KR19980077620A

KR19980077620A - 디아릴 헵타노이드 유도체 및 그 염을 주성분으로 함유하는 항암제 조성물

Info

Publication number: KR19980077620A
Application number: KR1019970014799A
Authority: KR
Inventors: 조의환; 정순간; 박시경; 오갑진; 공재명; 배춘일; 김현태; 김현종
Original assignee: 최승주; 삼진제약 주식회사
Priority date: 1997-04-21
Filing date: 1997-04-21
Publication date: 1998-11-16
Anticipated expiration: 2017-04-21
Also published as: KR0182244B1

Abstract

본 발명은 천연 자원으로부터 분리된 항암 활성을 나타내는 다음 일반식(1)으로 표시되는 물질 1,7-bis-(4-hydroxyphenyl)-5-(β-D-glucopyranosyloxy)-3-heptanone과 그 유도체 및 약학적으로 사용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 항암제 조성물에 관한 것이다. 천연자원으로부터 분리된 본 발명 물질은 항암 활성이 우수하고 안전성이 높으며 또한 기존약물에 비하여 부작용이 크게 감소될 것으로 기대된다.

식 중 R₁및 R₂는 각각 수소, 저급알킬기, 저급 알카노일기, 탄소수 5 내지 6의 단당류를 나타낸다.

Description

디아릴 헵타노이드 유도체 및 그 염을 주성분으로 함유하는 항암제 조성물

본 발명은 천연자원으로부터 분리된 디아릴 헵타노이드성 화합물에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로 본 발명은 오리나무로부터 분리된 항암활성을 나타내는 다음 일반 구조식(1)로 표시되는 화합물인 1,7-비스(4-치환페닐)-5-(베타-D-치환 또는 비치환)-3-헵타논)과 약학적으로 사용가능한 염을 주성분으로 함유하는 항암제 조성물에 관한 것이다.

식중에서 R₁, R₂는 수소, 저급알킬기, 아세틸기 또는 5-6의 탄소를 함유하는 단당류를 나타낸다.

상기 일반구조식(1)의 화합물중 1,7-비스-(4-하이드록시페닐)-5-(O-베타-D-글루코피라노실)-3-펩타논(이하 SJ-2704라 한다.)는 디아릴 헵타노이드의 일종으로 1973년 테라사와 등의 의해 베툴라 플라티필라(Betula platyphylla)로부터 최초로 분리된 물질로 보고되어 있다. [Mokuzai Gakkaishi 19(1), 47 (1973)] 그러나 이 문헌에는 SJ-2704가 항암효과를 가지고 있다는 어떠한 기재도 없다.

본 발명자들은 국내 천연자원으로부터 항암활성이 있는 물질을 찾기 위하여 오랫동안 천연물을 대상으로 약효 검색을 행하여 왔다. 오리나무수피는 고래로부터 해열, 지혈, 수렴작용이 있어 장염, 설사, 외상출혈, 혈변 등에 탕전하여 복용하거나 짓찧어서 한처에 붙이거나 하여 사용되어져 왔다. (김재길 : 원색천연약물 대사전, 1984)

본 발명자들은 오리나무의 잎과 수피로부터 추출한 엑기스에 대한 항암활성을 인체 유래 암 세포주에 대한 세포 독성실험을 실시한 결과 유의성 있는 활성을 관찰할 수 있었으며 일련의 계통적 용매 분획과 각종 칼럼 크로마토그래피를 이용하여 활성을 가진 물질(SJ-2704)을 추적분리하였다. 이 화합물은 기존의 항암작용을 갖는 약물들과 비교 실험한 결과 동등 이상의 약효를 갖고 있는 사실을 발견하였고 동물에 대한 급성독성 실험을 실시한 결과 경구투여와 복강내 투여에서 안전성이 매우 높은 것을 알 수 있었다. 오리나무(Alnus 속)에는 잔털오리나무(A. mayri), 물(산)오리나무(A. hirsuta), 물갬나무(A, hirstua var, sibirica), 덤블오리나무(A. fruticosa var, mandshurica), 두메오리나무(A. maxim-owiczii), 설령오리나무(A. vermicularis), 사방오리(A. firma), 좀사방오리(A, pendula), 오리나무(A. japonica)등이 있으며 자작나무과(Betulaceae)에 속하고 대부분이 산지 또는 고산지대에서 자란다. (이창복 : 대한식물도감, 1989)

본 발명의 목적은 상기 일반구조식(1)과 그 유도체 및 그 염을 주성분으로 함유하는 항암제 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

오리나무 잎을 건조 분쇄한 후 물과 알코올 혼합 용매로 추출하고 추출액을 감압 농축한 후 계통적인 용매분획을 실시하였다. 분획된 각각의 용매를 제거하여 농축 엑기스를 조제하고 이것을 1차로 세포독성효과검색의 시료로 사용하였다. 검색 결과 초산에틸 엑기스가 유의서 있는 효과를 나타내었으며 이 엑기스를 생리활성 지향분획에 의한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피와 겔 필트레이션 등의 방법으로 항암활성성분인 일반 구조식(1)의 화합물을 추적 분리하였다. 일반구조식(1)의 화합물은 기존의 항암제로 널리 사용되는 약물들과 비교할 때 동등 이상의 항암 효과를 나타내는 물질로서 약효가 우수하고 안전성이 매우 높은 것으로 나타났으며 또한 용해도가 우수하여 개발중에 있거나 개발된 약물들의 단점 중의 하나인 용해도 문제를 극복할 수 있어 제제화에 큰 도움이 될 뿐만 아니라 천연에서 분리된 물질로서 합성화합물에 비하여 부작용 또한 크게 감소 되리라 기대된다.

일반 구조식(1)의 화합물은 통상의 약학적으로 사용되는 부형제, 보조제, 안정화제, pH조절제, 항산화제와 함께 약학적으로 통상 사용되는 경구용제와 주사제등과 같은 통상의 제제형태로 제형화하여 투여할 수 있다.

일반구조식(1)의 화합물은 환자의 상태, 나이, 성별 등에 의하여 그 사용법이 달라질 수 있으나 통상으로 10∼1,000㎎의 양을 1일 1회 내지 수회 분할하여 투약할 수 있다. 또한 이 성분은 통상적으로 많이 사용되는 알칼리 금속염 또는 통상의 무기, 유기산 염류 등의 형태로 단독 또는 기타의 유효약물과 병용하여 투약할 수 있다.

다음의 실시예와 실험예로서 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

[실시예 1]

건조된 오리나무 잎 분말(10㎏)을 70% 에탄올 15ℓ로 3시간씩 3회 환류냉각 추출하고 추출액을 비점이하에서 감압 농축시켜 농축된 엑기스를 얻는다. 이 엑기스에 증류수 1ℓ를 넣고 80℃ 수조에서 현탁시킨 후 상온에서 계통적인 용매 분획을 실시하여 헥산(25g), 초산에틸(60g), 부탄올(80g), 물(360g) 엑기스를 조제하고 이것을 1차 약효검색의 시료로 사용하였다. 또한 유의성있는 활성이 관찰된 초산에틸 분획을 클로로포름/ 메탄올/ 물의 혼합용매를 사용한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피로 SJ-2704를 분리하였다.

[실시예 2]

건조된 오리나무 잎(5㎏)을 파쇄하여 메탄올 7ℓ로 상온에서 24시간씩 3회 추출하고 추출액을 합하여 농축한 다음 엑기스를 90% 메탄올과 헥산으로 진탕 추출하고 메탄올을 농축하여 클로로포름/ 메탄올/ 물을 사용한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피와 메탄올을 용매로한 겔 필트레이션을 행하여 SJ-2704를 분리하였다.

[실시예 3]

오리나무 수피(5㎏)를 절단하여 메탄올(7ℓ)로 상온에서 24시간, 3회 추출하고 이것을 농축한 후 헥산/메탄올로 분획하였다. 다시 메탄올을 취하여 농축하고 초산에틸과 물을 이용하여 초산에틸 분획을 얻었고 이것을 농축하여 초산에틸/ 메탄올/ 물의 혼합용매를 이용한 실리카겔 칼럼 크로마토그래피와 에탄올과 물로겔 필트레이션하여 SJ-2704를 얻었다.

SJ-2704의 기기분석 데이터

mp : 165℃(decomp.)

: 3400∼3350(OH), 2950∼1850(CH), 1700(C=O),

1610, 1590, 1510(Ph)

: 224(4.15), 279(3.54), 282(3.8)

¹H-NMR (CD₃OD, TMS, δ ppm)

1.74(m, 1H, 6-H), 1.83(m, 1H, 6-H), 2.59(m, 3H), 2.74∼2.81(m, 5H, 1,2,4,7-H), 4.16(m, 1H, 5-H), 6.67(dd, 4H, J=8Hz, Ar-H), 6.99(d, 2H, J=8.5Hz, Ar-H), 7.01(d, 2H, J=8.5Hz, Ar-H), 3.15(m, 1H, 2'-H), 3.25(m, 1H), 3.69(dd, 1H, J=12, 5Hz, 6'-H), 3.86(dd, 1H, J=12, 2Hz, 6'-H), 4.28(d, 1H, J=7.5Hz, 1'-H)

¹³C-NMR (Pyridine-d₅, TMS, δ ppm)

29.2(1), 45.9(2), 209.4(3), 48.2(4), 75.3(5), 38.2(6), 31.0(7), 132.1(1'),

133.2(1), 129.9(2'), 129.9(2), 116.3(3'), 116.3(3), 156.9(4'), 157.1(4),

116.2(5'), 116.2(5), 130.1(6'), 130.1(6), 103.6(1'), 75.3(2'), 78.5(3'), 71.7(4'),

78.3(5'), 62.8(6')

MS (m/z) : 476(M⁺), 296(M⁺-180)

[실시예 4]

SJ-2704 100㎎에 2% H₂SO₄5㎖을 넣고 환류냉각 반응을 2시간 한 다음 반응액을 클로로포름으로 추출하고 추출액을 비점 이하에서 감압농축한 다음 헥산/에틸아세테이트 혼합용매로 실리카겔 칼럼크로마토 그라피와 겔 필트레이션을 실시하여 SJ-2704의 가수분해물인 1,7-비스(4-하이드록시페닐)-5-하이드록시-3-헵타논(1,7-bis(4-hydroxyphenyl)-5-hydroxy-3-heptanone을 21㎎ 얻었다.

mp : 122℃ (decomp.)

: 3400(OH), 1690(C=O), 1600, 1500, 1210, 800

¹H-NMR (CD₃OD, TMS, δ ppm)

1.66(m, 2H, 6-H), 2.49∼2.75(m, 8H, 1-H, 2-H, 4-H, 7-H), 4.00(m, 1H, 5-H),

6.68(d, 2H, J=7.6Hz, 3'-H, 5'-H), 6.69(d, 2H, J=7.4Hz, 3-H, 5-H), 6.98(d, 4H, J=8Hz, 2'-, 6'-, 2-, 6-H)

¹³C-NMR (CD₃OD, TMS, δ ppm)

29.9, 32.0, 40.6, 46.5, 51.4, 68.4, 212.0, 116.6, 116.3, 130.3, 130.4, 133.4, 134.2, 156.5, 156.7

MS (m/z) : 314(M⁺), 296, 107(100)

[실시예 5]

SJ-2704 20㎎을 무수피리딘 1㎖에 녹이고 여기에 무수초산 1㎖를 가한후 상온에서 24시간 교반 방치한다. 반응 혼합물에 얼음물 50㎖를 넣고 클로로포름 50㎖로 3회 추출하고 추출액을 합하여 비점이하에서 감압 농축한 다음 클로로포름/에틸아세테이트로 실리카겔 칼럼 크로마토그라피하여 SJ-2704 헥사 아세테이트를 30㎎ 얻었다.

mp : 70℃ (decomp.)

¹H-NMR (CD₃OD, TMS, δ ppm)

2.28(two s, 6H, aromatic-OAc×2), 1.98, 2.01 and 2.03(four s, 12H,

alcoholic-OAc×4), 1.75∼1.86(m, 2H), 2.3∼2.87(m, 8H), 3.7(m, 1H),

4.58(d, 1H, J=8Hz, 1'-H), 4.6∼5.2(m, 7H), 6.96∼7.19(m, 8H, aromatic-H)

MS (m/z) : 728(M⁺), 686, 331, 107

[실험예 1]

세포 독성 실험 : SRB 방법.

각 실험 대상 세포주를 단세포 현탁액으로 만든 후 헤마토싸이토미터 체임버(hematocytometer chamber)에서 현미경으로 생존하고 있는 세포주를 계산한 뒤 96 웰 플레이트 보텀 마이크로미터 플레이트(well plate bottom microtiter plate)에 적정 농도의 세포수를 넣고 37℃, 5% CO₂-95% air incubator에서 24시간 preincubation했다. 대조군과 더불어 실험하고자 하는 시험물질을 넣고 37℃, 5% CO₂-95% air incubator에서 48시간 배양후 각 well의 배지를 aspiration 하여 제거하고 cold TCA를 가해준 후 4℃에서 1시간 방치한다. 흐르는 물에서 5회 세척후 공기중에 건조시킨다. 건조된 각 well에 0.4% SRB를 가하고 상온에서 30분간 방치한 후 1% HAc로 5회 세척하여 과량의 SRB를 제거하고 상온에서 건조시킨다. 완전히 건조된 각 well을 plate shaker에서 5분정도 진행시키고 ELISA reader로 파장 540nm에서 optical density(O.D.)를 측정하였다. 각 세포주에서 IC₅₀값(성장율 50% 억제하는데 요구되는 농도, 단위:㎍/ml)은 control O.D.의 50% 감소를 초래하는 시험물질의 농도로 정하였다. 모두 3회 이상의 반복실험을 하여 구하였으며 그 평균치를 다음의 공식에 의해 계산하였다.

(1-mean O.D. in test well/ mean O.D. in control well)×100(%)

이로부터 phamacological calculation program의 Quantal probit ananysis를 이용하여 각 시험 물질의 IC₅₀값을 구하였다.

[표 1] Cytotxicity against human tumor cell lines (IC₅₀;㎍/ml)

* Human tumor cell lines : A549 (lung carcinoma), AGS (gastric adenocarcinoma), HCT15 (colon adenocarcinoma), SKOV3 (ovary adenocarcinoma), HEP3B (hepatocellular carcinoma), VERO (green monkey kidney normal cell)

표1의 결과로부터 화합물 SJ-2704의 전반적인 세포독성 효과가 인정되고 정상세포(green monkey kidney normal cell)에 대한 독성이 기존약물에 비해 약한 것으로부터 보다 안전성이 높을 것으로 예상된다.

[실험예 2]

급성 독성 실험

5주령된 마우스(ICR계, 수컷 25±3.0g)를 실험 전에 실온 23±1℃, 습도 55±1%의 조건에서 고형사료 및 물을 자유롭게 섭취시켰다. 실험동물을 군 당 6마리씩 사용하여 약물을 경구투여와 비경구투여(복강, 정맥주사)하였다. 14일간 관찰하여 외견상태와 생사여부를 기록하였고 폐사동물은 부검하여 육안적 병변을 관찰하였다. LD₅₀값은 리치필드 제이 티 및 윌콕슨(Litchfield J. T. -Wilcoxon)법에 의해 구하였고 그 결과를 표 2에 나타내었다.

[표 2]. Acute toxicity (LD₅₀㎎/㎏)

* Drugs in Japan (ethical drugs)

표 2로부터 화합물 SJ-2704의 LD₅₀값은 경구투여에서 2000㎎/㎏ 이상이고 복강주사는 1000㎎/㎏ 이상으로 기존의 항암제들 보다 안전성이 매우 높은 것으로 나타났다.

제제 실시예 1.

정제의 조제

SJ-2404100㎎

콘 스타치50㎎

유 당50㎎

소디움 스타치 글리콜레이트40㎎

H. P. C5㎎

스테아린산 마그네슘5㎎

상기의 성분들을 통상의 정제의 제조 방법에 따라서 250㎎의 정제로 타정하여 정제로 제조한다.

제제 실시예 2.

캅 셀제의 제조방법

SJ-2704100㎎

유 당80㎎

제2인산칼슘100㎎

H. P. C.5㎎

스테아린산 마그네슘15㎎

상기의 성분들을 통상의 캅셀제 제조방법에 따라서 300㎎의 캅셀에 충전하여 제조한다.

제제 실시예 3.

주사제의 제조(2㎖ 기준)

SJ-2704100㎎

소디움 클로라이드18㎎

벤질 알콜45㎎

주사용 증류수적당량

상기의 성분들을 통상의 주사제 제조방법에 따라서 앰플에 충진하여 주사제로 제조한다.

제제실시예 4.

수액제의 제조(250㎖ 기준)

SJ-2704300㎎

소디움 클로라이드2250㎎

소디움 비설페이트250㎎

시트릭 산50㎎

소디움 시트레이트50㎎

프로필렌 글리콜12500㎎

주사용 증류수적당량

상기의 성분들을 통상의 수액제 제조방법에 따라 250㎖용량의 수액제 용기에 충전하여 수액제로 제조한다.

Claims

다음 일반구조식(1)의 화합물 또는 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하고 통상의 약학적으로 사용가능한 부형제 및 보조제와 통상의 약학적으로 허용되는 방법으로 통상의 약학적 제제로 제형화한 항암제 조성물.

식 중 R₁및 R₂는 각각 수소, 저급알킬기, 저급 알카노일기, 탄소수 5 내지 6의 단당류를 나타낸다.