KR20000052845A - 항-피53 단일쇄 항체 단편 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 종양 세포에 발현될 수 있는, 시험관내 DNA 결합 및 생체내 전사 활성화 기능을 복원시킬 수 있는 p53 단백질에 대해서 인도된 단일쇄 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 분자를 암호화하는 핵산, 이들을 함유하는 벡터 및 이들의 용도에 관한 것이다.

Description

항-피53 단일쇄 항체 단편 및 이의 용도{ANTI-P53 SINGLE-CHAIN ANTIBODY FRAGMENTS AND THEIR USES}

야생형 p53 단백질은 세포 사이클의 조절 및 세포 게놈의 보존성 유지에 관여된다. 주요 기능이 특정 유전자의 전사 활성자인 이러한 단백질은 아직은 잘 정의되지 않은 과정에 의해서, 게놈 복제중에 돌연변이가 나타날 때 세포 사이클의 G1기에서 세포를 차단하고 특정 수의 DNA 수선 과정을 작동 상태로 세팅할 수 있다. 또한, 이러한 수선 과정에 결점이 있거나 너무 많아서 수정될 수 없는 돌연변이 사건이 일어나는 경우, 이 단백질은 아폽토시스라고 불리는 프로그램밍된 세포 사멸의 현상을 유도할 수 있다. 이러한 방식으로, p53 단백질은 비정상적인 방법으로 분화되거나 게놈이 손상된 세포를 제거함으로써 종양 억제자로서 기능한다.

p53의 이러한 주요 기능은 전사 인자 기능, 즉, 게놈 DNA내 특정 서열을 인식하고 전사의 일반 기구를 보충하는 이중 능력에 의존한다.

p53 단백질은 5 가지 기능성 도메인을 규정하는 393 개 아미노산을 포함한다:

- 1 내지 73 번 아미노산으로 이루어지고 단백질 TBP와 같은 일반 전사 기구의 특정 인자를 결합시킬 수 있는 전사 활성자 도메인. 이 도메인은 또한 특정 수의 후-해독 변형의 부위이다. 이것은 또한 p53 단백질과 대다수의 기타 단백질, 특히 단백질이 야생형 단백질의 기능을 차단할 수 있는 세포 단백질 mdm2 또는 엡스타인-바 (Epstein-Barr) 바이러스 (EBV) 단백질 EBNA5 간의 대다수의 상호작용 부위이다. 또한, 이 도메인은 PEST라고 불리우고 단백질 분해에 민감한 아미노산 서열을 지닌다.

- 아미노산 73과 315 사이에 위치하는 DNA-결합 도메인. p53의 이러한 중앙 도메인의 배치는 p53 단백질에 특이적인 DNA 서열의 인식을 조절한다. 이 도메인은 야생형 단백질의 기능에 영향을 미치는 두 유형의 변형된 부위이다:

(i) p53의 기능을 차단하고 유비키틴 시스템에 의해서 이의 분해를 일으킬 수 있는, SV 40 바이러스의 "거대 T" 항원 또는 HPV16 및 HPV18 바이러스의 E6 바이러스 단백질과 같은 단백질과의 상호작용. 이러한 후자의 상호작용은 단지 세포 단백질 E6ap (유비키티닐화 캐스케이드의 효소 E3)의 존재 하에서만 수행될 수 있다.

(ii) p53 및 이 영역에 위치된 거의 모든 기능에 영향을 미치는 점 돌연변이.

- 아미노산 315 내지 325로 이루어지고 단백질이 주요 기능을 발휘할 구획으로 단백질을 정확히 인도하기에 필수적인 핵 배치 시그널.

- 아미노산 325 내지 355로 이루어지는 올리고머화 도메인. 이러한 325 내지 355 영역은 β 플리팅 시이트 (326 내지 334)-굴곡부(335 내지 336)-α-나선 (337 내지 355) 유형의 구조를 형성한다. 이 영역에 위치하는 기능적인 변형은 본질적으로 야생형 단백질의 기능에 가변적인 효과를 일으킬 수 있는 상이한 돌연변이 형태와 야생형 단백질의 상호작용으로 인한 것이다.

- 365 내지 393 번 아미노산으로 이루어지고 포지티브 또는 네가티브 방식으로 p53 단백질의 기능을 조정하는 다양한 후-해독 변형 (글리코실화, 포스포릴화, RNA 결합 등) 부위인 조절 도메인. 이 도메인은 야생형 단백질의 활성을 조정하는 매우 중요한 역할을 한다.

p53 단백질의 작동은 다양한 방식으로 붕괴될 수 있다.

- 이의 기능은 다양한 인자, 예를 들면, SV40 바이러스 "거대 T" 항원, 엡스타인 바 바이러스 EBNA5 단백질 또는 mdm2 세포 단백질에 의해서 차단될 수 있다.

- 단백질은 단백질 분해에 대한 민감성을 증가시킴으로써, 특히 유비키티닐화 사이클로의 p53 유입을 촉진하는 단백질인 인간 파필로마 바이러스 HPV16 및 HPV18의 E6 단백질과의 상호작용에 의해서 불안정화될 수 있다. 이 경우에, 이들 두 단백질 간의 상호작용은 결합 부위가 거의 알려지지 않은 세포 단백질, E6ap 단백질의 선행 결합에 의해서만 수행될 수 있다.

- 점 돌연변이가 p53 유전자 내에서 일어날 수 있다.

- p53 대립유전자 하나 또는 모두가 결실될 수 있다.

마지막 두 유형의 변형은 상이한 유형의 암의 약 50 %에서 발견되었다. 이에 관하여, 암 세포에서 목록으로 만든 p53에 대한 유전자의 돌연변이는 이 단백질을 암호화하는 유전자의 대부분에 영향을 미치고 이 단백질의 작동에 다양한 변화를 유발한다. 그러나, 이들 돌연변이 대부분이 p53 단백질에 특이적인 게놈 서열과 접촉하는 영역으로 알려진 p53 단백질의 중앙부에 위치함이 주지될 수 있다. 이것은 p53 단백질의 대부분의 돌연변이체의 주요 특성이 야생형 단백질에 의해서 인식되는 DNA 서열에 더이상 결합될 수 없고, 따라서 전사 인자의 역할을 더이상 수행할 수 없는 이유를 설명한다. 다른 점에서, 일부 돌연변이체가 특정 유전자의 전사 수준으로의 활성화와 같은 신규한 기능을 획득하는 것으로 보인다.

현재, 모든 이러한 다양한 변형이 3가지 범주로 분류되어 있다:

- 두 대립유전자 중 하나만이 돌연변이되는 경우, 나머지 한 대립유전자에 의해서 암호화되는 야생형 단백질의 작동에 영향을 미치지 않는 비기능성 단백질 산물인 소위 약 돌연변이체. 이러한 범주의 주요 대표적 예는 돌연변이체 H273과 암 질환에 대한 고민감성의 리-프라우메니(Li-Fraumeni) 가족성 증후군에 특이적인 W248이다.

- 두 대립유전자 중 하나만이 돌연변이되는 경우, 및 야생형 단백질과의 상호작용에 의해서, 및 야생형 단백질에 특이적인 DNA 서열에 더이상 결합할 수 없는 불활성 혼합 올리고머를 형성함으로써 야생형 단백질의 작동을 차단할 수 있는 비기능성 단백질 산물인 우성-네가티브 돌연변이체. 이러한 범주의 주요 예는 돌연변이체 G281이다.

- 한편으로는 이전 범주의 돌연변이체와 같이 야생형 단백질의 기능을 차단하고, 다른 한편으로는 잘 이해되지 않은 메커니즘에 의해 종양 발생을 촉진할 수 있어 이렇게 하여 기능에 있어 이득을 나타내는 단백질 산물인 우성-옹코진 돌연변이체. 이러한 범주의 주요 예는 돌연변이체 H175이다.

항-종양 및 아폽토시스 성질, 및 과증식형 대다수 병리에 있어 이의 관련의 견지에서, 야생형 p53 유전자가 유전자 치료 및 세포 치료 접근에 사용되었다. 특정 과증식성 병리, 특히 암이 야생형 p-53 유전자를 생체내에 투여하고 이로 인해 p53 기능을 복원시킴으로써 치료됨이 특히 제안되었다. 투여는 선택적으로 바이러스 벡터, 특히 아데노바이러스 (WO94/24297) 또는 레트로바이러스 (WO94/06910) 벡터에 의해서 수행될 수 있다. 따라서, 야생형 p53 단백질을 암호화하는 핵산의 도입이 세포 생장의 정상 조절을 부분적으로 복원되게 할 수 있음이 입증된다 [참고문헌: Roth et al., Nature Medicine 2 (1996) 985]. p53 유형의 성질을 지니는 키메릭 분자를 사용함을 기초로 하는 대안 전략이 또한 개발되었다 (PCT/FR96/01111).

야생형 p53 단백질의 기능 복원을 목적으로 하는 다른 접근법은 내생 돌연변이 단백질의 야생형 p53의 종양-억제 및 아폽토시스 성질을 나타내는 야생형 표현형으로의 복귀를 기초로 한다. 이러한 접근법은 p53 돌연변이체 기능의 손실이 돌연변이에 의해서 유도되는 단백질의 배치 변화로 인한 것이라는 입증으로부터 유발된다. 이에 관하여, 출원 WO94/12202는 pAb421로 표시되고 p53 단백질에 대해서 인도되는 특정 모노클론 항체가 시험관내 DNA에의 결합 기능을 인간 암에 자주 나타나는 특정 부류의 돌연변이체에 복원할 수 있음을 입증한다. 그러나, 이러한 유형의 화합물의 사용은 특히 요구되는 대량의 항체 (그러므로 생산/정제의 관련 문제)와 이의 불량한 세포내 투과에 연관되는 심각한 약점이 있다.

본 발명은 전사 인자 기능이 없거나 전사 인자 기능이 감소된 돌연변이 p53 단백질을 발현하는 세포에서 p53-의존성 트랜스활성화 활성을 복원시키기 위한 방법에 관한 것이다. 좀더 상세하게는, 본 발명의 방법은 돌연변이 p53 단백질을 특이적으로 결합시킬 수 있는 단일쇄 항체를 사용함을 기초로 한다. 본 발명은 또한 p53 단백질을 특이적이고 효율적으로 결합시킬 수 있고 또한 종양 세포에서 p53 활성을 복원시킴을 가능하게 하는 신규한 분자와 이들 분자를 암호화하는 핵산 및 이들을 함유하는 벡터에 관한 것이다. 이러한 방법 및 본 발명의 분자는 p53 및 이의 돌연변이 형태의 기능 메커니즘을 연구하고 p53 단백질을 정제하기 위해서 시험관내 또는 생체외에서 사용될 수 있다. 이들은 또한 생체내 용도, 특히 암과 같은 병리적 상황에서 p53 활성을 복원시키기 위한 치료 접근법을 제공한다.

도 1: 항체 스크리닝 전략.

도 2: 겔에서 p53의 이동을 지연시키는 항체 능력의 입증.

도 3: 겔에서 p53H273의 이동을 지연시키는 항체 능력의 입증.

도 4: ScFv와 야생형 p53의 연계를 입증하기 위한 ELISA의 사용. 검은 원: IgG 11D3 (초기 1 ㎕/㎖); 흰원: IgG 421 (초기 1 ㎕/㎖); 사각형: 바이오티닐화 폴리클론 혈청 (초기 1 ㎕/㎖); 검은 삼각형: ScFv 11D3-myc (초기에 희석된 1/2); 흰 삼각형: ScFv 421 myc (초기에 희석된 1/2); 마름모: 관계없는 ScFv (항-CD3, 초기에 희석된 1/2).

도 5: ScFv에 의해서 유도된 겔 지연의 입증.

도 6: p53의 돌연변이체로 DNA-결합 활성의 복원.

도 7: H1299에서 ScFv421의 발현.

도 8: 세포주 H358에서 돌연변이체 H273의 전사 활성의 복원.

도 9: 세포주 HT29에 내생성인 돌연변이체 H273의 전사 활성의 복원.

본 출원은 p53 단백질 변이체의 야생형 성질을 복원하기 위한 좀더 효과적인 접근법을 기재한다. 본 출원은 특히 p53 단백질에 대해 특히 특이적이고 야생형 p53 기능을 복원시키기에 유리한 리간드의 작제를 기재한다. 좀더 상세하게는, 본 출원은 단일쇄 항체 (ScFv), 특히 p53 단백질에 특이적인 분자 11D3의 작제를 기재한다. 본 출원은 또한 ScFv가 p53을 인식할 수 있고 종양 세포 내에서 효율적으로 발현될 수 있으며 특정 부류의 p53 돌연변이체의 트랜스 활성화 기능의 일부를 재활성화시킬 수 있음을 입증한다.

선행 기술의 방법에 비하여, 이러한 분자는 중요한 장점, 특히 종양 세포에서 원위치에 실질적인 양으로 발현될 가능성을 나타낸다. 하기에 제시된 결과는 모두 친화력의 손실이 종종 통상적인 항체로부터 ScFv로 통과시 관찰되었으므로 더욱 예상치 못한 것이다. 또한, 출원인은 적합한 세포내 구획에 ScFv를 발현함이 가능하고 이로 인해 최적의 생물학적 활성이 수득되도록 할 수 있다는 것을 입증했다.

그러므로, 본 발명은 돌연변이 p53 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 단일쇄 항체를 세포로 도입함을 포함하는, 돌연변이 p53 단백질을 지니는 세포에 p53-의존성 트랜스활성화 활성을 복원시키기 위한 방법에 관한 것이다. 유리하게, 본 발명의 방법은 세포에서 기능할 수 있는 프로모터의 조절 하에서 단일쇄 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 세포로 도입함을 포함한다. 본 발명의 다른 양태는 특히 단백질의 배치를 변경시키기 위해 돌연변이 p53 단백질을 결합시킬 수 있는 단일쇄 항체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한 특히 돌연변이 p53 단백질이 수반되는 과증식성 장애를 치료하고자 하는 약학 조성물 제조를 위한 돌연변이 p53 단백질을 결합시킬 수 있는 단일쇄 항체의 용도 및 특히 돌연변이 p53 단백질이 수반되는 과증식성 장애를 치료하고자 하는 약학 조성물 제조를 위한 돌연변이 p53 단백질을 결합시킬 수 있는 단일쇄 항체를 암호화하는 핵산의 용도에 관한 것이다.

그러므로, 본 발명의 방법은 부분적으로 돌연변이 p53 단백질을 특이적으로 결합시킬 수 있는 단일쇄 항체를 작제하고 벡터화한 다음 이러한 항체를 세포에 도입시킴을 기초로 한다. 단일쇄 항체 (ScFv)는 본질적으로 아암에 의해 VL 영역에 결합되는 VH 영역으로 이루어진다. 이러한 변형된 항체를 암호화하는 ScFv 및 핵산 서열의 작제가 예를 들면 본원에 참조로 인용되는 특허 US 4,946,778 또는 출원 WO 94/02610 및 WO 94/29446에 기재되어 있다.

본원에는 좀더 상세하게는 p53에 대해 인도된 항체를 생성하는 하이브리도마 라이브러리의 생성 및 이 라이브러리로부터 상응하는 ScFv의 작제가 기재되어 있다. 또한 상응하는 핵산의 발현 벡터로의 클로닝 및 세포로의 이들의 전달이 기재되어 있다. 또한 이러한 전달이 p53 돌연변이체의 DNA-결합 활성 및 이의 트랜스활성화 활성을 효율적으로 생체내에 복원되게 할 수 있음을 입증한다.

좀더 상세하게는, 본 발명의 방법은 p53의 C-말단 영역에 존재하고 올리고머화 도메인과 조절 도메인을 운반하는 에피토프를 특이적으로 결합시킬 수 있는 ScFv를 사용한다. 이에 관하여, 본 출원에는 또한 이러한 성질을 지니는 ScFv가 ELISA 기술에 의해서 선택될 수 있게 하는 시험이 기재되어 있다.

좀더 바람직하게도, 본 발명 방법에 사용된 ScFv는 잔기 320 내지 393 사이의 p53의 C-말단 영역에 존재하는 에피토프를 특이적으로 결합시킬 수 있다. 이에 관하여, 본 출원에는 특정 예로서, 서열번호 1의 서열을 갖는 ScFv 421과 서열번호 2의 서열을 갖는 11D3의 작제 및 발현이 기재되어 있다.

본 발명의 방법은 일반적으로 전체적으로 또는 부분적으로 DNA에 결합하는 능력을 상실한 돌연변이 p53 단백질에 적용될 수 있고 본 발명의 방법은 이 능력이 복원될 수 있게 한다. 좀더 상세하게는, 본 발명의 방법은 전체적으로 또는 부분적으로 p53의 전사 인자 기능을 상실한 돌연변이 p53 단백질에 적용될 수 있고 이 기능이 복원될 수 있게 한다. 복원의 정도는 전체적이거나 부분적일 수 있다. 유리하게, 돌연변이체가 세포 사이클을 차단하고/하거나 아폽토시스를 유도함으로써 종양-억제 기능을 발휘할 수 있게 하기에 충분하다. 그러므로, 본 발명의 방법은 이러한 활성이 없는 내생 돌연변이 p53 단백질을 지니는 세포에 종양-억제 활성을 적어도 부분적으로 복원시킴을 가능하게 한다. 유리하게, 이 단백질은 종양 세포에 존재하는 돌연변이 단백질이다. 상기에 지적된 바와 같이, p53 단백질의 상이한 돌연변이형이 종양 세포에서 입증되었다. 단백질 p53H273, p53W248 및 p53G281이 예로서 언급될 수 있다. 하기에 제시된 실시예는 특히 본 발명의 방법이 이들 돌연변이체의 시험관내 및 생체내 배치 및 생물학적 성질을 변형시킴을 가능하게 함을 입증한다. 특히, 이들 실시예는 ScFv 421과 11D3이 DNA를 특이적으로 결합시키고 p53-의존성 트랜스활성화를 유도하는 돌연변이체 273 및 248의 능력을 복원시킬 수 있음을 입증한다.

본 발명의 방법은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 실행될 수 있다. 시험관내 또는 생체외에서, 본 발명의 방법 및 분자는 예를 들면, p53 기능의 메커니즘과 이의 돌연변이 형태를 연구함을 가능하게 할 수 있다. 또한, 본 발명의 분자는 예를 들면, 분자를 지지체에 커플링하고 이들을 p53 단백질을 함유하는 용액에 접촉시킴으로써, 필요시 형성된 복합체의 가시화 또는 용출에 의해서 p53 단백질을 검출하거나 정제하기 위해서 사용될 수 있다. 생체내, 특히 인간에서, 이들은 p53 활성의 부족이 관찰되는 과증식성 장애와 같은 병리 상황에서 이러한 기능이 복원됨이 가능하게 할 수 있다. 이에 관하여, 본 방법은 기타 상기-언급된 접근법 (야생형 p53 유전자)과 연계하여 또는 그밖에 화학요법 (WO96/22101)과 연계하여 사용될 수 있다. 생체내에서도, 본 발명의 방법 및 분자는 예를 들면, ScFv가 발현되는 수준을 측정하고 인간에서의 사용을 위한 치료 접근의 가능성을 평가하기 위해서 동물에 사용될 수 있다.

유리하게도, 돌연변이 p53 단백질을 지니는 세포는 포유동물 종양 세포이다. 이에 관하여, 좀더 상세하게 언급될 수 있는 이들 세포는 폐 (특히 작지 않은 세포), 결장, 간, 뇌, 두부 및 목부의 암, 및 좀더 일반적으로 돌연변이 형태의 p53 단백질이 관찰되는 암의 세포이다. 유리하게, 세포는 p53H273, p35W248 및/또는 p53G281 돌연변이체가 관찰되는 (폐, 결장, 뇌, 두부 및 목부, 간) 인간 종양 세포이다. 본 발명의 특정 세포에의 적용능은 특히 하기의 방법을 사용하여 결정될 수 있다: 세포를 우선 돌연변이 p53 단백질의 존재에 대해 검사한다. 이 단백질을 돌연변이 성질을 측정하기 위해서 검사한다. 이 돌연변이가 공지된, 특히 상기에 수록된 돌연변이인 경우, 세포를 본 발명의 방법에 의한 처리에 민감성이라고 언급할 수 있다. 돌연변이가 수록되지 않은 돌연변이인 경우, 다양한 접근이 가능하다. 돌연변이 단백질을 우선 분리하고 (또는 인공적으로 합성하고) 실시예에 기재된 바와 같이 ScFv의 존재하에 시험관내 및 생체내 행위에 대해서 시험할 수 있다. 이것은 이 단백질의 결손된 기능을 복원하기에 적합한 ScFv가 동정될 수 있게 한다. 다른 접근법은 ScFv의 생물학적 효능을 측정하기 위해서 세포 배양시 ScFv를 직접 시험함에 있다.

본 발명의 방법을 수행하기 위해서, ScFv를 유리하게 세포에서 기능할 수 있는 프로모터의 조절 하에서 ScFv를 암호화하는 핵산을 운반하는 벡터의 형태로 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포에 도입한다.

프로모터는 유리하게 포유동물 세포, 바람직하게는 인간 세포에서 기능할 수 있는 프로모터 중에서 선택한다. 좀더 바람직하게는, 프로모터는 핵산이 과증식성 (암, 재협착증 등) 세포에서 발현될 수 있게 하는 프로모터이다. 이에 관하여 다양한 프로모터가 사용될 수 있다. 프로모터는 예를 들면, p53 유전자 본래의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 (다른 단백질 또는 합성 단백질의 발현을 책임지는) 상이한 기원의 영역일 수 있다. 따라서, 프로모터는 유전자의 전사를 특이적으로 또는 비-특이적으로, 유도적으로 또는 비-유도적으로 및 강하게 또는 약하게 자극하거나 억제하는 프로모터 또는 유도된 프로모터일 수 있다. 진핵세포 또는 바이러스 유전자의 프로모터 서열을 특히 언급할 수 있다. 예를 들면, 프로모터 서열은 표적 세포의 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열일 수 있다. 특히 사용될 수 있는 진핵세포 프로모터는 편재성 프로모터 (HPRT, PGK, α-액틴, 튜불린 등 유전자의 프로모터), 중간체 필라멘트의 프로모터 (GFAP, 데스민, 비멘틴, 뉴로필라멘트, 케라틴 등 유전자의 프로모터), 치료 유전자의 프로모터 (예를 들면, MDR, CFTF, 인자 VIII, ApoAI 등 유전자의 프로모터), 조직-특이성 프로모터 (피루베이트 키나제, 빌린, 소장 지방산 결합 단백질, 평활근 α-액틴 등 유전자의 프로모터) 또는 그밖에 자극에 반응하는 프로모터 (스테로이드 호르몬 수용체, 레티노산 수용체 등)이다. 유사하게, 프로모터 서열은 바이러스 게놈으로부터 유도된 프로모터 서열, 예를 들면, 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, CMV 초기 프로모터, 또는 기타 RSV LTR 프로모터 등일 수 있다. 또한, 이들 프로모터 영역은 조직-특이성이거나 주로 조직-특이성인 발현을 허용하는 활성화 서열 또는 조절 서열(들)의 첨가에 의해서 변형될 수 있다.

상기에 지적된 바와 같이, 본 출원에는 또한 돌연변이 p52 단백질을 결합시키고 복귀시키는 특히 유리한 성질을 지니는 신규한 분자가 기재되어 있다. 좀더 상세하게, 본 발명에는 특정 ScFv (11D3 및 421)의 작제, 벡터화 및 세포로의 전달이 기재되어 있다. 이러한 ScFv의 핵산 서열 및 펩티드 서열이 서열번호 1과 서열번호 2에 기재되어 있다. 하기의 실시예는 (i) 특이적으로 C-말단 영역에서 돌연변이 p53 단백질을 결합시키고, (ii) DNA를 결합시키는 이들 돌연변이 단백질의 능력을 복원시키며, (iii) 전사를 활성화하는 이들 단백질의 능력을 복원시키는 이 분자의 특히 유리한 능력을 설명한다. 실시예는 또한 이들 분자가 종양 세포에서 정확하게 발현되고 이로 인해 분자가 과증식성 장애의 상황에서 유리하게 사용될 수 있게 함을 설명한다. 또한, 본 발명의 ScFv의 성질은 또한 개선될 수 있다. 특히, ScFv의 친화력이 CDR 영역 (서열에서 밑줄쳐진 것)에 의해서 개선되고 일상의 돌연변이/선택 실험에 의해서 개선될 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 항체에서 수행된 돌연변이가 예를 들면, Marks 등 [참조문헌: Bio/Technology, 10, 779-783, 1992] 및 Winter G.와 Milstein C. [참조문헌: Nature, 349, 293-299, 1991]에 의해서 기재되었다. 이들 참조문헌에 기재된 기술을 본 발명에 따라 변형된 친화력을 갖는 ScFv의 변체를 제조하는 데에 적용시킬 수 있다. 이어서 선택을 실시예에 기재된 조건 하에서 수행할 수 있다.

그러므로, 본 발명은 또한 펩티드 서열이 서열번호 2에 기재된 11D3 분자 및 p53 단백질을 결합시키는 능력을 보유한 CDR 영역에서의 변형을 나타내는 변체에 관한 것이다. 변형은 CDR 영역의 하나 이상의 잔기의 결실, 치환 또는 삽입으로 이루어진다. 유리하게, 변형은 10 개 이하의 잔기에 영향을 미친다.

본 발명은 또한 ScFv 11D3 또는 상기의 변체를 암호화하는 핵산에 관한 것이다.

본 발명에 따른 핵산은 리보핵산 (RNA) 또는 디옥시리보핵산 (DNA)일 수 있다. 유리하게, 이것은 상보적인 DNA (cDNA)이다. 이것은 인간, 동물, 바이러스, 합성 또는 반-합성 기원일 수 있다. 이것은 상이한 방법으로, 특히 본 출원에 제시된 서열을 사용하는 화학적 합성, 예를 들면, 핵산 합성기에 의해서 수득될 수 있다. 이것은 또한 특정 탐침, 특히 본 출원에 기재된 것을 갖는 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득될 수 있다. 이것은 라이브러리를 스크리닝함으로써 수득된 서열의 화학적 변형 (신장, 결실, 치환 등)을 포함하는 혼합된 기술에 의해서 수득될 수 있다. 일반적인 방법에서, 본 발명의 핵산은 기술자에게 공지된 기술 (특히, 본원에 참조로 인용되는 특허 US4,946,778 및 WO94/02610에 기재된 기술)에 의해서 제조할 수 있다. ScFv를 암호화하는 핵산을 작제하기 위한 표준 전략은 하기와 같다: VH 및 VL을 암호화하는 cDNA 분자를 선택된 항-p53 항체를 생성하는 하이브리도마로부터 수득한다. 이를 위해서, 하이브리도마의 RNA 전체를 추출한 다음 프라이머로서 랜덤 육량체를 사용하는 역전사 반응에 투입한다. 이러한 유형의 프라이머의 사용은 이뮤노글로불린에 특이적인 프라이머를 사용함을 피할 수 있게 한다. 생성된 cDNA 클론은 V 영역을 클로닝하기에 충분한 길이이다. 이들이 너무 적게 존재하는 cDNA 전체의 분획을 나타내는 경우, 클로닝을 위한 충분한 DNA를 생성하기 위해서 예비 증폭 반응이 수행될 수 있다. 이를 위해서, VH 및 VL 영역을 암호화하는 cDNA 분자가 개별적으로 증식된다. 사용된 프라이머는 각 쇄의 가변성 영역 (H 및 L)의 상대 말단에 하이브리드화하는 올리고뉴클레오티드이다. 중쇄에 특이적인 프라이머를 사용하여 수득된 증폭 산물과 경쇄에 특이적인 프라이머를 사용하여 수득된 증폭 산물을 정제한다. 정제 후, 항체의 VH 및 VL 영역을 암호화하는 cDNA 분자를 뉴클레오티드 아암 (L)을 사용하여 단일쇄에 함께 결합시킨다. 말단 중 하나가 VH 영역을 암호화하는 cDNA의 3' 말단에 결합하고 다른 하나가 VL 영역을 암호화하는 cDNA의 5' 말단에 결합하도록 뉴클레오티드 아암을 작제한다. 아암의 서열이 펩티드 (G4S)3을 암호화한다. 약 700 bp의 조합된 서열은 VH-L-VL 조합을 함유하고, 이 서열이 예를 들면, NcoI/NotI 단편의 형태로 서열번호 1과 서열번호 2에 도시되어 있다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 핵산은 cDNA 또는 RNA이다.

본 발명에 따른 핵산은 유리하게

(a) 서열번호 2 또는 이의 상보적 본쇄 모두 또는 일부,

(b) (a) 서열과 하이브리드화하고 바람직하게는 C-말단 영역 내에서 p53 단백질을 특이적으로 결합시킬 수 있는 ScFv를 암호화하는 서열, 및

(c) 유전자 코드의 퇴화로부터 생성된 (a) 및 (b)의 변체 중에서 선택된다.

본 발명은 또한 상기에 정의된 핵산, 이것이 발현될 수 있게 하는 프로모터 및 전사 종결 시그널을 포함하는 발현 카세트에 관한 것이다.

본 발명의 방법에서, 산은 유리하게 (i) 세포 침투의 효능, (ii) 표적화 및/또는 (iii) 세포외 및 세포내 안정성을 개선할 수 있게 하는 투여 벡터에 의해서 세포로 도입된다.

본 발명의 하나의 특히 바람직한 양태에서, 핵산은 화학적 (리포좀, 미세입자, 펩티드 복합체, 양이온성 지질 또는 중합체 등), 바이러스 (레트로바이러스, 아데노바이러스, 허프스바이러스, AAC, 백시니아 바이러스 등) 또는 플라스미드 기원일 수 있는 벡터로 혼입된다.

바이러스 벡터의 사용은 바이러스의 천연 형질감염 성질을 기초로 한다. 따라서, 예를 들면, 아데노바이러스, 허프스바이러스, 레트로바이러스 및 아데노-수반 바이러스를 사용함이 가능하다. 이들 벡터는 형질감염에 대해서 특히 효율적인 것으로 밝혀졌다. 특히, 종양 세포를 감염시키는 아데노바이러스와 레트로바이러스의 능력은 이들 바이러스를 본 발명의 정황에서 선택되는 벡터로 만든다. 이에 관하여, 본 발명의 바람직한 양태에서, 핵산은 레트로바이러스 벡터의 형태로, 즉, 게놈이 상기에 정의된 바와 같은 ScFv를 암호화하는 핵산을 포함하는 결손 재조합 레트로바이러스의 형태로 도입된다. 본 발명의 다른 바람직한 양태에서, 핵산은 아데노바이러스 벡터의 형태로, 즉, 게놈이 상기에 정의된 ScFv를 암호화하는 핵산을 포함하는 결손 재조합 아데노바이러스의 형태로 도입된다.

본 발명에 따른 벡터는 진핵세포에서 핵산의 전달 및 발현을 촉진할 수 있는 비-바이러스 제제일 수 있다. 합성 또는 천연 화학적 또는 생화학적 벡터는 특히 편리함, 안전성 및 형질감염될 DNA의 크기에 관한 이론적 한계의 부재로 인하여 천연 바이러스의 유력한 대안을 나타낸다. 이들 합성 벡터는 형질감염될 핵산을 압축하고 세포에의 결합 및 원형질 막과 필요한 경우 두 핵막을 통한 통과를 촉진하는 2 가지 주요한 기능이 있다. 핵산의 다음이온성을 보상하기 위해서, 비-바이러스 벡터는 모두 다양이온성 전하를 지닌다. 본 발명에 따른 특정 방법에서, 벡터는 화학적이거나 생화학적이다.

본 발명은 또한 상기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기에 정의된 바와 같은 적어도 하나의 ScFv를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 동시 결합된 사용을 위해서 또는 시간에 따라 간격을 두는 결합된 사용을 위해서, 상기에 정의된 바와 같은 핵산 또는 벡터 및 야생형 p53을 암호화하는 핵산 또는 벡터를 포함하는 조성물에 관한 것이다.

증식방지성으로 인하여, 본 발명에 따른 약학 조성물은 과증식성 장애, 예를 들면, 특히 암 및 재협착증 치료에 매우 특히 적합하다. 따라서, 본 발명은 세포, 특히 과증식성 세포 파괴를 위한 특히 효율적인 방법을 공급한다.

본 발명은 시험관내 또는 생체외에서 사용될 수 있다. 이 경우에, 하나 이상의 핵산 (또는 벡터 또는 카세트 또는 직접 ScFv)의 존재하에 세포를 배양함에 있다. 10⁶세포당 벡터 0.01 내지 1000 ㎍의 용량 또는 바이러스 벡터에 대해 0.1 내지 1000 ㎍의 MOI가 사용될 수 있다.

생체내에서, 유기체에 본 발명에 따른 벡터 (또는 카세트)의 활성량을 바람직하게는 치료될 부위 (특히 종양)에 직접 투여함에 있다. 이에 관하여, 본 발명은 또한 세포, 또는 이들 세포의 일부를 상기에 정의된 핵산과 접촉시킴을 포함하는 과증식성 세포 파괴 방법에 관한 것이다. 생체내 사용에 있어서, 본 발명에 사용되는 핵산 또는 벡터가 국부, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내, 경피 등의 경로에 의해 투여할 목적으로 제형될 수 있다. 바람직하게는, 핵산 또는 벡터는 주사 형태로 사용된다. 그러므로, 이것은 주사 제형, 특히 직접 처리된 부위로의 주사에 약학적으로 허용되는 부형제와 혼합될 수 있다. 조성물은 특히 멸균, 등장 용액, 또는 멸균수 또는 생리 식염수의 첨가에 의해서 경우에 따라 주사 용액이 구성될 수 있게 하는 건조, 특히 동결건조 조성물일 수 있다. 환자의 종양으로의 핵산의 직접 주사는 치료 효과를 환부 조직의 수준에 집중시킬 수 있게 하므로 유리하다. 사용된 핵산의 용량은 다양한 파라미터에 따라서, 특히 유전자, 벡터, 사용된 투여 양식, 관련 병리 또는 소망하는 치료 지속 기간에 따라서 조절될 수 있다. 유리하게, 생체내에 투여되는 용량은 아데노바이러스와 같은 바이러스 벡터에 대해서 10⁶내지 10¹⁰pfu이다. 또한, 반복 투여가 또한 수행될 수 있다.

생체내에서, 본 발명의 방법 및 분자가 p53의 기능 메커니즘을 연구하고 동물 모델에 대한 ScFv의 포텐셜을 측정하기 위해서 사용될 수 있다.

본 발명은 과증식성 세포 (즉, 비정상적으로 증식하는 세포)를 파괴하기 위해서 생체내에서 유리하게 사용된다. 따라서, 이것은 혈관 벽의 종양 세포 또는 평활근 세포 (재협착증)의 파괴에 적용될 수 있다. 이것은 p53의 돌연변이체가 관찰되는 암을 치료하는 데에 매우 특히 적합하다. 예로서, 결장 선암, 갑상선암, 폐암종, 골수 백혈병, 결장직장암, 유방암, 폐암, 위암, 식도암, B 임파종, 난소암, 방광암, 신경교아종, 간암, 골수암, 피부암 또는 췌장암, 신장암, 전립선암, 후두암, 두부 및 목부 암, HPV-양성 항문생식기암, EBV-양성 비인두암, 세포 단백질 mdm2가 과잉발현되는 암 등을 언급할 수 있다.

본 발명은 하기의 실시예에서 좀더 상세하게 기재되고, 설명적이고 비제한적인 것으로서 언급되어야 한다.

실시예 1: 항체 11D3의 분리 및 스크리닝

본 실시예에는 p53 단백질에 대해 특이적으로 인도되고 p35의 돌연변이 형태의 DNA-결합 기능을 활성화할 수 있는 모노클론 항체의 제조, 분리 및 선별이 기재되어 있다.

1.1. 마우스를 면역시키기 위해서 사용되는 단백질의 분리 및 하이브리도마의 스크리닝

야생형 p53 단백질과 종양 세포에서 종종 발견되는 야생형 p53의 돌연변이에 상응하는 다양한 단백질, 즉, p35 H273, p53 W248 및 p53 G281을 재조합 바큘로바이러스로 감염된 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) Sf9 곤충 세포에서 생성하고 폴리클론 항체 PAb421 [참조문헌: Leveillard et al., EMBO J. 15, 1615-1623 (1996)]이 커플링된 아가로스 겔에서 친화력 크로마토그래피에 의해서 정제한다. 야생형 p53 단백질의 단편 1 내지 320 및 73 내지 320에 상응하는 단백질을 또한 Invitrogen사에 의해서 제공된 지시에 따라서 재조합 바큘로바이러스로 감염된 스포도프테라 프루기페르다 Sf9 곤충 세포에서 생성한다. pBlueBacIII 전달 플라스미드로 삽입된 상보적 DNA를 예를 들면, Sambrook 등 [참조문헌: Sambrook, Fritsch & Maniatis: Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd edition, 1989, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory]에 의해서 기재된 바와 같은 표준 재조합 DNA 기술을 사용하여 생성한다.

1.2. 하이브리도마의 분리 및 스크리닝

마우스를 상기에 기재된 세 돌연변이체 p53 단백질의 동몰 혼합물로 면역시키고 Harlow와 Lane [참조문헌: Harlow & Lane: Antibodies, a laboratory manual, 1988, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory]에 의해서 기재된 과정 프로토콜에 의해서 분리한다. 상기에 기재된 돌연변이체 p53 단백질에 대해서 인도되는 모노클론 항체를 생성하는 하이브리도마를 Harlow와 Lane [참조문헌: Harlow & Lane: Antibodies, a laboratory manual, 1988, Ed. Cold Spring Harbor Laboratory]에 의해서 기재된 과정 프로토콜에 따라서 상기에 기재된 세 돌연변이체 p53 단백질의 동몰 혼합물 1 마이크로그램의 양이 사전에 면역된 96-웰 PVC 플레이트의 웰에서 하이브리도마 배지에 생성된 항체를 포획하는 방법에 의해서 선택한다. 이러한 제 1 스크리닝은 317 개의 양성 하이브리도마가 선택되도록 한다. 하이브리도마를 증폭시킨 2 주 후, 증폭된 하이브리도마의 상등액을 먼저 상기의 항체 포획 방법 (방법 1)을 사용하여 재평가한 다음 고정된 단백질의 성질이 상이하다는 사실과는 별개로 상기에 기재된 방법과 원칙적으로 동일한 3 가지 스크리닝 방법을 사용하여 분류한다: 정제된 야생형 p53 단백질 (방법 2), 또는 야생형 p35의 1 내지 320 단편을 생성하는 Sf9 세포로부터 유도된 단백질 추출물 (방법 3), 또는 야생형 p35의 73 내지 393 단편을 생성하는 Sf9 세포로부터 유도된 단백질 추출물 (방법 4)이 웰에 고정된다. 포스페이트 완충제에서 반복된 냉동/해동에 의해 Sf9 세포를 용해시킨 다음 세포 파편을 초원심분리함으로써 단백질 추출물이 수득된다. 317 개의 증폭된 하이브리도마 상등액 중에서, 162 개는 더이상 방법 1에 반응하지 않는다. 나머지 155 개 모두 방법 2에 양성이고, 이중 33 개 (그룹 A)는 방법 3 및 4에 음성이고 115 개 (그룹 B)는 방법 3에 양성이고 방법 4에 음성이며, 마지막으로 7 개 (그룹 C)는 방법 3 및 4에서 양성이다. 그룹 B 상등액은 에피토프가 p53의 처음 73 번 아미노산에 위치하는 항체를 함유하는 상등액에 상응한다. 이러한 그룹의 77 개의 상등액은 p53의 처음 40 개의 아미노산의 서열에 상응하는 펩티드 (1 mg/㎖)로 예비배양할 경우 방법 2에 음성인 것으로 밝혀졌다. 그룹 A 항체, 상기에 언급된 77 개의 항체를 제거한 후 존재하는 38 그룹 B 항체, 및 그룹 C 항체는 우리가 IgM 항체를 제거할 수 있게 한다. 이러한 결과가 도 1에 요약되어 있다.

이어서 42 개의 항체를 p35/DNA 복합체에 수퍼쉬프트를 유도하는 능력에 대해서 시험한다. 단백질 A/세파로스에서 정제한 후, 항체를 정량한다. 겔 지연 실험을 정제된 야생형 p53 단백질을 p53에 대한 특정 결합 서열을 나타내는³²P-표지 DNA 탐침으로 배양함으로써 수행한다. 이어서 다양한 항체 300 ng를 첨가한다. 복합체를 아크릴아미드 겔 상에서 분할시킨다.

도 2의 결과는 이들 항체 중 27 개가 수퍼쉬프트를 유도할 수 있음을 입증한다. 이들 27 개 중의 19 개를 동일한 겔 지연 실험에서 야생형 p53 단백질을 His273 돌연변이체로 대체함으로써 시험한다 (도 3). 이들 19 개의 항체는 모두 양성 결과를 제공한다. 항체 26 번은 다른 것들 보다 더욱 명백한 지연을 나타낸다. 이 항체를 11D3이라 하고 후속 실험에 사용한다.

실시예 2: ScFv 421과 D3M의 분리

VH 및 VL 영역에 특이적인 퇴화한 프라이머를 사용하여 수행된 PCR 실험을 기초로 하는 표준 분자 생물학적 기술을 사용하여 하이브리도마로부터 ScFv를 분리한다. 항체 11D3으로부터 유도된 ScFv를 D3M이라 한다. 이의 서열이 서열번호 2에 기재되어 있다. ScFv421의 서열이 서열번호 1에 기재되어 있다.

실시예 3: ScFv 발현을 위한 벡터의 작제

본 실시예에는 본 발명의 핵산을 시험관내 또는 생체내로 전달하기 위해서 사용될 수 있는 벡터의 작제가 기재되어 있다.

3.1. 플라스미드 벡터의 작제

두 유형의 벡터를 플라스미드 벡터 작제에 사용한다.

- 문헌 [참조: DNA Cloning, A practical approach Vol. 2, D.M. Glover (Ed) IRL Press, Oxford, Washington DN, 1985]에 기재된 벡터 pSV2. 이 벡터는 진핵세포 발현 벡터이다. ScFv를 암호화하는 핵산을 이 벡터에 HpaI/EcoRV 단편의 형태로 삽입한다. 이것은 ScFv를 SV40 바이러스 인핸서 프로모터의 조절하에 배치한다. 상이한 시험관내 및 생체내 평가 시스템에서 시험하기 위해서 실시예 2에 기재된 작제물 모두를 이 벡터로 도입한다.

- 벡터 pCDNA3 (Invitrogen). 이것은 또한 진핵세포 발현 벡터이다. 이러한 벡터에서, 본 발명의 ScFv를 암호화하는 핵산을 CMV 초기 프로모터의 조절하에 배치한다. 실시예 2에 기재된 작제물 모두를 HindIII/NotI 단편의 형태로 이 벡터로 도입한다.

3.2. 바이러스 벡터의 작제

특정 양태에 따라서, 본 발명은 상기에 정의된 핵산이 생체내에 전달되고 발현될 수 있게 하는 바이러스 벡터의 작제 및 사용을 수반한다.

좀더 상세하게는, 구조 및 성질이 다소 다른 다양한 아데노바이러스 혈청형을 특징으로 한다. 이들 혈청형 중에서, 본 발명의 정황 내에서, 유형 2 또는 유형 5 인간 아데노바이러스 (Ad 2 또는 Ad 5) 또는 동물 기원의 아데노바이러스를 사용함이 바람직하다 (WO94/26914 참조). 본 발명의 정황 내에서 사용될 수 있고 언급될 수 있는 동물 기원의 아데노바이러스는 개, 소, 마우스 (예: Mav1, [참조문헌: Beard et al., Virology 75 (1990) 81]), 양, 돼지, 조류 또는 원숭이 기원의 아데노바이러스이다. 동물 기원의 아데노바이러스는 바람직하게는 개 아데노바이러스이고, 좀더 바람직하게는 CAV2 아데노바이러스 [예를 들면, Manhattan 또는 A26/61 균주 (ATCC VR-800)]이다. 인간 또는 개 또는 혼합 기원의 아데노바이러스가 바람직하게 본 발명의 정황 내에서 사용된다.

바람직하게, 본 발명의 결손 아데노바이러스는 ITR, 캡시드화 서열 및 본 발명에 따른 핵산을 포함한다. 좀더 바람직하게, 적어도 E1 영역은 본 발명의 아데노바이러스의 게놈에 비-기능성이다. 해당 바이러스 유전자는 기술자들에게 공지된 기술에 의해서, 특히 전체 결실, 치환, 부분 결실 또는 하나 이상의 염기의 해당 유전자(들)로의 첨가에 의해서 비-기능성으로 될 수 있다. 이러한 본성의 변형이 시험관내에서 (분리된 DNA에서) 또는 원위치에서, 예를 들면, 유전공학 기술을 사용하여 또는 돌연변이제로 처리함으로써 수득될 수 있다. 기타 영역, 특히 E 영역 (WO95/02697), E2 영역 (WO94/28938), E4 영역 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697, WO96/22378) 및 L5 영역 (WO95/02697)이 또한 변형될 수 있다. 바람직한 양태에서 따라서, 본 발명에 따른 아데노바이러스는 E1 및 E4 영역에 결실을 포함한다. 바람직한 양태에 따라서, 이것은 E4 영역 및 본 발명의 핵산이 삽입되는 E1 영역에 결실을 포함한다 (WO96/13596). 본 발명의 바이러스에서, E1 영역의 결실은 바람직하게는 Ad5 아데노바이러스 서열에서 뉴클레오티드 455로부터 뉴클레오티드 3329로 연장된다.

본 발명에 따른 결손 재조합 아데노바이러스는 기술자들에게 공지된 기술에 의해서 제조될 수 있다 [참조문헌: Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917]. 특히 아데노바이러스와 특히 해당 DNA 서열을 운반하는 플라스미드 사이의 동종 재조합에 의해서 제조될 수 있다. 동종 재조합은 아데노바이러스와 플라스미드가 적합한 세포주로 형질감염된 후 일어난다. 사용된 세포주는 바람직하게는 (i) 상기 요소에 의해서 형질감염되어야 하고 (ii) 재조합의 위험을 피하기 위해서 결손 아데노바이러스 게놈의 일부를 바람직하게는 통합된 형태로 보충할 수 있는 서열을 지녀야 한다. 세포주의 예로서, 게놈, Ad5 아데노바이러스 게놈의 좌측부 (12 %)에 포함된, 특히 통합된 인간 배 신장 세포주 293 [참조문헌: Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59] 및 특히 WO94/26914, WO95/02697 및 WO96/22378의 출원에 기재된 바와 같은 E1 및 E4 기능을 보충할 수 있는 세포주를 언급할 수 있다.

다중화된 아데노바이러스가 수득되고 실시예에 설명된 바와 같이 표준 분자 생물학 기술을 사용하여 정제된다.

아데노수반 바이러스 (AAV)는 안정하고 부위-특이적인 방식으로 이들이 감염하는 세포의 게놈에 통합되는 상대적으로 작은 크기의 DNA 바이러스이다. 이들은 세포 생장, 조직 또는 분화에 어떠한 영향도 미치지 않으면서 광범위한 스펙트럼의 세포를 감염시킬 수 있다. 또한, 이들은 인간 병리에 수반되는 것 같지 않다. AAV의 게놈이 클로닝되고 서열화되고 특성화되었다. 이것은 약 4700 개의 염기를 포함하고 각 말단에 바이러스 복제의 기원으로서 제공되는 약 145 개 염기의 역 반복 영역 (ITR)을 함유한다. 게놈의 나머지는 캡시드화 기능을 운반하는 2 가지 고유 영역: rep 유전자를 함유하고 바이러스 복제 및 바이러스 유전자의 발현에 수반되는 게놈의 좌측부; cap 유전자를 함유하고 바이러스의 캡시드 단백질을 암호화하는 게놈의 우측부로 세분된다.

유전자를 시험관내 및 생체내에서 전달하기 위해 AAV로부터 유도된 벡터의 용도가 문서 (특히, WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,368, US 5,139,941, EP 488 528 참조)에 기재되어 있다. 이들 출원에는 rep 및/또는 cap 유전자가 결실되고 해당 유전자로 대체된 다양한 AAV-유도된 작제물, 및 시험관내 해당 유전자를 (배양액내 세포로) 또는 생체내 해당 유전자를 (유기체로 직접) 전달시키기 위한 이들 작제물의 용도가 기재되어 있다. 본 발명에 따른 결손 재조합 AAV가 인간 보조 바이러스 (예를 들면, 아데노바이러스)로 감염된 세포주로 두 AAV 역 반복 영역 (ITR)에 의해서 플랭킹된 해당 본 발명의 핵산 서열과 AAV 캡시드화 유전자 (rep 및 cap 유전자)를 운반하는 플라스미드를 함유하는 플라스미드를 공형질감염 시킴으로써 제조될 수 있다. 사용될 수 있는 세포주의 예는 세포주 293이다. 생성된 재조합 AAV가 표준 기술에 의해서 정제된다.

허프스바이러스 및 레트로바이러스로부터 유도된 재조합 벡터의 작제가 문헌 [참조: Breakfield et al., New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein et al., Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689 등]에 상세히 기재되어 있다. 특히, 레트로바이러스는 분리된 세포를 선택적으로 감염시키는 통합 바이러스이다. 그러므로, 이들은 암에 대한 적용을 위해서 해당 벡터를 구성한다. 레트로바이러스 게놈은 본질적으로 2 개의 LTR, 캡시드화 서열 및 3 개의 암호화 영역 (gag, pol 및 env)을 포함한다. 레트로바이러스-재조합 벡터에서, gag, pol 및 env 유전자는 일반적으로 전체적으로 또는 부분적으로 결실되고 해당 이종 핵산 서열로 대체된다. 이들 벡터는 다양한 유형의 레트로바이러스, 예를 들면, 특히 MoMuLV (마우스 몰로니 육종 바이러스), HaSV (하비 육종 바이러스); SNV (비장 괴사 바이러스); RSV (라우스 육종 바이러스) 또는 그밖의 프렌즈 바이러스로부터 작제될 수 있다.

본 발명에 따른 핵산을 함유하는 본 발명에 따른 재조합 레트로바이러스를 작제하기 위해서, 특히 LTR, 캡시드화 서열 및 핵산을 함유하는 플라스미드가 작제된 다음 플라스미드에서 부족한 레트로바이러스 기능을 트랜스로 공급할 수 있는 소위 캡시드화 세포주를 형질감염시키기 위해서 사용된다. 그러므로, 일반적으로 캡시드화 세포주는 gag, pol 및 env 유전자를 발현할 수 있다. 이러한 성질의 캡시드화 세포주가 선행 기술에서 특히 세포주 PA317 (US 4,861,719); 세포주 PsiCRIP (WO90/02806) 및 세포주 GP+envAm-12 (WO89/07150)에 기재되어 있다. 또한, 재조합 레트로바이러스는 전사 활성을 억제하기 위한 LTR 및 gag 유전자의 일부를 포함하는 광범위한 캡시드화 서열에 변형을 함유할 수 있다 [참조문헌: Bender et al., J. Virol. 61 (1987) 1639]. 생성된 재조합 레트로바이러스가 표준 기술에 의해서 정제된다.

본 발명을 실행하기 위해서, 아데노바이러스 또는 결손 재조합 레트로바이러스를 사용함이 특히 유리하다. 이것은 이들 벡터가 유전자를 종양 세포에 전달하기에 특히 유리한 성질을 지니기 때문이다.

3.3. 화학적 벡터

개발된 합성 벡터 중에서, 본 발명의 정황에서 폴리리신, (LKLK)n, (LKKL)n (WO95/21931), 폴리에틸렌이민 (WO96/02655) 및 DEAE 덱스트란 유형의 양이온성 중합체 또는 그밖의 양이온성 지질 또는 리포펙턴트를 사용함이 바람직하다. 이들은 DNA를 응축시키고 세포막과의 연계를 촉진하는 성질을 지닌다. 이들 중에서, 언급될 수 있는 것들은 리포폴리아민 (리포펙타민 및 트랜스펙타민, WO95/18863 및 WO96/17823), 다양한 양이온성 또는 중성 지질 (DOTMA, DOGS, DOPE 등) 및 또한 핵 기원의 펩티드 (WO96/25508)이다. 또한, 수용체-매개된 표적화된 형질감염의 개념이 생성되었고, 이 개념은 DNA를 양이온성 중합체의 도움으로 응축시키고 동시에 양이온성 중합체와 형질감염을 원하는 세포 유형의 표면에 존재하는 막 수용체의 리간드간 화학적 커플링으로 인하여 복합체의 부착을 막으로 인도하는 원리를 이용한다. 따라서, 트랜스페린 수용체, 인슐린 수용체 또는 간세포의 아시알로글리코프로테인 수용체의 표적화가 기재되어 있다. 이러한 화학적 벡터를 사용하는 본 발명에 따른 조성물은 기술자들에게 공지된 기술에 의해서, 일반적으로 상이한 성분을 단순히 접촉시킴으로써 제조된다.

실시예 4: ScFv는 p53을 인식한다.

ScFv와 p53의 연계가 ELISA 시험에 의해서 입증된다.

myc tag가 이들이 검출될 수 있도록 하는 ScFv에 용해된다. ScFv 421 및 11D3 (D3M) 및 조절 ScFv (항-CD3)가 이러한 상이한 ScFv를 발현하는 세균의 주변세포질로부터 생성된다.

정제된 p53 으로 코팅된 ELISA 플레이트를 다양한 희석의 11D3 IgG, 421 IgG, 바이오티닐화 항-p53 폴리클론 혈청, 11D3 ScFv, 421 ScFv 및 항-CD3 ScFV로 배양한다.

두 IgG를 알칼리성 포스파타제에 커플링된 2차 항-IgG 항체를 사용하여 가시화한다. 바이오티닐화 혈청을 알칼리성 포스파타제에 커플링된 엑스트라비딘을 사용하여 가시화한다. ScFv를 항-myc 항체 9E10을 사용한 다음 알칼리성 포스파타제에 커플링된 항-IgG 항체를 사용하여 가시화한다. 알칼리성 포스파타제 활성의 열량계 분석이 도 4에 도시되어 있고, 2 개의 정제된 IgG, 폴리클론 혈청 및 421, 및 11D3 ScFv가 p53을 인식하고 동시에 항-CD3 ScFv가 불활성임을 예시한다.

실시예 5: ScFv는 야생형 p53의 수퍼쉬프트를 유도할 수 있다.

야생형 p53의 DNA-결합 기능을 활성화하는 ScFv의 능력을 겔 지연 실험에 의해서 시험한다.

p53에 대해 특정 결합 부위를 나타내는 DNA 이본쇄를 32P로 표지한 다음 정제된 야생형 p53과 다양한 정제된 항체 또는 세균 주변세포질에서 생성된 ScFv로 배양한다. 복합체를 아크릴아미드 겔에서의 전기영동에 의해서 해상한다.

수득된 결과가 도 5에 도시되어 있다.

DNA/p53 복합체는 "기저" 트랙에서 관찰된다. 항체 HR231, pAb421 및 11D3은 추가 지연 (수퍼쉬프트)을 유도하고 DNA/p53 복합체의 양을 증가시킬 수 있다.

421 및 D3M ScFv가 또한 수퍼쉬프트를 유도할 수 있고 반면에 항-ras 조절 ScFv (Y28)은 어떠한 영향도 없다. D3M ScFv에 대조적으로 421 ScFv는 p53/DNA 복합체 양의 증가를 유도한다.

실시예 6: ScFv는 p53 돌연변이체에 DNA-결합 기능을 복원시킬 수 있다.

유사한 방식으로, ScFv를 불활성 돌연변이체 Trp248에 DNA-결합 기능을 복원시키는 능력에 대해서 시험한다. 수득된 결과가 도 6에 도시되어 있다.

이들은 두 ScFv가 p53/DNA 복합체에 상응하는 지연된 밴드의 출현을 유도함을 증명한다.

실시예 7: ScFv는 종양 세포에서 바르게 발현된다.

ScFv의 발현이 발현 벡터 (SV40 프로모터)를 H1299 종양 세포로 일시적으로 형질감염시킴으로써 입증된다. 좀더 상세하게, 핵산을 pSV2 유형의 플라스미드 벡터의 형태로 (실시예 3) 및 양이온성 지질, 즉, 리포펙타민의 존재하에 투여한다.

수득된 결과가 도 7에 도시되어 있다. 웨스턴 블롯이 전체 추출물에서 수행될 경우, 예상된 크기에 상응하는 30 kD 주위로 이동하는 주 밴드가 관찰되고 분자가 종양 세포에서 현저한 수준으로 발현되었음을 확증한다.

실시예 8: ScFv는 His273 돌연변이체의 트랜스활성화 기능을 부분적으로 복원할 수 있다.

종양 세포 내에서 돌연변이 형태의 p53의 부족한 트랜스활성화 기능에 대한 영향을 발휘하는 ScFv의 능력을 하기의 방식으로 측정한다.

일시적 형질감염을 세포주 H358 또는 H1299 (두 세포주 모두 p53에 대해서 결실됨)에서 또는 세포주 HT29 (p53 돌연변이체 His273을 포함)에서 수행한다. 이러한 형질감염은 야생형 p53에 대해 발현 벡터를, 두 ScFv에 대해서 돌연변이체 H273 또는 His175 및 p53-의존성 프로모터의 조절 하에서 CAT (클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제) 유전자를 함유하는 리포터 플라스미드를 유도한다. 형질감염 48 시간 후 측정된 CAT 활성은 p53의 트랜스활성화 기능을 반영한다.

도 8에 도시된 결과는 세포주 H358에서 두 ScFv가 돌연변이체 His273의 전사 활성의 중요한 재활성화를 수행할 수 있음을 나타낸다. 동일한 결과가 세포주 H1299에서 수득된다.

유사한 방식으로, 두 ScFv는 세포주 HT29에서 내생 돌연변이체 His273의 전사 활성을 증가시킬 수 있다 (도 9).

서열

Claims (27)

1. 돌연변이 p53 단백질을 특이적으로 결합시킬 수 있는 단일쇄 항체를 세포에 도입시킴을 포함하는, 돌연변이 p53 단백질을 나타내는 세포에서 p53-의존성 트랜스활성화 활성을 복원시키기 위한 방법.
2. 제 1 항에 있어서, 세포에서 기능할 수 있는 프로모터의 조절 하에서 단일쇄 항체를 암호화하는 서열을 포함하는 핵산을 세포에 도입함을 포함하는 방법.
3. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 단일쇄 항체가 p53 C-말단 영역에 존재하고 올리고머화 도메인과 조절 도메인을 운반하는 에피토프를 특이적으로 결합시킬 수 있음을 특징으로 하는 방법.
4. 제 3 항에 있어서, 단일쇄 항체가 p53의 C-말단 영역의 잔기 320 내지 393 사이에 존재하는 에피토프를 특이적으로 결합시킬 수 있음을 특징으로 하는 방법.
5. 제 3 항에 있어서, 단일쇄 항체가 서열번호 1의 ScFv421 및 서열번호 2의 11D3 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
6. 제 2 항에 있어서, 핵산이 벡터의 일부임을 특징으로 하는 방법.
7. 제 6 항에 있어서, 벡터가 바이러스 벡터임을 특징으로 하는 방법.
8. 제 7 항에 있어서, 벡터가 결손 재조합 아데노바이러스임을 특징으로 하는 방법.
9. 제 7 항에 있어서, 벡터가 결손 재조합 레트로바이러스임을 특징으로 하는 방법.
10. 제 7 항에 있어서, 벡터가 결손 재조합 AAV임을 특징으로 하는 방법.
11. 제 7 항에 있어서, 벡터가 결손 재조합 HSV임을 특징으로 하는 방법.
12. 제 6 항에 있어서, 벡터가 화학적 또는 생화학적 벡터임을 특징으로 하는 방법.
13. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 돌연변이 p53 단백질에 종양-억제 활성이 없음을 특징으로 하는 방법.
14. 제 13 항에 있어서, 돌연변이 p53 단백질이 종양 세포에 존재하는 형태임을 특징으로 하는 방법.
15. 제 14 항에 있어서, 돌연변이 p53 단백질이 단백질 p53H273, p53W248 및 p53G281 중에서 선택됨을 특징으로 하는 방법.
16. 제 1 항 또는 2 항에 있어서, 돌연변이 p53 단백질을 나타내는 세포가 종양 세포임을 특징으로 하는 방법.
17. 제 16 항에 있어서, 종양 세포가 폐, 결장, 두부 및 목부, 간 또는 뇌 종양의 세포임을 특징으로 하는 방법.
18. 돌연변이 p53 단백질의 배치를 변형시키기 위해서 돌연변이 p53 단백질을 특이적으로 결합시킬 수 있는 단일쇄 항체의 용도.
19. 돌연변이 p53 단백질이 관련되는 과증식성 장애 치료용 약학 조성물을 제조하기 위해서 돌연변이 p53 단백질을 특이적으로 결합시킬 수 있는 단일쇄 항체의 용도.
20. 돌연변이 p53 단백질이 관련되는 과증식성 장애 치료용 약학 조성물을 제조하기 위해서 돌연변이 p53 단백질을 특이적으로 결합시킬 수 있는 단일쇄 항체를 암호화하는 핵산의 용도.
21. 동일한 에피토프를 인식하거나 개선된 친화력을 갖는 분자 11D3 또는 변체.
22. 제 21 항에 따른 분자를 암호화하는 핵산.
23. 제 22 항에 있어서, 이것이 cDNA, RNA 또는 합성 또는 반-합성 산임을 특징으로 하는 핵산.
24. 제 23 항에 있어서, 서열번호 2의 서열을 특징으로 하는 핵산.
25. 제 22 항에 따른 핵산을 포함하는 조성물.
26. 제 21 항에 따른 분자를 포함하는 조성물.
27. 과증식성 장애를 치료하기 위한, 제 22 항에 따른 핵산과 약학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약학 조성물.