KR20020042014A

KR20020042014A - 규조류로부터 분리한 자유라디칼 소거기능이 있는 화합물및 그 제조방법

Info

Publication number: KR20020042014A
Application number: KR1020000071702A
Authority: KR
Inventors: 최원철; 정해영; 손병화
Original assignee: 최원철; 정해영; 손병화
Priority date: 2000-11-29
Filing date: 2000-11-29
Publication date: 2002-06-05

Abstract

본 발명은 규조류로부터 분리한 자유라디칼 소거기능이 있는 화합물 및 그 제조방법에 관한 것으로, 본 발명은 해양미세조류의 규조류 (bacillariophycean)인 한치시아 마리나 (Hantzschia marina)로부터 분리한 본 발명 화합물 푸코키산틴을 여러 종류의 분광학 분석에 의해 그 화학구조를 결정한 후, DPPH (1,1-diphenyl- 2-picrylhydrazyl), 페록시나이트리트 (peroxynitrite; ONOO^-) 및 일산화질소 라디칼 (nitric oxide radical; ·NO)에 대한 소거활성을 조사한 결과, 강한 자유라디칼 소거활성이 관찰되었으며, 특히 일산화질소 라디칼 (nitric oxide radical; ·NO)에 대해서는 표준물질 (carboxy-PTIO)의 약 30배의 뛰어난 효과가 관찰되었다.

Description

규조류로부터 분리한 자유라디칼 소거기능이 있는 화합물 및 그 제조방법 {Free-radical scavenging compound isolated from Bacillariophycean and process for preparation thereof}

본 발명은 규조류로부터 분리한 자유라디칼 소거기능이 있는 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 해양미세조류의 규조류인 한치시아 마리나 (Hantzschia marina)를 CH₂Cl₂-MeOH을 사용하여 추출한 추출물에서 분리한 자유라디칼 소거활성이 우수한 화합물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

색소, 광합성 저장 산물 (photosynthetic storage product), 세포벽, 점액, 지방산 (fatty acid), 지방 (lipid), 유지 (oil), 스테롤 (sterol), 탄화수소 및 2차 대사산물을 포함하는 생물활성 화합물의 생화학적 다양성을 통하여 미세조류 (microalgae)의 계통발생학적 넓이를 추정할 수 있다 (Metting Jr, 1996).

푸코키산틴을 포함한 카로티노이드 (carotenoids)의 항산화 특성은 임상적, 영양학적 및 공업적 분야에서의 응용이라는 측면에서 관심을 받아왔다 (MettingJr, 1996). 규조 (Boczaret al., 1989), 홍조 (Palermoet al., 1991) 및 갈조 (Yanet al., 1999)에 푸코키산틴이 포함되어 있다는 것이 보고되었고, 푸코키산틴이 항산화작용 (Yanet al., 1999), 항암작용 (Nishino, 1995) 및 항돌연변이작용 (Nishino, 1998)등의 다양한 생물활성을 갖고 있다는 것이 보고되었다. 더 나아가, 푸코키산틴은 식용으로 사용되고 있는 갈조 톳 (Hizikia fusiformis)의 주요 항산화 성분으로서 (Yanet al., 1999), 산업적 이용을 위한 개발가치가 있는 것으로 생각된다.

본 발명에서는 노화방지제 개발에 초점을 맞추어, 해양 미세조류 (marine microalgae)로부터 새로운 생물활성이 있는 해양천연물질을 개발할 목적으로, DPPH, 페록시나이트리트 및 일산화질소 등의 자유라디칼 소거기능이 있는 화합물을 탐색하였다. 초기의 실험을 통하여 DPPH (Choiet al., 2000), 페록시나이트리트 (peroxynitrite, ONOO^-) (Sounget al., 1999) 및 일산화질소 라디칼 (nitric oxide radical, ·NO) (Nagataet al., 1999)에 대한 소거활성이 있는 해양 미세조류의 추출물들을 획득할 수 있었다. 이에, 본 발명자들은 해양 규조류인 한치시아 마리나로부터 알렌 및 에폭시 그룹을 가지고 있는 카로티노이드 (Allenic and epoxy carotenoid)인 푸코키산틴을 분리하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 규조인 한치시아 마리나 (Hantzschia marina)의 CH₂Cl₂-MeOH 추출물을n-hexane-EtOAc (100 %→0 %) 용매 실리카겔 컬럼 크로마토그래피한 분획 중 DPPH 제거능이 있는 활성분획을 MeOH 용매 역상 HPLC 처리하여 분리 및 동정하는 과정으로 구성된 자유라디칼 소거기능이 뛰어난 화합물의 제조방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 규조인 한치시아 마리나 (Hantzschia marina)의 CH₂Cl₂-MeOH 추출물로부터 분리 및 동정한 자유라디칼 소거활성 및 항산화활성이 우수한 화합물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 상기 목적은 규조인 한치시아 마리나 (Hantzschia marina)를 산소가스를 포화시킨 F/2배지에서 배양하여 수확한 조류를 CH₂Cl₂-MeOH 용매로 추출한 후 농축하고 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 DPPH 소거활성을 보인 분획을 다시 MeOH 용매 역상 HPLC 처리하여 본 발명 화합물을 획득하고 UV-visible, IR 스펙트럼,¹H- 및¹³C-NMR 분석을 통하여 본 발명 화합물 푸코키산틴의 화학구조와 분자식을 결정한 후 DPPH, 페록시나이트리트 및 일산화질소와 같은 라디칼에 대한 소거활성을 측정함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성을 상세히 설명한다.

본 발명은 분양받은 규조류 (Bacillariophycean)인 한치시아 마리나 (Hantzschia marina,strain #, KMCC B-37)를 산소가스를 포화시킨 f/2 배지에서 배양한 후 상기 조류를 원심분리, 여과 및 동결건조시키는 단계; 상기 조류를 CH₂Cl₂-MeOH (1:1)용매로 추출한 후 감압농축하여 획득한 추출물을n-hexane-EtOAc (100 %→0 %) 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 7개의 분획을 획득하는 단계; 상기 분획중 DPPH 소거활성을 보인 4번째 활성분획을 다시n-hexane-EtOAc (100 %→0 %) 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하고,n-hexane/EtOAc (1:1)을 용매로 하여 용출된 활성 분획을 MeOH 용매 역상 (reversed-phase) HPLC 처리하여 본 발명 화합물 푸코키산틴 (fucoxanthin)(화합물 [Ⅰ])을 순수 분리하는 단계; 상기 본 발명 화합물 [Ⅰ]의 UV-visible, IR 스펙트럼,¹H- 및¹³C-NMR 분석을 통하여 화학구조와 분자식을 결정하는 단계; 다양한 해양 미세조류중에서 규조류로부터 본 발명 화합물 푸코키산틴을 분리하는 단계; DPPH, 페록시나이트리트 SIN-1 및 일산화질소 (·NO) 라디칼에 대한 본 발명 푸코키산틴의 라디칼 제거능을 조사하는 단계로 구성된다.

광학적 회전도 (optical rotation)는 Perkin Elmer model 341 편광계 (polarimete)를 이용하여 조사하였으며, IR 스펙트럼 데이터는 Bruker FT-IR model IFS-88 spectrometer로 기록하였다. JEOL JNM-ECP 400 NMR spectrometer를 이용하여¹H (400 MHz) 및¹³C (100 MHz) 핵자기 공명 스펙트럼 (NMR spectrum)을 측정하였다. JEOL JMS-700 spectrometer로 MS 스펙트럼을 측정하였으며, UV-visible 스펙트럼은 Hitachi U-2001 UV-Vis spectrometer기로 측정하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 방법을 실시예를 들어 상세히 설명하고자 하지만 본 발명의 권리 범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 미세조류 한치시아 마리나 ( Hantzschia marina )로부터 푸코키산틴의 분리 및 물리화학적 특성 분석

본 발명자들은 카로티노이드계 화합물인 푸코키산틴을 규조류인 한치시아 마리나 (Hantzschia marina)로부터 처음으로 분리하였다.

제1단계 : 본 발명 규조 Hantzschia marina 의 배양

규조류 (Bacillariophycean)인 한치시아 마리나 (Hantzschia marina,strain #, KMCC B-37)를 부경대학교 수산과학연구소 (Institute of Fisheries Science, Pukyong National University)의 한국해양미세조류은행 (Korea Marine Microalgae Culture Center)으로부터 분양받아 사용하였다. 상기 규조를 산소가스 (여과된 공기, 0.3L/min)로 포화시킨 f/2 배지 [NaNO₃(150 mg), NaH₂PO₄(8.69 mg), Ferric EDTA (10.0 mg), MnCl₂(0.22 mg), CoCl₂(0.11 mg), CuSO₄·5 H₂O (0.0196 mg), ZnSO₄·7 H₂O (0.044 mg), Na₂SiO₃·9 H₂O (50.0 mg), Na₂MoO₄·2 H₂O (0.012 mg), vitamin B₁₂(1.0 ㎍), biotin (10.0 ㎍), thiamine·HCl (0.2 mg) per seawater (1 L)]를 이용하여 500Lux의 형광조명하 23℃에서 28일동안 배양하였다. 4주 후, 상기 조류의 배양액 20Ｌ를 원심분리하고 거름종이로 여과하여 얻은 잔사를 동결건조(lyophilization)시켰다.

제2단계 : 본 발명 화합물 푸코키산틴 (fucoxanthin)의 분리 및 물리화학적 특성

동결 건조한 상기 조류 (11.0 g)를 CH₂Cl₂-MeOH (1:1)을 용매로 하여 추출한 후 (r.t) 감압하에서 농축하여 용매를 제거함으로써 4.1 g의 추출물을 획득하였다. 추출물 1.0 g을n-hexane-EtOAc (100 %→0 %) 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 획득한 7개의 분획중에서 DPPH (1,1-diphenyl-2- picrylhydrazyl)에 대하여 소거활성을 보인 화합물을 포함하는 4번째 활성분획 (60 mg)을 다시n-hexane-EtOAc (100 %→0 %) 혼합용매를 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하였다.n-hexane/EtOAc (1:1)을 용매로 하여 용출된 상기 활성 분획을 MeOH 용매 역상 (reversed-phase) HPLC (YMC, ODS-A, 10 x 250 mm, 1 mL/min, detection at 445 nm)를 실시하여 본 발명 화합물 22 mg을 순수 분리하였다.

본 발명 화합물의 물리화학적 특성을 조사하였다. 본 발명 화합물은 밝은 오렌지색의 고체물질로, [α]_D+18°(c0.2, CHCl₃)의 광학활성을 보였다. 본 발명 화합물의 IR (KBr) 스펙트럼을 조사한 결과, 3438, 2361, 2332, 1723, 1654, 1605, 1251, 1030 cm^-1의 흡수시그날이 관찰되었는데, 3438cm^-1에서 수산기 (hydroxyl), 2361, 2332cm^-1에서 sp-혼성탄소 (allenic), 1723, 1251cm^-1에서 에스테르 (ester), 1654, 1605cm^-1에서 폴리엔 (polyene)에 기인하는 흡수시그날들이 관찰되었다. 본발명 화합물의 핵자기 공명 스펙트럼 데이터 분석결과를 표 1에 나타내었다.

본 발명 화합물의¹H-(δ, mult,J) 및¹³C-(δ, mult) NMR 데이터

C#	δ_H	δ_C	C#	δ_H	δ_C
1		35.2	(s)	1'		35.8	(s)
2	1.24(m), 1.46(m)	47.1	(t)	2'	1.35(m), 1.93(m)	45.5	(t)
3	3.80(m)	64.4	(d)	3'	5.37(m)	68.0	(d)
4	1.77(m), 2.29(m)	41.7	(t)	4'	1.46(m), 2.29(m)	45.3	(t)
5		66.2	(s)	5'		72.7	(s)
6		67.2	(s)	6'		117.5	(s)
7	2.58, 3.64(eachd,18.3)	40.8	(t)	7'		202.4	(s)
8		197.9	(s)	8'	6.04(s)	103.4	(d)
9		134.5	(s)	9'		132.5	(s)
10	7.14(d, 10.7)	139.1	(d)	10'	6.11(d, 11.5)	128.5	(d)
11	6.59(m)	123.4	(d)	11'	6.59(m)	125.7	(d)
12	6.59(m)	145.0	(d)	12'	6.33(d, 15.1)	137.1	(d)
13		135.4	(s)	13'		138.1	(s)
14	6.39(d, 11.5)	136.6	(d)	14'	6.73(dd, 14.2, 11.7)	132.5	(d)
15	6.25(d, 11.5)	132.2	(d)	15'	6.59(m)	129.4	(d)
16	0.94(s)	28.1	(q)	16'	1.33(s)	31.3	(q)
17	1.02(s)	25.1	(q)	17'	1.05(s)	32.1	(q)
18	1.20(s)	21.4	(q)	18'	1.37(s)	29.2	(q)
19	1.93(s)	11.8	(q)	19'	1.80(s)	14.0	(q)
20	1.98(s)	12.8	(q)	20'	1.98(s)	12.9	(q)
				Ac	2.03(s)	21.4	(q)
						170.4	(s)
[주] CDCl₃를 이용한 400MHz(¹H) 및 100MHz(¹³C)에서 기록하였다.화학적 이동 (chemical shift)의 기준은 TMS(δ=0 ppm) 및 CDCl₃(δ=77.0 ppm)각 수소 및 탄소의 귀속은 HMBC, HMQC, COSY, 및 DEPT로 결정하였다.

본 발명 화합물의¹H- 및¹³C-핵자기공명 스펙트럼 데이터 (NMR spectral data)를 분석한 결과, 본 발명 화합물은 아세틸 (acetyl), 공역 케톤 (conjugated keton), 두 개의 4차 같은자리 이메틸 (two quaternary geminal dimethyls), 두 개의 4차 산소 같은자리 메틸 (two quaternary geminal methyls of oxygen), 4개의올레핀 메틸 (four olefinic methyls) 및 알렌 작용기 (allene functionalities)를 포함하고 있었다. 상기 물리화학적 특성들은, 본 발명 화합물이 수산기 하나가 아세틸화된 카로티노이드 (carotenoid)계 화합물임을 보여준다. 이러한 결과는 UV/visible 스펙트럼 [468 nm (ε51,000) (sh), 446 (56,000), 332 (17,000), 267 (24,000)]과 잘 일치되고 있다. UV (MeOH): 468 nm (ε 51,000)(sh), 446 (56,000), 332 (17,000), 267 (24,000); 고분해능 EI-MS (LREIMS)를 측정한 결과, 분자이온 피크가m/z658 [(M⁺), rel. int. 3]에서 관찰되었으며, 그 외 640 [(M⁺-H₂O), 15], 580 [(M⁺-AcOH), 25], 562 [(580-H₂O), 3], 313 (2), 287 (24), 263 (24), 247 (55), 237 (36), 221 (100), 207 (50)에서 2차 분열 피크들이 관찰되었다. 푸코키산틴과 본 발명 화합물의 데이터를 비교한 결과, 본 발명 화합물은 모든 측면에서 (Palermoet al., 1991; Yanet al., 1999) 순수한 푸코키산틴의 특징을 나타내었다. 상기의 데이터를 기초로 하여 본 발명 화합물 [Ⅰ]을 푸코키산틴 (C₄₂H₅₈O₆)으로 결정하고 그 구조를 아래의 일반식 [Ⅰ]에 나타내었다.

실시예 2 : 해양 미세조류 (marine microalgae)에서 푸코키산틴의 분포

해양 미세조류 (marine microalgae) 30종의 각 배양액 20 L로부터 상기의 방법으로 배양 및 추출한 엑스를 대상으로 본 발명 화합물 푸코키산틴의 분포를 TLC [Merck, 60F₂₅₄precoated plate,n-hexane-EtOAc (1:1), R_f= 0.4] 및 HPLC (상기와 동일조건, t_R= 12.0 min)를 이용하여 분석하였다.

그 결과, 푸코키산틴 [Ⅰ]은 녹조류 (green alga)인 Chlorophyceae, 규조류 (diatom)인 Bacillariophyceae 및 남조류 (blue-green algae)인 Cyanophyceae 중에서 분석한 10종류의 규조류에서만 검출되었다. 따라서, 푸코키산틴 [Ⅰ]은 3종류의 해양미세조류를 과 (family) 레벨에서 분류하는 화학적분류 마커 (chemotaxonomic marker)로 이용될 수 있을 것이다 (Choiet al., 2000).

실시예 3 : 본 발명 화합물 푸코키산틴 [Ⅰ]의 자유라디칼 (Free radical :DPPH) 소거활성 분석 (scavenging activity assay)

최 등의 방법을 이용하여 (Choiet al., 2000) 상기 본 발명 화학물질 푸코키산틴의 자유라디칼 소거활성을 조사하였다.

상기 본 발명 푸코키산틴 [Ⅰ] 시료를 MeOH에 녹인 용액 160㎕을 96-well microtiter tray에 주입하고 각각의 well에 40㎕의 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) (1.5 x 10^-4M)을 첨가하였다. 혼합액을 잘 흔들어 준 후, 상온에서 30분간 방치시킨 다음, 흡광도 (absorbance)를 microplate reader (Packard Co.,Spectra Count^TM)를 이용하여 520nm에서 OD (optical density)값을 측정하고 그 결과 나타난 DPPH 라디칼 소거활성을 IC₅₀[MeOH (160 ㎕) 및 DPPH (40 ㎕) 혼합용액의 흡광도를 50 %로 낮추는데 필요한 테스트 화합물의 농도]로 나타내었다.

Soung등의 방법 (Sounget al., 1999)을 이용하여 상기 본 발명 화합물 푸코키산틴의 페록시나이트리트 (peroxynitrite; ONOO^-) 소거활성을 조사하였다. DMF에 용해시킨 DHR 123 (dihydrorhodamine 123) 5 mM을 질소기류로 탈기시킨 후 저장액으로 사용하기 위하여 빛에 노출시키지 않은 상태로 -80^oC에서 보관하여 저장액 (stock solution)으로 사용하였다. 사용한 완충용액 (pH 7.4)은 90 mM NaCl, 50 mM Na₃PO₄, 5 mM KCl (pH 7.4) 및 100 μM diethylenetriaminepentaacetic acid (DTPA)의 혼합물을 탈염수에 용해시킨 후 탈기시켜 제조하였다. DHR 123의 최종 농도는 5 μM이었다. 표준 페록시나이트리트 (peroxynitrite; SIN-1)를 처리 또는 무처리하여 5분 (1시간)후에 최종 형광광도를 측정한 결과, SIN-1에 의한 DHR 123의 산화는 서서히 증가하였다. 그러나, DHR 123은 표준 페록시나이트리트에 의해 산화되었으며, 그 최종 형광광도는 시간이 지나도 변하지 않았다. 산화된 DHR 123의 형광광도는 480 nm의 흡수파장 (excitation wavelength) 및 525 nm의 방출파장 (emission wavelength)에서 microplate fluorescence reader (FL 500, Bio-Tex Instruments)로 측정하였으며, 소거활성은 DHR 123의 산화 억제 %로 나타내었다.

Nagata등 (Nagataet al., 1999)의 방법을 이용하여 상기 본 발명 화학물질푸코키산틴의 일산화질소 (·NO) 라디칼 소거활성을 조사하였다.

·NO와 특이하게 반응하는 4,5-diaminofluorescein (DAF-2)는 그 분자 내의 두 아미노산 사이에 ·NO를 선택적으로 포집하여 490-495 nm의 빛을 흡수한 후 녹색의 형광을 방출하는 triazolofluorescein을 생산한다 (Nagataet al., 1999). DAF-2 (1mg)을 0.55mL 디메틸술폭사이드 (dimethyl sulfoxide)에 용해시킨 다음, 50mM에서 인산완충용액 (pH 7.4)으로1/400-fold로 희석하였다. ·NO 주게 (donor)인 sodium nitroprusside (f.c., 2 mM)와 DAF-2 (f.c., 3.14μM)을 96-well microplate에 첨가하였다. 형광도 (fluorescence intensity)는 DAF-2에 의해 포집된 ·NO의 양에 의존하였다. DAF-2와 ·NO의 반응에 의한 형광 시그널을 10분 후, 485nm 및 530nm의 흡수 및 방출 파장에서 fluorescence spectrometer (FL 500, Bio-Tek instruments)을 사용하여 측정하였다.

DPPH, 페록시나이트리트 (peroxynitrite; ONOO^-), 및 일산화질소 라디칼 (nitric oxide radical;^.NO) 등에 대한 푸코키산틴 [Ⅰ]의 라디칼 소거 활성을 측정한 결과, IC₅₀값이 32 μM, 60 μM, 및 0.5 μM 등으로 나타난 것으로 보아 본 발명 푸코키산틴은 다양한 자유라디칼 소거활성이 관찰되었으며, 특히 일산화질소 라디칼 (^.NO)에 대하여 강한 소거활성이 있음을 알 수 있다.

이상의 상기 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 규조류 (Bacillariophycean)인 한치시아 마리나 (Hantzschia marina)의 CH₂Cl₂-MeOH 추출물을n-hexane-EtOAc 용매 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하여 DPPH 소거능이 있는 활성분획을 획득하고 상기 활성분획을 다시n-hexane-EtOAc 용매 실리카겔 컬럼 크로마토그래피한 후, MeOH 용매 역상 HPLC로 분리 및 정제하여 카로티노이드계 화합물인 푸코키산틴을 획득하였으며, 상기 본 발명 푸코키산틴 화합물은 DPPH, 페록시나이트리트 및 일산화질소와 같은 자유라디칼 소거기능 및 항산화물질로서의 기능이 뛰어난 효과가 있으므로, 생리 활성 물질 및 의약품 제조산업상 선도물질로서 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims

규조류 한치시아 마리나 (Hantzschia marina)를 CH₂Cl₂-MeOH로 추출한 추출물을n-hexane-EtOAc 용매 실리카겔 컬럼 크로마토그래피하는 단계;

상기 분획중 DPPH 소거능이 있는 활성분획을n-hexane-EtOAc 용매 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 하는 단계; 및

상기 활성분획을 MeOH 용매 역상 HPLC로 분리 및 정제하는 단계로 구성됨을 특징으로 하는 규조류로부터 분리한 자유라디칼 소거기능이 있는 화합물 제조방법.
제 1항 기재의 방법에 의해 규조로부터 획득할 수 있는 오렌지색 고체 결정이며, DPPH 또는 페록시나이트리트 또는 일산화질소 라디칼 소거기능이 있음을 특징으로 하는 하기 일반식 [Ⅰ]로 표시되는 푸코키산틴 화합물 (C₄₂H₅₈O₆= 658).
제 2항 기재의 일반식 [Ⅰ]로 표시되는 푸코키산틴 화합물을 유효성분으로 함유함을 특징으로 하는 항산화활성 조성물.