KR20020008174A

KR20020008174A - 재조합 단백질의 생산 방법

Info

Publication number: KR20020008174A
Application number: KR1020017014055A
Authority: KR
Inventors: 미케 파비크; 마르쿠스 론돈; 유르겐 도멘; 울리케 다렘스; 게르트 겔리센; 알렉산더 더블유. 슈트라써
Original assignee: 추후제출; 라인 비오테크 게셀새프트 퓌르 너이에 비오테크놀로지세 프로제세 운트 프로덕테 엠비에이치
Priority date: 1999-05-05
Filing date: 2000-05-05
Publication date: 2002-01-29
Anticipated expiration: 2020-05-05
Also published as: DE19920712A1; DE50014875D1; KR100534558B1; EP1177305B1; WO2000068400A1; ATE382089T1; US20030040047A1; EP1177305A1; AU4917300A

Abstract

본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 재조합 분비 단백질, 재조합 분비 단백질의 분비를 증진시키는 발현 산물의 핵산 분자를 확인하는 방법, 이종단백질(heterologous protein)의 증가된 분비를 확인하기 위한 상기 분자의 용도 및 그에 상응하는 키트 시스템(kit systems)에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 분비 단백질을 코딩하는 핵산을 진핵 전사 시작 인자(eukaryotic translation initiation factor) 4E의 생물학적 활성을 지닌 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 및/또는 CaM 키나제의 생물학적 활성을 지닌 폴리펩티드를 코딩하는 핵산과 함께 적합한 숙주세포에서 발현되도록 한다. 전사 시작 인자에 대한 유전자 및/또는 CaM 키나제 유전자의 동시발현(coexpression)은 세포로부터 목적 단백질의 분비를 증진시킨다.

Description

재조합 단백질의 생산 방법{Method for producing a recombinant protein}

약제(medicaments)를 함유하고 있는 많은 활성 화합물(active compounds)들은 현재 화학적 합성(chemical synthesis), 동ㆍ식물로부터의 추출(extraction) 또는 정제(purification)에 의해서 생산되지 않고 재조합 DNA 기술(recombinant DNA technology)에 의해 생산되고 있다. 상기 재조합 DNA 기술에 의하면 특성화된(well-characterized) 숙주(hosts)로부터 단백질을 무제한으로 얻을 수 있다는 장점이 있다.

재조합 단백질은 그들이 분비될 때 세포 상등액(cell supernatant)으로부터수득이 가능하므로 더욱 효과적으로 얻을 수 있다. 이런 경우 단백질은 비교적 높은 순도로 존재하기 때문에 복잡한 정제단계(purification steps)를 줄일 수 있다.

많은 양의 분비 단백질을 생산하기 위해서 사용되어온 숙주세포로는 효모(yeasts)와 곰팡이(filamentous fungi) 등이 있다. 이들은 비교적 배양과 유지가 간편하며 분비 단백질을 고효율로 수확할 수 있다. 또한, 생산된 단백질들은 당화(glycosylation)와 같은 번역 후 변형(posttrans lational modification)을 거치기도 한다.

재조합 DNA 서열의 발현을 위해서는 단백질을 코딩하는 핵산 서열을 기능적 인자들(functional elements)-프로모터, 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signals), 종결 인자(termination elements) 등-을 포함하는 벡터에 클로닝(cloning)시켜야 하며, 상기의 벡터는 숙주세포(host cells)로 적당한 방법-일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 또는 리포좀을 이용한 형질도입(calcium- or liposome-mediated transfection) 등-에 의해 삽입시켜야 한다. DNA 서열은 또한 5'-말단에 분비 유도서열(secretion leader sequence)을 포함하고 있어야 하는데, 이 서열에 의해 합성된 재조합 단백질이 숙주세포의 분비장치(secretion apparatus)로 직접 들어가게 된다.

그러나 이렇게 삽입된 외래 DNA(foreign DNA)가 효과적으로 발현된다는 보장은 없다. 비효율적인 전사(inefficient transcription) 및/또는 비효율적인 번역(inefficient translation), mRNA의 빠른 분해(rapid degradation) 및 합성된 단백질의 불안정성(instability) 등이 종종 일어나는 문제들이다. 더욱이 재조합 단백질은 경우에 따라 숙주세포에 의해 원하지 않는 방향으로 변형되기도 한다. 특히, 제빵에 사용되는 효모인 사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 숙주세포로 사용한 경우 재조합 단백질의 분비는 매우 비효율적이다. 그러나, 특정 조건하에서는 재조합 단백질의 생산을 증진시킬 수 있다. 즉, 효율적인 전사 및 번역, 프로세싱(processing), 안정화(stabilization), 변형(modification) 및 특정 세포 구획으로의 분비(distribution to certain cell compartments)를 도와주는 단백질을 동시에 생산하게 함으로써 재조합 단백질을 효율적으로 생산할 수 있다. 상기의 목적을 위해서 S.세레비시애의 돌연변이체들이 만들어 졌는데 예를 들면 ssc1 및 ssc2 유전자를 위한 돌연변이체(Smith et al, 1985)와 rgr1 및 ose1 유전자를 위한 돌연변이체(Sakai et al, 1988; Hinnen et al, 1994; Gellissen and Hollenberg, 1997)가 그것이다. 또한, PDI(protein disulphide isomerase) 또는 샤페론 BiP의 과생산(overproduction), 또는 제빵용 효모내에서 포유류의 SPC(signal peptidase complex) 성분의 이용 등 다른 유기체로부터 유래된 이종 유전자(heterologous genes)의 과발현(overexpression)이 다른 방법으로서 시도되기도 하였다(Shusta et al., WO 98/13473, 1998).

메탄올을 유일한 에너지원 및 탄소원으로 이용하는 메틸로트로픽효모(methylotrophic yeasts)는 S.세레비시애에 비해 재조합 단백질의 당화(glycosylation)를 훨씬 적게 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한 메틸로트로픽 효모는 비교적 효율적으로 이종 단백질(heterologous protein)을 분비한다는 장점이 있다. 이러한 메틸로트로픽 효모를 비롯하여 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 및 스키조사카로미세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 등을 발현 숙주(expression hosts)로 이용하는 시도들이 있었으나(Giga-Hama and Kumagai, 1997; Gellissen and Hollenberg, 1997; Hollenberg and Gellissen, 1997), 메틸로트로픽 효모를 이용하였을 경우에도 제한된 정도의 재조합 단백질이 생성 및 분비되었다. 따라서 목적하는 분비 단백질을 효과적으로 분비시킬 수 있는 시스템의 개발이 시급한 실정이다. 또한, 재조합 단백질이 적합한 2차 변형(secondary modifications)을 거쳐 생산되도록 하는 방법의 개발이 필요하다.

따라서, 본 발명의 목적은 재조합 단백질의 효과적인 분비를 위한 수단 및 자연 상태에서 일어나는 2차 변형과 유사한 2차 변형을 거쳐 재조합 단백질이 생산 및/또는 분비되도록 하는 수단을 제공하는 것이다.

본 발명에 따르면, 상기의 목적은 재조합 분비 단백질의 생산에 하기의 단계들로 구성된 방법을 사용함으로써 성취될 수 있다:

a) 분비 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 진핵 번역 시작 인자 4E(eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E)의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드 및/또는 CaM 키나제(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase)의 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 그리고 P1 프로모터의 조절을 받는 eIF4E 또는 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 적합한 숙주 세포에서 동시에 발현시키는 단계;

b) 숙주 세포로부터 단백질을 분비시키는 단계, 및

c) 분비된 단백질을 회수하는 단계.

eIF4E는 번역의 시작에 있어서 중요한 역할을 한다. 이것은 "캡 결합(cap binding)" 복합체(eIF4F)의 일부를 이루며, 상기 복합체가 mRNA의 5'-캡 구조에 결합하는 데에도 필수적으로 작용한다(Sonenberg, 1996). CaM 키나제(eukaryotic type Ⅱ Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase)는 여러 종류의 목적 단백질(target proteins)을 인산화(phosphorylation) 시킴으로써, 에너지 대사(energy metabolism), 세포주기(cell cycle) 및 이온 침투성(ion permeability) 등을 조절하는 역할을 한다(Schulman, 1993).

eIF4E 및 CaM 키나제에 있어서 "생물학적 활성(biological activity)"이라는용어는 참고문헌에서 언급된 상기 효소들의 활성을 의미한다. eIF4E의 생물학적 활성은 알트만과 트라첼(Altmann and Trachsel, 1989)에 의해 언급되었으며, CaM 키나제의 생물학적 활성은 오히야 등(Ohya et al., 1991)에 의해 언급된 바 있다.

P1 프로모터는 선택된 숙주 세포 내에서의 프로모터로 작용하는 바람직한 프로모터로서, 상기 프로모터를 사용한 많은 보고가 있다(Sambrook et al., 1989).

본 발명의 방법은 목적 단백질의 유전자와 eIF4E 및/또는 CaM 키나제 유전자를 동시에 발현시킴으로써 목적하는 단백질을 효과적으로 생산ㆍ분비되도록 한다.

재조합 단백질의 과도한 생산은 숙주세포의 전사/번역 및 분비 장치에 과도한 부담을 주어 숙주세포의 생장이 저해되거나 중단되기도 한다. 번역 시작 시점에서 빈번한 문제가 발생되는데, 본 발명자들은 ATP-의존 시작인자(ATP-dependent initiation factor) 4E가 잠재적 제한요인으로 작용한다는 것을 발견하였다. 상기의 문제는 재조합 DNA 서열과 함께 번역 시작인자의 유전자를 함께 발현시킴으로써 해결이 가능하다. 번역 시작인자 4E를 함께 발현시킬 경우 분비 효율(secretion efficiency)에도 영향을 주었다. 즉, 번역 시작인자 4E를 함께 발현시키면 목적하는 분비 단백질의 분비도 큰 폭으로 증가하는 것을 확인하였으며, CaM 키나제를 함께 발현시켰응 경우에도 재조합 단백질의 분비가 증가하는 것을 관찰하였다(Pausch et al., 1991; Ohya et al., 1991). 그러나 단백질 분비가 증가되는기작(mechanism)에 대해서는 알려진 바가 없는 실정이다.

본 발명의 방법은 과도하게 생산된 단백질을 효율적으로 분비되도록 함으로 분비 단백질을 고수율로 수확하도록 해 준다. 단백질의 생산량은 하나의 요소 또는 몇몇 요소들의 조합에 의하여 증가시킬 수 있다. 예를 들어 벡터의 선택 하나만으로도 세포 당 카피(copy)수에 영향을 줄 수 있다. 2μ-베이스(based) 벡터의 경우 세포 당 5-100 카피가 존재하는데 통상적인 경우의 효모세포에서는 세포 당 20-40 카피가 존재한다. 통합 벡터(integrative vectors)의 경우는 세포 당 80-150 카피가 존재한다.

선별 시스템(selection system)의 선택 역시 벡터의 카피수에 영향을 줄 수 있다. 트립토판-요구성 돌연변이체(tryptophane-auxotrophic mutants)와 선별 마커(selection marker)로서 플라스미드의TRP1을 사용할 경우 영양요구성 세포(auxotrophic cell)에서 플라스미드를 증폭(amplification)시킬 수 있다. 또한,LEU2영양요구성 균주(auxotrophic strains)와Leu2d대립유전자(allele)를 사용할 경우에도 세포 내 플라스미드의 카피수를 증가시킬 수 있다.Leu2d대립유전자는 많은 부분이 결실된 프로모터를 가진LEU2유전자로서 상대적으로 약한 전사율을 보인다.LEU2영양요구성 세포는 LEU2 단백질을 필요로 함으로 플라스미드의 급격한 증폭이 유도되며 이 경우 플라스미드에 포함된 목적하는 재조합 단백질의 구조 유전자(structural gene)의 증폭도 일어나게 된다.

생산 시스템에 영향을 미치는 또 다른 요인은 목적하는 구조 유전자의 앞에 존재하는 프로모터의 강도(strength)이다. 서로 다른 강도를 가진 유도 및 비유도 프로모터들이 알려져 있는데 샘부룩 등(Sambrook et al)의 매뉴얼에 여러 프로모터들에 대한 언급이 있다.GAL1프로모터 또는PDC1프로모터가 효모세포에서의 단백질 생산에 많이 사용된다.

생산된 단백질은 세포 상등액(cell supernatant)으로부터 원심분리(centrifugation)를 통해 세포 잔류물(cell residue)을 제거하고, 전기영동(gel electrophoresis)이나 크로마토그래피(ion exchange chromatography, affinity chromatography) 등의 방법을 통해 정제함으로써 쉽게 얻을 수 있다.

본 발명의 방법에 대한 바람직한 구체예로서, 번역시작인자 4E의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 하기의 군으로부터 선택될 수 있다.

ⅰ) 사카로미세스 세레비시애(CDC33)의 eIF4E를 코딩하는 핵산;

ⅱ) eIF4E의 생물학적 활성을 가지는 eIF4E 유사체(homologue)를 코딩하는 핵산;

ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅳ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅲ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅴ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅳ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.

상기 ⅰ) 항에서 "유사체(homologue)"는 사카로미세스 세레비시애의 번역시작인자 4E의 아미노산 서열과 적어도 60% 이상의 상동성(homology)를 가지는 단백질을 의미한다(Brenner et al., 1988). 상동성은 70% 또는 80%인 것이 바람직하고, 90% 또는 95%인 것은 더욱 바람직하며, 98% 또는 99%인 것이 가장 바람직하다. 상동성의 정도는 피어슨과 립만(Pearson and Lipman, 1988)의 방법에 따라서 계산이 가능하다.

"상동성(homology)"은 둘 또는 그 이상의 단백질들간의 친화성(affinity)의 정도를 의미한다. 친화성의 정도는 컴퓨터에 의한 서열비교(computer-aided sequence compatison, basic local alignment search tool, S. F. Altschul etal.,J. Mol. Bio., 1990, 215, 403-410) 등의 알려진 방법에 의해 아미노산 서열을 비교함으로써 결정할 수 있다. "상동성"의 정도는 주로 백분율로 나타내는데 이는 비교하는 둘 이상의 서열에서 동일한 부분의 비율로부터 얻어진다. 주로 사용되는 컴퓨터 프로그램은 특정한 요구를 수용할 수 있는 알고리즘(algorithms)과 함께 사용된다.

상동성을 결정하기 위한 바람직한 방법들은 먼저 비교 대상 서열들 사이의 일치되는 부분을 찾아낸다. 둘 이상의 서열들 사이의 상동성을 결정해 주는 컴퓨터 프로그램으로는 GAP를 포함하는 GCG 프로그램 패키지(Devereux, J., et al.,Nucleic Acids Research, 1984, 12(12), 387; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, WI), BLASTP, BLASTN 및 FASTA(Altschul, S., et al.,J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410) 등이 있다. BLAST 프로그램은 NCBI(National Center for Biotechnology Information) 또는 다른 곳(BLAST Manual, Altschul, S., et al.,J. Mol. Biol., 1990, 215, 403-410)에서 얻을 수 있다. 잘 알려진 프러그램인 스미스 워터만 알고리즘(Smith Waterman algorithm) 역시 상동성을 결정하는 용도로 사용할 수 있다.

아미노산 서열을 비교하기 위한 바람직한 매개변수(parameters) 들은 하기와 같이 구성된다.

알고리즘: 니들만과 분쉬(Needleman and Wunsch,J. Mol. Biol., 1970, 48, 443- 453)

비교 매트릭스(Comparison matrix): BLOSUM 62(Henikoff and Henikoff,PNAS USA, 1992, 89, 10915-10919)

갭 페널티(Gap penalty): 12

갭 길이 페널티(Gap length penalty): 4

유사도의 역치값(Threshold of similarity): 0

GAP 프로그램 역시 상기의 매개변수들을 사용하기에 적합하다. 상기의 매개변수들은 아미노산 서열 비교를 위해 사전에 설정된 값(default parameters)이다. 말단의 갭은 상동성의 정도를 감소시키지 않는다. 매우 짧은 서열을 참고 서열과 비교할 경우에는 예상값(expectation value)을 100,000 정도까지 증가시킬 필요가 있으며 워드의 크기(word size)는 2까지 감소시킬 필요가 있다.

다른 알고리즘들, 갭 오프닝 페널티(gap opening penalties), 갭 익스텐션 페널티(gap extension penalties), 비교 매트릭스(comparison matrices) 등은 프로그램 매뉴얼(Program manual, Wisconsin Package, Version 9, Swptember 1997)에 있는 대로 사용할 수 있다. 특정한 비교 양식에 따라 프로그램 선택이 가능한데, 서열 쌍(pairs) 사이의 비교에는 GAP 또는 Best Fit이 바람직하고, 하나의 서열과 큰 데이터베이스 사이의 비교에는 FASTA 또는 BLAST가 바람직하다.

상기의 알고리즘에서 60% 일치(match)를 얻었다면 이는 상동성의 정도가 60%라는 것을 의미하며, 더 높은 값에서도 역시 일치의 정도와 상동성의 정도가 동일하다.

본 발명의 목적은 하기의 단계들로 구성되는 재조합 단백질의 제조방법을 제공하는 것이다:

a) 재조합 단백질을 코딩하는 핵산과 CaM 키나제(Ca2+/ calmodulin-dependent protein kinase)의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산, 즉 P1 프로모터의 조절을 받는 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 적합한 숙주 세포에서 동시에 발현시키는 단계;

b) 단백질을 수득하는 단계.

목적하는 단백질은 재조합 단백질에 대한 유전자와 CaM 키나제에 대한 유전자를 동시에 발현시킴으로써 효과적으로 생산할 수 있고 생산된 단백질은 분비 단백질인 경우는 세포 상등액으로부터, 비 분비성인 세포내 단백질은 세포 루멘(cell lumen)으로부터 수득이 가능하다. CaM 키나제의 유전자를 목적 단백질의 유전자와 동시에 발현시키는 것은 목적 단백질의 효과적인 생산은 물론 많은 숙주세포에서관찰되는 재조합 단백질의 과도한 당화(hyperglycosylation)를 획기적으로 감소시켜주는 이점이 있다. 즉, 목적하는 재조합 단백질의 당화 양상(glycosylation pattern)이 CaM 키나제가 과생산되지 않은 S. 세레비시애에서 생산된 재조합 단백질의 당화 양상에 비해 자연적으로 일어나는 당화 양상과 훨씬 더 유사하게 된다.

본 발명의 방법의 바람직한 구체예로서, CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 하기의 군으로부터 선택될 수 있다.

ⅰ) 사카로미세스 세레비시애(CMK2)의 CaM 키나제를 코딩하는 핵산;

ⅱ) CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 CaM 키나제 유사체(homologue)를 코딩하는 핵산;

ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅳ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅲ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

본 발명의 방법에 의해 재조합 단백질을 생산할 수 있는 적당한 숙주세포로는 식물 세포, 동물 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포 또는 점질곰팡이(slime fungus) 세포 등이 있다.

동물 세포 중에서는 포유동물 세포 또는 곤충 세포가 바람직하다. 효모 세포 중에서는 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 속, 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 피치아(Pichia) 속, 스와니오미세스(Schawanniomyces) 속, 칸디다(Candida) 속 및 야로위아(Yarrowia) 속이 바람직하며, 구체적으로 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 피누스(Pichia pinus), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 및 칸디다 보이디니(Candida boidinii) 등이 바람직하다. 바람직한 곰팡이 세포로는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스 속, 뉴로스포라(Neurospora) 속, 리조푸스(Rhizopus) 속 및 트리코더마(Trichoderma) 속이 있다. 발현 숙주로서 바람직한 점액곰팡이 세포로는 딕티오스페리움(Dictyostelium) 속이 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, eIF4E 및/또는 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 단백질 및 폴리펩티드에 대한 유전자는 강력한 프로모터인 P1 프로모터의 조절하에 발현되는 것이 바람직 하다.

유도가 가능한 P1 프로모터(inducible promoter P1)는 특히 바람직하다. 상기 프로모터의 일례로서GAL1프로모터(Johnston and Davis, 1984)를 들 수 있는데, 이것은 두 당(sugars) 즉 포도당(glucose)과 갈락토스(galactose)에 의해 조절이 가능하다. 숙주 세포를 포도당이 포함된 배지에서 배양하는 경우 GAL1 프로모터의 조절하에 있는 유전자의 프로모터 활성이 유도되어 많은 양의 mRNA가 전사 산물로 생성된다. 반대로, 배지에 갈락토스가 포함되어 있는 경우에는 프로모터의 활성이 매우 낮아서 적은 양의 mRNA만이 생성된다.

본 발명의 한 구체예에서, 분비 단백질은 효소 피타제(phytase)이다. 피타제는 피티닉산(phytinic acid)으로부터 미오-이노시톨(myo-inositol)을 분리하는 식물 효소이다. 미오-이노시톨의 리포트로픽 효과(lipotrophic effects)로 인해 이것은 간치료제로서 사용된다. 피타제를 가금(poultry) 및 돼지(pigs) 등의 단위동물(monogastric animals)의 사료로 첨가하면, 동물들이 사료로부터 인산(phosphate)을 효율적으로 흡수하도록 하며, 동시에 인산의 배출도 감소시켜 준다. 이는 가축의 사료에 인산을 포함시킬 필요가 없거나 아주 적은 양의 인산만첨가하면 된다는 것으로, 다시 말하면 인산의 농도를 감소시킴으로써 환경오염을 방지할 수 있다는 것을 의미한다.

또 다른 구체예로서, 알파-아밀라제(α-amylase) 또는 글루코아밀라제(glucoamylase)와 같은 녹말분해 효소(amylolytic enzymes) 또는 호르몬 등이 생산된다. 본 발명의 구체예에서, 재조합 단백질은 과도하게 생산되는 것이 바람직하다. 상기에서 언급된 바와 같이, 단백질의 생산은 여러 가지 요인들-사용되는 벡터, 선별 시스템 및 프로모터-에 의해 영향을 받는다. 본 발명에 따르면, 단백질은 강력한 그리고/또는 유도될 수 있는 프로모터의 조절 하에서 생산되는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 숙주세포로부터 재조합 단백질의 분비를 증가시키기 위하여, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 하나 이상의 핵산을 사용한다.

ⅱ) eIF4E의 생물학적 활성을 가진 eIF4E 유사체를 코딩하는 핵산;

ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅵ) 사카로미세스 세레비시애(CMK2)의 CaM 키나제를 코딩하는 핵산;

ⅶ) CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 CaM 키나제 유사체(homologue)를 코딩하는 핵산;

ⅷ) 상기 ⅵ) 또는 ⅶ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅸ) 상기 ⅵ) 항 내지 ⅷ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅹ) 상기 ⅵ) 항 내지 ⅸ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.

상기의 핵산들 중 하나를 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산과 함께 발현시키면 목적 단백질이 효과적으로 분비될 수 있게 해 준다.

상기 핵산 중 하나 이상을 포함하고 있는 숙주세포로부터 분비되는 재조합 단백질은 목적 단백질이 효과적으로 분비되며 따라서 정제하기도 쉽다는 장점이 있다. 이것은 또한 생산비를 감소시킬수 있다는 의미도 된다. 따라서, 본 발명의 방법은 의약품, 식품 또는 화장품 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 ⅰ) 항 내지 ⅹ) 항의 핵산들은 하나의 벡터로 통합시킬 수 있다. 이 경우 벡터는 상기의 핵산들과 기능적으로 연결된 P1 프로모터 이외에도 다중 아데닐화(polyadenylation) 및 번역 종결 신호(translation termination signals)를 포함하고 있어야 한다.

또한, 본 발명은 진핵세포로부터 재조합 분비 단백질의 분비를 증가시키는 단백질을 코딩하는 핵산을 확인하는, 하기의 단계로 구성되는 방법을 제공한다.

a) 분비 표지 단백질(secretory marker protein)을 코딩하며 P3 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포(recombinant host cells)를 준비하는 단계, 이 경우 숙주세포는 분비 표지 단백질의 생산에 의하여 성장이 저해되며 어떤 유기체에서 유래된 DNA 분절을 가진 발현벡터를 포함하는 재조합 숙주세포는 적합한 P1 프로모터의 조절을 받게 된다;

b) 발현벡터의 존재를 선별할 수 있는 조건에서 재조합 숙주세포를 성장시키는 단계;

c) 생장에 대한 탈억제 현상(derepression)을 보이는 군집(colonies)을 선별하는 단계;

d) 생장에 대한 탈억제 현상을 보이는 군집의 발현벡터에 포함되어 있는 DNA를 분석하는 단계;

e) 재조합 숙주세포에서 발현되어 생장 저해에 대한 탈억제를 일으키는 핵산 서열을 확인하는 단계.

P3 프로모터는 숙주세포에서 분비 표지 단백질에 대한 유전자를 발현하도록 하는 프로모터로서, 강력한 프로모터를 선택하는 것이 좋다.

본 발명의 스크리닝 방법은 분비단백질을 코딩하는 핵산의 지나치게 과도한 발현이 숙주세포의 분비장치에 무리를 준다는 발견에 기초한다. 즉, 과도하게 발현된 재조합 단백질에 의해 소포체(endoplasmic reticulum) 및 골지장치(Golgi apparatus)가 "폐쇄(clogged)"되고, 세포의 생장 및 단백질 분비가 중단되게 된다. 상기의 문제점을 해결할 수 있는 또 다른 재조합 단백질이 생장과 분열을 회복한 세포에서 생산되었다. 본 발명자들은 가능한 많은 다른 재조합 단백질들을 대상으로 실험한 결과, 세포 생장 저해를 방지하거나 생장 저해를 회복시킬 수 있는 단백질과 그에 대한 핵산 서열을 확인할 수 있는 방법을 고안하였다.

본 발명의 방법에 사용될 수 있는 숙주세포로는 식물 세포, 동물 세포, 효모 세포, 곰팡이 세포 또는 점액곰팡이 세포 등이 있다. 동물 세포 중에서는 포유동물 세포 또는 곤충 세포가 바람직하며, 효모 세포 중에서는 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 속, 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 피치아(Pichia) 속, 스와니오미세스(Schawanniomyces) 속, 칸디다(Candida) 속 및 야로위아(Yarrowia) 속이 바람직하며, 구체적으로 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 피치아 피누스(Pichia pinus), 클루이베로미세스 락티스(Kluyveromyces lactis), 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 및 칸디다 보이디니(Candida boidinii) 등이 바람직하다. 바람직한 곰팡이 세포로는 아스퍼질러스니거(Aspergillus niger) 등의 아스퍼질러스 속, 뉴로스포라(Neurospora) 속, 리조푸스(Rhizopus) 속 및 트리코더마(Trichoderma) 속이 있다. 특히 바람직한 점액곰팡이 세포로는 딕티오스페리움(Dictyostelium) 속이 있다.

본 발명의 방법의 한 구체예에서, 표지 단백질의 생산을 조절하는 프로모터는 유도-프로모터(inducible promoter)인데, 강력한 프로모터(strong promoter)가 바람직하다.PDC1프로모터가 유도-프로모터의 한 예인데, 이것은 단계 b)의 유도 조건에서 배양되는 재조합 숙주세포에서 특히 유용하게 사용된다. 즉, 발현벡터와 함께PDC1프로모터를 사용하면, 숙주세포는 포도당을 함유하고 갈락토스는 결핍된 배지에서 성장이 가능하다.

또 다른 구체예에서, 분비 표지 단백질을 코딩하는 핵산은 숙주세포당 많은 수의 카피를 가지는 플라스미드에 포함되어야 한다. 이는LEU2d유전자의 존재에 의해서 성취될 수 있다.

본 발명에 따르면, 상기 단계 a)에서 사용된 DNA 분절은 cDNA 유전자 은행으로부터 얻어진 것이 바람직하다. S.세레비시애의 cDNA 유전자 은행은 리우 등(Liu et al., 1992)에 의해 언급된 바 있으며, 이들에 의해 확립된 기본 벡터인 pRS316(CEN/ARS plasmid, Sikorski and Hieter, 1989)이 특히 바람직하다.

또 다른 구체예에서, 상기 단계 a)에서 사용된 DNA 분절은 S.세레비시애 게놈(genome)으로부터 얻어진 유전자 은행 등의 게노믹 유전자 은행에서 얻을 수도 있다.

상기 단계 a)의 DNA 분절을 포함하는 발현 벡터는 CEN/ARS 벡터 pRS316(Sikorski and Hieter, 1989)인 것이 특히 바람직하다.

분비 표지 단백질로는 글루코아밀라제(glucoamylase, EC3.2.1.3; glucoamylase with debranching activity) 효소가 바람직하다. 글루코아밀라제를 코딩하는 핵산 서열은 S.옥시덴탈리스(occidentalis)로부터 유래한GAM1서열인 것이 특히 바람직하다.

본 발명은 또한 재조합 숙주세포의 용도를 포함한다. 숙주세포는 표지 단백질에 대한 유전자의 발현에 의해 숙주세포의 성장이 저해될 경우, 발현에 의해 성장 저해에 대한 탈억제를 가능하게 해주는 핵산 서열을 확인하기 위한 분비 표지 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하며 이것은 프로모터의 조절을 받는다.

본 발명은 또한 재조합 과정에 의해 숙주세포의 염색체로 삽입되는, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 핵산을 지닌 숙주세포를 포함한다:

본 발명은 또한 단백질의 분비에 적합한 숙주세포 및 eIF4E의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하며 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 핵산을 지닌 발현 벡터를 포함하는 키트(kit)를 포함한다:

발현 벡터는 숙주세포내에 존재할 수도 있고 따로 제공될 수도 있다.

상기 키트는 진핵 숙주세포로부터 목적하는 단백질의 분비를 쉽고 효과적으로 되도록 해 주며 따라서 기존의 방법에 비해 더 많은 양의 단백질을 더 빨리 생산할 수 있도록 해 준다.

본 발명은 또한 단백질의 분비 및/또는 당화에 적합한 숙주세포 및 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하며 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 핵산을 지닌 발현 벡터를 포함하는 키트를 포함한다.

상기의 키트는 단백질의 분비가 효과적으로 이루어지도록 할 뿐 아니라 재조합 단백질의 당화과정에서 종종 일어나는 과도한 당화를 감소시켜 줌으로써 자연상태의 당화 양상과 비슷하게 일어나도록 해 준다.

본 발명은 또한 단백질의 분비 및/또는 당화에 적합한 숙주세포 및 CaM 키나제 및 eIf4E의 샹물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하며 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 핵산들로 구성된 발현 벡터를 가지는 키트를 포함한다:

ⅴ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅳ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될수 있는 서열을 가진 핵산.

본 발명의 키트는 또한 재조합 및/또는 재조합 분비 단백질을 코딩하는 핵산의 클로닝에 적합한 빈 발현 벡터(empty expression vector)를 포함한다. 상기의키트는 숙주세포에서 재조합 단백질의 효율적인 분비를 가능하게 하고 및/또는 재조합 단백질의 과도한 당화를 감소시킴으로써 특정한 핵산의 빠르고 안정적인 발현을 가능하게 한다.

본 발명은 또한 상기에서 언급된, 분비를 증가시키는데 필요한 특정 서열을 가지는 숙주세포 및 재조합 및/또는 재조합 분비 단백질을 코딩하는 핵산의 클로닝에 적합한 빈 발현 벡터(empty expression vector)를 포함하는 키트를 제공한다. 상기의 키트는 발현 벡터를 포함하는 키트에서와 같이 숙주세포의 형질전환을 통해 목적하는 단백질의 생산 및 분비가 효과적으로 이루어지도록 한다.

하기의 도면 및 그에 대한 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것이다. 또한, 여기에 사용된 유전적 요소들(genetic components)과 DNA 서열들은 본 발명의 필수적인 원리들(essential principles)을 설명하기 위한 것이다. 단, 본 발명의 내용이 하기의 설명에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 재조합 단백질의 생산 방법에 관한 것으로서, 좀 더 상세하게는 재조합 분비 단백질, 재조합 분비 단백질의 분비를 증진시키는 발현 산물의 핵산 분자를 확인하는 방법, 이종단백질(heterologous protein)의 증가된 분비를 확인하기 위한 상기 분자의 용도 및 그에 상응하는 키트 시스템(kit systems)에 관한 것이다.

도 1은 플라스미드 pMF23의 플라스미드 지도를 나타내는 모식도이고,

상기의 pMF23은 E.콜라이/S.세레비시애(E.coli/S.serevisiae) 셔틀벡터(shuttle vector)이며, 하기의 기능 단위들(functional units)을 운반한다: 증식(propagation)과 E.콜라이에서의 선별을 위한 oriR(origin ofreplication) 및 bla(β-lactamase) 유전자, 그리고 S.세레비시애에서의 증식을 위한 2 μ DNA. 효모에서의 선별을 위한 표지서열들(marker sequences)로는TRP1유전자 및LEU2d대립유전자(allele)가 있다. 플라스미드 pMF23은 종결자(terminator)를 포함하고 있는 S.옥시덴탈리스(S.occidentalis)로부터 유래된GAM1유전자를 가지는데,GAM1유전자는 S.세레비시애로부터 유래된PDC1프로모터의 조절을 받는다.

pMF25는 pMF23과 같은 구조와 같은 코딩 서열을 가지고 있으나, C-말단에 인플루엔자 바이러스에서 유래된 헤마글루티닌 에피토프(haemagglutin epitope)를 가지고 있다.

도 2는 발현 강도(expression strength)에 따라 S.세레비시애의 여러 균주에서 Gam1p 단백질이 어느 곳에 존재하게 되는지를 나타내는 전기영동 사진들이고,

GAM1유전자는 "단일복사 플라스미드(single copy plasmid)"인 pMF28 및 "다중복사 플라스미드(multi-copy plasmid)"인 pMF25 모두로부터 발현된다. pMF28 프라스미드는URA3 ⁺유전자를 선별 표지(selection marker)로 갖고 있는 CEN 벡터로서,GAM1서열은 헤마글루티닌을 코딩하는 서열과 융합되어 있다. 세포들은 우라실(uracil)이 결핍된(pMF28) 또는 트립토판(tryptophane)이 결핍된(pMF25) 100 ㎖의 최소배지(minimal medium)에서 배양되었으며, 유일한 탄소원(sole carbonsource)으로서 갈락토스(galactose) 또는 글루코스(glucose)를 사용하였다. 경우에 따라서는 류신(leucine)이 결핍된 최소배지에서 세포들의 생장을 30시간 동안 억제시키기도 하였다. 선형 수크로스 농도구배(linear sucrose gradient, 7-47%) 원심분리를 이용하여 세포 분획들(fractions)을 분리하고, 그들의 Gam1p 단백질 함량을 SDS-PAGE 및 항-헤마글루티닌 항체를 이용한 웨스턴 블로팅(Western blotting)으로 분석하였다. 특정한 표지 단백질의 존재로서 부세포구획들(subcellular compartments)을 확인하였다. 표지 단백질로는 돌리콜 포스페이트 만노스 신타제(dolichol phosphate mannose synthase, Dpm1p-endoplasmic reticulum), 올리고사카릴 트랜스퍼라제(oligosaccharyl transferase, Och1p-early Golgi), ATPase(Pmr1p-medial Golgi) 및 엔도프로테아제(endoprotease, Kex2p-late Golgi)를 사용하였다.

도 3은 S.세레비시애 균주의 배양 상등액과 세포벽 분획에서의 Gam1p 활성을 나타내는 그래프이고,

상기에서 사용된 세포들은 트립토판이 결핍된 또는 트립토판과 류신이 결핍된 20 ㎖의 SG 배지에 접종되었다.CDC33을 코딩하는 DNA를 지닌 플라스미드를 포함하고 있는 슈퍼트랜스포먼트(supertransformants)는 우라실(uracil)이 결핍된 배지에서 배양되었다. 상기 세포들을 지수증식기(stationary phase)에 이를 때까지 생장시켰으며, 그 후실시예 3에서 설명된 방법에 따라 글루코아밀라제(glucoamylase) 활성을 측정하였다. 활성도는 적어도 3회 반복하여그 결과들의 평균값으로 결정하였다.

도 4는 S.세레비시애 균주의 배양 상등액과 세포벽 분획에서의 Gam1p 활성을 나타내는 그래프이고,

모든 조건은도 3에서와 동일하다. 형질전환된 균주는 대조군으로서CMK2를 코딩하는 플라스미드를 지닌다.

도 5는CMK2및CDC33을 과도하게 발현하는 S.세레비시애 균주에서의 Gam1p 당화 정도를 나타내는 전기영동 사진이고,

상기 균주는도 2의 설명에서와 같은 방법으로 배양되었으며, 이들의 부세포 분획에서의 Gam1p 함량을 측정하였다.CMK2가 과발현되는 균주에서는 대부분의 Gam1p 단백질이 과당화(hyperglycosylation)되지 않은 것으로 나타났다.

도 6은CMK2를 과도하게 발현하는 한세눌라 폴리모르파(Hansenula polymorpha) 균주에서의 피타제(phytase) 당화 정도를 나타내는 전기영동 사진이고,

피타제를 생산하는 H.폴리모르파 세포들을 S.세레비시애로부터 유래된GAL1프로모터의 조절을 받는, S.세레비시애로부터 유래된CMK2유전자를 포함하고 있는 플라스미드로 형질전환 시켰다. 형질전환된 상기의 세포들은 글리세린배지(glycerin medium, 5% glycerin, 0.1 M PO₄, pH 5.0)에서 배양되었다. 분비된 피타제 단백질을 SDS-PAGE로 분석하였으며, Endo H를 처리하여 탈-당화된(deglycosylated) 분비 산물과 비교하였다. 전기영동 사진에서는 본래의 피타제-생산 균주에서 분비된 피타제와GAL1프로모터를 지닌CMK2컨스트럭트(construct)를 포함하고 있는 형질전환체에서 분비된 피타제를 비교하여 보여준다. 형질전환체에서는 고당화(hyperglycosylatio n)의 정도가 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

레인 2, 4, 6, 8, 10 : Endo H로 전처리한 피타제 샘플,

레인 1, 3, 5, 7, 9 : 전처리하지 않은 피타제 샘플,

레인 1-4 : 형질전환된 세포에서 분비된 피타제(2 배양 상등액),

레인 5-10 : 본래의 피타제-생산 균주에서 분비된 피타제(3 배양 상등액),

레인 11 : 분자량을 나타내는 마커; 위쪽의 밴드는 66.3 kDa, 아래쪽의 밴드는 55.4 kDa를 나타낸다.

도 7의A는 목적하는 재조합 단백질의 효과적인 분비 또는 고당화를 감소시키는데 적합한 숙주세포의 플라스미드 구조를 나타내는 모식도이고,

도 7의B는 숙주세포의 생장 저해를 탈억제(derepression) 시킬 수 있는 핵산 분자를 확인하기에 적합한 숙주세포의 플라스미드 구조를 나타내는 모식도이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

사카로미세스 세레비세애 균주( Saccharomyces cerevisiae strains)

균주(Strain)	유전형(Genotype)	참고사항(Reference)
JD52	MATα,Leu2-3,112,trp1-Δ63,ura3-52, his3-Δ200, lys2-801, cir+	Dohmen et al., 1995
MF9	MATα,Leu2-Δ1100,112,trp1-Δ63,ura3-52, his3-Δ200, lys2-801, cir°	하기 참조

상기 S.세레비시애의 JD52 균주에서,LEU2의 ORF는 기능적인LEU2분절을 이용한 유사재조합(homologous recombination)에 의해 재조립(restore)되었다. 기능적LEU2분절은SalⅠ-XhoⅠ 분절로서 pUC/LEU#5로부터 얻었다. 재조립된LEU2유전자는 -407에서 +748까지의 부분이 결실되어 있다. 내생의(endogenous) 2 μ DNA는 에른하르트와 홀렌버그(Erhart and Hollenberg, 1983)의 방법을 사용하여 제거되었으며, 그 결과로 MF9 균주를 얻었다.

플라스미드(Plasmids)

플라스미드	DNA 서열이 포함된 컨스트럭션	참고사항
pJDcPG-15	CEN/ARS 플라스미드,GAM1발현 카세트인URA3포함	Dohmen, 1989
pJDaG-15	TRP1/ARS플라스미드, GAM1 발현 카세트 포함	Dohmen, 1989
pJDB219	완전한 2 μLEU2dE.콜라이 셔틀 벡터	Beggs, 1981
pRS316	CEN/ARS,URA3	Sikorski andHieter, 1989
pUC19	E.콜라이 클로닝 벡터	Sambrooket al., 1989
pUC/LEU#5	LEU2유전자를 포함하는 게노믹SalⅠ/KhoⅠ 분절을 지닌 pUC19	J. Dohmen,출판되지 않음
pMF23	BglⅡ-PstⅠ을 사용하여 pJDaG-15로부터 ARS 요소를 제거. 양쪽 말단은 T4 폴리머라제를 사용하여 플라스미드를 다시 결합시킴.EcoRⅠ을 이용한 부분적 분해로 pJDB219로부터 2 μLEU2d를 얻어EcoRⅠ 제한효소 부위로 라이게이트 시킴.	2μTRP1/LEU2d발현 플라스미드를P _PDC1 프로모터의 조절을 받도록 하기 위한 것임.
pMF25	PCR 산물인 MF238/246(GAM1) 및 MF247/248 (GAM1종결자)에SacⅠ-KpnⅠ과XbaⅠ-NotⅠ을 각각 처리. pJD307로부터KpnⅠ-XbaⅠ 분절로서 얻은 HA₂에피토프(Dohmen et al., 1995)를SacⅠ-KpnⅠ 분절 및XbaⅠ-NotⅠ 분절과 함께SacⅠ/NotⅠ부위를 지닌 pMF23 플라스미드로 라이게이트 시킴.	C-말단에 이중 HA 에피토프를 가지는 글루코아밀라제를 코드하도록 하기 위한 것임.
pMF28	pMF25의SacⅠ/NotⅠ 분절을 pJDcPG-15로 다시 클로닝.	GAM1을 위한 "단일-복사" 발현 플라스미드를 위한 것임.

방법(Methods)

배지(Media)

사카로미세스 세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)를 위한 배지:

YPD 완전배지(full medium) 1% 효모 추출물(yeast extract); 2% 펩톤

(peptone); 2% 포도당(glucose)

YPGal 완전배지 1% 효모추출물; 2% 펩톤; 2% 갈락토스

SD 최소배지(minimal medium) 6.7 g/ℓ효모 니트로젠 베이스 w/o 아미노

산; 2% 포도당; 50 mM 시트레이트 pH 4.5

SG 최소배지 SD 최소배지와 동일, 단, 2% 포도당 대신

2% 갈락토스 포함

선별과정에 따라 하기의 요소들을 첨가한다.

히스티딘(histidine) 및 메티오닌(methionine) 각 0.01 g/ℓ; 아르기닌(arginine) 0.02 g/ℓ; 리신(lysin) 및 트립토판(tryptophane) 0.04 g/ℓ; 트레오닌(threonine) 0.05 g/ℓ; 류신(leucine), 이소류신(isoleucine) 및 페닐알라닌(phenylalanine) 0.06 g/ℓ; 우라실(uracil) 40 ㎎/ℓ; 아데닌(adenine) 20 ㎎/ℓ

고체배지(solid culture media)의 경우는 추가로 1.8%의 한천(agar)이 첨가되었다. 경우에 따라서는 0.5%의 수용성 전분(soluble starch)이 첨가되기도 한다(Zulkowsky, Merck). 효모세포들은 일반적으로 30℃에서 배양되었다.

에스체리시아 콜라이(Eschrichia coli)를 위한 배지:

LB 배지 1% 트립톤(tryptone); 0.5% 효모추출물; 1% NaCl

SOC 배지 2% 트립톤; 0.5% 효모추출물; 20 mM 포도당; 10

mM NaCl; 2.5 mM KCl; 10 mM MgCl₂; 10 mM MgSO₄;

pH 7.5

M9 최소배지 Na₂HPO₄×7H₂O 12.8 g/ℓ; KH₂PO₄3 g/ℓ; NaCl

0.5 g/ℓ; NH₄Cl 1 g/ℓ

고체배지의 경우는 추가로 1.8%의 한천이 첨가되었다. 플라스미드를 포함하고 있는 세포들을 선별하기 위하여 120 ㎎/ℓ의 앰피실린(ampicillin)을 배지에 첨가하였다. 세균 세포들은 일반적으로 37℃에서 배양되었다.

<실시예 1> S.세레비시애 숙주세포 내에서 이종 단백질의 분비에 영향을 주는 유전자를 확인하는 시스템 제조

플라스미드 pJDaG-15 및 pJDB219(Dohmen, 1989; Beggs, 1981)로부터 pMF23으로 표기되는 2 μ 플라스미드를 얻었다. 이 플라스미드는도 1에 그 구조가 나타나 있으며, 완전한 2 μ DNA 및PDC1프로모터와 융합되어 있는, S.옥시덴탈리스로부터 유래된GAM1서열을 포함하고 있다. 또한, 선별 마커(selection markers)들인TRP1과LEU2d도 포함하고 있다.LEU2d는LEU2유전자의 대립유전자로서, 프로모터의 주요한 부위가 결실되어 있기 때문에 그 발현이 약하게 나타난다. 상기 두 개의 선별 마커는 선별 압력(selection pressure)을 다양하게 함으로써, S.세레비시애의 MF9 균주에 도입된 플라스미드의 카피 수(copy number)에 영향을 줄 수 있다. 즉,LEU2d선별 조건하에서는 도입된 플라스미드의 아주 많은 수의 카피를 얻을 수 있는 반면에,TRP1선별 조건하에서는 많은 수이기는 하지만LEU2d조건에 비해서는 적은 수의 카피를 얻을 수 있다.LEU2d선별 조건하에서, 상기에서 언급된 플라스미드로 형질전환된 재조합 균주는 따라서PDC1프로모터의 전사 조절을 받는 GAM1 유전자의 비교적 많은 수의 카피를 지니게 된다. 포도당을 함유한 배지에서 생장하는 경우PDC1프로모터는 강한 활성을 가지는 반면, 갈락토스가 함유된 배지에서는 낮은 활성을 보인다.LEU2d선별 조건에서 생장하는 형질전환체는 포도당 또는 갈락토스가 함유된 배지에서 모두 생장이 가능하다. 상기의 세포들을 효소적으로 불활성인 글루코아밀라제를 코딩하는 플라스미드로 형질전환된 형질전환체와 비교해 본 결과,LEU2d선별 조건에서 관찰되는 생장 저해는 글루코아밀라제의 효소 활성 때문이 아니라 재조합 효소의 과도한 생산에 의한 분비 스트레스(secretory stress) 때문이라는 것이 확인되었다. 상기의 사실은 덜 가혹한 조건하에서 Gam1p 생산이 효소를 소포체(endoplasmic reticulum) 및 골지체(cis-Golgi)에 축적시킨다는 관찰을 통해서 다시 한 번 증명되었다(도 2).

상기의 형질전환체들을 S.세레비시애 cDNA 유전자 은행의 클론된 DNA 서열로 다시 형질전환 시켰다. S.세레비시애로부터 유래한 cDNA 유전자 은행이 상기의 목적을 위하여 사용되었으며,GAL1프로모터의 조절을 받도록 CEN/ARS 벡터로 클로닝 되었다(Liu et al., 1992; Ausubel et al., 1987). S.세레비시애 균주들은 비-선별배지(non-selective medium, YPD) 또는 최소배지에서 배양되었다. 선별 조건하에서 글루코아밀라제를 다시 분비할 수 있게된 균주에는 생장 저해를 극복할 수 있도록 해 주며 분비를 제한하는 DNA 분절이 통합되어 있다. Gam1p를 과도하게 생산하는 숙주 균주의 생장 저해를 극복한 형질전환체로부터 얻은 플라스미드를 대상으로 DNA 서열을 분석하였다.

본 발명의 조건하에서 얻어진 글루코아밀라제 단백질을 모든 조건은 동일하지만 CMK2 및/또는 CDC33을 포함하는 벡터 대신에 빈 벡터(empty vector)를 사용한 대조군에서 얻어진 글루코아밀라제와 비교하였으며, 분비산물의 당화 양상과 같은 2차 변형을 평가하였다.

<실시예 2> Gam1p를 과생산하는 S.세레비시애 균주의 생장 저해를 탈억제하는 S.세레비시애 유전자의 확인

MF9:pMF23 균주를 상기에서 언급된 cDNA 유전자 은행을 이용하여 형질전환 시켰다. 420,000개의 형질전환체를 트립토판 및 우라실이 결핍된 SG 플레이트에서 2일 동안 생장시켰다. 상기에서 얻어진 콜로니들을 레플리카 플레이팅(replica plating)법을 이용하여 류신, 트립토판 및 우라실이 결핍된 SG 플레이트로 복제하였다. 그 결과, 320개의 류신-영양요구성 클론을 얻었으며, 그 중 66개의 클론은 탄소원에 따라서 다른 성장 현상(갈락토스에서는 성장, 포도당에서는 성장하지 못함)을 보였다. 글루코아밀라제의 분비는 모든 클론에서 관찰되었다. 가장 빠른 성장을 보이는 55개 클론의 cDNA 인서트(inserts)를 PCR 증폭(amplification)으로 분석하였다. 서로 다른 크기의 8 종류의 cDNA가 관찰되었는데, 그 중의 3개는 여러 클론에 존재하는 것이 확인되었다. 총 13개의 플라스미드가 분리되어 DNA 서열이 분석되었다. 분리된 DNA 서열은 각각의 서열을 MF9:pMF23 균주에 다시 형질전환시킴으로써 생장저해에 대한 탈억제 효과를 가진다는 것이 확인되었다. 서열들간의 상동성은 서열 데이터베이스의 데이터와 비교하여 결정되었다. 상기 서열들 중에서CDC33서열은 4번에 걸쳐,CMK2서열은 3번에 걸쳐 존재하였다.CDC33은 mRNA의 5'-캡 구조에 결합함으로써 "캡 결합 복합체(cap binding complex)"의 형성에 필수적인 역할을 하는 부분을 코드한다(Sonenberg, 1996). Gam1p의 분비효율을 숙주세포가 원래 분비하는 Gam1p의 분비효율과 비교하였으며, 분비 산물의 당화 양상도 분석하였다.

<실시예 3> S.세레비시애 CDC33 유전자를 과발현하는 균주에서의 Gam1p 생산

재조합 균주인 MF9:pMF23을GAL1프로모터의 조절을 받는, S.세레비시애로부터 유래된CDC33을 코딩하는 서열을 포함하고 있는 플라스미드인 pCDC33으로 형질전환 시켰다. 원래의 균주 및 다시 형질전환된 균주를 트립토판이 결핍된배지(TRP1selection) 또는 트립토판 및 류신이 결핍된 배지(TRP1andLEU2dselection) 20 ㎖에서 30℃로 정지기(stationary phase)에 도달할 때까지 배양하였다.

재조합 균주에서 분비된 글루코아밀라제의 활성을 효모세포가 새로이 획득한 전분을 분해하는 능력을 이용하여 측정하였다. 따라서, 상기의 세포가 생장하는 플레이트에는 0.5%의 수용성 전분이 포함되도록 하였다(Zulkowski, Merck, Darmstadt). 생장이 끝난 후, 플레이트를 요오드 결정(iodine crystals)으로 처리하여 옥화시켰다(iodized). 붉은색의 배경에서 나타난 무색환의 지름을 측정하여 분비된 글루코아밀라제의 양을 결정하였다. 다른 균주들에서의 글루코아밀라제 활성을 더 정확하게 결정하기 위하여, 전분을 기질로 하여 형성되는 포도당의 양을 측정하였다(Dohmen et al., 1990; Gellissen et al., 1991). 포도당의 측정에는 "포도당 테스트 키트(glucose test kit, Merck, Darmstadt)를 사용하였으며, 제조자의 매뉴얼에 따라 실험을 수행하였다. 글루코아밀라제의 활성은 배양 상등액과 세포벽 분획에서 측정하였다. 또한, 지수증식기에 있는 세포로부터 얻어진 총세포추출물(whole cell extracts)에서의 효소활성도 측정하였다. 효소 활성도는 적어도 3회 반복한 결과를 평균하여 결정되었다(표 3).

균주(strain)	선별조건	OD₆₀₀	배양상등액에서의 활성(units/ℓ)	세포벽 분획에서의 활성(units/ℓ)	총세포추출물에서의 활성(units×10^-3/g 단백질)
MF9:pMF23	TRP1	5.0	122.0±18.6	256.3±14.9	54.7±8.4
MF9:pMF23pCDC33	TRP1	5.0	292.9±34.5	237.1±15.0	53.2±2.5
MF9:pMF23pCDC33	LEU2d	4.5	841.8±12.0	350.1±27.7	n.d.

n.d.: 결정되지 않음

CDC33유전자의 과도한 발현은TRP1선별의 경우 글루코아밀라제의 생산을 2.5배 증가시켰으며,LEU2d선별의 경우 7배 증가시켰다(도 3).

<실시예 4> S.세레비시애 CMK2 유전자를 과발현하는 균주에서의 Gam1p 생산

재조합 균주인 MF9:pMF23을GAL1프로모터의 조절을 받는, S.세레비시애로부터 유래된CMK2를 코딩하는 서열을 포함하고 있는 플라스미드인 pCMK2로 형질전환 시켰다. 원래의 균주 및 다시 형질전환된 균주를 트립토판이 결핍된 배지(TRP1selection) 또는 트립토판 및 류신이 결핍된 배지(TRP1andLEU2dselection) 50 ㎖에서 30℃로 정지기(stationary phase)에 도달할 때까지 배양하였다. 글루코아밀라제의 활성은 배양 상등액과 세포벽 분획에서 측정하였다. 또한, 정지기에 있는 세포로부터 얻어진 총세포추출물(whole cell extracts)에서의 효소활성도 측정하였다. 효소 활성도는 적어도 3회 반복한 결과를 평균하여 결정되었다(표 4).

균주(strain)	선별조건	OD₆₀₀	배양상등액에서의 활성(units/ℓ)	세포벽 분획에서의 활성(units/ℓ)	총세포추출물에서의 활성(units×10^-3/g 단백질)
MF9:pMF23	TRP1	5.0	122.0±18.6	256.3±14.9	54.7±8.4
MF9:pMF23pCMK2	TRP1	5.0	341.8±5.0	254.4±24.6	56.1±15.3
MF9:pMF23pCMK2	LEU2d	4.5	781.4±12.0	470.4±19.7	n.d.

n.d.: 결정되지 않음

CMK2유전자의 과도한 발현은TRP1선별의 경우 글루코아밀라제의 생산을 3배 증가시켰으며,LEU2d선별의 경우 6.4배 증가시켰다(도 4).

<실시예 5> CDC33 및 CMK2 유전자를 과발현하는 재조합 S.세레비시애 균주에서 Gam1p의 당화 정도

Gam1p단백질은 분자량이 140 kDa 이상인 효소이다. 아미노산 서열로 계산된 분자량은 140 kDa이며, 실제로는 당화(N- 및 O-linked glycosylation)로 인하여 분자량에 차이가 생길 수 있다. Gam1p를 N-연결 당 단위체를 제거하는 효소인 PNGase F로 처리하면 분자량이 120 kDa로 감소된다. 본 실험에서는 원래의 S.세레비시애 균주에서 생산된 Gam1p 단백질과CDC33및CMK2유전자를 과발현하는 형질전환체에서 생산된 Gam1p 단백질을 비교하였다. 상기의 목적을 위하여, C-말단에 HA 마커를 가진 글루코아밀라제를 준비하여 세포분획의 이종 단백질을 웨스턴 블롯분석법을 이용하여 면역학적으로 확인하였다. 세포 배양액을 가볍게 분쇄(gentle homogenization)시켜 세포 추출물을 얻고, 당 농도구배 원심분리(sucrose density gradient centrifugation)하여 세포 분획들을 수득하였다. 다양한 세포 구획(cellular compartments)들을 특정 부세포 분획(subcellular fractions)에 특이적인 표지 효소들(marker enzymes)을 이용하여 확인하였다(도 2). 이종 Gam1p 단백질의 크기와 존재여부를 SDS-PAGE로 확인하였다(Laemmli, 1970). 분리된 폴리펩티드를 PVDF 막으로 전이(transfer)시키고(Schleicher and Schuell) HA 에피토프(BabCo)에 특이적인 항체를 처리하였다.CMK2유전자가 과도하게 발현되는 균주에서, Gam1p 단백질은 분자량 140 kDa 및 104 kDa를 갖는 두 분자로 구성되어 있다. 이는CMK2유전자의 발현으로 인해, 변형되지 않은 아미노산 사슬(amino acid chain)의 분자량과 상응하는 분자량을 갖는 재조합 단백질이 생산되었다는 것을 보여주는 것이다. 이러한 효과는CDC33유전자가 과발현되는 균주에서는 관찰되지 않았다.

상기의 결과는CMK2유전자의 과발현이 분비의 증가 및 당화의 감소를 유도하였다는 것을 증명하는 것이다. 반면에,CDC33유전자의 과발현은 분비의 증가만을 유도하였다. 이 경우 당화의 정도에는 변화가 없었다(도 5).

<실시예 6> S.세레비시애의 CMK2 유전자를 과발현하는 H.폴리모르파 균주에서 재조합 피타제의 당화 정도

이종 단백질의 당화에 미치는CMK2유전자의 영향을 피타제를 생산하는 H.폴리모르파 균주에서 분석하였다(Mayer et al., 1999). 상기의 균주는 게놈과 통합되어 있는, 발현 조절을 위해 H.폴리모르파의 FMD 프로모터와 융합되어 있는 피타제를 코딩하는 서열을 가진 40 카피의 피타제 발현 플라스미드를 포함하고 있다. 여러 피타제의 변형(variants)들은 모두 분자량 55 kDa 크기의 아미노산 서열로 구성되어 있다. 단백질의 고당화(hyperglycosylation)는 이 크기를 60 kDa에서 110 kDa 사이로 변화시킨다. 생산 균주는 S.세레비시애의GAL1프로모터의 조절을 받거나 또는 H.폴리모르파의 FMD 프로모터의 조절을 받는, S.세레비시애로부터 유래된CMK2유전자를 지닌 플라스미드로 형질전환된 것이다. 상기의 형질전환체들에서 분비된 피타제의 당화 정도를 SDS-PAGE로 비교 분석하였다. 그 결과, 두 경우 모두에서 고당화 현상이 감소되는 것을 확인하였다. 단백질 밴드는 서로 다른 분자량을 가진 여러 개의 밴드가 나타나는 대신에 뚜렷한 크기의 밴드로 나타났다(도 6).

참고문헌(Cited literature):

- Altmann and Trachsel, Nuc. Acid Res. 17, 5923 (1989)

- Ausubel et al. (eds), Current protocols in molecular biology,

Wiley & Sons, New York (1987)

- Beggs, Molecular genetics in yeast, von Wettstein et al. eds., Munksgaard,Copenhagen (1981)

- Brenner et al., Mol. Cell. Biol.8, 3556 (1988)

- Dohmen, PhD thesis, Heinrich-Heine-Universitat Dusseldorf (1989)

- Dohmen et al., Gene 95, 111 (1990)

- Dohmen et al., J. Biol. Chem. 270, 18099 (1995)

- Erhart and Hollenberg, J. Bact. 156, 625 (1983)

- Gellissen et al., Biotechnology 9, 291 (1991)

- Gellissen and Hollenberg, Gene 190, 87 (1997)

- Giga-Hama and Kumagai, "Foreign gene expression in fission yeast Schizosaccharomyces pombe", Springer, Berlin (1997)

- Hinnen et al., Gene expression in recombinant microorganisms, Smith, ed., Marcel Dekker, N.Y., 121 (1994)

- Hollenberg and Gellissen, Curr. Opin. Biotechnol. 8, 554 (1997)

- Johnston & Davis, Mol.Cell. Biol. 4 (8), 1440 (1984)

- Laemmli U, Nature 227, 680 (1970)

- Liu et al., Genetics 132, 665 (1992)

- Mayer et al., Biotechnol. Bioeng. 63, pp. 373-381 (1999)

- Ohya et al., J. Biol. Chem. 266, 12784 (1991)

- Pausch et al., EMBO J. 10, 1511 (1991)

- Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 2444 (1988)

- Sakei et al., Genetics 129, 499 (1988)

- Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning - A Laboratory Handbook, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)

- Shulman, Curr. Opin. Cell Biol. 5, 247 (1993)

- Shusta et al., Nature/Biotechnology 116, 773 (1998)

- Sikorski & Hieter, Genetics 122, 19 (1989)

- Smith et al., Science 229, 1219 (1985)

- Sonenberg, Translational control, Mathews et al. eds, Cold Spring Harbour, N.Y. (1996)

- WO98/13473

Claims

하기의 단계들로 구성되는 재조합 분비 단백질의 생산방법:

a) 분비 단백질을 코딩하는 핵산 서열과 진핵 번역 시작 인자 4E(eukaryotic translation initiation factor 4E, eIF4E)의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드 및/또는 CaM 키나제(Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase)의 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열 그리고 P1 프로모터의 조절을 받는 eIF4E 또는 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 적합한 숙주 세포에서 동시에 발현시키는 단계;

b) 숙주 세포로부터 단백질을 분비시키는 단계, 및

c) 분비된 단백질을 회수하는 단계.
제 1항에 있어서, 핵산은 eIF4E의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하며, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법:

ⅰ) 사카로미세스 세레비시애(CDC33)의 eIF4E를 코딩하는 핵산;

ⅱ) eIF4E의 생물학적 활성을 가지는 eIF4E 유사체(homologue)를 코딩하는 핵산;

ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅳ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅲ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅴ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅳ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.
하기의 단계들로 구성되는 재조합 단백질의 생산 방법:

a) 재조합 단백질을 코딩하는 핵산과 CaM 키나제(Ca2+/ calmodulin-dependent protein kinase)의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산,즉 P1 프로모터의 조절을 받는 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 적합한 숙주 세포에서 동시에 발현시키는 단계;

b) 단백질을 수득하는 단계.
제 1항 내지 3항 중 적어도 하나에 있어서, 핵산은 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하며, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법:

ⅰ) 사카로미세스 세레비시애(CMK2)의 CaM 키나제를 코딩하는 핵산;

ⅱ) CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 CaM 키나제 유사체(homologue)를 코딩하는 핵산;

ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅳ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅲ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅴ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅳ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.
제 1항 내지 4항 중 적어도 하나에 있어서, 적합한 숙주세포는 식물 세포(plant cell), 동물 세포(animal cell), 효모 세포(yeast cell), 곰팡이 세포(fungal cell) 또는 점액곰팡이 세포(slime fungus cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 5항 중 적어도 하나에 있어서, 동물 세포는 포유동물 세포 또는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 6항 중 적어도 하나에 있어서, 효모 세포는 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 속, 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 피치아(Pichia)속, 스와니오미세스(Schawanniomyces) 속, 칸디다(Candida) 속 및 야로위아(Yarrowia) 속의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 7항 중 적어도 하나에 있어서, 곰팡이 세포는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 뉴로스포라(Neurospora) 속, 리조푸스(Rhizopus) 속 및 트리코더마(Trichoderma) 속의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 8항 중 적어도 하나에 있어서, 점액곰팡이 세포는 딕티오스테리움(Dictyostelium) 속의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 9항 중 적어도 하나에 있어서, 프로모터 P1은 강력한 프로모터(strong promoter)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 제 10항 중 하나에 있어서, 프로모터는 유도가 가능한(inducible) 것을 특징으로 하는 방법.
제 1항 내지 11항 중 적어도 하나에 있어서, 분비 단백질은 피타제(phytase), 글루코아밀라제(glucoamylase), 포스파타제(phosphatase) 및 성장 인자(growth factors)로 구성된 군으로부터 선택될 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
숙주세포로부터 분비 단백질의 분비를 증가시키는 적어도 하나의, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 것을 특징으로 하는 핵산의 용도:

ⅰ) 사카로미세스 세레비시애(CDC33)의 eIF4E를 코딩하는 핵산;

ⅱ) eIF4E의 생물학적 활성을 가진 eIF4E 유사체를 코딩하는 핵산;

ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅳ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅲ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 eIF4E의생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅴ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅳ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.

ⅵ) 사카로미세스 세레비시애(CMK2)의 CaM 키나제를 코딩하는 핵산;

ⅶ) CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 CaM 키나제 유사체(homologue)를 코딩하는 핵산;

ⅷ) 상기 ⅵ) 또는 ⅶ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅸ) 상기 ⅵ) 항 내지 ⅷ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅹ) 상기 ⅵ) 항 내지 ⅸ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.
제 13항에 있어서, 핵산은 벡터에 통합되는 것을 특징으로 하는 용도.
진핵세포로부터 재조합 분비 단백질의 분비를 증가시키는 단백질을 코딩하는 핵산을 확인하는, 하기의 단계들로 구성되는 방법:

a) 분비 표지 단백질(secretory marker protein)을 코딩하며 P2 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는 핵산을 포함하는 재조합 숙주 세포(recombinant host cells)를 준비하는 단계, 이 경우 숙주세포는 분비 표지 단백질의 생산에 의하여 성장이 저해되며 어떤 유기체에서 유래된 DNA 분절을 가진 발현벡터를 포함하는 재조합 숙주세포는 적합한 프로모터의 조절을 받게 된다;

b) 발현벡터의 존재를 선별할 수 있는 조건에서 재조합 숙주세포를 성장시키는 단계;

c) 생장에 대한 탈억제 현상(derepression)을 보이는 군집(colonies)을 선별하는 단계;

d) 생장에 대한 탈억제 현상을 보이는 군집의 발현벡터에 포함되어 있는 DNA를 분석하는 단계;

e) 재조합 숙주세포에서 발현되어 생장 저해에 대한 탈억제를 일으키는 핵산 서열을 확인하는 단계.
제 15항에 있어서, 재조합 숙주세포는 식물 세포(plant cell), 동물 세포(animal cell), 효모 세포(yeast cell), 곰팡이 세포(fungal cell) 또는 점액곰팡이 세포(slime fungus cell)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 동물 세포는 포유동물 세포 또는 곤충 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 효모 세포는 사카로미세스(Saccharomyces) 속, 스키조사카로미세스(Schizosaccharomyces) 속, 클루이베로미세스(Kluyveromyces) 속, 한세눌라(Hansenula) 속, 피치아(Pichia) 속, 스와니오미세스(Schawanniomyces) 속, 칸디다(Candida) 속 및 야로위아(Yarrowia) 속의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 곰팡이 세포는 아스퍼질러스(Aspergillus) 속, 뉴로스포라(Neurospora) 속, 리조푸스(Rhizopus) 속 및 트리코더마(Trichoderma) 속의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 16항에 있어서, 점액곰팡이 세포는 딕티오스테리움(Dictyostelium) 속의 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 20항 중 적어도 하나에 있어서, 표지 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 유도될 수 있는 프로모터(inducible promoter)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 21항에 있어서, 유도될 수 있는 프로모터는PDC1프로모터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 21항 및/또는 22항에 있어서, 재조합 숙주세포는 유도된 조건(inducedconditions)하에서 생장하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 23항 중 적어도 하나에 있어서, 분비 표지 단백질을 코딩하는 핵산은 많은 카피수를 가진 플라스미드에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 24항 중 적어도 하나에 있어서, 제 15항의 단계 a)에서 사용되는 DNA 분절들은 cDNA 유전자 은행으로부터 얻어진 것임을 특징으로 하는 방법.
제 25항에 있어서, cDNA 유전자 은행은 S.세레비시애 유래인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 24항 중 적어도 하나에 있어서, 제 15항의 단계 a)에서 사용되는 DNA 분절들은 게노믹 유전자 은행으로부터 얻어진 것임을 특징으로 하는 방법.
제 15항 내지 27항 중 적어도 하나에 있어서, 제 15항 단계 a)의 다른 유기체로부터 유래된 DNA 분절들을 포함하고 있는 발현벡터는 CEN/ARS 벡터인 것을 특징으로 하는 방법.
제 15 내지 28항 중 적어도 하나에 있어서, 분비 표지 단백질은 글루코아밀라제인 것을 특징으로 하는 방법.
제 29항에 있어서, 글루코아밀라제를 코딩하는 핵산 서열은 S.옥시덴탈리스(S.occidenralis) 유래의GAM1P서열인 것을 특징으로 하는 방법.
분비 표지 단백질을 코딩하며 프로모터 P2의 조절을 받는 핵산을 포함하는, 표지 단백질을 코딩하는 유전자의 발현에 의해 세포의 생장이 저해되는 재조합 숙주세포를 생장 저해에 대한 탈억제(derepression)를 나타내는 핵산 서열의 확인에 이용하는 용도.
재조합 과정에 의해 세포내로 삽입되는, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 숙주세포:

ⅰ) 사카로미세스 세레비시애(CDC33)의 eIF4E를 코딩하는 핵산;

ⅱ) eIF4E의 생물학적 활성을 가진 eIF4E 유사체를 코딩하는 핵산;

ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅳ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅲ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅴ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅳ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.

ⅵ) 사카로미세스 세레비시애(CMK2)의 CaM 키나제를 코딩하는 핵산;

ⅶ) CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 CaM 키나제 유사체(homologue)를 코딩하는 핵산;

ⅷ) 상기 ⅵ) 또는 ⅶ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅸ) 상기 ⅵ) 항 내지 ⅷ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅹ) 상기 ⅵ) 항 내지 ⅸ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.
하기의 군으로 구성되는 것을 특징으로 하는 키트(kit):

(a) eIF4E의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하며 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 핵산을 지닌 발현벡터:

ⅰ) 사카로미세스 세레비시애(CDC33)의 eIF4E를 코딩하는 핵산;

ⅱ) eIF4E의 생물학적 활성을 가진 eIF4E 유사체를 코딩하는 핵산;

ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅳ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅲ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅴ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅳ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.

및

(b) 단백질의 분비에 적합한 숙주세포.
하기의 군으로 구성되는 것을 특징으로 하는 키트:

(a) CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하며 프로모터와 기능적으로 연결되어 있는, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 핵산을 지닌 발현벡터:

ⅰ) 사카로미세스 세레비시애(CMK2)의 CaM 키나제를 코딩하는 핵산;

ⅱ) CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 CaM 키나제 유사체(homologue)를 코딩하는 핵산;

ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅳ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅲ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅴ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅳ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.

및

(b) 단백질의 분비 및/또는 당화에 적합한 숙주세포.
하기의 군으로 구성되는 것을 특징으로 하는 키트:

(a) CaM 키나제 및/또는 eIF4E의 생물학적 활성을 가지는 폴리펩티드를 코딩하며, 하기의 군으로부터 선택될 수 있는 핵산 중 적어도 하나를 하나를 지닌 적어도 하나의 발현벡터:

ⅰ) 사카로미세스 세레비시애(CDC33)의 eIF4E를 코딩하는 핵산;

ⅱ) eIF4E의 생물학적 활성을 가진 eIF4E 유사체를 코딩하는 핵산;

ⅲ) 상기 ⅰ) 또는 ⅱ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅳ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅲ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 eIF4E의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅴ) 상기 ⅰ) 항 내지 ⅳ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.

ⅵ) 사카로미세스 세레비시애(CMK2)의 CaM 키나제를 코딩하는 핵산;

ⅶ) CaM 키나제의 생물학적 활성을 가지는 CaM 키나제 유사체(homologue)를 코딩하는 핵산;

ⅷ) 상기 ⅵ) 또는 ⅶ) 항의 핵산으로부터 유전암호(genetic code)의 퇴화(degeneration), 결실(deletion), 삽입(insertion) 부가(addition) 및/또는 뉴클레오티드 교환(nucleotide exchange)에 의해 유래된 핵산으로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 핵산;

ⅸ) 상기 ⅵ) 항 내지 ⅷ) 항의 핵산 중 하나의 분절(fragment)로서 CaM 키나제의 생물학적 활성을 가진 폴리펩티드를 코딩하는 분절;

ⅹ) 상기 ⅵ) 항 내지 ⅸ) 항의 핵산과 상보적으로 혼성화(hybridization)될 수 있는 서열을 가진 핵산.

(b) 단백질의 분비 및/또는 당화에 적합한 숙주세포.
제 33항에 있어서, 재조합 단백질 및/또는 재조합 분비 단백질을 코딩하는 핵산의 클로닝에 적합한 빈 발현벡터(empty expression vector)를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 32항의 숙주세포 및 재조합 단백질 및/또는 재조합 분비 단백질을 코딩하는 핵산의 클로닝에 적합한 빈 발현벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.