KR20010085196A - 비오틴-결합 수용체 분자 - Google Patents

Abstract

단백질이 세포질 도메인, 멤브레인-스패닝 도메인 및 세포외 도메인으로 구성되며, 여기서 세포외 도메인이 비오틴-결합 활성으로 구성되는 비오틴화 분자에 결합할 수 있는 신규의 막투과 단백질.

Description

비오틴-결합 수용체 분자 {BIOTIN-BINDING RECEPTOR MOLECULES}

비오틴(비타민 H)은 혈액 및 조직 중에서 저농도로 발견되는 쉽게 물에 용해되는 물질이다. 비오틴의 생리학적 역할은 활성화된 CO₂의 담체로서, 부가적 자유 에너지 없이도 수용체에 CO₂의 전달을 허용한다. 활성화된 카르복시비오틴은 보통 카르복시비오틴의 형성에 필요한 효소에 부착된다. 예를 들면, 비오틴은, 아세틸 CoA의 존재 하에, 카르복시비오틴의 형성 및 피루베이트에 활성화된 카르복실기의 계속적인 전이를 촉매하여 옥살로아세테이트를 형성하는 피루베이트 카르복실라제에 부착될 수 있다.

비오틴은 또한, 아비딘(달걀 흰자위로 부터의 63 kDa 당단백질) 및 스트렙타비딘(스트렙토미세스 아비디니(Streptomyces avidinii) 세균속으로 부터의 비당화된 단백질)에 자연적으로 가장 유사한 것들 중 하나와 결합한다. 결합은 특성(Ka 10¹⁵mol^-1)에 있어서 거의 비가역적이다. 아비딘과 비오틴 사이의 친화력은 광위의 생물분석 응용에 매우 유용한 것으로 증명되어 왔다. 예를 들면, 아비딘-비오틴 복합체는, 광위의 검출계에 성공적으로 사용되어 왔으며, 여기서 목표 분자는 그의 카르복시 말단을 통해서 비오틴과 결합하여 비오틴화 분자를 형성하며, 이 비오틴화 분자는 용액에서 쉽게 검출 또는 분리될 수 있다. 비오틴화는 각종 분자들의 생리학적 및 이화학적 특성들을 변화시키지 않고, 아비딘에 비오틴 보결분자족의 결합능에 영향을 주지 않으면서 일어날 수 있다.

본 발명은 비오틴-결합 활성을 갖는 멤브레인-스패닝 단백질(membrane-spanning proteins)에 관한 것이다.

도 1은 본 발명의 융합 단백질의 도해도이고, 여기서 A는 아비딘을 나타내며, B는 엔도사이토시스 수용체의 멤브레인-스패닝 도메인을 나타내고(및 C는 비오틴을 나타냄);

도 2는 셔틀 벡타를 사용한 클로닝 단계의 도해도이고,

도 3은 레트로바이러스 벡타를 사용한 클로닝 단계의 도해도이다.

본 발명들은 이제 아비딘 및 스트렙타비딘의 비오틴-결합 활성이 비오틴화된 분자들과 결합할 수 있는 막투과 단백질(transmembrane proteins)의 생산에 이용할 수 있다는 것을 실현하게 되었다. 본 발명의 단백질은 세포질 도메인, 멤브레인-스패닝 도메인 및 세포외 도메인으로 구성될 수 있으며, 여기서 세포외 도메인은 비오틴 결합 활성으로 구성될 수 있다. 세포외 도메인은 아비딘 또는 스트렙타비딘의 기능 활성으로 구성될 수 있다.

본 발명의 단백질 또는 핵산 분자를 사용해서, 조직 중의 특정 부위에 비오틴화된 분자를 목표로 하는 것이 가능하다. 이 방법 중의 목표화된 분자들은, 분자들이 세포내 또는 세포 표면에서 그들의 효과를 발휘하도록 허락하는, 엔도사이토시스(endocytosis)에 의해 조직 또는 세포에 흡수될 수 있다.

본 발명의 단백질은 종래의 재조합 DNA 기술을 사용하여 생산할 수 있다. 전형적으로, 아비딘, 스트렙타비딘 또는 관련 단백질 등의 기능 도메인을 위한 DNA 서열 코딩(coding)은 멤브레인-스패닝 특성을 갖는 단백질의 DNA 서열 코딩을 구성하는 유전적 구조물로 처리된다. 아비딘 및 스트렙타비딘-관련 단백질의 예로 AVR-1-AVR-5, AVR-X-AVR-V, Stv1 및 Stv2가 포함된다.

융합 단백질의 개별 도메인은 폴리머라제 연쇄 반응에 의해 증폭되거나, 제한 효소 소화, 단리 및 정제(예를 들면, 전기영동)시키고, 이어서 결찰(예를 들면, DNA 리가제(ligase)를 사용함)을 사용해서 모cDNA로 부터 단리시킬 수 있다. 이어서, 융합 단백질 구조물은 적당한 숙주 세포로 형질감염시키고, 배양시키고, 표준 단백질 정제 기술을 사용하여 단리시킬 수 있다.

상기 구조물은 또한 네이키드(naked) DNA 또는 플라스미드/리포솜, 플라스미드/폴리에틸렌이민, 플라스미드/덴드리머 또는 플라스미드/펩티드 복합체로서 사용될 수 있다.

다른 방법으로, 구조물은 체내의 특정 위치에 구조물을 목표화하기 위해 사용될 수 있는 복제-결핍 바이러스에 도입될 수 있다. 예를 들면, 구조물은 융합 단백질의 적당한 cDNA로 구성되는 레트로바이러스성 벡타일 수 있다. 이어서, 예를 들면, 몰로니(Moloney) 쥐 레트로바이로스인 복제-결핍 레트로바이러스를 목표 세포 및 조직의 안정한 형질감염을 위해 사용할 수 있다. 사용할 수 있는 기타의 바이러스는 복제-결핍 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 포진 바이러스, 유두종 바이러스 및 시니비스(sinibis) 바이러스가 포함된다. 그외의 바이러스들은 당업자들에게 명확하게 될 것이다.

아비딘, 스트렙타비딘 또는 관련 단백질의 기능 도메인 이외에, 융합 단백질은 전형적으로 엔도사이도시스 수용체의 멤브레인-스패닝 도메인으로 구성된다. 이러한 수용체들의 사용은 목표 세포내로 비오틴화 분자를 섭취할 수 있게 한다. 본 발명에 사용할 수 있는 적합한 수용체는 스캐벤저(scavenger) 수용체 클라스 A, 저밀도의 지단백질 수용체, 매우 낮은 밀도의 지단백질 수용체, 트랜스페린 수용체 및 LOX-1 수용체를 포함한다. 융합 단백질은 또한 수용체 단백질과 아비딘 펩티드 서열 사이의 링커(linker)로 구성될 수 있다. 링커는 길이를 가질 수 있으며, 단 융합 단백질의 다른 성분들의 기능 활성은 보유된다.

일반적으로, 아비딘 또는 스트렙타비딘 펩티드 서열 및 수용체 펩티드 서열 사이의 융합은 수용체 단백질의 세포외 도메인과 아비딘 또는 스트렙타비딘의 비오틴-결합 부위의 특정 부위 바깥쪽 사이에 있다.

다음의 실시예로 본 발명을 설명한다.

실시예

DNA 구조물을 소 스캐벤저 수용체 클라스 A(ScR) (코다마(Kodama) 등. (1990) Nature343: 531~535)와 아비딘(그린(Green). (1975) Adv. Prot. Chem.29: 85~133) 사이에서 생성했고, 이것은 ScR 세포질 도메인, 멤브레인-스패닝 도메인및 α-나선으로 감겨진 도메인을 가지며, 비오틴 결합 도메인에 결찰된 단백질을 코드한다. 융합 단백질의 완전한 아미노산 서열은 서열번호 2에 나타냈으며, 여기서 아미노산 1~53은 세포질 도메인을 나타내고, 아미노산 55~79는 막투과 도메인을 나타내고, 아미노산 81~111은 스페이서 도메인(spacer domian)을 나타내고, 아미노산 113~272은 α-나선형으로 감겨진 도메인을 나타낸다. 아미노산 273~400은 분비 신호가 결여된 아비딘 cDNA(고프(Gope) 등. (1987) Nucleic Acid Res.15: 3595~3606)로 부터 유도된 성숙 아비딘 펩티드 서열을 나타낸다.

간략하면, ScR의 cDNA는 내부 라우스 육종 바이러스 프로모터(internal Rous Sarcoma Virus Promoter) 및HindIII 제한 위치를 갖는 ScR cDNA를 함유하는 플라스미드(PLScRNL)로 미리 형질감염시킨 배양 세포로 부터 얻었다. 그 다음, 단리된 cDNA를 레트로바이러스 벡타 pLS1ARNL의HindIII 위치에 삽입했다. 아비딘 cDNA를 폴리머라제 연쇄반응에 의해 생산하고, 이어서 ScR cDNA 상의 Sty 1 제한 위치에서 레트로바이러스 벡타에 삽입했다. 본 발명을 구체화하는 cDNA는 서열번호 1에 나타냈고, 여기서 뉴클레오티드 1~989는 Mo-MuSV로 부터의 긴 말단 반복을 나타내고, 뉴클레오티드 1071~2270은 융합 단백질의 코딩 영역을 나타내고, 뉴클레오티드 2376~3101은 소 스캐벤저 수용체 I cDNA로 부터의 비전사 영역을 나타내고, 뉴클레오티드 3107~3376은 RSV 프로모터 영역을 나타내고, 뉴클레오티드 3727~4522는 신생 R 유전자를 나타내고, 뉴클레오티드 4540~5177은 Mo-MuLV로 부터의 긴 말단 반복을 나타낸다.

도 2 및 3은 이 실시예에서 사용한 방법을 언급한다. 더욱 구체적으로, 도 2는 내부 RSV 프로모터를 갖는 ScR cDNA를HindIII에 의해 플라스미드 pLScRNL로 부터 절단해서, 셔틀 벡타의HindIII 위치로 클로닝하는 방법을 나타낸 것이다. 도 3은 ScR-아비딘-RSV cDNA를 레트로바이러스 벡타 pLRNLHindIII 위치로 클로닝하는 방법을 나타낸 것이다.

벡타로 형질감염된 세포 중의 융합 단백질의 발현은 노던 블로팅 및 아비딘에 대해 증가된 항체를 사용한 면역세포화학적 염색에 의해 확인할 수 있다.

실험한 결과, 완전한 mRNA 전사물은 55 kDa 단량체로 번역되는 것으로 나타났으며, 상기 단량체는 비환원 조건 하에서 S-S 결합에 의해 부착된 110 kDa 이량체의 이차 구조를 형성할 수 있었다. 변성 조건을 사용해서, 대략 110 kDa 이량체 및 55 kDa 단량체 펩티드를 검출했다. 이 결과는 단량체 융합 단백질, 45 kDa의 컴퓨터 계산치와 유사하다. 비변성 조건(즉, 웨스턴 블로팅에 앞서 아세틸화를 사용함)에서, 가장 강한 신호는 대략 220 kDa이었으며, 이것은 사량체 형성을 암시하는 대략 110 kDa 이량체 및 55 kDa 단량체로 변성되었다. 또한, 220 kDa 단백질의 존재는, 화학적 가교제, 예를 들면, NHS-에스테르를 사용해 증명했다. 결과들은 아비딘이 용해된 채로 남고, 엔도사이토시스 수용체의 멤브레인-스패닝 도메인에 부착되었을 때조차 사량체를 형성할 수 있는 것을 나타냈다.

융합 단백질은 동초점 현미경 및 원자력(atomic force) 현미경에 의한 분석시, FITC-비오틴과 결합할 수 있는 기능 단백질로 나타났다. 형질도입되지 않은 세포 및LacZ유전자를 함유하는 레트로바이러스 벡타로 형질감염된 세포를 대조군으로서 사용했다.LacZ-형질도입된 대조군 세포에 프로브(probe)한 비오틴의 비특정적 결합은 원자력 현미경에 의해 검출되지 않았다. 예상한 바와 같이, 형질감염된 세포들은 비고정된 샘플 중에서 반복적으로 측정될 수 있는 특정적 결합을 나타냈다. 측정된 결합력은 평균 149±19 pN (평균치±평균편차)의 배수이었고, 이것은 또한 예상했던대로, 이전에 보고된 비오틴-스트렙다비딘 결합력, 160 pN의 범위내에 있다(플로린(Florin) 등. (1994), Science 264 : 415~417).

구조물의 기능성은 FACS 분석을 사용하여, 융합 단백질 구조물을 갖는 세포에 형광-표지된 비오틴 분자들의 결합을 표시하여 또한 체내에서 확인될 수 있다.

체내에서의 융합 단백질의 기능 활성은 래트 악성 신경교종 모델 중에서 분석되었다. BT4C 야생-유형 신경교종 세포들을 동계교배한 BDIX 암컷 래트 뇌 중의 2.5 mm의 깊이에서 우측 뇌량 중의 두개골내로 이식했다. 종양의 성장을 고분해(high resolution) MRI(자기공명영상)로 빈번하게 모니터했다. 종양 세포 접종 3주 후, 각각 2 x 10⁶cfu/ml 및 1.3 x 10⁶cofu/ml의 적정량 중의 융합 단백질 또는LacZ유전자의 cDNA를 운반하는 슈도타입(pseudotype) 레트로바이러스는 처음에는 2.5 mm의 깊이에서, 이어서 1.5 mm의 깊이에서 10분의 간격으로 종양으로 이동되었다. 유전자 이동은 성장 2일 후에 반복되었다. 동물들을 희생시키고, 최종 주사후 3일째, 4% PFA로 관류-고정시켰다. 뇌를 제거하고, 주사 부위에서 2개의 관상 조각으로 나누고, 얼음 위에서 절편화하고, 항아비딘 항체에 대한 면역반응성을 사용해 분석했다. 결과들은 융합 단백질이 체내의 래트 악성 신경교종 중에서 발현되는 것을 나타냈다. 단백질은 신경교종 및 종양 혈관 중의 혈관 내피 세포를 닮은고리와 같은 구조 중에서 검출되었다.

Claims (11)

1. 멤브레인-스패닝 도메인 및 세포외 도메인으로 구성되고, 세포외 도메인이 비오틴 결합 활성으로 구성되는 단백질.
2. 제 1항에 있어서, 추가로 세포질 도메인으로 구성되는 단백질.
3. 제 1항 또는 2항에 있어서, 세포외 도메인이 아비딘 또는 스트렙타비딘 기능 활성으로 구성되는 단백질.
4. 상기 항 중의 어느 하나의 항에 있어서, 스캐벤저 수용체 클라스 A로 부터의 아미노산 서열로 구성되는 단백질.
5. 제 1항 내지 3항 중의 어느 하나의 항에 있어서, 단백질이 서열번호 2로 정의된 아미노산 서열로 구성되는 단백질.
6. 상기 항 중의 어느 하나의 항에 따른 단백질을 암호화하는 핵산 분자.
7. 제 6항에 따른 핵산 분자로 구성되는 재조합 발현 벡타.
8. 세포주를 제 7항에 따른 재조합 발현 벡타로 형질감염 시키고, 형질감염된 세포 중에서 단백질을 발현하는 것으로 구성되는, 제 1항 내지 5항 중 어느 하나의 항에 따른 단백질의 제조 방법.
9. 분자를 목표물을 함유하는 용액에 첨가하는 단계로 이루어지고, 상기 분자가 비오틴화 되었고, 상기 목표물이 제 1항 내지 5항 중 어느 하나의 항에 따른 단백질로 구성되며, 상기 분자를 시험관에서 목표물 부위에 전달하는 방법.
10. 핵산 분자에 의해 암호화된 단백질이 목표 부위에서 발현되는, 제 6항에 따른 핵산 분자를 사용하는, 목표 부위에 투여되는 의약.
11. 목표 부위가 제 1항 내지 5항 중 어느 하나의 항에 따른 단백질로 구성되는, 비오틴화 분자를 사용하는, 목표 부위에 투여되는 의약.