KR20020003519A - Ｌ-글루탐산을 생산하는 세균 및 ｌ-글루탐산의 생산방법 - Google Patents

Ｌ-글루탐산을 생산하는 세균 및 ｌ-글루탐산의 생산방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20020003519A
KR20020003519A KR1020010039749A KR20010039749A KR20020003519A KR 20020003519 A KR20020003519 A KR 20020003519A KR 1020010039749 A KR1020010039749 A KR 1020010039749A KR 20010039749 A KR20010039749 A KR 20010039749A KR 20020003519 A KR20020003519 A KR 20020003519A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
dna
gene
trehalose
nucleotide sequence
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
KR1020010039749A
Other languages
English (en)
Other versions
KR100809856B1 (ko
Inventor
오타키히로미
나카무라쥰
이즈이히로시
나카마쓰쓰요시
Original Assignee
에가시라 구니오
아지노모토 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 에가시라 구니오, 아지노모토 가부시키가이샤 filed Critical 에가시라 구니오
Publication of KR20020003519A publication Critical patent/KR20020003519A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100809856B1 publication Critical patent/KR100809856B1/ko
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/90—Isomerases (5.)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C12P13/14—Glutamic acid; Glutamine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/13—Brevibacterium
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/15—Corynebacterium

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)

Abstract

L-글루탐산은, 예를 들어, 트레할로스-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 유전자, 말토올리고실트레할로스 신타제를 암호화하는 유전자 또는 이들 유전자 모두를 파괴함으로써 트레할로스 합성 능력이 감소되거나 제거된, L-글루탐산 생산 능력을 갖는 코리네형 세균을 배양하여 배지에서 L-글루탐산을 생산, 축적하고, 배지로부터 L-글루탐산을 수집함으로써 생산된다.

Description

Ｌ-글루탐산을 생산하는 세균 및 L-글루탐산의 생산방법{Bacterium producing L-glutamic acid and method for producing L-glutamic acid}
본 발명은 신규한 L-글루탐산을 생산하는 세균 및 이를 이용하는 발효에 의한 L-글루탐산의 생산 방법에 관한 것이다. L-글루탐산은 식료품, 약물 등에 있어서 중요한 아미노산이다.
통상적으로, L-글루탐산은, 브레비박테리움(Brevibacterium), 코리네박테리움 (Corynebacterium) 또는 마이크로박테리움(Microbacterium) 속 또는 이들의 돌연변이체 균주에 속하는 소위 L-글루탐산을 생산하는 코리네형 세균을 이용하는 발효 방법에 의해 주로 생산된다[참조 문헌: Amino Acid Fermentation, pp.195-215, Gakkai Shuppan Center, 1986].
발효에 의한 L-글루탐산의 생산에서, 트레할로스가 2차 산물로서 또한 생산된다는 사실은 공지되어 있다. 따라서, 생산된 트레할로스를 분해하거나 대사하는 기술이 개발되어 왔다. 이러한 기술은 트레할로스에 대한 증식 능력이 도입된 코리네형 세균을 이용하는 발효에 의한 아미노산의 생산 방법[참조: 일본 공개 특허공보 제5-276935호] 및 트레할로스 이화 효소를 암호화하는 유전자가 증폭된 코리네형 세균을 이용하는 발효에 의한 아미노산의 생산 방법[참조: 대한민국 특허공보 제165836호]을 포함한다. 그러나, L-글루탐산을 생산하는 세균에서 트레할로스 자체의 형성을 억제하는 방법은 공지되어있지 않다.
에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)에서, 트레할로스의 합성은 트레할로스-6-포스페이트 신타제에 의해 촉매된다. 상기 효소는 otsA 유전자에 의해 암호화되어 있는 것으로 공지되어 있다. 추가로, otsA 유전자가 파괴된 에스케리키아 콜라이 균주는 고삼투압 배지에서 거의 성장하지 못하는 것으로 보고 되어 있다[참조 문헌: H.M. Glaever, et al., J. Bacteriol., 170(6), 2841-2849 (1998)]. 그러나, otsA 유전자 파괴와 물질 생산 간의 관계는 공지되어 있지 않다.
이와 달리, treY 유전자가 브레비박테리움 세균 속에 속하는 세균 중의 브레비박테리움 헬볼럼(Brevibacterium helvolum)에 대하여 공지되어 있다 해도, 어떠한 otsA 유전자도 브레비박테리움 헬볼럼에 대하여 공지되어 있지않다. 미코박테리움(Mycobacterium) 세균 속에 속하는 세균에 대해서는, 트레할로스 생합성 경로의 효소를 암호화하는 유전자로서 otsA 유전자 및 treY 유전자와 상이한 treS 유전자(트레할로스 신타제(TreS))에 의해 암호화되는 생성물에 의해 촉매되는 반응을 통한 경로가 공지되어 있다[참조 문헌: De Smet K.A., et al., Microbiology, 146 (1), 199-208 (2000)]. 그러나, 상기 경로는 말토스를 기질로서 사용하며, 글루코스, 프럭토스 또는 수크로스를 출발 물질로서 사용하는 통상적인 L-글루탐산 발효와는 관련되지 않는다.
본 발명은, 코리네형 세균을 사용하는 발효에 의한 L-글루탐산 생산에 있어서 L-글루탐산의 생산 효율을 2차 산물로서의 트레할로스 생산을 억제하는 것을 통하여 개선시키는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 발명자들은 위에서 언급한 목적을 달성하기 위해 지속적으로 연구하였다. 그 결과, 본 발명자들은 브레비박테리움 속에 속하는 세균은 미코세균 투베르쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 같이 otsA 유전자 및 treY 유전자를 포함하고, L-글루탐산의 생산 효율은 하나 이상의 이들 유전자를 파괴함으로써 개선시킬 수 있다는 것을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명에 의해 다음의 세균이 제공된다.
1) 세균내 트레할로스 합성 능력이 감소되거나 결실된, L-글루탐산 생산 능력을 갖는 코리네형 세균.
2) 트레할로스 합성 경로의 효소를 암호화하는 염색체 유전자내에 돌연변이 를 도입시키거나 당해 유전자를 파괴시킴에 의해 트레할로스 합성 능력이 감소되거나 결실된, (1)에 따르는 코리네형 세균.
3) 트레할로스 합성 경로의 효소를 암호화하는 유전자가 트레할로스-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 유전자, 말토올리고실트레할로스 신타제를 암호화하는 유전자 또는 이들 유전자 둘다로 이루어진, (2)에 따르는 코리네형 세균.
4) 트레할로스-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 유전자가 서열 30의 아미노산 서열을 암호화하고, 말토올리고실트레할로스 신타제를 암호화하는 유전자가서열 32의 아미노산 서열을 암호화하는 (3)에 따르는 코리네형 세균.
5) (1) 내지 (4) 중의 어느 하나에 따르는 코리네형 세균을 배지에서 배양하여 배지중에 L-글루탐산을 생산하고 축적하여 상기 배지로부터 L-글루탐산을 수득함을 포함하는, L-글루탐산의 생산 방법.
6) 다음의 A) 또는 B)에서 정의되는 단백질을 암호화하는 DNA:
A) 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
B) 하나 또는 수개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가를 포함하고 트레할로스-6-포스페이트 신타제 활성을 갖는 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 단백질.
7) 다음의 a) 또는 b)에서 정의되는, (6)에 따르는 DNA:
a) 서열 29의 뉴클레오타이드 서열의 484번 내지 1938번 뉴클레오타이드 잔기를 적어도 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA,
b) 엄격한 조건(stringent condition)하에서 서열 29의 뉴클레오타이드 서열의 484번 내지 1938번 뉴클레오타이드 잔기를 적어도 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화 가능하고 상기 뉴클레오타이드 서열과 55% 이상의 상동성을 나타내며, 트레할로스-6-포스페이트 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
8) 다음의 A) 또는 B)에서 정의되는 단백질을 암호화하는 DNA:
A) 서열 32의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
B) 하나 또는 수 개의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가를 포함하고 말토올리고실트레할로스 신타제 활성을 갖는 서열 32의 아미노산 서열을 갖는단백질.
9) 다음의 a) 또는 b)에서 정의되는, (8)에 따르는 DNA:
a) 서열 31의 뉴클레오타이드 서열의 82번 내지 2514번 뉴클레오타이드 잔기를 적어도 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA,
b) 엄격한 조건하에서, 서열 31의 뉴클레오타이드 서열의 82번 내지 2514번 뉴클레오타이드 잔기를 적어도 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화 가능하고, 위의 뉴클레오타이드 서열과 60% 이상의 상동성을 나타내며, 말토올리고실트레할로스 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
트레할로스-6-포스페이트 신타제 활성은, α,α-트레할로스-6-포스페이트 및 UDP가 UDP-글루코스 및 글루코스-6-포스페이트로부터 생성되는 반응을 촉매하는 활성을 의미하고, 말토올리고실트레할로스 신타제 활성은 말토트리오실트레할로스가 말토펜토스로부터 생성되는 반응을 촉매하는 활성을 의미한다.
본 발명에 있어서, 코리네형 세균을 사용하는 발효에 의한 L-글루탐산 생산에 있어서 L-글루탐산의 생산 효율은 2차 산물로서의 트레할로스의 생산 억제를 통하여 개선될 수 있다.
이후에, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 코리네형 세균은 트레할로스 합성 능력이 감소되거나 결실된, L-글루탐산 생산 능력을 갖는 코리네형 세균이다.
본 발명에서 언급되는 코리네형 세균은, 산 내성 및 포자 형성 능력을 갖지 않는 호기성 그람-양성 간균인, 문헌[참조 문헌: Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8th edition, p.599 (1974)]에서 정의된 바와 같은 미생물 그룹을 포함한다. 이제까지, 이들 미생물 그룹은 브레비박테리움 속으로 분류되었지만, 현재는 코리네박테리움 속으로 통합되었으며[참조 문헌: Int. J. Syst. Bacteriol., 41, 255 (1981)], 코리네박테리움 속과 밀접하게 관련있는 브레비박테리움 또는 마이크로박테리움 속에 속하는 세균을 포함한다. 이러한 코리네형 세균의 예는 다음과 같이 언급된다:
코리네박테리움 아세토액시도필럼(Corynebacterium acetoacidophilum)
코리네박테리움 아세토글루타미컴(Corynebacterium acetoglutamicum)
코리네박테리움 알카놀리티컴(Corynebacterium alkanolyticum)
코리네박테리움 칼루내(Corynebacterium callunae)
코리네박테리움 글루타미컴(Corynebacterium glutamicum)
코리네박테리움 릴리엄(Corynebacterium lilium: 코리네박테리움 글루타미컴)
코리네박테리움 멜라세콜라(Corynebacterium melassecola)
코리네박테리움 서모아미노제네스(Corynebacterium thermoaminogenes)
코리네박테리움 헤르쿨리스(Corynebacterium herculis)
브레비박테리움 디바리카툼(Brevibacterium divaricatum: 코리네박테리움 글루타미컴)
브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum: 코리네박테리움 글루타미컴)
브레비박테리움 이마리오필럼(Brevibacterium immariophilum)
브레비박테리움 락토퍼멘텀((Brevibacterium lactofermentum: 코리네박테리움 글루타미컴)
브레비박테리움 로세움(Brevibacterium roseum)
브레비박테리움 사카롤리티컴(Brevibacterium saccharolyticum)
브레비박테리움 티오제니탈리스(Brevibacterium thiogenitalis)
브레비박테리움 암모니아제네스(Brevibacterium ammoliagenes: 코리네박테리움 암모니아제네스)
브레비박테리움 알붐(Brevibacterium album)
브레비박테리움 세리엄(Brevibacterium cerium)
마이크로박테리움 암모니아필럼(Microbacterium ammoniaphilum).
특히, 다음의 균주를 예로 들 수 있다.
코리네박테리움 아세토액시도필럼 ATCC 13870
코리네박테리움 아세토글루타미컴 ATCC 15806
코리네박테리움 알카놀리티컴 ATCC21511
코리네박테리움 칼루내 ATCC 15991
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13020, 13032, 13060
코리네박테리움 릴리엄(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC 15990
코리네박테리움 멜라세콜라 ATCC 17965
코리네박테리움 서모아미노제네스 AJ12340(FERM BP-1539)
코리네박테리움 헤르쿨리스 ATCC13868
브레비박테리움 디바리카텀(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC 14020
브레비박테리움 플라붐(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC 13826, ATCC14067
브레비박테리움 이마리오필럼 ATCC14068
브레비박테리움 락토퍼멘텀(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC 13665, ATCC 13869
브레비박테리움 로세움 ATCC 13825
브레비박테리움 사카롤리티컴 ATCC 14066
브레비박테리움 티오제니탈리스 ATCC 19240
브레비박테리움 암모니아제네스(코리네박테리움 글루타미컴) ATCC 6871
브레비박테리움 알붐 ATCC 15111
브레비박테리움 세리엄 ATCC 15112
마이크로박테리움 암모니아필럼 ATCC 15354.
위에서 언급한 바와 같은 이러한 코리네형 세균의 트레할로스 합성 능력은 돌연변이유발 처리 또는 유전자 재조합 기술을 사용하여 트레할로스 합성 경로의 효소를 암호화하는 유전자를 돌연변이유발시키거나 파괴함으로써 감소시키거나 결실시킬 수 있다. 이러한 돌연변이는 트레할로스 합성 경로의 효소를 암호화하는 유전자의 전사 또는 해독을 억제하는 돌연변이, 또는 트레할로스 합성 경로의 효소의 제거 또는 감소를 유발하는 돌연변이일 수 있다. 트레할로스 합성 경로의 효소는 트레할로스-6-포스페이트 신타제, 말토올리고실트레할로스 신타제 또는 이들 효소 둘다를 예로 들 수 있다.
트레할로스 합성 경로의 효소를 암호화하는 유전자의 파괴는 동종 재조합을 사용하는 유전자 치환에 의해 수행할 수 있다. 트레할로스 합성 경로의 효소를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA를 사용하여 코리네형 세균을 형질전환함으로써 코리네형 세균 염색체상의 유전자를 파괴하여 효소의 일부를 결실시킬 수 있으며, 따라서 트레할로스 합성 경로의 효소는 정상적인 기능을 하지 못하며(결실형 유전자), 염색체상의 결실형 유전자와 정상 유전자 간의 재조합이 일어난다. 이러한 동종 재조합에 의한 유전자 파괴는 이미 확립되어 있다. 이 때문에, 코리네형 세균 중에서 복제하지 않는 선형 DNA 또는 환상 DNA를 사용하는 방법 및 온도 민감성 복제 오리진을 함유하는 플라스미드를 사용하는 방법을 언급할 수 있다. 그러나, 코리네형 세균내에서 복제하지 않는 환상 DNA 또는 온도 민감성 복제 오리진을 함유하는 플라스미드를 사용하는 방법이 바람직하다.
트레할로스 합성 경로의 효소를 암호화하는 유전자에는 예를 들어, otsA 유전자 또는 treY 유전자가 있으며, 이들 유전자 둘다로 이루어질 수도 있다. 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 otsA 유전자 및 treY의 뉴클레오타이드 서열 및 이의 플랭킹 영역이 본 발명에 의해 유추되며, 이들 유전자들은 당해 서열을 기초로 한 프라이머를 작제하고 프라이머 및 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 염색체 DNA를 주형으로 사용하여 PCR[폴리머라제 연쇄 반응, 참조 문헌: White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)]을 수행함으로써 쉽게 수득할 수 있다.
이후에 기술하는 실시예에서 수득되는 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 otsA 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열 및 treY 유전자를 포함하는 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열 29 및 31에 나타낸다. 추가로, 이들 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화되는 아미노산 서열은 각각 서열 30 및 32에 나타낸다.
각각의 otsA 유전자 및 treY 유전자는 하나 또는 수 개의 아미노산의 하나 또는 대다수의 위치에서의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가를 포함하는 단백질을 암호화하는 유전자가 될 수 있으며, 단, 이에 의해 암호화된 트레할로스-6-포스페이트 신타제 또는 말토올리고실트레할로스 신타제의 활성이 변질되지 않아야 한다. "몇개의" 아미노산의 수가 3차 구조 단백질의 아미노산 잔기의 위치 또는 유형에 따라 상이하며, 상이한 아미노산의 수는 바람직하게는 1 내지 40개, 보다 바람직하게는 1 내지 20개, 추가로 바람직하게는 1 내지 10개이다.
상기에서 기술한 트레할로스-6-포스페이트 신타제 또는 말토올리고실트레할로스 신타제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는 예를 들어, 각각의 뉴클레오타이드 서열을 예를 들어, 부위특이적 돌연변이유발법에 의해 변형시켜 특정 부위의 하나 이상의 아미노산 잔기가 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위를 포함하도록 함으로써 수득될 수 있다. 또한, 상기에서 기술한 바와 같이 변형된 DNA는 통상적으로 공지된 돌연변이 처리에 의해 수득할 수 있다. 돌연변이 처리는, 트레할로스-6-포스페이트 신타제 또는 말토올리고실트레할로스를 암호화하는 DNA를 시험관내에서 예를 들어, 하이드록실아민으로 처리하는 방법 및 미생물, 예를 들어, 트레할로스-6-포스페이트 신타제 또는 말토올리고실트레할로스를 암호화하는DNA를 갖는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 자외선 조사 또는 돌연변이 처리에서 통상적으로 사용되는 돌연변이유발원(예:N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘 (NTG) 및 질산)으로 처리하는 방법을 포함한다.
상기에서 기술한 바와 같은 뉴클레오타이드의 치환, 결실, 삽입, 첨가 또는 역위는, 예를 들어, 개별적인 차이 또는 트레할로스-6-포스페이트 신타제 또는 말토올리고실트레할로스를 갖는 미생물 종 또는 속의 차이를 기초로 하는 천연 발생 돌연변이주 또는 변이주를 또한 포함한다.
상기에서 기술한 바와 같은 트레할로스-6-포스페이트 신타제 또는 말토올리고실트레할로스 신타제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 상기에서 기술한 바와 같이 돌연변이된 이러한 DNA를 적합한 세포내에서 발현시키고 발현 생성물의 트레할로스-6-포스페이트 신타제 활성 또는 말토올리고실트레할로스 신타제의 활성을 조사함으로써 수득할 수 있다.
또한, 트레할로스-6-포스페이트 신타제와 매우 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들어, 서열 29에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 484 내지 1938번 뉴클레오타이드에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 또는 엄격한 조건하에서 뉴클레오타이드 서열로부터 작제할 수 있으며, 위에서 언급한 뉴클레오타이드 서열과 55% 이상, 바람직하게는 65% 이상, 보다 바람직하게는 75% 이상의 상동성을 나타내고, 돌연변이된 트레할로스-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 DNA 또는 이를 포함하는 세포로부터의 트레할로스-6-포스페이트 신타제 활성을 갖는 프로브를 갖는 DNA와 하이브리드화 가능한 DNA를 분리함으로써 수득할 수 있다. 유사하게는, 말토올리고실트레할로스 신타제와 실질적으로 동일한 단백질을 암호화하는 DNA는, 예를 들어, 서열 31에 나타낸 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 82번 내지 2514번에 상응하는 뉴클레오타이드 서열 또는 엄격한 조건하에서 뉴클레오타이드 서열로부터 작제할 수 있으며, 상술한 뉴클레오타이드 서열에 대해 60% 이상, 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 나타내고, 돌연변이된 말토올리고실트레할로스 신타제를 암호화하는 DNA 또는 이를 갖는 세포로부터의 말토올리고실트레할로스 신타제 활성을 갖는 프로브를 갖는 DNA와 하이브리드화 가능한 DNA를 분리함으로써 수득할 수 있다.
본원에서, "엄격한 조건"은 소위 특이적 하이브리드가 형성되며 비-특이적 하이브리드는 형성되지 않는 조건이다. 이러한 조건은 수치로 명확히 표현하는 것은 어렵다. 그러나, 예를 들어, 엄격한 조건은 높은 상동성을 갖는 DNA, 예를 들어, 55% 이상, 바람직하게는 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA가 서로 하이브리드화 되며, 상기한 수준보다 낮은 상동성을 갖는 DNA는 서로 하이브리드화되지 않는 조건을 포함한다. 또한, 엄격한 조건의 예에는 DNA가 서던 하이브리드화(Southern hybridization)에서의 세척액의 표준조건(즉, 1×SSC, SDS 0.1%, 바람직하게는 60℃에서 0.1×SSC, SDS 0.1%)에 상응하는 염 농도에서 서로 하이브리드화되는 조건이 있다.
프로브로서는, 각각의 유전자의 일부 서열을 또한 사용할 수 있다. 이러한 프로브는, 각각의 유전자의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여 제조된 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로서 사용하고 각각의 유전자를 함유한 DNA 단편을 주형으로서사용하는 PCR에 의해 제조할 수 있다. 약 300bp 길이의 DNA 단편을 프로브로서 사용하는 경우, 하이브리드화를 위한 세척액 조건은 50℃, 2×SSC 및 0.1% SDS로 이루어질 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같이, 이러한 조건하의 하이브리드화 가능한 유전자는, 유전자의 암호화 영역에서 발생하는 종결 코돈을 갖는 유전자 및 활성 중심부의 돌연변이로 인해 활성을 갖지 않는 유전자를 포함한다. 그러나, 이러한 돌연변이주는 각각의 유전자를 시판되는 발현 벡터와 연결시키고 트레할로스-6-포스페이트 활성 또는 말토올리고실트레할로스 신타제 활성을 측정함으로써 쉽게 제거할 수 있다.
otsA 유전자 또는 treY 유전자를 코리네형 세균 염색체상에서 이들 유전자를 파괴하기 위해 사용하는 경우, 암호화된 트레할로스-6-포스페이트 신타제 또는 말토올리고실트레할로스 신타제가 이의 활성을 갖을 필요는 없다. 또한, 유전자 파괴용으로 사용되는 otsA 유전자 또는 treY 유전자는, 이들이 코리네형 세균의 이들 유전자와 동종 재조합 할 수 있다면, 다른 미생물로부터 유도된 유전자도 가능하다. 예를 들어, 에스케리키아 또는 미코박테리움에 속에 속하는 세균의 otsA 유전자, 알트로박터, 브레비박테리움 헬볼룸 또는 리조비엄 속에 속하는 세균의 treY 유전자를 언급할 수 있다.
otsA 유전자 또는 treY 유전자의 결실형 유전자는, 제한효소(들)를 사용하여 이들 유전자의 하나 또는 일부를 함유하는 DNA 단편으로부터 일정 영역을 절단시켜 암호화 영역 또는 발현 조절 서열(예:프로모터)의 일부를 적어도 결실시킴으로써작제할 수 있다.
추가로, 결실형 유전자는 유전자의 일부가 결실되도록 디자인된 프라이머를 사용하는 PCR을 수행함으로써 또한 수득할 수 있다. 게다가, 결실형 유전자는 단일 뉴클레오타이드 돌연변이, 예를 들어, 프레임 쉬프트 돌연변이에 의해 수득할 수 있다.
otsA 유전자의 유전자 파괴는 이후에 설명한다. treY 유전자의 유전자 파괴도 이와 유사하게 수행할 수 있다.
숙주 염색체상의 otsA 유전자는 하기와 같이 결실형 otsA 유전자로 대체할 수 있다. 즉, 결실형 otsA 유전자 및 약물, 예를 들어, 가나마이신, 클로람페니콜, 테트라사이클린 및 스트렙토마이신 내성용 마커 마커 유전자(marker gene)를 코리네형 세균내에서 자가 복제할 수 없는 플라스미드내에 삽입하여 재조합 DNA를 작제한다. 코리네형 세균을 재조합 DNA로 형질전환시킬 수 있으며 형질전환 균주를 약물을 함유한 배지에서 배양하여 재조합 DNA가 염색체 DNA내로 도입된 형질전환 균주를 수득할 수 있다. 또한, 이러한 형질전환 균주는 플라스미드로서 온도 민감성 플라스미드를 사용하고 온도 민감성 플라스미드가 복제할 수 없는 온도에서 형질전환체를 배양함으로써 수득할 수 있다.
상기에서 기술한 바와 같이, 재조합 DNA가 염색체로 삽입된 균주에서, 재조합 DNA는 염색체상에 원래 존재하는 otsA 유전자 서열과 재조합하며, 염색체 otsA 및 결실형 otsA 유전자를 포함하는 2개의 융합된 유전자가 염색체내에 삽입됨으로써 재조합 DNA의 또 다른 부분(벡터 부분 및 약물 내성 마커 유전자)이 이들 사이에 위치한다.
이어서, 염색체 DNA에 결실형 otsA 유전자만을 남기기 위해, otsA 유전자의 하나의 카피를 2개의 otsA 유전자의 재조합에 의해 (약물 내성 마커 유전자를 포함하는) 벡터 부분과 함께 염색체 DNA로부터 제거한다. 이러한 경우, 정상 otsA 유전자가 염색체 DNA 상에 남겨지며 결실형 otsA 유전자는 절단되거나, 이와 반대로, 결실형 otsA 유전자가 염색체 DNA 상에 남겨지며 정상 otsA 유전자는 제거된다. 어떠한 유형의 유전자가 염색체 DNA 상에 남겨져 있는지는 PCR, 하이브리드화 또는 이와 유사한 방법을 사용하여 염색체상의 otsA 유전자의 구조를 조사함으로써 확인할 수 있다.
본 발명을 위해 사용되는 코리네형 세균은, 이의 트레할로스 합성 능력이 결실되거나 제거되는 것 이외에, L-글루탐산의 생합성을 촉매하는 효소의 활성이 증진된다. L-글루탐산 생합성을 촉매하는 효소의 예에는 글루타메이트 데하이드로게나제, 글루타민 신테타제, 글루타메이트 신타제, 이소시트레이트 데하이드로게나제, 아코니테이트 하이드라타제, 시트레이트 신타제, 피루베이트 카복실라제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 포스포에놀피루베이트 신타제, 에놀라제, 포스포글리세로뮤타제, 포스포글리세레이트 키나제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 프럭토스 비스포스페이트 알돌라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스 포스페이트 이소머라제 등이 포함된다.
또한, 본 발명을 위해 사용되는 코리네형 세균 중에서, L-글루탐산의 생합성 경로로부터 분기됨으로써, L-글루탐산 이외의 화합물을 생성하는 반응을 촉매하는효소를 제거하거나 결손시킬 수 있다. 이러한 효소의 예에는 α-케토 글루타레이트 데하이드로게나제, 이소시트레이트 리아제, 포스페이트 아세틸트랜스페라제, 아세테이트 키나제, 아세토하이드록시메이트 신타제, 아세토락테이트 신타제, 포르메이트 아세틸트랜스퍼라제, 락테이트 데하이드로게나제, L-글루타메이트 데카복실라제, 1-피롤린 데하이드로게나제 등이 포함된다.
게다가, 비오틴 활성 억제 물질(예: 표면활성제)에 대한 온도 민감성 돌연변이를 L-글루탐산 생산 능력을 갖는 코리네형 세균중에 도입함으로써, 세균은 비오틴 활성 억제 물질의 부재하의 과량의 비오틴을 함유하는 배지에서 L-글루탐산을 생산할 수 있게된다[참조: 제WO96/016180호]. 이러한 코리네형 세균으로서는, 제WO96/06180호에 공개되어 있는 브레비박테리움 락토퍼멘텀 AJ13029 균주를 언급할 수 있다. AJ13029 균주는 1994년 9월 2일자로 통상산업성 공업기술원 산하 생명공학공업기술연구소[현재는 비독립 행정 법인인 National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, 국제 특허 생물 기탁기관(우편 번호: 305-5466, 일본 이바라키켄 쓰쿠바시 1-1 히가시 1-초메)]에 기탁하였으며 기탁 번호 FERM P-14501을 부여받았다. 이어서, 이를 부다페스트 조약이 정한 규칙하에 1995년 8월 1일자로 국제 기탁기관으로 이전하였으며 기탁 번호 FERM BP-5189를 부여받았다.
트레할로스 합성 능력이 감소되거나 결실된, L-글루탐산 생산 능력을 갖는 코리네형 세균을 적합한 배지에서 배양하는 경우, L-글루탐산은 배지에 축적된다.
L-글루탐산 생산을 위해 사용하는 배지는 탄소원, 질소원, 무기 이온 및 기타 필수 미량 영양소를 함유한다. 탄소원으로서, 당(예: 글루코스, 락토스, 갈락토스, 프럭토스, 수크로스, 말토스, 블랙스트랩 당밀 및 전분 가수분해물); 알콜(예: 에탄올 및 이노시톨); 또는 유기산(예: 아세트산, 푸마르산, 시트르산 및 석신산)을 사용할 수 있다.
질소원으로서, 무기 암모늄 염(예: 황산암모늄, 질산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄 및 암모늄 아세테이트), 암모니아, 유기 질소(예: 펩톤, 육즙, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 대두 가수분해물, 암모니아 기체, 수성 암모니아 등)을 사용할 수 있다.
무기 이온으로서(또는 이의 이온원으로서), 소량의 인산칼륨, 황산마그네슘, 철 이온, 망간 이온등을 첨가한다. 유기 미량 영양소에 대해서는, 적합한 요구량의 필수 물질(예: 비타민 B1, 효물 추출물 등)을 첨가하는 것이 바람직하다.
바람직하게는, 배양은 통기를 위한 진탕 및 교반 또는 이와 유사한 방법을 사용하여 16 내지 72시간 동안 수행하는 호기성 조건하에서 수행한다. 배양 온도는 30 내지 40℃가 되도록 조절하고, PH는 배양 동안 5 내지 9가 되도록 조절한다. 이러한 PH로 조절하기 위해, 유기 또는 무기 산성 또는 알칼리성 물질, 암모니아 기체 등을 사용할 수 있다.
예를 들어, 이온 교환 수지, 결정화 등을 사용하는 방법에 의해 발효 브로쓰로부터 L-글루탐산을 수집할 수 있다. 상세하게는, L-글루탐산을 음이온 교환 수지에 흡착시켜 이로부터 분리시킬 수 있거나, 중화에 의해 결정화할 수 있다.
실시예
본 발명은 이후에 하기 실시예를 참조로 하여 보다 상세하게 설명된다
실시예 1: 브레비박테리움 락토퍼멘텀의 otsA 유전자가 파괴된 균주의 작제
<1> otsA 유전자의 클로닝
브레비박테리움 락토퍼멘텀의 otsA 유전자가 공지되어있지 않기 때문에, 이는 또 다른 미생물 otsA 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 참조로 사용하여 수득한다. 이제까지, 에스케리키아 및 미코박테리움의 otsA 유전자를 이의 전체 뉴클레오타이드 서열에 대해서 유추한 바 있다[참조 문헌: Kaasen I., et al., Gene, 145 (1), 9-15 (1994); De Smet K.A., et al., Microbiology, 146 (1), 199-208 (2000)]. 따라서, 상기 뉴클레오타이드 서열로부터 유추한 아미노산 서열을 참조로, PCR용 DNA 프라이머 P1(서열 1) 및 P2(서열 2)를 먼저 합성한다. DNA 프라이머 P1 및 P2는 에스케리키아 콜라이 otsA 유전자(GenBank accession X69160)의 뉴클레오타이드 서열의 뉴클레오타이드 1894번 내지 1913번 및 2531번 내지 2549번의 영역에 각각 상응한다. 또한, 상기 프라이머는 미코박테리움 투베르쿨로시스(Genbank accession Z95390)의 otsA 유전자의 뉴클레오타이드 40499번 내지 40518번 및 41166번 내지 41184번 영역에 상응한다.
이어서, 프라이머 P1 및 P2를 사용하고 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하며, 한 사이클이 94℃에서 0.5분 동안, 50℃에서 0.5분 동안, 72℃에서 4분 동안의 반응으로 이루어지는 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행한다. 그 결과, 단일 종의 0.6kbp의 증폭된 단편을 수득한다. 상기 증폭된 단편을 오리지날 TA 클로닝 키트[Original TA Cloned Kit, 제조원: Invitrogen]를 사용하여 플라스미드 벡터 pCR2.1중으로 클로닝하여 pCotsA를 수득한다. 이어서, 클로닝된 단편의 뉴클레오타이드 서열을 측정한다.
상기에서 기술한 바와 같이 수득한 otsA 유전자 일부 단편의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, DNA 프라이머 P10(서열 8) 및 P12(서열 10)을 새롭게 합성하고 일부 단편에 플랭킹된 알지 못하는 영역을 인버스 PCR(inverse PCR)을 사용하여 증폭시킨다[참조 문헌: Triglia, T. et al., Nucleic Acids Res., 16, 81-86 (1998); Ochman H., et al., Genetics, 120, 621-623 (1988)]. 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869의 염색체 DNA를 제한 효소 BamHI, BglⅡ, ClaⅠ, HindⅢ, KpnⅠ, MluI, MunL, SalI 또는 XhoI로 절단하고 T4 DNA 리가제[제조원: Takara Shuzo]를 사용하여 자가 연결시킨다. 상기와 같이 수득된 DNA를 주형으로 사용하고 DNA 프라이머 P10 및 P12 사용하며, 한 사이클이 94℃에서 0.5분 동안, 55℃에서 1분 동안 및 72℃에서 4분 동안의 반응으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행한다. 그 결과, ClaⅠ또는 BglⅡ을 제한효소로서 사용하는 경우, 각각의 경우에서 증폭된 단편 4kb를 수득한다. 상기 증폭된 단편의 뉴클레오타이드 서열을 DNA 프라이머 P5 내지 P9(서열 3 내지 7) 및 P11 내지 P15(서열 9 내지 13)를 사용함으로써 직접 측정한다. 따라서, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869의 otsA 유전자의 전체 뉴클레오타이드 서열은 서열 29에 나타낸 바와 같다. 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열 29 및 30에 나타낸다.
상기에서 언급한 otsA 유전자 서열의 상동성을 에스케리키아 콜라이(GenBank accession X69610)의 otsA 유전자 및 미코박테리움 투베르쿨로시스(GenBank accession Z95390)에 관해서 측정하는 경우, 뉴클레오타이드 서열은 각각 46.3% 및 55.9%의 상동성을 나타내며 아미노산 서열은 각각 30.9% 및 51.7%의 상동성을 나타낸다. 상동성은 리프만-퍼슨법(Lipman-Person method)에 기반하여, 소프트웨어, "GENETIX-WIN"(Software Development)를 사용하여 산출한다[참고 문헌: Science, 227, 1435-1441 (1985)].
<2> otsA 유전자 파괴용 플라스미드의 작제
코리네형 세균중의 트레할로스 생합성 경로의 효소를 암호화하는 유전자의 파괴에 의한 L-글루탐산 생산력에서의 개선효과 여부를 조사하기 위해, otsA 유전자 파괴용 플라스미드를 작제한다. otsA 유전자 파괴용 플라스미드의 작제는 하기와 같다. otsA 유전자를 클로닝하여 주형으로서 이미 작제한 플라스미드 pCotsA, 및 ClaⅠ부위를 포함하는 프라이머 P29(서열 33) 및 P30(서열 34)을 사용하여, 94℃에서 0.5분 동안, 55℃에서 0.5분 동안 및 72℃에서 8분 동안의 반응으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행한다. 증폭된 단편을 ClaⅠ로 분해하고, T4 DNA 폴리머라제(Takara Shuzo)를 사용하여 평활 말단이 되도록하며, T4 리가제(Takara Shizo)를 사용하여 자가 연결시켜 대략 이의 중심 부분에 프레임 쉬프트 돌연변이(frame shift mutation: 서열 29의 1258번 내지 1300번 뉴클레오타이드가 결실됨)된 otsA 유전자를 포함하는 플라스미드 pCotsAC를 작제한다.
<3> otsA 유전자가 파괴된 균주의 작제
유전자 파괴용 pCotsAC를 사용하여, L-글루탐산 생산 세균, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869를 전기 펄스 방법으로 형질전환시키고, 형질전환체를 가나마이신 20mg/L을 함유하는 CM2B 배지에서의 성장 능력에 따라서 선별한다. otsA 유전자 파괴용 플라스미드 pCotsA는 브레비박테리움 락토퍼멘텀에서 기능할 수 있는 복제 오리진을 가지고 있지 않기 때문에, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 염색체상의 otsA 유전자와 유전자 파괴용 플라스미드 pCotsAC 간에서 발생하는 동종 재조합을 공급하는 플라스미드를 사용하여 형질전환체를 수득한다. 상기에서 기술한 바와 같이 수득한 동종 재조합 균주로부터, 유전자 파괴용 플라스미드 pCotsAC의 벡터 부분이 동종 재조합의 재발생으로 인해 제거된 균주를 마커로서 획득된 가나마이신 민감성을 기반으로하여 선별한다.
상기에서 기술한 바와 같이 수득한 균주로부터, 목적하는 프레임 쉬프트 돌연변이가 도입된 균주를 선별한다. 이러한 균주의 선별은 가나마이신 민감성으로 된 균주로부터 주형으로서 추출한 염색체 DNA 및 DNA 프라이머 P8(서열 14) 및 P13(서열 11)을 사용하고, 한 사이클이 94℃에서 0.5분 동안, 55℃에서 0.5분 동안 및 72℃에서 1분 동안의 반응으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행하며, DNA 프라이머 P8을 사용하여 수득한 단편을 서열분석하고 프레임 쉬프트 돌연변이의 도입에 의해 otsA 유전자가 파괴되었음을 확인한다. 상기에서 기술한 바와 같이 수득한 균주를 ΔOA 균주로 명명한다.
실시예 2: treY 유전자가 파괴된 균주의 작제
<1> treY 유전자의 클로닝
브레비박테리움 락토퍼멘텀의 treY 유전자가 공지되어있지 않기 때문에, 이는 또 다른 미생물 treY 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 참조로 사용하여 수득한다. 이제까지, treY 유전자의 뉴클레오타이드 서열을 알트로박터, 브레비박테리움 및 리조비엄 속에 대하여 유추한 바 있다[참조 문헌: Maruta K., et al., Biochim. Biophys. Acta, 1289 (1), 10-13 (1996); Genbank accession AF039919; Maruta k., et al., Biosci. Biotechnol. Biochem., 60 (4), 717-720 (1996)]. 따라서, 상기 뉴클레오타이드로부터 유추한 아미노산 서열의 경우에는, PCR용 DNA 프라이머 P3(서열 14) 및 P4(서열 15)를 먼저 합성한다. DNA 프라이머 P3 및 P4는 알트로박터 종(GenBank accession D63343)의 treY 유전자 뉴클레오타이드 서열의 975번 내지 992번 뉴클레오타이드 및 2565번 내지 2584번 뉴클레오타이드 영역에 개별적으로 상응한다. 또한, 상기 프라이머는 브레비박테리움 헬볼럼(Genbank accession AF039919)의 treY 유전자의 893번 내지 910번 뉴클레오타이드 및 2486번 내지 2505번 뉴클레오타이드 영역에 각각 상응한다. 더욱이, 상기 프라이머는 리조비엄 종(GenBank accession D78001)의 treY 유전자의 뉴클레오타이드 862번 내지 879번 및 2452번 내지 2471번 영역에 상응한다.
이어서, 프라이머 P3 및 P4를 사용하고 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869의 염색체 DNA를 주형으로서 사용하며, 한 사이클이 94℃에서 0.5분 동안, 55℃에서 0.5분 동안, 72℃에서 2분 동안의 반응으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행한다. 그 결과, 실질적으로 동종인 1.6kbp의 증폭된 단편이 상당량수득된다.
상기 증폭된 단편을 "오리지날 TA 클로닝 키트[Original TA Cloned Kit, 제조원: Invitrogen]" 를 사용하여 플라스미드 벡터 pCR2.1내로 클로닝한다. 이어서, 약 0.6kb에 대한 뉴클레오타이드 서열을 측정한다.
상기에서 기술한 바와 같이 수득한 treY 유전자의 일부 단편의 뉴클레오타이드 서열에 기초하여, DNA 프라이머 P16(서열 16) 및 P26(서열 26)을 새롭게 합성하고 일부 단편에 플랭킹된 알지 못하는 영역을 "인버스 PCR(inverse PCR)"을 사용하여 증폭시킨다[참조 문헌: Triglia, T. et al., Nucleic Acids Res., 16, 81-86 (1998); Ochman H., et al., Genetics, 120, 621-623 (1988)]. 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869의 염색체 DNA를 제한 효소 BamHI, HindⅢ, SalI 또는 XhoI로 절단하고 T4 DNA 리가제(Takara Shuzo)를 사용하여 자가 연결시킨다. 상기와 같이 수득된 DNA를 주형으로서 사용하고 DNA 프라이머 P16 및 P26을 사용하며, 한 사이클이 94℃에서 0.5분 동안, 55℃에서 1분 동안 및 72℃에서 4분 동안의 반응으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행한다. 그 결과, HindⅢ 또는 SalⅠ을 제한 효소로서 사용하는 경우, 각각 0.6kbp 또는 1.5kbp의 증폭된 단편을 수득한다. 상기 증폭된 단편의 뉴클레오타이드 서열을 DNA 프라이머 P16 내지 P28(서열 16 내지 28)을 사용하여 직접 측정한다. 따라서, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869의 treY 유전자의 전체 뉴클레오타이드 서열은 서열 31에 나타낸 바와 같이 측정한다. 상기 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열은 서열 31 및 32에 나타낸다.
상기에서 언급한 treY 유전자 서열의 상동성을 알트로박터 종(GenBank accession D63343)의 treY 유전자, 브레비박테리움 헬볼럼(GenBank accession AF039919)의 treY 유전자 및 리조비엄 종(GenBank accession D78001)의 treY 유전자에 관해서 측정하는 경우, 뉴클레오타이드 서열은 각각 52.0%, 52.3% 및 51.9의 상동성을 나타내며 아미노산 서열은 각각 40.9%, 38.5% 및 39.8%의 상동성을 나타낸다. 상동성은 리프만-퍼슨법에 기반하여, 소프트웨어, "GENETIX-WIN"(Software Development)를 사용하여 산출한다[참고 문헌: SCIENCE, 227, 1435-1441 (1985)].
<2> treY 유전자 파괴용 플라스미드의 작제
코리네형 세균중의 트레할로스 생합성 경로의 효소를 암호화하는 유전자의 파괴에 의한 L-글루탐산 생산력의 개선효과 여부를 조사하기 위해, treY 유전자 파괴용 플라스미드를 작제한다. 첫째로, 프라이머 P17(서열 17) 및 P25(서열 25)을 사용하고 ATCC 13869를 주형으로서 사용하며, 한 사이클이 94℃에서 0.5분 동안, 60℃에서 0.5분 동안 및 72℃에서 2분 동안의 반응으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행한다. 증폭된 단편을 EcoRⅠ으로 절단하고, T4 리가제(Takara Shuzo)를 사용하여 EcoRⅠ으로 절단된 pHSG299(Takara Shuzo)에 연결하여 플라스미드 pHtreY를 수득한다. 또한, 상기 pHtreY는 AflⅡ(Takara Shuzo)로 절단하고, T4 DNA 폴리머라제(Takara Shizo)를 사용하여 평활 말단이 되도록하며, T4 리가제(Takara Shizo)를 사용하여 자가 연결시켜 대략 중심 부분에서 프레임 쉬프트 돌연변이된(4개의 뉴클레오타이드가 서열 31의 서열중 1145번째 뉴클레오타이드 뒤에 삽입된) treY 유전자를 포함하는 플라스미드 pHtreYA를 작제한다.
<3> treY 유전자가 파괴된 균주의 작제
유전자 파괴용 pCtreYA를 사용하여, L-글루탐산 생산 세균, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 ATCC 13869를 전기 펄스 방법으로 형질전환시키고, 형질전환체를 가나마이신 20mg/L을 함유하는 CM2B 배지에서의 성장 능력에 따라서 선별한다. treY 유전자 파괴용 플라스미드 pCtreYA는 브레비박테리움 락토퍼멘텀에서 기능할 수 있는 복제 오리진을 가지고 있지 않기 때문에, 브레비박테리움 락토퍼멘텀 염색체상의 treY 유전자와 유전자 파괴용 플라스미드 pCtreYA 간에서 발생하는 재조합을 제공하는 플라스미드를 사용하여 형질전환체를 수득한다. 상기에서 기술한 바와 같이 수득한 동종 재조합 균주로부터, 유전자 파괴용 플라스미드 pCtreYA의 벡터 부분이 동종 재조합의 재발생으로 인해 제거된 균주를 마커로써 획득된 가나마이신 민감성을 기초로하여 선별한다.
상기에서 기술한 바와 같이 수득한 균주로부터, 목적하는 프레임 쉬프트 돌연변이가 도입된 균주를 선별한다. 이러한 균주 선별은 DNA 프라이머 P19(서열 19) 및 P25(서열 25)를 사용하고, 한 사이클이 94℃에서 0.5분 동안, 55℃에서 0.5분 동안 및 72℃에서 1.5분 동안의 반응으로 이루어진 사이클을 30회 반복하는 PCR을 수행하며, DNA 프라이머 P21 또는 P23을 사용하여 수득한 단편을 서열분석하여 프레임 쉬프트 돌연변이의 도입에 의해 treY 유전자가 파괴되었음을 확인한다. 상기에서 기술한 바와 같이 수득한 균주를 ΔTA 균주로 명명한다.
실시예 3: ΔOA 균주 및 ΔTA 균주의 L-글루탐산 생산 능력의 평가
ATCC 13869 균주, ΔOA 균주 및 ΔTA 균주는 하기와 같이 L-글루탐산을 생산하기 위해 개별적으로 배양한다. 이들 각각의 균주를 CM2B 플레이트 배지에서 배양함으로써 보충하고, 각각의 보충된 균주를 글루코스 80g, KH2PO41g, MgSO40.4g, (NH4)2SO430g, FeSO4.7H2O 0.01g, MnSO4.7H2O 0.01g, 대두 가수분해물 용액 15㎖, 티아민 하이드로클로라이드 200㎍, 비오틴 3㎍ 및 (KOH를 사용하여 pH 8.0으로 조절된) 순수한 물 1ℓ중의 CaCO350g를 함유한 배지에서 31.5℃로 배양한다. 배양 후, 배지에 축적된 L-글루탐산의 양 및 51배 희석된 배양 브로쓰의 620nm에서의 흡광도를 측정한다. 결과는 표 1에 나타낸다.
otsA 유전자 또는 treY 유전자가 파괴된 브레비박테리움 락토퍼멘텀 균주의 성장도는 모 균주(parent strain)의 성장도와 유사하게 나타나며, 또한 L-글루탐산 생산은 모 균주와 비교하여 증가된 것으로 나타난다.
균주 OD620(x51) L-글루탐산(g/ℓ) 수율(%)
ATDD 13869 0.930 40.2 48.4
ΔOA 1.063 43.8 52.8
ΔTA 0.850 45.6 54.9
(서열 목록의 설명)
서열 1: otsA의 증폭용 프라이머 P1
서열 2: otsA의 증폭용 프라이머 P2
서열 3: 프라이머 P5
서열 4: 프라이머 P6
서열 5: 프라이머 P7
서열 6: 프라이머 P8
서열 7: 프라이머 P9
서열 8: 프라이머 P10
서열 9: 프라이머 P11
서열 10: 프라이머 P12
서열 11: 프라이머 P13
서열 12: 프라이머 P14
서열 13: 프라이머 P15
서열 14: treY 유전자의 증폭용 프라이머 P3
서열 15: treY 유전자의 증폭용 프라이머 P4
서열 16: 프라이머 P16
서열 17: 프라이머 P17
서열 18: 프라이머 P18
서열 19: 프라이머 P19
서열 20: 프라이머 P20
서열 21: 프라이머 P21
서열 22: 프라이머 P22
서열 23: 프라이머 P23
서열 24: 프라이머 P24
서열 25: 프라이머 P25
서열 26: 프라이머 P26
서열 27: 프라이머 P27
서열 28: 프라이머 P28
서열 29: otsA 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열 30: otsA의 아미노산 서열
서열 31: treY 유전자의 뉴클레오타이드 서열
서열 32: treY의 아미노산 서열
서열 33: 프라이머 P29
서열 34: 프라이머 P30
본 발명에 의해, 트레할로스 합성 능력이 감소되거나 제거된, L-글루탐산을 생산하는 세균을 사용하는 발효 방법으로 L-글루탐산을 고 수율로 생산할 수 있다.

Claims (9)

  1. 세균 내에서 트레할로스 합성 능력이 감소되거나 결실된, L-글루탐산 생산 능력을 갖는 코리네형 세균.
  2. 제1항에 있어서, 트레할로스 합성 능력이 트레할로스 합성 경로의 효소를 암호화하는 염색체 유전자 속으로 돌연변이를 도입하거나 당해 유전자를 파괴함으로써 감소되거나 결실되는 코리네형 세균.
  3. 제2항에 있어서, 트레할로스 생합성 경로의 효소를 암화화하는 유전자가 트레할로스-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 유전자, 말토올리고실트레할로스 신타제를 암호화하는 유전자 또는 이들 유전자 둘 다로 이루어지는 코리네형 세균.
  4. 제3항에 있어서, 트레할로스-6-포스페이트 신타제를 암호화하는 유전자가 서열 30의 아미노산 서열을 암호화하고, 말토올리고실트레할로스 신타제를 암호화하는 유전자가 서열 32의 아미노산 서열을 암호화하는 코리네형 세균.
  5. 제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 따르는 코리네형 세균을 배지에서 배양하여 배지에 L-글루탐산을 생산, 축적하는 단계 및
    당해 배지로부터 L-글루탐산을 수집하는 단계를 포함하는, L-글루탐산의 생산방법.
  6. 다음의 (A) 또는 (B)에서 정의되는 단백질을 암호화하는 DNA:
    (A) 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
    (B) 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가를 포함하고 트레할로스-6-포스페이트 신타제 활성을 갖는, 서열 30의 아미노산 서열을 갖는 단백질.
  7. 제6항에 있어서, 다음의 (a) 또는 (b)에서 정의되는 DNA:
    (a) 서열 29의 뉴클레오타이드 서열의 484번 내지 1938번 뉴클레오타이드 잔기를 적어도 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA,
    (b) 엄격한 조건(stringent condition)하에서 서열 29의 뉴클레오타이드 서열의 484번 내지 1938번 뉴클레오타이드 잔기를 적어도 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화 가능하고, 위의 뉴클레오타이드 서열과 55% 이상의 상동성을 나타내며, 트레할로스-6-포스페이트 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
  8. 다음의 (A) 또는 (B)에서 정의되는 단백질을 암호화하는 DNA:
    (A) 서열 32의 아미노산 서열을 갖는 단백질,
    (B) 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환, 결실, 삽입 또는 첨가를 포함하고 말토올리고실트레할로스 신타제 활성을 갖는 서열 32의 아미노산 서열을 갖는 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 다음의 (a) 또는 (b)에서 정의되는 DNA:
    (a) 서열 31의 뉴클레오타이드 서열의 82번 내지 2514번 뉴클레오타이드 잔기를 적어도 포함하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하는 DNA,
    (b) 엄격한 조건하에서 서열 31의 뉴클레오타이드 서열의 82번 내지 2514번 뉴클레오타이드 잔기를 적어도 포함하는 뉴클레오타이드 서열과 하이브리드화 가능하고, 위의 뉴클레오타이드 서열과 60% 이상의 상동성을 나타내며, 말토올리고실트레할로스 신타제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA.
KR1020010039749A 2000-07-05 2001-07-04 Ｌ-글루탐산을 생산하는 세균 및 ｌ-글루탐산의 생산방법 Expired - Lifetime KR100809856B1 (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2000-00204256 2000-07-05
JP2000204256A JP4304837B2 (ja) 2000-07-05 2000-07-05 Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20020003519A true KR20020003519A (ko) 2002-01-12
KR100809856B1 KR100809856B1 (ko) 2008-03-04

Family

ID=18701550

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020010039749A Expired - Lifetime KR100809856B1 (ko) 2000-07-05 2001-07-04 Ｌ-글루탐산을 생산하는 세균 및 ｌ-글루탐산의 생산방법

Country Status (13)

Country Link
US (3) US20020137150A1 (ko)
EP (1) EP1174508B1 (ko)
JP (1) JP4304837B2 (ko)
KR (1) KR100809856B1 (ko)
CN (4) CN1664106A (ko)
AT (1) ATE383427T1 (ko)
AU (1) AU784207B2 (ko)
BR (1) BR0102669A (ko)
DE (1) DE60132277T2 (ko)
MY (1) MY134051A (ko)
PE (1) PE20020212A1 (ko)
PL (1) PL348447A1 (ko)
RU (1) RU2276189C2 (ko)

Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU756507B2 (en) * 1998-03-18 2003-01-16 Ajinomoto Co., Inc. L-glutamic acid-producing bacterium and method for producing L-glutamic acid
JP4427878B2 (ja) 1999-08-20 2010-03-10 味の素株式会社 析出を伴う発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
DE60133304T2 (de) * 2000-11-17 2009-03-05 Cj Cheiljedang Corp. L-glutamine produzierende mikroorganismen und verfahren zur herstellung von l-glutamine unter verwendung derselben
EP1358337A1 (en) * 2001-01-30 2003-11-05 Degussa AG Nucleotide sequences which code for the otsa gene of c. glutamicum
JP4560998B2 (ja) * 2001-02-05 2010-10-13 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミンの製造法及びｌ−グルタミン生産菌
JP4599726B2 (ja) 2001-02-20 2010-12-15 味の素株式会社 Ｌ−グルタミン酸の製造法
DE10139062A1 (de) * 2001-08-09 2003-04-30 Degussa Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
US20030092139A1 (en) * 2001-08-09 2003-05-15 Degussa Ag Process for the fermentative preparation of L-amino acids using coryneform bacteria
DE10261579A1 (de) * 2002-12-23 2004-07-15 Basf Ag Verfahren zur Herstellung von Trehalose-freien Aminosäuren
JP2008283863A (ja) 2005-08-26 2008-11-27 Ajinomoto Co Inc Ｌ−アミノ酸生産菌及びｌ−アミノ酸の製造方法
DE102005047596A1 (de) * 2005-10-05 2007-04-12 Degussa Ag Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminosäuren unter Verwendung coryneformer Bakterien
KR100824457B1 (ko) * 2006-10-16 2008-04-22 씨제이제일제당 (주) 고농도의 글루탐산을 생산하는 미생물 및 이를 이용한글루탐산의 제조 방법
CN103305544B (zh) * 2013-07-05 2015-07-01 浙江海正药业股份有限公司 阿卡波糖工程菌及其制备方法和应用
CN107227304B (zh) * 2015-04-02 2019-06-04 湖南汇升生物科技有限公司 一种麦芽寡糖基海藻糖合成酶突变体的制备及其应用
CN112041455A (zh) 2018-04-27 2020-12-04 长濑产业株式会社 景天庚酮糖的制备方法
JP6917434B2 (ja) * 2019-10-25 2021-08-11 長瀬産業株式会社 好気性菌の代謝酵素破壊株およびその培養法
CN111172089A (zh) * 2020-02-14 2020-05-19 江南大学 一种利用重组海藻糖合成酶合成海藻糖的方法
CN116355924A (zh) * 2022-07-19 2023-06-30 江南大学 一种l-谷氨酸产量提高的谷氨酸棒杆菌的构建与应用

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR9203053A (pt) * 1991-08-07 1993-03-30 Ajinomoto Kk Processo para produzir acido l-glutamico pro fermentacao
DE4134450A1 (de) 1991-10-18 1993-04-22 Degussa Verfahren zur erhoehung der leistungsfaehigkeit aminosaeuren ausscheidender bakterien
JP3301140B2 (ja) * 1993-02-16 2002-07-15 味の素株式会社 発酵法によるｌ−グルタミン酸の製造法
WO1995034672A1 (en) * 1994-06-14 1995-12-21 Ajinomoto Co., Inc. α-KETOGLUTARIC DEHYDROGENASE GENE
KR0165836B1 (ko) 1995-12-29 1999-01-15 손경식 글루타민산의 제조방법, 유전자 재조합 플라스미드 및 미생물
FR2747131B1 (fr) * 1996-04-09 1998-06-26 Orsan Procede de production d'amino acide par fermentation de corynebacterie exprimant une activite trehalase
RU2107723C1 (ru) * 1996-09-16 1998-03-27 Государственный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ Штамм бактерий corynebacterium glutamicum в-7198-продуцент l-глютаминовой кислоты
MXPA01013123A (es) * 1999-06-25 2002-06-21 Basf Ag Genes de corynebacterium glutamicum que codifican proteinas de via metabolica.
DE19956686A1 (de) * 1999-11-25 2001-05-31 Degussa Neue für die Gene sucC und sucD codierende Nukleotidsequenzen
JP4623825B2 (ja) * 1999-12-16 2011-02-02 協和発酵バイオ株式会社 新規ポリヌクレオチド
CN100334213C (zh) 2000-12-22 2007-08-29 巴斯福股份公司 棒状杆菌基因
EP1358337A1 (en) 2001-01-30 2003-11-05 Degussa AG Nucleotide sequences which code for the otsa gene of c. glutamicum

Also Published As

Publication number Publication date
EP1174508A3 (en) 2002-05-02
PL348447A1 (en) 2002-01-14
MY134051A (en) 2007-11-30
BR0102669A (pt) 2002-03-05
JP4304837B2 (ja) 2009-07-29
JP2002017364A (ja) 2002-01-22
CN1763200A (zh) 2006-04-26
RU2276189C2 (ru) 2006-05-10
US20100124777A1 (en) 2010-05-20
DE60132277T2 (de) 2009-01-02
DE60132277D1 (de) 2008-02-21
ATE383427T1 (de) 2008-01-15
CN1335394A (zh) 2002-02-13
AU784207B2 (en) 2006-02-23
PE20020212A1 (es) 2002-04-09
US20020137150A1 (en) 2002-09-26
CN1664106A (zh) 2005-09-07
CN1935983A (zh) 2007-03-28
EP1174508A2 (en) 2002-01-23
US7307160B1 (en) 2007-12-11
CN1335394B (zh) 2012-11-28
AU5401901A (en) 2002-01-10
EP1174508B1 (en) 2008-01-09
KR100809856B1 (ko) 2008-03-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20100124777A1 (en) Bacterium producing L-glutamic acid and method for producing L-glutamic acid
EP1010755B1 (en) Method for producing L-Glutamic acid by fermentation
KR100838038B1 (ko) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용한 ｌ-라이신 생산 방법
EP0931833B1 (en) Method of producing L-serine by fermentation
US7846698B2 (en) Method of producing L-lysine
KR101126041B1 (ko) 트랜스포존을 이용한 형질전환용 벡터, 상기 벡터로형질전환된 미생물 및 이를 이용한 ｌ-라이신 생산방법
KR100674401B1 (ko) Ｌ-글루탐산-생성 세균 및 ｌ-글루탐산 제조 방법
EP0857784A2 (en) Method for producing L-lysine
EP0854189A2 (en) Method for producing L-lysine
JP4541347B2 (ja) Ｌ−リシン生産能の向上したコリネバクテリウム属微生物及びそれを利用したｌ−リシンの生産方法
EP2115135A1 (en) A microorganism of corynebacterium genus having enhanced l-lysine productivity and a method of producing l-lysine using the same
KR100789270B1 (ko) Ｌ-라이신 생산능이 향상된 코리네박테리움 속 미생물 및그를 이용하여 ｌ-라이신을 생산하는 방법
CN101010423A (zh) 生产l－谷氨酸的微生物和生产l－谷氨酸的方法
US8110381B2 (en) L-glutamic acid-producing bacterium and method for production of L-glutamic acid
EP1038970B1 (en) Method for producing L-glutamic acid

Legal Events

Date Code Title Description
PA0109 Patent application

Patent event code: PA01091R01D

Comment text: Patent Application

Patent event date: 20010704

PG1501 Laying open of application
A201 Request for examination
PA0201 Request for examination

Patent event code: PA02012R01D

Patent event date: 20060703

Comment text: Request for Examination of Application

Patent event code: PA02011R01I

Patent event date: 20010704

Comment text: Patent Application

E902 Notification of reason for refusal
PE0902 Notice of grounds for rejection

Comment text: Notification of reason for refusal

Patent event date: 20070528

Patent event code: PE09021S01D

E701 Decision to grant or registration of patent right
PE0701 Decision of registration

Patent event code: PE07011S01D

Comment text: Decision to Grant Registration

Patent event date: 20071129

GRNT Written decision to grant
PR0701 Registration of establishment

Comment text: Registration of Establishment

Patent event date: 20080227

Patent event code: PR07011E01D

PR1002 Payment of registration fee

Payment date: 20080228

End annual number: 3

Start annual number: 1

PG1601 Publication of registration
PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20110127

Start annual number: 4

End annual number: 4

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20120130

Start annual number: 5

End annual number: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130201

Year of fee payment: 6

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20130201

Start annual number: 6

End annual number: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20140204

Year of fee payment: 7

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20140204

Start annual number: 7

End annual number: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20150130

Year of fee payment: 8

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20150130

Start annual number: 8

End annual number: 8

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160127

Year of fee payment: 9

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20160127

Start annual number: 9

End annual number: 9

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170202

Year of fee payment: 10

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20170202

Start annual number: 10

End annual number: 10

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180219

Year of fee payment: 11

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20180219

Start annual number: 11

End annual number: 11

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190218

Year of fee payment: 12

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20190218

Start annual number: 12

End annual number: 12

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200218

Year of fee payment: 13

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20200218

Start annual number: 13

End annual number: 13

PR1001 Payment of annual fee

Payment date: 20210218

Start annual number: 14

End annual number: 14

PC1801 Expiration of term

Termination date: 20220104

Termination category: Expiration of duration