에 한 번 이루어졌다. 모든 측정은 일주기 변동성을 피하기 위해 하루 중 같은 시간에 이루어졌다. 베이스라인 BBB는 수술 후 첫 번째 시험에서 기록된 값으로서 정의되었다. 주간 점수 (weekly score)는 각 일정관리 주 동안 수득된 최저 점수였다. 감각 회복은 본 프레이 필라멘트 검사 (von Frey filament test)를 사용하여 평가하였다. 굽힘력의 구배를 갖는 필라멘트 (Bioseb)를 발에 적용하여 통각 반응 (자극으로부터 빠른 발 움추림)을 유도하였다. 움추림 임계값은 시도 사이에 30초의 간격을 두고 3번의 시도 중 2번에서 양성 반응을 유도하는 최소 힘으로 정의된다.
MRI
MRI는 신호 여기에는 원통형 볼륨 코일 (내경 86 mm)을 사용하고 신호 수신에는 단일 채널 표면 코일 (직경 20 mm)을 사용하여 9.4T 보어 스캐너 (Bruker Biospec, Ettlingen, Germany)로 수행하였다. 동물을 마취 (0.5-1.5% 이소플루란) 하에 두고 산소 (0.5 L/분)를 보충하였다. 이미징 (Small Animal Instruments, Stony Brook, New York, NY) 동안 호흡을 모니터링하고 체온을 온도 조절기-조절된 순환 온수를 사용하여 유지하였다. DTI 이미징 전에, DTI 스캔 슬라이스 기하학 구조를 결정하기 위해 RARE 시퀀스를 사용하여 시상 및 축상 T2-가중 해부학 스캔을 획득하였다. RARE 획득 매개변수는 다음과 같았다: 0.8 mm 두께, FOV=3x3 cm, 매트릭스 치수=192x192, (공간 해상도=156x156 μm2), 반복/에코 시간 (TR/TE) = 1200/16.22 ms, 4회 평균. DTI 이미징은 다음의 매개변수를 갖는 EPI-DTI 시퀀스를 사용하여 수득하였다: 30 비-공선형 구배 방향, 3 A0 이미지, b=1000 s/mm2, diff 지속기간 (δ)=2.6, diff 분리 (△)=11, 2회 평균, 0.8 mm 두께, FOV=3x3 cm, 매트릭스 치수=192x192, (공간 해상도=156x156 μm2). DTI 계산 및 섬유 추적은 ExploreDTI 소프트웨어를 사용하여 수행하였다 (Leemans et al., 2009). 수득된 텐서는 고유 성분 (eigen-component)으로 스펙트럼 분해되었다. 고유-값 (eigen-value)을 사용하여 분획 이방성 (FA) 맵을 계산하였다. 척수 (백질 및 회백질)의 관심 영역 (ROI)을 각 슬라이스에서 수동으로 분할하였다. 신경다발 추적법 (tractography)은 결정론적 (유선형) 섬유 추적을 사용하여 적용되었으며, FA가 0.2 미만인 복셀에서 종료되거나, 0.078mm 스텝 크기 및 0.2-100 mm 섬유 길이로 30°보다 높은 트랙 방향 변화 (Basser et al. 2000)를 추적한다. 수동으로 선택된 ROI를 통과한 섬유는 유선형으로 플롯팅하였다.
전기생리학
8주차에, 병변을 통한 신경 신호 전파를 기록하기 위해 전기생리학을 수행하였다. 케타민/자일라진 마취 후, 래트를 정위 장치에 배치하고 머리 피부에 중간선 절개를 수행하였다. 두개골을 노출시키고 두 개의 전기 자극 나사 전극을 중간선의 오른쪽 2 mm, 브레그마 (bregma)의 전방과 후방 각각 -1.0mm 및 + 4.0 mm에 이식하였다. 나사 전극을 자극기의 출력 단자에 연결하였다. 다리 뒤쪽의 좌골 신경을 노출시키고 두 개의 은색 와이어 후크 전극을 삽입하였다. 또 다른 와이어를 다리의 발바닥에 삽입되었으며 접지 전극으로서 작용하였다. 증폭된 신호를 0.1 내지 3kHz (7DA 드라이버 증폭기가 있는 7P511 AC 광대역 전치증폭기, Grass Technologies, Warwick, RI) 사이에서 대역-통과 필터링하고 디지털화 (NI USB-6341 아날로그-디지털 변환기, National Instruments)하고, 10kHz에서 획득하여 WinWCP 소프트웨어 패키지를 실행하는 개인용 컴퓨터에 저장하였다 (영국 Strathclyde 대학의 Dr. John Dempster 제공). 자극 강도는 첫 번째 동물에서 뒷다리 수축 및 신뢰할 수 있는 좌골 신경 화합물 활동 전위 (CAP)의 출현에 따라 선택하였으며 실험 전반에 걸쳐 유지하였다.
웨스턴 블롯팅
병변이 있는 척수 절편 및 간을 프로테아제 억제제 칵테일 (100mM PMSF, 2 mg/ml 류펩틴, 50 mM Na-오르타바나데이트, 50 mM 아프로티닌, Sigma)을 함유하는 RIPA 용액 ((1% 나트륨 데옥시콜레이트 (DOC) (Sigma), 1% 100x-Triton (Biolab), 50 mM Tris-HCl (Sigma), 150mM NaCl (Sigma), 5 mM EDTA (Sigma))에 넣었다. 조직을 균질화하고 총 단백질 20 μg을 4-12% SDS-PAGE에 의해 분리한 다음 90분 동안 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 3시간 동안 0.1% Tween20 (TBST)과 함께 트리스-완충 염수에서 2% BSA로 차단한 후, 막을 TBST 중의 2% BSA에서 로딩 대조군으로서 항-PTEN, 1:1000 (마우스 단클론; Cat. #9556, Cell Signaling) 또는 항-β-액틴, 1:1000 (토끼 단클론; Cat. #8457, Cell Signaling)과 함께 밤새 배양하였다. 다음 날, 3회 TBST 헹굼 후, 막을 항-토끼 IgG-HRP (1:5000, NA934V, GE Healthcare) 또는 항-마우스 IgG-HRP (1:5000, NA931V, GE Healthcare)와 함께 RT에서 2시간 동안 배양하였다. 신호는 강화된 화학발광 시약 (Cat. #1705061, BioRad)에 블롯을 노출시키고 LAS-3000 이미징 시스템 (FujiFilm)에서 후속적으로 노출시킴으로써 전개되었다.
RT- qPCR
병변이 있는 척수 조직과 간으로부터 총 RNA를 Qiagen RNeasy Mini 키트를 사용하여 추출하고 첫 번째 가닥 DNA를 제조업체의 지침에 따라 고성능 cDNA 역전사 키트 (Applied Biosystems)를 사용하여 합성하였다. 실시간 정량적 PCR을 QuantStudio 12K Flex 실시간 PCR 시스템에서 수행하였다. 프라이머는 PTEN (Thermo Fisher, 분석 ID : Rn00477208) 또는 GAPDH (Thermo Fisher, 분석 ID : Rn01775763-g1)를 포함하였다. 증폭 반응 조건은 다음과 같았다: 10 μl 반응에서 삼중으로 20초 동안 95℃에 이어 40 사이클의 3초 동안 95℃, 30초 동안 60℃. 상대 발현 수준은 관심 유전자를 GAPDH 발현에 대해 표준화시키는 △△Ct 방법을 사용하여 결정하였다.
신경해부학적 추적
피질척수 축삭을 추적하기 위해, 래트에서 6주차에 비오틴화 덱스트란 아민 (BDA)으로 전진성 추적을 수행하였다. 위에 기술된 바와 같은 케타민 및 자일라진 마취하에서, 래트를 정위 프레임에 배치하였다. 두피 털을 면도하고 그 부위를 에탄올로 닦고 감각운동 피질 위의 두개골에 작은 구멍을 뚫었다. 당겨진 유리 마이크로피펫을 가진 Hamilton 마이크로시린지를 사용하여 부위 당 2분에 걸쳐 1 μl의 10% BDA (MW 10,000, D1956, Molecular Probes)를 주사 사이에 2분 간격으로 다음 좌표를 사용하여 반구당 8개 부위에 주사하였다: AP +1.0, ML ± 2.0; AP 0, ML ± 1.5; AP -1.0, ML ± 1.5; AP -2.0, ML ± 1.5; DV 1.5 mm. 모든 주사가 완료된 후, 두피를 봉합하고 래트가 회복될 때까지 회복실에 두었다. 8주차에, 래트를 케타민과 자일라진으로 깊이 마취하고 4% PFA로 경심 관류시켰다. 병변을 함유하는 척수의 분절을 수확하고, 30% 수크로스에서 동결보호하고, OCT에 매봉하고, 20 μm 두께의 절편으로 되도록 세로로 절편화하였다. 절편을 PBS 및 0.1% Triton X-100에서 3회 세척하고, Alexa Fluor594-접합 스트렙타비딘 (1:500, Invitrogen, S32356)과 함께 4℃에서 밤새 배양하고, PBS에서 3회 헹구고, 커버슬립을 장착하여 덮었다.
통계 분석
통계 분석은 MATLAB/Prism 5 소프트웨어 (USA)를 사용하여 수행하였다. 양방 비쌍체 스튜던츠 t 검정을 사용하여 두 그룹 간을 비교하였다. 달리 명시되지 않는 한, 나머지 데이터는 사후 Tukey 다중 비교와 함께 일원 또는 이원 ANOVA를 사용하여 분석하였다. 모든 그룹화된 데이터는 평균 ± SEM으로 표시된다. 유의 수준: *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ****p<0.0001.
실시예 1 - 비강내 MSC - Exo는 BBB를 횡단하여 척수로 이동한다
중간엽 줄기 세포 엑소좀 (MSC-Exo)으로부터 단리된 엑소좀은 평균 크기가 111±64 nm이고 농도가 40.43x108개 입자/ml이었다 (도 S1D-E). Cryo-TEM으로 시각화된 MSC-Exo는 전형적인 구체 형상을 나타내었다. MSC-Exo가 BBB를 횡단할 수 있는지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 문헌 (Betzer et al., 2017, ACS Nano 11, 10883-10893)에 기술된 바와 같이 MSC-Exo를 금 나노입자 (GNP)로 표지화하였다. GNP가 로딩된 MSC-Exo의 Cryo-TEM 이미징은 엑소좀으로의 GNP 흡수를 나타내었다 (도 1). MSC-Exo가 비강내 (IN) 투여 후 혈액 뇌 장벽을 횡단할 수 있는지를 조사하기 위해, GNP-로딩된 MSC-Exo를 완전 척수 횡절개 후 3시간에 IN 투여하였다. 투여한지 24시간 후 마이크로-CT 스캐닝은 척수 병변 영역에서는 상당한 GNP 축적을 입증하였지만 뇌에서는 그렇지 않았다 (도 2, 상부 패널). 이와 달리, 건강한 대조군에서, GNP는 주로 뇌 및 후구에 국한되었다 (도 2, 하단 패널). 유도 결합 플라스마 (ICP) 평가는 T10 척추 분절 영역에서의 GNP의 양이 건강한 대조군에 비해 손상된 래트에서 유의하게 더 높았음을 확인시켜 주었다 (도 3a, 일원 ANOVA F (3, 8) = 27.5, p<0.001, Tukey). 유사하게, 유의하게 더 높은 양의 IN-투여된 PKH26 (적색 친유성 염료)-표지된 엑소좀이 건강한 래트에 비해 손상된 래트의 T10 척수 분절 영역에 축적되었다 (도 4, t (14) = 3.21, p<0.01). 척추 병변의 면역형광 염색과 함께 CNS의 정성적 마이크로-CT 스캔 및 정량적 ICP 검사는 MSC-Exo가 혈액-뇌-장벽을 관통하고 척수 병변으로 귀소함을 보여주었다. 예기치 않게도, 척수 손상을 가진 래트에서는 MSC-Exo가 손상 부위에서 유의하게 더 널리 퍼진 반면 건강한 래트에서는 뇌에 더 널리 퍼졌다.
비강내 투여 후 MSC-Exo의 생물-분류를 연구하기 위해, 화염 원자 흡수 분광법 (FAAS)을 배치하여 투여한지 24시간 후 주요 기관 (간, 폐, 심장, 신장 및 비장)에서 GNP를 정량하였다. 폐, 심장 및 비장에서 건강한 래트 대 손상된 래트의 MSC-Exo 수준 간에는 유의한 차이가 발견되지 않았다. 그러나, 손상된 래트에 비해 건강한 래트의 간과 신장에서 더 높은 수준이 발견되었으며, 이것은 손상되지 않은 래트에서의 MSC-Exo의 보다 빠른 배설을 나타낸다 (도 4, 우측 패널, 일원 ANOVA F (9, 10) = 12.92, p<0.001, Sidak 다중 비교 검정).
또한 본 발명자들은 백일해 독소를 가진 PKH26 (적색)-표지된 엑소좀의 케모카인 수용체를 차단하는 것이 MSC-Exo가 병변으로 이동하는 능력을 극적으로 감소시켰음을 보여주었다. 특정 세포 유형에 의한 MSC-Exo의 우선적 흡수가 척수 병변에 존재하는지를 알아보기 위해, 손상 후 2-3시간에 래트에게 PKH26-Exo를 IN 투여한지 24시간 후 병변이 있는 분절의 뉴런, 성상 세포 및 소교 세포를 면역염색시켰다. 본 발명자들은 MSC-Exo가 주로 뉴런에 공동-국재화되고 성상 세포 및 활성화된 소교 세포에는 훨씬 적다는 것을 발견하였다 (도 5, 일원 ANOVA, F (2, 13) = 11.59, p>0.01, Tukey).
실시예 2. MSC - Exo에 로딩된 PTEN - siRNA는 시험관내에서 강력한 DRG 뉴런 성장을 촉진한다
MSC-Exo는 재료 및 방법에 기술된 바와 같이 콜레스테롤 접합된 비-코딩 cy3-MAPK-siRNA로 로딩되었다. Nanosight 분석은 효율적인 cy3-MAPK-siRNA 로딩 (33.64%)을 입증하였다 (도 6).
siRNA를 포함하는 MSC-Exo에 의해 전달되는 PTEN 억제가 축삭 성장을 조절할 수 있는지를 시험하기 위해, 본 발명자들은 배양물에서 배근 신경절 (DRG) 뉴런으로 자가-전달 가능한 PTEN-siRNA를 MSC-Exo에 로딩하였으며, 이를 이하에서는 ExoPTEN이라고 하였다. ExoPTEN 처리한지 하루 후, DRG 뉴런은 배지 단독, 비-표적 대조 siRNA (NTC-siRNA), MSC-Exo 또는 PTEN-siRNA 단독으로 처리된 뉴런과 비교하여 더 복잡하고 분지화된 길쭉한 형태를 특징으로 하였다 (도 7). 중간 분기 수준에서, ExoPTEN-처리된 뉴런은 유의하게 더 많은 수의 분기점을 나타내었다 (도 8, 일원 ANOVA, p<0.001, Tukey). 총 신경돌기 길이, 신경돌기 수, 분기점 및 최대 분기 수준은 모두 ExoPTEN-처리된 뉴런에서 유의하게 더 높았다: 보다 구체적으로, 치료하지 않은 뉴런보다 각각 6.6배, 6.6배, 6.8배, 2.3배 더 높음 (도 9, 일원 ANOVA, all p<0.001, Tukey). MSC-Exo와 PTEN-siRNA는 둘 다 DRG 뉴런 성장을 유사한 정도로 유도했지만, ExoPTEN 처리보다는 덜 극적으로 유도하였다.
실시예 3. 비강내 ExoPTEN은 척수 병변에서 PTEN 발현을 침묵시킨다
생체내 ExoPTEN의 침묵 효과를 확인하기 위해, ExoPTEN을 완전 척수 횡절개 일자로부터 연속 5일 동안 비강내 투여하였다. 8주차에, SCI 영역으로부터 추출된 단백질의 웨스턴 블롯 분석은 처리되지 않은 SCI 래트와 비교하여 ExoPTEN-처리된 래트에서 PTEN 단백질 수준의 59% 감소를 보였다 (도 10a, Kruskal-Wallis 검정, p=0.0627). 그룹간 간 조직에서의 단백질 수준에는 유의한 변화가 발견되지 않았다 (도 10b, p=0.8643). 동시에, RT-qPCR 분석은 처리되지 않은 SCI 래트와 비교하여 ExoPTEN-처리된 래트에서 PTEN 유전자 발현의 32% 감소를 보인 반면 (도 10c, p=0.1520), 유전자 발현은 간에서 필적하였다 (도 10d, p>0.9999).
실시예 4. 비강내 ExoPTEN은 완전한 SCI 래트에서 유의적인 기능 회복을 가능하게 한다
ExoPTEN 처리의 신경보호 가능성을 평가하기 위해, 완전한 SCI를 가진 래트를 (1) 처리하지 않음, (2) 병변내 (IL) PTEN-siRNA 처리, (3) 병변내 ExoPTEN 단일 투여, (4) 5일 연속 엑소좀 IN 투여 및 (5) 5일 연속 ExoPTEN IN 투여 (손상 당일부터 시작)의 다섯 그룹으로 나누었다. 래트에게 8주 동안 매주 BBB 운동 점수를 매겼다. 5일간의 IN ExoPTEN 투여는 다른 모든 처리 그룹과 비교하여 유의한 운동 회복을 초래하였다 (각각 F (4, 300) = 35.72, p<0.0001, F (8, 300) = 2.931 p<0.001). 보다 구체적으로, 8주차에, ExoPTEN (IN) 그룹의 평균 BBB 운동 점수 (도 11a)는 7.75±2.14에 도달했으며, 이것은 처리되지 않은 횡절개 래트의 평균 0.39±0.14 점수와는 뚜렷하게 대조되었다 (p<0.001). ExoPTEN으로 비강내 처리된 그룹과 빈 엑소좀으로 비강내 처리된 그룹간에 통계적으로 유의한 차이가 관찰되었다 (도 11a). 경미하지만 통계적으로 유의하지 않은 (모두 p>0.05) 개선이 PTEN-siRNA (IL), ExoPTEN (IL) 및 Exosome (IN) 그룹에서 8주차에 측정되었으며, BBB 운동 점수는 각각 2.17±1.48, 2.50±1.21, 2.00±1.23이었다 (도 11a). 8주 전반에 걸쳐, ExoPTEN (IN)-처리된 래트의 28.6%가 일관된 발바닥 스테핑 (plantar stepping), 발가락 벌림 (toe clearance), 및 일관된 앞다리-뒷다리 조정력 (forelimb-hindlimb coordination)을 반영하는 BBB 운동 점수 ≥14를 나타낸 반면 다른 처리 그룹 중 어느 것도 이러한 수준의 운동 개선을 달성하지 못했다 (도 11b). ExoPTEN (IN)-처리된 래트는 다른 그룹보다 빠르게 체중이 증가하였고 5주차에 안정 상태를 유지하였다 (도 11c). 또한, 8주차에, 래트 체중과 BBB 운동 점수 사이의 양의 상관관계가 주지되었다 (도 11d, 피어슨 상관 계수 =0.6819, p<0.0001). 굽힘력의 기울기 (6, 8, 10, 15, 26, 60, 100, 180, 300g)를 사용한 본 프레이 필라멘트 검정을 뒷다리에 적용하여 감각 회복의 지표로서 발 움추림 임계값을 결정하였다. 건강한 래트에서 발 움추림을 유도하기 위한 컷오프 임계값은 60g으로 설정되었으며, 이것 미만에서 움추림 반응은 이질통으로 간주하였다. 어떠한 래트도 SCI 후 300g 필라멘트 털에 반응하지 않았으며, 이것은 감각 기능의 완전한 폐지를 나타낸다. 정상적인 감각 반응은 4주차에 각각 ExoPTEN (IL) 및 ExoPTEN (IN)에서 동물의 25% 및 33.3%에 도달하였으며, 8주차에도 동일하게 유지되었다. 또한, 엑소좀 (IN) 그룹의 래트의 25%는 8주차에 감각 회복을 얻었다. 이와 달리, 처리되지 않은 및 PTEN-siRNA (IL) 그룹은 8주 이내에 감각 회복을 보이지 않았다 (도 11e). 방광 기능을 반영하는 뇨의 반사 반응에 걸리는 시간은 ExoPTEN (IN) 동물 (7.0±0.7일)이 가장 빠르게 회복되었고, 처리되지 않은 래트 (8.9±0.7일)가 그 뒤를 이었다 (도 11f, 일원 ANOVA, p=0.4079, Tukey). 도 11g는 대조군, 엑소좀 및 ExoPTEN으로 처리한 병변 후 8주 동안 래트의 회복에 있어서의 차이를 보여준다.
실시예 5. 비강내 ExoPTEN은 구조적 조직 및 전기생리학적 전도를 유도한다
척수의 구조적 완전성을 평가하기 위해, 9.4T 기존 MRI 및 확산 텐서 이미징 (DTI)을 처리되지 않은 SCI 동물, 엑소좀 (IN)- 또는 ExoPTEN (IN)-처리된 SCI 동물, 및 손상되지 않은 래트에서 수행하였다. 횡절개 대조군에서 손상 진원지에 대해 꼬리측으로 4mm에 심각한 척수 위축이 관찰된 반면 이러한 퇴행은 엑소좀 및 ExoPTEN 그룹에서는 덜 분명하였다. 손상 진원지에 대해 주둥이측으로 4mm에서 정량된 단면적은 SCI 그룹간에 유의하게 다르지 않았지만 (도 12a, 일원 ANOVA, F (3, 11) = 0.6120, p=0.6212), ExoPTEN-처리 그룹과 비교하여 횡절개 대조군에서는 진원지에 대해 꼬리측으로 4mm에서 극적으로 감소하였다 (도 12b, 2.5±0.5 mm2 vs 4.2±0.3 mm2, p<0.05). 확산 텐서 이미징 (DTI) 신경다발 추적법은 횡절개 그룹에서 주둥이와 꼬리 남은 부분의 완전한 분리, 엑소좀 그룹에서 부분 브리징, 및 ExoPTEN 그룹에서 가장 눈에 띄는 브리징을 보여주었다. 손상 부위에 대해 주둥이측 및 꼬리측의 분획 이방성 (FA) 기록은 엑소좀 또는 처리되지 않은 SCI 그룹에 비해 ExoPTEN-처리된 래트에서 더 높았지만, 손상되지 않은 래트에서보다는 여전히 더 낮았다 (횡절개 대조군, 엑소좀, ExoPTEN, 및 손상되지 않은 래트에서의 병변 내 평균 FA 값은 각각 0.2856, 0.2938, 0.3293, 0.5055이었다, 도 12c). 평균 확산도 (MD) 기록은 처리되지 않은 그룹, 엑소좀 및 ExoPTEN SCI 그룹 간에 차이를 보이지 않았다. 또한, 고-진폭 운동 유발 전위 (MEP)는 운동 피질로부터 병변을 통해 ExoPTEN으로 처리된 래트의 좌골 신경으로 전파하는 것으로 관찰된 반면 저-진폭 신호는 엑소좀 그룹에서 측정되었다 (도 12d, 각각 1.283±0.085 mV vs 0.662±0.162 mV, p=0.0273). ExoPTEN 처리된 그룹에서 MEP의 대기는 엑소좀 처리된 그룹에서보다 더 짧았다 (도 12e, 31.03±3.05 ms vs 38.49±6.78 ms, p=0.3726). 모든 신호는 척수 병변에 대해 주둥이측으로 재-횡절개한 후 폐지되었다.
실시예 6. 비강내 ExoPTEN은 병변 미세환경을 개선하고 피질척수 축삭을 재생한다
운동 회복의 기초가 되는 세포 메커니즘을 확인하기 위해, 처리되지 않은 동물, 엑소좀 (IN)-처리된 동물 및 ExoPTEN (IN)-처리된 동물의 척수 병변을 β-III-튜불린, CD11b, GFAP 및 CD31로 염색하여 각각 축삭 재생, 소교세포증, 성상세포증 및 혈관신생을 검출하였다. β-III-튜불린 발현은 엑소좀-처리된 래트보다 ExoPTEN-처리된 래트에서 유의하게 더 높은 반면 처리되지 않은 SCI 래트에서는 거의 검출되지 않았다 (도 13a, p<0.0001). CD11b-양성 소교 세포는 처리되지 않은 횡절개 그룹에서 가장 풍부한 세포 유형이었으며 엑소좀 및 ExoPTEN 그룹에서는 훨씬 덜 풍부하였고 (F (2, 24) = 25.18, p<0.0001), 두 그룹 간에 유의한 차이는 없었다 (도 13b, 패널 2, p=0.9818). 유사한 발현 프로파일이 GFAP+ 성상세포에 대해 관찰되었다 (도 13c). 본 발명자들은 CD31+ 세포에 의해 측정되는 바와 같이 가장 낮은 수준의 혈관신생이 처리되지 않은 횡절개 래트에서 측정되었음을 발견하였다 (도 13d).
피질척수로 (CST)는 신체와 뒷다리의 자발적인 운동 제어를 담당한다. 비강내 ExoPTEN 처리가 이러한 특정 관을 재생할 수 있는지를 연구하기 위해, 본 발명자들은 비처리, 엑소좀 (IN) 또는 ExoPTEN (IN)-처리된 SCI 래트에서 체운동 피질에 주사된 비오틴화된 덱스트란 아민 (BDA)을 사용하여 이의 궤적을 추적하였다. 본 발명자들은 처리되지 않은 SCI 그룹에서는 BDA-양성 섬유가 병변으로 침투하지 못한 반면 (도 14, 상부 패널), 엑소좀-처리된 그룹에서는 BDA-양성 섬유가 병변 내에서 보였지만 꼬리측 남은 부분으로 확장되지 않았음 (도 14, 중간 패널)을 밝혀내었다. 이와 달리, ExoPTEN 그룹에서는, BDA-양성 섬유가 병변에 침투하여 그 너머로 확장되는 것이 명확하게 보였다 (도 14, 하부 패널).
본 발명이 이의 특정 실시양태와 관련하여 기술되었지만, 많은 대안, 수정 및 변경이 당업계의 숙련가들에게 자명할 것임이 분명하다. 따라서, 이것은 첨부된 청구범위의 취지 및 넓은 범위에 속하는 이러한 모든 대안, 수정 및 변형을 포함하는 것으로 의도된다. 본 발명이 이의 바람직한 실시양태에 의해 본원에 기술되었지만, 첨부된 청구범위에 정의된 바와 같이 본 발명의 취지 및 본질에서 벗어나지 않고 수정될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Technion Research & Development Foundation Limited RAMOT AT TEL-AVIV UNIVERSITY LTD. <120> VESICLES COMPRISING A PTEN INHIBITOR AND USES OF SAME <130> TECH-075 PCT <150> 62/649648 <151> 2018-03-29 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 403 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Thr Ala Ile Ile Lys Glu Ile Val Ser Arg Asn Lys Arg Arg Tyr 1 5 10 15 Gln Glu Asp Gly Phe Asp Leu Asp Leu Thr Tyr Ile Tyr Pro Asn Ile 20 25 30 Ile Ala Met Gly Phe Pro Ala Glu Arg Leu Glu Gly Val Tyr Arg Asn 35 40 45 Asn Ile Asp Asp Val Val Arg Phe Leu Asp Ser Lys His Lys Asn His 50 55 60 Tyr Lys Ile Tyr Asn Leu Cys Ala Glu Arg His Tyr Asp Thr Ala Lys 65 70 75 80 Phe Asn Cys Arg Val Ala Gln Tyr Pro Phe Glu Asp His Asn Pro Pro 85 90 95 Gln Leu Glu Leu Ile Lys Pro Phe Cys Glu Asp Leu Asp Gln Trp Leu 100 105 110 Ser Glu Asp Asp Asn His Val Ala Ala Ile His Cys Lys Ala Gly Lys 115 120 125 Gly Arg Thr Gly Val Met Ile Cys Ala Tyr Leu Leu His Arg Gly Lys 130 135 140 Phe Leu Lys Ala Gln Glu Ala Leu Asp Phe Tyr Gly Glu Val Arg Thr 145 150 155 160 Arg Asp Lys Lys Gly Val Thr Ile Pro Ser Gln Arg Arg Tyr Val Tyr 165 170 175 Tyr Tyr Ser Tyr Leu Leu Lys Asn His Leu Asp Tyr Arg Pro Val Ala 180 185 190 Leu Leu Phe His Lys Met Met Glu Glu Thr Ile Pro Met Phe Ser Gly 195 200 205 Gly Thr Cys Asn Pro Gln Phe Val Val Cys Gln Leu Lys Val Lys Ile 210 215 220 Tyr Ser Ser Asn Ser Gly Pro Thr Arg Arg Glu Asp Lys Phe Met Tyr 225 230 235 240 Phe Glu Phe Pro Gln Pro Leu Pro Val Cys Gly Asp Ile Lys Val Glu 245 250 255 Phe Phe His Lys Gln Asn Lys Met Leu Lys Lys Asp Lys Met Phe His 260 265 270 Phe Trp Val Asn Thr Phe Phe Ile Pro Gly Pro Glu Glu Thr Ser Glu 275 280 285 Lys Val Glu Asn Gly Ser Leu Cys Asp Gln Glu Ile Asp Ser Ile Cys 290 295 300 Ser Ile Glu Arg Ala Asp Asn Asp Lys Glu Tyr Leu Val Leu Thr Leu 305 310 315 320 Thr Lys Asn Asp Leu Asp Lys Ala Asn Lys Asp Lys Ala Asn Arg Tyr 325 330 335 Phe Ser Pro Asn Phe Lys Val Lys Leu Tyr Phe Thr Lys Thr Val Glu 340 345 350 Glu Pro Ser Asn Pro Glu Ala Ser Ser Ser Thr Ser Val Thr Pro Asp 355 360 365 Val Ser Asp Asn Glu Pro Asp His Tyr Arg Tyr Ser Asp Thr Thr Asp 370 375 380 Ser Asp Pro Glu Asn Glu Pro Phe Asp Glu Asp Gln His Thr Gln Ile 385 390 395 400 Thr Lys Val <210> 2 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary siRNA sequences that are contemplated for inhibition of PTEN <400> 2 guuagcagaa acaaaaggag auaucaa 27 <210> 3 <211> 27 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary siRNA sequences that are contemplated for inhibition of PTEN <400> 3 uugauaucuc cuuuuguuuc ugcuaac 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary siRNA sequences that are contemplated for inhibition of PTEN <400> 4 cagccguucg gaggauuauu cgucutt 27 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary siRNA sequences that are contemplated for inhibition of PTEN <400> 5 agacgaauaa uccuccgaac ggcugtt 27 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary sequence to which the PTEN siRNA may be targeted <400> 6 gagttcttcc acaaacagaa 20 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Exemplary sequence to which the PTEN siRNA may be targeted <400> 7 gtatagagcg tgcagataa 19 <210> 8 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Examples of oligonucleotide sequences that can be used to form the loop <220> <221> n <222> (10)..(10) <223> n=a, u, t, c, g or absent <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or u <400> 8 uucaagagan 10 <210> 9 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial sequence <220> <223> Examples of oligonucleotide sequences that can be used to form the loop <220> <221> n <222> (10)..(10) <223> n=a, u, t, c, g or absent <220> <221> misc_feature <222> (10)..(10) <223> n is a, c, g, or u <400> 9 uuuguguagn 10 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 10 gaguucuucc acaaacagaa 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> artificial sequence <400> 11 uucuguuugu ggaagaacuc 20

Claims (41)

  1. 신경세포의 손상 (neuronal injury) 또는 부상 (damage) 치료용 약제학적 조성물로서, 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN) mRNA를 표적화하는 siRNA 및 PTEN mRNA를 표적화하는 shRNA에서 선택되는 PTEN 발현의 외인성 억제제가 로딩된 (loaded) 세포외 소포를 포함하며,
    세포외 소포가 골수 유래 중간엽 줄기세포 (MSC)로부터 유래되며,
    세포외 소포가 엑소좀인 약제학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, PTEN 발현의 억제제가 (i) 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 siRNA 및 (ii) 서열 번호 6 및 7로부터 선택된 핵산 서열을 표적화하는 siRNA로부터 선택되는, 약제학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 PTEN 발현의 억제제가 소수성 모이어티를 추가로 포함하며, 상기 소수성 모이어티가 스테롤, 강글리오시드, 지질, 비타민, 지방산, 및 이들의 조합을 포함하는, 약제학적 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 스테롤이 콜레스테롤인, 약제학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 세포외 소포가 단리된 세포외 소포인, 약제학적 조성물.
  6. 제1항에 있어서, 콘드로이티나제 ABC 또는 콘드로이티나제 ABC를 포함하는 세포외 소포를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 비강내, 병변내, 척수강내, 정맥내, 근육내, 피하, 설하, 경구 및 뇌내 투여 경로로부터 선택된 투여 경로를 통한 투여를 위해 제형화되는, 약제학적 조성물.
  8. 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 있어서, 대상체에서 신경세포의 손상 또는 부상을 치료하는데 사용하기 위한, 약제학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 신경세포의 손상 또는 부상이 척수 손상 (SCI)인, 약제학적 조성물.
  10. 제8항에 있어서, siRNA가 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 약제학적 조성물.
  11. 제10항에 있어서, siRNA가 콜레스테롤 모이어티와 접합되는, 약제학적 조성물.
  12. 제8항에 있어서, 사용이 조성물의 비강내 투여를 포함하는, 약제학적 조성물.
  13. 제8항에 있어서, 사용이 콘드로이티나제 ABC의 투여를 추가로 포함하는, 약제학적 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 외인성 PTEN 억제제가 로딩된 세포외 소포 및 콘드로이티나제 ABC가 단일 약제학적 조성물로 또는 상이한 약제학적 조성물로 투여되는, 약제학적 조성물.
  15. 포스파타제 및 텐신 동족체(PTEN) mRNA를 표적화하는 siRNA 및 PTEN mRNA를 표적화하는 shRNA에서 선택되는 외인성 PTEN 억제제가 로딩된 단리된 세포외 소포로서,
    세포외 소포가 골수 유래 중간엽 줄기세포 (MSC)로부터 유래되며,
    세포외 소포가 엑소좀인 단리된 세포외 소포.
  16. 제15항에 있어서, PTEN 억제제가 (i) 서열 번호 10, 11, 2, 3, 4 및 5로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는 siRNA 및 (ii) 서열 번호 6 및 7로부터 선택된 핵산 서열을 표적화하는 siRNA로부터 선택되는, 단리된 세포외 소포.
  17. 제16항에 있어서, 상기 PTEN 억제제가 소수성 모이어티를 포함하며, 상기 소수성 모이어티가 스테롤, 강글리오시드, 지질, 비타민, 지방산, 및 이들의 조합을 포함하는, 단리된 세포외 소포.
  18. 제17항에 있어서, 상기 스테롤이 콜레스테롤인, 단리된 세포외 소포.
  19. 제16항에 있어서, siRNA가 서열 번호 10, 11, 2 및 4로부터 선택된 핵산 서열을 포함하는, 단리된 세포외 소포.
  20. 제15항에 있어서, 콘드로이티나제 ABC 또는 이를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 추가로 포함하는, 단리된 세포외 소포.
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