KR20010041348A

KR20010041348A - ΙｇＡ 생산의 억제

Info

Publication number: KR20010041348A
Application number: KR1020007009462A
Authority: KR
Inventors: 다케사코가주토; 사이토히데하루; 가토이쿠노신
Original assignee: 오미야 히사시; 다까라 슈조 가부시키가이샤
Priority date: 1998-05-15
Filing date: 1999-05-11
Publication date: 2001-05-15
Anticipated expiration: 2019-05-11
Also published as: DE69924105T2; ATE290374T1; WO1999059567A1; DE69924105D1; CN1170529C; US20010049392A1; CN1301153A; KR100569082B1; EP1080723B1; EP1080723A4; EP1080723A1; AU3728699A; US6294581B1

Abstract

15-데옥시스퍼구알린 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 경구 투여하여 IgA 생산을 선택적으로 억제하여, 따라서 IgA 신장병과 같은 IgA-관련된 면역학적 질병을 예방 및 치료한다.

Description

ΙｇＡ 생산의 억제{Inhibition of IgA production}

항체 및 그와 구조적으로 및 기능적으로 관련된 단백질을 포함하는 면역글로부린은 그들의 기능성 성질에 기초하여 5개의 부류(IgA, IgD, IgE, IgM 및 IgG)로 분류된다. 이들중에서, IgA는 두개의 아부류, 즉, 혈청 IgA 및 분비 IgA(IgA1 및 IgA2)로 분리된다. IgA1의 L쇄는 H-쇄에 공유결합되어 있다. 다른한편, IgA2의 L-쇄는 H-쇄에 결합하는 대신에 S-S 결합을 통해 서로 결합되어 있다. 혈청 IgA1의 90%는 IgA1이고, 반면에 분비 IgA의 60%는 IgA2이다.

IgA 생산 부위는 예를들어 소화관 점막 고유층, 침샘, 유선등에 있는 점막하 형질 세포(plasma cell)에 존재한다. 인간의 소화관 점막 고유층에서의 IgA-생산 세포의 수가 IgG를 생산하는 세포보다 림프절 또는 비장에서의 비 1:3 (IgA:IgG)에 대조적으로 약 20:1로 훨씬 크다. 점막 분비물중의 IgA는 하나의 J-쇄 성분을 갖는 이량체로서 생산되고, 혈청 IgA에는 오직 소량인 분비 분비편(SC)이 수반된다. 분비편은 장 또는 호흡관의 점막하 형질 세포로부터 점액 분비물로 나오는 동안 이량체 IgA 분자에 가해진다.

유기체에서 항체의 생산은 특정 항원에 의한 자극에 의해 유도된다. 예를들어, 장내박테리아 균주인 비피도박테리움 론굼(Bifidobacterium longum)의 경구 투여는 배설물중의 IgA의 총량을 증가시키는 것으로 보고되었다.

항원을 보다 효과적으로 다루는 항체 생산 세포를 비특이적으로 자극할 수 있는 물질이 종종 어쥬번트라고 불린다. 예를들어, 비브리오 콜레라(Vibrio cholerae)에 의해 생산되는 설사의 원인 독소인 콜레라 독소가 작은 창자의 점막에 작용하고 막의 이온 투과성을 변형시키는 것으로 알려져 있다. 이 변형은 작은 창자로부터 많은 양의 전해질과 물을 분비시켜 설사 증상을 일으킨다. 독소의 상당한 부분을 제거하여 제조된 탈독소화된 성분인 콜레라 독소 B 서브유니트는 작은 창자의 점막에 침입한후 IgA 항체 생산을 촉진하는(IgA를 유도할 수 있는) 면역반응을 유발할 수 있고, 따라서 어쥬번트로서 작용하는 것으로 알려져 있다.

인간에서 혈청 면역글로부린(Ig)의 약 65%인, IgG는 거의 모든 항원에 대한 항체로 구성되고, 전신 보호 면역성에서 중요한 역할을 한다. 다른한편, IgA는 국부적 면역 반응에서 중요한 역할을 한다. 점액 분비물중의 분비 IgA는 점막에 고도의 병인성인 미생물 또는 알레르겐의 결합을 억제한다. 그러므로, IgA는 감염을 억제할 뿐만아니라 또한 알레르겐으로서 작용할 수 있는 식품중의 성분에 결합하여 이 성분이 소화관을 통과하는 것을 방지한다.

예를들어, 세포외 독소가 미생물 세포로부터 분비되는 경우에, 항체에 의한 생물학적 방어는 미생물의 표면에 결합된 항체의 직접적인 작용에 의해 좌우된다. 따라서, 항체는 미생물에 직접 결합하여 다양한 효과를 발휘할 수 있다.

그러나, IgA는 또한 생체에 병리적으로 작용하는 것으로 알려지고 있다. 예를들어, IgA 신장병은 항원에 반응한 IgA의 과잉 면역 반응 및 주로 IgA를 함유하는 면역 복합체가 신장의 사구체에 침적하여 야기되는 면역학적 질환이다. 신장병의 개시는 장기간의 고 IgA 항체 역가에 의해 일으켜진다. IgA 신장병을 앓는 환자로부터의 혈액중의 IgA 항체의 역가는 건강하고 정상적인 개인에서 보다 아주 높다. 그러나, 면역 복합체의 형성에 포함되는 IgA가 점막이외의 부위(비장, 골수, 말초 혈액)로부터의 혈청형이냐, 점막(소화관, 호흡장치등)으로부터의 분비형이냐가 입증되지 않았다.

면역 반응의 원인제가 주로 상부 기도 및 소화관에서의 항원 자극인 것으로 의심되고 있다. 후보 항원은 식품(예를들어, 글루텐, 밀크, 콩), 박테리아(예를들어, 하에모필루스 파라인플루엔자(Haemophilus parainfluenzae), 바이러스(예를들어, 시토메갈로바이러스(Cytomegalovirus), 아데노바이러스, 엡스타인-바르 (Epstein-Barr)(EB) 바이러스)를 포함한다[Tomino, Y., Bio. Clinica, 12(6):375-379(1997)]. 예를들어, 하에모필루스 파라인플루엔자(HP)의 성분 및 IgA-형 안티-HP 항체가 IgA 신장병(nephropathy)을 앓는 환자의 사구체 및 혈청중에 존재한다는 것이 입증되었다[Suzuki, S., Nakatomi, Y., Sato, H. et al., Journal of Allergy Clinical Immunology, 96:1152-1160(1995)].

IgA 신장병의 원인 및 그의 진전의 메카니즘에 관한 가설이 상기 기술된 바와 같이 제안되었지만, 이들의 많은 것이 여전히 불분명하다. 현재 IgA 신장병에 대한 어떤 특별한 치료법은 없다. 따라서, 식이요법 치료법 또는 약물요법이 사용된다. 식이 요법 치료법은 저염 식품 또는 저단백질 식품을 사용한다. 약물요법은 사구체에서 혈액 응고를 억제하기 위한 항혈소판물질, 안지오텐신 변환 효소 억제제 또는 혈압 상승을 억제하는 칼슘 길항제, 또는 아드레노코르티코이드를 사용한다[Sakai, H., Bio. Clinica, 16:372-374(1997)].

수개의 면역억제제의 효과는 현재 비경구 투여에 의해 조사되고 있다. 그러나, 이들중 많은 것이 IgA의 과생산의 억제에 덧붙여 IgG 생산 및 세포 면역성과 같은 면역학적 메카니즘을 전신적으로 억제하기 때문에, 심각한 부작용을 일으킬 위험성이 높다. 그러므로, 이러한 면역억제제는 임상적으로 아직 널리 사용되지 않고 있다.

상기 면역억제제의 예는 화학식 1의 15-데옥시스퍼구알린(15-deoxyspergualin)(이하에서 DSG라고 표기)을 포함한다:

Gu-(CH₂)₆-CONHCH(OH)CONH(CH₂)₄NH(CH₂)₃-NH₂(여기에서, Gu는 구아니디노 그룹을 나타낸다). DSG는 신장 이식을 위한 주사가능한 형태의 면역억제제로서 임상적으로 사용된다.

다르게는, 비경구 투여된 DSG에 의한 항체 생산을 억제하는 효과가 JP-A 8-40887, JP-A 5-238932, Okubo, M.등의 문헌[Nephron, 60:336-341(1992)], Makino, M.등의 문헌[Immunopharmacology, 14:107-114(1987)], Inoue, K.등의 문헌[Proceedings Japanese Society Nephrology 30th Annual Meeting, pp. 191(1987)]에 보고되어 있다. IgE, IgG, IgM등의 항체 생산의 억제는 이들에서 확인되었다. 그러나, DSG는 IgA를 선택적으로 억제하는 것으로 보고되어 있지 않다.

다른한편, 경구 조성물중에 DSG의 사용은 일본국 특허 제 2610621 호 및 JP-A 8-40887에 기술되어 있다. 그러나, 특정화된 부류의 항체를 선택적으로 억제하는 것은 개시되어 있지 않다.

본 발명은 IgA 생산의 억제, 보다 특히, 인간 및 동물에서 IgA 항체의 과생산에 의해 일어나는 면역학적 질환을 예방 및 치료하기 위한 IgA 생산의 선택적 억제에 관한 것이다.

발명의 목적

본 발명의 한 목적은 인간 및 동물에서 IgA의 과생산에 의해 일어나는 면역학적 질환을 예방 및 치료하는데에 유용하고 신규한 수단을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 잇점은 하기 기술로부터 명백해질 것이다.

발명의 요약

본 발명자들은 경구 투여된 DSG가 항원에 의한 자극에 기인하여 점막 조직에서 IgA를 생산하도록 만들어진 동물 실험 모델을 사용하여 분비 IgA 및 혈청 IgA의 생산을 효과적으로 억제한다는 것을 확인하였다. 놀랍게도, 또한 IgA 생산을 억제하는 효과와 같은 수준으로 IgG 생산을 억제하는 중요한 효과와 같은, DSG의 비경구 투여시(예를들어, 정맥 투여) 관찰되는 강한 전신적 면역억제 효과가 관찰되지 않음이 또한 입증되었다. 또한, 본 발명자들은 IgA 생산이 증가된 동물에 DSG를 경구 투여하는 것은 DSG에 의해 억제하려는 항체중 IgA를 뛰어나게 억제한다는 것을 입증했다.

따라서, 본 발명에서, IgA 항체 생산을 선택적으로 억제하는 것을 필요로하는 환자 경우에 사용되는 DSG 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 통상적인 방법보다 생체에 보다 안전한 경구 투여에 의해 공급했다.

본 발명의 한 구체예는 활성 성분으로서 DSG 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 IgA 생산을 선택적으로 억제하기 위해 인간 또는 동물에 경구 투여하기 위한 조성물이다.

본 발명의 또다른 구체예는 IgA 생산을 선택적으로 억제하기 위한 인간 또는 동물에의 경구 투여용 조성물을 제조하기 위한 DSG 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 용도이다.

또한, 본 발명의 또다른 구체예는 IgA 생산의 선택적 억제를 필요로하는 인간 또는 동물에 DSG 또는 약리학적으로 허용되는 그의 염을 인간 또는 동물에 경구 투여함을 포함하는 것을 특징으로 하는 인간 또는 동물에서 IgA 생산을 선택적으로 억제하는 방법이다.

본 발명에 따르면, 면역 반응, 특히 경구 섭취된 항원에 반응한 IgA 항체 생산이 억제되어, 전신적 면역억제가 거의 없거나 약하고, IgA 생산의 선택적 억제가 일어난다. 그러므로, 본 발명은 IgA 신장병과 같은 IgA-관련된 면역질환을 예방 및 치료하는데에 유용하다.

본 명세서에서 사용된바, IgA 생산의 "선택적 억제"는 IgA 항체 생산은 상당히 억제되고, IgG 항체 생산 및/또는 지연 과민면역반응은 심각하게 억제되지 않는다는 것을 의미한다.

본 발명에 따른 IgA 생산을 선택적으로 억제하기 위한 경구 투여용 조성물에 함유된 활성 성분은 DSG 또는 DSG의 약리학적으로 허용되는 염일 수 있다. DSG는 산과 염을 형성한다. 염형성을 위한 산은 약리학적으로 허용되는 한 무기 산 또는 유기 산일 수 있다. 바람직한 무기 산은 예를들어 염산, 황산, 질산 및 인산을 포함한다. 바람직한 유기 산은 예를들어 아세트산, 프로피온산, 숙신산, 푸마르산, 말레산, 말산, 타르타르산, 글루타르산, 시트르산, 벤젠설폰산, 톨루엔설폰산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 프로판설폰산, 아스파라그산(asparagic acid) 및 글루탐산을 포함한다.

또한, 본 발명에서, DSG 또는 상기 기술된 바와 같은 그의 약리학적으로 허용되는 염과 유사한 IgA 생산 억제 효과를 나타내는 화학식 2:Gu-X₀-X₁-A-X₂-CO-X₃(여기에서, Gu는 구아니디노 그룹을 나타내고, X₀는 (CH₂)_1-6, 또는 페닐렌 그룹 또는 치환체를 가질 수 있는 CH₂C₆H₄를 나타내며, X₁은 (CH₂)_2-7또는 CH=CH를 나타내고, A는 CONH 또는 NHCO를 나타내며; A가 CONH일때, X₂는 α-아미노 그룹 및 α-카복실 그룹이 α-아미노산으로부터 제거된 잔기 또는 ω-아미노 그룹 및 α-카복실 그룹이 ω-아미노산으로부터 제거되고, 작용기가 잔기중에 제공될 수 있는 잔기를 나타내고; 광학적 활성 탄소를 갖는 α-또는 ω-아미노산 으로부터 유래된 잔기의 입체화학은 L-, D- 또는 DL-형태에 구체적으로 제한되지 않으며; 전형적이고 구체적인 예는 α-아미노 그룹 및 α-카복실 그룹이 글리신, α-하이드록시글리신, α-메톡시글리신 및 세린과 같은 α-아미노산으로부터 제거된 잔기 및 ω-아미노 그룹 및 α-카복실 그룹이 β-알라닌, γ-아미노부티르산, δ-아미노발레르산 및 ε-아미노카프로산과 같은 아미노산으로부터 제거된 잔기를 포함하고; A가 NHCO일때, X₂는 단일 결합, CH₂NH, CH₂O, 또는 치환 또는 비치환된 저급 알킬렌 그룹을 나타내며; 저급 알킬렌 그룹은 예를들어, 메틸렌 그룹, 에틸렌 그룹 및 프로필렌 그룹을 포함하고, 그의 치환체는 불소, 염소 및 브롬과 같은 할로겐, 메톡시 그룹 및 에톡시 그룹과 같은 저급 알콕시 그룹 및 하이드록실 그룹을 포함하고; 본 명세서 사용된바, 치환체에 대해 사용된 용어 "저급"은 치환체가 1-6개, 바람직하게는 1-3개의 탄소를 가짐을 의미하며; X₃은 NH-(CH₂)₄-N(R₁)-(CH₂)₃-NH-R₂(여기에서, R₁은 수소, 또는 하이드록실 그룹이 α-페닐글리신중의 카복실 그룹으로부터 제거되고, R₂가 수소 또는 하이드록실 그룹이 아미노산 또는 펩타이드중의 카복실 그룹으로부터 제거된 잔기를 나타낸다) 를 나타낸다)의 스퍼구알린-관련 화합물의 하나가 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 "15-데옥시스퍼구알린(DSG)" 및 그의 약리학적으로 허용되는 염은 화학식 2에 의해 나타내지는 스퍼구알린-관련 화합물로 부터 선택된 화합물 및 그의 약리학적으로 허용되는 염을 포함한다.

스퍼구알린-관련 화합물은 유도체의 형에 따라 항-종양 활성, 면역강화 활성 또는 면역억제 활성을 갖는 것으로 알려진 바실러스(Bacillus) 속의 생산자 균주로부터 분리된 스퍼구알린의 유도체이다(JP-A 58-62152, JP-A 61-129119, JP-A 64-90164). 또한, 화학식 1의 DSG를 생산하는 방법은 JP-B 61-23183과 같은 공보에 개시되어 있다.

본 발명에 따른 경구 투여용 조성물중에 활성 성분으로서 함유된 DSG 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염은 상기 기술된 공지된 방법 또는 그의 변형에 따라 생산될 수 있다.

본 발명에 따른 경구 투여용 조성물은 DSG 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 단독으로 사용하거나, 부형제 또는 담체와 혼합하여 공지된 방법에 따라 제형화된다. DSG는 활성 입체이성체 또는 라세미 화합물일 수 있다.

어떠한 약리학적으로 허용되는 물질도 부형제 또는 담체로서 사용될 수 있다. 예를들어, 물, 알콜, 콩유, 땅콩유, 참깨유 및 광유와 같은 동물 또는 식물유, 또는 합성유가 액체 담체로서 사용된다. 락토즈, 말토즈 및 슈크로즈와 같은 다당류, 아미노산, 하이드록시셀룰로즈와 같은 셀룰로즈 유도체, 마그네슘 스테아레이트와 같은 유기 염, 덱스트란, 덱스트란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 헤파린, 젤라틴등이 고체 담체로서 사용된다. 이들 고체 담체 또는 액체 담체는 정제, 캡슐, 분말, 과립, 용액, 드라이 시럽 또는 마이크로스피어(microsphere) 제제와 같은 경구 투여용 제제를 제조하는데에 사용될 수 있다. 단일 투여량 형태의 제제가 바람직하다.

또한, 산 또는 알칼리 또는 적당량의 버퍼가 pH를 조정하기 위하여 본 발명에 따른 조성물에 첨가될 수 있다.

또한, 활성 성분으로서 함유된 DSG 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 경구 피흡수성을 증가시키기 위하여 본 발명에 따른 경구 투여용 조성물에 소듐 라우레이트 또는 글리코콜산, 또는 β-사이클로덱스트린과 같은 계면활성제를 첨가하는 것이 바람직하다. 소화관의 점막으로부터 흡수를 촉진하고 피흡수성을 증가시키기 위하여 생분해성 락테이트 중합체, 락테이트-글리콜레이트 공중합체등을 사용하여 마이크로스피어 제제를 제조하는 것이 또한 바람직하다.

본 발명에 따른 경구 투여용 조성물중의 DSG 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 함량은 제제에 따라 변하지만, 함량은 보통 0.1-100 중량%, 바람직하게는 1-98중량%이다. 일반적으로, 정제, 캡슐, 산제 또는 과립은 5-100 중량%, 바람직하게는 25-98중량%의 활성 성분을 함유한다.

본 발명에 따른 IgA 생산을 선택적으로 억제하는 방법에서, IgA 생산을 억제하는 유효량의 DSG 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 IgA 생산을 선택적으로 억제하는 것이 필요한 인간 또는 동물에 경구 투여한다.

투여량은 개 또는 고양이와 같은 애완동물 및 가축 동물을 포함하는 포유동물과 같은 대상으로서의 인간 또는 동물의 연령, 체중, 질병 상태, 치료 목적등에 의해 결정된다. 경구 투여용 치료 투여량은 1일 성인(체중 65 kg)당 바람직하게는 0.01-5 mg/kg/일 또는 3-300 mg이다. 보다 바람직하게는, 투여량은 IgG 생산이 적어도 심각하게(significantly) 억제되지 않도록 결정된다. 따라서, 본 발명에 따른 경구 투여용 조성물은 적어도 IgG 생산을 심각하게 억제하지 않는 투여량으로 IgA 생산을 심각하게 억제하는 것을 특징으로 한다.

특별화된 환경에서 사육된 마우스와 같은 특정 실험실 동물은 IgA를 생산하도록 면역학적으로 감작화되지 않았다. 본 발명에 따른 경구 투여용 조성물의 IgA생산을 선택적으로 억제하는 효과는 점막 면역학적 감작화를 위한 항원의 경구 투여에 의해 점막 IgA 및 혈청 IgA를 생산하도록 만들어진 실험 모델을 사용하여 확인될 수 있다. 다른한편, 인간 또는 가축동물은 예를들어 식품중의 경구 섭취된 이종 항원에 의하여 점막 면역학적 감작화를 이미 받았고, IgA를 생산한다. 그러므로, 본 발명에 따른 경구 투여용 조성물은 실험 모델에서 행한 것과 마찬가지로 인간 또는 가축동물에서 경구 접종된 항원에 대한 점막 IgA 및 혈청 IgA를 생산하는 것을 선택적으로 억제하는 효과를 나타낸다.

점막 IgA 및/또는 혈청 IgA에 기인한 질병은 예를들어 IgA 신장병에 의해 예시된다. 본 발명에 따른 경구 조성물은 IgA 신장병을 치료하는데에 유용하다.

하기 실시예는 본 발명을 보다 상세히 예시하나 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 안된다. 실시예에서 사용된 DSG는 상기 기술된 바와 같은 화학식 1의 화합물이다.

실시예 1

경구 투여된 항원에 대해 반응한 분비 IgA 생산에 대한 DSG의 억제 효과

경구 투여된 DSG가 분비 IgA 생산을 억제하는 효과는 콜레라 독소가 경구적으로 투여된 마우스로부터의 배설물중의 항-콜레라 독소 IgA 항체의 역가를 측정하여 확인되었다.

먼저, 콜레라 독소 용액 및 DSG 용액을 준비하였다. 콜레라 독소(Sigma)를 50 ㎍/ml의 농도로 0.2 M NaHCO₃에 용해시켜 콜레라 독소 용액을 수득하였다. DSG(Takara Shuzo, 동결건조된 원래의 약제) 를 5 mg/ml 또는 1.25 mg/ml의 농도로 염수에 용해시켜 DSG 용액을 수득하였다.

다음으로, 0.2 ml의 콜레라 독소 용액을 C57BL/6 마우스(7주령, 암컷, 그룹당 5마리의 마우스)의 3개 그룹에 2회 경구 투여하였다(0일째 및 7일째). 이하의 본 실시예에서, 경과일 수는 콜레라 독소가 첫번째 투여된 0일 째로 부터 계수된 날짜이다. 5 mg/ml의 DSG 용액, 1.25 mg/ml의 DSG 용액 또는 염수를 0.2 ml/투여량으로 3개 그룹의 마우스에 5회(7일 부터 11일까지 하루에 1회) 경구투여하였다. 각각의 그룹에 경구 투여된 DSG의 투여량은 각각 50 mg/kg, 12.5 mg/kg 및 0 mg/kg이었다. 7일째 및 14일째, 각 그룹의 마우스로부터 배설물을 채취하였다. 배설물 0.1 g중의 항체를 1 ml의 인산염 완충된 염수(PBS)로 추출하였다. 추출물을 이하에서 배설물 항체 추출물이라고 표기한다. 7일째 배설물을 DSG 투여전에 채취하였다.

배설물 항체 추출물중의 IgA 항체의 역가를 ELISA 방법으로 측정하였다. 0.2 M NaHCO₃중의 10 ㎍/ml의 각 콜레라 독소 용액 50 ㎕를 콜레라 독소를 코팅하기 위하여 4 ℃에서 16시간동안 정치시킨 Immuno Modules(Nunc)에 첨가하여, ELISA 방법용 고체상을 얻었다. 이어서 고체상을 PBS에 용해시킨 1%(w/v) 소 혈청 알부민(Sigma)을 함유하는 BSA 용액으로 블로킹시키고, 각 배설물 항체 추출물 50 ㎕를 거기에 첨가하고, 이어서 37℃에서 1 시간동안 반응시켰다. 50 ㎕의 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)-표지된 토끼 항-뮤린(murine) IgA 항체(Zymed)를 첨가하고 37℃에서 1시간동안 반응시켰다. 이어서 시트레이트-포스페이트 버퍼에 용해된 2.75 mg/ml의 아지노 비스-에틸벤조티아졸린 설폰산(ABTS, HRP용 기질, nacalai tesque)을 함유하는 ABTS 용액 50 ㎕를 여기에 첨가하고, 실온에서 15분동안 반응시키고, 이어서 405 nm 파장에서의 흡광도(OD₄₀₅)를 측정하였다.

그 결과를 표 1에 나타내었다. 표 1에서, 분비 IgA 항체 생산의 증가된 양은 7일째 및 14일째의 IgA 생산량 사이의 차이를 의미한다. 차이는 7일째의 배설물 항체 추출물의 OD₄₀₅값 및 14일째의 배설물 항체 추출물의 OD₄₀₅사이의 차이에 의해 표시된다(평균치±표준 오차).

표 1

DSG의 투여량(mg/kg)	분비 IgA 항체 생산의 증가된 양	유의적인 차이 P
0	0.409±0.091
12.5	0.249±0.092	＜0.05
50	0.082±0.017	＜0.0001

표 1의 결과로부터 알수 있는 바와 같이, 50 mg/kg 및 12.5 mg/kg에서의 DSG의 경구 투여가 DSG를 받지않은 그룹에 대해 관찰된 것과 비교하여 경구 투여된 항원에 반응한 분비 IgA의 생산량 증가에서 상당한 감소를 가져왔다. 이들 결과는 경구 투여된 DSG가 IgA 생산을 억제하는 효과를 확인시켰다.

실시예 2

경구 투여된 항원에 반응한 IgA 생산을 DSG가 선택적으로 억제하는 효과

경구 투여된 DSG에 의한 항체 생산을 억제하는 효과는 배설물중의 항-콜레라 독소 IgA 항체의 역가 및 콜레라 독소를 경구적으로 받은 마우스로부터의 혈액중의 항-콜레라 독소 IgA 항체 및 항-콜레라 독소 IgG 항체의 역가를 측정하여 확인하였다.

콜레라 독소를 실시예 1에서 기술된 바와 같이 5개 그룹의 C57BL/6 마우스(7주령, 암컷, 그룹당 5 마리의 마우스)에 경구 투여하였다. 3개 DSG 용액중 하나 또는 염수의 0.2 ml/투여량을 콜레라 독소 투여를 위한 4개 그룹의 마우스에 10회(하루에 한번, 13일을 제외한 7일 째부터 17일째 까지) 경구 투여하였다. 용액은 염수에 용해된 DSG를 5 mg/ml, 1.25 mg/ml 또는 0.313 mg/ml으로 함유했다. 각각의 그룹에 경구 투여된 DSG의 투여량은 각각 50 mg/kg, 12.5 mg/kg, 3.13 mg/kg 및 0 mg/kg이었다. 0.313 mg/ml의 DSG 용액을 투여량당 0.2 ml로 콜레라 독소 투여용 마우스의 나머지의 한 그룹에 10회 복강내 투여하였다(하루에 1회, 13일을 제외한 7일째부터 17일째까지). 복강내 투여된 DSG의 투여량은 3.13 mg/kg이었다.

배설물을 7일째 및 18일째 각 그룹의 마우스로부터 채취하였다. 항체를 0.1 g의 배설물로부터 PBS 1 ml로 추출하였다. 추출물은 하기에서 배설물 항체 추출물이라고 표기한다. 7일째의 배설물을 DSG 투여전 채취하였다.

다른한편, 혈액을 에테르 마취하에서 각 그룹으로부터의 마우스의 오르비탈 정맥 총(orbital venous plexus)으로부터 7일째 부분적으로 채취하고, 전 신체 혈액을 18일째 채취하였다. 혈청을 이렇게 얻어진 혈액으로부터 분리하고, 50배로 희석하였다. 희석물을 이하 혈액 항체 샘플이라고 표기한다. 7일째 혈액을 DSG 투여전 채취하였다.

배설물 항체 추출물 또는 혈액 항체 샘플중의 콜레라 독소에 대한 IgA 항체의 역가를 ELISA 방법에 의하여 측정하였다. 측정은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 수행하였다. 혈액 항체 샘플을 또한 혈액중에서 생산된 콜레라 독소에 대한 IgG 항체의 양을 측정하기 위하여 사용하였다. ELISA 방법에 의해 항체의 적량에 사용된 고체상은 실시예 1의 ELISA 방법에 의해 IgA 항체의 적량(titration)을 위해 사용된 것과 같다.

고체상을 실시예 1에 기술된바와 같이 BSA 용액으로 블로킹시킨후, 각 항체 샘플 50 ㎕를 거기에 첨가하고, 이어서 37℃에서 1 시간 동안 반응시켰다. 50 ㎕의 HRP-표지된 토끼 항-뮤린 IgG 항체(Zymed)를 첨가하고, 37℃에서 1 시간동안 반응시켰다. 이어서 2.75 /ml의 ABTS 용액 50 ㎕를 거기에 첨가하고, 실온에서 15분동안 반응시키며, 이어서 405 nm 파장에서의 흡광도(OD₄₀₅)를 측정하였다.

그 결과를 표 2에 나타낸다. 표 2는 7일째 생산된 항체의 양과 18일째의 양사이의 차이의 다양함을 보여준다. 차이는 7일째의 배설물 항체 추출물 또는 혈액 항체 샘플의 OD₄₀₅값과 18일째의 배설물 항체 추출물 또는 혈액 항체 샘플의 OD₄₀₅값사이의 차이에 의해 나타내진다 (평균치±표준 오차).

표 2

DSG	항체 역가
투여량(mg/kg)	분비 IgA	혈액 IgA	혈액 IgG
0	0.308±0.075	0.051±0.013	0.493±0.148
3.13(p.o.)	0.327±0.065	0.035±0.012	0.472±0.112
12.5(p.o.)	0.112±0.116^*	0.028±0.012^*	0.570±0.107
50(p.o.)	0.009±0.054^**	0.016±0.020^*	0.330±0.169
3.13(i.p.)	0.008±0.016^***	-0.009±0.009^***	0.034±0.035^**

표 2에서. 수의 우측 어깨의 부호^*,^**및^***는 각각 P＜0.05, P＜0.001 및 P＜0.0001의 유의적인 차이를 각각 나타낸다. 또한, p.o.는 DSG가 경구 투여된 그룹을 나타내고, i.p.는 DSG가 복강내 투여된 그룹을 나타낸다.

배설물 및 혈액중의 복강내 투여된 DS가 항체 생산을 억제하는 효과는 매우 강하다. 항체, 분비 IgA, 혈액 IgA 또는 혈액 IgG 어느것의 생산도 완전히 억제되어, 전신적 면역억제의 발생을 제시한다. 경구 투여는 투여량 의존 방법으로 분비 IgA 및 혈액 IgA의 항체 생산을 억제한다. 비경구 투여한 경우와 비교해서 경구 투여경우 항체 생산 억제의 낮은 정도 및 혈액에서 IgG 생산 억제의 부재는 경구 투여(administration)에 의한 전신 면역억제는 약하다는 것을 제시한다.

실시예 3

피하 투여된 항원에 반응한 항체 생산과 지연 과민면역반응의 DSG에 의한 억제

실시예 1 및 2에 대조적으로, 피하 투여된 항원에 반응한 항체 생산에 대한 경구 투여된 DSG의 효과가 확인되었다. 간략하게, 오브알부민을 마우스에 피하 투여한후, DSG를 경구 투여하였다. 뮤린 배설물중의 항-오브알부민 IgA 항체의 역가 및 혈액중의 항-오브알부민 IgA 항체의 역가 및 항-오브알부민 IgG 항체의 역가가 효과를 확인하기 위하여 측정되었다. 또한, 오브알부민에 대한 지연 과민 면역반응에서의 DGS의 효과가 확인되었다.

(1) 항체 생산의 억제

피하 투여용 오브알부민 현탁액을 오브알부민(Sigma)과 프로인드(Freund) 완전 어쥬번트를 혼합하여 200 ㎍/ml 농도로 제조하였다. DSG 용액은 실시예 1에서 기술된 바와 같이 5 mg/ml, 1.25 mg/ml 또는 0.313 mg/ml의 농도로 염수에 DSG를 용해시켜 제조하였다.

이어서, 0.1 ml의 오브알부민 현탁액을 3개 그룹의 C57BL/6 마우스(7주령, 암컷, 그룹당 5 마리)에 2회 피하 투여하였다( 0일, 14일). 본 실시예의 이하에서, 경과일 수는 오브알부민이 처음으로 투여된 0일로부터 계산된 수이다. 이어서, 투여량당 0.2 ml의 DSG 용액 또는 염수를 오브알부민 투여를 위한 3개 그룹에 10회(하루에 1회, 20일을 제외한 14일부터 24일까지) 경구 투여하였다. 각각의 그룹에 경구 투여된 DSG의 투여량은 각각 50 mg/kg, 12.5 mg/kg 및 0 mg/kg이었다. 투여량당 0.2 ml의 DSG 용액(0.313 mg/ml)을 오브알부민 투여를 위한 마우스의 나머지 한 그룹에 10회(하루에 1회, 20일을 제외한 14일부터 25일까지) 복강내 투여하였다. 복강내 투여된 DSG의 투여량은 3.13 mg/kg이었다.

배설물을 각 그룹의 마우스로부터 14일 및 25일 채취하였다. 배설물 0.1 g중의 항체를 1 ml의 PBS로 추출하였다. 추출물을 이하에서 배설물 항체 추출물이라고 표시한다. 14일째의 배설물을 DSG 투여전 채취하였다.

다른한편, 혈액을 에테르 마취하의 각 그룹으로부터의 마우스의 오르비탈 정맥총(orbital venous plexus)으로부터 14일째 부분적으로 채취하고, 전 신체 혈액을 25일 채취했다. 혈청을 이렇게 얻어진 혈액으로부터 분리하고, 50- 또는 250배 희석시켰다. 희석물은 이하에서 혈액 항체 샘플로 표시된다. 14일째의 혈액을 DSG 투여전 채취했다.

배설물 항체 추출물 또는 혈액 항체 샘플중의 오브알부민에 대한 항체의 역가는 ELISA 방법으로 측정하였다. 측정은 고체상에 대해 사용된 항원이 콜레라 독소로부터 오브알부민으로 바뀐것 이외에는 ELISA 방법에 대해 실시예 2에서 기술된 바와 같이 수행하였다.

오브알부민의 피하 투여는 배설물 또는 혈액중의 IgA 항체의 양을 증가시키지 않았다. 다른한편, 오브알부민의 피하 투여는 혈액중의 IgG 항체의 양을 증가시켰다. 혈액에서 생산된 IgG 항체량의 변화 결과가 표 3에 나타나 있다. 표 3은 14일째 생산된 다양한 항체의 양과 25일째 양사이의 차이를 나타낸다. 차이는 250배 희석된 14일째의 혈액 항체 샘플의 OD₄₀₅값과 250배 희석된 25일째의 혈액 항체 샘플의 OD₄₀₅값사이의 차이로 표시된다(평균치±표준 오차).

표 3

DSG의 투여량(mg/kg)	혈액 IgG	유의적인 차이 P
0	0.437±0.173
12.5(p.o.)	0.286±0.074
50(p.o.)	0.125±0.141	＜0.05
3.13(i.p.)	0.064±0.080	＜0.001

표 3에서, p.o.는 DSG를 경구 투여한 그룹을 나타내고, i.p.는 DSG를 복강내 투여한 그룹이다.

50 mg/kg으로 DSG를 투여하는 것은 혈액중의 IgG 항체 생산을 상당히 억제하나, 12.5 mg/kg의 DSG 투여는 상기 생산을 상당히 억제하지는 않았다. 다른한편, 3.13 mg/kg으로 DSG의 복강내 투여는 50 mg/kg으로 DSG를 경구 투여하는 것보다 보다 강하게 혈액중의 항체 생산을 억제하였다.

상기 언급된 결과는 DSG의 경구 투여가 비경구적으로 접종된 항원에 반응하는 것 보다 경구 섭취된 항원에 반응한 항체 생산을 선택적으로 억제한다는 것을 보여준다.

(2) 지연 과민면역반응의 억제:

오브알브민의 수용액(400 ㎍/ml) 25 ㎕를 오브알부민 투여하고 24일후 실시예 3(1)의 각 실험 그룹의 마우스의 발바닥에 피하투여하였다. 발바닥의 부종을 오브알부민 피하투여하고 24시간후 측정하였다. 그 결과를 표 4에 나타낸다.

표 4

DSG의 투여량(mg/kg)	발바닥의 부종(×10^-2mm)
0	88.6±57.2
12.5(p.o.)	83.2±41.4
50(p.o.)	62.0±24.8
3.13(i.p.)	22.8±35.3

50 mg/kg으로 DSG가 경구 투여된 그룹에 대해 관찰된 발바닥의 부종과 투여없는 그룹에 대해 관찰된 부종사이에 어떤 차이가 인식되지 않았다. 다른한편, DSG를 3.13 mg/kg으로 복강내 투여받은 그룹경우 관찰된 발바닥에서의 부종은 투여가 없는 그룹에서 관찰된 것과 비교해서 감소되었다. 따라서, DSG의 경구 투여는 지연 면역과민반응을 억제하지 않고 DSG에 기인한 전신 면역억제를 일으키지 않는다고 시사되었다.

실시예 4

IgA 항체 생산 억제를 위한 경구 조성물의 제조

과립제

50중량부의 DSG, 600 중량부의 락토즈, 330중량부의 결정화된 셀룰로즈및 20중량부의 하이드록시프로필 셀룰로즈를 잘 혼합하고, 롤-형 콤팩터(Roller Compactor^TM)를 사용하여 밀집되게하고, 분쇄하여, 16-메쉬 및 60-메쉬사이의 체를 통과시켜 과립을 얻었다.

정제

30중량부의 DSG, 120 중량부의 결정화된 락토즈, 147 중량부의 결정화된 셀룰로즈 및 3 중량부의 마그네슘 스테아레이트를 V-형 믹서를 사용하여 혼합시키고 압착하여 정제(300 mg/정제)를 얻었다.

상기 기술된 바와 같이, 본 발명에 따른 DSG 또는 그의 약제학적으로 허용되는 염을 함유하는 경구 조성물은 경구 섭취된 항원에 반응한 면역 반응, 특히, IgA 항체 생산을 억제하고, 반면에 거의 없는 또는 약한 전신 면역억제가 관찰된다. 그러므로, 본 발명에 따른 DSG 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 경구 조성물은 IgA 신장병과 같은 IgA-결합된 면역학적 질병을 치료 및 예방하는데에 사용될 수 있다.

Claims

활성 성분으로서 15-데옥시스퍼구알린(15-deoxyspergualin) 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 함유하는 IgA 생산을 선택적으로 억제하기 위한 인간 또는 동물에 대한 경구 투여용 조성물.
제 1 항에 있어서, IgA 신장병을 예방 또는 치료하기 위한 조성물.
15-데옥시스퍼구알린 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염의 IgA 생산을 선택적으로 억제하기 위한 인간 또는 동물에 대한 경구 투여용 조성물의 제조를 위한 용도.
제 3 항에 있어서, 조성물이 IgA 신장병을 예방 또는 치료하기 위한 용도.
IgA 생산의 선택적 억제를 필요로하는 인간 또는 동물에게 15-데옥시스퍼구알린 또는 그의 약리학적으로 허용되는 염을 경구 투여하는 것을 포함함을 특징으로 하는 인간 또는 동물에서 IgA 생산을 선택적으로 억제하는 방법.
제 5 항에 있어서, IgA 신장병을 예방 또는 치료하기 위한 방법.