KR20020007332A - 일 단계 샘플 제조 및 복합적인 생물학적 샘플에서 핵산의검출 - Google Patents

일 단계 샘플 제조 및 복합적인 생물학적 샘플에서 핵산의검출 Download PDF

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Abstract

복합적인 생물학적 샘플로부터 핵산의 동시 방출 및 검출방법이 기재되어 있다. 본 발명은 세포 용균 및 세포성 핵산의 방출을 촉진시키기 위해 구아니딘 티오시아네이트와 같은 강력한 카오트로픽제(chaotropic agent)를 함유하는 용균 완충액의 배합 사용 및 핵산 혼성화에 의해 용균중 방출된 특정 핵산을 검출하기 위한 새로운 타입의 바이사이클릭 뉴클레오타이드 유사체, 록(locked) 핵산(LNA)의 사용에 관한 것이다. 특히 포획 LNA-올리고의 공유 결합을 위한 특별한 방법이 기재되어 있다. 예를 들어 폴리아데닐화된 mRNA의 샘플 제조를 위한 새로운 방법이 또한 제시되어 있다. 본 발명은 추가로 상기 방법을 수행하기 위한 시약 및 상기 방법의 시약 및 적용에 관한 것이다.

Description

일 단계 샘플 제조 및 복합적인 생물학적 샘플에서 핵산의 검출{One step sample preparation and detection of nucleic acids in complex biological samples}
관련기술의 간단한 설명
원핵 및 진핵세포로부터 또는 복합적인 생물학적 샘플로부터 핵산을 분리하기 위해 사용되는 기술에서 페놀과 클로로포름과 같은 유기용매를 전통적으로 사용한다. 핵산 분리는 전형적으로 프로테아제로 수행되는 효소 분해로 시작하여 이온성 계면활성제를 이용하여 세포를 용균(lysis)한후 페놀 또는 페놀/클로로포름 배합물로 추출하는 것으로 이어진다. 유기 및 수성 상을 분리하고 수성상으로 분배된 핵산을 알콜 침전에 의해 회수한다. 그러나, 페놀 또는 페놀/클로로포름 혼합물은 인간 피부에 대해 부식성이고 주의하여 다루어져야 하고 적절히 폐기되어야 하는 위험한 폐기물로 인식되어 있다. 더욱이, 추출방법은 시간 소모적이고 노동 집약적이다. Marmur, J. Mol. Biol., 3: 208-218(1961)에 효소 처리, 계면활성제 첨가, 및 페놀 또는 페놀/클로로포름과 같은 유기용매의 사용에 의해 원핵생물로부터 완전한 상태의 고분자량 DNA를 추출 및 정제하는 표준 분취 과정이 기재되어 있다. Chirgwin 등, Biochemistry, 18: 5294-5299(1979)에는 GnSCN 및 2-머캅토에탄올중에서 균질화한후, 에탄올 침전 또는 염화세슘을 통한 침전에 의해 리보뉴클레아제가 풍부한 조직으로부터 완전한 상태의 RNA를 분리하는 것이 기재되어 있다. 더욱 개선된 방법이 Current Protocols in Molecular Biology, pub. John Wiley & Sons (1998)에 Ausubel 등에 의해 기재되어 있다.
또한, 카오트로픽(chaotropic) 염이 세포의 용균을 촉진함과 동시에 뉴클레아제와 프로테아제를 저해한다는 사실에 크게 기인하여, 구아니딘 티오시아네이트(GnSCN)와 같은 카오트로픽제(chaotropic agents)의 사용이 핵산을 세포로부터 용액중으로 용균시키고 방출하는데 광범위하게 이용되고 있다.
핵산 혼성화가 알려져 있고 이는 증빙된 핵산의 동정방법이다. 혼성화는 상보적인 핵산 가닥의 염기쌍 형성에 기초한다. 1본쇄 핵산을 적절한 완충용액중에서 인큐베이션하면, 상보적 염기서열은 쌍을 이루어 2본쇄의 안정한 분자를 형성한다. 그러한 쌍의 존재 또는 부재는 당업계에 잘 알려진 몇몇 다른 방법에 의해 검출될 수 있다.
본 발명과 관련하여 특히 흥미로운 기술이 Cell, Vol. 12, pages 23-36(1977)에 Dunn & Hassell에 의해 기재되어 있다. 그들의 분석법은 "표적"(target) 핵산과 고형 지지체상에 고정화된 "포획"(capturing) 핵산 탐침간에 일어나는 제1 혼성화에 의한 샌드위치-형이다. 그후 전형적으로 플루오로포어, 방사성 동위원소 또는 항원 결정기에 의해 표지된 "신호"(signal) 핵산 탐침이 고정화된 표적 핵산의 다른 부분에 혼성화하는 제2 혼성화가 이어진다. 그후 신호 탐침의 혼성화는 예를 들어, 형광측정법에 의해 검출될 수 있다.
US 4,486,539 및 US 4,563,419 및 EP 0,079,139에서 Ranki 등은 먼저 핵산을 1본쇄로 만든후 1본쇄 핵산을 고형 담체에 고정된 핵산 및 방사성 동위원소로 표지된 핵산과 혼성화하도록 하는 단계를 필요로 하는 샌드위치-형 분석법을 기술하고 있다. 따라서, Ranki 등의 분석법은 분석에서 동정 또는 표적화하고자 하는 핵산의 1본쇄화를 필요로 한다.
카오트로픽 용액중에서 생물학적 샘플을 용해시키고 용해된 샘플상에서 직접 분자적 혼성화를 수행하는 접근법이 Thompson 및 Gillespie, "Analytical Biochemistry", 163: 281-291(1987)에 의해 기재되어 있다. 또한 WO 87/06621를 참조하라. Cox 등은 또한 핵산 혼성화를 수행하는 방법 및 세포로부터 핵산을 분리하는 방법에서 GnSCN의 사용을 기술하였다(EP-A-0-127-327).
DNA 또는 RNA 탐침과의 분자적 혼성화에 적당한 상태에 있는 니트로셀룰로스 막상에서의 봉입 및 고정화를 위해 생물학적 출처중의 DNA 또는 mRNA를 이용할 수 있도록 하기 위하여, Bresser, Doering 및 Gillespie, "DNA", 2: 243-254(1983)은 NaI의 사용을 보고하였고, Manser 및 Gefter, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 2470-2474(1984)는 NaSCN의 사용을 보고하였다.
포획-탐침으로서의 또한 올리고를 검출하기 위한 LNA의 사용은 지금까지 연구된 바 없다. LNA의 특이한 특징으로 인해, DNA와 RNA가 안정한 하이브리드를 형성할 수 없는 조건, 예를 들어, 순수한 물 또는 계면활성제와 고농도의 강력한 카오트로픽제를 함유하는 완충액내에서 효율적인 혼성화를 얻는 것이 가능하다. 따라서, 포획-혼성화, 검출-혼성화 및 세포-용균 단계들을 한 단계로 수행하는 것이가능하다.
발명의 요약
본 발명은 핵산의 혼성화 및 추출을 위한 조성물 및 분석방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 복합적인 생물학적 샘플이나 표본중에서 세포로부터 핵산을 방출하는 동시에 용균중에 방출된 상보적 핵산을 혼성화하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 결정적인 성분은 인 비트로 DNA 진단을 향상시키기 위해 가장 중요한 후보가 되도록 하는 다소 이상한 특징을 갖는 새로운 클래스의 DNA 유사체인 LNA이다. LNA 모노머는 RNA-모노머와 구조적으로 매우 유사한 바이사이클릭 화합물이고, 화학식 Ⅰ을 참조하라. LNA는 DNA 및 RNA와 대부분의 화학적 성질을 공유하고, 수용성이며, 전기영동, 에탄올 침전 등에 의해 분리될 수 있다. 더욱이, LNA 올리고뉴클레오타이드는 표준 포스포르아미디트 화학에 의해 편리하게 합성된다. 포스포르아미디트 화학은 LNA와 DNA(또는 RNA)를 모두 함유하는 키메라 올리고의 합성을 가능하게 한다. 따라서, 미리 결정된 녹는점(Tm)을 갖는 혼합된 LNA/DNA 올리고를 제조할 수 있다. 또한 포스포르아미디트 합성 접근법은 유동적이므로 모든 상업적으로 입수가능한 링커, 플루오로포어 및 이 표준 화학을 위해 사용할 수 있는 표지-분자를 운반하는 LNAs를 쉽게 생산할 수 있다. 중요하게는, LNA 모노머를 DNA 또는 RNA 올리고로 도입함으로써 상보적인 DNA 또는 RNA와 전례없이 높은 열안정성을 갖는 동시에 왓슨-크릭 염기-쌍 규칙을 따르는 2중쇄를 쉽게 제조할 수 있다. 일반적으로 헤테로-2중쇄의 열안정성은 2중쇄중의 LNA 모노머당 3-8 ℃씩 증가한다. 우리가 아는한 LNA는 상보적인 DNA 또는 RNA에 대해 지금까지보고된 가장 높은 친화성을 갖는다(Tetrahedron, 54, 3607-3630(1998)). LNA/DNA 및 LNA/RNA 헤테로2중쇄의 열안정성은 구아니딘 티오시아네이트(GnSCN)와 같은 카오트로픽제의 존재하에서도 효율적인 혼성화가 일어나도록 하기에 충분히 안정적이다.
본 발명은 혼성화 분석을 위해 존재하는 핵산 물질을 제조하고 이용가능하도록 하는 복합적인 생물학적 샘플 또는 표본중의 세포로부터 핵산을 방출하기 위한 신규한 방법에 관한 것이다. 또한 신규한 핵산 혼성화 방법이 제공된다. 특히, 세포 용균과 세포성 핵산의 방출을 촉진하고 동시에 LNA와의 혼성화를 가능하게 하는 적어도 하나의 강력한 카오트로픽제를 포함하는 완충액과 샘플을 배합하여, 관심이 있는 표적 핵산을 함유할 것으로 추정되는 샘플로부터의 핵산을 혼성화하기 위한 방법이 기술된다. 그후 표적 핵산에 대한 상보적인 핵산의 혼성화 정도를 결정한다.
이들 혼성화 방법의 하나의 장점은 혼성화를 모든 시약이 미리 배합된 하나의 용이한 단계로 수행할 수 있다는 점이다.
도 1.
본 발명의 일 구체예를 나타낸다.
도 1-1.
혼성화 실험을 마이크로타이터-플레이트의 웰에 공유적으로 고정화된 3 개의 상이한 LNA 변형된 올리고(표 1-1 참조) 및 상보적인 표적 DNA 올리고로 수행하였다. 나타낸 바와 같은 다양한 농도의 구아니딘-하이드로클로라이드(GnHCl)로 혼성화를 수행하였다.
도 2-1.
LNA 혼성화의 특이성을 나타내는 경쟁 분석을 다양한 농도의 구아니딘 하이드로클로라이드에서 수행하였다. 경쟁제(일 염기 미스매칭 돌연변이 올리고)의 농도를 0.1 nM 내지 0.3 μM로 변화시키는 한편, 매칭 야생형 올리고의 양을 0.5 nM농도로 일정하게 유지시킨다. 화살표는 동몰량의 표적 및 경쟁 올리고를 가리킨다. 0 내지 8 M 구아니딘 하이드로클로라이드(GnHCl)를 함유하는 혼성화 완충액에서 얻은 혼성화 수행이 또한 표시되어 있다.
도 2-2.
LNA 혼성화의 특이성을 나타내는 경쟁 분석을 다양한 농도의 구아니딘 하이드로클로라이드에서 수행하였다. 경쟁제(일 염기 미스매칭 야생형 올리고)의 농도를 0.1 nM 내지 0.3 μM로 변화시키는 한편, 매칭 돌연변이형 올리고의 양을 0.5 nM 농도로 일정하게 유지시킨다. 화살표는 동몰량의 표적 및 경쟁 올리고를 가리킨다. 0 내지 8 M 구아니딘 하이드로클로라이드(GnHCl)를 함유하는 혼성화 완충액에서 얻은 혼성화 수행이 또한 표시되어 있다.
도 3-1.
LNA 혼성화 실험을 마이크로타이터-플레이트의 웰에 공유적으로 고정화된 2 개의 상이한 LNA 변형 올리고(표 3-1 참조) 및 2 개의 상보적인 표적 DNA 올리고로 수행하였다. 나타낸 바와 같이 다양한 농도의 구아니딘 티오시아네이트(GnSCN) 및 시트르산 나트륨 또는 인산 기초 완충액에서 혼성화를 수행하였다.
도 4-1.
혼성화의 특이성을 나타내는 경쟁 분석을 인산 기초 완충액 및 다양한 구아니딘 티오시아네이트(GnSCN)로 수행하였다. 경쟁제(일 염기 미스매칭 돌연변이 올리고)의 농도를 0.1 nM 내지 0.3 μM로 변화시키는 한편, 매칭 야생형 올리고의 양을 0.5 nM 농도로 일정하게 유지시킨다. 화살표는 동몰량의 표적 및 경쟁 올리고를 가리킨다. 0 내지 4 M GnSCN을 함유하는 혼성화 완충액에서 얻은 혼성화 수행이 또한 표시되어 있다.
도 4-2.
혼성화의 특이성을 나타내는 경쟁 분석을 인산 기초 완충액 및 다양한 구아니딘 티오시아네이트(GnSCN)로 수행하였다. 경쟁제(일 염기 미스매칭 야생형 올리고)의 농도를 0.1 nM 내지 0.3 μM로 변화시키는 한편, 매칭 돌연변이형 올리고의 양을 5 nM 농도로 일정하게 유지시킨다. 화살표는 동몰량의 표적 및 경쟁 올리고를 가리킨다. 0 내지 4 M GnSCN을 함유하는 혼성화 완충액에서 얻은 혼성화 수행이 또한 표시되어 있다.
도 4-3.
혼성화의 특이성을 나타내는 경쟁 분석을 시트르산 나트륨 기초 완충액 및 다양한 구아니딘 티오시아네이트(GnSCN)로 수행하였다. 경쟁제(일 염기 미스매칭 야생형 올리고)의 농도를 0.1 nM 내지 0.3 μM로 변화시키는 한편, 매칭 돌연변이형 올리고의 양을 0.5 nM 농도로 일정하게 유지시킨다. 화살표는 동몰량의 표적 및 경쟁 올리고를 가리킨다. 0 내지 4 M GnSCN을 함유하는 혼성화 완충액에서 얻은 혼성화 수행이 또한 표시되어 있다.
도 4-4.
혼성화의 특이성을 나타내는 경쟁 분석을 시트르산 나트륨 기초 완충액 및 다양한 구아니딘 티오시아네이트(GnSCN)로 수행하였다. 경쟁제(일 염기 미스매칭 야생형 올리고)의 농도를 0.1 nM 내지 0.3 μM로 변화시키는 한편, 매칭 돌연변이형 올리고의 양을 5 nM 농도로 일정하게 유지시킨다. 화살표는 동몰량의 표적 및 경쟁 올리고를 가리킨다. 0 내지 4 M GnSCN을 함유하는 혼성화 완충액에서 얻은 혼성화 수행이 또한 표시되어 있다.
도 6-1.
단일 염기 다형성의 검출. 3 개의 인간 세포주(HCV29, T112C1 및 T112D1)로부터의 바이오티닐화 PCR 앰플리콘과 플라스미드를 생성시켰다. 3 개의 인간 세포주 모두는 ApoB3500 돌연변이에 관하여 야생형(G-대립형질)이다. "A-대립형질" 플라스미드는 ApoB R3500Q 돌연변이(아미노산 3500에서 G→A 전환(arg→gln))를 함유한다. 각각의 샘플을 야생형(C8) 또는 돌연변이(T8) 특이적 LNA 포획 프로브에 대해 시험하였다. 검은 막대: 야생형, 연한 막대: 돌연변이형.
도 7-1.
세균 세포 용균물에서 플라스미드 DNA의 검출. 3 개의 상이한 세균 균주(표 7-1 참조)를 용균하고 마이크로타이터-플레이트의 웰에 공유적으로 고정화된 C11 또는 T11 포획 탐침(표 7-2 참조)에 혼성화하였다. 2 M 구아니딘 티오시아네이트를 함유하는 혼성화 완충액에서 혼성화를 수행하였다. NF1815 세포는 플라스미드를 함유하지 않고, TOP10/pCR 세포는 ApoB 서열 없이 pCR™2.1-TOPO 플라스미드를 함유하며, TOP10/pApoBwt 세포는 pCR™2.1-TOPO 플라스미드내로 삽입된 ApoB3500 야생형 서열을 함유한다.
본 발명은 핵산을 함유하는 용균된 복합적인 생물학적 혼합물로부터 방출된 핵산을 검출하는 신규 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 세포, 세포의 일부 또는 바이러스중에 존재할 것으로 추정되는 핵산, 즉 표적 핵산(들)을 용이하게 분석할 수 있게 한다. 그러한 방법은 세포를 강력한 카오트로픽제를 포함하는 혼성화 배지중에서 용균시키고, 혼성화 조건하에 세포중에 존재할 것으로 추정되는 뉴클레오타이드 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 록 핵산(locked nucleic acid; LNA)과 용균물을 접촉시키고, 혼성화 정도를 결정하는 것을 포함한다.
"표적 핵산"은 그의 존재가 관심의 대상이고 혼성화 분석에서 그의 존재 또는 부재를 검출하고자 하는, 데옥시리보핵산(DNA), 리보핵산(RNA)(리보솜 리보핵산(rRNA), 전달 RNA(tRNA), 소형 핵(snRNA), 텔로머라제 결합 RNA, 리보자임 등을 포함)의 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 관심의 대상이 되는 핵산 샘플은 특정 표적 핵산, 예를 들어 특정 유전자, 유전자 단편 또는 RNA를 함유할 것으로 추정되는 것이다. 특히 관심이 있는 것은 진핵, 원핵, 원시(archae) 또는 바이러스 기원일 수 있는 특정 mRNAs의 검출이다. 중요하게는, 본 발명은 특정 미생물과 관련된 것으로 알려진 특정 서열을 분석함으로써 다양한 감염성 질환의 진단을 도울 수 있다. 표적 핵산은 핵산(RNA, DNA 및/또는 rRNA) 및 비-핵산의 복합적인 생물학적 혼합물에서 제공될 수 있다. 가장 바람직한 표적 핵산은 RNA 분자이고, 특히, 여기에 참조로서 인용되는, 일반적으로 양도된 U.S. 특허출원 제08/142,106호에 기재된 16S 또는 23S rRNA와 같은 특정 rRNAs이다. 선택된 표적 핵산이 2본쇄이거나 아니면 심각한 2 차 및 3 차 구조를 가지면, 그들을 혼성화전에 가열하는 것이 필요할 수 있다. 이 경우, 핵산을 포획 탐침을 함유하는 혼성화 배지로 도입하기전이나 후에 가열할 수 있다. 또한 일부의 경우 당업계에 알려진 방법에 의해 백그라운드 간섭을 감소시키기 위하여 혼성화 분석전에 복합적인 생물학적 샘플로부터 핵산을 추출하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 혼성화 및 추출방법은 핵산(RNA 및/또는 DNA) 및 비-핵산의 복합적인 생물학적 혼합물에 적용될 수 있다. 그러한 복합적인 생물학적 혼합물은 프로토플라스트를 포함한 광범위한 진핵 및 원핵세포; 표적 핵산을 가질 수 있는 기타 생물학적 물질을 포함한다. 따라서 이 방법은 조직 배양 동물 세포, 동물 세포(예를 들어, 혈액, 혈청, 혈장, 망상적혈구, 림프구, 뇨, 골수 조직, 뇌척수액 또는 혈액이나 림프로부터 제조된 모든 생성물) 또는 모든 타입의 조직 생검(예를 들어, 용균 완충액중에서 균질화된 근육 생검, 간 생검, 신장 생검, 방광 생검, 골 생검, 연골 생검, 피부 생검, 췌장 생검, 장관 생검, 흉선 생검, 유방 생검, 자궁 생검, 고환 생검, 안구 생검 또는 뇌 생검), 식물 세포, 삼투압 충격에 대해 민감한 기타 세포 및 세균 세포, 효모, 바이러스, 마이코플라스마, 프로토조아, 리케치아, 진균 및 기타 소형 미생물 세포 등에 적용될 수 있다. 본 발명의 분석 및 분리과정은 예를 들어, 관심의 대상이 되는 비-병원성 또는 병원성 미생물의 검출에 유용하다. 알려진 출처의 핵산 탐침과 생물학적 샘플중에 존재하는 핵산간의 특이적 혼성화를 검출함으로써, 미생물의 존재를 확립할 수 있다.
고농도의 구아니딘, 구아니딘 티오시아네이트 또는 특정의 다른 카오트로픽제 및 계면활성제를 함유하는 용액은 원핵 및 진핵세포를 효과적으로 용균시킬 수 있고 동시에 방출된 내생성 핵산에 LNA 탐침을 특이적으로 혼성화시킬 수 있다. 용액은 세포의 용균과 가용화 및 핵산 혼성화를 촉진하기 위해 일반적인 완충액 및 계면활성제외에 어떠한 다른 성분도 함유할 필요가 없다.
혼성화전에 추출 과정을 사용하는 경우, 페놀 및 클로로포름과 같은 유기용매를 핵산 분리에서 사용되는 기술에 사용할 수 있다. 전통적으로, 페놀 또는 페놀-클로로포름 배합물과 같은 유기용매를 상 분리를 이용하는 핵산의 추출에 사용한다(Current Protocols in Molecular Biology, pub. John Wiley & Sons (1998)에서 Ausubel 등). 이들 방법은 본 발명의 용균 용액을 이용하여 효과적으로 사용될 수 있다; 그러나, 본 발명에 따른 방법의 장점은 장황한 추출방법이 불필요하고 따라서 고처리량의 분석 수행을 향상시키는 것이다. 바람직하게는, 용균 완충액/혼성화 배지는 세포의 용균을 촉진하고 동시에 LNA 탐침의 효율적인 혼성화를 위해 표준 완충액 및 계면활성제를 함유한다. 시트르산 나트륨, 트리스-HCl, PIPES 또는 HEPES, 바람직하게는 약 0.05 내지 0.1 M 농도의 트리스-HCl을 사용할 수 있다. 또한 혼성화 배지는 바람직하게는 약 0.05 내지 0.5%의 이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 소듐 도데실설페이트(SDS) 또는 사르코실(Sigma Chemical Co., St. 루이스, MO) 및 1 내지 10 mM의 EDTA를 함유한다. 다양한 극성 수-용해성 또는 팽윤성 시약, 예를 들어 음이온성 폴리아크릴레이트 또는 폴리메타크릴레이트 및 전하를 띄는 당 중합체, 예를 들어 황산 텍스트란 등을 포함하는 부피 제외(volume exclusion) 시약과 같은 기타 첨가제도 포함될 수 있다. 혼성화의 특이성 또는 엄격성(stringency)를 예를 들어 카오트로픽제의 농도 및 타입 및 전형적으로는 0 내지 1 M NaCl인 NaCl 농도를 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9 또는 1.0과 같이 변화시킴으로써 조절할 수 있다.
단백질의 2 차 및 3 차 구조를 방해하는 카오트로픽제, 예를 들어 구아니딘 하이드로클로라이드(GnHCl) 및 티오시아네이트(GnSCN)와 같은 구아니딘염, 또는 요소, 리튬 클로라이드 및 기타 티오시아네이트를 자연 발생 핵산을 분리하고 뉴클레아제를 저해하기 위한 베타-머캅토에탄올 또는 DTT와 같은 계면활성제 및 환원제와 함께 사용할 수 있다. 핵산의 추출 및 혼성화에 있어서 카오트로픽제의 사용은 여기서 참조로 인용되는 EP 공개 제0 127 327호에 기재되어 있다.
표적 핵산에 실질적으로 상보적인 LNA가 혼성화 과정에 도입된다. 용어 "표적 핵산에 실질적으로 상보적인 LNA"는 혼성화 조건하에서 표적 핵산과 혼성화하여 표적 및 상보적 핵산간에 안정하고도 특이적인 결합이 일어나도록 충분히 상보적인, 적어도 하나의 LNA 모노머 및 다양한 수의 자연 발생 뉴클레오타이드 또는 7-데아자구아노신 또는 이노신과 같은 그들의 유사체를 함유하는 폴리뉴클레오타이드 또는 올리고뉴클레오타이드를 가리킨다. 따라서, LNA 서열은 표적 핵산의 정확한 서열을 반영할 필요는 없다. 예를 들어, 상보적 핵산 서열이 표적 핵산과 충분한 상보성을 갖고 그와 혼성화하여 혼성화 복합체를 형성하고 추가로 이하에서 더욱 상세히 기재하는 바와 같은 고형 지지체에 표적 핵산을 고정화시킬 수 있다면, 비-상보적 뉴클레오타이드 단편을 상보적 뉴클레오타이드 단편에 결합시키거나, 대안으로 비-상보적 염기 또는 더 긴 서열을 상보적 핵산사이에 삽입할 수 있다. 방출된 핵산과 결합하는 포획 탐침은 그룹에 결합할 수 있다(예를 들어, 바이오틴, 플루오레세인, 자기 마이크로-입자 등). 대안으로, 포획 탐침을 예를 들어 안트라퀴논 광화학(WO 96/31557)에 의해 미리 고체 상 또는 입자에 영구적으로 결합시킬 수 있다.
본 발명의 매력적인 가능성은 어레이(array) 형식으로 스팟팅되고 그 표면에영구적으로 고정된 게놈중의 상이한 서열에 대한 상이한 LNA-올리고머의 사용이다(Nature Genetics, suppl. vo. 21, Jan 1999, 1-60 및 WO96/31557). 이어서 그러한 어레이를 용해된 세포 및 수많은 적당한 검출 LNA-탐침을 함유하는 용균 완충액/혼성화 배지 혼합물과 함께 인큐베이션시킨다. 그후 용균 및 혼성화가 일어나게 하고 최종적으로 어레이를 세척하고 적절히 현상한다. 그러한 과정의 결과는 다수의 상이한 표적 핵산의 반정량적 평가이다.
DNA 또는 RNA에 관하여 LNA를 포함한 안정한 혼성화 복합체(2중쇄)의 형성을 위해 요구되는 상보성의 정도는 혼성화 배지 및/또는 세척 배지의 엄격성에 따라 변화한다. 상보적 핵산은 미리 제조된 혼성화 배지내에 존재하거나 혼성화전 약간 더 늦은 시점에 도입될 수 있다.
혼성화 배지는 생물학적 샘플과 배합되어 세포의 용균 및 핵산쌍 형성을 촉진한다. 바람직하게는, 생물학적 샘플의 부피 대 혼성화 배지의 부피는 약 1:10이다.
복합적인 생물학적 샘플상에서 일 단계로 수행될 수 있다는 것이 본 발명의 혼성화 방법의 의도된 장점이다. 그러나, 소수의 기계적 또는 기타 처리를 일정 상황하에서 고려할 수 있다. 예를 들어, 저속 원심분리 또는 여과에 의한 것과 같은 혼성화전에 용균물을 정화하거나 상기한 바와 같이 혼성화전에 핵산을 추출하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명의 혼성화 분석은 당업자에게 공지되거나 여기에 제시된 가이드라인의 면역분석 방법론과 유사한 모든 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 분석방법은 샌드위치 분석법 및 그의 변형 및 경쟁 또는 치환 분석이다. 혼성화 기술은 일반적으로 "Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach", Ed. Hames, B.D. 및 Higgins, S.J., IRL Press, 1985; Gall 및 Pardue(1969), Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 63: 378-383; 및 John, Burnsteil 및 Jones(1969) Nature, 223: 582-587에 기재되어 있다. 혼성화 기술에서 추가의 개량은 당업자에게 잘 알려져 있고 쉽게 적용될 수 있다.
본 발명에서 포획 LNA-탐침은 전형적으로 고체 표면, 예를 들어, 마이크로타이터 트레이 웰 또는 마이크로비드에 결합된다. 따라서 편리하고도 매우 효율적인 세척 과정을 수행할 수 있어 본 발명의 수행에 추가될 수 있는 다양한 효소 기초 반응에 대한 가능성을 열어준다. 가장 주목할만한 것은 혼성화 분석의 감도가 검출되는 표적 핵산을 증대시키는 핵산 증폭 시스템의 사용을 통해 증가될 수 있는 가능성이다. 그러한 시스템의 예는 중합효소 연쇄 반응(PCR) 시스템 및 리가제 연쇄 반응(LCR) 시스템을 포함한다. 최근에 기술되고 당업자에게 알려진 다른 방법은 핵산 서열 기초 증폭(NASBA™, Cangene, 미씨싸우가, 온타리오) 및 Q 베타 레플리카제 시스템이다. PCR은 선별된 DNA 서열을 복제하는 주형 의존적 DNA 중합효소 프라이머 연장 방법이다. 이 방법은 반복된 변성 및 중합효소 연장 단계가 뒤따르는 DNA 폴리뉴클레오타이드의 특정 서브-서열의 DNA 중합효소 복제를 개시하는 과량의 특정 프라이머의 사용에 의존한다. PCR 시스템은 당업계에 잘 알려져 있다(US 4,683,195 및 US 4,683,202 참조). 또한 PCR 방법에 대한 추가적인 정보에 대해서는 PCR 프로토콜을 참조하라: A Guide to Methods and Applications, ed.Innis, Gelland, Shinsky 및 White, Academic Press, Inc.(1990). PCR을 수행하기 위한 시약 및 하드웨어는 노르왁, Conn의 Perkin-Elmer/Cetus Instruments를 통해 상업적으로 입수가능하다.
PCR과 유사한, LCR은 표적화된 DNA 서열의 수를 증폭시키기 위하여 다중 사이클의 교대 온도를 사용한다. 그러나, LCR은 주형 연장을 위해 개개의 뉴클레오타이드를 사용하지 않는다. 그 대신, LCR은 표적 부위의 양 가닥에 상보적인 과량의 올리고뉴클레오타이드에 의존한다. 2본쇄 주형 DNA의 변성에 이어, LCR 과정은 하나의 표적 가닥상의 인접 부위에 상보적인 두 개의 올리고뉴클레오타이드 프라이머를 결찰시키는 것으로 시작한다. 어느 하나의 가닥에 상보적인 올리고뉴클레오타이드는 결합할 수 있다. 결찰 및 제2 변성 단계후, 원래의 주형 가닥과 두 개의 새로이 결합된 생성물이 추가의 결찰을 위한 주형으로 작용하여 표적 서열의 대수적인 증폭을 제공한다.
이 방법은 여기에 참조로서 인용되는 Genomics, 4: 560-569(1989)에 상술되어 있다. 다른 증폭 시스템이 개발되어 있으므로, 그들 또한 본 발명에서 사용될 수 있다.
본 발명의 혼성화 배지 및 방법은 일 단계 분석에 특징적으로 적합하다. 배지는 혼성화를 위한 모든 필요 성분을 함유하도록 상업적으로 또는 실험실에서 미리 제조될 수 있다. 예를 들어, 샌드위치 분석에서 배지는 카오트로픽제(예를 들어, 구아니딘 티오시아네이트), 원하는 완충액 및 계면활성제, 마이크로비드와 같은 고형 지지체에 결합된 포획 LNA-탐침, 및 역시 LNA일 수 있는 검출 핵산을 포함할 수 있다. 그후 이 배지를 분석을 실시할때 표적 핵산을 함유하는 샘플과 배합하기만 하면 된다. 일단 혼성화가 일어나면 고형 지지체에 결합된 혼성화 복합체를 세척하고 혼성화 정도를 결정할 수 있다.
샌드위치 분석은 핵산 서열을 검출하거나 분리하기 위한 상업적으로 유용한 혼성화 분석이다. 그러한 분석은 고형 지지체에 공유적으로 고정화된 "포획" 핵산 및 용액중의 표지된 "신호" 핵산을 사용한다. "포획" 핵산 및 "신호" 핵산 탐침은 표적 핵산과 혼성화하여 "샌드위치" 혼성화 복합체를 형성한다. 효과적이기 위하여, 신호 핵산은 포획 핵산과 혼성화할 수 없지만, 포획 탐침과 다른 위치에서 표적 핵산과 혼성화하도록 설계된다.
실질적으로는 금속 및 플라스틱을 포함한 모든 고체 표면을 혼성화 분석을 위한 지지체로서 사용할 수 있다. 두 가지 유형의 고체 표면이 일반적으로 이용될 수 있다. 즉:
a) 막, 폴리스티렌 비드, 나일론, 테플론, 폴리스티렌/라텍스 비드, 라텍스 비드 또는 활성화된 카복실레이트, 설포네이트, 포스페이트 또는 유사한 활성화가능 그룹을 갖는 모든 고형 지지체가 핵산 또는 올리고뉴클레오타이드가 고정화되는 고체 표면 기층으로서의 사용에 적당하다.
b) 상업적으로 얻을 수 있고 포획 올리고뉴클레오타이드를 고정화하는데 사용될 수 있는 전-활성화된 표면을 갖는 다공성 막(예를 들어, Pall Immunodyne Immunoaffinity Membrane, Pall BioSupport Division, 이스트 힐즈, N.Y. 또는 Immobilon Affinity membranes from Millipore, 베드포드, Mass.). 폴리스티렌,테플론, 나일론, 실리카 또는 라텍스로 된, 자기 비드를 포함한 마이크로비드 역시 사용할 수 있다.
그러나, a) 및 b)에서 언급된 일반적으로 입수가능한 표면은 특히 핵산과 다양한 다른 용해된 생분자의 복합적 혼합물을 혼성화에 의해 분석할때 종종 백그라운드 문제를 일으킨다. 당업계에 공지된(WO 96/31557) 안트라퀴논(AQ) 기초 광-커플링 방법에 의해 고체 표면에 포획-탐침을 공유적으로 결합시킬때 백그라운드를 상당히 감소시킬 수 있었다. 이 방법은 포획 LNA-올리고의 폴리카보네이트 및 폴리에틸렌과 같은 다양한 비교적 열안정성의 중합체를 포함하는 대부분의 중합체 물질의 표면 및 처리된 유리 표면에 대한 공유결합을 가능하게 한다. 따라서 AQ 광-커플링 방법을 사용하여, 포획 LNA-탐침을 현재의 PCR 증폭 기술에 적합한 용기 표면에 결합시킬 수 있다.
혼성화 분석에 사용하기 위한 포획 또는 신호 핵산으로 적당한 서열을 유기체 게놈의 전체 서열 또는 그의 일부로부터, 전령 RNA로부터, 또는 전령 RNA의 역전사에 의해 얻은 cDNA로부터 얻을 수 있다. 그러한 얻어진 서열로부터 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져 있다(Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology, pub. John Wiley & Sons(1988), 및 Sambrook 등, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory Press, 1989). 더욱이 많은 공공 및 상업적 서열 데이타베이스가 접근가능하고 관련 서열을 얻기 위하여 접근될 수 있다.
일단 적절한 서열을 결정하면, LNA 탐침을 바람직하게는 당업계에 공지된 바와 같이(Tetrahedron, 1998, 54, 3607-30) 상업적으로 입수가능한 방법 및 장치를 이용하여 화학적으로 합성한다. 예를 들어, 고상 포스포르아미디트 방법을 짧은 LNA 탐침을 생산하는데 사용할 수 있다(Caruthers 등, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 47: 411-418(1982), 및 Adams 등, J. Am. Chem. Soc., 105: 661(1983)).
특정 표적에 대한 탐침을 합성할때, 뉴클레오타이드 서열의 선택이 시험의 특이성을 결정할 것이다. 예를 들어, 몇몇 바이러스 분리물로부터의 DNA 서열을 비교함으로써, 타입-특이적 또는 속 특이적인, 바이러스 검출을 위한 서열을 선택할 수 있다. DNA 부위 및 서열을 상업적으로 이용가능한 컴퓨터 프로그램을 사용하여 비교할 수 있다.
혼성화 정도를 당업계에 잘 알려진 모든 방법에 의해 수행할 수 있다. 검출가능한 혼성화가 없는 경우, 혼성화 정도는 0이 된다. 전형적으로, 표지된 신호 핵산을 혼성화를 검출하기 위해 사용한다. 혼성화된 폴리뉴클레오타이드의 존재를 검출하기 위해 전형적으로 사용되는 몇몇 방법중 어느 하나에 의해 상보적 핵산 또는 신호 핵산을 표지할 수 있다. 가장 일반적인 검출방법은 표지된 항체에 결합하는 리간드, 플루오로포어 또는 화학발광 시약을 사용하는 것이다. 그러나, 탐침을 또한3H,125I,35S,14C,33P 또는32P로 표지할 수 있고 이어서 방사성사진으로 검출할 수 있다. 방사성 동위원소는 합성의 용이성에 기인한 연구 선호도, 가변적인 안정성 및 선별된 동위원소의 반감기에 따라 선택한다. 다른 표지는 표지된 리간드에 대한 특이적인 결합쌍 멤버로 작용할 수 있는 항체를 포함한다. 표지는 요구되는 감도, 탐침과의 컨쥬게이션의 용이성, 안정성 요구도 및 이용가능한 장치에 따라 선택된다.
LNA 탐침은 전형적으로 합성중에 표지된다. 더욱이 포스포르아미디트 합성 접근법은 유동적이어서 모든 상업적으로 이용가능한 링커, 플루오로포어 및 이 표준 화학을 위해 이용가능한 표지-분자를 운반하는 LNAs를 용이하게 생산할 수 있다. LNA는 또한 효소 반응, 예를 들어 키나제 처리에 의해 표지될 수 있다.
검출 탐침이 DNA나 RNA인 상황을 상상할 수 있다. 그러한 탐침은 표지의 선택에 따라 다양한 방식으로 표지될 수 있다. 방사성 탐침은 전형적으로 원하는 방사성 동위원소를 함유하는 상업적으로 입수가능한 뉴클레오타이드를 사용하여 제조된다. 방사성 뉴클레오타이드는 2본쇄 탐침을 닉 해독(nick translation)하거나; 방사성 dNTP의 존재하에 DNA 중합효소의 클레나우 단편을 이용하여 특정한 삽입체를 갖는 1본쇄 M13 플라스미드를 복제하거나; 방사성 dNTP의 존재하에 역전사효소를 이용하여 RNA 주형으로부터 cDNA를 전사하거나; 방사성 rNTP의 존재하에 SP6 또는 T7 RNA 중합효소를 사용하여 SP6 프로모터 또는 T7 프로모터를 함유하는 벡터로부터 RNA를 전사하거나; 말단 트랜스페라제를 사용하여 방사성 뉴클레오타이드로 탐침의 3' 말단을 테일링(tailing)하거나; [32P]-ATP 및 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 탐침의 5' 말단을 인산화하는 것과 같은 몇몇 수단에 의해 탐침으로 도입될 수 있다.
비-방사성 탐침은 종종 간접적인 수단에 의해 표지된다. 일반적으로, 리간드 분자를 탐침에 공유결합시킨다. 그후 리간드는 원래 검출가능하거나 검출가능한 효소, 형광 화합물, 또는 화학발광 화합물과 같은 신호 시스템에 공유결합된 항-리간드 분자와 결합한다. 리간드와 항-리간드는 광범위하게 변화될 수 있다. 리간드가 천연 항-리간드를 갖는 경우, 예를 들어, 바이오틴, 티록신, 및 코티솔인 경우, 표지된 자연 발생 항-리간드과 결합하여 사용될 수 있다. 대안으로, 모든 합텐 또는 항원성 화합물을 항체와 함께 사용할 수 있다.
DNA의 경우, LNA-탐침을 또한 신호 발생 화합물에 예를 들어, 효소 또는 플루오로포어와의 컨쥬게이션에 의해 직접 컨쥬게이트시킬 수 있다. 표지로서 관심이 있는 효소는 일차적으로 하이드로라제, 특히 포스파타제, 에스테라제 및 글라이코시다제, 또는 옥시도리덕타제, 특히 퍼옥시다제이다. 형광 화합물은 플루오레세인 및 그의 유도체, 로다민 및 그의 유도체, 댄실, 움벨리페론 등을 포함한다. 화학발광 화합물은 루시페린, AMPPD([3-(2'-스피로아만탄)-4-메톡시-4-(3'-포스포릴옥시)-페닐-1,2-디옥세탄]) 및 2,3-디하이드로프탈아진디온, 예를 들어 루미놀을 포함한다.
혼성화 배지 또는 추출용액중에 존재하는 표지된 탐침의 양은 광범위하게 변화될 수 있다. 일반적으로, 탐침의 표적 DNA에 대한 결합속도를 증가시키기 위하여 표적 핵산의 화학양론적 양에 비하여 실질적으로 과량의 탐침을 사용한다. 반응 용기를 상업적으로 입수가능한 초음파조에 침지시키는 것에 의한 초음파 처리는 종종 혼성화 속도를 가속화할 수 있다.
사용된 특정 혼성화 용액에 적합한 온도 및 시간에서 혼성화한후, 포획 LNA-탐침:표적 핵산 혼성화 복합체가 결합된 지지체를 전형적으로 혼성화 용액에서 제공된 것과 유사한 시약(예를 들어, 염화나트륨, 완충제, 유기용매 및 계면활성제)을 함유하는 세척 용액에 도입한다. 이들 시약은 혼성화 배지와 유사한 농도일 수 있지만, 종종 더 엄격한 세척 조건을 원하는 경우 더 낮은 농도이다. 지지체를 세척 용액중에 유지시키는 시간은 분 내지 몇 시간 이상으로 변화할 수 있다.
혼성화 또는 세척 배지는 엄격할 수 있다. 적절히 엄격한 세척후, 이제 정확한 혼성화 복합체를 표지의 성질에 따라 검출할 수 있다.
탐침은 표지와 직접 컨쥬게이트될 수 있다. 예를 들어, 표지가 방사성인 경우, 결합된 혼성화 복합체 기질을 갖는 탐침은 X-선 필름에 노출된다. 표지가 형광인 경우, 샘플은 먼저 특정 파장의 빛으로 조사함으로써 검출된다. 샘플은 이 빛을 흡수한후 검출기에 의해 감지될 수 있는 상이한 파장의 빛을 발산하다(Physical Biochemistry, Freifelder, D., W.H. Freeman & Co.(1982), pp537-542). 표지가 효소인 경우, 샘플을 효소에 대한 적절한 기질상에서 인큐베이션하여 검출한다. 발생된 신호는 착색된 침전물, 착색 또는 형광 가용성 물질, 또는 생물발광 또는 화학발광에 의해 발생된 광자일 수 있다. 탐침 분석을 위해 바람직한 표지, 예를 들어, 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 송아지 소장 알칼라인 포스파타제, 글루코스 옥시다제 및 베타-갈락토시다제는 양성 판독을 나타내는 착색된 침전물을 생성한다. 예를 들어, 알칼라인 포스파타제는 나중에 환원 반응에 참여하여 테트라졸리윰 염을 고도로 착색된 불용성 포마잔으로 전환시키는 인독실 포스페이트를 탈인산화한다.
혼성화 복합체의 검출은 신호 발생 복합체의 표적 및 탐침 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산의 2중쇄에 대한 결합을 요구할 수 있다. 전형적으로, 그러한 결합은 리간드-컨쥬게이트된 탐침과 신호와 컨쥬게이트된 항-리간드사이에서와 같이 리간드와 항-리간드의 상호작용을 통해 일어난다. 신호 발생 복합체의 결합은 또한 초음파 에네지에 노출시켜 쉽게 가속화될 수 있다.
표지는 또한 혼성화 복합체의 간접적 검출을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 표지가 합텐 또는 항원일때, 샘플을 항체를 이용하여 검출할 수 있다. 이들 시스템에서, 신호를 형광 또는 효소 분자를 항체에 결합시키거나 방사성 표지에 결합시켜 발생시킨다(Tijssen, P., "Practice and Theory of Enzyme Immunoassay", "Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon, R.H., van Knippenberg, P.H., Eds., Elsevier(1985), pp. 9-20).
따라서 본 명세서에서, 용어 "표지"는 그 자체로나 검출 시리즈의 일부로서 검출가능한 그룹을 의미한다. 리포터 그룹의 기능성 부분의 예는 바이오틴, 딕옥시게닌, 형광 그룹(일정한 파장의 전자기 방사선, 예를 들어 광 또는 X-선을 흡수할 수 있고 이어서 더 긴 파장의 방사선으로 흡수된 에너지를 재발산하는 그룹; 구체적인 예는 댄실(5-디메틸아미노)-1-나프탈렌설포닐), DOXYL(N-옥실-4,4-디메틸옥사졸리딘), PROXYL(N-옥실-2,2,5,5-테트라메틸피롤리딘), TEMPO(N-옥실-2,2,6,6-테트라메틸피페리딘), 디니트로페닐, 아크리딘, 쿠마린, Cy3 및 Cy5(Biological Detection Systems, Inc.의 상표), 에리트로신, 쿠마르산, 움벨리페론, 텍사스 레드, 로다민, 테트라메틸 로다민, 록스, 7-니트로벤조-2-옥사-1-디아졸(NBD), 피렌, 플루오레세인, 유로피움, 루테늄, 사마리움, 및 기타 희토류 금속), 방사성 표지,화학발광 표지(화학 반응동안 빛의 발산을 통해 검출될 수 있는 표지), 전자 스핀 공명 분광분석기를 사용하여 검출될 수 있는 생물학적 분자에 결합된 스핀 표지(자유 라디칼(예를 들어, 치환된 유기 니트록사이드) 또는 기타 상자성 탐침(예를 들어, Cu2+, Mg2+)), 효소(퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, β-갈락토시다제, 및 글루코스 옥시다제), 항원, 항체, 합텐(펩타이드나 스테로이드 호르몬과 같은 항체와 결합할 수 있으나, 그들 스스로 면역 반응을 개시할 수 없는 그룹), 지방산 잔기, 스테로이드 부위(콜레스테릴), 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 특정 수용체를 위한 폴산 펩타이드, 엔도사이토시스를 매개하는 그룹, 상피세포 성장인자(EGF), 브래디키닌, 및 혈소판 유래 성장인자(PDGF);와 같은 세포막 투과를 위한 담체 시스템이다. 특히 관심이 있는 예는 바이오틴, 플루오레세인, 텍사스 레드, 로다민, 디니트페닐, 딕옥시게닌, 루테늄, 유로피움, Cy5, Cy3 등이다.
RNA의 분리에 관하여, 이소시아네이트의 염(예: 구아니딘 티오시아네이트)과 같은 카오트로픽제는 단백질의 완전 파괴와 핵산 상호작용을 일으키지 않고, 따라서 최적의 혼성화를 방지한다고 기재되어 있다(US 5,376,529). 카오트로픽제와 표적 핵산을 함유하는 혼성화 용액에 열을 가할 경우 혼성화가 상당히 증가되는 것으로 보고되었다. 이전에, 연구자들은 반응물의 안정성을 유지시키는 낮은 혼성화 온도를 유지하려고 시도해왔다. Cox 등, EP 출원번호 84302865.5를 참조하라. 그러나, LNA/DNA 및 LNA/RNA 헤테로2중쇄의 상당히 증가된 열안정성은 상승된 온도에서 LNA-탐침과의 혼성화가 일어날 수 있게 한다. 따라서 본 발명은 리보핵산 검출 분석의 감도를 증가시키고 분석 단계를 간소화하는 방법을 제공한다. 표적 핵산이RNA인 경우 핵산 혼성화를 수행하는 과정은 당업계에 공지된 바와 같이(US 5,376,529) 핵산 용액 또는 샘플을 상승된 온도, 예를 들어 70-100 ℃로 가열하는 것을 포함한다. 본 발명의 핵산 용액은 카오트로픽제, 표적 핵산, 및 관심이 있는 표적 핵산에 실질적으로 상보적인 LNA를 포함한다. LNA와 그의 표적사이의 혼성화를 최대화하기 위하여 단백질과 핵산 상호작용을 완전히 파괴하도록 핵산 용액을 가열한다.
매우 높은 친화성의 LNA 탐침을 사용할때, DNA:DNA 및 DNA:RNA 상호작용을 완전히 파괴하는데 필요한 상승된 온도에서도 혼성화가 일어날 수 있다. 그후 상보적 핵산이 표적 핵산과 혼성화하여 혼성화 복합체를 형성할때까지 용액을 냉각한다.
이들 방법은 샘플 조작 및 분석 시약을 최소화할 수 있으므로 부가적으로 우수하다. 예를 들어, 카오트로픽제, 완충제 또는 계면활성제와 같은 기타 적절한 성분, 고형 지지체에 결합된 포획 LNA-탐침, 및 표적 핵산과 혼성화할 수 있는 신호 또는 검출 LNA(또는 핵산)를 함유하는 즉시사용형 시약 용액을 제공할 수 있다. 편리하게는, 표적 핵산을 갖는 것으로 추정되는 복합적인 생물학적 샘플을 미리 제조된 혼성화 시약과 직접 배합함으로써, 혼성화가 일 단계로 일어나도록 한다. 배합된 용액을 여기에 기재된 바와 같이 가열하고 혼성화가 일어날때까지 냉각시킨다. 그후 생성된 혼성화 복합체를 간단하게 세척하여 혼성화되지 않은 물질을 제거하고 혼성화 정도를 결정한다.
또한 핵산, 예를 들어 mRNA의 추출 및 혼성화를 위한 키트가 제공된다. 그러한 키트는 강력한 카오트로픽제 및 고형 지지체에 결합된 포획 LNA-탐침을 포함하는 추출 용액 또는 혼성화 배지를 함유하는 적어도 하나의 바이알을 함유한다. 또한 계면활성제, 완충용액 및 표적 핵산을 검출하는 성분을 함유하는 부가적인 바이알을 포함할 수 있다.
여기서 사용된, 용어 "LNA" 또는 "포획 LNA-탐침"은 일반식 Ⅰ의 뉴클레오사이드 유사체를 적어도 하나 포함하는 올리고머 및 그의 염기염 및 산부가염을 가리킨다:
상기 식에서, X는 -O-, -S-, -N(RN*)-, -CR6(R6*)-로부터 선택되고;
B는 뉴클레오염기로부터 선택되며;
P는 후행(succeeding) 모노머에 대한 뉴클레오사이드간 결합 또는 5'-말단 그룹을 위한 라디칼 위치를 나타내고, 그러한 뉴클레오사이드간 결합 또는 5'-말단 그룹은 임의로 치환체 R5를 포함하고;
R3또는 R3*는 선행(preceding) 모노머에 대한 뉴클레오사이드간 결합 또는 3'-말단 그룹을 나타내는 P*이며;
R4*및 R2*는 함께 -C(RaRb)-, -C(Ra)=C(Ra)-, -C(Ra)=N-, -O-, -Si(Ra)2-, -S-,-SO2-, -N(Ra)-, 및 >C=Z로부터 선택되는 1-4 개의 그룹/원자로 구성된 바이라디칼을 나타내고,
여기서 Z는 -O-, -S- 및 -N(Ra)-로부터 선택되고, 각각의 Ra및 Rb는 수소, 임의로 치환된 C1-12-알킬, 임의로 치환된 C2-12-알케닐, 임의로 치환된 C2-12-알키닐, 하이드록시, C1-12-알콕시, C2-12-알케닐옥시, 카복시, C1-12-알콕시카보닐, C1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬-티오, 할로겐, DNA 삽입제(intercalaters), 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트화 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환되고, 2 개의 제미날 치환체 Ra및 Rb는 함께 임의로 치환된 메틸렌(=CH2, 임의로 아릴에 대한 임의의 치환체로서 정의된 바와 같은 치환체로 1 또는 2 회 치환된다)이고,
P 또는 P*에 존재하고 그에 관여하지 않는 각각의 치환체 R1*, R2, R3, R3*,R5, R5*, R6및 R6*는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-12-알킬, 임의로 치환된 C2-12-알케닐, 임의로 치환된 C2-12-알키닐, 하이드록시, C1-12-알콕시, C2-12-알케닐옥시, 카복시, C1-12-알콕시카보닐, C1-12-알킬카보닐, 포밀, 아릴, 아릴옥시카보닐, 아릴옥시, 아릴카보닐, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시-카보닐, 헤테로아릴옥시, 헤테로아릴카보닐, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐, 아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노-C1-6-알킬-아미노카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, C1-6-알킬설포닐옥시, 니트로, 아지도, 설파닐, C1-6-알킬티오, 할로겐, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트화 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 독립적으로 선택되고(후자의 그룹은 치환체 B에 대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다), 여기서 아릴 및 헤테로아릴은 임의로 치환되고, 2 개의 제미날 치환체는 함께 옥소, 티옥소, 이미노, 또는 임의로 치환된 메틸렌을 나타낼 수 있거나, 함께 임의로 -O-, -S-, 및 -(NRN)-으로부터 선택되는 하나 이상의 헤테로원자/그룹이 중간과/이나 말단에 존재하는 1-5 개의 탄소 원자(들)의 알킬렌 쇄로 구성된 스피로 바이라디칼을 형성할 수 있으며(여기서 RN은 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택된다), 두 개의 인접한 (제미날이 아닌) 치환체는 이중 결합을 형성하는 부가적인 결합을 나타낼 수 있고; RN*는 바이라디칼에 존재하고 그에 관여하지 않을때, 수소 및 C1-4알킬로부터 선택된다.
여기서 사용된, 용어 "LNA"(록 뉴클레오사이드 유사체(LockedNucleosideAnalogues)는 올리고머(일반식 Ⅰ)에 도입된 바이사이클릭 뉴클레오사이드 유사체를 가리킨다.
본 명세서에서, 용어 "뉴클레오염기"는 자연 발생 뉴클레오염기 및 비-자연 발생 뉴클레오염기를 포함한다. 이전에는 "비-자연 발생"의 것으로 여겨져왔던 다양한 뉴클레오염기가 이후 자연계에서 발견되었다는 것은 당업자에게 명확하다. 따라서, "뉴클레오염기"는 알려진 퓨린 및 피리미딘 헤테로사이클뿐만 아니라 그의 헤테로사이클릭 유사체 및 토토머를 포함한다. 뉴클레오염기의 구체적인 예는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신, 우라실, 퓨린, 크산틴, 디아미노퓨린, 8-옥소-N6-메틸아데닌, 7-데아자크산틴, 7-데아자구아닌, N4,N4-에타노사이토신, N6,N6-에타노-2,6-디아미노퓨린, 5-메틸사이토신, 5-(C3-C6)-알키닐사이토신, 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 슈도이소사이토신, 2-하이드록시-5-메틸-4-트리아졸로피리딘, 이소사이토신, 이소구아닌, 이노신 및 Benner 등, U.S. 특허 제5,432,272호에 기재된 "비-자연 발생" 뉴클레오염기를 포함한다. 용어 "뉴클레오염기"는 이들 예 및 그의 유사체 및 토토머 모두를 포함하고자 하는 것이다. 특히 흥미로운 뉴클레오염기는 인간의 치료상 및 진단상 적용과 관련하여 자연 발생 뉴클레오염기로 간주되는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신, 및 우라실이다.
여기서 사용된, 용어 "DNA 삽입제"는 DNA 또는 RNA 나선, 2중쇄 또는 3중쇄내로 삽입할 수 있는 그룹을 의미한다. DNA 삽입제의 기능성 부분의 예는 아크리딘, 안트라센, 안트라퀴논과 같은 퀴논, 인돌, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 디하이드로퀴논, 안트라사이클린, 테트라사이클린, 메틸렌 블루, 안트라사이클리논, 소랄렌, 쿠마린, 에티디움-할라이드, 다이네미신, 1,10-페난트롤린-구리와 같은 금속 복합체, 칼케아미신과 트리스(4,7-디페닐-1,10-페난트롤린)루테늄-코발트-엔디인, 포피린, 디스타미신, 네트로프신, 바이올로겐, 다우노마이신이다. 특히 흥미로운 예는 아크리딘, 안트라퀴논과 같은 퀴논, 메틸렌 블루, 소랄렌, 쿠마린, 및 에티디움-할라이드이다.
본 명세서에서, 용어 "광화학적 활성 그룹"은 광조사시 화학 반응을 일으킬 수 있는 화합물을 포함한다. 그의 기능기의 구체적인 예는 퀴논, 특히 6-메틸-1,4-나프토퀴논, 안트라퀴논, 나프토퀴논, 및 1,4-디메틸-안트라퀴논, 디아지린, 방향족 아지드, 벤조페논, 소랄렌, 디아조 화합물, 및 디아지리노 화합물이다.
본 명세서에서 "열화학적 활성 그룹"은 다른 그룹과 열화학적으로 유도되는 공유결합을 형성할 수 있는 기능기로 정의된다. 열화학적 활성 그룹의 기능성 부분의 구체적인 예는 카복실산, 활성화된 에스테르와 같은 카복실산 에스테르, 산 플루오라이드, 산 클로라이드, 산 브로마이드 및 산 요오다이드와 같은 카복실산 할라이드, 카복실산 아지드, 카복실산 하이드라지드, 설폰산, 설폰산 에스테르, 설폰산 할라이드, 세미카바지드, 티오세미카바지드, 알데히드, 케톤, 1급 알콜, 2급알콜, 3급 알콜, 페놀, 알킬 할라이드, 티올, 디설파이드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 하이드라진, 에폭사이드, 말레이미드, 및 붕산 유도체이다.
본 명세서에서, 용어 "킬레이트화 그룹"는 하나를 초과하는 결합 위치를 갖고 빈번하게 다른 분자, 원자 또는 이온과 하나를 초과하는 결합 위치를 통해 동시에 결합하는 분자를 의미한다. 킬레이트 그룹의 기능성 부분의 예는 이미노디아세트산, 니트릴로트리아세트산, 에틸렌디아민 테트라아세트산(EDTA), 아미노포스폰산 등이다.
본 명세서에서 "리간드"는 결합하는 무엇인가를 의미한다. 리간드는 방향족 그룹(예: 벤젠, 피리딘, 나프탈렌, 안트라센, 및 페난트렌), 헤테로방향족 그룹(예: 티오펜, 퓨란, 테트라하이드로퓨란, 피리딘, 디옥산, 및 피리미딘), 카복실산, 카복실산 에스테르, 카복실산 할라이드, 카복실산 아지드, 카복실산 하이드라지드, 설폰산, 설폰산 에스테르, 설폰산 할라이드, 세미카바지드, 티오세미카바지드, 알데히드, 케톤, 1급 알콜, 2급 알콜, 3급 알콜, 페놀, 알킬 할라이드, 티올, 디설파이드, 1급 아민, 2급 아민, 3급 아민, 하이드라진, 에폭사이드, 말레이미드, 임의로 방향족 또는 일/다불포화 탄화수소를 함유하는 산소 원자, 질소 원자, 및/또는 황 원자와 같은 하나 이상의 헤테로원자가 임의로 중간 또는 말단에 존재하는 C1-C20알킬 그룹, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리옥시에틸렌, 폴리-β-알라닌과 같은 올리고/폴리아미드, 폴리글리신, 폴리라이신, 펩타이드, 올리고/폴리사카라이드, 올리고/폴리포스페이트, 독소, 항생제, 세포 독, 및 스테로이드:와 같은 기능기 및또한 "친화성 리간드", 즉 특정 단백질, 항체, 폴리- 및 올리고사카라이드, 및 다른 생분자상의 위치에 대해 특이적 친화성을 갖는 기능기 또는 생분자를 포함할 수 있다.
DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드의 상기한 특정 예가 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분에 상응한다는 것은 당업자에게 분명하다. 더욱이 당업자에게 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드가 전형적으로 M-K-(여기서 M은 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분이고 K는 "활성/기능성" 부분이 5- 또는 6-원 환에 결합되는 스페이서이다) 형태로 나타내어지는 것이 분명하다. 따라서, B가 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택되는 경우, 그룹 B는 M-K-(여기서 M은 각각 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드의 "활성/기능성" 부분이고, K는 5- 또는 6-원 환과 "활성/기능성" 부분사이에 1-50 개의 원자, 바람직하게는 1-30 개의 원자, 특히 1-15 개의 원자를 포함하는 임의의 스페이서이다) 형태를 가짐을 이해하여야 한다.
본 명세서에서, 용어 "스페이서"는 위에서 정의된 바와 같은 타입의 두 개 이상의 다른 부위를 연결하는데 사용되는 열화학적 및 광화학적 비-활성 거리-유지 그룹을 의미한다. 스페이서는 그의 소수성, 친수성, 분자 유연성 및 길이를 포함한 다양한 특징에 기초하여 선택된다(예를 들어 Hermanson 등, "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, San Diego, California(1992),p.137-ff를 참조하라). 일반적으로, 스페이서의 길이는 약 400 Å 또는 그 미만, 일부 적용에서 바람직하게는 100 Å 미만이다. 따라서, 스페이서는 임의로 산소 원자, 질소 원자 및/또는 황 원자와 같은, 하나 이상의 헤테로원자가 중간 또는 말단에 존재하는 탄소 원자쇄를 포함한다. 따라서, 스페이서 K는 하나 이상의 아미드, 에스테르, 아미노, 에테르, 및/또는 티오에테르 기능기, 및 임의로 방향족 또는 일/다불포화 탄화수소, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리옥시에틸렌, 폴리-β-알라닌과 같은 올리고/폴리아미드, 폴리글리신, 폴리라이신, 및 일반적인 펩타이드, 올리고사카라이드, 올리고/폴리포스페이트를 포함할 수 있다. 더욱이 스페이서는 그의 결합된 단위로 구성될 수 있다. 스페이서의 길이는 5- 또는 6-원 환과 관련하여 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분의 원하거나 필요한 위치 및 공간적 배향을 고려하여 변화될 수 있다. 특히 흥미로운 구체예에서, 스페이서는 화학적으로 절단될 수 있는 그룹을 포함한다. 그러한 화학적으로 절단가능한 그룹의 예는 환원전 조건하에서 절단가능한 디설파이드 그룹, 펩티다제로 절단가능한 펩타이드 단편 등을 포함한다.
하나의 변형예에서, K는 해당 그룹의 "활성/기능성" 부분이 5- 또는 6-원 환에 직접 결합할 수 있도록 하는 단일 결합을 나타낸다.
바람직한 구체예에서, 일반식 Ⅰ 및 Ⅱ에서 치환체 B는 바람직하게는 뉴클레오염기, 특히 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신 및 우라실로부터 선택된다.
올리고머(화학식 Ⅰ)에서, P는 후행 모노머에 대한 뉴클레오사이드간 결합을 위한 라디칼 위치, 또는 5'-말단 그룹을 나타낸다. 첫번째 가능성은 해당 LNA가5'-말단 "모노머"가 아닐때 적용되는 반면, 두번째 가능성은 해당 "LNA"가 5'-말단 "모노머"일때 적용된다. 그러한 뉴클레오사이드간 결합 또는 5'-말단 그룹은 치환체 R5(또한 동일하게 적용가능한: 치환체 R5*)를 포함하여 그룹 P와 이중결합을 형성할 수 있음이 이해되어야 한다(이하 뉴클레오사이드간 결합 또는 5'-말단 그룹의 정의로부터도 분명하다)(5'-말단은 뉴클레오사이드에서 리보스 부위의 5' 탄소원자에 상응하는 위치를 가리킨다).
한편, 선행 모노머에 대한 뉴클레오사이드간 결합 또는 3'-말단 그룹(P*)은 치환체 R3또는 R3*의 하나에 의해 정의된 위치, 바람직하게는 치환체 R3*에 의해 정의된 위치로부터 기원될 수 있다(3'-말단은 뉴클레오사이드에서 리보스 부위의 3' 탄소 원자에 상응하는 위치를 말한다).
R3*로서("정상" 위치) 또는 R3로서의(자일로 배열) 그룹 P*의 배향은 2 개의 동일한 흥미로운 가능성을 나타냄이 이해되어야 한다. 모든 "정상"(R3*=P*) 올리고머 및 "정상" LNA 모노머와 뉴클레오타이드(2-데옥시뉴클레오타이드 및/또는 뉴클레오타이드)가 결합된 올리고머가 DNA, RNA 및 기타 LNA 올리고머에 강력하게(증가하는 친화성으로) 혼성화하는 것이 이해되어야 한다. 현재 모든-자일로 LNA 올리고머와 자일로 LNA(R3=P*) 모노머와 예를 들어, 자일로 뉴클레오타이드(뉴클레오타이드 및/또는 2-데옥시뉴클레오타이드)를 갖는 올리고머의 배합물이 비교할만한 혼성화 성질을 유발하는 것으로 믿어진다. "정상" 배열(R3*=P*)을 갖는 올리고머는 DNA, RNA 또는 또다른 LNA 올리고머에 혼성화될때(증가하는 친화성으로) LNA 올리고머의 역-평행 배향을 유발하는 것으로 나타났다. 따라서 자일로 배열(R3=P*)을 갖는 올리고머가 DNA, RNA 또는 또다른 LNA에 혼성화될때 평행 배향을 유발하는 것으로 생각된다.
상기한 바에 비추어, 하나의 올리고머에서 "정상" LNAs와 자일로-LNAs의 결합은 상이한 타입의 이들 모노머가 도메인에 위치하여, 즉 적어도 5 개, 예를 들어 적어도 10 개의 모노머(예를 들어, 자일로-LNA, 자일로-뉴클레오타이드 등 모노머)가 적어도 5 개, 예를 들어 적어도 10 개의 다른 타입의 모노머의 방해받지 않은 도메인이 뒤따르는 한 흥미로운 성질을 일으킬 수 있을 것으로 생각된다. 그러한 키메라 타입 올리고머는 예를 들어 핵산을 포획하는데 사용될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "모노머"는 자연적으로 존재하는 뉴클레오사이드, 비-자연 발생 뉴클레오사이드, PNAs 등 및 LNAs에 관한 것이다. 따라서, 용어 "후행 모노머"는 5'-말단 방향에 있는 이웃 모노머에 관한 것이고 "선행 모노머"는 3'-말단 방향에 있는 이웃 모노머에 관한 것이다. LNA 모노머의 위치로부터 알 수 있는, 그러한 후행 및 선행 모노머는 자연 발생 뉴클레오사이드 또는 비-자연 발생 뉴클레오사이드, 또는 심지어 추가의 LNA 모노머일 수 있다.
결과적으로, 본 명세서에서(상기 정의로부터 유추될 수 있는 바와 같이), 용어 "올리고머"는 하나 이상의 LNAs의 도입에 의해 변형된 올리고뉴클레오타이드를의미한다.
본 명세서에서, 바이라디칼(R2*-R4*)의 배향은 좌측편이 가장 낮은 수의 치환체를 나타내고 우측편이 가장 높은 수의 치환체를 나타내게 하고, 따라서, R2*및 R4*가 함께 바이라디칼 "-O-CH2-"를 나타내는 경우, 산소 원자는 R2*를 나타내고, 따라서 산소 원자는 예를 들어 R2*의 위치에 결합되고 메틸렌 그룹은 R4*를 나타낸다.
올리고머에 혼입된 LNA(s)에서 바이라디칼(R2*-R4*)의 구조에 대한 수많은 흥미로운 가능성을 고려하여, 바이라디칼은 바람직하게는 -(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-, -(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-Y-, -Y-(CR*R*)r+s-Y-, -Y-(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-, -(CR*R*)r+s-, -Y-, -Y-Y-로부터 선택되고, 여기서 각각의 Y는 -O-, -S-, -Si(R*)2-, -N(R*)-, >C=O, -C(=O)-N(R*)-, 및 -N(R*)-C(=O)-로부터 선택되며, 각각의 R*는 독립적으로 수소, 할로겐, 아지도, 시아노, 니트로, 하이드록시, 머캅토, 아미노, 모노- 또는 디(C1-6-알킬)아미노, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, 임의로 치환된 C1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택되고/거나, 두 개의 인접한(제미날이 아닌) R*는 함께 이중 결합을 나타낼수 있고; 각각의 r 및 s는 0-4이고 단 r+s의 합은 1-4이다. 특히 흥미로운 상황은 바이라디칼이 -Y-, (CR*R*)r+s-, -(CR*R*)r-Y-(CR*R*)s-, 및 -Y-(CR*R*)r+s-Y-로부터 선택되고, 여기서 각각의 r 및 s는 0-3이며, 단 r+s의 합은 1-4인 것이다.
특히 흥미로운 올리고머는 올리고머중의 적어도 하나의 LNA의 R2*및 R4*가 함께 -O-, -S-, -N(R*)-, -(CR*R*)r+s+1-, -(CR*R*)r-O-(CR*R*)s-, -(CR*R*)r-S-(CR*R*)s-, -(CR*R*)r-N(R*)-(CR*R*)s-, -O-(CR*R*)r+s-O-, -S-(CR*R*)r+s-O-, -O-(CR*R*)r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)r+s-O-, -O-(CR*R*)r+s-N(R*)-, -S-(CR*R*)r+s-S-, -N(R*)-(CR*R*)r+s-N(R*)-, -N(R*)-(CR*R*)r+s-S-, 및 -S-(CR*R*)r+s-N(R*)-로부터 선택된 바이라디칼을 나타내는 것이다.
하나의 R*는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, 임의로 치환된 C1-6-알킬, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택되고 모든 남은 치환체 R*는 수소인 것이 더욱 바람직하다.
하나의 바람직한 변형예에서, 적어도 하나의 LNA의 바이라디칼에서 하나의그룹 R*은 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택된다(후자의 그룹은 치환체 B에 대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다).
바람직하게는, P 또는 P*에 존재하고 그에 관여하지 않는, LNA(s)의 각각의 치환체 R1*, R2, R3, R3*, R5, R5*, R6및 R6*는 독립적으로 수소, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 하이드록시, C1-6-알콕시, C2-6-알케닐옥시, 카복시, C1-6-알콕시카보닐, C1-6-알킬카보닐, 포밀, 아미노, 모노- 및 디(C1-6-알킬)아미노, 카바모일, 모노- 및 디(C1-6-알킬)-아미노-카보닐, C1-6-알킬-카보닐아미노, 카바미도, 아지도, C1-6-알카노일옥시, 설포노, 설파닐, C1-6-알킬티오, DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드 및 할로겐으로부터 선택되고, 두 개의 제미날 치환체는 함께 옥소를 나타내며, RN*는, 바이라디칼에 존재하고 그에 관여하지 않을때, 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택된다.
LNAs의 바람직한 변형예에서, X는 -O-, -S-, 및 -NRN*-, 특히 -O-로부터 선택되고 P 또는 P*에 존재하고 그에 관여하지 않는, LNA(s)의 각각의 치환체 R1*, R2, R3, R3*, R5, R5*, R6및 R6*는 수소를 나타낸다.
더욱 바람직한 변형예에서, X는 -O-이고, R2는 수소, 하이드록시 및 임의로 치환된 C1-6-알콕시로부터 선택되며, R3및 R3*의 하나는 P*이고 다른 것은 수소이며, R1*, R5및 R5*는 수소를 나타내고, 더욱 구체적으로, 바이라디칼(R2*-R4*)는 -O-, -(CH2)0-1-O-(CH2)1-3-, -(CH2)0-1-S-(CH2)1-3-, -(CH2)0-1-N(RN)-(CH2)1-3-, 및 -(CH2)2-4-, 특히 -O-CH2-, -S-CH2-, 및 -NRH-CH2-로부터 선택된다. 일반적으로, 이제까지 얻어진 결과에 관하여, R2*및 R4*로 구성된 바이라디칼은 두 개의 탄소원자 브릿지를 형성하고, 즉, 바이라디칼은 퓨라노스 환(X=O)을 갖는 5 원 환을 형성한다. 또한 특히 흥미로운 것은 화학식 Ⅰ의 도입된 LNA의 R2*및 R4*가 함께 -O-CH2-, -S-CH2- 및 -NRH-CH2-로부터 선택된 바이라디칼을 나타내고; X가 O이고, B는 아데닌, 구아닌, 티민, 사이토신 및 우라실로부터 선택된 뉴클레오염기를 나타내며; R2가 수소이고 R3또는 R3*의 하나가 P*이고 다른 것은 수소이며, R1*, R3, R5및 R5*는 수소를 나타내는 그들 올리고머이다.
이들 구체예에서, 올리고머에 도입된 적어도 하나의 LNA는 아데닌 및 구아닌으로부터 선택된 뉴클레오염기(치환체 B)를 포함하는 것이 더욱 바람직하다. 특히 그에 도입된 LNA를 갖는 올리고머는 티민, 우라실 및 사이토신으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오염기와 아데닌 및 구아닌으로부터 선택된 적어도 하나의 뉴클레오염기를 포함한다. LNA 모노머를 위해, 뉴클레오염기가 아데닌 및 구아닌으로부터 선택되는 것이 특히 바람직하다.
이들 흥미로운 구체예에서, 모든 올리고뉴클레오타이드의 모노머는 LNA 모노머이다.
일반식 Ⅰ(올리고머중의 LNA(s)) 및 그와 관련된 정의로부터 명백해지듯이, 하기와 같이 치환체의 성질 및 가능한 바이라디칼에 따라 올리고머에 존재하는 하나 또는 몇몇 비대칭 탄소 원자가 존재할 수 있다.
하나의 변형예에서, R3*는 P*를 나타낸다. 다른 변형예에서, R3은 P*를 나타내고, 제3의 변형예에서 올리고머내에서 일부 R3*는 일부 LNAs의 P*를 나타내고 R3는 다른 LNAs의 P*를 나타낸다.
올리고머는 전형적으로 일반식 Ⅰ의 1-10000 개의 LNA(s) 및 자연 발생 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체로부터 선택된 0-10000 개의 뉴클레오사이드를 포함한다. 뉴클레오사이드의 수와 LNA(s)의 수의 합은 적어도 2, 바람직하게는 적어도 3, 특히 적어도 5, 특히 적어도 7, 예를 들어 2-15000 범위, 바람직하게는 2-100 범위, 예를 들어 3-100, 특히 2-50 범위, 예를 들어 3-50 또는 5-50 또는 7-50 범위이다.
본 명세서에서, 용어 "뉴클레오사이드"는 헤테로사이클릭 염기의 글라이코사이드를 의미한다. 용어 "뉴클레오사이드"는 비-자연 발생 뉴클레오사이드, 자연발생 뉴클레오사이드 및 기타 뉴클레오사이드 유사체를 포함하는 것으로서 넓은 의미로 사용된다. 뉴클레오사이드의 구체적인 예는 리보스 부위를 포함하는 리보뉴클레오사이드 및 데옥시리보스 부위를 포함하는 데옥시리보뉴클레오사이드이다. 그러한 뉴클레오사이드의 염기에 관하여, 이것은 모든 자연 발생 염기, 예를 들어 아데닌, 구아닌, 사이토신, 티민, 및 우라실, 및 그의 모든 변형된 변이체 또는 모든 가능한 비자연적 염기일 수 있음을 이해하여야 한다.
정의 및 알려진 뉴클레오사이드(자연 발생 및 비-자연 발생) 및 뉴클레오사이드 유사체(알려진 바이- 및 트리사이클릭 유사체 포함)를 고려할때, 올리고머가 하나 이상의 LNA(s)(치환체의 선택 및 바이라디칼의 선택에 관하여 동일하거나 상이할 수 있는) 및 하나 이상의 뉴클레오사이드 및/또는 뉴클레오사이드 유사체를 포함할 수 있음이 분명하다. 본 명세서에서 "올리고뉴클레오타이드"는 뉴클레오사이드간 결합을 통해 결합된 뉴클레오사이드의 연속된 쇄를 의미한다: 그러나, 올리고머(올리고뉴클레오타이드)에 있는 하나 이상의 뉴클레오타이드 단위(모노머)의 뉴클레오염기는 상기 정의된 바와 같이 치환체 B에 관하여 변형될 수 있음을 이해하여야 한다.
상기 언급한 바와 같이, 올리고머의 LNA(s)는 뉴클레오사이드간 결합을 통해 다른 모노머와 결합된다. 본 명세서에서, 용어 "뉴클레오사이드간 결합"은 -CH2-, -O-, -S-, -NRH-, >C=O, >C=NRH, >C=S, -Si(R")2-, -SO-, -S(O)2-, -P(O)2-, -PO(BH3)-, -P(O,S)-, -P(S)2-, -PO(R")-, -PO(OCH3)-, 및 -PO(NHRH)-(여기서 RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C1-6-알킬 및 페닐로부터 선택된다)로부터 선택되는 2 내지 4 개, 바람직하게는 3 개의 그룹/원자로 구성된 결합을 의미한다. 그러한 뉴클레오사이드간 결합의 구체적인 예는 -CH2-CH2-CH2-, -CH2-CO-CH2-, -CH2-CHOH-CH2-, -O-CH2-O-, -O-CH2-CH2-, -O-CH2-CH=(후행 모노머에 대한 결합으로서 사용될때 R5포함), -CH2-CH2-O-, -NRH-CH2-CH2-, -CH2-CH2-NRH-, -CH2-NRH-CH2-, -O-CH2-CH2-NRH-, -NRH-CO-O-, -NRH-CO-NRH-, -NRH-CS-NRH-, -NRH-C(=NRH)-NRH-, -NRH-CO-CH2-NRH-, -O-CO-O-, -O-CO-CH2-O-, -O-CH2-CO-O-, -CH2-CO-NRH-, -O-CO-NRH-, -NRH-CO-CH2-, -O-CH2-CO-NRH-, -O-CH2-CH2-NRH-, -CH=N-O-, -CH2-NRH-O-, -CH2-O-N=(후행 모노머에 대한 결합으로서 사용될때 R5포함), -CH2-O-NRH-, -CO-NRH-CH2-, -CH2-NRH-O-, -CH2-NRH-CO-, -O-NRH-CH2-, -O-NRH-, -O-CH2-S, -S-CH2-O-, -CH2-CH2-S-, -O-CH2-CH2-S-, -S-CH2-CH=(후행 모노머에 대한 결합으로서 사용될때 R5포함), -S-CH2-CH2-, -S-CH2-CH2-O-, -S-CH2-CH2-S-, -CH2-S-CH2-, -CH2-SO-CH2-, -CH2-SO2-CH2-, -O-SO-O-,-O-S(O)2-O-, -O-S(O)2-CH2-, -O-S(O)2-NRH-, -NRH-S(O)2-CH2-, -O-S(O)2-CH2-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -S-P(O)2-O-, -S-P(O,S)-O-, -S-P(S)2-O-, -O-P(O)2-S-, -O-P(O,S)-S-, -O-P(S)2-S-, -S-P(O)2-S-, -S-P(O,S)-S-, -S-P(S)2-S-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(OCH3)-O-, -O-PO(OCH2CH3)-O-, -O-PO(OCH2CH2S-R)-O-, -O-PO(BH3)-O-, -O-PO(NHRN)-O-, -O-P(O)2-NRH-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -CH2-P(O)2-O-, -O-P(O)2-CH2-, 및 -O-Si(R")2-O-이며; 그중 -CH2-CO-NRH-, -CH2-NRH-O-, -S-CH2-O-, -O-P(O)2-O-, -O-P(O,S)-O-, -O-P(S)2-O-, -NRH-P(O)2-O-, -O-P(O,NRH)-O-, -O-PO(R")-O-, -O-PO(CH3)-O-, 및 -O-PO(NHRN)-O-(여기서 RH는 수소 및 C1-4-알킬로부터 선택되고, R"는 C1-6-알킬 및 페닐로부터 선택된다)가 특히 바람직하다.
추가의 구체적 예는 Mesmaeker 등, Current Opinion in Structural Biology 1995, 5, 343-355에 제공되어 있다. 뉴클레오사이드간 결합의 좌측편은 우측편이 선행 모노머의 5'-위치에 결합되는 반면, 치환체 P*로서 5-원 환에 결합된다.
또한 해당 LNA가 5'-말단 모노머인 경우 그룹 P가 또한 5'-말단 그룹을 나타낼 수 있음이 상기로부터 분명하다. 그러한 5'-말단 그룹의 예는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, 임의로 치환된 C1-6-알킬카보닐옥시, 임의로 치환된 아릴옥시, 모노포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, 및 -W-A'-이고, 여기서 W는 -O-, -S- 및 -N(RH)-이며, 여기서 RH는 수소 및 C1-6-알킬로부터 선택되고, A'는 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택된다(후자의 그룹은 치환체 B에 대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다).
본 발명의 상세한 설명 및 청구범위에서, 용어 "모노포스페이트", "디포스페이트", 및 "트리포스페이트"는 각각 화학식의 그룹을 의미한다:
-O-P(O)2-O-, -O-P(O)2-O-P(O)2-O-, 및 -O-P(O)2-O-P(O)2-O-P(O)2-O-
특히 흥미로운 구체예에서, 그룹 P는 모노포스페이트, 디포스페이드 및 트리포스페이트로부터 선택되는 5'-말단 그룹을 나타낸다. 특히 트리포스페이트 변형체가 핵산 중합효소의 기질로서 흥미롭다.
유사하게, 그룹 P*는 해당 LNA가 3'-말단 모노머인 경우 3'-말단 그룹을 나타낼 수 있다. 그러한 3'-말단 그룹의 예는 수소, 하이드록시, 임의로 치환된 C1-6-알콕시, 임의로 치환된 C1-6-알킬카보닐옥시, 임의로 치환된 아릴옥시, 및 -W-A'-이고, 여기서 W는 -O-, -S- 및 -N(RH)-로부터 선택되며, 여기서 RH는 수소 및 C1-6-알킬로부터 선택되고, A'는 DNA 삽입제, 광화학적 활성 그룹, 열화학적 활성 그룹, 킬레이트 그룹, 리포터 그룹, 및 리간드로부터 선택된다(후자의 그룹은 치환체 B에대해 정의된 바와 같은 스페이서를 포함할 수 있다).
LNAs의 바람직한 변형예에서, 올리고머는 하기 화학식 Ⅴ를 갖는다:
G-[Nu-L]n(o)-{[LNA-L]m(q)-[Nu-L]n(q)}q-G*Ⅴ
상기 식에서
q는 1-50이고;
각각의 n(0)...n(q)는 독립적으로 0-10000이며;
각각의 m(1)...m(q)는 독립적으로 1-10000이고;
단 n(0)...n(q)와 m(1)...m(q)의 합은 2-15000이며;
G는 5'-말단 그룹을 나타내고;
각각의 Nu는 독립적으로 자연 발생 뉴클레오사이드 및 뉴클레오사이드 유사체로부터 선택되는 뉴클레오사이드를 나타내며;
각각의 LNA는 독립적으로 뉴클레오사이드 유사체를 나타내고;
각각의 L은 독립적으로 Nu 및 LNA로부터 선택되는 두 그룹간의 뉴클레오사이드간 결합을 나타내거나, L은 G*와 함께 3'-말단 그룹을 나타내며;
각각의 LNA-L은 독립적으로 상기 정의된 바와 같은 일반식 Ⅰ의 뉴클레오사이드 유사체를 나타낸다.
이 변형예내에서 및 일반적으로, LNAs는 바람직하게는 상이한 뉴클레오염기, 특히 티민, 사이토신 및 우라실로부터 선택되는 뉴클레오염기 및 아데닌 및 구아닌으로부터 선택되는 뉴클레오염기 모두를 포함한다.
올리고머는 또한 키메라 올리고머를 포함하는 것이다. 용어 "키메라 올리고머"는 서로 직접적으로 또는 스페이서를 통해 결합된 상이한 기원의 모노머를 갖는 2 개 이상의 올리고머를 의미한다. 결합될 수 있는 그러한 올리고머의 구체적 예는 펩타이드, PNA-올리고머, LNAs를 함유하는 올리고머, 및 올리고뉴클레오타이드 올리고머이다. 자일로-LNA(R3=P*) 도메인(들) 및 "정상" LNA(R3*=P*) 도메인(들)을 갖는 올리고머의 결합은 다양한 도메인이 상이한 친화성 및 특이성 프로파일을 가질 수 있으므로 키메라 올리고머의 예로 해석될 수 있다.
일반적으로, 올리고머는 친화성 및 특이성에 관하여 놀랍게도 우수한 혼성화 성질을 갖는다. 따라서, 올리고머는 뉴클레오사이드 유사체를 포함하지 않는 상응하는 비변형된 참조 올리고뉴클레오타이드 보다 적어도 2.5 ℃ 높은, 바람직하게는 적어도 3.5 ℃ 높은, 특히 적어도 4.0 ℃ 높은, 특히 적어도 5.0 ℃ 높은, 상보적 DNA 올리고뉴클레오타이드와의 Tm을 올리고머에게 부여하는, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 유사체를 포함한다. 특히, 올리고머의 Tm은 적어도 2.5×N ℃ 높고, 바람직하게는 적어도 3.5×N ℃ 높으며, 특히 적어도 4.0×N ℃ 높고, 특히 적어도 5.0×N ℃ 높다(여기서 N은 뉴클레오사이드 유사체의 갯수이다).
상보적인 RNA 올리고뉴클레오타이드와 혼성화하는 경우, 적어도 하나의 뉴클레오사이드 유사체가 올리고머에게 뉴클레오사이드 유사체를 포함하지 않는 상응하는 비변형된 참조 올리고뉴클레오타이드 보다 적어도 4.0 ℃ 높은, 바람직하게는 적어도 5.0 ℃ 높은, 특히 적어도 6.0 ℃ 높은, 특히 적어도 7.0 ℃ 높은, 상보적DNA 올리고뉴클레오타이드와의 Tm을 부여한다. 특히, 올리고머의 Tm은 적어도 4.0×N ℃ 높고, 바람직하게는 적어도 5.0×N ℃ 높으며, 특히 적어도 6.0×N ℃ 높고, 특히 적어도 7.0×N ℃ 높다(여기서 N은 뉴클레오사이드 유사체의 갯수이다).
용어 "상응하는 비변형된 참조 올리고뉴클레오타이드"는 동일한 절대적 순서로(또한 동일한 배향으로) 동일한 뉴클레오염기를 나타내는 자연 발생 뉴클레오타이드로만 구성된 올리고뉴클레오타이드를 의미하고자 하는 것이다.
Tm은 하기 조건중의 하나에서, 바람직하게는 조건 a)에서, 동몰량(전형적으로, 1.0 μM)의 올리고머 및 상보적 DNA 올리고뉴클레오타이드에서 측정된다:
a) 10 mM Na2HPO4, pH 7.0, 100 mM NaCl, 0.1 mM EDTA;
b) 10 mM Na2HPO4, pH 7.0, 0.1 mM EDTA; 또는
c) 3 M 테트라메틸암모늄클로라이드(TMAC), 10 mM Na2HPO4, pH 7.0, 0.1 mM EDTA.
올리고머는 적어도 하나의 뉴클레오사이드 유사체가 화학식 Ⅰ을 갖고 B가 뉴클레오염기인 경우, 바람직하게는 상기 정의된 바와 같다. 특히 흥미로운 것은 적어도 하나의 뉴클레오사이드 유사체가 아데닌 및 구아닌으로부터 선택된 뉴클레오염기를 포함하는 경우이다.
더욱이, 특이성 및 친화성에 관하여, 올리고머는 상기 올리고머와 하나 이상의 미스매치를 갖는 부분적으로 상보적인 DNA 올리고뉴클레오타이드, 또는 부분적으로 상보적인 RNA 올리고뉴클레오타이드와 혼성화될때, 미스매치의 결과로 뉴클레오사이드 유사체를 포함하지 않는 상응하는 비변형 참조 올리고뉴클레오타이드로 관찰되는 감소와 같거나 그 보다 더 큰 Tm의 감소를 나타낸다. 또한, 올리고머는 상응하는 비변형 참조 올리고뉴클레오타이드의 것과 실질적으로 동일한 혼성화 완충액의 이온 강도에 대한 Tm의 감도를 갖는다.
여기서 정의된 올리고머는 전형적으로 적어도 1% 변형되고, 예를 들어 적어도 2% 변형되며, 예를 들어 3% 변형되거나, 4% 변형되거나, 5% 변형되거나, 6% 변형되거나, 7% 변형되거나, 8% 변형되거나, 9% 변형되고, 적어도 10% 변형되며, 예를 들어 적어도 11% 변형되고, 예를 들어 12% 변형되거나, 13% 변형되거나, 14% 변형되거나, 15% 변형되고, 적어도 20% 변형되고, 예를 들어 적어도 30% 변형되거나, 적어도 50% 변형되고, 예를 들어 70% 변형되고 일부 흥미로운 적용에서 100% 변형된다.
올리고머는 바람직하게는 상응하는 비변형 참조 올리고뉴클레오타이드 보다 실질적으로 더 높은 3'-엑소뉴클레오라이시스 안정성을 갖는다.
올리고머(LNAs가 혼입된) 및 LNAs 자체는 약제학적으로 허용되는 염이 특히 관련성이 있는, 그의 가능한 염을 포함하는 것임을 이해해야만 한다. 염은 산부가염 및 염기염을 포함한다. 산부가염의 예는 염산염, 나트륨염, 칼슘염, 칼륨염 등이다. 염기염의 예는 (남아 있는) 반대 이온이 나트륨과 칼륨과 같은 알칼리 금속, 칼슘과 같은 알칼리토금속, 및 암모늄 이온(+N(Rg)3Rh(각각의 Rg및 Rh는 독립적으로 임의로 치환된 C1-6-알킬, 임의로 치환된 C2-6-알케닐, 임의로 치환된 아릴, 또는 임의로 치환된 헤테로아릴을 나타낸다)로부터 선택되는 염이다. 약제학적으로 허용되는 염은 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, 17 Ed., Alfonso R. Gennaro (Ed.), Mack Publishing Company, 이스톤, PA, U.S.A, 1985 및 최신판 및 Encyclopedia of Pharmaceutical Technology에 기재된 것들이다. 따라서, 여기서 사용된 용어 "그의 산부가염 및 염기염"은 그러한 염을 포함하고자 하는 것이다. 더욱이, 올리고 및 LNAs 및 그의 모든 중간체 또는 출발물질이 또한 수화물 형태로 존재할 수 있다.
실시예 1
GnHCl은 인산염 완충액중에서 LNA 혼성화를 허용하고 증진시킨다
구아니딘 하이드로클로라이드(GnHCl)와 같은 강력한 카오트로픽제가 혼성화에 미치는 영향을 연구하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.
5' 안트라퀴논을 갖는 LNA 변형된 올리고(표 1-1 참조)를 UV 조사에 의해 마이크로타이터-플레이트의 웰에 공유적으로 고정화시키고 상보적인 표적 DNA 올리고와의 혼성화 분석에서 포획 탐침으로 사용하였다. 5' 바이오티닐화 DNA 검출 탐침을 혼성화 혼합물에 포함시킴으로써 하이브리드를 검출하였다.
표 1-1: 연구된 올리고뉴클레오타이드
주:LNA 모노머는 대문자로 나타내었다. DNA 모노머는 소문자로 나타내었다. Cmet는 모노머가 5-메틸사이토신 LNA임을 나타낸다. 5'-AQ는 올리고가 5' 안트라퀴논(AQ) 및 C3 링커를 운반하고, 조성이 AQ-CONH-(CH2)3-올리고임을 나타낸다.5'-AQ-HEG는 올리고의 5' 말단이 AQ-CONH-(CH2)3-PO4-((CH2)2O)5-(CH2)2-올리고임을 나타낸다. 5'-바이오틴은 올리고의 5' 말단이 바이오틴-(CH2)4-CONH-(CH2)6-올리고임을 나타낸다.
ApoB 포획 탐침의 고정화:
안트라퀴논 LNA 포획 탐침(C8, C11 또는 HEG C8-표 1-1 참조)을 0.2 M NaCl에 0.1 μM의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕의 올리고를 마이크로타이터-플레이트(C96 polysorp; Nalge Nunc International, 로스킬드, 덴마크)의 각각의 웰에 첨가하고, 15 분동안 ULS-20-2 조명장치(UV-Lights Systems, 덴마크)에 최대 35 ℃에서 약한 UV광(약 350 nm)에 노출시켰다. 조명장치에 28 개의 Philips Cleo Compact 25W-S 광 전구를 장착하고(14 개는 유리 플레이트 샘플 홀더 상부에 위치하고 14 개는 그 하부에 위치함); 상부 전구만 켰다.
인큐베이션후 웰을 먼저 0.25% 트윈 20(Riedel-de Haen, 실즈, 독일)을 갖는 300 ㎕의 0.4 M NaOH로 세척한후 300 ㎕의 탈이온수로 3 회 세척하였다.
표적 및 검출 탐침과의 혼성화:
야생형(WT) 표적 분자(0.3 μM, EQ3185, 서열번호 7)를 C8, C11 또는 HEG C8 포획 탐침으로 코팅된 마이크로타이터-웰에 첨가하였다. 혼성화 혼합물중의 GnHCl의 농도를 하기하는 바와 같이 2 배 "희석"으로 변화시켰다. 생성된 GnHCl의 농도는 0.0078, 0.016, 0.032, 0.063, 0.13, 0.25, 0.5, 1, 2, 4 및 8 M이었다.
혼성화 완충액을 0.1% 트윈 20을 갖는 pH 7의 50 mM 인산염 완충액에 8 M의최종 농도로 고체 GnHCl을 용해시켜 제조하였다. 더 낮은 농도의 GnHCl을 갖는 완충액을 0 M GnHCl을 함유하는 유사한 완충액으로 8 M HCl을 함유하는 완충액을 희석시켜 제조하였다.
100 ㎕의 혼성화 혼합물을 마이크로타이터-플레이트 웰당 첨가하였다. 포획 및 표적 올리고를 반 시간 동안 37 ℃에서 혼성화하도록 하였다. 그후 웰을 0.1% 트윈 20을 갖는 300 ㎕의 1×SSC로 5 회 세척하였다(1×SSC는 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 나트륨이다). 그후, 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC에 용해된 100 ㎕의 0.12 μM 검출 탐침(EQ-3246, 서열번호 8)을 가하고 반 시간 동안 37 ℃에서 혼성화하도록 하였다. 마지막으로 마이크로타이터-플레이트를 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC로 3 회 세척하였다.
스트랩타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제(strA-HRP)를 바이오티닐화 검출 탐침에 결합시켜 하이브리드를 검출하였다. strA-HRP(Pierce, 록포드, IL, USA. Cat. no. 21126)를 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC에 1 ㎍/㎖의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕를 웰당 첨가하고 15 분동안 인큐베이션하였다. 그후 플레이트를 1×SSC; 0.1% 트윈 20으로 3 회 세척하고 OPD-분석에서 신호를 발현시켰다.
OPD-분석:
6 ㎖의 0.1 M 시트레이트 완충액 pH=5.0, 2 개의 2 mg 오르소-페닐렌-디아민(OPD) 정제(Kem-En-Tech, 코펜하겐, 덴마크) 및 2.5 ㎕의 30% H2O2를 함유하는 주-혼합물을 제조하였다. 100 ㎕의 주-혼합물을 각각의 반응 챔버에 가하고 효소 활성에 따라 1 내지 30 분동안 인큐베이션하였다. 분석을 100 ㎕의 0.5 M H2SO4로 중지시키고 광학 밀도를 ELISA-판독기로 λ=492에서 측정하였다.
결과:
그 결과를 도 1-1에 나타내었다.
결론:
실험으로부터 GnHCl을 함유하는 완충액중에서 우수한 효율로 혼성화하는 것이 가능한 것으로 결론내려졌다. 놀랍게도, 혼성화 신호가 GnHCl의 농도가 증가할수록 증가하는 것으로 관찰되었다. 매우 높은(8 M) GnHCl 농도에서도, 높은 혼성화 신호를 얻었다. 실제로, DNA-링커(C8(EQ-3133, 서열번호 4) 및 C11(EQ-3131, 서열번호 5))를 갖는 포획 올리고의 경우, 약 0.1 M에서 그 효과가 나타나기 시작하여 약 0.5 M 내지 5 M 농도에서 혼성화 신호가 약 30% 증가하는 최적값을 갖는 GnHCl의 함수로서 혼성화 신호가 증가한다. 헥사에틸렌 글리콜 링커(HEG C8(EQ-3018, 서열번호 6)를 통한 마이크로타이터-플레이트의 표면에 고정화된 포획 탐침에 대한 혼성화는 영향을 덜 받는 것으로 보인다.
실시예 2
GnHCl에서의 혼성화는 특이적이다(경쟁 실험)
강력한 카오트로픽제를 함유하는 완충액에서 혼성화가 단일 염기를 구별할 수 있을 정도의 충분히 높은 엄격도로 수행될 수 있는지를 연구하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.
5'-안트라퀴논을 갖는 LNA 변형 올리고(표 2-1 참조)를 마이크로타이터-플레이트의 웰에 UV 조사에 의해 공유적으로 고정시키고 상보적인 표적 DNA 올리고와의혼성화 분석에서 포획 탐침으로서 사용하였다. 혼성화 혼합물중에 5' 바이오티닐화 DNA 검출 탐침을 포함시킴으로써 하이브리드를 검출하였다.
표 2-1: 연구된 올리고뉴클레오타이드
주:LNA 모노머는 대문자로 나타내었다. DNA 모노머는 소문자로 나타내었다. Cmet는 모노머가 5-메틸사이토신 LNA임을 나타낸다. 5'-AQ는 올리고가 5' 안트라퀴논(AQ) 및 C3 링커를 운반하고, 조성이 AQ-CONH-(CH2)3-올리고임을 나타낸다. 5'-바이오틴은 올리고의 5' 말단이 바이오틴-(CH2)4-CONH-(CH2)6-올리고임을 나타낸다.
ApoB 포획 탐침의 고정화:
안트라퀴논 LNA 포획 탐침(C8 또는 T8-표 2-1 참조)을 0.2 M NaCl에 0.1 μM의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕의 올리고를 마이크로타이터-플레이트(C96 polysorp; Nalge Nunc International, 로스킬드, 덴마크)의 각각의 웰에 첨가하고, 15 분동안 ULS-20-2 조명장치(UV-Lights Systems, 덴마크)에 최대 35 ℃에서 약한 UV광(약 350 nm)에 노출시켰다. 조명장치에 28 개의 Philips Cleo Compact 25W-S 광 전구를 장착하고(14 개는 유리 플레이트 샘플 홀더 상부에 위치하고 14 개는 그 하부에 위치함); 상부 전구만 켰다.
인큐베이션후 웰을 먼저 0.25% 트윈 20(Riedel-de Haen, 실즈, 독일)을 갖는 300 ㎕의 0.4 M NaOH로 세척한후 300 ㎕의 탈이온수로 3 회 세척하였다.
야생형 표적 분자(EQ-3185) 및 돌연변이형 표적 분자(EQ-3187)와의 혼성화:
단일 염기 미스매칭 돌연변이형 표적 분자(EQ3187, 서열번호 10)의 양을 5 배 "연속 희석"으로 변화시킨 반면, 야생형 표적 분자(EQ3185, 서열번호 7)를 C8 포획 탐침(EQ3133, 서열번호 4)으로 코팅된 웰에 일정한 낮은 농도로(0.0005 μM) 첨가하였다. 생성된 돌연변이형 표적 분자의 농도는 0.0001, 0.0005, 0.0025, 0.012, 0.06 및 0.30 μM이었다.
단일 염기 미스매칭 야생형 표적 분자(EQ3185, 서열번호 7)의 양을 5 배 "연속 희석"으로 변화시키는 한편, 돌연변이형 표적 분자(EQ3185, 서열번호 7)를 T8 포획 탐침(EQ3134, 서열번호 9)으로 코팅된 챔버에 일정한 낮은 농도로(0.005 μM) 첨가하였다. 생성된 야생형 표적 분자의 농도는 0.0001, 0.0005, 0.0025, 0.012, 0.06 및 0.30 μM이었다.
혼성화 완충액을 0.1% 트윈 20을 갖는 pH 7의 50 μM 인산염 완충액에 8 M의최종 농도로 고체 GnHCl을 용해시켜 제조하였다. 더 낮은 농도의 GnHCl을 갖는 완충액을 0 M GnHCl을 함유하는 유사한 완충액으로 8 M HCl을 함유하는 완충액을 희석시켜 제조하였다.
100 ㎕의 혼성화 혼합물을 마이크로타이터-플레이트 웰당 첨가하였다. 포획 및 표적 올리고를 반 시간 동안 37 ℃에서 혼성화하도록 하였다. 그후 웰을 0.1% 트윈 20을 갖는 300 ㎕의 1×SSC로 5 회 세척하였다(1×SSC는 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 나트륨이다). 그후, 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC에 용해된 100 ㎕의 0.12 μM 검출 탐침(EQ-3246, 서열번호 8)을 가하고 반 시간 동안 37 ℃에서 혼성화하도록 하였다. 마지막으로 마이크로타이터-플레이트를 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC로 3 회 세척하였다.
스트랩타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제(strA-HRP)를 바이오티닐화 검출 탐침에 결합시켜 하이브리드를 검출하였다. strA-HRP(Pierce, 록포드, IL, USA. Cat. no. 21126)를 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC에 1 ㎍/㎖의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕를 웰당 첨가하고 15 분동안 인큐베이션하였다. 그후 플레이트를 1×SSC; 0.1% 트윈 20으로 3 회 세척하고 OPD-분석에서 신호를 발현시켰다.
OPD-분석:
6 ㎖의 0.1 M 시트레이트 완충액 pH=5.0, 2 개의 2 mg 오르소-페닐렌-디아민(OPD) 정제(Kem-En-Tech, 코펜하겐, 덴마크) 및 2.5 ㎕의 30% H2O2를 함유하는 주-혼합물을 제조하였다. 100 ㎕의 주-혼합물을 각각의 반응 챔버에 가하고 효소 활성에 따라 1 내지 30 분동안 인큐베이션하였다. 분석을 100 ㎕의 0.5 M H2SO4로 중지시키고 광학 밀도를 ELISA-판독기로 λ=492에서 측정하였다.
결과:
그 결과를 도 2-1 및 2-2에 나타내었다.
결론:
이 실험에 기초하여 혼성화의 엄격성-높은 농도의 GnHCl에서도-이 GnHCl을 함유하지 않는 완충액에서 관찰된 엄격성과 양립가능한 것으로 결론내려졌다.
C8 포획 탐침 사용시, (비-특이적) 신호의 명확한 증가는 경쟁 돌연변이형 표적 분자의 농도가 0.05 μM를 초과할때까지 나타나지 않는다. 이 농도에서 매칭 대 미스매칭 올리고의 비율은 1:100이다. 매칭 및 미스매칭 올리고로부터의 동일한 기여(예를 들어 2 배의 신호 증가)를 GnHCl의 농도에 따라 0.2-0.5 μM의 경쟁 올리고의 양에서 얻는다. 높은 엄격성이 4 M GnHCl 이하의 농도에서 나타난다. 이들 완충액에서 동일한 신호를 약 1:600의 매칭 대 미스매칭 올리고의 비율에서 얻는다. 환언하면, 1:600의 신호 대 잡음 비율이 관찰된다.
T8 포획 탐침 사용시, (비-특이적) 신호의 명확한 증가는 경쟁 야생형 표적 분자의 농도가 0.1 μM를 초과할때까지 나타나지 않는다. 이 농도에서 매칭 대 미스매칭 올리고의 비율은 1:20이다. 매칭 및 미스매칭 올리고로부터의 동일한 기여(예를 들어 2 배의 신호 증가)를 경쟁 올리고의 어떠한 양에서도 얻을 수 없다. 따라서 동일한 신호는 1:60 보다 높은 매칭 대 미스매칭 올리고의 비율에서 얻어질 것으로 추정된다. 환언하면, 1:60(추정된 값으로 1:100보다 좋은) 보다 높은 신호 대 잡음 비율이 관찰된다.
구아니딘 하이드로클로라이드(GnHCl)와 같은 강력한 카오트로픽제를 함유하는 완충액에서의 혼성화를 단일-염기를 구별하기에 충분히 높은 엄격도에서 수행할 수 있는 것으로 결론내려졌다.
실시예 3
GnSCN은 시트르산 나트륨 및 인산염 완충액에서의 혼성화를 허용하고 증진시킨다
RNA 제조를 위한 표준 용균 완충액은 종종 시트르산 나트륨 완충액을 종종 기초로 한다(예: Gilsin(1974) Biochemistry 13, 2633 및 Chirwin(1979) Biochemistry 18, 5294). 하기 실험을 시트르산 나트륨 또는 인산염에 기초한 완충제를 함유하는 구아니딘 티오시아네이트(GnSCN) 함유 완충액에서의 혼성화 수행을 비교하기 위하여 수행하였다.
5'-안트라퀴논을 갖는 LNA 변형 올리고(표 3-1 참조)를 마이크로타이터-플레이트의 웰에 UV 조사에 의해 공유적으로 고정시키고 상보적인 표적 DNA 올리고와의 혼성화 분석에서 포획 탐침으로서 사용하였다. 하이브리드를 혼성화 혼합물중에 5' 바이오티닐화 DNA 검출 탐침을 포함시킴으로써 검출하였다.
표 3-1: 연구된 올리고뉴클레오타이드
주:LNA 모노머는 대문자로 나타내었다. DNA 모노머는 소문자로 나타내었다. Cmet는 모노머가 5-메틸사이토신 LNA임을 나타낸다. 5'-AQ는 올리고가 5' 안트라퀴논(AQ) 및 C3 링커를 운반하고, 조성이 AQ-CONH-(CH2)3-올리고임을 나타낸다. 5'-바이오틴은 올리고의 5' 말단이 바이오틴-(CH2)4-CONH-(CH2)6-올리고임을 나타낸다.
ApoB 포획 탐침의 고정화:
안트라퀴논 LNA 포획 탐침(C8 또는 T8-표 3-1 참조)을 0.2 M NaCl에 0.1 μM의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕의 올리고를 마이크로타이터-플레이트(C96 polysorp; Nalge Nunc International, 로스킬드, 덴마크)의 각각의 웰에 첨가하고,15 분동안 ULS-20-2 조명장치(UV-Lights Systems, 덴마크)에 최대 35 ℃에서 약한 UV광(약 350 nm)에 노출시켰다. 조명장치에 28 개의 Philips Cleo Compact 25W-S 광 전구를 장착하고(14 개는 유리 플레이트 샘플 홀더 상부에 위치하고 14 개는 그 하부에 위치함); 상부 전구만 켰다.
인큐베이션후 웰을 먼저 0.25% 트윈 20(Riedel-de Haen, 실즈, 독일)을 갖는 300 ㎕의 0.4 M NaOH로 세척한후 300 ㎕의 탈이온수로 3 회 세척하였다.
WT(EQ-3185) 및 MUT(EQ-3187) 표적 분자와의 혼성화:
야생형(WT) 표적 분자(0.012 μM)를 C8 포획 탐침으로 코팅된 마이크로타이터-웰에 첨가하였다. 혼성화 혼합물중의 GnSCN의 농도를 2 배 "희석"으로 변화시켰다-하기 참조. 생성된 GnSCN의 농도는 0.03, 0.06, 0.13, 0.25, 0.5, 1, 2 및 4 M이었다.
유사하게, 돌연변이형(MUT) 표적 분자(0.012 μM)를 T8 포획 탐침으로 코팅된 마이크로타이터-웰에 첨가하고 0.03, 0.06, 0.13, 0.25, 0.5, 1, 2 및 4 M GnSCN에서 혼성화하였다.
혼성화 완충액을 0.5% 사르코실을 갖는 pH 7의 40 mM 시트르산 나트륨 완충액 또는 0.1% 트윈 20을 갖는 pH 7의 50 mM 인산염 완충액에 고체 GnSCN을 4 M의 최종 농도로 용해시켜 제조하였다. 그후 더 낮은 농도의 GnSCN을 갖는 완충액을 4 M GnSCN을 함유하는 완충액을 0 M GnSCN을 함유하는 유사한 완충액으로 희석시킴으로써 제조하였다.
100 ㎕의 혼성화 혼합물을 마이크로타이터-플레이트 웰당 첨가하였다. 포획및 표적 올리고를 반 시간 동안 37 ℃에서 혼성화하도록 하였다. 그후 웰을 0.1% 트윈 20을 갖는 300 ㎕의 1×SSC로 5 회 세척하였다(1×SSC는 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 나트륨이다). 마지막으로 마이크로타이터-플레이트를 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC중의 100 ㎕의 0.12 μM 검출 탐침(EQ-3246, 서열번호 8)을 반 시간동안 37 ℃에서 첨가한후, 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC로 3 회 세척하였다.
스트랩타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제를 바이오티닐화 검출 탐침에 결합시켜 하이브리드를 검출하였다. strA-HRP(Pierce, 록포드, IL, USA. Cat. no. 21126)를 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC에 1 ㎍/㎖의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕를 웰당 첨가하고 15 분동안 인큐베이션하였다. 그후 플레이트를 1×SSC; 0.1% 트윈 20으로 3 회 세척하고 OPD-분석에서 신호를 발현시켰다.
OPD-분석:
6 ㎖의 0.1 M 시트레이트 완충액 pH=5.0, 2 개의 2 mg 오르소-페닐렌-디아민(OPD) 정제(Kem-En-Tech, 코펜하겐, 덴마크) 및 2.5 ㎕의 30% H2O2를 함유하는 주-혼합물을 제조하였다. 100 ㎕의 주-혼합물을 각각의 반응 챔버에 가하고 효소 활성에 따라 1 내지 30 분동안 인큐베이션하였다. 분석을 100 ㎕의 0.5 M H2SO4로 중지시키고 광학 밀도를 ELISA-판독기로 λ=492에서 측정하였다.
결과:
그 결과를 도 3-1에 나타내었다.
결론:
혼성화 신호가 약 0.2 M에서 그 효과를 나타내기 시작하여 약 1 M 내지 2 M에서 최적값을 갖는 GnSCN의 함수로서 증가되는 것이 관찰된다.
GnSCN에 의한 가장 현저한 증가는 인산염 기초 완충액에서 C8 포획 LNA 탐침 및 WT 표적 올리고간의 혼성화에서 나타난다. GnSCN의 최적 농도에서 신호는 75% 증가되었다.
T8 및 MUT 올리고와의 혼성화는 GnSCN에 의해 덜 영향을 받는다. 인산염 완충액에서 높은 농도의 GnSCN(4 M)은 부정적인 영향을 미쳤다.
결론적으로 시트르산 나트륨에 기초한 완충액, 예를 들어 많은 세포 용균-완충액에서 사용되는 타입은 적어도 인산염-기초 완충액만큼은 우수하며, 구아니딘 하이드로클로라이드(GnHCl)와 유사하게 GnSCN은 높은 농도에서 혼성화를 허용하고 실제로 증진시키는 것으로 확인되었다.
실시예 4.
GnSCN에서의 혼성화는 시트르산 나트륨 및 인산염 완충액과 비교하여 특이적이다(경쟁 실험)
시트르산 나트륨 또는 인산염에 기초한 완충액을 함유하는 구아니딘 티오시아네이트(GnSCN)에서 혼성화 엄격도를 비교하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
5'-안트라퀴논을 갖는 LNA 변형 올리고(표 4-1 참조)를 마이크로타이터-플레이트의 웰에 UV 조사에 의해 공유적으로 고정시키고 상보적인 표적 DNA 올리고와의 혼성화 분석에서 포획 탐침으로서 사용하였다. 하이브리드를 혼성화 혼합물중에 5' 바이오티닐화 DNA 검출 탐침을 포함시킴으로써 검출하였다.
표 4-1: 연구된 올리고뉴클레오타이드
주:LNA 모노머는 대문자로 나타내었다. DNA 모노머는 소문자로 나타내었다. Cmet는 모노머가 5-메틸사이토신 LNA임을 나타낸다. 5'-AQ는 올리고가 5' 안트라퀴논(AQ) 및 C3 링커를 운반하고, 조성이 AQ-CONH-(CH2)3-올리고임을 나타낸다. 5'-바이오틴은 올리고의 5' 말단이 바이오틴-(CH2)4-CONH-(CH2)6-올리고임을 나타낸다.
ApoB 포획 탐침의 고정화:
안트라퀴논 LNA 포획 탐침(C8 또는 T8-표 4-1 참조)을 0.2 M NaCl에 0.1 μM의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕의 올리고를 마이크로타이터-플레이트(C96 polysorp; Nalge Nunc International, 로스킬드, 덴마크)의 각각의 웰에 첨가하고,15 분동안 ULS-20-2 조명장치(UV-Lights Systems, 덴마크)에 최대 35 ℃에서 약한 UV광(약 350 nm)에 노출시켰다. 조명장치에 28 개의 Philips Cleo Compact 25W-S 광 전구를 장착하고(14 개는 유리 플레이트 샘플 홀더 상부에 위치하고 14 개는 그 하부에 위치함); 상부 전구만 켰다.
인큐베이션후 웰을 먼저 0.25% 트윈 20(Riedel-de Haen, 실즈, 독일)을 갖는 300 ㎕의 0.4 M NaOH로 세척한후 300 ㎕의 탈이온수로 3 회 세척하였다.
야생형 표적 분자(EQ-3185) 및 돌연변이형 표적 분자(EQ-3187)와의 혼성화:
단일 염기 미스매칭 돌연변이형 표적 분자(EQ3187, 서열번호 10)의 양을 5 배 "연속 희석"으로 변화시킨 반면, 야생형 표적 분자(EQ3185, 서열번호 7)를 C8 포획 탐침(EQ3133, 서열번호 4)으로 코팅된 웰에 일정한 낮은 농도로(0.0005 μM) 첨가하였다. 생성된 돌연변이형 표적 분자의 농도는 0.0001, 0.0005, 0.0025, 0.012, 0.06 및 0.30 μM이었다.
단일 염기 미스매칭 야생형 표적 분자(EQ3185, 서열번호 7)의 양을 5 배 "연속 희석"으로 변화시키는 한편, 돌연변이형 표적 분자를 T8 포획 탐침(EQ3134, 서열번호 9)으로 코팅된 챔버에 일정한 낮은 농도로(0.005 μM) 첨가하였다. 생성된 야생형 표적 분자의 농도는 0.0001, 0.0005, 0.0025, 0.012, 0.06 및 0.30 μM이었다.
혼성화 완충액을 0.5% 사르코실을 갖는 pH 7의 40 mM 시트르산 나트륨 완충액; 또는 0.1% 트윈 20을 갖는 pH 7의 50 μM 인산염 완충액에 4 M의 최종 농도로 고체 GnSCN을 용해시켜 제조하였다. 더 낮은 농도의 GnSCN을 갖는 완충액을 0 MGnSCN을 함유하는 유사한 완충액으로 4 M GnSCN을 함유하는 완충액을 희석시켜 제조하였다.
100 ㎕의 혼성화 혼합물을 마이크로타이터-플레이트 웰당 첨가하였다. 포획 및 표적 올리고를 반 시간 동안 37 ℃에서 혼성화하도록 하였다. 그후 웰을 0.1% 트윈 20을 갖는 300 ㎕의 1×SSC로 5 회 세척하였다(1×SSC는 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 나트륨이다). 그후, 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC에 용해된 100 ㎕의 0.12 μM 검출 탐침(EQ-3246, 서열번호 8)을 가하고 반 시간 동안 37 ℃에서 혼성화하도록 하였다. 마지막으로 마이크로타이터-플레이트를 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC로 3 회 세척하였다.
하이브리드를 스트랩타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제를 바이오티닐화 검출 탐침에 결합시켜 검출하였다. strA-HRP(Pierce, 록포드, IL, USA. Cat. no. 21126)를 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC에 1 ㎍/㎖의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕를 웰당 첨가하고 15 분동안 인큐베이션하였다. 그후 플레이트를 1×SSC; 0.1% 트윈 20으로 3 회 세척하고 OPD-분석에서 신호를 발현시켰다.
OPD-분석:
6 ㎖의 0.1 M 시트레이트 완충액 pH=5.0, 2 개의 2 mg 오르소-페닐렌-디아민(OPD) 정제(Kem-En-Tech, 코펜하겐, 덴마크) 및 2.5 ㎕의 30% H2O2를 함유하는 주-혼합물을 제조하였다. 100 ㎕의 주-혼합물을 각각의 반응 챔버에 가하고 효소 활성에 따라 1 내지 30 분동안 인큐베이션하였다. 분석을 100 ㎕의 0.5 M H2SO4로 중지시키고 광학 밀도를 ELISA-판독기로 λ=492에서 측정하였다.
결과:
그 결과를 도 4-1, 4-2, 4-3 및 4-4에 나타내었다.
결론:
이 실험에 기초하여 혼성화의 엄격성-높은 농도의 GnSCN에서도 이 GnSCN을 함유하지 않는 완충액에서 관찰된 엄격성과 양립가능한 것으로 결론내려졌다. 또한 엄격도는 시트르산 나트륨 및 인산염-기초 완충액에서 비교할만한 것으로 결론내려졌다.
C8 포획 탐침 사용시, (비-특이적) 신호의 명확한 증가는 경쟁 돌연변이형 표적 분자의 농도가 0.05 μM를 초과할때까지 나타나지 않는다. 이 농도에서 매칭 대 미스매칭 올리고의 비율은 1:100이다. 매칭 및 미스매칭 올리고로부터의 동일한 기여(예를 들어 2 배의 신호 증가)는, 4 M GnSCN, PO4-완충액에서의 C8 혼성화를 제외하고는, 어떠한 양의 경쟁 올리고에서도 얻을 수 없다. 4 M GnSCN, PO4에서 C8에 대한 혼성화의 경우, 신호 대 잡음 비율이 약 300임을 나타내는 0.15 μM에서 동일한 신호가 얻어진다. 나머지 혼성화에서 신호 대 잡음 비율은 1:600 보다 더 좋다.
T8 포획 탐침 사용시, (비-특이적) 신호의 명확한 증가는 경쟁 야생형 표적 분자의 농도가 0.1 μM를 초과할때까지 나타나지 않는다. 이 농도에서 매칭 대 미스매칭 올리고의 비율은 1:20이다. 매칭 및 미스매칭 올리고로부터의 동일한기여(예를 들어 2 배의 신호 증가)를 경쟁 올리고의 어떠한 양에서도 얻을 수 없다. 따라서 동일한 신호는 1:60 보다 높은 매칭 대 미스매칭 올리고의 비율에서 얻어질 것으로 추정된다. 환언하면, 1:60 보다 높은 신호 대 잡음 비율이 관찰된다.
혼성화 엄격도는 시트르산 나트륨 또는 인산염에 기초한 완충액에서 거의 동일하다. 그러나, 시트르산 나트륨에 기초한 완충액에서 더 높은 혼성화 신호를 얻었다.
구아니딘 티오시아네이트(GnSCN)와 같은 강력한 카오트로픽제를 함유하는 완충액에서의 혼성화를 단일-염기를 구별하기에 충분히 높은 엄격도에서 수행할 수 있고 시트르산 나트륨 또는 인산염에 기초한 완충액을 사용할 수 있는 것으로 결론내려졌다.
실시예 5
구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 완충액에서 DNA 및 LNA 올리고뉴클레오타이드의 열안정성
모든-DNA 및 LNA 변형 올리고뉴클레오타이드의 열안정성을 열조절되는 펠티어(Peltier) 부품(Perkin Elmer, UV 람다 40)이 장착된 분광분석기를 사용하여 분광분석적으로 결정하였다. 1 ㎖의 혼성화 혼합물을 2 개의 상이한 완충액(pH 6.8의 50 mM Na-PO4, 0.1 mM EDTA; 또는 pH 6.8의 Na-PO4, 115 mM NaCl, 0.1 mM EDTA중의 4 M GnHCl)의 하나 및 동몰량(1 μM)의 LNA 변형 올리고뉴클레오타이드 및 그들의 상보적이거나 미스매치된 DNA 올리고뉴클레오타이드를 함유하여 제조하였다.비변형된 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 동일한 혼성화 혼합물을 참조로서 제조하였다.
각각의 샘플을 가열 블록에서 90 ℃로 에펜도르프 튜브에서 가열하고 꺼진 가열 블록내에서 실온으로 서서히 냉각되도록 하였다. 샘플을 500 ㎕ 석영 큐벳(Perkin Elmer)내로 옮겼다. 그후 샘플을 UV 람다 40 분광분석측정기상에서 측정하였다. 온도를 분당 1 ℃ 상승시키면서 샘플을 260 nm 에서 측정하였다. Tm'을 용융 곡선의 제1 파생물로서 얻었다. 표 5-2는 그 결과를 요약한다. 표 5-1은 사용된 올리고를 요약한다.
표 5-1
주:LNA 모노머는 대문자로 나타내었다. DNA 모노머는 소문자로 나타내었다. Cmet는 모노머가 5-메틸사이토신 LNA임을 나타낸다.
결과:
표 5-2는 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 완충액중의 DNA 및 LNA 올리고뉴클레오타이드의 열안정성을 나타낸다.
표 5-2
주:ΔTm은 완전한 매칭 LNA:DNA 헤테로2중쇄와 해당 2중쇄간의 Tm의 차이를 나타낸다.
결론:
실험으로부터 높은 농도의 강력한 카오트로픽제를 함유하는 완충액에서 혼성화가 일어나는 것으로 결론내려진다.
단일 미스매치가 표적 DNA 올리고뉴클레오타이드내로 도입될때, LNA:DNA 헤테로2중쇄의 Tm은 상당히 저하된다. 그 결과는 Tm변화가 표준 완충액과 비교하여 완충액을 함유하는 구아니딘에서 더 현저한 것으로 나타나, 강력한 카오트로픽제를 함유하는 혼성화 완충액이 혼성화에 의한 단일 염기 구별을 위해 우수할 수 있음을 암시한다.
실시예 6
PCR 생성물의 LNA 포획 올리고에 대한 혼성화에 의한 단일 염기 다형성의 검출
복합적인 생물학적 샘플에서 특정 서열을 검출할 수 있는지를 시험하는 제1 단계로서, 하기 실험을 수행하였다.
PCR의 생성물은 합성 50'mer 주형을 첨가하는 것보다 상당히 더 복합적이고, 이것은 혼성화 과정을 공격할 수 있다. 카오트로픽 완충액에서 혼성화가 충분히 구별할 수 있고 민감한지 시험하기 위하여, PCR 반응을 야생형 또는 돌연변이형 ApoB3500을 함유하는 다양한 주형상에서 수행하고 LNA 혼성화 분석에서 시험하였다. 분석은 포획 탐침으로 작용하는 5'안트라퀴논 고정화된 LNA 변형 올리고(표 6-1 참조) 및 상보적인 표적 DNA 올리고로서의 PCR 생성물로 구성된다. 하이브리드를 PCR 생성물의 바이오티닐화 말단에 스트랩타비딘-호스 래디쉬 퍼옥시다제를 결합시킨후 OPD 분석을 수행함으로써 검출하였다.
표 6-1: 적용된 올리고뉴클레오타이드
주:LNA 모노머는 대문자로 나타내었다. DNA 모노머는 소문자로 나타내었다. Cmet는 모노머가 5-메틸사이토신 LNA임을 나타낸다. 5'-AQ는 올리고가 5' 안트라퀴논(AQ) 및 C3 링커를 운반하고, 조성이 AQ-CONH-(CH2)3-올리고임을 나타낸다. 5'-바이오틴은 올리고의 5' 말단이 바이오틴-(CH2)4-CONH-(CH2)6-올리고임을 나타낸다.
표 6-2: PCR 주형
주의:이들 총 DNA 또는 플라스미드 제제상에 적용된 전향 및 후향 프라이머사용시 예상된 PCR 증폭 단편의 길이는 167 bp이고 센스 가닥상에 5' 바이오티닐화된다.
프라이머의 합성 및 분석:
DNA 프라이머를 상업적 출처(DNA Technology, 아아르후스, 덴마크)로부터 HPLC 정제된 올리고로서 얻었다.
샘플 제조
1) 인간 게놈 DNA:
인간 게놈 DNA를 ApoB3500 다형성(Ludwig 등 (1987) DNA 6: 363-372; accession no. M19828)에 관하여 야생형인 3 개의 상이한 인간 암 세포주: HCV29, T112C1, T112D1(Skouv 등(1989) Mol Carcin. 2, 59-62)로부터 표준 페놀 추출(Sambrook 등(1989) Molecular Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)에 의해 분리하였다.
2) "A-대립형질"-플라스미드:
인간 게놈 DNA를 포유동물 혈액을 위한 DNA 분리 키트(Roche Molecular Systems cat. no. 1 667 327, Roche Molecular Biochemicals, 흐비도브르, 덴마크)를 이용하고 제조자의 권고에 근사하게 따르면서 5 ㎖의 전체 혈액으로부터 분리하였다.
ApoB 유전자의 "A-대립형질"을 ApoB3500 위치를 포함하는 야생형 인간 ApoB 유전자의 일부의 PCR-증폭에 의해 생성시켰다. PCR 단편을 플라스미드 pCR™2.1-TOPO로 TOPO™TA 클로닝™ 키트(Invitrogen, cat. no. K4500-01, Invitrogen Corporation, 칼스바드, CA, USA)를 사용하여 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 세균 배양물로부터 QUIGEN™ 플라스미드 키트(QIAGEN GmbH, 힐덴, 독일)을 사용하여 정제하였다. 관심이 있는 DNA 서열을 ALFexpress Ⅱ DNA 분석 시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하고 제조자의 권고에 근사하게 따라 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.
샘플 제제에 대한 PCR:
6 개의 반응을 위한 PCR 주-혼합물:
148.50 ㎕ H2O
30 ㎕ 10×AmpliTaq 골드 완충액(Perkin-Elmer Corporation, 노르왁, CT, USA)
18 ㎕ MgCl2(25 mM)
30 ㎕ dNTP(2 mM)
30 ㎕ 전향 프라이머 EQ3198(서열번호 17)(10 μM)
30 ㎕ 후향 프라이머 EQ3213(서열번호 3)(10 μM)
1.5 ㎕ AmpliTaq 골드™ DNA 중합효소(5 U/㎕)(Perkin-Elmer cat. no. N808-0240, Perkin-Elmer Corporation, 노르왁, CT, USA).
PCR 증폭:
PCR 반응을 에펜도르프 마스터-사이클러 그래디언트 써모사이클러(Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, 함부르크, 독일)를 사용하여 0.5 ㎖ 얇은 벽 튜브에서 수행하였다. 48 ㎕ 주-혼합물에 2 ㎕의 샘플을 첨가하였다.
써모사이클링:
변성: 94 ℃, 15 분
증폭(30 사이클): 94 ℃, 40 초; 56 ℃, 40 초; 72 ℃, 40 초
연장: 72 ℃, 10 분
종결: 4 ℃, ∞.
검출:
이어서 PCR 생성물을 겔에서 1:30,000으로 희석된 겔-스타™(FMC BioPorducts, 록랜드, ME, USA) 및 1×트리스-아세테이트/EDTA 전기영동 완충액(0.04 M 트리스-아세테이트; 0.001 M EDTA)를 포함하는 2% 아가로스 겔(LE, 분석 등급; Promega Corporation, 매디슨, USA)상에서 표준 겔 전기영동에 의해 분석하였다. 각각의 PCR 반응물 5 ㎕에 1 ㎕의 6×로딩 완충액(40% 수크로스, 0.25% 브로모페놀 블루, 0.25% 크실렌 시아놀, 0.1 M EDTA pH 8.0)을 첨가하였다. 겔을 7 V/㎝의 일정한 전압에서 약 1 시간동안 전개시켰다.
영구적인 기록을 위하여 겔을 적절한 UV-투영기(모델 TM-20E UV 제품, 업랜드, CA, USA) 및 필터(Kodak Wratten #9 Eastman Kodak Co., 로체스터, NY, USA)를 사용하여 표준 폴라로이드(Polaroid LTD., St. 알반스, CA, USA) 사진기로 촬영하였다.
ApoB 포획 탐침의 고정화:
안트라퀴논 LNA 포획 탐침(C8 또는 T8-표 6-1 참조)을 0.2 M NaCl에 0.1 μM의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕의 올리고를 마이크로타이터-플레이트(C96 polysorp; Nalge Nunc International, 로스킬드, 덴마크)의 각각의 웰에 첨가하고, 15 분동안 ULS-20-2 조명장치(UV-Lights Systems, 덴마크)에 최대 온도 35 ℃에서 약한 UV광(약 350 nm)에 노출시켰다. 조명장치에 28 개의 Philips Cleo Compact 25W-S 광 전구를 장착하고(14 개는 유리 플레이트 샘플 홀더 상부에 위치하고 14 개는 그 하부에 위치함); 상부 전구만 켰다.
인큐베이션후 웰을 먼저 0.25% 트윈 20(Riedel-de Haen, 실즈, 독일)을 갖는300 ㎕의 0.4 M NaOH로 세척한후 300 ㎕의 탈이온수로 3 회 세척하였다.
PCR 반응물과의 혼성화:
고정된 C8 또는 T8 포획 탐침을 갖는 챔버에 95 ㎕의 2 M GnSCN 시트르산 나트륨 완충액과 함께 5 ㎕의 PCR 생성물을 첨가하고 반 시간동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다.
혼성화 완충액은 0.5% 사르코실을 갖는 pH 7의 40 mM 시트르산 나트륨 완충액중의 2 M GnSCN이었다.
혼성화후 웰을 0.1% 트윈 20을 갖는 300 ㎕의 1×SSC(1×SSC는 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 나트륨이다)로 5 회 세척하였다.
스트랩타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제를 바이오티닐화 PCR 생성물에 결합시켜 하이브리드를 검출하였다. strA-HRP(Pierce, 록포드, IL, USA. Cat. no. 21126)를 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC에 1 ㎍/㎖의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕를 웰당 첨가하고 15 분동안 인큐베이션하였다. 그후 플레이트를 1×SSC; 0.1% 트윈 20으로 3 회 세척하고 OPD-분석에서 신호를 발현시켰다.
OPD-분석
6 ㎖의 0.1 M 시트레이트 완충액 pH=5.0, 2 개의 2 mg 오르소-페닐렌-디아민(OPD) 정제(Kem-En-Tech, 코펜하겐, 텐마크) 및 2.5 ㎕의 30% H2O2를 함유하는 주-혼합물을 제조하였다. 100 ㎕의 주-혼합물을 각각의 반응 챔버에 가하고 효소 활성에 따라 1 내지 30 분동안 인큐베이션하였다. 분석을 100 ㎕의 0.5 M H2SO4로 중지시키고 광학 밀도를 ELISA-판독기로 λ=492에서 측정하였다.
결과:
그 결과를 도 6-1에 나타내었다.
결론:
모든 4 개의 PCR 반응물에서 2 M GnSCN에서의 혼성화에 의해 단일 염기 차이를 검출할 수 있다. 상기 실시예에서도 알 수 있는 바와 같이 "A-대립형질" 포획 탐침(T8)에 대한 신호는 C8 LNA 포획 탐침으로 얻은 신호보다 낮지만, 신호는 이 경우에도 매우 분명하여, 2 M GnSCN중에서의 혼성화가 매우 엄격함을 나타낸다.
실시예 7
세균 세포 용균물에서 플라스미드 DNA의 검출
본 발명의 혼성화 및 추출방법이 핵산과 비-핵산의 복합적인 생물학적 혼합물에 대해 적용할 수 있는지 연구하기 위하여, 하기 실험을 수행하였다.
간략하게는, 3 개의 상이한 세균 균주(E. coliK12)(2 개는 플라스미드를 함유하고 1 개의 균주는 플라스미드가 없음)(표 7-1 참조)를 배양하고 용균시키며 플라스미드를 구아디닌 티오시아네이트(GnSCN) 함유 완충액에서의 혼성화에 의해 검출하였다.
표 7-1: 세균 균주
ApoBwt 플라스미드의 클로닝:
인간 게놈 DNA를 포유동물 혈액용 DNA 분리 키트(Roche Molecular Systems cat. no. 1 667 327, Roche Molecular Biochemicals, 흐비도브르, 덴마크)를 이용하고 제조자의 권고에 근사하게 따르면서 5 ㎖의 전체 혈액으로부터 분리하였다.
ApoB 유전자의 "G-대립형질"을 ApoB3500 위치를 포함하는 야생형 인간 ApoB 유전자의 일부의 PCR-증폭에 의해 생성시켰다(Ludwig 등 (1987) DNA 6: 363-372; accession no. M19828, 서열번호 1 및 서열번호 2). PCR 단편을 플라스미드 pCR™2.1-TOPO로 TOPO™TA 클로닝™ 키트(Invitrogen, cat. no. K4500-01, Invitrogen Corporation, Carlsbad, USA)를 사용하여 클로닝하였다. 플라스미드 DNA를 세균 배양물로부터 QUIGEN™ 플라스미드 키트(QIAGEN GmbH, 힐덴, 독일)을 사용하여 정제하였다. 관심이 있는 DNA 서열을 ALFexpress Ⅱ DNA 분석시스템(Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하고 제조자의 권고에 근사하게 따라 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 생성된 플라스미드를 pApoBwt라 명명하였다.
TOP10/pCR 균주는 ApoB 삽입체를 갖지 않는 pCR™2.1-TOPO 플라스미드를 함유한다.
세균 세포 용균물의 제조:
세균을 진탕 장치상에서 37 ℃에서 밤새 100 ㎍/㎖ 앰피실린을 갖는 LB 배지(Sambrook 등 (1989) Molecular Cloning, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, NY)에서 증식시켰다.
다음날 세포를 원심분리한후(15 분, 8000 r/분) 1/50 부피의 50 mM 트리스-Cl(pH 8)에 재현탁하였다. 그후 세포를 얼음상에서 45 초동안 초음파처리하거나 2.5 ㎖의 재현탁된 세포당 0.250 ㎖의 100 ㎎/㎖ 라이소자임을 첨가하고 실온에서 15 분동안 인큐베이션하였다. 그후 용균된 세포를 -20 ℃에서 유지시켰다.
검출:
5'안트라퀴논을 갖는 LNA 변형 올리고(표 7-2 참조)를 UV 조사에 의해 마이크로타이터-플레이트의 웰에 공유적으로 고정하고 상보적인 표적 DNA 올리고와의 혼성화 분석에서 포획 탐침으로서 사용하였다. 혼성화후 혼합물에 5' 바이오티닐화된 DNA 검출 탐침을 포함시켜 하이브리드를 검출하였다.
표 7-2: 연구된 올리고뉴클레오타이드
주:LNA 모노머는 대문자로 나타내었다. DNA 모노머는 소문자로 나타내었다. Cmet는 모노머가 5-메틸사이토신 LNA임을 나타낸다. 5'-AQ는 올리고가 5' 안트라퀴논(AQ) 및 C3 링커를 운반하고, 조성이 AQ-CONH-(CH2)3-올리고임을 나타낸다. 5'-바이오틴은 올리고의 5' 말단이 바이오틴-(CH2)4-CONH-(CH2)6-올리고임을 나타낸다.
ApoB 포획 탐침의 고정화:
안트라퀴논 LNA 포획 탐침(C11 또는 T11-표 7-1 참조)을 0.2 M NaCl에 0.1 μM의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕의 올리고를 마이크로타이터-플레이트(C96 polysorp; Nalge Nunc International, 로스킬드, 덴마크)의 각각의 웰에 첨가하고, 15 분동안 ULS-20-2 조명장치(UV-Lights Systems, 덴마크)에 최대 35 ℃에서 약한 UV광(약 350 nm)에 노출시켰다. 조명장치에 28 개의 Philips Cleo Compact 25W-S 광 전구를 장착하고(14 개는 유리 플레이트 샘플 홀더 상부에 위치하고 14 개는 그하부에 위치함); 상부 전구만 켰다.
인큐베이션후 웰을 먼저 0.25% 트윈 20(Riedel-de Haen, 실즈, 독일)을 갖는 300 ㎕의 0.4 M NaOH로 세척한후 300 ㎕의 탈이온수로 3 회 세척하였다.
혼성화:
50 ㎕의 세균 세포 용균물을 50 ㎕(4 M GnSCN, 25 mM 시트르산 나트륨, pH 7, 0.5% 사르코실)와 혼합하고 C8 또는 T8 LNA 포획 탐침으로 코팅된 마이크로타이터-플레이트 웰에 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
그후 웰을 0.1% 트윈 20을 갖는 300 ㎕의 1×SSC(1×SSC는 150 mM NaCl, 15 mM 시트르산 나트륨이다)로 5 회 세척하였다. 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC중의 0.12 μM 검출 탐침(EQ-3246, 서열번호 8) 100 ㎕를 가하고 37 ℃에서 밤새 혼성화한후, 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC로 3 회 세척하였다.
하이브리드를 스트랩타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다제를 바이오티닐화 검출 탐침에 결합시켜 검출하였다. strA-HRP(Pierce, 록포드, IL, USA. Cat. no. 21126)를 0.1% 트윈 20을 갖는 1×SSC에 1 ㎍/㎖의 농도로 용해시켰다. 100 ㎕를 웰당 첨가하고 15 분동안 인큐베이션하였다. 그후 플레이트를 1×SSC; 0.1% 트윈 20으로 3 회 세척하고 OPD-분석에서 신호를 발현시켰다.
OPD-분석:
6 ㎖의 0.1 M 시트레이트 완충액 pH=5.0, 2 개의 2 mg 오르소-페닐렌-디아민(OPD) 정제(Kem-En-Tech, 코펜하겐, 덴마크) 및 2.5 ㎕의 30% H2O2를 함유하는 주-혼합물을 제조하였다. 100 ㎕의 주-혼합물을 각각의 반응 챔버에 가하고 효소 활성에 따라 1 내지 30 분동안 인큐베이션하였다. 분석을 100 ㎕의 0.5 M H2SO4로 중지시키고 광학 밀도를 ELISA-판독기로 λ=492에서 측정하였다.
결과:
그 결과를 도 7-1에 나타내었다.
결론:
그 결과로부터 pApoBwt 플라스미드를 초음파 처리 및 라이소자임 처리에 의해 용균된 세균에서 포획하고 검출할 수 있는 것으로 결론내려진다. 플라스미드는 2본쇄의 슈퍼코일 DNA 분자이므로, 이 실험은 조 세균 용균물과 같은 복합적인 생물학적 샘플중의 2본쇄의 슈퍼코일 DNA 분자를 검출할 수 있음을 나타낸다.

Claims (49)

  1. a) 핵산을 함유하는 샘플을 제공하고,
    b) 샘플을 카오트로픽제(chaotropic agent)를 함유하는 용균 완충액으로 처리하여 샘플중의 세포성 물질을 용균시키고, 성분을 용해시키며 샘플중의 핵산을 변성시키고,
    c) 샘플로부터 방출된 핵산을 표적(target) 핵산과 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 포획(capturing) LNA-탐침과 접촉시키는 것을 포함하여 표적 핵산을 분리하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 포획 LNA-탐침이 리간드에 공유결합된 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 포획 LNA-탐침이 고체 표면에 공유결합된 것인 방법.
  4. 제2항에 있어서, LNA-탐침이 공유결합된 리간드가 고체 표면에 공유결합된 항-리간드에 커플링된 것인 방법.
  5. 제3항 또는 제4항에 있어서, 샘플로부터 방출된 핵산을 고체 표면에 결합된 LNA와 접촉시킨후, 고체 표면을 과량의 물질로부터 분리하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 고체 표면을 완충액으로 세척하여 과량의 물질을 제거하는 방법.
  7. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침이 표적 핵산에 상보적인 방법.
  8. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침의 길이가 4 내지 50 뉴클레오타이드인 방법.
  9. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침의 길이가 8 내지 30 뉴클레오타이드인 방법.
  10. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침의 길이가 8 내지 20 뉴클레오타이드인 방법.
  11. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침의 길이가 8 내지 15 뉴클레오타이드인 방법.
  12. 전항중 어느 한 항에 있어서, 1 개를 초과하는 포획 LNA-탐침을 사용하고 포획 탐침이 상이한 표적 핵산 또는 동일한 핵산의 상이한 부위에 대한 상이한 LNA-올리고머로 구성된 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상이한 포획 탐침을 고체 표면상에 어레이(array) 형식으로 스팟팅(spot)하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 어레이가 적어도 10 개의 포획 탐침을 갖는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 어레이가 적어도 100 개의 포획 탐침을 갖는 방법.
  16. 제13항에 있어서, 어레이가 적어도 1,000 개의 포획 탐침을 갖는 방법.
  17. 제13항에 있어서, 어레이가 적어도 10,000 개의 포획 탐침을 갖는 방법.
  18. 전항중 어느 한 항에 있어서, 핵산이 세포, 조직 샘플 또는 조직 추출물로부터 기원하는 것인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 세포가, 원시(archae), 원핵, 진핵 기원의 것인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 샘플이 용균 완충액중에 균질화된, 혈액, 혈청, 혈장, 망상적혈구, 림프구, 뇨, 골수 조직, 뇌척수액 또는 혈액이나 림프로부터 제조된 어느 생성물, 근육 생검, 간 생검, 신장 생검, 방광 생검, 골 생검, 연골 생검, 피부생검, 췌장 생검, 장관 생검, 흉선 생검, 유방 생검, 자궁 생검, 고환 생검, 안구 생검 또는 뇌 생검으로부터 유래된 것인 방법.
  21. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침(들)이 특정한 종의 유기체에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 핵산(들)에 대한 LNA-올리고머(들)로 구성된 것인 방법.
  22. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침(들)이 특정한 종, 아종 또는 품종의 유기체에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 핵산(들)에 대한 LNA-올리고머(들)로 구성된 것인 방법.
  23. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침(들)이 특정한 종의 미생물에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 핵산(들)에 대한 LNA-올리고머(들)로 구성된 것인 방법.
  24. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침(들)이 특정한 종, 아종 또는 균주의 미생물에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 핵산(들)에 대한 LNA-올리고머(들)로 구성된 것인 방법.
  25. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침(들)이 전염체에 대해 특이적인 하나이상의 표적 핵산(들)에 대한 LNA-올리고머(들)로 구성된 것인 방법.
  26. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침(들)이 특정한 종, 아종 또는 품종의 전염체에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 핵산(들)에 대한 LNA-올리고머(들)로 구성된 것인 방법.
  27. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침(들)이 유전 질환에 관여하는 단백질을 코딩하는 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 핵산(들)에 대한 LNA-올리고머(들)로 구성된 것인 방법.
  28. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침(들)이 라이프 스타일 질환과 관련된 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 핵산(들)에 대한 LNA-올리고머(들)로 구성된 것인 방법.
  29. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침(들)이 암 관련 유전자에 대해 특이적인 하나 이상의 표적 핵산(들)에 대한 LNA-올리고머(들)로 구성된 것인 방법.
  30. 제28항에 있어서, 라이프 스타일 질환이 죽상경화증 및 당뇨병으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  31. 전항중 어느 한 항에 있어서, 고체 표면이 유리, 카보하이드레이트 중합체 및 금속으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 전항중 어느 한 항에 있어서, 고체 표면이 마이크타이터-플레이트 웰의 벽인 방법.
  33. 전항중 어느 한 항에 있어서, 고체 표면이 비드 형태인 방법.
  34. 전항중 어느 한 항에 있어서, 고체 표면이 평평한 플레이트 형태인 방법.
  35. 전항중 어느 한 항에 있어서, 분리를 일 단계로 수행하는 방법.
  36. 제2항 및 제3항중 어느 한 항에 있어서, 리간드가 바이오틴인 방법.
  37. 전항중 어느 한 항에 있어서, 포획 탐침에 혼성화된 표적 핵산을 검출 탐침에 의해 검출하는 방법.
  38. 제37항에 있어서, 검출 탐침이 플루오로포어, 방사성 동위원소, 효소, 리간드 및 합텐 및 항원성 화합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 표지로 표지되는 방법.
  39. 제38항에 있어서, 플루오로포어가 플루오로세인, 로다민 및 텍사스 비드로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  40. 제38항에 있어서, 방사성 동위원소가32P,33P,35S,3H,125I 및14C로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  41. 제38항에 있어서, 효소가 호스래디쉬 퍼옥시다제, 알칼라인 포스파타제, 송아지 소장 알칼라인 포스파타제, 글루코스 옥시다제 및 베타-갈락토시다제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  42. 제38항에 있어서, 리간드가 바이오틴, 티록신 및 코티솔로 구성된 그룹으로부터 선택되는 방법.
  43. 제37항 내지 제42항중 어느 한 항에 있어서, 검출 탐침이 포획 탐침과 상이한 부위의 고정화된 표적 핵산에 혼성화하는 방법.
  44. 제37항 내지 제42항중 어느 한 항에 있어서, 검출 탐침이 적어도 하나의 LNA-모노머를 함유하는 방법.
  45. a) 핵산을 함유하는 샘플을 제공하고,
    b) 샘플을 카오트로픽제를 함유하는 용균 완충액으로 처리하여 샘플중의 세포성 물질을 용균시키고, 성분을 용해시키며 샘플중의 핵산을 변성시키고,
    c) 샘플로부터 방출된 핵산을 표적 핵산과 실질적으로 상보적인, 고체 표면에 공유결합된 적어도 하나의 포획 LNA-탐침과 접촉시키며,
    d) 고체 표면을 과량의 물질로부터 분리하고,
    e) 포획된 핵산을 적당량의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제와 배합하며,
    f) 포획 LNA-탐침을 주형으로 사용하여, 포획된 핵산에 혼성화하는 어느 올리고뉴클레오타이드를 연장시켜 연장 생성물을 형성하고,
    g) 형성된 연장 생성물을 검출하는 단계를 포함하여, 포획 탐침에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  46. a) 핵산을 함유하는 샘플을 제공하고,
    b) 샘플을 카오트로픽제를 함유하는 용균 완충액으로 처리하여 샘플중의 세포성 물질을 용균시키고, 성분을 용해시키며 샘플중의 핵산을 변성시키고,
    c) 샘플로부터 방출된 핵산을 표적 핵산과 실질적으로 상보적인, 고체 표면에 공유결합된 적어도 하나의 포획 LNA-탐침과 접촉시키며,
    d) 고체 표면을 과량의 물질로부터 분리하고,
    e) 포획된 핵산을 적당량의 뉴클레오사이드 트리포스페이트 및 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제와 배합하며,
    f) 포획 LNA-탐침을 주형으로 사용하여, 포획된 핵산에 혼성화하는 어느 올리고뉴클레오타이드를 연장시켜 연장 생성물을 형성하고,
    g) 적당량의 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 뉴클레오타이드 트리포스페이트 중합제의 존재하에, 단계 c)로부터의 1본쇄 핵산을 적어도 하나의 하류 프라이머와 혼성화하여 추가의 연장 생성물을 합성하는 단계를 포함하여, 포획 탐침에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  47. a) 핵산을 함유하는 샘플을 제공하고,
    b) 샘플을 카오트로픽제를 함유하는 용균 완충액으로 처리하여 샘플중의 세포성 물질을 용균시키고, 성분을 용해시키며 샘플중의 핵산을 변성시키고,
    c) 샘플로부터 방출된 핵산을 표적 핵산과 실질적으로 상보적인, 고체 표면에 공유결합된 적어도 하나의 포획 LNA-탐침과 접촉시키며,
    d) 고체 표면을 과량의 물질로부터 분리하고,
    e) 포획된 핵산을 적당량의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제 및 적어도 하나의 하류 프라이머와 배합하며,
    f) 주형으로 사용되는 포획된 핵산에 혼성화하는 어느 올리고뉴클레오타이드를 연장시켜 연장 생성물을 형성하고,
    g) 형성된 연장 생성물을 검출하는 단계를 포함하여, 포획 탐침에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  48. a) 핵산을 함유하는 샘플을 제공하고,
    b) 샘플을 카오트로픽제를 함유하는 용균 완충액으로 처리하여 샘플중의 세포성 물질을 용균시키고, 성분을 용해시키며 샘플중의 핵산을 변성시키고,
    c) 샘플로부터 방출된 핵산을 표적 핵산과 실질적으로 상보적인, 고체 표면에 공유결합된 적어도 하나의 포획 LNA-탐침과 접촉시키며,
    d) 고체 표면을 과량의 물질로부터 분리하고,
    e) 포획된 핵산을 적당량의 뉴클레오사이드 트리포스페이트, 뉴클레오사이드 트리포스페이트 중합제 및 적어도 하나의 하류 프라이머와 배합하며,
    f) 주형으로 사용되는 포획된 핵산에 혼성화하는 어느 올리고뉴클레오타이드를 연장시켜 연장 생성물을 형성하고,
    g) 적당량의 뉴클레오사이드 트리포스페이트와 뉴클레오타이드 트리포스페이트 중합제의 존재하에, 단계 c)로부터의 1본쇄 핵산을 적어도 하나의 하류 프라이머와 혼성화하여 추가의 연장 생성물을 합성하며,
    h) 충분한 횟수로 단계 g) 내지 h)를 반복하여 검출가능한 양의 연장 생성물을 생성하고,
    i) 형성된 연장 생성물을 검출하는 단계를 포함하여, 포획 탐침에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 갖는 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  49. a) 샘플중의 세포성 물질을 용균시키기 위한 카오트로픽제를 함유하는 용균완충액,
    b) 표적 핵산에 실질적으로 상보적인 적어도 하나의 포획 LNA-탐침을 포함하는 표적 핵산 분리용 키트.
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Patent event date: 20010915

Patent event code: PA01051R01D

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