KR20020004089A - 리보솜 재활용 인자의 삼차원 구조 및 결정화 방법 - Google Patents
리보솜 재활용 인자의 삼차원 구조 및 결정화 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20020004089A KR20020004089A KR1020000037527A KR20000037527A KR20020004089A KR 20020004089 A KR20020004089 A KR 20020004089A KR 1020000037527 A KR1020000037527 A KR 1020000037527A KR 20000037527 A KR20000037527 A KR 20000037527A KR 20020004089 A KR20020004089 A KR 20020004089A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- rrf
- compound
- dimensional structure
- hydrophobic
- inhibitors
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Ceased
Links
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 title claims abstract description 19
- 108010037379 ribosome releasing factor Proteins 0.000 title description 274
- 101710102451 Ribosome-recycling factor Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 101710150195 Ribosome-recycling factor, chloroplastic Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 101710084690 Ribosome-recycling factor, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 116
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 79
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 78
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 63
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 claims abstract description 18
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 68
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 54
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 claims description 39
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 29
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 28
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 28
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 26
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 21
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 19
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 claims description 16
- WOQQAWHSKSSAGF-WXFJLFHKSA-N decyl beta-D-maltopyranoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 WOQQAWHSKSSAGF-WXFJLFHKSA-N 0.000 claims description 14
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims description 14
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 claims description 8
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 claims description 8
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 claims description 6
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims description 5
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 claims 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 abstract description 34
- 239000013078 crystal Substances 0.000 abstract description 31
- 238000013461 design Methods 0.000 abstract description 14
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 abstract description 9
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 abstract description 7
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 abstract description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 abstract description 4
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 44
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 43
- 239000000463 material Substances 0.000 description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 20
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 description 14
- 108020004566 Transfer RNA Proteins 0.000 description 13
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108010077742 Peptide Elongation Factor G Proteins 0.000 description 10
- 102000010562 Peptide Elongation Factor G Human genes 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 10
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 7
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 238000002441 X-ray diffraction Methods 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- 150000002611 lead compounds Chemical class 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 108010086507 peptide-chain-release factor 3 Proteins 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N mercury Chemical compound [Hg] QSHDDOUJBYECFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 3
- 238000012900 molecular simulation Methods 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100025698 Cytosolic carboxypeptidase 4 Human genes 0.000 description 2
- ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N Erythromycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](C)C(=O)O[C@@H]([C@@]([C@H](O)[C@@H](C)C(=O)[C@H](C)C[C@@](C)(O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@H](C[C@@H](C)O2)N(C)C)O)[C@H]1C)(C)O)CC)[C@H]1C[C@@](C)(OC)[C@@H](O)[C@H](C)O1 ULGZDMOVFRHVEP-RWJQBGPGSA-N 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002050 diffraction method Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 2
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 2
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 2
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 125000003071 maltose group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 238000000329 molecular dynamics simulation Methods 0.000 description 2
- 238000002887 multiple sequence alignment Methods 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 108020005098 Anticodon Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- -1 Asp amino acids Chemical class 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102100030667 Eukaryotic peptide chain release factor subunit 1 Human genes 0.000 description 1
- 101710175705 Eukaryotic peptide chain release factor subunit 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 1
- 101000932590 Homo sapiens Cytosolic carboxypeptidase 4 Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241000203353 Methanococcus Species 0.000 description 1
- 101001033003 Mus musculus Granzyme F Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 108010044843 Peptide Initiation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000005877 Peptide Initiation Factors Human genes 0.000 description 1
- 229920002352 Peptidyl-tRNA Polymers 0.000 description 1
- 229920002565 Polyethylene Glycol 400 Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 101150023003 RRF gene Proteins 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000061458 Solanum melongena Species 0.000 description 1
- 235000002597 Solanum melongena Nutrition 0.000 description 1
- 244000300264 Spinacia oleracea Species 0.000 description 1
- 235000009337 Spinacia oleracea Nutrition 0.000 description 1
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101000832077 Xenopus laevis Dapper 1-A Proteins 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000002547 anomalous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037358 bacterial metabolism Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006059 cover glass Substances 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 229960003276 erythromycin Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 230000022886 mitochondrial translation Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 1
- 238000000324 molecular mechanic Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229930014626 natural product Natural products 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004260 plant-type cell wall biogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 208000019880 recessive mitochondrial ataxia syndrome Diseases 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000002922 simulated annealing Methods 0.000 description 1
- CSRCBLMBBOJYEX-UHFFFAOYSA-M sodium;2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1 CSRCBLMBBOJYEX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 1
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000002424 x-ray crystallography Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Zoology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
계면활성제 및 RRF의 복합체의 결정, 그 결정화 방법 및 RRF의 삼차원 구조를 이용하여 RRF 저해제를 탐색 및 고안하는 방법이 개시되어 있다. 본 발명은 계면활성제의 존재하에서 그 계면활성제와 복합화된 RRF의 결정을 얻고, 이것에 의하여 RRF의 삼차원 구조를 분석하여 리보솜의 A-사이트와 결합하는 RRF의 결합부위와 소수성 틈을 형성하는 활성부위를 확인하였으며, 이러한 RRF의 삼차원 구조, 특히 RRF의 결합부위 및 활성부위의 삼차원 구조를 이용하여 RRF의 기능을 저해하는 RRF 저해제를 효율적으로 고안할 수 있게 한다. RRF는 원핵생물에서는 생존에 필수적인 것이지만 진핵생물에 있어서는 반드시 있어야 하는 것은 아니라는 사실에 의거하여 RRF 저해제는 항생제로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 리보솜 재활용 인자(Ribosome Recycling Factor; RRF)의 결정 및 결정화 방법에 관한 것이다. 상세하게는, 본 발명은 계면활성제와의 결합에 의하여 형성되는 리보솜 재활용 인자의 결정 및 그것의 결정화 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 RRF 또는 RRF 유사체와 RRF의 두 도메인 사이에 형성되는 소수성 틈에 결합되는 물질을 포함하는 단백질 복합체에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 리보솜에 결합하는 RRF의 한 도메인의 구조를 포함하는 폴리펩티드에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 RRF의 3차원 구조를 이용하여 RRF 저해제 물질을 탐색하는 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 데실-β-D-말토피라노사이드 또는 이의 유도체를 포함하는 RRF 저해제에 관한 것이다.
페니실린이 현대적인 개념의 항생제로 이용된 이후에 여러 가지 항생제가 병원균을 제어하기 위하여 개발되어오고 있다. 그러나 새로운 병원균의 등장과 항생제 내성을 가진 균들의 출현으로 새로운 항생제에 대한 개발에 대한 요구가 꾸준히 제기되고 있다. 세포벽 합성이나 단백질 생합성 같은 세균의 대사의 억제를 목표로 하는 항생제들은 주로 천연 화합물(natural compound)의 유도체로부터 개발되어 왔다.
최근에 단백질 결정학과 계산 화학의 발달은 소위 "구조에 근거한 신약 고안(structure based drug design)" 이라는 새로운 방법을 신약연구분야에 도입시켰다. 고해상도의 결정구조에 근거를 하여 가능한 저해제를 목표단백질의 활성부위에 맞추고 여러 가지 방법을 통하여 이 결합체의 결합강도 또는 친화력(affinity)을 계산하여 후보물질들을 찾아내는 것이 그것이다. 이러한 접근방법은 새로운 항생제연구에도 응용될 수 있을 것이다.
단백질 생합성은 잘 알려져 있는 바와 같이 개시(initiation), 연장(elongation) 그리고 종료(termination)로 이루어져 있다. 종료과정에서 방출 인자들(releasing factors; 원핵생물에서는 RF1 과 RF2, 진핵생물에서는 eRF1)들은 정지 코돈(stop codon)에 머문 후 합성된 단백질을 떨어뜨리는데 도움을 주고 나서 방출 인자 3(releasing factor 3; RF3)에 의해서 리보솜의 A-사이트에서 떨어져 나간다 (Freistroffer et al., 1997). 그 다음에 종료 복합체(termination complex)에 남아있는 다른 요소들이 다시 재활용되어야 계속하여 단백질 생합성을 진행할 수 있다 (Kaji et al., 1998). 리보솜 재활용 인자(Ribosome recycling factor; RRF)는 이 과정에서 GTP의 가수분해와 함께 연장 인자 G(elongation factor G; EF-G) 또는 방출 인자 3(release factor 3; RF3)의 도움으로 mRNA와 tRNA를 리보솜에서 분리하는 과정을 촉매함으로 단백질 생합성과정에 필수적인 기능을 가지고 있다 (Pavlov et al., 1997a; Kaji et al., 1998; Grentzmann et al., 1998; 그림 1). RRF는 탈아실화된 tRNA(deacylated tRNA)뿐만아니라 펩티딜-tRNA(peptidyl-tRNA)를 역시 리보솜으로부터 직접 분리시킨다는 사실이 알려져 있다 (Heurgue-Hamard et al., 1998; Grentzmann et al., 1998). 또한 RRF는 단백질 합성의 연장(elongation)과정에서 발생하는 오차를 막아주는 역할도 담당하고 있다는 사실이 알려져 있다 (Janosi et al., 1996). RRF의 활성을 방해하였을 때 세균의 생장이 억제된다는 사실에서 리보좀의 재활용 과정이 단백질 생합성에서 필수적이라는 것을 알 수 있다 (Janosi et al., 1998). 대장균의 경우 RRF가 없으면 대장균이 죽는데 (Janosi et al., 1994), 이것은 아마도 단백질 생합성과정에서 오차가 증가하거나 (Janosi et al., 1996) 합성이 끝난 후 예상치 않게 또 다른 합성이 일어나기 때문일 것이다 (Ryoji et al., 1981; Janosi et al., 1998).
전이과정의 오차의 방지나 리보좀의 재활용같은 RRF의 작용기작은 아직 잘 알려져 있지 않다. RRF는 리보좀의 A-사이트에 결합하고 이러한 결합은 방출 인자 1(releasing factor 1; RF1)의 결합과 경쟁적이라는 사실이 알려져 있다 (Pavlov et al., 1997b). 이처럼 리보좀에 대한 결합력을 근거로 보면 RRF는 리보좀의 A-사이트에 결합하는 다른 전이인자 (translation factor)들과 구조적인 유사성을 갖을 것이라고 예상된다. 따라서 다른 전이 인자에서 제안되고 있는 tRNA-모사(tRNA-mimicry)구조가 RRF에도 역시 존재하리라 여겨진다 (Nakamura et al., 1996; Brock et al., 1998). 현재 제안되고 있는 리보좀의 재활용에 대한 모델에 의하면, EF-G에 의하여 RRF는 리보좀의 A-사이트에 결합한후 (Nakamura et al., 1996) P-사이트로 이동되고, 탈아실화된 tRNA(deacylated tRNA)는 E-사이트로 이동한다 (Janosi et al., 1996; Pavolv et al., 1997a). 이후에 복합체는 mRNA, tRNA 그리고 리보좀으로 분리되거나 (Kaji et al., 1998) mRNA가 결합된 상태에서 두 개의 단위체로 분리된다 (Pavolv et al., 1997a). 최근에 보고된 연구결과에서 제안된 기작은 조금 다른데 (Karimi et al. 1999), 이 경우 RRF, EF-G 그리고 GTP가 단지 50S 단위체만 분리해내고 개시 인자(initiation factor)의 한가지인 IF3에 의하여 tRNA는 30S:mRNA:tRNA로 분리된다.
RRF의 유전자는 원핵생물에 광범위하게 존재하고, 매우 높은 유전자상의 유사성을 보이고 있다 (Janosi et al., 1996). 유전자서열로 검색해본 결과 여러 가지 진핵생물에도 역시 RRF의 유전자가 발견되었다. 하지만 이들은 대부분 세포소기관내에 존재하고 있다 (Janosi et al., 1996). 효모의 경우 RRF 유사체가 미토콘드리아내의 단백질 생합성에 관여하고 있지만 (Janai et al., 1998) 세포의 생장에 꼭 필요한 것이 아니라는 것이 알려져 있다 (Kaji et al., 1998). 또한 시금치의 엽록체에 있는 RRF 유사체는 세균의 온도 민감성 돌연변이체를 저해하는 작용을 보인다 (Rolland et al., 1999). 이러한 결과를 종합해 보면 진핵생물의 RRF는 세포의 생존과 관계없고, 이 세포 소기관에 존재하는 RRF를 저해해도 세포질의 단백질합성에는 영향을 미치지 않는다고 결론지을 수 있다. 이러한 사실은 진핵생물과 유사한 전이체계를 갖는 고생물인 메타노코커스 자나쉬(Methanococcus jannashchii)에 RRF가 존재하지 않는다는 사실에 의해서 증명되고 있다. 이와 같이 원핵생물에서는 필수적이지만 진핵생물에는 필요하지 않은 RRF는 새로운 항세균 시약을 개발하기 위한 목표로 여겨지고 있다 (Kaji et al., 1998). 이러한 저해제가 진핵생물의 미토콘드리아에 영향을 줄 수 있을 수 모르지만, 테트라실린(tetracyclin)이나 에리스로마이신(erythromycin)과 같이 광범위하게 이용되고 있는 항생제 역시 미토콘드리아의 단백질합성을 목표로 하고 있다는 점에서 RRF의 저해제의 개발과 그 이용 가능성은 크다고 할 수 있다. 또한 대장균과 더불어 최근에 연구가 활발히 진행되고 있는 P. 애루지노사(P. aeruginosa)의 RRF에 대한 연구결과, 이 두 세균의 RRF가 서로 교환이 가능하다는 사실이 밝혀졌다. 이 사실은 대장균을 대상으로 진행되는 연구를 통해 광범위한 항균력을 갖는 저해제를 개발할 수 있다는 것이다.
본 발명의 목적은 RRF의 결정 및 결정화 방법을 제공하는 것이다. RRF의 RRF의 삼차원 구조를 분석할 수 있게 하고, 더 나아가 RRF의 삼차원 구조는 RRF 저해제 물질을 고안할 수 있도록 한다.
또한, 본 발명의 목적은 RRF의 삼차원 구조를 이용하여 RRF 저해제 물질을 탐색, 고안하는 방법을 제공하는 것이다. 이 방법에 의하여 RRF 저해제 물질을 용이하게 탐색할 수 있고 최적의 RRF 저해 기능을 가지는 RRF 저해제를 고안할 수 있다.
또한, 본 발명의 목적은 본 발명에 의하여 RRF 저해 활성을 가지는 것으로 확인된 말토피라노사이드 및 이의 유도체를 포함하는 RRF 저해제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 RRF의 꼬인 코일 도메인 구조의 전부 또는 일부를 갖는 폴리펩티드를 제공하는 것이다. 이러한 폴리펩티드는 리보솜의 RRF 결합 부위에 결합하여 RRF가 리보솜에 결합하는 것을 방해함으로써 RRF의 활성을 저해할 수 있다.
도 1은 본 발명의 RRF 결정에 의하여 분석된 RRF의 삼차원 구조를 리본 형식으로 도시한 것이다.
도 2는 본 발명의 RRF 결정에 의하여 분석된 RRF의 삼차원 구조에서 표면 모델로 그려진 RRF의 소수성 틈 위로 계면활성제를 막대 모델로 도시한 것이다.
도 3은 원핵생물들로부터 유래하는 RRF의 다중 서열 배치(multiple sequence alignment)를 도시한 것이다.
도 4은 본 발명의 RRF 결정에 의하여 분석된 RRF의 삼차원 구조에서 RRF의 두 도메인의 상대적인 움직임을 도시한 것이다.
도 5는 tRNA 및 EF-G와 같이 리보솜의 A-사이트에 결합하는 분자들과 RRF의 구조적 유사성을 보이기 위하여 그들의 표면 입체구조 모델을 도시한 것이다.
본 발명은 RRF 또는 RRF 유사체의 결정 및 결정화 방법을 제공한다. 본 발명의 RRF 또는 RRF 유사체의 결정은 RRF의 특정 부위에 결합하는 물질의 존재하에서 결정화함으로써 얻어질 수 있다. 본 발명의 RRF 결정은 RRF와 RRF의 특정 부위에결합하는 물질을 포함한다. RRF의 특정 부위는 본 발명에 따라 얻어진 RRF의 결정에 의하여 확인된 RRF의 삼차원 구조를 통하여 두 개의 도메인 사이에 형성된 소수성 틈임이 밝혀졌다. 본 발명의 RRF 결정을 기초로 밝혀진 RRF의 삼차원 구조에는 두 개의 도메인이 L자 모양을 형성하고 두 개의 도메인에 의하여 소수성 틈이 형성되어 있다. RRF의 한 도메인은 리보솜과 결합하고 소수성 틈에 의하여 RRF의 기능이 발휘된다.
또한, 본 발명은 RRF의 삼차원 구조를 이용하여 RRF의 기능을 저해하는 RRF 저해제를 탐색 또는 고안하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 RRF 저해 활성을 가지는 것으로 확인된 말토피라노사이드 또는 이의 유도체를 포함하는 RRF 저해제를 제공한다.
또한, 본 발명은 RRF의 꼬인 코일 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 폴리펩티드를 제공한다. 이러한 폴리펩티드는 리보솜의 RRF 결합 부위에 결합하여 RRF가 리보솜에 결합하는 것을 방해함으로써 RRF의 활성을 저해할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
약자 및 용어 정의
1) 약자
RRF : 리보솜 재활용 인자 (ribosome recycling factor)
아미노산
아미노산 한글자기호 세글자기호
----------------------------------------------------------
알라닌(Alanine) A Ala
아르기닌(Arginine) R Arg
아스파라긴(Asparagine) N Asn
아스파르트산(Aspartic acid) D Asp
시스테인(Cysteine) C Cys
글루타민(Glutamine) Q Gln
글루탐산(Glutamic acid) E Glu
글리신(Glycine) G Gly
히스티딘(Histidine) H His
이소류신(Isoleucine) I Ile
류신(Leucine) L Leu
라이신(Lysine) K Lys
메티오닌(Methionine) N Met
페닐알라닌(Phenylalanine) F Phe
프롤린(Proline) P Pro
세린(Serine) S Ser
스레오닌(Threonine) T Thr
트립토판(Tryptophan) W Trp
티로신(Tyrosine) Y Tyr
발린(Valine) V Val
-------------------------------------------------------
2) 용어정리 : 본 발명에서 사용된 용어들에 대한 설명은 다음과 같다.
결정 : 결정화된 형태로 만들어진 단백질을 가리킨다. 결정은 여러개의 단위세포들이 쌓인 것을 말한다.
복합체 : 단백질이 한 개나 혹은 그 이상의 물질과 결합한 형태를 말한다.
단위세포(unit cell) : 결정에 있어서 가장 간단하고 작은 부피의 단위이고 단위세포의 a,b,c,알파,베타, 감마라는 6개의 숫자로 정의된다 (Blundel et al., 1976).
공간군: 결정내의 대칭요소들의 배열을 말한다. 공간군의 정의에서 영어대문자는 격자모양을 가리키고 다른 숫자는 대칭조작을 말한다.
비대칭 단위(Asymmetric Unit) : 단위세포내에서 대칭요소를 갖지않지만 공간군의 대칭조작에 의해 같은 모양으로 겹칠수 있는 가장 큰 단위를 말한다.
다중 동형체 치환법(multiple isomorphous replacement) : 중금속 용액을 결정에 침투시켜 만드는 중금속 유도체를 이용하여 삼차구조를 얻기 위한 위상에 대한 정보를 얻는 방법이다 (Blundel et al. 1976).
분자치환법(molecular replacement) : 구조좌표가 알려진 분자의 위치를 변화시켜가면서 구조가 알려져 있지 않은 결정의 예비적 구조를 얻어내는 방법이다.
본 발명에서 언급하는 RRF 유사체는 RRF와 30% 이상의 아미노산 유사성을 갖는 것을 의미하며, RRF 돌연변이체를 포함한다.
RRF의 결정화 및 결정 구조
먼저, 본 발명은 데실-β-D-말토피라노사이드(decyl-β-D-maltopyranoside)와 같은 소수성 잔기를 가지는 계면활성제(detergent)의 존재하에서 폴리에틸렌 글리콜과 같은 침전제를 포함하는 용액으로부터 RRF의 결정을 얻는다. RRF는 소수성 잔기를 가지는 계면활성제가 없는 상태에서는 결정 상태로 얻을 수 없다. 이것은 하기에서 설명하는 바와 같이, RRF의 삼차원 구조는 두 개의 도메인으로 구성되어 있고, 두 개의 도메인이 서로 움직이는 성질을 가지고 있어서 RRF의 결정화가 어렵다는데 기인한다. 본 발명의 이전에 다른 연구팀들이 대장균으로부터 분리된 RRF를 결정화하기 위하여 많은 시도를 하였으나 결정화에 성공하지 못하였다. 또한, 본 발명에 앞서, 본 발명자들도 대장균으로부터 분리된 RRF를 결정화하기 위하여 여러 가지 단백질 농도들 및 다른 결정 조건들에서 RRF의 결정화를 시도하였으나 모두 실패로 돌아가고 말았다. 이러한 결정화 실패 이유는 소수성 잔기를 가지는 계면활성제의 존재하에서 결정화를 수행하지 않았기 때문이라 여겨진다. RRF의 결정화에 있어서 소수성 잔기를 가지는 계면활성제가 필요한 이유는 하기에서 설명하는 바와 같이, RRF의 두 개가 도메인 사이에 형성된 소수성 틈에 소수성 잔기를 가지는 계면활성제가 결합되어 RRF의 두 개의 도메인이 상대적으로 움직일 수 없도록 하기 때문이다. 따라서, 대장균 또는 다른 세균 등에서 분리된 RRF 또는 RRF돌연변이체(또는 RRF 유사체)를 결정화시키기 위해서는 하기에서 언급하는 RRF의 소수성 틈에 결합할 수 있는 물질, 바람직하게는 소수성 잔기를 가지는 계면활성제가 필수적이라 여겨진다.
RRF 결정의 구조
상기와 같은 방법으로 얻은 소수성 잔기를 포함하는 본 발명의 RRF 결정은 X-선 회절 분석에 의하여 삼차원 구조를 분석할 수 있을 정도의 결정이다. 본 발명의 RRF 결정은 X-선 회절 분석 데이터를 모아 분석하면, a=b=48.06Å, c=142.27Å의 단위세포길이의 긴 막대모양을 갖고 P3121의 공간군을 갖는다.
또한, RRF의 삼차원 구조는 도 1에 도시되어 있다. 도 1은 본 발명의 RRF 결정에 의하여 분석된 RRF의 삼차원 구조를 리본 형식으로 도시한 것이다. 두 개의 도메인은 링커로 연결되어 있고 화살표는 스트랜드(strand), 실린더는 헬릭스를 가리킨다. 아미노산 말단과 카복실 말단이 각각 표시되어 있고, 계면활성제가 공간 채움 모형으로 그려져 있다.
RRF는 표 1에서 보는 바와 같이, 0.23 nm 해상도에서 삼차원 구조가 결정되었고, 1437개의 단백질 원자와 230개의 물분자 그리고 데실-β-D-말토피라노사이드(decyl-β-D-maltopyranoside)의 16개 원자에 대한 삼차원적 모델이 완성되었다. RRF의 삼차원 구조를 이루는 각각의 원자들의 삼차원상의 위치 (coordinate)는 표 2에 정리되어 있다. RRF는 도 1에서 보는 바와 같이, 두 개의 도메인으로 구성된 L자모양의 구조를 보여주고 있다. 첫 번째 도메인의 아미노 말단 헬릭스(H1)는 두 번째 도메인으로 연결이 되고 있다. 카복실 말단에는 두 번째 도메인에서 들어오는 두 개의 서로 반대 방향의 헬릭스가 짧은 U-턴(U-turn)으로 연결되어 아미노 말단 헬릭스와 다시 폴딩(folding)하고 있다 (H3 및 H4). 따라서 첫 번째 도메인은 65 정도로 긴 세 개의 헬릭스가 만드는 다른 방향의 꼬인 코일(coiled-coil)로 구성되어 있다. 이 꼬인 코일(coiled-coil)에서 가장 짧은 헬릭스 H1은 H3와는 같은 방향으로, 그리고 H4와는 다른 방향으로 결합하고 있다. U-턴(U-turn) 근처에 있는 H3의 카복실 말단과 H4의 아미노 말단의 헬릭스는 두 개의 헬릭스가 만드는 다른 방향의 꼬인 코일(coiled-coil)을 이루고 있다. 두 번쩨 도메인은 약 23 x 26 x 36 정도의 크기인 α/β 토폴로지(topology)를 이루고 있다. 이곳에는 짧은 β핀 (S1 과 S2)과 α헬릭스 (H2)가 네 개의 스트랜드로 구성된 β판 (S3-S6)의 한면에 결합되어 있다. 두 개의 도메인은 약 110정도의 각을 이루면서 두 개의 링커(linker)로 연결되어 있다.
표 1
RRF의 X선 회절 데이터 및 최적화 결과
| 데이터 수집(Data collection)해상도 (Å)Rmerge(%)완성도(Completeness) (%)독특한 반사의 개수(No. of unique reflections)여분(Redundancy) | 20.0-2.3(2.38-2.30)4.8(23.0)96.2(97.7)8,691(858)3.34 |
| 재조정(Refinement)해상도 (Å)Rfactor/Rfree(%)반사 갯수(No. reflections (2σ cut off))용매 원자의 갯수단백질 원자의 갯수헤테로원자의 갯수평균 B 인자(Mean B factor) (Å제곱)결합길이에서의 R.m.s.d. (Å)결합각에서의 R.m.s.d (o) | 20.0 2.322.8 / 29.78,39123014371653.90.0101.63 |
상기 표에서 나타내는 용어는 다음과 같다.
해상도 : 브래그(Bragg)의 회절조건을 만족시킬 때 두 판 사의 거리
Rmerge: 회절강도측정을 반복했을 때, 그 들간의 일치정도
Rfactor: 실험적으로 얻어진 회절강도와 모델에서 계산된 회절강도의 차이
Rfree: 얻어진 모델의 유용성을 측정하기 위해 최적화 과정에서 제외시킨 회절점들을 이용하여 계산한 Rfactor
소수성 틈과 도메인들의 움직임
도 2는 막대 모델로 표시된 계면활성제가 표면 모델로 그려진 RRF의 소수성 틈 위로 도시되어 있다. 소수성 결합에 참여하는 아미노산들(Thr-106, Arg-31, Pro-103, Leu-36, Leu-37, Ile-40, Leu-87, Leu-89, Leu-102)이 그 이름과 함께 도시되어 있다. 계면활성제 중 소수성 결합에 참여하지 않는 머리 부분은 도시되어있지 않다.
도 3은 원핵생물들로부터 유래하는 RRF의 다중 서열 배치(multiple sequence alignment)를 도시한 것이다. 대장균(E. coli), 해모필러스 인플루엔자(Haemophilus influenzae; H. inf), 수도모나스 애유러지노사(Pseudomonas aeuruginosa; P. aeu) 및 바실러스 섭틸리스(B. sub)로부터 유래하는 RRF의 서열들이 다중 서열 배치를 위하여 사용되어 있다. 대장균 RRF의 이차 구조는 β-스트랜드에 대하여 화살표로 α-헬릭스에 대하여 실린더로 표시되어있다. 계면활성제의 알킬 사슬에 결합하는 아미노산들은 별표(*)로 마크되어 있다. RRF의 온도-민감성 돌연변이체들에서 확인된 돌연변이 잔기들(Janosi et al., 1998)은 # 마크에 의하여 표시되어 있다. 꼬인 코일(coiled-coil)에 일곱 개 한벌(heptad) 패턴(abc defg)의 각 잔기가 또한 도시되어 있다. 네 개의 서열들에서, 동일한 잔기들은 흑색 박스(box)로 표시되어 있고 상동성의 잔기들은 회색 박스로 표시되어 있다.
도 2에 도시된 바와 같이, 계면활성제인 n-데실-β-D-피라노말토사이드의 알킬체인이 두 도메인사이의 관절부분에 형성된 소수성 틈에 위치하고 있다. 여러개의 소수성 아미노산들이 이 소수성 틈을 구성하고 있고 이들은 계면활성제의 알킬체인과 소수성 결합을 하고 있다. 도 3에서 보는 바와 같이, 여러 종들의 RRF들의 단백질 서열을 비교하였을 때, 이들 결합에 참여하고 있는 아미노산들은 매우 잘 보존이 된다는 사실을 알수 있다. 따라서 이러한 아미노산들은 원래 다른 단백질들이나 소수성물질과의 상호결합에 관여할 것이라는 것을 예상할 수 있고 이러한 상호결합은 RRF의 활성과 밀접한 관련을 가질 것이라 예상할 수 있다. 또한 이러한 소수성 틈을 메우고 있는 계면활성제의 존재로 인하여 소수성 틈이 연결하고 있는 두 개의 도메인사이의 움직임이 적어질 것이다. 실제로, 두 도메인의 상대적인 위치가 서로 다른 결정에서 차이를 보이고 있다. 이것은 도 4에 도시되어 있다.
도 4은 RRF의 두 도메인의 상대적인 움직임을 도시한 것이다. 세 개의 서로 다른 RRF의 결정으로부터 얻은 RRF의 구조를 아래쪽 도메인이 겹쳐지도록 놓았을 때 위쪽 도메인의 움직임을 관찰할수 있다. 세 개의 서로 다른 RRF의 결정은 PT1(왼쪽), Native1(가운데) 및 Native2(오른쪽)로 명명하였다. 도 3에는 Native1의 계면활성제가 도시되어 있다. 이러한 움직임은 계면활성제가 없을 때 더욱 커질 것이다. 이러한 도메인의 움직임은 상기에서 설명한 바와 같이, RRF 자체만으로는 결정화되기 어렵게 하는 요인이 된다.
도 4으로부터 RRF는 두 개의 움직이는 도메인들에 의하여 형성되는 소수성 틈에 통하여 다른 분자들 또는 그것들의 부분과 상호 결합할 것이라는 것은 쉽게 예상할 수 있고, 그래서, 상대적으로 움직이는 두 도메인에 의하여 형성되는 RRF의 소수성 틈은 다른 분자들 또는 그것들의 부분이 결합하는 자리로서 작용하고, 이것은 이 소수성 틈에 의하여 단백질 생합성시에 작용하는 RRF의 기능이 수행됨을 의미한다 할 것이다.
한편, RRF의 두 도메인의 상대적인 움직임 및 RRF의 두 도메인에 의해 형성되는 소수성 틈은 tRNA나 EF-G와 같은 리보솜의 A-사이트에 결합하는 분자들에게 공통적으로 발견되는 현상이다. 이것은 RRF 도메인들의 상대적인 움직임 및 소수성틈이 RRF의 단백질 생합성시의 그 역할과 연관하여 매우 중요한 현상이라는 상기의 사실을 뒷받침하는 것이다.
따라서, 앞에서 언급했듯이 RRF는 세균의 생존에 필수적인 단백질이므로 (Janosi et al., 1994) 항세균성 신약개발의 주요한 목표물로 여겨지고 있으며 (Kaji et al., 1998), 항세균성 신약개발을 위한 RRF의 특징적인 부위 중 하나는 상기에서 언급한 소수성 틈이 될 것이다. 다시 말하면, RRF의 소수성틈에 결합하는 물질은 RRF의 두 도메인사이의 움직임을 막아 RRF의 역할을 차단할 것이므로, 본 발명에 의하여 밝힌 RRF의 삼차원 구조를 이용함으로써 이러한 소수성 틈에 결합하는 물질을 용이하게 탐색하고, 고안할 수 있을 것이다. 이러한 소수성 틈에 결합하는 물질은 결국, RRF 저해제로서 작용하게 된다. 즉, 항세균제로서 사용할 수 있게 될 것이다.
한편, 본 발명에서 얻는 RRF의 결정은 RRF와 데실-β-D-말토피라노사이드의 복합체를 사용하여 얻은 것이며, 이것으로부터 상기의 데실-β-D-말토피라노사이드는 RRF의 소수성 틈에 잘 결합한다는 것을 알 수 있다. 따라서, 데실-β-D-말토피라노사이드는 RRF의 기능을 저해할 수 있으므로 RRF의 저해제로 사용할 수 있을 것이다.
또한, 본 발명에 따른 상기 계면활성제를 포함하는 RRF의 결정에 의하여 분석된 RRF의 삼차원 구조에 의하면, 상기 계면활성제의 알킬기 중 7개의 탄소 사슬이 RRF의 소수성 틈에 결합하고 있는 것을 알 수 있다. 즉, 알킬기의 말단에서부터 7개의 탄소 사슬이 RRF의 소수성 틈에 들어가 있고 나머지 3개의 탄소사슬은 RRF의소수성 틈 밖에 나와 있다. 그리고 상기 계면활성제의 말토스 그룹(두개의 6탄당)은 RRF의 소수성 틈의 둘레에 있는 비소수성 잔기와 상호작용을 하지 않는 상태로 존재한다. 따라서, RRF의 소수성 틈과 결합하는 소수성 알킬기의 탄소수는 3~12 정도가 바람직하다. 소수성 알킬기의 탄소수가 너무 적은 경우에는 소수성 틈과의 소수성 결합이 너무 약하게 되고, 너무 많은 경우에는 소수성 틈과 결합하지 않는 알킬기의 부분이 RRF의 다른 부분과 밀어내기 작용을 할 수 있을 것이다. 또한, RRF의 소수성 틈의 둘레 또는 그 주위에 존재하는 비소수성 잔기들과 비소수성 결합(수소결합, 쌍극자-쌍극자 결합, 전하-전하 결합 등)을 할 수 있는 그룹을 계면활성제가 가진다면 더욱 바람직할 것이다. 이러한 물질에서, 소수성 알킬기 부분은 RRF의 소수성 틈과의 결합 사이트를 제공하고 비소수성 결합을 할 수 있는 그룹은 RRF의 소수성 틈의 둘레 또는 그 주위의 비소수성 아미노산 잔기들과 특이적 결합을 할 수 있다. 그럼으로써, 그러한 물질은 RRF의 소수성 틈 및 그 둘레 또는 그 주위의 아미노산들과 더욱 강력한 결합을 유지할 수 있다.
따라서, 본 발명의 계면활성제를 포함하는 RRF의 삼차원 구조로부터 RRF의 기능을 저해할 수 있는 계면활성제의 바람직한 구조는 3~12의 탄소수를 가지는 알킬기 및 비소수성 결합을 할 수 있는 그룹을 가지는 것이다. 또한, 본 발명에서 사용할 수 있는 계면활성제의 알킬기는 n-알킬이 바람직하지만, 비소수성 틈과 결합하는 알킬기 중 최소한 하나의 탄소에 1~3의 알킬기가 치환될 수 있다.
리보솜의 A-사이트와 결합하는 RRF의 꼬인 코일 도메인
도 5는 tRNA 및 EF-G와 같이 리보솜의 A-사이트에 결합하는 분자들과 RRF의 구조적 유사성을 보이기 위하여 그들의 표면 입체구조 모델을 도시한다. 도면에서, 왼쪽이 RRF, 가운데가 tRNA 그리고 오른쪽이 EF-G의 3,4,5 도메인들이다. 흰색은 소수성 부위, 붉은색은 음전하, 푸른색은 양전하를 각각 가리킨다.
도 5에서 보는 바와 같이, RRF는 리보솜의 A-사이트에 결합하는 분자들인 tRNA, EF-G 등과 삼차원 구조가 유사하다. 특히, RRF의 꼬인 코일에 해당하는 도메인은 tRNA의 안티코돈 줄기(anticodon stem) 및 EF-G의 도메인 IV와 구조적으로 매우 유사하다. 이러한 결과 및 여러 가지 다른 실험결과들을 종합하면, RRF의 꼬인 코일 부분이 리보솜의 A-사이트와 직접 결합하는 부위라 여겨진다.
따라서, 본 발명의 RRF의 삼차원 구조를 이용하여 RRF의 꼬인 코일 도메인 중에서 리보솜의 A-사이트와 결합하는 특징적 부위를 확인하고, 이 특징적 부위와 결합하는 물질을 탐색 및 고안할 수 있을 것이다. 이러한 물질은 결국 RRF가 리보솜의 A-사이트에 결합하는 것을 방해하게 될 것이므로, RRF 저해제로서 사용될 수 있을 것이다.
RRF의 삼차원 구조를 이용한 RRF 저해제의 탐색 및 고안
1) RRF의 소수성 틈을 이용한 RRF 저해제의 탐색 및 고안
본 발명은 RRF의 삼차원 구조를 이용하여 RRF의 소수성틈에 상보적인 물질을 탐색, 고안하고, 이를 합성하여 항생제로 이용하는 방법에 관한 것이다. 이 경우 RRF의 소수성 틈에 상보적인 물질, 즉, RRF의 활성을 방해하는 물질은 물리적으로그리고 구조적으로 RRF의 소수성 틈에 결합하여야 한다. 이 때 결합은 공유결합이 아닌, 수소결합, 이온 결합 반데르발스 결합 그리고 소수성 결합들을 포함한다. 본 발명에 따른 RRF 저해제를 탐색, 고안하는 과정을 아래에서 예시한다.
a. 먼저, RRF의 삼차구조의 계면활성제의 결합부위, 즉, 소수성 틈과 상보적일 것으로 예상되는 물질 또는 그것의 부분을 데이터베이스 상에서 찾거나 RRF의 소수성 틈의 삼차원 구조를 기초로 하여 상보적일 것으로 예상되는 물질 또는 그것의 부분을 고안한다. 이 때, 고려하여야 할 것은 찾고자 하는 물질 또는 그것의 부분이 RRF의 소수성 틈과 물리적으로 그리고 구조적으로 결합할 수 있어야 한다는 것이다. 이러한 결합은 공유결합이 아닌, 수소결합, 반데르발스 결합 및 소수성 결합 등을 포함할 수 있다. 또한, 그 화합물 또는 그것의 부분이 RRF의 소수성 틈과 결합할 수 있는 그 화합물의 공간적 원자 배열(conformation)이 허용될 수 있는지를 고려하여야 한다. 이러한 공간적 원자 배열은 그 화합물 단독으로 있는 상태에서 고려되는 것이 아니라 RRF의 소수성 틈에 결합되는 상태를 가정하여 고려되어야 한다. 이러한 물질의 선택 및 고안은 컴퓨터 모델링 방법에 의하여 수행될 수 있다. 그리고, 이러한 물질들을 실제로 합성하기 전에 컴퓨터 모델링 기술을 사용하여 RRF의 소수성 틈에 대한 결합력을 분석할 수 있다. 즉, 선택 또는 고안된 물질들은 컴퓨터 모델링 방법에 의하여 RRF와의 결합강도를 측정할 수 있다. 만약, 이러한 모델링방법에 의하여, 데이터베이스에서 선택된 또는 고안된 물질 또는 그것의 부분이 RRF의 소수성 틈과 충분한 결합강도를 보이지 않는다면 그것은 RRF 저해능력을 가지지 않는 것이므로 이후의 과정, 즉, 그것을 기초로 한 구조의 변형, 치환기의 교체 등을 포함하는 결합강도의 최적화를 위한 분자 재모델링, 그 물질 또는 재모델링된 물질의 합성 및 활성측정 등의 과정을 진행하지 않는다. 이것은 활성을 갖지 않는 화합물의 합성을 배제시켜 주므로, RRF 저해제 개발의 효율성을 향상시킨다. 만약 모델링에 의하여 그 화합물 또는 부분이 RRF의 소수성 틈에 대하여 높은 결합력을 보이면 그 물질을 합성하여 RRF와 결합하는 능력이나 저해제로서의 활성을 시험관내에서 측정할 수 있다. 이때 RRF에 대하여 화합물-RRF 복합체의 해리상수가 100 마이크로몰(micro mole) 이하의 값을 보이는 결합강도를 가지는 물질은 저해제의 후보자로서 이용할 수 있다. 해리상수가 100 마이크로몰이면 99%의 저해제가 RRF와 복합체로 존재하고 나머지 1%가 해리상태로 존재하는 결합강도에 해당한다. 즉, 해리상수가 작을수록 저해제와 RRF의 결합강도는 크다. 저해제 후보물질을 이용한 보다 강력한 저해제의 고안은 하기의 b에 서술되어 있다. 이러한 컴퓨터 모델링을 이용한 일차적인 결합강도 측정의 과정은 도 2에서 보는 바와 같이, 저해제가 결합하는 소수성 틈을 포함하는 두 도메인사이의 틈에 유기물들이나 이들의 부분을 여러 가지 방향으로 돌려가면서 집어넣어 눈으로 보아 가장 잘 맞게 한다. 이러한 작업은 인사이트II(insightII), 시빌(sybyl), 오(o), 체인(chain), 프로도(frodo) 등의 모델링 프로그램 상에서 수행될 수 있다. 또한 유기물들이나 이들의 부분을 RRF의 소수성 틈에 넣는 방법은 도킹(docking)을 통해서도 이루어질수 있다. 도킹은 쿠안타(Quanta), 오토독(autodock), 독(dock), 인사이트II(insightII), 시빌(Sybyl) 등과 같은 컴퓨터 프로그램을 이용하여 수행될 수 있다. 이러한 과정들을 거쳐서 결합부위에 위치한 물질들은 에너지 최소화(energy minimization)나 분자 동역학(molecular dynamics)을 이용하여 그 위치를 보다 정밀화 한다. 분자 동력학(molecular dynamics)에는 CHARMM 이나 AMBER같은 표준 분자 molecular 역학 역장(mechanics forcefield)을 이용한다.
상기와 같은 진행과정을 이용하여 물질을 선택하는 과정에는 아래와 같은 프로그램들이 필요하다.
1. GRID (Goodford, P. J., "A Computational Procedure for Determining Energetically Favorable Binding Sites on Biologically Important Macromolecules" J. Med. Chem., 28, pp. 849-857 (1985)). GRID 는 옥스퍼드 대학(Oxford University, Oxford, UK)으로부터 구할 수 있다.
2. MCSS (Miranker, A. and M. Karplus, "Functionality Maps of Binding Sites: A Multiple Copy Simultaneous Search Method." Proteins: Structure, Function and Genetics, 11, pp. 29-34 (1991)). MCSS는 분자 시뮬레이션즈 (Molecular Simulations, Burlington, Mass)로부터 구할 수 있다.
3. AUTODOCK (Goodsell, D. S. and A. J. Olsen, "Automated Docking of Substrates to Proteins by Simulated Annealing" Proteins: Structure. Function, and Genetics, 8, pp. 195-202 (1990)). AUTODOCK은 스크립스 연구소(Scripps Research Institute, La Jolla, Calif)로부터 구할 수 있다.
4. DOCK (Kuntz, I. D. et al., "A Geometric Approach to Macromolecule-Ligand Interactions" J. Mol. Biol., 161, pp. 269-288 (1982)).DOCK is available from University of California, San Francisco, Calif.
상기의 과정을 거쳐서 선택된 유기물이나 그 부분들 여러 개가 RRF의 소수성 틈 및 그 둘레 또는 그 주위의 결합부위에 자리잡고 있을 경우에는 이들을 연결시켜서 한 개의 물질로 만들 필요가 있다. 이 과정은 위에서 언급된 모델링 프로그램을 이용하고 아래의 프로그램을 사용하여 수행될 수 있다.
1. CAVEAT (Bartlett, P. A. et al, "CAVEAT: A Program to Facilitate the Structure-Derived Design of Biologically Active Molecules". In Molecular Recognition in Chemical and Biological Problems", Special Pub., Royal Chem. Soc., 78, pp. 182-196 (1989)). CAVEAT는 캘리포니아 대학(the University of California, Berkeley, Calif.)으로부터 구할 수 있다.
2. MACCS-3D (MDL Information Systems, San Leandro, Calif.)와 같은 3D 데이터베이스 시스템들. 이 분야는 마틴(Martin, Y. C.)의 "3D Database Searching in Drug Design", J. Med. Chem., 35, pp. 2145-2154 (1992))에 정리되어 있다.
3. HOOK (분자 시뮬레이션즈(Molecular Simulations, Burlington, Mass.)로부터 구할 수 있음).
일단 물질이 고안되거나 또는 결합부위에 결합가능한 물질을 선택한 다음에 계산에 의한 평가를 통해 이들의 결합강도를 측정할 수 있다. 효과적인 저해제는 결합전후에 에너지변화가 적어야 한다. 따라서 저해제는 결합에 의한 저해제와 RRF의 변형(deformation) 에너지가 10 kcal/mole 이상이어서는 안 된다. 저해제의 결합력은 저해제와 RRF의 복합체의 해리상수를 계산하여 평가할 수도 있다. 이 경우, 해리상수는 100마이크로몰 이하인 것이 바람직하다. 또한 결합 후에 RRF와 안정한 결합력을 유지해야 한다. 이것을 위해서 전하-전하 (charge-charge), 쌍극자-쌍극자(dipole-dipole) 그리고 전하-쌍극자 (charge-dipole) 상호작용과 같은 밀쳐내는 정전기 상호작용이 없어야 하고, 정전기 상호작용의 합이 중성이거나 결합의 엔탈피에 긍정적인 역할을 해야한다. 이러한 결합강도를 계산하는 프로그림들은 : Gaussian 92, revision C [M. J. Frisch, Gaussian, Inc., Pittsburgh, Pa. .COPYRGT.1992]; AMBER, version 4.0 [P. A. Kollman, University of California at San Francisco, .COPYRGT.1994]; QUANTA/CHARMM [Molecular Simulations, Inc., Burlington, Mass. .COPYRGT.1994]; 그리고 Insight II/Discover (Biosysm Technologies Inc., San Diego, Calif. .COPYRGT.1994)등을 포함하여 여러 가지가 있다. 이렇게 해서 선택된 선도 화합물(lead compound)들을 이용하여 보다 결합력이 강한 저해제를 만들 수 있다. 이 과정은 아래에서 설명한다.
b. 상기에서 선택되거나 고안된 화합물(선도 화합물)에서 그 화합물의 원자나 측쇄 그룹 혹은 구조의 일정부위를 치환하거나 변형시켜서 RRF와의 결합강도를 높일 수 있다. 일반적으로 치환과정에서 교환되는 그룹은 처음 것과 비슷한 크기, 소수성, 전위를 가지고 있어야 하고 급격한 변화는 피해야 한다. 이렇게 치환 후에 물질은 상기 a에서 열거된 방법을 이용하여 그 결합강도를 다시 측정하여 보다 높은 결합강도를 가지는 방향으로 수행할 수 있다.
한편, 본 발명의 결정을 얻기 위하여 사용된 계면활성제인 데실-β-D-말토피라노사이드은 RRF의 소수성 틈에 결합하는 것이 확인되었으므로, 이것을 선도 화합물로 사용하여 상기와 같은 작업을 수행할 수 있다. 필요한 경우, 데실-β-D-말토피라노사이드의 소수성 사슬인 알킬 사슬에 적당한 치환기를 치환하거나, 데실-β-D-말토피라노사이드의 말토스 그룹을 다른 그룹으로 변경하여 상기의 작업을 수행할 수 있다.
c. 상기 방법에 의하여 도출된 물질들을 합성하여 RRF와 결합시킨 후 X-선 결정학적인 방법을 이용하여 고해상도에서 (0.28 nm 이상)구조를 결정하고 이러한 구조에서 얻어낸 RRF와 저해제 사이의 상호작용에 대한 지식을 저해제를 보다 변형시켜서 RRF와 결합강도를 높이는데 이용할 수 있다.
d. 이러한 과정에 의하여 최적화된 RRF 저해제 후보 물질이 선택 또는 고안되면, 이 저해제 후보 물질의 RRF 저해활성을 테스트하기 위하여 시험관 내 및 생체 내 시험을 수행할 수 있다. 이렇게 하여 RRF 저해 활성이 확인된 저해제 후보 물질은 그대로 저해제로서 사용하거나 그것의 구조를 기초로 더욱 최적화된 저해제를 개발하기 위하여 사용될 수 있다. 즉, 시험관 내 및 생체 내 시험에 의하여 RRF의 활성을 저해하는 능력이 충분한 것으로 확인된 RRF 저해제의 구조를 상기의 컴퓨터 모델링 방법을 사용하여 RRF와의 결합력, 용해도 등의 특성을 개선할 수 있다. 다시 말하면, 활성이 확인된 RRF 저해제를 선도 화합물로 사용하여 재모델링함으로써 그 화합물의 RRF 저해성능, 용해도 등의 특성을 향상시킬 수 있다.
또한, 상기의 저해제 활성을 테스트하기 전에, 또는 그것과 무관하게, 컴퓨터에 의하여 계산된 결합강도를 확인하기 위하여, 저해제 물질과 RRF의 복합체에 대한 해리상수를 실제 실험에 의하여 측정할 수 있다.
2) 리보솜의 A-사이트와 결합하는 RRF의 도메인의 삼차원 구조를 이용한 RRF 저해제의 탐색 및 고안
a. 리보솜의 A-사이트와 결합하는 RRF의 꼬인 코일(coiled-coil) 도메인에서 리보솜과의 결합에 필수적인 아미노산의 확인
RRF의 삼차원상의 원자들의 좌표 (표 2)로 표현되는 RRF의 삼차원 구조 (도 1) 상에서 확인된 리보솜과의 결합에 중요하다고 여겨지는 꼬인 코일 도메인의 표면에 있는 아미노산 위치 1, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 14, 15, 17, 18, 19, 107, 108, 109, 111, 112, 114, 115, 116, 118, 119, 120, 122, 123, 125, 126, 127, 129, 130, 132, 133, 134, 136, 137, 138, 140, 141, 143, 144, 145, 146, 147, 148, 150, 151, 152, 153, 155, 156, 158, 159, 161, 162, 164, 165, 166, 167, 169, 170, 172, 173, 174, 176, 177, 179, 180, 181의 아미노산들 중 한 개 혹은 여러 개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환된 RRF를 가지는 대장균의 돌연변이체를 만들 수 있다. 이러한 돌연변이체를 가지는 대장균이 잘 생장하지 못하거나 성장 정도가 느리다면, 이러한 돌연변이체는 RRF의 기능이 저하된 돌연변이체들이다. 즉, 이러한 돌연변이체는 치환된 아미노산에 기인하여 리보솜과 적절하게 결합하지 못하여 RRF의 기능을 제대로 발휘할 수 없는 것이다. 따라서 이러한 돌연변이체들이 가지고 있는 RRF의 치환된 아미노산은 RRF가 리보솜과 직접 결합하는데 중요한 역할을 하는 아미노산일 것이고, 그 치환된 아미노산을 포함하는 부위는 RRF가 리보솜의 A-사이트에 결합하게 하는 RRF의 중요한 결합 사이트가 된다.
b. RRF의 꼬인 코일 도메인의 확인된 결합 사이트의 구조를 이용한 RRF 저해제의 탐색 및 고안
상기에서와 같이, 일단 RRF가 리보솜의 A-사이트에 결합하는데 중요한 역할을 하는 아미노산이 확인되면, RRF의 삼차원 구조를 통하여 그 아미노산을 포함하는 부위의 삼차원 구조를 알 수 있다. 그러면, 그 아미노산을 포함하는 부위의 삼차원 구조를 바탕으로 하여, 그 구조에 상보적인 물질, 예를 들어, 펩타이드 또는 다른 화합물을 탐색 및 고안할 수 있다. 예를 들어, 1번 Met, 3번 Ser, 4번 Asp아미노산에 돌연변이가 생긴 돌연변이체가 가장 적은 활성을 보인다면, 이 세 아미노산이 리보솜과의 결합에서 가장 중요한 역할을 하는 아미노산이라는 것을 알 수 있고, RRF의 삼차원 구조에서 이 세 아미노산이 이루는 부분의 상세한 구조를 알 수 있으므로 그 구조와 상보적인 물질은 RRF와 리보솜의 결합을 방해하게 될 것이다
이러한 상보적인 물질의 탐색 및 고안은 상기에서 설명한 바와 같은 컴퓨터 모델링 방법에 의하여 수행될 수 있다. 또한, 상기에서 설명한 바와 같은, 모델링 방법에 의하여 선택된 화합물의 구조를 변형하거나 치환기를 치환하여 결합력 또는 용해도 등을 개선하는 재모델링을 수행할 수도 있다.
다음으로, 이러한 방법에 의하여 최적화된 구조를 가지는 물질을 합성하고, 그 물질의 RRF 저해 활성을 시험관 내에서 그리고 생체 내에서 시험할 수 있다. 그시험 결과 그 물질이 RRF 저해 활성을 가지는 것으로 확인되면, 그 물질 또는 그 물질의 유도체를 항생제로 사용할 수 있다. 또한, 상기에서 설명한 방식을 사용하여, 저해 활성이 확인된 화합물을 선도 화합물로 사용하여 그 화합물의 특성을 더욱 향상시킬 수 있다.
상기 저해제의 RRF 저해 활성을 확인하기 전에 컴퓨터에 의하여 확인된 결합력을 확인하기 전에, 상기 저해제와 RRF의 복합체의 해리상수를 실제로 측정할 수 있다.
RRF의 삼차원 구조를 이용한 RRF의 유사체 또는 RRF와 저해제 복합체의 구조 결정
RRF의 삼차원 구조 또는 그것의 각 domain은 RRF의 다른 결정형태, RRF의 유사체(RRF와 30 % 이상의 아미노산 유사성을 갖는 경우)의 결정구조, RRF의 돌연변이체 혹은 RRF와 다른 결합물질간의 복합체의 결정구조를 규명하는데 이용될 수 있다. 이러한 방법에 이용되는 것이 분자치환법(molecular replacement)인데, 이 방법을 이용하여 위에서 열거된 단백질들의 구조를 규명하기 위해서는 본 발명의 대장균 RRF의 삼차원 좌표 (표 2)가 이용되어야 한다. 이 방법을 통해 알려져 있지 않은 결정구조를 보다 빠르고 효과적으로 규명할 수 있다. 이러한 방법에 이용되는 프로그램은 아래와 같은 것들이 많이 이용되고 있다.
CNS (Br ger,A.T., Adams,P.D., Clore,G.M., DeLano,W.L., Gros,P., Grosse-Kunstleve,R.W., Jiang,J.S., Kuszewski,J., Nilges,M., Pannu,N.S.,Read,R.J., Rice,L.M., Simonson,T. and Warren,G.L. (1998) Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr., D 54, 905-921)
CCP4 program package (Collaborative Computational Project Number 4 (1994) The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr., D 50, 760-763) : Amore, Polarrfn 등의 분자 치환법 프로그램(molecular replacement program)을 포함하고 있음
EPMR (Kissinger,C.R., Gehlhaar,D.K. and Fogel,D.B. (1999) Rapid automated molecular replacement by evolutionary search. Acta Crystallogr., D 55, 484-491)
RRF의 꼬인 코일 도메인을 모사한 저해제의 개발
RRF의 꼬인 코일 도메인은 리보솜의 A-사이트에 결합하는 것이므로, RRF의 꼬인 코일 도메인의 전부 또는 일부를 모사한 폴리펩티드는 리보솜의 A-사이트에 결합할 수 있다. 이 폴리펩티드는 RRF와 경쟁적으로 리보솜과 결합한다. 결과적으로, RRF가 리보솜에 결합하는 것을 방해하므로, RRF의 저해제로 사용할 수 있다. RRF의 꼬인 코일 도메인 전부를 포함하는 폴리펩티드를 제조하는 것은 RRF의 이차원 아미노산 서열 및 삼차원 구조를 알고 있으므로 일반적인 생물학적 기술 또는 합성적 기술을 사용하여 용이하게 수행될 수 있다.
한편, RRF의 꼬인 코일 도메인 전부를 포함하는 폴리펩티드를 RRF의 저해제로 사용할 수 있지만, 그것은 크기가 크기 때문에 효율적이라고 할 수는 없다. 따라서, RRF의 꼬인 코일 도메인 중에서 리보솜과 결합하는데 중요한 부위(결합 부위)의 삼차원 구조를 모사하는 아미노산 또는 폴리펩티드 또는 이와 유사한 구조의 물질을 포함하는 화합물을 RRF의 저해제로 사용할 수 있다면 더욱 바람직할 것이다. 이러한 화합물은 상기에서 설명한 바와 같이, RRF의 꼬인 코일 도메인의 표면 아미노산에 돌변변이가 발생한 돌연변이체에 의한 대장균의 성장능력을 테스트함으로써 밝혀진 그 도메인의 결합부위의 구조를 모사한 것이 바람직하다. 그러한 화합물의 고안은 상기에서 설명한 바와 같은 컴퓨터 모델링 방법을 사용하여 수행할 수 있다. 또한, 예를 들어, 두 개의 아미노산에 의하여 형성되는 삼차원 구조가 결합부위임이 확인되고, 그 결합부위 근처에 다른 세 개의 아미노산에 의하여 형성되는 삼차원 구조가 결합부위임이 확인되면, 그 두 개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드 및 그 세 개의 아미노산으로 이루어진 폴리펩티드를 각각 RRF의 저해제로 사용할 수 있고, 또한, 두 개의 폴리펩티드를 적절하게 연결한 화합물을 RRF의 저해제로 사용할 수도 있다. 후자의 화합물은 전자의 폴리펩티드보다 그 결합력에 있어서 유리한 활성을 보일 것이다.
한편, 그러한 아미노산 또는 폴리펩티드 또는 이와 유사한 구조의 물질을 포함하는 화합물을 개발하기 위한 다른 방법으로 우선, 결합부위일 것으로 추정되는 아미노산 또는 폴리펩티드를 포함하는 화합물을 고안하고 합성한다. 이 때, 꼬인 코일 도메인의 그 부위는 실제로 리보솜과 결합하는 결합부위인지는 알 수 없다. 따라서, 그 화합물이 실제로 RRF의 저해활성을 가지는지는 시험관 내 또는 생체 내시험을 통하여서만 확인할 수 있다. 만약, 그 화합물이 RRF의 저해 활성을 가지는 것이 확인되면, 그 화합물은 RRF의 저해제로 사용할 수 있고, 그 RRF의 꼬인 코일 도메인에서 그 아미노산 또는 폴리펩티드와 동일한 구조를 가지는 부위가 결합 부위라는 것을 알 수 있을 것이다. 또한, 상기와 같은 방식으로 RRF 활성을 저해하는, 아미노산 또는 폴리펩티드를 포함하는 화합물이 두 개 이상이고, 그 화합물들의 각 아미노산 또는 폴리펩티드가 RRF의 꼬인 코일 도메인의 표면에서 서로 이웃하거나 가깝게 위치하고 있다면, 그 아미노산들 또는 폴리펩티드들을 서로 연결하여 형성되는 새로운 화합물을 고안, 합성할 수 있다. 그리고, 이렇게 합성된 새로운 화합물은 다시 RRF 활성을 저해하는지를 확인할 수 있다. 각 아미노산 또는 폴리펩티드의 연결을 고안함에 있어서, 특별한 잘못이 없다면 대부분의 경우, 새로운 화합물도 역시 RRF 저해 활성을 가질 것이다. 두 개 이상의 아미노산 또는 폴리펩티드가 연결된 새로운 화합물은 분리된 화합물들에 비하여 보다 강력한 저해 활성을 보일 것이다. 왜냐하면, 그것은 리보솜과 보다 강력하게 결합할 수 있기 때문이다.
실시예
대장균 RRF의 발현 및 정제
대장균 RRF 유전자를 대장균 게놈 DNA를 템플레이트로 사용하여 PCR에 의하여 증폭하였다. 그 PCR 산물을 NdeI 및 XhoI로 절단하고 pET22b 벡터에 접합시켜 pET22b-RRF 플라스미드라 명명하였다. 이것을 대장균 세포에 형질전환시켰다.pET22b-RRF 플라스미드로 형질전환된 대장균 세포 B834(DE3)을 50 ㎍㎖-1암피실린을 포함하는 LB 배지 및 310 K의 온도에서 성장시켰다. 대장균 RRF는 4시간동안 0.5 mM IPTG로 유도되었다. 세포들을 원심분리(6분 동안 5000g)에 의하여 277K에서 수확하고 초음파 분쇄한 후 완충용액 A(20 mM 트리스-HCl pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM PMSF)에 재현탁시켰다. 15,000g에서 30분 동안 원심분리한 후, 상등액을 완충용액 A로 평형화된 5 ml 하이트랩(HiTrap) Q 컬럼(Pharmacia) 상에 적용하였다. RRF를 포함하는 용출액을 완충용액 B(20 mM NaH2PO4 pH 6.0, 10 mM MgCl2)에 대하여 투석하고 완충용액 B로 평형화된 5 ml 하이트랩 SP 컬럼(Pharmacia) 상에 로딩시켰다. 용출액에서 확인된 단백질은 한외여과기(ultrafiltration)(Amicon, YM10)에 의하여 농축되고 150 mM NaCl을 포함하는 완충용액 A로 평형화된 수퍼덱스(Superdex) 200 겔-여과 컬럼(HiLoad 16/60, Pharmacia) 상에 로딩되었다. RRF를 포함하는 분획들을 모으고 결정화를 위하여 농축하였다.
결정화 및 구조분석
대장균 RRF의 결정은 계면활성제의 일종인 데실-β-D-말토피라노사이드의 존재하에서 폴리에틸렌글리콜을 침전제로 하여 만들어졌다 (Yun et al., 2000). 자세히 기록하면 다음과 같다. 단백질은 20 mM 트리스-HCl, pH 8.0, 10 mM MgCl2, 1 mM PMSF, 150 mM NaCl의 완충용액에서 100 mg/ml의 농도로 준비되었다. 결정을 성장시키는데 필요한 결정성장용액은 0.1 M MES-NaOH, pH 6.5, 10 % PEG 350 MME, 12 %PEG 400의 조성을 가졌다. 준비된 단백질 용액 2 ㎕를 cover glass위에 놓아 지름 약 2 -3 mm 정도의 방울을 만든 후, 결정성장용액 2 ㎕, 그리고 0.4 ㎕의 18 mM 데실-β-D-말토피라노사이드를 차례로 이 방울 위에 놓았다. 세 가지 용액이 확산에 의해 섞이는 것 이외에 용액을 섞기 위한 다른 시도는 하지 않았다. 세 가지 용액을 합쳐 만든 방울은 마지막 계면활성제를 섞은 직후 0.5 ml의 결정성장용액 위를 덮고 밀봉을 한 후 섭씨 14도에서 평형을 이루게 하였다. 밀봉을 위해서는 진공 그리스를 사용하였다. 이렇게 닫힌 계 (closed system)내에서 방울내의 용액이 결정성장용액과 평형을 이루기 위하여 기상 확산(vapour diffusion)을 시작하고 결과적으로 방울내의 용액의 농도가 증가하게 되어 일주일 정도의 시간이 경과하면 0.15 mm x 0.15 mm x 1.0 mm 정도의 긴 막대모양의 결정이 성장하였다. 이 결정으로부터 X선 회절 데이터를 모아 분석하면, 이 결정은 a = b = 48.06 c = 142.27 의 단위세포길이를 갖고 P3121의 공간군을 갖는다는 것을 알 수 있었다. 또 한 이로부터 하나의 분자가 한 비대칭 단위(asymmetric unit)에 있을 때 용매함량이 53.4 %라는 것을 알 수 있다. 이 구조를 해석하는데는 변칙 스캐터링(anomalous scattering)을 이용한 다중 동형체 치환법(multiple isomorphous replacement (MIRAS))과 용매 플리핑(solvent flipping)과 같은 밀도 변형(density modification) 방법이 사용되었다. 또한 X-선 회절 데이터를 처리하는데는 DENZO, SCALEPACK들의 프로그램, 그리고 모델을 만드는데는 "O", 모델을 최적화하는 데는 "CNS"를 이용하였다.
표 2
본 발명의 RRF 결정에 의하여 분석된 RRF의 삼차원 구조의 좌표
원자 타입 갯수 평균 B 최대 B 평균 Q
단백질 주사슬 740 50.506 108.570 1.000
단백질 측쇄 697 54.907 111.870 1.000
단백질 모든 원자 1437 52.640 111.870 1.000
리간드/기질 0 0.000 0.000 0.000
물 분자 231 61.297 96.420 1.000
기타(Other entities) 14 65.118 79.610 1.000
모든 원자 1682 53.933 111.870 1.000
상기 표에서 (나)로 표시된 "원자 타입" 은 각각의 좌표가 결정된 원소들을 가리킨다. 각 행의 첫 번째 글자가 그 원소를 가리킨다. 예를 들면 "O"로 시작하는 것은 산소, "C"로 시작하는 것은 탄소, "N"으로 시작하는 것은 질소, "S"로 시작하는 것은 황이다. 단 "HG"는 수은을 뜻한다.
(다)로 표시된 "아미노산 종류"는 20개의 아미노산 외에, HOH는 물분자이고, MER는 수은 원자, DMA는 계면활성제를 가리킨다.
(라)로 표시된 "아미노산의 번호"는 1 - 185는 RRF의 185개 아미노산, 302-645는 물분자, 701-703은 수은 원자, 801은 계면활성제를 가리킨다.
"X, Y, Z" 은 결정학적으로 측정된 각 원소들의 3차원상의 위치를 가리킨다.
(마)로 표시된 "공간율(Occupancy)"은 각 원자가 공간을 차지하고 있는 정도를 가리킨다. 예를 들면 1.0은 지정된 좌표상에 그 원자 한 개가 위치함을 말하고, 0.2는 0.2개의 원자만이 존재함을 뜻한다.
"B" 는 "온도요소"로서 각 원자의 중심으로부터 원자가 움직이는 정도를 가리킨다.
본 발명은 계면활성제의 존재하에서 그 계면활성제와 복합화된 RRF의 결정을 얻고, 이것에 의하여 RRF의 삼차원 구조를 분석하여 리보솜의 A-사이트와 결합하는 RRF의 결합부위와 소수성 틈을 형성하는 활성부위를 확인하였으며, 이러한 RRF의 삼차원 구조, 특히 RRF의 결합부위 및 활성부위의 삼차원 구조를 이용하여 RRF의 기능을 저해하는 RRF 저해제를 효율적으로 고안할 수 있게 한다. RRF는 원핵생물에서는 생존에 필수적인 것이지만 진핵생물에 있어서는 반드시 있어야 하는 것은 아니라는 사실에 의거하여 RRF 저해제는 항생제로 사용될 수 있다.
인용문헌
Agrawal, R. K., Penczek, P., Grassucci, R. A., Li, Y., Leith, A., Nierhaus, K. H., and Frank, J. (1996). Direct visualization of A-, P-, and E-site transfer RNAs in the Escherichia coli ribosome. Science 271, 1000-1002.
Agrawal, R. K., Penczek, P., Grassucci, R. A., and Frank, J. (1998). Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: the mechanism of translocation. Proc Natl Acad Sci USA 95, 6134-6138.
Agrawal, R. K., Heagle, A. B., Penczek, P., Grassucci, R. A., and Frank, J. (1999). EF-G dependent GTP hydrolysis induces translocation accompanied by large conformational changes in the 70S ribosome. Nat. Struct. Biol. 6, 643-647.
Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Capel, M., Moore, P. B., and Steitz, T. A. (1999). Placement of protein and RNA structures into a 5 resolution map of the 50S ribosomal subunit. Nature 400, 841-847.
Blundel et al., 1976, Protein Crystallography, Academic Press.
Brock, S., Szkaradkiewicz, K., and Sprinzl, M. (1998). Initiation factors of protein biosynthesis in bacteria and their structural relationship to elongation and termination factors. Mol Microbiol. 29, 409-417.
Brunger, A. T., Adams, P. D., Clore, G. M., DeLano, W. L., Gros, P., Grosse-Kunstleve, R. W., Jiang, J. S., Kuszewski, J., Nilges, M., Pannu, N. S., Read, R. J., Rice, L. M., Simonson, T., and Warren, G. L. (1998).Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallogr. D 54, 905-921.
Bullough, P. A., Hughson, F. M., Skehel, J. J., and Wiley, D. C. (1994). Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature 371, 37-43.
Collaborative Computational Project Number 4 (1994). The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D 50, 760-763.
Colovos, C., and Yeates, T. O. (1993). Verification of protein structures: patterns of nonbonded atomic interactions. Protein Sci. 2, 1511-1519.
Fortelle, E. d. L., and Bricogne, G. (1997). Maximum likelihood heavy atom refinement for multiple isomorphous replacement and multianomalous diffraction methods. Methods Enzymol. 276, 472-494.
Freistroffer, D. V., Pavlov, M. Y., MacDougall, J., Buckingham, R. H., and Ehrenberg, M. (1997). Release factor RF3 in E.coli accelerates the dissociation of release factors RF1 and RF2 from the ribosome in a GTP-dependent manner. EMBO J. 16, 4126-4133.
Grentzmann, G., Kelly, P. J., Laalami, S., Shuda, M., Firpo, M. A., Cenatiempo, Y., and Kaji, A. (1998). Release factor RF-3 GTPase activity acts in disassembly of the ribosome termination complex.. RNA 4, 973-983.
Heurgue-Hamard, V., Karimi, R., Mora, L., MacDougall, J., Leboeuf, C., Grentzmann, G., Ehrenberg, M., and Buckingham, R. H. (1998). Ribosome release factor RF4 and termination factor RF3 are involved in dissociation of peptidyl-tRNA from the ribosome. EMBO J. 17, 808-816.
Janosi, L., Shimizu, I., and Kaji, A. (1994). Ribosome recycling factor (ribosome releasing factor) is essential for bacterial growth. Proc Natl Acad Sci USA 91, 4249-4253.
Janosi, L., Ricker, R., and Kaji, A. (1996). Dual functions of ribosome recycling factor in protein biosynthesis: disassembling the termination complex and preventing translational errors. Biochimie 78, 959-969.
Janosi, L., Mottagui-Tabar, S., Isaksson, L. A., Sekine, Y., Ohtsubo, E., Zhang, S., Goon, S., Nelken, S., Shuda, M., and Kaji, A. (1998). Evidence for in vivo ribosome recycling, the fourth step in protein biosynthesis. EMBO J. 17, 1141-1151.
Jones, T. A., Zou, J.-Y., Cowan, S. W., and Kjeldgaard, M. (1991). Improved methods for binding protein models in electron density maps and the location of errors in these models. Acta Crystallogr. A 47, 110-119.
Kaji, A., Teyssier, E., and Hirokawa, G. (1998). Disassembly of the post-termination complex and reduction of translational error by ribosome recycling factor (RRF)-A possible new target for antibacterial agents.Biochem Biophys Res Commun. 250, 1-4.
Kanai, T., Takeshita, S., Atomi, H., Umemura, K., Ueda, M., and Tanaka, A. (1998). A regulatory factor, Fil1p, involved in derepression of the isocitrate lyase gene in Saccharomyces cerevisiae--a possible mitochondrial protein necessary for protein synthesis in mitochondria. Eur J Biochem. 256, 212-220.
Karimi, R., Pavlov, M. Y., Buckingham, R. H., and Ehrenberg, M. (1999). Novel roles for classical factors at the interface between translation termination and initiation. Mol Cell 3, 601-609.
Kissinger, C. R., and Gehlhaar, D. K. (1998). EPMR, A program for crystallographic molecular replacement by evolutionary search, versions 2.1 (Agouron Pharmaceticals, Inc.).
Kraulis, P. J. (1991). MOLSCRIPT: a program to produce both detailed and schematic plots of protein. J. Appl. Crystallogr. 24, 946-950.
Laskowski, R. A., Macarthur, M. W., Moss, D. S., and Thornton, J. M. (1993). PROCHECK: a program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291.
Liljas, A., and Garber, M. (1995). Ribosomal proteins and elongation factor. Current Opinion in Str. Biol. 5, 721-727.
Lupas, A. (1996). Coiled coils: new structures and new functions.Trends Biochem. Sci. 21, 375-382.
Martemyanov, K. A., and Gudkov, A. T. (1999). Domain IV of elongation factor G from Thermus thermophilus is strictly required for translocation. FEBS Lett 452, 155-159.
Nakamura, Y., Ito, K., and Isaksson, L. A. (1996). Emerging understanding of translation termination. Cell 87, 147-150.
Nevskaya, N., Tishchenko, S., Nikulin, A., al-Karadaghi, S., Liljas, A., Ehresmann, B., Ehresmann, C., Garber, M., and Nikonov, S. (1998). Crystal structure of ribosomal protein S8 from Thermus thermophilus reveals a high degree of structural conservation of a specific RNA binding site. J. Mol. Biol. 279, 233-244.
Kim, K. K., Min, K., and Suh, S. W. (2000). Crystal structure of the ribosome recycling factor from Escherichia coli. EMBO J. 19(10), 2363-2370.
Nicholls, A., Sharp, K. A., and Honig, B. (1991). Protein folding and association: insights from the interfacial and thermodynamic properties of hydrocarbons. Prot. Struct. Funct. Genet. 11, 281-296.
Nissen, P., Kjeldgaard, M., Thirup, S., Polekhina, G., Reshetnikova, L., Clark, B. F., and Nyborg, J. (1995). Crystal structure of the ternary complex of Phe-tRNAPhe, EF-Tu, and a GTP analog. Science 270, 1464-1472.
Otwinowski, Z., and Minor, W. (1997). Processing of X-ray diffractiondata collected in oscillation model. Methods Enzymol. 276, 307-326.
Pavlov, M. Y., Freistroffer, D. V., MacDougall, J., Buckingham, R. H., and Ehrenberg, M. (1997a). Fast recycling of Escherichia coli ribosomes requires both ribosome recycling factor (RRF) and release factor RF3. EMBO J. 16, 4134-4141.
Pavlov, M. Y., Freistroffer, D. V., Heurgue-Hamard, V., Buckingham, R. H., and Ehrenberg, M. (1997b). Release factor RF3 abolishes competition between release factor RF1 and ribosome recycling factor (RRF) for a ribosome binding site. J Mol Biol. 273, 389-401.
Rolland, N., Janosi, L., Block, M. A., Shuda, M., Teyssier, E., Miege, C., Cheniclet, C., Carde, J. P., Kaji, A., and Joyard, J. (1999). Plant ribosome recycling factor homologue is a chloroplastic protein and is bactericidal in Escherichia coli carrying temperature-sensitive ribosome recycling factor. Proc Natl Acad Sci USA 96, 5464-5469.
Ryoji, M., Berland, R., and Kaji, A.(1981). Reinitiation of translation from the triplet next to the amber termination codon in the absence of ribosome-releasing factor. Proc Natl Acad Sci USA 78, 5973-5977.
Wang, R., Liu, L., and Lai, L. (1998). SCORE: A New Empirical Method for Estimating the Bindind Affinity of a Protein-Ligand Complex. J. Mol. Model 4, 379-394.
Yun, J., Kim, W., Ha, S. S., Eom, S.-H., Suh, S. W., and Kim, K. K. (2000). Crystallization and preliminary crystallographic studies of ribosome recycling factor from Escherichia coli. Acta Crystallogr D 56, 84-85 .
Claims (21)
- RRF 또는 RRF의 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 치환 또는 제거되거나 RRF의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가된 것으로서 RRF의 3차원 구조와 실질적으로 동일한 RRF 돌연변이체 또는 RRF 유사체; 및RRF의 두 도메인 사이에 형성되는 소수성 틈에 결합되는 화합물을 포함하는RRF 또는 RRF 유사체의 결정.
- 제1항에 있어서,상기 RRF 또는 RRF 유사체의 소수성 틈에 결합하는 상기 화합물은 직쇄상에 3~12 탄소수를 가지는 알킬기를 포함하는 화합물 또는 직쇄상에 3~12 탄소수를 가지는 알킬기와 비소수성 결합을 할 수 있는 작용기를 가지는 그룹을 포함하는 화합물인RRF 또는 RRF 유사체의 결정.
- 제1항에 있어서,상기 RRF 또는 RRF 유사체의 소수성 틈에 결합하는 상기 화합물은 데실-β-D-말토피라노사이드(decyl-β-D-maltopyranoside)인RRF 또는 RRF 유사체의 결정.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,상기 RRF 또는 RRF 유사체의 삼차원 상의 각 원자들의 위치와 이에 대응하는 표 2에 표시된 각 원자들의 삼차원 상의 위치간의 rmsd(root mean square devication)이 0.2 nm 내에서 특성화되는 삼차원 구조를 가지는RRF 또는 RRF 유사체의 결정.
- RRF 또는 RRF의 아미노산 잔기들 중 하나 이상이 치환 또는 제거되거나 RRF의 아미노산 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기가 부가된 것으로서 RRF의 3차원 구조와 실질적으로 동일한 RRF 돌연변이체 또는 RRF 유사체를 RRF의 두 도메인 사이에 형성되는 소수성 틈에 결합되는 화합물의 존재 하에서 결정화하는 단계를 포함하는RRF 또는 RRF 유사체의 결정화 방법.
- 제5항에 있어서,상기 RRF 또는 RRF 유사체의 소수성 틈에 결합하는 상기 화합물은 직쇄상에3~12 탄소수를 가지는 알킬기를 포함하는 화합물 또는 직쇄상에 3~12 탄소수를 가지는 알킬기와 비소수성 결합을 할 수 있는 작용기를 가지는 그룹을 포함하는 화합물인RRF 또는 RRF 유사체의 결정화 방법.
- 제5항에 있어서,상기 RRF 또는 RRF 유사체의 소수성 틈에 결합하는 상기 화합물은 데실-β-D-말토피라노사이드(decyl-β-D-maltopyranoside)인RRF 또는 RRF 유사체의 결정화 방법.
- RRF 또는 RRF 유사체의 소수성 틈에 결합하여 RRF 또는 RRF 유사체의 활성을 저해하는 화합물로서, RRF의 소수성 틈과 소수성 결합을 할 수 있는 직쇄상에 3~12 탄소수를 가지는 알킬기를 포함하는 화합물 또는 직쇄상에 3~12 탄소수를 가지는 알킬기와 RRF의 소수성 틈의 둘레 또는 그 주위와 비소수성 결합을 할 수 있는 작용기를 가지는 그룹을 포함하는 화합물을 포함하는 RRF 저해제.
- 제8항에 있어서,상기 RRF 또는 RRF 유사체의 소수성 틈에 결합하는 상기 화합물은 데실-β-D-말토피라노사이드(decyl-β-D-maltopyranoside)인 RRF 저해제.
- 표 2로 표시되는 RRF의 삼차원 구조 좌표에 의하여 정의되는 RRF의 삼차원 구조를 이용하여 RRF 저해제 후보 화합물 또는 화합물의 부분(fragment)을 화합물 데이터베이스로부터 선택하거나 고안하는 단계;컴퓨터 모델링 방법을 이용하여 상기 선택 또는 고안된 RRF 저해제 후보 물질을 상기 RRF의 삼차원 구조에 적용시키는 단계;상기 RRF 저해제 후보 물질과 상기 RRF 간의 상호작용의 적합성을 판단하는 단계; 및RRF의 활성을 저해할 수 있을 정도로 RRF에 대하여 상호작용의 적합성을 가지는 화합물 또는 화합물의 부분을 선택하는 단계를 포함하는RRF 저해제의 고안방법.
- 제10항에 있어서,RRF의 활성을 저해할 수 있을 정도로 RRF에 대하여 상호작용의 적합성을 가지는 상기 화합물 또는 화합물의 부분을 상기 RRF의 삼차원 구조를 이용하여 더 적합한 구조로 변형하고, 상기 RRF의 삼차원 구조에 적용시키는 단계 및 상호작용의적합성을 판단하는 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는RRF 저해제의 고안방법.
- 제10항에 있어서,RRF에 대하여 상호작용의 적합성을 가지는 두 개이상의 상기 화합물 또는 화합물의 부분이 RRF의 서로 다른 이웃 부위에 결합하는 경우, 그 화합물들 또는 화합물의 부분들을 서로 연결하여 하나의 화합물로 고안하고, 상기 RRF의 삼차원 구조에 적용시키는 단계 및 상호작용의 적합성을 판단하는 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는RRF 저해제의 고안방법.
- 제10항에 있어서,RRF에 대하여 상호작용의 적합성을 가지는 상기 화합물을 합성하는 단계;원핵생물에 대하여 상기 화합물이 RRF의 활성을 저해하는지를 시험관 내 또는 생체 내 시험을 통하여 확인하는 단계; 및상기 확인단계에서 RRF의 저해 활성이 확인된 화합물을 상기 RRF의 삼차원 구조를 이용하여 더 적합한 구조로 변형하고, 상기 RRF의 삼차원 구조에 적용시키는 단계 및 상호작용의 적합성을 판단하는 단계를 반복하는 단계를 더 포함하는RRF 저해제의 고안방법.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,이용되는 상기 RRF의 삼차원 구조는 두 개의 도메인에 의하여 형성되는 소수성 틈 및 그 둘레 또는 주위의 아미노산들에 의하여 형성되는 삼차원 구조인RRF 저해제의 고안방법.
- 제14항에 있어서,상기 RRF 저해제 후보 화합물 또는 화합물의 부분은 상기 RRF의 소수성 틈에 소수성 결합할 수 있는 알킬기를 포함하고 상기 RRF의 소수성 틈의 둘레 또는 그 주위와 비소수성 결합을 할 수 있는 작용기를 포함하는 그룹을 포함하는 것인RRF 저해제의 고안방법.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,상기 RRF에 대하여 상호작용의 적합성을 판단하는 단계는 상기 저해제 후보 화합물 또는 화합물의 부분과 상기 RRF의 결합강도가 이 둘의 복합체의 해리상수를 기준으로 100마이크로몰 이하일 때, 적합한 것으로 판단하는 것인RRF 저해제의 고안방법.
- 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,이용되는 상기 RRF의 삼차원 구조는 RRF의 꼬인 코일(coiled coil) 도메인 중 리보솜과 결합하는 부위의 삼차원 구조인RRF 저해제의 고안방법.
- 제17항에 있어서,상기 RRF의 꼬인 코일 도메인의 표면 아미노산들 중 하나 또는 그 이상이 치환된 돌연변이체를 만드는 단계;상기 돌연변이체를 가지는 원핵생물이 성장상태를 조사하는 단계; 및상기 원핵생물이 성장하지 못하거나 성장속도가 느린 경우, 치환된 원래의 RRF의 아미노산을 포함하는 부위를 리보솜에 결합하는 결합부위로 확인하는 단계를 더 포함하는RRF 저해제의 고안방법.
- RRF의 꼬인 코일(coiled coil) 도메인의 구조와 실질적으로 동일한 삼차원구조를 포함하는 폴리펩티드.
- RRF의 꼬인 코일 도메인의 표면 아미노산들 중 하나 또는 그 이상이 치환된 돌연변이체를 만드는 단계;상기 돌연변이체를 가지는 원핵생물의 성장상태를 조사하는 단계;상기 원핵생물이 성장하지 못하거나 성장속도가 느린 경우, 치환된 원래의 RRF의 아미노산을 포함하는 부위를 결합부위로 확인하는 단계;상기 결합부위로 확인된 아미노산 또는 폴리펩티드 또는 이와 유사한 구조의 물질을 포함하는 화합물을 상기 RRF의 삼차원 구조를 이용하여 고안하는 단계;상기 화합물을 합성하는 단계;상기 화합물이 RRF 저해 활성을 가지는지를 시험관 내 시험 또는 생체 내 시험을 통하여 확인하는 단계; 및RRF 저해 활성이 확인된 상기 화합물을 RRF 저해제로 선택하는 단계를 포함하는RRF 저해제의 고안방법.
- 제20항에 있어서,RRF 저해 활성이 확인된 아미노산 또는 폴리펩티드 또는 이와 유사한 구조의물질을 포함하는 상기 두 개 이상의 화합물의 각 아미노산 또는 폴리펩티드또는 이와 유사한 구조의 물질이 RRF의 꼬인 코일 도메인의 표면에서 서로 이웃하거나 가까운 위치에 존재하는 경우, 상기 한 화합물에 존재하는 아미노산 또는 폴리펩티드 또는 이와 유사한 구조의 물질을 다른 화합물에 존재하는 아미노산 또는 폴리펩티드 또는 이와 유사한 구조의 물질과 연결하여 새로운 화합물을 합성하는 단계; 및상기 새로운 화합물이 RRF 저해 활성을 가지는지를 확인하는 상기 단계를 더 포함하는RRF 저해제의 고안방법.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020000037527A KR20020004089A (ko) | 2000-07-01 | 2000-07-01 | 리보솜 재활용 인자의 삼차원 구조 및 결정화 방법 |
| JP2000348260A JP2002017377A (ja) | 2000-07-01 | 2000-11-15 | リボソームリサイクル因子の三次元構造および結晶化方法 |
| US09/731,487 US20020022257A1 (en) | 2000-07-01 | 2000-12-07 | Three-dimensional structure and crystallization method of ribosome recycling factor (RRF) |
| US10/357,884 US20030199070A1 (en) | 2000-07-01 | 2003-02-03 | Crystallization of ribosome recycling factor (RRF) and method of developing inhibitor of RRF |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020000037527A KR20020004089A (ko) | 2000-07-01 | 2000-07-01 | 리보솜 재활용 인자의 삼차원 구조 및 결정화 방법 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20020004089A true KR20020004089A (ko) | 2002-01-16 |
Family
ID=19675742
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020000037527A Ceased KR20020004089A (ko) | 2000-07-01 | 2000-07-01 | 리보솜 재활용 인자의 삼차원 구조 및 결정화 방법 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20020022257A1 (ko) |
| JP (1) | JP2002017377A (ko) |
| KR (1) | KR20020004089A (ko) |
Families Citing this family (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6638908B1 (en) * | 2000-08-09 | 2003-10-28 | Yale University | Crystals of the large ribosomal subunit |
| US6947844B2 (en) * | 2000-08-09 | 2005-09-20 | Yale University | Modulators of ribosomal function and identification thereof |
| IL151012A0 (en) * | 2001-08-03 | 2003-02-12 | Ribosomes Structure And Protei | Ribosomes structure and protein synthesis inhibitors |
| US6952650B2 (en) * | 2001-08-03 | 2005-10-04 | Yale University | Modulators of ribosomal function and identification thereof |
| KR20050033510A (ko) * | 2001-10-05 | 2005-04-12 | 프로사이트 코포레이션 | 피부의 색소 과다 침착의 치료방법 |
| WO2008148054A1 (en) * | 2007-05-24 | 2008-12-04 | The Regents Of The University Of California | Structures of aminoglycoside antibiotics bound to both subunits of the bacterial ribosome |
| CN107266540A (zh) * | 2017-07-19 | 2017-10-20 | 福州大学 | 一种结核分枝杆菌延伸因子EF‑Tu蛋白的制备方法 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998037202A1 (fr) * | 1997-02-24 | 1998-08-27 | Akira Kaji | Isolation de genes de facteur recyclant les ribosomes et determination des structures primaires de genes de facteur recyclant les ribosomes de pseudomonas aeruginosa et d'une autre bacterie |
| JPH11196877A (ja) * | 1998-01-12 | 1999-07-27 | Akira Kaji | リボソームリサイクリング因子（ｒｒｆ）の阻害を検出する方法、同因子を阻害する物質のスクリーニング方法、該方法によってスクリーニングされた抗菌物質、並びにそれらの方法に有用なプラスミド及びそのプラスミドで形質転換された宿主細胞 |
| JP2000086696A (ja) * | 1998-09-08 | 2000-03-28 | Akira Kaji | リボソームリサイクリング因子（ｒｒｆ）タンパクの結晶及び該結晶から得られる三次元構造情報に基づくラシヨナルドラグデザインへの応用 |
| JP2000157275A (ja) * | 1998-11-20 | 2000-06-13 | Giichi Nakamura | 高度好熱菌リボソームリサイクリングファクター遺伝子 |
-
2000
- 2000-07-01 KR KR1020000037527A patent/KR20020004089A/ko not_active Ceased
- 2000-11-15 JP JP2000348260A patent/JP2002017377A/ja active Pending
- 2000-12-07 US US09/731,487 patent/US20020022257A1/en not_active Abandoned
-
2003
- 2003-02-03 US US10/357,884 patent/US20030199070A1/en not_active Abandoned
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1998037202A1 (fr) * | 1997-02-24 | 1998-08-27 | Akira Kaji | Isolation de genes de facteur recyclant les ribosomes et determination des structures primaires de genes de facteur recyclant les ribosomes de pseudomonas aeruginosa et d'une autre bacterie |
| JPH11196877A (ja) * | 1998-01-12 | 1999-07-27 | Akira Kaji | リボソームリサイクリング因子（ｒｒｆ）の阻害を検出する方法、同因子を阻害する物質のスクリーニング方法、該方法によってスクリーニングされた抗菌物質、並びにそれらの方法に有用なプラスミド及びそのプラスミドで形質転換された宿主細胞 |
| JP2000086696A (ja) * | 1998-09-08 | 2000-03-28 | Akira Kaji | リボソームリサイクリング因子（ｒｒｆ）タンパクの結晶及び該結晶から得られる三次元構造情報に基づくラシヨナルドラグデザインへの応用 |
| JP2000157275A (ja) * | 1998-11-20 | 2000-06-13 | Giichi Nakamura | 高度好熱菌リボソームリサイクリングファクター遺伝子 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 1999 Dec;55 ( Pt 12):2049-50 * |
| Science. 1999 Dec 17;286(5448):2349-52 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JP2002017377A (ja) | 2002-01-22 |
| US20030199070A1 (en) | 2003-10-23 |
| US20020022257A1 (en) | 2002-02-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Shin et al. | Structural analyses of peptide release factor 1 from Thermotoga maritima reveal domain flexibility required for its interaction with the ribosome | |
| Botos et al. | Crystal structure of the AAA+ α domain of E. coli Lon protease at 1.9 Å resolution | |
| Andersen et al. | High resolution crystal structure of bovine mitochondrial EF-Tu in complex with GDP | |
| US20040137518A1 (en) | CRYSTALLIZED PPARa LIGAND BINDING DOMAIN POLYPEPTIDE AND SCREENING METHODS EMPLOYING SAME | |
| US6197495B1 (en) | Methods using the staphylococcus aureus glycyl tRNA synthetase crystalline structure | |
| Wada et al. | Molecular dynamism of Fe–S cluster biosynthesis implicated by the structure of the SufC2–SufD2 complex | |
| US20030068650A1 (en) | Target analysis for chemistry of specific and broad spectrum anti-infectives and other therapeutics | |
| Ruzheinikov et al. | Analysis of the open and closed conformations of the GTP-binding protein YsxC from Bacillus subtilis | |
| Rimsa et al. | High-resolution structure of the M14-type cytosolic carboxypeptidase from Burkholderia cenocepacia refined exploiting PDB_REDO strategies | |
| US20030199070A1 (en) | Crystallization of ribosome recycling factor (RRF) and method of developing inhibitor of RRF | |
| US6845328B2 (en) | Screening methods using the crystal structure of ribosomal protein L11/GTPase activating region rRNA complex | |
| CA2352036A1 (en) | Crystal structure of antibiotics bound to the 30s ribosome and its use | |
| US20150094229A1 (en) | Methods for the screening of antibacterial substances | |
| JP2003510250A (ja) | スタフィロコッカス・アウレウス延長因子ｐの結晶化および構造決定 | |
| WO2005017137A1 (en) | Novel purified polypeptides from hemophilus influenzae | |
| US7606670B2 (en) | Crystal structure of the 30S ribosome and its use | |
| US7079956B2 (en) | Crystal structure of antibiotics bound to the 30S ribosome and its use | |
| Jeon et al. | Insights into the structure of mature streptavidin C1 from Streptomyces cinnamonensis reveal the self-binding of the extension C-terminal peptide to biotin-binding sites | |
| Zhou et al. | De novo design protein binders for MBP and GST tags | |
| US20030082773A1 (en) | Crystal structure | |
| Negron Teron et al. | Cocrystallization of ubiquitin–deubiquitinase complexes through disulfide linkage | |
| Lakhanpal | Biophysical Characterization of Cell Signalling Proteins from Arabidopsis thaliana: CYP71, Chromatin Remodelling Protein and CNGC18, Ca2+ Permeable Cation Channel | |
| US20050038611A1 (en) | S8 rrna-binding protein from the small ribosomal subunit of staphylococcus aureus | |
| Ferbitz | Structure of trigger factor in complex with the ribosome defines the molecular environment of the emerging nascent polypeptide chain | |
| WO2002061063A1 (en) | Crystal structure of peroxiredoxin 5 and its use for design of structural homologues |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20000701 |
|
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| PN2301 | Change of applicant |
Patent event date: 20010104 Comment text: Notification of Change of Applicant Patent event code: PN23011R01D |
|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0201 | Request for examination |
Patent event code: PA02012R01D Patent event date: 20020107 Comment text: Request for Examination of Application Patent event code: PA02011R01I Patent event date: 20000701 Comment text: Patent Application |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20040326 Patent event code: PE09021S01D |
|
| E601 | Decision to refuse application | ||
| PE0601 | Decision on rejection of patent |
Patent event date: 20040726 Comment text: Decision to Refuse Application Patent event code: PE06012S01D Patent event date: 20040326 Comment text: Notification of reason for refusal Patent event code: PE06011S01I |