KR20020007366A

KR20020007366A - 면역글로불린과 그의 고친화성 수용체와의 결합을억제하는 항체에 대한 항-이디오타입 항체

Info

Publication number: KR20020007366A
Application number: KR1020017013103A
Authority: KR
Inventors: 프란츠 크리첵; 베다 스타들러; 모니크 포겔
Original assignee: 한스 루돌프 하우스, 헨리테 브룬너, 베아트리체 귄터; 노파르티스 아게
Priority date: 1999-04-14
Filing date: 2000-04-12
Publication date: 2002-01-26
Anticipated expiration: 2020-04-12
Also published as: SK14592001A3; HUP0200713A2; MXPA01010348A; IL145507A0; NO20014936D0; CA2363991C; CO5241329A1; ES2302693T3; HK1044544A1; HK1044544B; JP2002544125A; US20020141989A1; CN1268644C; AR029624A1; BR0009781A; EP1169353A1; GB9908533D0; AU767712B2; US7041288B2; EP1169353B1

Abstract

IgE의 CεE 영역과 그의 고친화성 수용체의 결합을 방해하는 항체에 대해 항-이디오타입이고, 특히 BSW17에 대해 항-이디오타입인 항체 및 항체 단편(미모바디)과 약제, IgE-매개 질환의 치료에 특히 백신으로의 그의 용도에 관해 기재한다.

Description

면역글로불린과 그의 고친화성 수용체와의 결합을 억제하는 항체에 대한 항-이디오타입 항체 {Anti-Idiotypic Antibodies Against Antibodies Which Inhibit the Binding of Immunoglobuline to Its High Affinity Receptor}

고친화성 수용체(FcεRI)와 상호작용하는 IgE상의 특이적 결합 부위를 알아내는 것은 결합-에피토프를 인식함으로써 이러한 상호작용을 막는 항체를 생산하는데 있어서의 기초를 제공한다. 백신 접종으로 이와 같은 항체를 유도하여 알레르기에 대한 신규하고 일반적으로 적용할 수 있는 치료법을 제공할 수 있다. 본 발명은 IgE-매개 알레르기 반응의 유도를 막는 항-IgE 항체를 생산하기 위한 백신으로 제제화할 수 있는, 특히 재조합 항체 단편의 동정과 생산을 기술한다.

알레르기 증상은 혈관작용 아민(매개체), 특히 히스타민이 세포에서 주위 조직과 혈관구조로 방출되어 유도된다. 히스타민은 일반적으로 비만세포와 호염기성 과립구로서 알려진 특정 세포에 저장되어있다. 비만세포는 동물조직 전체에 분포되어 있는 반면, 호염기성 세포는 혈관계내를 순환한다. 이들 세포는 특별한 일련의 사건이 일어나 히스타민 방출을 유발시키지 않는 한, 세포내에서 히스타민을 합성하여 저장한다.

알레르기 반응을 조절하는 IgE 항체의 역할은 이미 잘 알려져 있다. IgE는 다른 면역글로불린과 같이, 디술파이드 상호작용에 의해 "Y"자 형태로 서로 결합되어 있는 2개의 경쇄와 2개의 중쇄로 구성된 복잡한 배열의 폴리펩티드 시슬이다. 각각의 경쇄는 2개의 도메인을 가지며, 하나의 가변 도메인(V_L)이 불변 도메인(C_L)으로 명명되는 비교적 변화하지 않는 아미노산 서열을 갖는 하나의 도메인과 연결되어 있다. 이에 비교하여, 중쇄는 하나의 가변성 도메인(V_H)과, IgE의 경우 C_H1, C_H2, C_H3, C_H4(Cε1, Cε2, Cε3, Cε4로도 알려짐)인 4개의 불변성 도메인을 가진다. 항체의 2개의 "암(arm)"은 항원 결합에 관여하고, 폴리펩티드 구조가 다양한 영역을 가지며, 디술파이드 결합으로 서로 연결된 2개의 Fab'암으로 표시되는 Fab'단편 또는 F(ab')₂으로 명명된다. 항체의 "테일(tail)" 또는 중심축은 펩티드의 일정한 또는 불변적 서열을 가지며 Fc 단편으로 명명된다. Fc 단편은 항체가 다른 면역계 분자 또는 세포의 Fc 수용체상에 결합함으로서 그들과 교신할 수 있는 능력을 부여하는 상호작용 부위를 가지고 있다. Fc 수용체는 면역글로불린 Fc영역내의활성분자 부위에 특이적으로 결합하는 분자이다. Fc 수용체는 세포의 외부 원형질막 내에 막통합 단백질로서 존재할 수 있거나, 혈액 또는 다른 체액내에서 자유롭게 순환하는 유리 "가용성" 분자로서 존재할 수 있다. 인간 시스템에서, IgE의 FcεRI로의 고친화성 결합은 IgE의 세 번째 중쇄 불변성 영역 도메인(Cε3)의 다양한 부분과 FcεRIα서브유닛의 막-인접 면역글로불린-유사 도메인(α2)을 포함하는 복잡한 단백질-단백질 상호작용으로 이루어진다. 결합에 중요한 Fcε의 Cε3 도메인 내의 잔기와 FcεRIα의 α2 도메인에 속하는 영역이 밝혀졌지만, 결합 과정의 상세한 메카니즘은 아직도 더 특성화되어야 한다. 실험적 증거에 의하면 인간 IgE는 FcεRI(Kd10^-10M)에 대한 IgE의 고친화성을 제공한다고 추측되는 굽은 구조를 가지고 있다. 더욱이, IgE 분자는 두 개의 Cε3 도메인상에 수용체 결합을 위한 동일한 에피토프를 제공할 것이지만, 이 굽은 구조는 IgE와 세포-결합 또는 가용성 FcεRIα 가 동일한 몰수로 결합하는 것에 관여하는 것으로 추측된다. 이와 같은 모노밸런시는 알레르기 항원의 부재시에 수용체 작용개시가 회피되어야 하는 경우에는 기능상 필수적이다.

상호작용 부위는 그의 기능에 따라 이미 노출되어 세포 수용체에 결합할 수 있다. 이와는 달리, 항체가 항원에 결합하여 항체의 구조가 변하고 이어서 특정 면역 활성을 유도할 수 있는 다른 활성 부위가 노출될 때까지, 상호작용 부위는 감추어져 있을 수 있다. 수용체 결합시에 Cε3 도메인에 영향을 주는 구조의 재배열은 세포 표면상에서 Fcε/FcεRI 결합체가 화학량론적으로 1:1로 되는 것에 대한설명이 될 수 있을 것이다.

유기체내의 비만세포와 호염기성 세포로부터 매개체의 알레르기(면역)적 방출은 단지 다음의 환경하에 일어날 수 있다: IgE 분자는 세포의 Fc 수용체 부위 상 고착하거나 그 자신의 Fc 부분으로 부착하여 IgE 분자를 비만세포 또는 호염기성 세포에 고정시키고, 세포-결합된 IgE 분자의 Fab' 부분이 특정 항원(알레르기 항원)에 가교결합되어야 한다. 이와 같은 상호작용이 일어나는 경우, 비만세포 또는 호염기성 세포는 자동적으로 작용개시되어 국소 환경에 히스타민을 방출시켜 통상적인 알레르기 증상을 나타낸다(도 1). 다른 생화학적 사건이 후기 단계에서 일어나고, 결과적으로 사이토카인과 다른 매개자의 새로운 합성과 방출을 일으킨다.

알레르기 치료에 대한 통상적인 방법은 항-히스타민제를 사용한 전신적인 치료와 환자의 민감성을 완화하는 방법을 포함하며, 이들 연구는 기초적인 IgE-비만세포/호염기성 세포 상호작용에 근거하는 것은 아니다. 또 다른 연구는 세포 표면상의 Fc 수용체에 IgE 항체가 결합하는 것을 차단하고, IgE가 이미 결합된 경우에는 상호작용 부위로부터 IgE를 치환할 수 있는 폴리펩티드 사슬의 생산에 관한 것으로, 히스타민 방출을 위해 비만세포 및(또는) 호염기성 세포를 자극개시하는 면역 신호를 제공하는 것으로 추측되는 IgE Fc 영역 내의 추정되는 "이펙터" 부위의 성질을 조사하였다.

재조합 IgE 단편을 보호 항-IgE 백신의 생산을 위한 면역원으로서 사용하는 것이 시도되었으며 또한 효과가 있는 것으로 나타났다. 그러한 백신에 대한 주된 단점은 면역을 위해 많은 양의 IgE 단편을 사용하면 환자내에서 억제성 항체의 생산이 개시될 뿐만 아니라 가교결합을 일으켜 아나필락시유발성 항체를 생산한다는 가능성에서 발생한다.

이 문제를 극복하기 위한 방법은, 이상적으로는 수용체 상호작용 결합 부위만으로 구성되고, 결합 부위는 결합 후에는 IgE/IgERI 결합체내에 파묻혀서 더 이상 백신-유도된 면역 반응에 의한 가교결합에 대한 여지가 없는 가능한 가장 작은 IgE 단편의 동정을 목적으로 한다.

본 발명은 항-이디오타입 항체에 관한 것이다. 본 발명은 정상적으로는 알레르기 항원에 결합된 세포-결합 면역글로불린 E(IgE)에 의해 유도되는 비만세포와 호염기성 세포의 작용개시를 유발하여 결과적으로 히스타민과 다른 매개체를 방출 하고 알레르기와 염증 반응의 조절과 관련된 사이토카인을 데 노보 합성하는 상호작용을 억제하는 것에 관한 것이다. 본 발명은 IgE의 Cε3영역이 IgE에 대한 고친화성 수용체에 결합하는 것을 방해하는 항-이디오타입 항체 또는 항체 단편에 관한 것이다.

도 1: IgE와 그의 고친화성 수용체 사이의 결합.

도 2: 모노클로날 항-hIgE 항체 BSW17의 특성.

도 3: 항-이디오타입 네트워크.

BSW17에의해 인식되는 hIgE 에피토프와 항-이디오타입 파라토프를 검은 점으로 표시하여 도식화 하였다. 검은 원은 항-이디오타입 항체 Ab2로 면역화하여 유도한 항체 BSW17(Ab1)과 폴리클로날 항체 3(Ab3)의 상동성의 초가변성 영역을 나타낸다.

도 4: 3개의 재조합 BSW17 미모바디의 구조.

A: 항-이디오타입-BSW17, 클론 52(SDS426); 경쇄: (L.C.)₂(서열 36)

B: 항-이디오타입-BSW17, 클론 52(SDS427); Fab: F_AB(서열 35 및 36)

C: 항-이디오타입-BSW17, 클론 43(SDS463); Fab: F_AB(서열 37 및 38)

도 5: 항-BSW17 Fab 클론: 박테리오파지 디스플레이한 인간 면역글로불린의 DNA 서열과 계통의 아미노산 서열.

초가변성 영역 (상보성 결정 영역; CDR)은 이탤릭체이다.

도 5a: 클론 52; 가변성 중쇄 (서열 1 및 2) (CDR1: 서열 39 및 40; CDR2: 서열 41 및 42; CDR3: 서열 43 및 44).

도 5b: 클론 52; 가변성 경쇄 (서열 3 및 4) (CDR1: 서열 45 및 46; CDR2:서열 47 및 48; CDR3: 서열 49 및 50).

도 5c: 클론 43; 가변성 중쇄 (서열 5 및 6) (CDR1: 서열 51 및 52; CDR2: 서열 53 및 54; CDR3: 서열 55 및 56).

도 5d: 클론 43; 가변성 경쇄 (서열 7 및 8) (CDR1: 서열 57 및 58; CDR2: 서열 59 및 60; CDR3: 서열 61 및 62).

도 6: 항-BSW17 rFab와 인간 IgE의 Cε3 도메인 사이의 아미노산 서열 상동성.

A: 각각, 항-이디오타입 Fab, 클론 52, 중쇄(hIGE, Cε3: 서열 25; 클론 52: 서열 26),

항-이디오타입 Fab, 클론 52, 경쇄, 정렬1(hIGE, Cε3: 서열 27; 클론 52: 서열 28),

항-이디오타입 Fab, 클론 52, 경쇄, 정렬2(hIGE, Cε3: 서열 29; 클론 52: 서열 30).

B: 각각, 항-이디오타입 Fab, 클론 43, 중쇄(hIGE, Cε3: 서열 31; 클론 43: 서열 32),

항-이디오타입 Fab, 클론 43, 경쇄(hIGE, Cε3: 서열 33; 클론 43: 서열 34).

아미노산 서열 정렬: 동일한 잔기는 검은 박스로 나타내고, 유사한 아미노산은 회색 박스로 나타낸다(림프만 및 퍼르슨). Fcε 잔기의 위치는 각각의 정렬의 상단에 나타낸다. 재조합 Fab 단편의 초가변성(CDR) 및 프레임워크 영역의 제공하는 부위는 각 서열 쌍 하단에 나타낸다.

도 7: IgE-프라이밍 CHOα세포 상의 항-이디오타입 BSW17 rFab와 FITC-표지 BSW17의 경쟁적 결합.

도 8: 인간 IgE에 대한 친화성-정제 토끼 항-BSW17 미모바디 면역글로불린의 결합.

샌드위치-ELISA에 의한 hIgE/항-미모바디 결합체의 결정: hIgE와 면역친화성-정제 항-BSW17 미모바디 제제를 등가몰의 농도로 혼합하고 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 배양 혼합물을 포착성 항체인 모노클로날 항-hIgE 항체 LE27(1㎍/ml)로 코팅한 마이크로역가 플레이트 웰에 가하였다. 결합한 미모바디 IgG를 염소 항-토끼 IgG-HRP로 검출하였다.

□= hIgE/SDS410 결합체,

o = hIgE/SDS411 결합체.

도 9: Balb/c 마우스 내에서의 항-BSW17 미모바디 면역 반응.

■= 마우스1; ●= 마우스2; ▼=마우스3; ▲= 마우스4; ◆= 마우스5

A: 항-이디오타입-BSW17.52; 경쇄(SDS426),

B: 항-이디오타입-BSW17.52; Fab(SDS427),

C: 항-이디오타입-BSW17.43; Fab(SDS463),

O.D. 값은 광학밀도 데이터를 나타내고, 코팅되지 않은 웰에 결합하는 배경값으로 보정한다. 두 번 측정한 값의 평균으로 나타낸다. 편차는 일반적으로 O.D. 0.05 미만이었다.

도 10: 면역친화성-정제 항-미모바디 항체에 의한 HIgE/FcεRIα 결합의 저해성.

A: ■= BSW17

●= 항-클론 52; 경쇄(SDS410)

△= 항-클론52; Fab(SDS411)

▼= 항-클론52; (칼럼을 통과한) 경쇄

B: ■= BSW17

●= 항-클론 43 Fab(SDS476)

도 11: 다양한 미모바디 제제로 면역화한 리서스 원숭이 군(n=2)의 PCA 점수 프로필.

A: 면역원: 항-이디오타입-BSW17.52; 경쇄(SDS426),

B: 면역원: 항-이디오타입-BSW17.52; Fab(SDS427),

C: 면역원: 항-이디오타입-BSW17.43; Fab(SDS463).

면역화후, 다양한 시간대에서 리서스 원숭이 피부에서 수동성 피부 아나필락시스(PCA) 반응. PCA 점수 값은 주사한 IgE(JW8) 농도에 대한 청색 피부 점의 직경으로 그래프를 그려서 만들어진 곡선 밑의 면적을 계산하여 나온 PCA 세기를 나타낸다. 점수는 표 4에 나타낸 단일 원숭이 값으로부터 계산한, 동일한 미모바디 제제로 면역화한 2마리 원숭이의 각각의 그룹에 대한 평균 수치이다. 편차는 오차 막대기로서 나타낸다. 통계 p 값은 오차 막대기 상단에 나타낸다. 부스터 주사의 시간대는 x-축 하단에 나타낸다.

도 12: 3개의 재조합 BSW17-미모바디의 중쇄와 경쇄에 대한 완전한 아미노산 서열.

도 12a: 항-이디오타입-BSW17, 클론52: 중쇄의 가변성 및 첫 번째 불변성 도메인(서열35),

도 12b: 항-이디오타입-BSW17, 클론52: 카파 경쇄의 가변성 및 불변성 도메인(서열36),

도 12c: 항-이디오타입-BSW17, 클론43: 중쇄의 가변성 및 첫 번째 불변성 도메인(서열37),

도 12d: 항-이디오타입-BSW17, 클론43: 람다 경쇄의 가변성 및 불변성 도메인(서열38).

미모바디(L.C.)₂클론52는 도 4A에 나타낸 것과 같이 디술파이드 가교로 결합한 도12b의 경쇄(서열 36)를 포함한다.

미모바디 Fab 클론 52는 도 4B에 나타낸 것과 같이 디술파이드 가교로 결합한 도12b의 경쇄(서열 36)와 도 12a의 중쇄(서열 35)를 포함한다.

미모바디 Fab 클론 43은 도 4C에 나타낸 것과 같이 디술파이드 가교로 결합한 도12d의 경쇄(서열 38)와 도 12c의 중쇄(서열 37)를 포함한다.

"전통적인" 백신 연구에 본질적으로 관계된 문제는 활성 면역화를 위한 짧은 미모토프 펩티드를 적절한 캐리어에 결합된 화학적 합성 펩티드 또는 예를 들어 오발부민 또는 IgG와의 재조합 융합 구조물로서 사용하여 극복할 수 있다. 이와 같은 펩티드는 일부는 Cε3내에 존재하고 다른 일부는 Cε4내에 존재하는 Fcε상의 에피토프 구조를 인식하는 모노클로날 항체 BSW17에 의해 인식되는 에피토프의 구조적 유사체이다. BSW17를 생산하는 하이브리도마 세포주는 미생물 기탁에 관한 부다페스트 조약의 규정하에 ECACC에 1996년 12월 19일자로 기탁번호 96121916으로 기탁하였다. 이 항체는 도 2에 요약한 것과 같은 흥미로운 생물학적 활성 프로필을 보인다. 이 펩티드는 그 자체로 비-아나필락시유발성이고, 개시제에 의해 유도되는 IgE-의존성 히스타민 방출로부터 인간 비만세포와 호염기성 세포를 보호한다. 혈관계 내에서 순환하는 BSW17 또는 BSW17-유사 항체는 a) IgE/IgERI 상호작용의 경쟁적 억제를 통해 비만세포와 호염기성 세포의 작용개시를 억제하고, b) B 세포 단계에서 IgE 합성의 하향조절을 통해 혈청중 IgE의 양을 감소시켜 알레르기 반응으로부터 보호한다. 항-IgE 항체 에피토프의 구조적 유사체로서, 화학적으로 합성된 BSW17 미모토프 펩티드는 숙주내에서 면역 반응을 유도하여 BSW17-유사 항체를 생산한다. BSW17은 비-아나필락시유발성이고, IgE/IgERI 결합과 B 세포에서 IgE 합성을 억제하는 것으로 알려져 있기 때문에, BSW17 미모토프 펩티드에 대하여 유발된 항체를 기재로 하는 백신은 유사한 보호 특성을 가지고 있다. 이와 같은 BSW17 미모토프 펩티드-기재 백신의 가능한 단점은 펩티드의 면역원성을 증가시키기위해 캐리어 단백질에 화학적 합성 펩티드를 연결해야 할 필요가 있다는 것이다. 또한, 짧은 펩티드의 구조적 유연성에 기인하여 펩티드가 다른 많은 입체적 구조를 띨 수 있다는 것이다. 따라서, 폴리클로날 항-미모토프 면역 반응의 단지 일부만이 인간 IgE와 가교반응하여 치료적으로 유효할 것이다.

본 발명은 미모토프 펩티드 연구에 고유한 단점을 회피한 것이다. 본 발명은 고친화성 수용체에 대한 IgE의 결합을 방해하는 항체에 대한 항-이디오타입 항체 또는 항체 단편, 특히 BSW17에 대한 재조합 항-이디오타입 항체에 기초한다. 제른의 네트워크 이론[Jerne N., Ann. Immunol. 125C (1974)373 참조]에 따라, 항체(Ab1)의 초가변성 영역은 그 자신이 항원으로서 작용할 수 있다. 이와 같은 방식으로 생산되는 항체는 이 항체가 첫 번째 항체의 이디오타입 영역에 결합하기 때문에 항-이디오타입(anti-id) 항체(Ab2)로 알려져있다(도 3). 이와 같은 항-이디오타입 항체는 첫 번째 항체(Ab1)의 결합 부위(파라토프)를 향하고 있으므로 본래의 항원의 "내부 이미지"를 나타낸다. 따라서, 내부 이미지 항체 또는 Ab2β로 명명되는 항-이디오타입 항체(Ab2)는 그의 초가변성 영역을 통해 항체 형성을 유도할수 있다. 그 항-항-이디오타입 항체(Ab3)는 Ab1의 파라토프와 구조적으로 유사하므로, Ab1 항체와 같은 유사한 생물학적 특성을 가진다. hIgE/BSW17 시스템의 경우에, IgE는 원래의 항원을 나타내고 BSW17은 항체 Ab1을 나타내다. 따라서, 항-BSW17 이디오타입 항체 Ab2의 파라토프는 BSW17에 의해 인식되는 hIgE 영역(에피토프)과 구조적으로 유사함을 나타낸다.

구조적으로, Ab2 파라토프는 상기 언급한 화학적 합성 BSW17 미모토프 펩티드에 상응한다. 이와 같은 (재조합) 항-BSW17 이디오타입 항체를 백신으로 사용하면 BSW17-유사 면역 반응(Ab3)이 백신주사한 환자에서 유도될 것이다. BSW17과 같이, 이 (폴리클로날) Ab3 면역글로불린은 IgE와 그의 고친화성 수용체 사이의 결합을 방해할 것이므로 항-알레르기제로 작용할 것이다. 유연성이 있는 합성 미모토프 펩티드와 비교하여, Ab2 파라토프는 구조적으로 정의된 구조로 환경에 제공될 것이다. 따라서, 정의된 hIgE 에피토프에 대한 면역 반응은 더 특이적일 것이다. 또한, 이종의 면역원성 캐리어 단백질은 필요하지 않을 것이다. 따라서, 파상풍균 독소 또는 디프테리아 독소와 같은 캐리어 단백질에 의해 유발되는 가능한 부작용이 방지될 수 있을 것이다.

본 발명은 E25(olizumab) 또는 CGP56901과 같은 항체 또는 바람직하게는 IgE의 Cε3영역이 그의 고친화성 수용체에 결합하는 것을 방해하는 BSW17 항체에 대해 항-이디오타입인 항체 또는 항체 단편을 포함한다. 이를 이하 "본 발명의 미모바디"로 간단히 칭한다. 이들이 BSW17에 대해 항-이디오타입인 경우 "BSW17-미모바디"로 간단히 칭한다.

따라서, 본 발명의 미모바디는 IgE에 대한 고친화성 수용체(FcεRI)에 결합하는 IgE 분자의 Cε3영역상의 부위를 인식하는 항-IgE 항체의 파라토프인 에피토프에 특이적으로 결합하는 항-이디오타입항체 또는 항체 단편이다.

본 발명의 미모바디는 인체에 사용하는 것이 목적인 한 기본적으로 인간 유래의 것이다. 또한 재조합형인 것이 바람직하다. 본 발명의 미모바디는 모노클론인 것이 바람직하다.

본 발명의 미모바디는 바람직하게는,

도 4 또는 서열 35, 36, 37 및 38에 정의된 바와 같은, 바람직하게는 불변성 영역 구성 서열을 갖는 중쇄와 경쇄 모두(예를 들면, Fab 단편), 또는 단일 중쇄 또는 경쇄(예를 들면, 경쇄 이합체)(이의 "불변성 영역"은 알로타입 변이체에서 발견되는 것과 같은 1 내지 5개, 일반적으로 단지 1개의 아미노산의 유의적이지 않은 입체 변형을 포함할 수 있는 것으로 이해됨);

도 5a 내지 5d 또는 서열 2, 4, 6 및 8에 정의된 바와 같은, 상기 중쇄 및(또는) 경쇄의 부분, 특히 적어도 특이성-결정 부위;

도 5a, 5b, 5c 또는 5d, 또는 서열 2, 4, 6 및 8에 정의된 바와 같은, 임의로는 한쪽 또는 양쪽의 CDR 말단의 약 10개의 아미노산의 보조 프레임워크 서열을 갖는, 예를 들면 1개 , 바람직하게는 2개, 더 바람직하게는 3개의 CDR을 포함하는 아미노산 서열로 이루어진 펩티드와 같은, 상기 중쇄 및(또는) 경쇄의 소분분, 특히 적어도 초가변성 소부분

으로 구성되거나 이를 포함하는 항체 단편이다.

본 발명의 미모바디는 자연발생 항-이디오타입 항-IgE 항체로부터 유도된, 단리되고 실질적으로 순수한 항체 또는 항체 단편을 말한다. 특히, 이들은 실질적으로 다른 항체가 없다. "실질적으로 순수한"이란 약 60 중량% 이상, 바람직하게는 약 90 중량% 이상, 더 바람직하게는 약 99 중량% 또는 그 이상의 순도를 말한다.

본 발명은 또한 경우에 따라 보조제 및 추가의 통상적 부형제와 함께, 본 발명의 미모바디를 단일 분자 또는 면역원성 캐리어 분자에 화학적으로 결합된 단백질 결합체로서 포함하는 제약 조성물, 특히 백신에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 약제, 특히 IgE-매개 질환의 치료에, 특히 백신으로서 사용하는 것에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 파지 디스플레이 기술과 같은 통상적인 방법을 사용하여 본 발명의 미모바디의 동정을 위해, IgE에 대한 고친화성 수용체에 IgE의 Cε3영역의 결합을 억제하는, BSW17-유사 항체의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 IgE-매개 질환의 치료 또는 백신주사의 필요가 있는 환자에게 본 발명의 미모바디를 치료 유효량으로 투여하는 것을 포함하는, 특히 백신으로 IgE-매개 질환의 투여하는 치료 방법에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 IgE-매개 질환에 대한 약제, 특히 백신의 제조에서 본 발명의 미모바디의 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 수동 면역을 위해 본 발명의 미모바디에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 유발시키기위한 미모바디의 용도; 인간 이외의 적절한 동물에 본 발명의 미모바디를 투여하고 그에 대하여 생산된 항체를 단리하여 정제하거나 통상적인 하이브리도마 기술에 의한, 수동 면역을 위한 본 발명의 미모바디에 대한 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체의 제조; 및 수동 면역으로 IgE-매개 질환의 치료에서 본 발명의 미모바디로부터 수득한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 자연발생한 항-이디오타입 항-IgE 항체의 동정, 그 단편을 단리하고 IgE에 대한 고친화성 수용체에 IgE의 Cε3영역의 결합을 방해하는, BSW17과 같은 적절한 항-IgE 모노클로날 항체에 결합시켜 그의 재조합 단편을 선별하는 것을 포함하는 미모바디의 동정 방법에 관한 것이다.

일단 동정하고 특성화하면, 본 발명의 미모바디는 재조합 DNA 기술 또는 화학적 합성과 같은 통상적인 방법으로 제조할 수 있다.

상기 언급한 미모토프 펩티드(즉, IgE 상의 선택된 에피토프)와 동일한 특이성을 보이는 항-이디오타입 항체의 동정을 위해, 인간 항체 레퍼터리의 Fab 부위를 발현하는 박테리오파지 디스플레이 라이브러리를 사용할 수 있다. 이 라이브러리를 예를 들면 인간의 편도선에서 수득한 B 세포의 풀로부터 제조하고, 바이오패닝을 위해 표적으로 사용되는 BSW17 항체를 고정화한다. BSW17을 특이적으로 인식하는 인간 Fab-발현 파지 입자를 단리하고 집적한다. 따라서, 이 재조합 Fab 단편은 본 발명의 미모바디이고, BSW17의 초가변성 영역에 대해 항-이디오타입을 나타낸다. 백신으로 사용하는 경우, 백신은 알레르기 환자내에서 BSW17-유사 항체의 생산을 유발하는 면역 반응을 유도한다. BSW17은 아나필락시유발성이 아니고 B 세포에서 IgE/IgERI 결합과 IgE 합성을 억제하기 때문에, BSW17 항-이디오타입 Fab 백신에 대하여 환자내에서 유도되는 폴리클로날 항체는 유사한 특성을 가진다. 면역 반응은 매우 특이적이고 안전이고, 이는 "전통적인 백신 연구"에 비하여 면역화된 환자내에서 가교결합하는 항체를 생산할 수 있는 IgE-유도 단백질이 없고 캐리어가 없는 조성물이 고려될 수 있기 때문이다.

이 BSW17-미모바디는 인간 면역글로불린 G로부터 유도된 가변성 도메인(V-도메인)과 불변성(C-도메인)으로 구성한 재조합 항체 또는 항체 단편이다. 2개의 다른 클론(클론 52와 43)의 표면에 다른 미모바디 단편을 나타내는 이 클론은 고정화된 BSW17 항체 상에 항체 파지 라이브러리의 바이오패닝으로 동정하였다. 미모바디 구조는 V-도메인의 초가변성 영역(CDR)과 보조 프레임워크 영역(FR)내의 인간 IgE 잔기 상의 BSW17 에피토프와 유사하다. cDNA와 클론 52와 클론 43의 중쇄와 경쇄의 V-도메인의 아미노산 서열은 도 5a 내지 5d(서열 1 내지 8)에 있다. 클론 52 경쇄 제조물(L.C.)₂은 이합체인 "Fab-유사" 경쇄 단편으로 구성한다. 이 BSW17-미모바디의 전체 구조는 도 4A 내지 4C에, 그의 불변성 영역 부위는 또한 상기 언급한 것과 같이 알로타입 변이체에서 발견되는 것과 같은 유의적이지 않은 입체 변형을 포함되어야만 하는 것으로서, 도식적으로 나타낸다. 그 클론의 각각 완전한 중쇄와 경쇄의 아미노산 서열은 도 12a 내지 12d(서열 35 내지 38)에 나타낸다.

본 발명의 미모바디는 약제학적 활성을 가진다. 따라서, 그 미모바디는 예를 들면 백신에 대한 항원과 같이 약제로서의 용도를 나타낸다. 그 미모바디는 실질적으로 비-세포용해 히스타민 유리를 매개하는 것을 보이는 반면, IgE의 Fc 영역의 표적 아미노산 서열과 강한 혈청학적 가교-반응성을 가진 항체를 유도할 수 있다.

본 발명의 미모바디의 초기 투여량은 예를 들면 약 0.05mg 내지 약 5mg, 바람직하게는 약 1mg이다. 예를 들면 코로, 피하로 또는 근육내로 주사할 것이고, 이어서, 14 내지 28일 후 동일한 투여량으로 재주사(부스터)한다. 사용하는 투여량은 환자의 나이, 체중 및 일반적인 건강상태에 따라 일부 변화하고 적절하게 조절할 수 있다.

본 발명의 미모바디로, 능동 면역화라고 명명한, 직접적인 백신주사는 바람직하게는 통상적인 방법으로 예를 들면 박테리아, 진균류 또는 진핵 세포와 같은 다양한 숙주 발현 시스템에서 생산한 재조합 펩티드(Fab 단편, 경쇄 또는 중쇄)를 사용하여 실행할 것이다.

재조합 미모바디의 투여가 바람직하다. 하지만, 추가로 면역원성 캐리어에 화학적으로 연결하여 면역항원의 면역항원성을 또한 증가시킬수 있다. 여기서의 용어 "면역원성 캐리어 물질"은 숙주 동물 내에서 면역원 반응을 독립적으로 유도하는 특성을 가지고, 펩티드의 형성 또는 폴리펩티드에서 유리 카르복실, 아미노 또는 히드록실기와 면역원성 캐리어 물질 상에 상응하는 기 사이에 에스테르 결합을 통해 폴리펩티드에 직접적으로 공유결합 할 수 있거나, 또는 통상적인 이관능성 결합에의해 공유결합할 수 있는 그의 물질을 포함한다. 이와 같은 캐리어의 예는 예를 들면 문헌[J. Immuno. 111(1973)260-268, J. Immuno. 133(1979)302-308, J.Immuno. 98(1967)893-900 및 Am. J. Physiol. 199(1960)575-578]에 기재된 것과 같이, 동물 혈청의 알부민, 동물 혈청의 글로불린, 동물의 티로글로불린, 동물의 헤모글로불린, 동물의 헤모시아닌[특히 키홀 림페트 헤모시아닌(KLH)], 회충 추출물과 같은 회충에서 추출한 단백질, 또는 폴리라이신, 폴리글루탐산, 라이신-글루탐산, 코폴리머, 라이신 또는 오르니틴을 함유한 코폴리머 등의 그의 정제한 생성물을 포함한다. 최근, 백신은 CRM197과 같은 디프테리아 독소 또는 면역원성 캐리어 물질과 같은 파상풍균 독소를 사용하여 생산하고 있고[Lepow. M. L., et al., J. Infectious Diseases 150(1984)402-406, 및 Coen Beuvery, E. et al., Infection and Immunity 40(1983)39-45 참조] 그 독소 물질은 또한 여기서도 사용할 수 있다. 화학적으로 무독성화한 디프테리아 독소와 비교하여, 재조합 돌연변이 디프테리아 독소 CRM197를 사용하는 것이 바람직하다. CRM197 글라이신-52 잔기를 글루탐산으로 치환한 결과, 비독성 생성물이 된다. CRM197은 비-독성 캐리어 단백질로 잘 특성화되어있고 인증된 인간 백신으로 사용한다. 투베르쿨린의 정제한 단백질 유도체(PPD)는 (1) 자기자신의 T-세포 반응을 유도하지 못하고(즉, 사실상 "T-세포 헵텐"임), (2) 연결된 인식 형태에서 가장 강력한 헵텐 "캐리어" 중의 하나로 알려지고 (3) 추가의 시험없이 인간에 사용할 수 있는 것과 같이, 이미 완전히 공정한 항원으로 작용하고 T-세포에 의해 인식된다.

항원의 제조에서 사용되는 통상적인 헵텐-캐리어 결합제와 같은 것을 사용할 수 있다. 면역원성 캐리어 물질과 본 발명의 미모바디의 공유결합은 통상적인 방법으로 실행할 수 있다. 예를 들면, 직접적인 공유결합을 위해 연결제로서 비스-N-숙시니미딜 유도체, 가장 바람직하게는 비스(술포숙시니미딜)수버레이트, 또는 글루타르알데히드 또는 카르보디이미드, 가장 바람직하게는 (디시클로헥실)카르보디이미드 또는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)카르보디이미드의 사용이 가능하다.

헵텐, 헵텐-캐리어 결합제 및 캐리어의 비는 적절하게 결정할 수 있지만 캐리어가 헵텐 중량의 약 1 내지 약 6 배, 바람직하게는 약 1 내지 5 배의 양이고, 헵텐-캐리어 결합제는 헵텐의 등가몰의 약 5 내지 10 배의 양이다. 상기 연결 반응에의해, 캐리어는 헵텐-캐리어 결합제를 통해 헵텐에 결합하여 본 발명의 미모토프와 캐리어와의 펩티드-캐리어 복합체로 구성된 목적하는 항원이 수득된다.

반응을 완전히 끝낸 후, 결과로 생성된 면역원을 투석, 겔 여과 또는 분별침전과 같은 통상적인 방법으로 단리하고 정제한다.

본 발명은 본질적으로 직접적인 백신주사에 의한 능동 면역화에 관한 것이다. 하지만, 또한 수동 면역으로도 고려된다. 이와 같은 상황에서, 본 발명의 미모바디는 인간 이외의 적절한 동물에 투여하고 그에 대하여 생산되는 항체를 단리하고 정제하여 알레르기 증상의 완화를 유도하기 위해 인간에게 주사한다.

본 발명의 미모바디는 예를 들면 천식, 아토피성 피부염, 호산구증가증의 알레르기 형태, 비염, 만성 두드러기 및 음식 알레르기의 알레르기와 같은, 특히 IgE-매개 질환의 치료에서 약제, 특히 백신으로서의 용도를 나타낸다.

"치료"는 예방법과 치료법을 포함하는 것을 말한다. 숙주는 바람직하게는 인간이지만 본 발명은 예를 들면, 고양이 또는 개와 같은, 본질적으로 임의의 포유류에 필요한 변경을 가하여 적용할 수 있다.

하기의 실시예는 본 발명을 설명하지만 제한하지는 않는다.

온도는 섭씨이다. 사용하는 약자는 다음과 같다.

anti-id =항-이디오타입

ABTS =[2,2'-아지노디(3-에틸-벤즈티아조린)술포네이트]

BSA =소 혈청 알부민

BSW17 =마우스 모노클로날 항-인간-IgE 항체; Cε3 특이성

CDR =상보성 결정 영역

Cε3 =IgE의 세 번째 중쇄 불변성 영역 도메인

Cε4 =IgE의 네 번째 중쇄 불변성 영역 도메인

CεE =BSW17의 Cε3 에피토프 영역과 유사한 미모토프 펩티드

CεM =BSW17의 Cε4 에피토프 영역과 유사한 미모토프 펩티드

cfu =콜로니-형성 단위

ELISA =효소 연결 면역흡착체 분석

Fab =중쇄 불변성 영역 2와 3이 결여된 항체 단편

FcεRI; IgERI =IgE에 대한 고친화성 수용체

FcεRIα =IgE에 대한 고친화성 수용체, α사슬

FCS =송아지 태아 혈청

FR =프레임워크 영역

FITC =형광성 이소티오시아네이트-접합

HRP =양고추냉이 과산화효소

HSA =인간 혈청 알부민

(h)IgE =(인간)면역글로불린 E

mAb =모노클로날 항체

MNC =단핵 세포

NIP =3-니트로-4-히드록시-이오도페닐 아세트산

p.c. =폴리클로날

Phab =파지 디스플레이 Fab 단편(박테리오파지에서 발현하는 Fab)

PBS =포스페이트-버퍼 세일린

PCA =수동성 피부 아나필락시스

PWM =미국자리공 마이토젠

r =재조합

RT =실온

SPR =표면 플라스몬 반응

실시예 1 : 파지 디스플레이 라이브러리의 제조.

a) 림프구의 출처

말초혈액으로부터 단핵 세포(MNC)를 제조하기위해 두 명의 남자 성인 기증자가 이용되었다. 만성 알레르기 증상을 가진 첫 번째 남자 성인 아토피 기증자를 알룸-흡수 파상풍균 독소 0.5ml을 근육내 주사로 부스터하였다(Te Anatoxal Bern, Swiss Serum and Vaccine Institute, Bern, Switzerland). MNC는 7일 후, 피콜 구배 원심분리기(Lymphoprep, Pharmacia, Milwaukee, WI, USA)를 사용하여 단리하고 IL-2 10³U/ml(Sigma, St-Louis, MO, USA), 판소르빈 세포 50㎍/ml(Staphylococus aureus Cowan strain1, Calbiochem, La Jolla, CA, USA) 및 RPMI-1640 배지(Seromed, Basel, Switzerland)에 1:1000으로 희석된 파상풍균 독소가 함유된 RPMI-1640 배지에서 3일간 배양하였다. 전체 RNA를 이 세포로부터 페놀-클로로포름 구아니듐 이소티오시아네이트 방법[Chomczynsi, P. and Sacci, N., Anal.Biochem. 162(1987)156]을 사용하여 추출한다. 과민면역 리서스 D 기증자인, 두 번째 남자 성인 기증자를 혈액형 O RhD+군으로 알려진 남자 기증자로부터의 농축적혈구 세포 2ml로 정맥주사를 통해 부스터하였다. MNC를 부스터한 날에서 18일후, 피콜 구배 원심분리기로 단리하였다. 세포를 IL-2 10³U/ml 및 미국자리공 마이토젠 10㎍(PWM; Sigma L9379, Buchs, Switzerland)이 함유된 RPMI-1640 배지에서 3일간 배양한 후, RNA를 추출하였다.

인간 편도 샘플을 세 명의 편도적출한 아이로부터 수득하였다. 편도를 살균한 페트리 접시 내의 RPMI-1640 배지에서 침연하고 매우 작은 조각으로 잘랐다. 조직, 세포 및 배지를 살균한 튜브로 옮기고 조직 파편을 안정화하여 MNC를 피콜 구배 원심분리기를 사용하여 상청액에서 단리하였다. B 세포를 CD19-코팅 상자성체의 비드로 MNC를 배양하여 선별하고 이어서 RNA를 상기 언급한 페놀-클로로포름 구아니듐 이소티오시아네이트 방법에 따라 추출하였다.

모든 미모바디의 DNA를 클로닝하기 위해 사용한 pComb3 벡터[CA, USA; Barbas III, C.F. and Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2(1991)119]는 스크리프스 연구소(Scripps Research Institue La Jolla)로부터 획득하였다. pCom3 벡터와 VCSM13 헬퍼 파지의 형질전환을 위해 대장균주 XL1-Blue를 스트라타사이트(Stratacyte; La Jolla, CA, USA)로부터 구입하였다.

b) 박테리오파지 라이브러리의 제조

3개의 개별 라이브러리를 제조하였다. 첫 번째 남자 아토피 기증자로부터단리한 첫 번째 MNC를 BS로, 두 번째 남자 기증자로부터 정맥주사로 부스터한 날에서 18일 후에 수득한 두 번째의 MNC를 LD2로, 및 아이의 편도로부터 단리한 B-세포 과다 개체의 세 번째 MNC를 CT라고 명명한다. 전체 RNA를 이 세포로부터 페놀 클로로포름 구아니듐 이소티오시아네이트 방법으로 추출하였다. 이 RNA로부터의 10㎍을 올리고(dT)프라이머(400ng)로 cDNA를 제조하기 위해 사용하고, 공급자(Boehriger Mannheim, Germany)가 특성화한 조건에 따라 M-MuLV 역전사 효소로 역전사하였다. PCR 증폭을 보겔 등의 문헌[Vogel, M. et al., E.J. of Immunol. 24(1994)1200]에 기재한 것과 같이 실행하였다. 간단히 설명하면, PCR 반응 용액 100㎕는 10mM MgCl₂, 5㎕ cDNA, 적절한 각각의 5'와 3' 프라이머 150ng , 4종류 각각의 dNTP가 200μM로 및 2U/ml 택 폴리머라이즈(Perkin Elmer, NJ, USA)의 퍼킨-엘머 버퍼를 함유하였다. Fab 분자의 중쇄와 경쇄의 PCR 증폭은 스트라타사이트의 프라이머 세트로 개별적으로 실행하였다(하기에 상세히 설명). 중쇄에 있어, V_H유전자의 6개의 패밀리 각각에 혼성화하는데 6개의 상류 프라이머가 사용되고, 경쇄에 있어서는, 하나의 카파 및 하나의 람다 사슬 프라이머를 사용하였다. 중쇄에 대하여, 하류 프라이머는 불변성 도메인 γ1과 γ3의 힌지 영역에 대응하도록 설계되었다. 경쇄에 대하여, 하류 프라이머는 카파와 람다 불변성 도메인의 3'에 대응하도록 설계하였다. 중쇄와 경쇄 PCR 생성물을 개별적으로 모아서 겔-정제를 하고 XhoI/SpeI 과 SacI/XbaI 제한효소(Boeehriger Mannheim, Germany)로 각각 절단하였다. 절단후, PCR 생성물을 페놀:클로로포름:이소아밀 알콜로 한 번 추출하고 겔을 절단하여 정제하였다. XhoI/SpeI-절단 Fd 단편을 삽입하고 이어서 SacI/XbaI-절단 경쇄를 pComb3 벡터에 라이게이션하고, XL1-Blue 세포를 형질전환하여 파지를 문헌[Barbas III, C.F. 및 Lerner, R.A., Companion Methods Enzymol. 2(1991)119]에 기재된 것과 같이 생산하였다. XL1-Blue의 형질전환 후, 대장균 세포 샘플을 들어내어 라이브러리 사이즈 결정을 위해 플레이트상에 적정하였다. 이 결과는 BS, LD2 및 CT 각각에 대한 1×10⁷, 7.7×10⁶및 3×10⁶cfu(colony forming units)의 발현 라이브러리로 나타났다.

실시예 2 : 파지 라이브러리로부터 재조합 BSW17-특이성 항체 단편(BSW-17-미모바디)의 선별

BSW17-특이성 파지의 선별을 4회의 패닝으로 실시하였다. 각 회는 항-IgE mAb BSW17 상에 흡착 이전에 항-IgE mAb Le27 상에 두 번의 전-흡착을 포함하였다. 전-흡착은 다음과 같이 실행하였다. 2개의 면역튜브(Maxisorp, Nunc)를 Le27(20㎍/ml) 4ml로 4℃에서 밤새 코팅하고, PBS/2% 스킴 밀크 4ml로 37℃에서 2시간동안 블록킹을 하였다. 첫 번째 튜브를 각각의 파지 라이브러리(BS, LD2 및 CT)의 2×10¹²cfu를 함유한 블록킹 용액 4ml로 실온과 상하-회전 테이블 상에서 30분 동안 배양하였다. 파지를 두 번째 튜브로 옮긴후, 이 전 과정을 다시 한 번 실행하였다. 두 번째의 전-흡착 후, 비-Le27-특이성 파지를 BSW17(20㎍/ml) 4ml로 코팅하고 상기 언급한 PBS/2% 스킴 밀크로 블로킹하였다. 실온과 상하-회전 테이블에서 2시간의 배양후, 튜브를 연속적으로 PBS/0.1% 튜윈으로 10회, PBS로 10회 세척하였다. 점착성의 파지를 첫 번째 0.1M 트리에틸아민 500㎕로 용리하고, 이어서 PBS로 3번 세척한 후, 글라이신으로 pH2로 조절하고 BSA 1mg/ml을 함유한 0.1M HCl 500㎕로 연속적으로 용리하였다. 각 용리 단계는 실온에서 10분 동안 실행하고, 용리된 파지를 1M Tris.Cl(pH7.4) 250㎕과 2M Tris base 30㎕로 각각 중성화하였다. 선별한 파지를 문헌[Bawbas and Lerner, supra(1991)]에 기재된 것과 같이 대장균 XL1-Blue 세포를 사용하여 증폭하고, 이어서 추가의 패닝 3회에 사용하였다. 각 회의 패닝 후, 용리된 파지의 역가는 cfu 결정으로 측정하였다(표 2).

패닝의 연속적 횟수에 의한 BSW17 특이성 Phabs의 풍부함
패닝의 횟수^a)	용리된 파지의 갯수(cfu)
1	3×10⁵
2	2×10⁴
3	3×10⁵
4	5×10⁷
*^a)패닝의 각 회에 대한, 6×10¹²파지 입자를 Le27 20㎍/ml로 코팅한 튜브에서 두 번 전-흡착시키고 BSW17 20㎍/ml로 코팅한 1개의 튜브에서 배양하였다.

실시예 3 : 재조합 BSW17-미모바디의 뉴클레오티드 서열

선별된 파지 클론의 플라스미드를 뉴클레오트랩 키트(Machery-Nagel, Dueren, Germany)를 사용하여 제조하고 핵산 서열분석을 PRISM Ready Reaction DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems, Germany)를 사용하여 ABI 373A 서열분석 시스템에서 실행하였다.

중쇄 서열의 서열분석에 사용한 프라이머는 다음과 같다.

CHγ1 (5'-CGCTGTGCCCCCAGAGGT-3')(서열 20) 및

pCH (5'-GGCCGCAAATTCTATTTCAAGG-3')(서열 21).

경쇄 서열을 수득하기위해 다음의 프라이머를 사용하였다.

Cλ (5'-GAGACACACCAGTGTGGC-3')(서열 22),

Cκ (5'-CACAACAGAGGCAGTTCC-3')(서열 23) 및

pCL (5'-CTAAACTAGCTAGTCGCC-3')(서열 24).

프라이머는 마이크로시스(Microsynth; Balgach, Switzerland)로 합성하였다. 선별한 다양한 파지 클론의 DNA 서열 중에서, BSW17-특이성 재조합 항체 중쇄와 경쇄에 대하여 2개의 다른 아미노산 서열(클론 52와 클론 43)을 추정하였다. 그의 서열과 초가변성 영역(CDR)과 프레임워크 서열의 배치가 도 5a 내지 5d(서열 1 내지 8)에 나타낸다.

클론 52와 43의 BSW17-특이성 재조합 항체 단편의 아미노산 서열의 정렬은 인간 IgE와 함께 고친화성 수용체에 대한 결합과 관련된 인간 Cε3 도메인의 범위와 상동성을 보인다(도 6a 및 6b; 서열 25 내지 34). 따라서, 재조합 항체 단편의 파라토프는 인간 IgE("미모바디")의 정의된 구조의 유사하다. 따라서, 이 재조합 미모바디를 백신주사하여 알레르기 환자 내에서 생산되는 항체는 인간 IgE를 인식하고 IgE/IgERI 결합을 방해하여 알레르기 반응을 막을 것이다.

실시예 4 : 재조합 BSW17-미모바디의 제조와 정제

파지 클론 43과 52로부터 유도된 가용성 미모바디(도 5; 서열 1 내지8)를 생산하였다. 가용성 Fab 단편을 생산하기위해, 파지 입자의 pIII 테일 단백질을 코딩한 gIII 서열을 제거하고 Ni²⁺-킬레이트 친화성 크로마토그래피에 의한 Fab 단편의 정제를 용이하게 하기위해 헥사히스티딘 태그로 치환하였다.

파지미드 DNA를 뉴클레오트랩 키트(Macherey-Nagel, Dueren, Germany)를 사용하여 제조하고 SpeI과 NheI으로 절단하였다. gIII 부위가 결실된 4.7 kb DNA 단편을 알칼리 탈인산화효소로 처리하고 아가로즈 겔 전기영동으로 정제하였다. 직쇄화한 DNA를 SpeI과 NheI 제한 위치의 5'과 3' 각각에 DNA를 코딩하는 6개의 히스타민과 라이게이션하였다. 라이게이션 후, DNA를 대장균 XL1-Blue 세포에 형질전환하고 가용성 미모바디를 생산하는 각각의 클론을 선별하였다. 이 클론 중 하나를 대량규모의 정제를 위해 선발하고 37℃에서 카르베니실린 50㎍/ml을 함유한11SB(Super Broth)에서 OD₆₀₀1.0이 될 때까지배양하였다. 배양액을 1mM 이소프로필 β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG; Biofinex, Praroman, Switzerland)로 발현을 유도하고 37℃에서 4시간 동안 배양하였다. 박테리아를 4℃에서 20분 동안 6000rpm으로 펠렛화하고 초음파분해 버퍼(0.1M NaPO₄8M urea, pH8.0) 30ml에 재희석하여 얼음 상에서 초음파분해하였다. 비-가용성 구성분은 30분 동안 4℃와 15,6000rpm에서 원심분리하여 제거하고 Fab를 함유한 상청액을 니켈-니트릴로아세테이트 칼럼 1ml로 정제하였다. 이 칼럼을 초음파분해 버퍼로 세척하여 오염물질을 제거하고, pH5.1과 pH4.9의 초음파분해 버퍼로 각각 2회 용리하였다. 분획을 OD 280nm에서 모니터하고 분취량을 미모바디의 순도와 동일성을 확인하기위해 (12% 비환원)SDS-PAGE로 분석하였다. 미모바디를 함유한 분획을 모아서 농축하고 PBS로 투석을 하였다.

마지막 미모바디의 제제의 순도를 도 4와 12(서열 35, 36, 37 및 38)에서 기입한 것과 같이 SDS-PAGE로 샘플을 분석하여 평가하였다. 단백질 밴드는 코마시 블루 염색으로 검색하였다. 농도는 이미 알고 있는 양의 기준 단백질(BSA)과 미모바디를 코마시 블루 염색으로 비교하여 결정하였다. 이 미모바디 제제는 이어서 경쟁적 결합 분석과 토끼의 면역화에 사용하였다.

실시예 5 : 재조합 BSW17-미모바디에 의한 수용체-결합 IgE의 BSW17-매개 교환의 저해

BSW17은 IgE의 고친화성 수용체에 결합한 IgE를 인식하고 교환한다. 항-이디오타입 BSW17 rFab 단편이 이 교환을 저해할 수 있는지를 결정하기위해, 경쟁적 결합 분석을 IgERI가 노출된 세포 표면에 결합한 IgE를 사용하여 실행하였다. 인간 IgERI의 α-연쇄를 코딩한 DNA를 안정하게 트란스펙션한 재조합 차이니즈 햄스터 난소 세포주(CHO)를 분석하였다[CHOα 세포주; Blank, U. et al., Eur. J. Biol. Chem. 266 (1991) 2639]. 5x10⁴CHOα 세포를 함유한 시험 샘플의 시리즈를 IgE B11 하이브리도마[Zuercher, A.W. et al., Immunol. Lett. 46(1995)49-57] 48ng과 함께, FACS 버퍼(PBS, 0.3% BSA, 0.002% NaN₃)와 실온에서 15분 동안 배양하였다. FACS 버퍼로 한 번 세척한 후, 각각의 샘플을 실온에서 15분 동안 배양하며 형광 이소티오시아네이트-접합 BSW17(BSW17-FITC)과 결합체를 형성하게하고 항-이디오타입 BSW17 rFabs의 양을 증가시켰다. 결합체는 다음과 같이 제조하였다. 1.3nM BSW17-FITC 50㎕를 다른 양(40nM, 200nM, 1μM, 4μM 및 40μM)의 항-이디오타입-BSW17 rFabs과 함께 실온에서 30분 동안 배양하였다. 단지 CHOα 세포만을 함유한 컨트롤 샘플을 비-특이성 결합을 결정하기위해 BSW17-FITC와 함께 실온에서 15분 동안 배양하였다. CHOα 세포를 FACS 버퍼로 한 번 세척하고 FACS 버퍼 100μl를 가한 후, 세포를 488nm로 튜닝한 아르곤 레이져가 설치된 FACSCalibur(Becton Dickinson) 흐름 세포계산기로 분석하였다. 전방 분산기/측방 분산기 도트 블랏 내의 게이트를 단일 세포 주위에 셋팅하고 형광물질을 정량하여 평균 채널 형광(mcf)으로 표현하였다. 양성 세포의 퍼센트는 CHOα 세포에 결합하는 BSW17의 퍼센트로 계산되었다. 도 7에 나타난 것과 같이, CHOα 세포에 대한BSW17의 결합은 항-이디오타입-BSW17 Fab 단편의 농도를 증가시킬수록 감소하므로, 두 종의 항-이디오타입 BSW17 Fab 클론이 IgE에 대한 BSW17의 결합을 감소시킬 수 있음을 보여주었다.

실시예 6 : 재조합 BSW17 미모바디에 의한 토끼의 면역화

이 실시예는 (도 4B, 도12a 및 도 12b에 나타난 것과 같이 클론52의 중쇄와 경쇄로 구성한) anti-BSW17 rFab 또는 단지 경쇄(도 4A 및 도 12b; 서열 36)으로 구성한 재조합 미모바디는 토끼 내에서 인간 IgE와 가교반응하는 체액의 면역반응을 유도함을 보인다. 2마리의 뉴질랜드 백색 암컷 토끼를 항-BSW17 rFab 또는 클론 52의 경쇄 단편 300㎕/ml과 프로인즈 완전 보조제와 1:1로 유화한 것을 피하주사하여 첫 번째 면역화하고, 동일한 양의 미모바디와 프로인즈 불완전 보조제를 유화하여 2 주 마다 부스터를 3회 하였다. 혈청을 0일(전-채혈)에 채취하고 마지막 주사 7일 후, 채혈하였다.

토끼 면역 혈청을 면역친화성 크로마토그래피로 정제하였고 세파로즈 4B 칼럼에 화학적 가교결합한 인간 IgE(SUS-11 IgE)를 사용하였다. 이 방법으로 anti-hIgE 분획을 전체 면역글로불린에서 단리할 수 있으므로 항체 역가와 친화성에 관계한 약제학적으로 적절한 면역 반응을 정확히 특성화 할 수 있다.

항-미모바디 항체의 면역친화성 정제는 인간 IgE와 교차반응하고 두 단계로 구성하였다. 첫 번째 단계에서 IgG 분획을 토끼 항혈청에서 암모늄 술페이트 침전으로 단리하고, 두 번째 단계에서 hIgE-특이성 항-BSW17 미모바디 항체는 CH-세파로즈 4B에 공유결합한 인간 IgE(SUS-11 IgE)에 결합되어 있고, 용리하여 투석하고농축하였다.

인간 IgE로 용액에서 면역친화성-정제 면역글로불린의 농축에 따른 결합체 형성을 ELISA로 확인하였다. SUS-11 IgE를 등몰량의 항-미모바디 면역글로불린과 함께 밤새 4℃에서 배양하였다. 용액에서 형성한 결합체를 마이크로역가 플레이트 웰에 가하고 이 웰은 포착성 항체로 모노클로날 항-hIgE 항체 LE27로 코팅하였다. 결합한 항-미모바디 IgG는 폴리클로날 항-토끼 IgG-HRP로 검색하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

실시예 7: 재조합 BSW17 미모바디에 의한 마우스의 면역화

클론 43과 52 모두에 의해 유도된 재조합 미모바디는 항-미모바디 항체를 유도할 수 있다. 면역화를 마우스내에서 실행하였다. 5마리의 Balb/c 마우스의 그룹은 마우스 당 재조합 BSW17 미모바디 5㎍을 피하주사하였고 이 미모바디는 대장균 박테리아에서 생산하였고 니켈 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. 알루미늄 히드록시드는 다음과 같은 보조제로 사용되었다.

그룹 1은 배치 SDS426=항-이디오타입-BSW17.52; 경쇄로 면역화하였다.

그룹 2는 배치 SDS427=항-이디오타입-BSW17.52; Fab로 면역화하였다.

그룹 3은 배치 SDS463=항-이디오타입-BSW17.43; Fab로 면역화하였다.

첫 번째 면역화 21일과 41일 후에 두 번 부스터(마우스 당 5㎍)를 하였다. 혈액 샘플을 첫 번째 면역화 0, 20, 28, 35, 42, 49 및 56일 후에 채취하였다. 혈청을 제조하고 ELISA로 항-미모바디 항체의 존재를 조사하였다.

마이크로역가 플레이트 웰을 폴리클로날 인간 IgG 1㎍/ml로 코팅하고 면역화후 상기의 시간대에서 채취한 혈액 샘플로부터 제조한 마우스 혈청의 1:50 희석액에 배양하였다. 결합한 항-미모바디 항체(인간 프레임워크과 불변성 도메인 영역에 관계한 ahIgG)를 염소 항-마우스 IgG에 접합한 양고추냉이 과산화효소(감마IgG-HRP)로 두 번째 배양 때까지 검색하였다. 칼라 반응은 발광성 ABTS 기질을 사용하여 전개하였다.

모든 마우스는 항-미모바디 항체를 두 번째 부스터 후에 모든 재조합 미모바디를 제제와 함께 생산하였다(도 9).

실시예 8 : 재조합 BSW17에 대해 토끼에서 생산된 면역글로불린은 인간 IgE에 고친화성으로 결합한다.

재조합 BSW17 미모바디의 백신주사는 여기에서 인간 IgE에 대해 고친화성을 가진 체액 면역 반응을 유도함을 보여준다. 면역친화성-정제 항-미모바디 면역글로불린이 인간 IgE로 결합하는 것을 나타내는 역학 매개변수는 표면 플라스몬 반응(SPR)으로 분석하였다.

SPR 측정은 BIAcore 기구(Biacore, Uppsala, Sweden)로 실행하였다. 특이적인 결합 표면은 인간 IgE 또는 쥐과류 동물 IgG₃와 CM5 센서칩의 제조업자의 지시에 따라 아민 연결하여 제조하였다. 이 방법을 사용하여, 생분자는 1급 아미노기를 통해 카르복시메틸화한 센서칩의 덱스트란 표면에 접착하였다. 10pmole의 인간 골수종 IgE 또는SUS-11 IgE를 칩의 개별 흐름 세포에 연결하였다. 쥐과류의 IgG₃인 mAb ABL 364(ATCC HB 9324)를 고정화하여 동일한 센서칩을 개별 트랙에 고정화하였다. ABL 364를 항-미모바디 항체가 비-hIgE 면역글로불린 구에 결합하는 것을 결정하기위해 참조로 사용하고, 굴절률의 변화 가능성을 보정하였다. 이 굴절률의 변화는 버퍼 교체에 의해 일어난다. 연결 밀도는 ~13000RU이었다.

모든 생분자 상호작용은 BIAcore 기구로 25℃에서 측정하였고, HBS(10mM Hepes, pH=7.4, 150mM NaCl, 3.4mM EDTA 및 0.005% v/v surfactant P-20)을 연속적인 흐름 버퍼로 사용하여 실행하였다. 역학 분석을 위해, 센서칩 표면 상으로 지나는 각 분석물의 농도는 33 내지 499nM이었다. 흐름 비는 5㎕/분이었다. 분석물을 1200초 동안 주입하고 HBS로 약 1800초 동안 주입하여 결합된 분석물의 분리를 모니터하였다. 이 칩은 120초 동안 10mM HCl을 주입하여 재생산하였다. 비-특이성 결합은 분석물을 ABL 364 컨트롤 트랙 상으로 지나게 하여 모니터하였고 역학 분석 이전에 특이적 결합으로부터 뺀 ABL 364 컨트롤을 사용하였다.

SPR 측정으로 그려진 결합 곡선은 BIAevalution 3.0 분석 패키지를 사용하여 분석하였다. 항-미모바디/IgE 상호작용의 상대적 비교를 위해, 단일상 모델을 사용하였다, 결합비 상수 K_a, 비결합비 상수 K_d및 평형 비결합비 상수 K_D=1/K_A(K_A=친화성 상수)는 모든 곡선에 대해 계산하였고 표 3에 요약하였다.

이것은 인간 IgE에 대한 고친화성 항체가 재조합 BSW17-미모바디로 토끼의 면역화를 유도할 수 있음을 보인다(K_d값은 nM단위임).

클론43-유도 Fab(SDS463; 도 4C; 항-이디오타입-BSW17.43)는 인간 IgE에 대해 초-고친화성의 면역 반응을 유도할 수 있다(K_D＜1nM).

따라서, 모노클로날 항-이디오타입 항체를 사용하여, IgE에 대해 강한 폴리클로날 반응의 유도가 가능할 수 있고, 이는 인간 백신주사 방법의 의도와 같다.

실시예 9 : 재조합 BSW17-미모바디에 대해 토끼에서 생산하는 면역글로불린은 인간 IgE가 그의 고친화성 수용체에 결합하는 것을 저해한다.

항-알레르기 백신으로 활성인 경우, 항-미모바디 항체와 hIgE 사이에 결합체 형성은 IgE가 그의 고친화성 수용체에 결합하는 것을 막을 것이다. Val(370)-Asn(383)범위 내의 Cε3 에피토프 영역 Val(370)-Gly(379)(도 6; 서열 25)는 아미노산 서열 상동성이 BSW17-미모바디 CDR과 있음을 보여주고, 고친화성 수용체 결합과 관련된다. 따라서, 재조합 BSW17 미모바디에 대해 유도된 IgE-특이성 항체는 IgE가 그의 고친화성 수용체에 결합하는 것을 결합 도메인의 블로킹으로 저해하는 그의 약제학적 효과를 보일 것으로 기대된다. 이를 확인하기위해, 정제한 항-미모바디 항체를 면역화한 토끼에서 수득하고, 이는 hIgE/FcεRIα 결합의 저해를 경쟁적 ELISA에서 시험하였다. 질병의 적절한 판독으로, 유리 IgE는 재조합 FcεRIα(RIα-HSA-RIα 이중 융합 단백질; DFR; 도 10)에 대한 그의 결합 능력으로 측정하였다.

hIgE(SUS-11; 도 10A에서 1㎍/ml 및 도 10B에서 0.1㎍/ml)는 16시간 동안 +4℃에서 항-미모바디 면역글로불린 또는 mAb BSW17을 참고문헌과 같이 증가시키면서 전-배양하였다. SDS410 제제 중 면역친화성 칼럼을 통과하는 흐름에 존재하는 벌크 면역글로불린은 음성 컨트롤에 포함된다. 형성된 결합체는 포착성 항체로 항-IgE 항체 Le27 1㎍을 코팅한 마이크로역가 플레이트 웰에 가하고 양고추냉이 과산화효소가 표지된 FcεRIα-HSA-FcεRIα 이중 융합 단백질(DFP)과 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 결합한 DFP는 발광성 기질로 검색하였다. O.D. 값은 결합%로 나타낸다. 경쟁체와 유리 SUS-11 IgE와의 결합은 100%로 셋팅한다. 2회 측정치의 평균값으로 나타낸다. 편차는 일반적으로 2%미만이었다.

이 결과는 BSW17 미모바디의 면역화가 특이적 고친화성 항-hIgE 항체를 설치류에서 생산하게 한다는 것을 보여준다. 항-미모바디 항체는 IgE가 그의 고친화성 수용체에 생체외에서 결합하는 것을 저해하고, 이는 항-알레르기 백신 개발을 위한 BSW17-미모바디 백신주사 방법의 값어치를 나타낸다.

실시예 10 : 리서스 원숭이에서 재조합 BSW17 미모바디의 백신주사에 의한 수동 피부 아나필락시스의 저해

원숭이에서 수동 피부 아나필락시스(PCA)의 저해는 화합물의 항-알레르기 활성을 생체내에서 시험하는데 사용할 수 있다.

미모바디 백신주사는 아나필락시스 피부 반응의 저해를 리서스 원숭이에서 일으켰다. 2마리의 원숭이 그룹들에 동물 1마리 당 재조합 항-BSW17 미모바디 500㎍을 피하주사하였다. 첫 번째 면역화 후, 두 번의 부스터를 하였다. 각 부스터에서 10일 후, PCA 시험을 실행하였다. 원숭이 VI91, VI92, VI93 및 VI95는 마지막 부스터 3달후 한번 더 PCA 반응을 시험하였다. 면역화 도식은 다음의 표 1에 요약한다.

원숭이	면역원	부스터(경과일)	PCA(경과일)
VI91	anti-id-BSW17.52;경쇄(SDS426; 도4A)	0,21,54,92	0,30,61,105,203
VI92	anti-id-BSW17.52;경쇄(SDS426; 도4A)	0,21,54,92	0,30,61,105,203
VI93	anti-id-BSW17.52;Fab(SDS427; 도4B)	0,21,54,92	0,30,61,105,203
VI95	anti-id-BSW17.52;Fab(SDS427; 도4B)	0,21,54,92	0,30,61,105,203
VI2	anti-id-BSW17.43;Fab(SDS463; 도4C)	0,21,54,112	0,33,64,123
VI75	anti-id-BSW17.43;Fab(SDS463; 도4C)	0,21,54,112	0,33,64,123

리서스 원숭이는 작은 복용량의 케타민 히드로클로라이드(10 내지 15 mg/kg,i.m.; 등록상표 Ketalar, Parke Davis, GB)로 그의 고정화를 유지하기위해 전-처리하였고, 이 원숭이는 다양한 복양량의 IgE(JW8; Serotec, Oxford, U.K.)를 복부 피부에 피내주사하였다. IgE(JW8)은 키메라 항체이고, 헵텐 NIP에 대해 특이적인 마우스 항원-결합 부위와 인간 Fcε 중쇄로 구성한다. IgE(JW8)의 증가하는 양(살린 0, 2, 10, 50 및 250ng/ml)의 시리즈는 30게이지 주사로 100㎕를 주사하였다. 두 시간 후, BSA에 접합한 NIP을 한 마리 당 25mg씩 정맥주사하였다. 이 동물에 NIP-BSA 결합체를 정맥주사한 후, 다시 진정시켰다. 피부 반응을 시각화하기위해, 이반 블루 다이(1%, 0.5ml/kg)를 항원 주사 후, 즉시 정맥주사하였다. 피부 반응을 항원 주사 20분 후, 청색점의 두 지름을 측정하였고 그의 평균 mm로 계산하였다.

PCA를 첫 번째 면역화와 부스터 후, 표시된 시간대에서 시험하였다. PCA 세기는 곡선(AUG) 밑의 면적으로 계산하고 이 곡선은 주사한 IgE(JW8) 농도에 대해 청색 피부 지역의 지름을 플롯하여 만들었다. PCA 점수는 표4에 각 단일 원숭이에 대하여 계산한 AUG 값으로 나타내었다.

리서스 원숭이에서 수동 피부 아나필락시스 상에 BSW17-미모바디 백신주사의 효과
A
	PCA 점수
면역화후 경과일	면역원:anti-id BSW17.52; 경쇄(SDS426; 도 4A)	면역원:anti-id BSW17.52; Fab(SDS427; 도 4B)
	원숭이 VI91	원숭이 VI92	원숭이 VI93	원숭이 VI95
0	11.6¹⁾(100)²⁾	10.6(100)	15.8(100)	15.6(100)
30	10.5(91)	10.5(99)	15.4(97)	16.8(108)
61	10.1(87)	1.8(17)	21.4(139)	16.5(106)
105	4.6(40)	2.1(20)	5.6(35)	7.0(45)
203	9.8(84)	6.3(59)	12.6(80)	11.2(72)
B
	PCA 점수
면역화후 경과일	면역원:anti-id BSW17.43; Fab(SDS463; 도 4C)
	원숭이 VI2	원숭이 VI75
0	15.8(100)	15.8(100)
33	16.5(104)	18.9(120)
64	9.8(62)	13.0(82)
124	16.8(106)	18.9(120)
*¹⁾상기 기재한 것과 같이, 주사한 IgE(JW8) 농도에 대하여 청색 피부 지역의 지름을 플롯하여 만들어진 곡선(AUG) 밑의 면적으로 계산한 PCA 점수
*²⁾전-면역화 값에 대한 상대적 PCA 세기, 0일에서 PCA는 100%임

모든 원숭이는 참고문헌에서와 같이 각 전-면역화 PCA 점수(0일 값)를 가지며, BSW17 미모바디 백신주사에 대해 PCA 세기의 감소를 보인다. 최고의 결과는 클론 52 경쇄 제조물(SDS426; 도 4A)에서 60 내지 83%(PCA 점수 40 및 17)의 저해율을 보였다. 클론 52 Fab(배치 SDS427; 도 4B)로 면역화한 원숭이는 PCA가 55 내지 65%(PCA 점수 45 및 35)로 억제하였다. 18 내지 38%(PCA 점수 82 및 62)의 다소 낮은 PCA 억제는 클론 43 Fab(배치 SDS463; 도 4C)에서 나타나지만, 클론 43 Fab는 클론 52 미모바디보다 토끼에서 BSW17 결합과 고친화성 항-hIgE 유도에 대해서 탁월하다.

백신주사 방법에 따르는 클론 52 미모바디의 백신주사는 세 번째 부스터(원숭이 VI92는 예외) 후 효과적이고 부분적 PCA 억제는 3개월 이상 후에도 여전히 나타났다. 이에 비해, 클론 43 Fab는 두 번째 부스터 후 효과적인 반면, 세 번째 미모바디 주사는 효과를 가지지 못 하였다.

평균 PCA 점수는 동일한 미모바디 제제로 면역화한 두 마리 원숭이의 각 그룹에 대해 프로필하였고, 표 4의 단일 원숭이 값에서 계산하였으며, 도 11에 나타낸다.

백신주사한 원숭이에서 양성 PCA 결과는 (각 전-처리 점수 또는 비-처리 컨트롤 동물에 상대적으로) 미모바디 백신주사의 효능을 명확히 나타내고 그의 메카니즘 구상의 타당성을 증명한다. 리서스 원숭이에서 재조합 BSW17 미모바디의 백신주사는 PCA를 저해하는 고친화성 항-인간 IgE 항체를 생체내에서 생산하는 결과를 보인다.

Claims

IgE의 Cε3 영역이 IgE에 대한 고친화성 수용체에 결합하는 것을 방해하는 항체에 항-이디오타입인 항체 또는 항체 단편(미모바디).
제1항에 있어서, 항체 BSW17에 항-이디오타입인 재조합 모노클로날 항체 단편인 미모바디.
제1항에 있어서, 도 4(서열 35, 36, 37 및 38)의 경쇄 이합체 또는 두 개의 Fab 단편 중의 하나(이의 불변성 영역은 알로타입 변이체에서 발견되는 것과 같은 유의적이지 않은 입체 변형을 포함할 수 있는 것으로 이해됨)로 구성되거나 이를 포함하는 미모바디.
제1항에 있어서, 도 5a, 5b, 5c 또는 5d(서열 2, 4, 6 및 8)의 아미노산 서열로 구성되거나 이를 포함하는 미모바디.
제1항에 있어서, 임의로는 CDR 말단의 한쪽 또는 양쪽에서 아미노산 10개 이하의 보조 프레임워크 서열을 갖는, 도 5a(서열 2, 및 서열 40, 42 및 44), 도 5b(서열 4, 및 서열 46, 48 및 50), 도 5c(서열 6, 및 서열 52, 54 및 56) 또는 도 5d(서열 8, 및 서열 58, 60 및 62)의 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상, 더 바람직하게는 3개 이상의 CDR로 구성되거나 이를 포함하는 미모바디.
제1항에 있어서, 인간 IgE의 Cε3 도메인(서열 26, 28, 30, 32 및 34)에 대해 상동성을 갖는 클론 52와 43에 대해 도 6a 및 6b에서 정의된 하나 이상의 서열로 구성되거나 이를 포함하는 미모바디.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 미모바디와 단일 분자 또는 면역원성 캐리어 분자에 화학적으로 결합된 단백질 결합체로서의, 경우에 따라 보조제 및 추가의 통상적 부형제로 구성되거나 이를 포함하는 백신과 같은 제약 조성물.
알레르기와 같은 IgE-매개 질환, 특히 천식, 아토피성 피부염, 비염, 만성 두드러기 및 음식 알레르기의 치료를 위한 약제로서, IgE-매개 질환에 대한 특히 백신의 제조를 위한, 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 미모바디.
IgE-매개 질환의 치료 또는 백신접종의 필요가 있는 환자에게 치료 유효랑의 제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 미모바디를 투여하는 것을 포함하는, 특히 백신접종에 의한 IgE-매개 질환의 치료 방법.
제1항 내지 제6항 중의 어느 한 항에 따른 미모바디의,

수동 면역에 의해 그에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 유도하거나, 상기 미모바디를 인간이 아닌 적절한 동물에 투여하고 그에 대하여 생산된 항체를 단리하여 정제하는 것에 의해 또는 통상적인 하이브리도마 기술에 의해, 그에 대한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제조하기 위한 용도;

상기 미모바디로부터 수득한 폴리클로날 또는 모노클로날 항체의 수동 면역에 의한 IgE-매개 질환 치료에 있어서의 용도; 또는

IgE의 Cε3 영역이 IgE에 대한 고친화성 수용체에 결합하는 것을 방해하는 BSW17와 같은 항체에 의한 상기 미모바디의 동정에 있어서의 용도.