KR20040081237A - 봉입체 결합 단백질을 코딩하는 유전자를 결핍시키거나증폭시켜 목적 단백질을 제조하는 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 봉입체 결합 단백질 (inclusion body-associated protein)을 코딩하는 유전자 (ibpA및/또는ibpB)를 결핍시키거나 증폭시켜 목적 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 지금까지 목적 단백질 생산에 미치는 영향이 보고되지 않아왔던 대장균 유래의 봉입체 결합 단백질을 코딩하는 유전자 (ibpA및/또는ibpB)를 이용한 목적 단백질 제조 방법 두 가지를 제공한다. 첫째,ibpA및/또는ibpB가 결핍된 박테리아를 이용하여 목적 단백질의 분비 생산 및 활성을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다. 둘째,ibpA및/또는ibpB가 증폭된 박테리아를 이용하여 세포질 내에 생산되는 목적 단백질들의 생산성 향상과 아울러 목적 단백질을 수용성 형태에서 불용성 봉입체로 생산함으로써 생물공정에 많은 이점을 주는 방법에 관한 것이다.

Description

봉입체 결합 단백질을 코딩하는 유전자를 결핍시키거나 증폭시켜 목적 단백질을 제조하는 방법 {Method for producing target proteins by deleting or amplifying ibpA and/or ibpB gene coding for inclusion body-associated proteins}
발명의 분야
본 발명은 봉입체 결합 단백질 (inclusion body-associated protein)을 코딩하는 유전자 (ibpA및/또는ibpB)을 결핍시키거나 증폭시켜 목적 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 상세하게는ibpA및/또는ibpB가 결핍된 박테리아를 이용하여 분비된 단백질이 활성을 갖는 수용성 단백질로 분비 생산할 수 있도록 하거나,ibpA및/또는ibpB가 증폭된 박테리아를 이용하여 봉입체 형성을 조작하여 공정시스템에 따라 봉입체를 형성시키도록 하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
재조합 DNA기술의 발전은 자연 상태에서는 미량으로만 얻어질 수 있었던 의약용·산업용 유용 단백질을 세균, 효모, 곰팡이, 동·식물 및 곤충세포에서 대량 생산할 수 있게 해 주었다. 그러나 숙주세포에 목적 단백질을 대량 생산하게 되면 세포는 이를 스트레스로 인식하여 자신을 보호하기 위해 많은 분자 샤페론들 (molecular chaperones)을 생산하게 된다. 분자 샤페론은 대부분 열 충격 단백질들 (Heat Shock Proteins: HSPs)이며 모든 세포에 하나 이상씩 존재한다. HSPs에는 SecB, DnaK, DnaJ, GrpE, GroEL, GroES, IbpA, IbpB (대장균의 경우)등이 포함되며 DNA 복제, RNA 합성, 단백질 합성, 폴딩 (folding), 재순환 (recycling), 세포 분열과 성장 등에 중요한 역할을 한다 (참조: LaRossa and Van Dyk, Mol. Microbiol. 5, 529-534, 1991). 대장균 세포질 내의 가장 대표적인 HSPs는 DnaK-DnaJ-GrpE와 GroEL-GroES이다. DnaK는 변성된 단백질의 소수성 부분에 결합하며 DnaJ에 의해 가수분해된 후, GrpE에 의해 DnaK가 재순환되면서 정상 단백질 (native protein)로 복구시킨다. 이러한 변성된 단백질의 폴딩 (folding)은 GroEL-GroES에 의해 가속화된다.
HSPs을 이용하여 목적 단백질의 생산성을 향상시키고자 많은 연구가 진행되어왔다. 지금까지 진행된 연구 결과를 정리해 보면, 크게 목적 단백질을 수용성 형태로 생산하는 방법과 불용성 봉입체로 생산하는 방법 두 가지로 나눌 수 있다. 전자는 HSPs을 동시에 발현하여 목적 단백질의 생산성 및 활성을 향상시키는 방법을 그 특징으로 한다. Goloubinoff는 GroEL과 GroES를 이용하여 활성을 갖는 외래 루비스코스 (ribulose bisphosphate carboxylases; Rubiscos) 단백질의 생산성을 상당히 향상시켰다 (참조: Goloubinoff et al., Nature 337, 44-47, 1989). 또한,Georgiou와 Valax는 GroEL과 GroES 또는 DnaK과 DnaJ을 베타-갈락토시데아제 (β-galactosidase) 생산에 이용하였다 (참조: Georgiou and Valax, Curr. Opin. Biotechnol. 7, 190-197, 1996). Murby는 세포 자신의 단백질이나 목적 단백질의 발현과 분비(secretion)에 필수적인 단백질 DnaK을 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase)나 융합 단백질들 (fusion proteins)에 동시 발현시켜서 성공적으로 생산하였다 (Murby et al., Biotechnol. Appl. Biochem. 14, 336-346, 1991). 그러나 이러한 시스템은 목적 단백질을 생산하는데 몇 가지 문제점을 가지고 있다: (1) HSPs 단백질을 과량으로 동시에 발현시킴으로써 전체 단백질 중에 HSPs 단백질이 차지하는 비중이 커져서 (30-50%) 상대적으로 세포가 최대 목적 단백질을 합성할 수 있는 능력 (capacity)을 줄인다; (2) 두 개의 발현 벡터를 사용하기 때문에 플라스미드의 안정성 (stability)이 떨어지게 된다; (3) 목적 단백질의 정확한 폴딩 (folding)은 많은 다른 분자 샤페론들이 협동적으로 작용하여 이루어지기 때문에 한두 가지의 샤페론으로는 불가능하다 (Langer et al., Nature 356, 683-689, 1992). 최근에는, 이러한 문제점을 일부 보안하기 위해서 HSPs 자체의 돌연변이 균주를 이용하는 방법이 개발되었다. Baneyx는 DnaK 돌연변이체를 이용하여 활성을 갖는 목적 단백질을 2-4배로 증가시켰다 (참조: US 5,552,301).
후자는, HSPs의 조절인자 (rpoH)가 결핍된 균주를 사용해서 목적 단백질의 생산성을 높이는 방법을 그 특징으로 한다.rpoH유전자 (시그마 32;δ32)가 결핍된 균주는 변성된 단백질의 폴딩 (folding)과 분해 (degradation)에 관련하는 HSPs의합성을 감소시키므로 프로테아제 (protease)에 의해 분해되기 쉬운 단백질이나 불용성 봉입체로 생산되는 목적 단백질 생산에 적합하다. Easton는rpoH결핍 균주를 사용해서 세포질 내에 봉입체로 젖소 인슐린 유사 성장 인자 2 (bovine insulin-like growth factor 2; bIGF2)를 20-25%로 생산하였다 (참조: Easton et al., Gene 101, 291-295, 1991). Obukowicz는 새로운rpoH결핍 균주를 사용해서 많은 목적 단백질의 생산성을 향상시켰다 (참조: Obukowicz et al., Appl. Environ. Microbiol. 58, 1511-1523, 1992). 또한, Goldberg는rpoH와lon이 결핍 균주를 이용해서 목적 단백질의 분해를 감소시킴으로서 목적 단백질 생산을 향상시켰다 (참조: US 4,758,512). 그러나, 이러한 시스템 또한 목적 단백질을 생산하는데 있어 세포 성장에 치명적인 영향을 준다는 문제점이 있다.
지금까지 작은 열 충격 단백질들 (small heat shock proteins: sHSPs)은 목적 단백질 생산에 전혀 이용되지 않았다. sHSPs는 작은 분자량 (15-30 kDa)을 가지는 HSPs이며 열이나 목적 단백질 과잉생산과 같은 스트레스에 의해 유도되고 단백질의 변성을 보호한다. sHSPs는 진핵생물 (eukaryotes)에서 원핵생물 (prokaryotes)에 이르기까지 모든 생물에 존재하며 지금까지 밝혀진 것으로는 인체 (Human) 유래의 sHSPs (HSP27, αA-, αB-crystallin), murine HSP25, 피숨 사티붐 (Pisum sativum(pea)) 유래의 HSP18.1, 사카로마시스 세레비지에 (Saccharomyces cerevisiae) 유래의 HSP26, 브레디르비조비움 자포니컴 (Bradyrbizobium japonicum) 유래의 sHSPs (HSPH, HSPB, HSPC, HSPF), 메탄노코커스 잔나스치 (Methanococcus jannaschii) 유래의 HSP16.5, 시테초코커스 불카너스(Synechococcus vulcanus) 유래의 HSP16, 마이코박테리움 튜버쿨로시스 (Mycobacterium tuberculosis) 유래의 HSP16.3이 보고되었다 (참조: Studer and Narberhaus, J. Biol. Chem. 275, 37212-37218, 2000). 특히, 재조합 대장균에서 목적 단백질 생산시 sHSPs에 속하는 봉입체 결합 단백질인 IbpA 및/또는 IbpB가 목적 단백질에 결합된다고 보고되었다 (참조: Allen et al., J. Bacteriol. 174, 6938-6947, 1992). 따라서, sHSPs에 포함되는 IbpA 및/또는 IbpB는 모든 생물 (특히 박테리아)에서 스트레스에 의해 변성된 단백질을 보호한다는 자명한 사실이다. 본 발명에서는 IbpA 및/또는 IbpB가 목적 단백질 생산에 미치는 영향을 두 가지 방향으로 진행하였다. 첫째는ibpAB가 결핍된 박테리아를 이용하여 목적 단백질의 분비 생산 및 활성을 향상시켰다. 재조합 대장균에서 유용 단백질을 주변 세포질 (periplasm)이나 배양액으로 분비시키는 방법이 다음과 같은 여러 가지 장점을 가지고 있다: (1) 주변 세포질이나 배지 내에는 세포질 내에 비해 상당히 적은 단백질이 존재하기 때문에, 원하는 유용 단백질은 고순도로 분리 및 정제될 수 있다 (참조: Nossal et al., J. Biol. Chem., 241, 3055-3062, 1966), (2) 주변 세포질이나 배양액으로 분비된 유용 단백질은 대부분의 프로테아제가 존재하는 세포질로부터 분리되기 때문에, 세포질 내 프로테아제에 의한 분해를 사전에 막을 수 있어, 유용 단백질의 수율을 증진시킬 수 있다 (참조: Meerman and Georgiou, Ann. N. Y. Acad. Sci., 721, 292-302, 1994), (3) 주변 세포질은 세포질 내보다 더욱 산화된 환경이기 때문에 다이설파이드 (disulfide) 결합이 훨씬 용이하게 이루어지고, 결국 생산된 단백질의 올바른 폴딩 (folding)이 형성됨으로써 불용성 봉입체의 형성이 현저히 줄어든다 (참조: Hockney, TIBTECH, 12, 456-463, 1994). 그러나, 분비가 전혀 이루어지지 않거나 분비된 단백질이 활성을 갖지 못하는 불용성 봉입체를 형성하는 경우도 흔히 있다. 둘째는 박테리아에서ibpA및/또는ibpB를 증폭시킴으로써 목적 단백질의 생산성 향상과 더불어 수용성 형태의 목적 단백질을 불용성 봉입체로 만드는 방법이다. 지금까지, 봉입체 생성에 대해 많은 연구가 진행되고 있지만, 아직 봉입체 형성의 정확한 기작은 알려지지 않고 있으며, 어떤 일반적인 연관성을 발견하지 못한 실정이다 (참조: Makrides SC, Microbiol. Rev. 60, 512-538, 1996). 봉입체의 형성은 숙주-벡터 시스템, 단백질의 특성, 배양 및 발현 조건에 따라 변화하므로 원하는 시스템에서의 실험을 통해서만 알 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 봉입체의 형성을 원하는 대로 조작할 수 있기 때문에 의약용·산업용 유용단백질 공정시스템과 단백질의 특성에 따라 많은 장점이 된다: (1) 벡터 제작 및 배양 조건이 단순하며 세포고농도 배양과 같은 방법으로 대량생산이 가능하다 (참조: Lee SY, Trends Biotechnol. 14, 98-105, 1996); (2) 배양 후 균체 수거 및 파괴를 거쳐 저속 원심분리에 의해 보통 80-98%의 순도로 정제가 되므로 수용성 단백질의 경우 이러한 초기 분리 단계에서 1-30%의 순도가 얻어지는 것과 비교하면 분리가 월등히 용이하다.(참조: Jeong and Lee, Appl. Environ. Microbiol. 65, 3027-3032, 1999); (3) 세포 내 프로테아제에 민감하여 분해가 일어나는 단백질의 경우 봉입체의 형성에 의해 프로테아제의 공격으로부터 보호될 수 있다 (참조: Rudolph R., Wiley, New York, 1995; Kane and Hartley, Trends Biotechnol., 6, 95-101, 1988). 더욱이, 봉입체의 용해 (solubilization)와 재생 (renaturation)과정이 실험에 의해 잘 정립되어 수용성 형태로 얻는 것 보다 봉입체 형태로 얻는 것이 훨씬 우수한 생산 시스템이 될 수 있다 (참조: Denefle et al., Gene, 56, 61-70, 1987; Saito et al., J. Biochem., 101, 1281-1288, 1987; Gill et al., Bio/Technol., 3, 643-646, 1985; Weir and Sparks, Biochem. J., 245, 85-91, 1987).
이에 본 발명자들은 박테리아를 이용하여 목적 단백질 생산을 높이는 균주 시스템을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 대장균 유래의 봉입체 결합 단백질 (inclusion body-associated protein)을 코딩하는 유전자 (ibpA및/또는ibpB)가 결핍된 박테리아를 이용하여 목적 단백질의 분비 생산 및 활성을 향상시켰으며, 대장균 유래의 봉입체 결합 단백질 (inclusion body-associated protein)들을 코딩하는 유전자 (ibpA및/또는ibpB)를 증폭시킴으로써 박테리아의 세포질 내에 생산되는 목적 단백질들의 생산성 향상과 아울러 목적 단백질을 수용성 형태에서 불용성 봉입체로 생산함으로써 생물공정에 많은 장점을 이용할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
본 발명의 목적은 목적 단백질을 효율적으로 분비·생산하기 위해ibpA및/또는ibpB유전자가 결핍된 박테리아를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 목적 단백질을 효율적으로 분비·생산하기 위해ibpA및/또는ibpB유전자가 결핍된 대장균을 제공하는 것이다. 보다 구체적으로는ibpAB유전자가 제거된 대장균 WIB101을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기ibpA및/또는ibpB유전자가 결핍된 박테리아는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기ibpA및/또는ibpB유전자가 결핍된 박테리아를 배양하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 분비·생산방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기ibpA및/또는ibpB유전자가 결핍된 박테리아는 분비신호서열을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기ibpA및/또는ibpB유전자가 결핍된 박테리아에서 목적 단백질은 렙틴 (leptin) 또는 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 박테리아에서ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭시키는 기능을 가지는 플라스미드 pACTacIbpAB, pACIbpAB, pACTacIbpA 또는 pACTacIbpB을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭시킨 박테리아를 제공하는 것이다. 보다 구체적으로는 상기 플라스미드 pACTacIbpAB, pACIbpAB, pACTacIbpA 또는 pACTacIbpB로 형질전환하여 유전자를 증폭시킨 박테리아를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭시킨 대장균을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭시킨 박테리아는 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭시킨 박테리아를 배양하여 목적 단백질을 불용성 봉입체 (inclusion body) 형태로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭시킨 박테리아에 있어서 목적 단백질은 인슐린 유사 성장 인자-I (insulin-like growth factor-I), 인터루킨 12 베타 체인 (interleukin 12 β chain), 인터페론 감마 (interferon-γ), 또는 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein; GFP)인 것을 특징으로 하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭하거나 결핍시켜 목적 단백질의 생성형태를 수용성 또는 불용성으로 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 플라스미드 pSKIbpABKm의 유전자 지도이다.ibpA'는ibpA유전자 앞의 5' 으로부터 500 bp,ibpB'는ibpB유전자의 3'으로부터 500 bp를 표시한다.
도 2는 플라스미드 pACTacIbpA의 유전자 지도이다.
도 3은 플라스미드 pACTacIbpB의 유전자 지도이다.
도 4는 플라스미드 pACTacIbpAB의 유전자 지도이다.
도 5는 플라스미드 pACIbpAB의 유전자 지도이다.
도 6은 플라스미드 pTac99GFP의 유전자 지도이다.
도 7은 플라스미드 p223-3IFN-γ의 유전자 지도이다.
도 8은 플라스미드 pTac99IL-12p40의 유전자 지도이다.
도 9는 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 W3110로부터 유도발현 후 4시간 경과한 후에 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 10은 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 WIB101로부터 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 11은 재조합 플라스미드 pTrcSOb4로 형질전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 12는 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpA, pACTacIbpB, pACTacIbpAB와 pYKM-I1로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 13은 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpAB, pACIbpAB와 pYKM-I1로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 14는 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpAB, pACIbpAB와 p223-3IFN-γ로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 15는 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpAB, pACIbpAB와 pTac99IL-12p40으로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 16은 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpAB, pACIbpAB와 pTac99GFP로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
도 17은 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpAB와 pTac99GFP로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110으로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다.
본 발명은 대장균 유래의 봉입체 결합 단백질 (inclusion body-associated protein)을 코딩하는 유전자 (ibpA및/또는ibpB)가 결핍된 박테리아를 이용하여 목적 단백질의 분비 생산 및 활성을 향상시켰으며 대장균 유래의 봉입체 결합 단백질 (inclusion body-associated protein)들을 코딩하는 유전자 (ibpA및/또는ibpB)를 증폭시킴으로써 박테리아의 세포질 내에 생산되는 목적 단백질들의 생산성 향상과 아울러 목적 단백질을 수용성 형태에서 불용성 봉입체로 생산함으로써 생물공정에 많은 이점을 주는 방법에 관한 것이다. 상기에서 언급한 것과 같이, 지금까지ibpA및/또는ibpB유전자들이 목적 단백질 생산에 미치는 영향이 보고되지 않았으며 또한, 목적 단백질 생산에 전혀 이용되지 않았다. 본 발명에서는ibpA및/또는ibpB유전자들이 목적 단백질 생산에 미치는 영향을 두 가지 방향으로 진행하였다. 첫째는ibpA및/또는ibpB유전자가 결핍 박테리아를 이용하여 목적 단백질의 분비 생산 및 활성을 향상시켰다. 둘째는ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭시킴으로써 박테리아의 세포질 내에 생산되는 목적 단백질의 생산성 향상과 더불어 수용성 형태의 목적 단백질을 불용성 봉입체로 형성됨을 본 발명에서 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: ibpAB 유전자가 결핍된 대장균의 제조
대장균 W3110 (ATCC 39936)의 염색체 DNA를 샘브룩 (Sambrook) 등의 방법에 따라 분리 정제하였다 (참조: Sambrook et al. Molecular Cloning, 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1989). 대장균 W3110을 500 mL의 LB 배지 (Luria-Bertani medium)에서 24시간 동안 배양하였다. 균주들이 초기 대수성장기에있을 때 원심분리에 의하여 균체를 회수한 다음, 10 mg/mL의 리소자임 (lysozyme, Sigma Co., USA)이 포함되어 있는 TE 용액 (10 mM Tris, 1 mM EDTA; pH 7.6) 50 mL에 현탁시켰다. 상기 균주 현탁액을 24시간 동안 서서히 교반하면서 상온에서 배양하였다. 균주의 파쇄와 단백질 제거를 위하여, 상기 배양액에 10% 소디움 도데실 설페이트 (sodium dodecyl sulfate, SDS) 용액 16 mL과 20 mg/mL의 프로티네이즈 K (Proteinase K, Sigma Co., USA) 570 ㎕를 첨가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 이어서, 5 M 염화나트륨 용액 14 mL과 0.7 M 염화나트륨 용액에 용해되어 있는 10% 세틸트리메틸암모니움브로마이드 (cetyltrimethylammoniumbromide, CTAB, Sigma Co., USA) 10.66 mL을 첨가한 다음, 65℃에서 10분간 반응시켰다. 그 다음, 상기 반응액과 같은 부피의 클로로포름-이소아밀알코올 (chloroform:isoamylalcohol = 24:1)을 가하고, 상온에서 2시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 상기 혼합액을 6,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 비이커에 옮겨 담고, 두 배 부피의 냉각된 에탄올을 천천히 가하여 염색체 DNA를 침전시킨 후, 유리봉으로 DNA를 말아서 감아 올렸다. 상기 유리봉을 자연 건조시켜 에탄올을 제거하고, 1 mL TE 용액에 DNA를 용해시켰다. 상기 DNA 용액에 RNase (Sigma Co., USA)를 최종농도 50 ㎍/mL이 되도록 가하고, 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 다음, 다시 상기 반응액과 같은 부피의 클로로포름-이소아밀알코올 (chloroform:isoamylalcohol = 24:1)을 가하고, 상온에서 2시간 동안 조심스럽게 혼합하였다. 상기 혼합액을 6,000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액을 비이커에 옮겨담고, 두 배 부피의 냉각된 에탄올을 천천히 가하여 염색체 DNA를 침전시킨후, 유리봉으로 DNA를 말아서 감아 올렸다. 상기 유리봉을 자연 건조시켜 에탄올을 제거하고, 최종적으로 1 mL TE 용액에 정제된 대장균 W3110의 염색체 DNA를 용해시켰다.
대장균에서ibpAB유전자를 제거하기 위해 박테리오파지 λ의red오페론 (operon)을 이용하였다 (참조: Jeong and Lee, Appl. Environ. Microbiol. 68, 4979-4985, 2002). 상동성 재조합 (homologous recombination)을 이용한 돌연변이의 제작을 위하여 박테리오파지 λ의red오페론이 함유된 플라스미드 pTrcEBG로 대장균 W3110을 형질전환하였고 1 mM IPTG를 첨가하여 형질 전환된 W3110(pTrcEBG)에서red오페론의 발현을 유도하였다. 이 대장균을 이용하여 일렉트로포레이션 수용체 세포 (electroporation-competent cell)를 제작하였다. 동종 재조합을 이용한 돌연변이의 제작을 위하여 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고 서열번호 1과 2의 프라이머를 사용하여ibpAB유전자의 프로모터 부분을 함유하고 있는 500 bp와, 서열번호 3과 4번의 프라이머를 사용하여ibpAB유전자의 3'말단기로부터 500 bp을 증폭시켜서 플라스미드 pBluescript SK(-) (Stratagene Cloning Systems, USA)의 제한효소NotI와XbaI인식부위에, 제한효소EcoRI와SalI 인식부위에, 각각 삽입하였으며 서열번호 5와 6의 프라이머를 사용하여 카나마이신 저항 유전자 600 bp를 증폭시켜서 상기의 방법으로 제조된 플라스미드의 중간인 제한효소XbaI와EcoRI 인식부위에 삽입하여 플라스미드 pSKIbpABKm을 수득하였다 (도 1). 상기 플라스미드 pSKIbpABKm을 주형으로 하고 서열번호 1과 4를 프라이머로 해서 얻어진 PCR 산물을 상기 제조된 일렉트로포레이션 수용체 세포에 삽입함으로써ibpAB유전자를 제거하였다.ibpAB가 제거된 돌연변이 대장균을 WIB101이라 명명하였다. WIB101 균주로부터 염색체를 분리하여 염색체내ibpAB유전자 위치에 카나마이신 유전자가 삽입이 되어있는지 여부를 서열번호 5와 6의 프라이머를 사용하여 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction: PCR)방법으로 확인하였다. 모든 PCR에서, 첫 번째 변성 (denaturation)은 95℃에서 5분간 1회 수행하였고, 이후 두 번째 변성은 95℃에서 50초간, 교잡 (annealing)은 55℃에서 1분간, 연장 (extention)은 72℃에서 1분 30초간 수행하였으며, 이를 30회 반복하고, 이후 72℃에서 5분간 마지막 연장을 1회 수행하였다.
5'-ataagaatgcggccgccagctgtggatcaccgaaactgat-3' (서열번호 1)
5'-gctctagatgcatagactgagggggcagca-3' (서열번호 2)
5'-ggaattctttcgactgtttaagatatttcgg-3' (서열번호 3)
5'-acgcgtcgacggagaaaatccccagcactaccgg-3' (서열번호 4)
5'-gctctagagccacgttgtgtctcaaa-3' (서열번호 5)
5'-cgaattcttagaaaaactcatcgagca-3' (서열번호 6)
실시예 2: ibpA 및/또는 ibpB 유전자를 도입한 재조합 플라스미드의 제조
IbpA와 IbpB 단백질을 발현하기 위하여 아래와 같이 재조합 플라스미드들을 제작하였다.
대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 각각 서열번호 7과 8, 서열번호 9와 10, 서열번호 11과 12의 프라이머를 사용하여 실시예 1과 같이 PCR을 수행하여ibpA,ibpB,ibpAB유전자를 수득하였다. 확보된ibpA,ibpB,ibpAB유전자를 각각EcoRI과HindIII로 절단된 재조합 플라스미드 pTac99A에 삽입하여 각각 플라스미드 pTac99IbpA, pTac99IbpB, pTac99IbpAB를 제작하였다. 재조합 플라스미드 pTac99A는 pTrc99A (Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)의trc프로모터를 pKK223-3 (Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)의tac프로모터로 전환한 플라스미드이다. pKK223-3의tac프로모터를 제한효소PvuII 와EcoRI으로 얻은 다음tac프로모터 유전자 조각을 같은 제한효소로 절단된 pTrc99A에 삽입함으로써 제작하였다. 각각의 상기 플라스미드 pTac99IbpA, pTac99IbpB, pTac99IbpAB를 제한효소SspI으로 절단하여 제한효소DraI과PvuII로 절단된 플라스미드 pACYC184 (New England Biolabs, USA)에 삽입하여 각각 플라스미드 pACTacIbpA, pACTacIbpB, pACTacIbpAB를 제작하였다 (도 2, 도 3, 도 4).
ibpAB유전자를 자기 프로모터를 이용하여 발현하기 위하여 대장균 W3110의 염색체 DNA를 주형으로 하고, 각각 서열번호 13과 14의 프라이머를 사용하여 실시예 1과 같이 PCR을 수행하여ibpAB프로모터와ibpAB유전자를 포함한 PCR 산물을 수득하였다. 확보된 유전자를 제한효소EcoRI으로 절단하여 같은 효소로 절단된 pACYC184 (New England Biolabs, USA)에 삽입함으로써 플라스미드 pACIbpAB를 제작하였다 (도 5).
5'-ggaattcatgcgtaactttgatttatccc-3' (서열번호 7)
5'-cccaagcttttagttgatttcgatacggcgc-3' (서열번호 8)
5'-ggaattcatgcgtaacttcgatttatccccactg-3' (서열번호 9)
5'-cccaagcttttagctatttaacgcgggacgttcgct-3' (서열번호 10)
5'-ggaattcatgcgtaactttgatttatccc-3' (서열번호 11)
5'-cccaagcttttagctatttaacgcgggacgttcgct-3' (서열번호 12)
5'-ggaattccagctgtggatcaccgaaactg-3' (서열번호 13)
5'-ggaattcagaacgtgccgaaatatctta-3' (서열번호 14)
실시예 3: 목적 단백질들의 유전자를 도입한 재조합 플라스미드의 제조
아에쿠오레아 빅토리아 (Aequorea victoria)의 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP)의 발현을 위하여gfp uv 유전자를 포함한 플라스미드 pGFPuv(Stratagene Cloning Systems, USA)을 주형으로 하고 서열번호 15, 서열번호 16의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 확보된 GFP 유전자를 제한 효소EcoRI과HindIII으로 절단하여 같은 효소로 절단된 pTac99A에 삽입하여 플라스미드 pTac99GFP를 제작하였다 (도 6).
인체 유래 인터페론 감마 (interferon-γ: INF-γ) 단백질을 발현하기 위하여 사이토카인 (Cytokine) 은행 (http://cytokine.chonbuk.ac.kr/)에서 분양 받은인체 유래 인터페론 감마 유전자를 포함한 플라스미드 pUC18/IFN-γ를 주형으로 하고 서열번호 17, 서열번호 18의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 확보된 INF-γ 유전자를 제한 효소EcoRI과HindIII으로 절단하여 같은 효소로 절단된 pKK223-3 (Pharmacia Biotech., Uppsala, Sweden)에 삽입하여 플라스미드 p223-3IFN-γ를 제작하였다 (도 7).
인체 유래 인터루킨 12 베타 체인 (interleukin 12 β chain: IL-12p40) 단백질을 발현하기 위하여 사이토카인 은행 (http://cytokine.chonbuk.ac.kr/)에서 분양 받은 인체 유래 인터루킨 베타 체인 유전자를 포함한 플라스미드 pUC18/p40을 주형으로 하고, 서열번호 19, 서열번호 20의 프라이머를 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다. 확보된 IL-12p40 유전자를 제한 효소EcoRI과HindIII으로 절단하여 같은 효소로 절단된 pTac99A에 삽입하여 플라스미드 pTac99IL-12p40를 제작하였다 (도 8).
5'-ggaattcatgagtaaaggagaagaacttt-3' (서열번호 15)
5'-cccaagcttttatttgatgagctcatcc-3' (서열번호 16)
5'-ggaattcatgtgttactgccaggacccatat-3' (서열번호 17)
5'-cccaagcttttactgggatgctcttcgacc-3' (서열번호 18)
실시예 4: ibpAB 유전자가 결핍된 대장균에서 대장균 유래 알칼라인 포스파타제 단백질의 분비 생산
기존의 알칼라인 포스파타제 발현 플라스미드 pTrcS1PhoA (참조: Choi et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 53, 640-645, 2000)로 상기 실시예 1에서 제조된 대장균 WIB101과 모균주 W3110을 각각 형질전환 하였다. 항생제 카니마이신과 엠피실린 또는 엠피실린만 첨가된 LB 평판배지에서 각각의 형질전환 균주를 선별하였다. 각각의 재조합 대장균들을 250 mL 플라스크에서 배양하였으며 배양온도는 37℃, 사용한 배지는 LB배지 (100 mL)를 사용하였다. 알칼라인 포스파타제 단백질의 발현은 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도 (O.D.)가 0.7일 때 0.01 mM의 IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 줌으로써 유도하였다. 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 배양액 1 mL씩 채취하여 전체 단백질, 수용성 단백질, 불용성 단백질, 주변세포질 단백질 및 세포질 단백질로 각각 분획하였으며, 동시에 배양액 0.1 mL씩을 채취하여 알칼라인 포스파타제의 활성을 측정하였다. 전체 단백질, 수용성 단백질, 불용성 단백질, 주변세포질 단백질 및 세포질 단백질로 다음과 같이 각각 분획하였다: 전체 단백질은 배양액 1 mL를 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 얻은 침전물을 0.5 mL TE용액으로 한번 세척한 다음, 다시 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 이를 0.2 mL TE용액에 현탁하여 초음파 파쇄함으로써 분획하였다. 상기 전체단백질을 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상등액을 수용성 단백질로, 침전물을 불용성 봉입체로 하였다.
주변세포질 단백질 및 세포질 단백질을 분획하기 위하여, 배양액 1 mL를 4℃에서 6000 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 얻은 침전물에 20% 수크로스를 포함한 30 mM Tris-HCl (pH 8.0) 용액을 0.4 mL 넣고 충분히 섞어준 후, 1 mM EDTA를 첨가하여 약 10분 동안 상온에서 교반하였다. 이어, 다시 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 침전물을 수득하고, 차가운 5 mM MgSO4용액을 0.4 mL 넣어 조심스럽게 섞은 후 얼음 속에서 약 10분 동안 교반한 다음, 4℃에서 10,000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여 상층액 및 침전물을 각각 취하였다. 이때, 상층액은 세포의 주변 세포질에 있는 단백질로 하였으며, 침전물은 0.2 mL TE 완충용액에 현탁하고 초음파 파쇄하여 세포질 단백질로 하였다 (참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, 1989).
상기에서 얻은 단백질 함유 용액을 200 ㎕씩 취하여 SDS-PAGE 샘플 용액 (25% 글리세롤, 2% SDS, 14.4 mM 2-머캅토에탄올, 0.1% 브로모페놀블루 (bromophenol blue), 60 mM Tris-HCl) 50 ㎕와 혼합하고 10분간 끓인 다음, 이를 12% 분리용 젤 (separating gel)에서 SDS-PAGE 젤 전기영동하였다. 이어, 젤을 염색 용액 (메탄올 40%, 아세트산 10%, 0.25 g/L 쿠마시에 브릴리언트 블루 R (Coomassie brilliant blue R))에 2시간 이상 담가두어 염색하고, 다시 탈색 용액 (40% 메탄올, 7% 아세트산)에 2시간 이상씩 두 번 담가 탈색하였다 (도 9).
도 9는 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 W3110로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 9에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량을 나타내며, 레인 1 내지 5는 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 형질전환 균주로부터 수득한 전체 단백질, 수용성 단백질, 불용성 단백질, 주변세포질 단백질 및 세포질 단백질을 각각 나타낸다. 또한, 화살표 ( ← )는 분비된 알칼라인 포스파타제 단백질을 나타낸다.
도 9에서 보듯이, 대장균 W3110 내에서 분비작용이 일어난 후 분비 신호서열이 절단된 크기에 해당하는 약 50 kDa의 알칼라인 포스파타제의 대부분은 불용성 봉입체 형태로 존재하고 있어, 주변세포질 단백질에 내포된 수용성 알칼라인 포스파타제의 양은 매우 낮음을 알 수 있었다. 아울러, 상기 SDS-PAGE 젤 전기영동 결과는 덴시토메터를 이용한 단백질의 정량에 이용하여, 전체 단백질 중에서 알칼라인 포스파타제가 차지하는 비율은 약 20%이다.
도 10은 재조합 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 재조합 대장균 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 10에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량을 나타내며, 레인 1 내지 5는 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 형질전환 균주로부터 수득한 전체 단백질, 수용성 단백질, 불용성 단백질, 주변세포질 단백질 및 세포질 단백질을 각각 나타낸다. 또한, 화살표 ( ← )는 분비된 알칼라인 포스파타제 단백질을 나타낸다.
도 10에서 보듯이, 대장균 WIB101 내에서 분비작용이 일어난 후 분비 신호서열이 절단된 크기에 해당하는 약 50 kDa의 알칼라인 포스파타제의 대부분은 수용성 알칼라인 포스파타제로 존재하고 있어, 주변세포질 단백질에 내포된 수용성 알칼라인 포스파타제의 양은 상대적으로 높음을 알 수 있었다. 아울러, 상기 SDS-PAGE 젤 전기영동 결과는 덴시토메터를 이용한 단백질의 정량에 이용하여, 전체 단백질 중에서 분비된 알칼라인 포스파타제가 차지하는 비율은 약 30%로서 거의 주변세포질로 분비되었다.
분비된 알칼라인 포스파타제의 활성은 다음과 같은 방법으로 측정하였다 (참조: Brickman and Beckwith, J. Mol. Biol., 96, 307-316, 1975). 상기에서 수득한 대장균은 50 mM Tris-HCl(pH 7.5) 용액 1 mL에 현탁시키고, 여기에 클로로포름 0.1 mL를 가하여 37℃에서 5분간 반응시켰다. 이어, 0.4% PNPP (p-nitrophenyl phosphate) 0.1 mL를 첨가하고 다시 37℃에서 5분간 반응시킨 다음, 1M K2HPO4용액 0.1 mL로 반응을 정지시키고 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 상층액만을 취하였다. 이 상층액은 50 mM Tris-HCl 용액으로 희석시키고 분광광도계로 420 nm와 550 nm의 두 파장에서 흡광도를 측정하였다. 알칼라인 포스파타제의 활성도 (U/mL)는 다음과 같은 계산식에 의해 산출하여, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다:
상기에서, 대조구는 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환되지 않은 대장균 W3110, WIB101의 배양액을 전술한 바와 같은 방법으로 처리하여 측정한 알칼라인 포스파타제의 활성으로 하였다.
각 재조합 대장균에서 알칼라인 포스파타제의 활성도
대장균 알칼라인 포스파타제 활성도 (U/mL)
대장균 W3110 0.04
pTrcS1PhoA로 형질전환된 대장균 W3110 1405
대장균 WIB101 0.05
pTrcS1PhoA로 형질전환된 대장균 WIB101 4720
상기 표 1에서 보듯이, 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 대장균 WIB101의 알칼라인 포스파타제 활성이 플라스미드 pTrcS1PhoA로 형질전환된 대장균 W3110보다 3배 이상으로 가장 높은 활성을 나타냈으며, 형질전환되지 않은 대장균들은 거의 활성을 나타내지 않았다. 따라서, 알칼라인 포스파타제는 세포 내에서는 활성을 갖지 못하고 반드시 주변 세포질로 분비되어야만 활성을 갖게 되는 점을 감안하여 볼 때, 형질전환된 재조합 대장균에서 생산된 알칼라인 포스파타제는 주변 세포질로의 분비가 성공적으로 일어났음을 알 수 있었다. 그러나 형질전환된 재조합 대장균 W3110에서는 분비된 알칼라인 포스파타제가 불용성 봉입체로 형성되는 반면, 형질전환된 재조합 대장균 WIB101에서는 거의 모두 수용성 형태로 존재하며 활성도 훨씬 높음을 확인하였다. 또한, 형질전환된 재조합 대장균 WIB101의 세포 농도가 형질전환된 재조합 대장균 W3110에 비해 2배 이상 높음으로 실제로는 같은 시간에 알칼라인 포스파타제의 활성이 6배 이상 높게 나타난다. 따라서ibpAB가 결핍된 대장균 WIB101은 수용성 및 활성을 갖는 알칼라인 포스파타제 단백질의 분비 생산에 효율적인 균주임을 본 발명에서 확인하였다.
실시예 5: ibpAB 유전자가 결핍된 대장균에서 인체 유래 렙틴 (leptin)의 분비 생산
기존의 렙틴 발현 플라스미드 pTrcSOb4 (참조: Jeong and Lee., Biotechnol. Bioeng. 67, 398-407, 2000)로 상기 실시예 1에서 제조된 대장균 WIB101와 모균주 W3110에 각각 형질전환 하였다. 상기 실시예 4와 같은 방법으로 세포배양을 수행하였다. 렙틴 단백질의 발현은 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도 (O.D.)가 0.7일 때 1 mM의 IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 줌으로써 유도하였다. 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 배양액 1 mL씩을 채취하여 상기 실시예 4와 같은 방법으로 전체 단백질, 수용성 단백질 및 봉입체 단백질로 각각 분획하였다 (도 11).
도 11은 재조합 플라스미드 pTrcSOb4로 형질전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 11에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량를 나타내며, 레인 1 내지 3은 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 형질전환된 대장균 W3110로부터 수득한 전체 단백질, 수용성 단백질, 및 불용성 봉입체를 각각 나타낸다. 레인 4 내지 6은 유도발현 후 4시간 경과한 다음에 형질전환된 대장균 WIB101로부터 수득한 전체 단백질, 수용성 단백질, 및 불용성 봉입체를 각각 나타낸다. 또한, 화살표 ( ← )는 분비된 인체 유래 렙틴 단백질을 나타낸다.
도 11에서 보듯이, 형질전환된 대장균 W3110에서는 전체 렙틴 단백질의 약 50%가 불용성 봉입체를 형성하는 반면, 형질전환 대장균 WIB101에서는 형성된 모든 렙틴 단백질이 거의 수용성 형태로 존재함을 확인할 수 있다. 또한, 형질전환된 재조합 대장균 WIB101의 세포 농도가 형질전환된 재조합 대장균 W3110에 비해 3배 높음으로 실제로는 같은 시간에 수용성 렙틴 농도는 3배 이상 높게 나타난다. 따라서,ibpAB가 결핍된 대장균 WIB101은 수용성 렙틴 단백질의 분비 생산에 효율적인 균주임을 본 발명에서 확인하였다.
실시예 6: IbpA 및/또는 IbpB 발현 시스템에 의한 세포질 내에 인체 유래 인슐린 유사 성장 인자-I (human insulin-like growth factor-I: IGF-I) 단백질의 생산
상기 실시예 2에서 제작된 각각의 재조합 플라스미드 (p184△Cm, pACTacIbpA, pACTacIbpB, pACTacIbpAB, pACIbpAB)와 기존의 인슐린 유사 성장 인자-I 발현 플라스미드 pYKM-I1(참조: Kim and Lee, J. Biotechnol. 48, 97-105, 1996)로 상기 실시예 1에서 제조된 대장균 WIB101와 모균주 W3110에 동시에 형질전환 하였다. 세포배양은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다. 인체 유래 인슐린 유사 성장 인자-I 단백질의 발현은 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도 (O.D.)가 0.7일 때 1mM의 IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 줌으로써 유도하였다. 인체 유래 인슐린 유사 성장 인자-I 단백질 유도 후 4시간에 배양액을 모아 원심분리기로 회수한 뒤 각 형질전환 균주의 인체 유래 인슐린 유사 성장 인자-I 단백질을 실시예 4와 동일한 방법으로 전체 단백질을 분획하였다 (도 12, 도 13).
도 12는 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpA, pACTacIbpB, pACTacIbpAB와 pYKM-I1로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 12에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량, 레인 1는 재조합 플라스미드 p184△Cm와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 2은 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 3는 재조합 플라스미드 pACTacIbpA와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 4는 재조합 플라스미드 pACTacIbpB와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 5는 재조합 플라스미드 p184△Cm와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 6는 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 7는 재조합 플라스미드 pACTacIbpA와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 8는 재조합 플라스미드 pACTacIbpB와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 WIB101의 전체 단백질을 분획한 결과이다. 또한, 화살표 ( ← )는 인체 유래 인슐린 유사 성장 인자-I 단백질을 나타낸다.
도 13은 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpAB, pACIbpAB와 pYKM-I1로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 13에서, 레인 M은 단백질 표준 분자량, 레인 1은 재조합 플라스미드 p184△Cm와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 2는 재조합 플라스미드 p184△Cm와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 3은 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 4는 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 5는 재조합 플라스미드 pACIbpAB와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 6은 재조합 플라스미드 pACIbpAB와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 WIB101의 전체 단백질을 분획한 결과이다. 또한, 화살표 ( ← )는 인체 유래 인슐린 유사 성장 인자-I 단백질을 나타낸다.
도 12와 도 13에서 보는 바와 같이 대장균 W3110에ibpA, ibpB또는ibpAB를 동시에 발현시킴으로써 인체 유래 인슐린 유사 성장 인자-I 단백질이 대조구 (p184△Cm와 pYKM-I1로 형질전환된 대장균 W3110)보다 약 2배 증가됨을 확인하였다. 또한, 이 실험 결과로 알 수 있듯이ibpAB가 결핍된 대장균 WIB101에서는 세포질 내에 생산되는 목적 단백질을 생산할 수 없으며 IbpA와 IbpB 두 단백질이 모두 중요함을 확인하였다.
따라서 세포질 내에 생산되는 목적 단백질의 경우,ibpA, ibpB또는ibpAB가 목적 단백질의 생산성을 향상시킴을 본 발명에서 확인하였다. 본 발명에서 세포질 내에 생성되는 다른 목적 단백질의 적용여부를 확인하기 위하여ibpAB(pACTacibpAB와 pACibpAB)만으로 추가 실험을 수행하였다.
실시예 7: IbpAB 발현 시스템에 의한 세포질 내에 인체 유래 인터페론 감마 단백질 (interferon-γ: IFN-γ)의 생산
상기 실시예 2에서 제작된 각각의 재조합 플라스미드 (p184△Cm, pACTacIbpA, pACIbpAB)와 실시예 3에서 제작한 인체 유래 인터페론 감마 단백질의 플라스미드 p223-3IFN-γ로 상기 실시예 1에서 제조된 대장균 WIB101, 모균주 W3110을 동시에 형질전환 하였다. 세포배양은 상기 실시예 4와 동일한 방법으로 수행하였다. 인체 유래 인터페론 감마 단백질의 발현은 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도 (O.D.)가 0.7일 때 1 mM의 IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 줌으로써 유도하였다. 인체 유래 인터페론 감마 단백질 유도 후 4시간에 배양액을 모아 원심분리기로 회수한 뒤 각 형질전환 균주의 인체 유래 인터페론 감마 단백질을 실시예 4와 동일한 방법으로 전체 단백질을 분획하였다 (도 14).
도 14는 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpAB, pACIbpAB와 p223-3IFN-γ로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 14에서 레인 M은 단백질 표준 분자량, 레인 1은 재조합 플라스미드 p184△Cm와 p223-3IFN-γ로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 2는 재조합 플라스미드 p184△Cm와 p223-3IFN-γ로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 3은 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 p223-3IFN-γ로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 4는 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 p223-3IFN-γ로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 5는 재조합 플라스미드 pACIbpAB와 p223-3IFN-γ로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 6은 재조합 플라스미드 pACIbpAB와 p223-3IFN-γ로 형질전환된 대장균 WIB101의 전체 단백질을 분획한 결과이다. 또한, 화살표 ( ← )는 인체 유래 인터페론 감마 단백질을 나타낸다.
도 14에서 보는 바와 같이 대장균 W3110에 IbpAB를 동시에 발현시킴으로써 인체 유래 인터페론 감마 단백질이 대조구 (p184△Cm와 p223-3IFN-γ로 형질전환된 대장균 W3110)보다 약 2배 증가됨을 확인하였다. 또한, 이 실험 결과로 알 수 있듯이 IbpAB가 결핍된 대장균 WIB101에서는 세포질 내에 생산되는 목적 단백질을 생산할 수 없으며 IbpA와 IbpB 두 단백질이 모두 필요함을 확인하였다.
실시예 8: IbpAB 발현 시스템에 의한 세포질 내에 인체 유래 인터루킨 12 베타 체인 (interleukin 12 β chain) 단백질 생산
상기 실시예 2에서 제작된 각각의 재조합 플라스미드 (p184△Cm,pACTacIbpA, pACIbpAB)와 실시예 3에서 제작한 인체 유래 인터루킨 12 베타 체인 플라스미드 pTac99IL-12p40으로 상기 실시예 1에서 제조된 대장균 WIB101, 모균주 W3110을 동시에 형질전환 하였다. 세포배양은 상기 실시예 4과 동일한 방법으로 수행하였다. 인체 유래 인터루킨 12 베타 체인 단백질의 발현은 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도 (O.D.)가 0.7일 때 1 mM의 IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 줌으로써 유도하였다. 인체 유래 인터루킨 12 베타 체인 단백질 유도 후 4시간에 배양액을 모아 원심분리기로 회수한 뒤 각 형질전환 균주의 인체 유래 인터루킨 12 베타 체인 단백질을 실시예 4와 동일한 방법으로 전체 단백질을 분획하였다 (도 15).
도 15는 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpAB, pACIbpAB와 pTac99IL-12p40으로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 15에서 레인 M은 단백질 표준 분자량, 레인 1은 재조합 플라스미드 p184△Cm와 pTac99IL-12p40로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 2는 재조합 플라스미드 p184△Cm와 pTac99IL-12p40로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 3은 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 pTac99IL-12p40로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 4는 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 pTac99IL-12p40로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 5는 재조합 플라스미드 pACIbpAB와 pTac99IL-12p40로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 6은 재조합 플라스미드 pACIbpAB와 pTac99IL-12p40로 형질전환된 대장균 WIB101의 전체 단백질을 분획한 결과이다. 또한, 화살표 ( ← )는 인체 유래 인터루킨 12 베타 체인 단백질을 나타낸다.
도 15에서 보는 바와 같이 대장균 W3110에 IbpAB를 동시에 발현시킴으로써 인체 유래 인터루킨 12 베타 체인 단백질이 대조구(p184△Cm와 pTac99IL-12p40로 형질전환된 대장균 W3110)보다 약 1.5배 증가됨을 확인하였다. 또한, 이 실험 결과로 알 수 있듯이 IbpAB가 결핍된 대장균 WIB101에서는 세포질 내에 생산되는 목적 단백질을 생산할 수 없으며 IbpA와 IbpB 두 단백질이 모두 필요함을 확인하였다.
실시예 9: IbpAB 발현 시스템에 의한 세포질 내에 아에쿠오레아 빅토리아 ( A. victoria )의 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein: GFP)의 생산
상기 실시예 2에서 제작된 각각의 재조합 플라스미드 (p184△Cm, pACTacIbpA, pACIbpAB)와 실시예 3에서 제작한 아에쿠오레아 빅토리아 유래 녹색 형광 단백질 (GFP) 플라스미드 pTac99GFP로 상기 실시예 1에서 제조된 대장균 WIB101, 모균주 W3110을 동시에 형질전환 하였다. 세포배양은 상기 실시예 4과 동일한 방법으로 수행하였다. 녹색 형광 단백질의 발현은 분광광도계로 600 nm 파장에서 측정한 광학밀도 (O.D.)가 0.7일 때 1 mM의 IPTG (isopropyl-β-thiogalactoside)를 첨가하여 줌으로써 유도하였다. 녹색 형광 단백질 유도 후 4시간에 배양액을 모아 원심분리기로 회수한 뒤 각 형질전환 균주의 녹색 형광 단백질을 실시예 4와 동일한 방법으로 전체 단백질, 수용성 단백질 및 불용성 단백질을 분획하였다 (도 16, 도 17).
도 16은 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpAB, pACIbpAB와 pTac99GFP로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110과 WIB101로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 16에서 레인 M은 단백질 표준 분자량, 레인 1은 재조합 플라스미드 p184△Cm와 pTac99GFP로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 2는 재조합 플라스미드 p184△Cm와 pTac99GFP로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 3은 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 pTac99GFP로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 4는 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 pTac99GFP로 형질전환된 대장균 WIB101, 레인 5는 재조합 플라스미드 pACIbpAB와 pTac99GFP로 형질전환된 대장균 W3110, 레인 6은 재조합 플라스미드 pACIbpAB와 pTac99GFP로 형질전환된 대장균 WIB101의 전체 단백질을 분획한 결과이다. 또한, 화살표 ( ← )는 녹색 형광 단백질을 나타낸다.
도 16에서 보는 바와 같이 대장균 W3110에 IbpAB를 동시에 발현시킴으로써 녹색 형광 단백질이 대조구 (p184△Cm와 pTac99GFP로 형질전환된 대장균 W3110)보다 약 2배 이상 증가됨을 확인하였다. 또한, 이 실험 결과로 알 수 있듯이 IbpAB가 결핍된 대장균 WIB101에서는 세포질 내에 생산되는 목적 단백질을 생산할 수 없으며 IbpA와 IbpB 두 단백질이 모두 필요함을 확인하였다.
도 17은 각각의 재조합 플라스미드 p184△Cm, pACTacIbpAB와 pTac99GFP로 동시에 형질 전환된 재조합 대장균 W3110으로부터 수득한 단백질들을 SDS-PAGE 젤 상에서 분석한 결과를 나타내는 전기영동 사진이다. 도 17에서 레인 M은 단백질 표준 분자량, 레인 1 내지 3은 재조합 플라스미드 p184△Cm와 pTac99GFP로 형질전환된대장균 W3110의 각각 전체 단백질, 수용성 단백질 및 불용성 단백질, 레인 4 내지 6은 재조합 플라스미드 pACTacIbpAB와 pTac99GFP로 형질전환된 대장균 W3110의 각각 전체 단백질, 수용성 단백질 및 불용성 단백질을 분획한 결과이다. 또한, 화살표 ( ← )는 녹색 형광 단백질을 나타낸다.
도 17에서 보는 바와 같이 대장균 W3110에 IbpAB를 동시에 발현시킴으로써 수용성 목적 단백질을 거의 100% 불용성 봉입체로 전환됨을 확인하였다. 따라서, 유용단백질의 특성과 공정시스템에 따라 봉입체의 형성을 우리가 원하는 대로 조작할 수 있음을 본 발명에서 확인하였다.
본 발명은 대장균 유래의 봉입체 결합 단백질 (inclusion body-associated protein)을 코딩하는 유전자 (ibpA및/또는ibpB)를 이용한 목적 단백질 제조 방법 두 가지를 제공한다. 첫째,ibpA및/또는ibpB가 결핍된 박테리아를 이용하여 목적 단백질의 분비 생산 및 활성을 향상시키는 방법을 제공하는 것이다. 상기 박테리아를 이용하면 분비된 단백질이 활성을 갖지 못하는 불용성 봉입체로 형성되는 것을 활성을 갖는 수용성 단백질로 분비 생산할 수 있도록 하며 생산성 향상도 기대된다. 둘째,ibpA및/또는ibpB가 증폭된 박테리아를 이용하여 박테리아의 세포질 내에 생산되는 목적 단백질들의 생산성을 향상시키고 아울러 목적 단백질을 불용성 봉입체로 생산함으로써 생물공정에 많은 이점을 주는 방법에 관한 것이다. 상기 재조합 벡터의 도입을 통해 봉입체 형성을 원하는 대로 조작할 수 있어 유용 단백질의 특성과 공정시스템에 따라 봉입체를 형성시킴으로써 생물공정에 많은 이점이 기대된다.
본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분양의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.
<110> KAIST <120> Method for producing target proteins by deleting or amplifying ibpA and/or ibpB gene coding for inclusion body-associated proteins <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 1 ataagaatgc ggccgccagc tgtggatcac cgaaactgat 40 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 2 gctctagatg catagactga gggggcagca 30 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 3 ggaattcttt cgactgttta agatatttcg g 31 <210> 4 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 acgcgtcgac ggagaaaatc cccagcacta ccgg 34 <210> 5 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 5 gctctagagc cacgttgtgt ctcaaa 26 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 6 cgaattctta gaaaaactca tcgagca 27 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 7 ggaattcatg cgtaactttg atttatccc 29 <210> 8 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 8 cccaagcttt tagttgattt cgatacggcg c 31 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 9 ggaattcatg cgtaacttcg atttatcccc actg 34 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 10 cccaagcttt tagctattta acgcgggacg ttcgct 36 <210> 11 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 11 ggaattcatg cgtaactttg atttatccc 29 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 12 cccaagcttt tagctattta acgcgggacg ttcgct 36 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 13 ggaattccag ctgtggatca ccgaaactg 29 <210> 14 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 14 ggaattcaga acgtgccgaa atatctta 28 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 15 ggaattcatg agtaaaggag aagaacttt 29 <210> 16 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 16 cccaagcttt tatttgatga gctcatcc 28 <210> 17 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 17 ggaattcatg tgttactgcc aggacccata t 31 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer <400> 18 cccaagcttt tactgggatg ctcttcgacc 30

Claims (18)

  1. ibpA및/또는ibpB유전자가 결핍된 박테리아.
  2. 제1항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 박테리아.
  3. 제2항에 있어서,ibpAB유전자가 제거된 대장균 WIB101.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아.
  5. 제4항에 있어서, 분비신호서열을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 박테리아.
  6. 미생물을 배양하여 목적 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 제4항의 박테리아를 배양하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 분비·생산방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 목적 단백질은 렙틴 (leptin) 또는 알칼라인 포스파타제 (alkaline phosphatase)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 박테리아는 분비신호서열을 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 박테리아에서ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭시키는 기능을 가지는 플라스미드 pACTacIbpAB, pACIbpAB, pACTacIbpA 또는 pACTacIbpB.
  10. ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭시킨 박테리아.
  11. 제10항에 있어서, 대장균인 것을 특징으로 하는 박테리아.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 제9항의 플라스미드를 도입하여ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭시킨 박테리아.
  13. 제10항 또는 제11항에 있어서, 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 박테리아.
  14. 미생물 배양에 의해 불용성 봉입체 (inclusion body) 형태의 목적 단백질을 제조하는 방법에 있어서, 제13항의 박테리아를 배양하는 것을 특징으로 하는 목적 단백질의 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 상기 목적 단백질은 세포질 내에 축적되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제14항에 있어서, 수용성 형태로 생산되는 목적 단백질을 불용성 봉입체 형태로 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제14항에 있어서, 상기 목적 단백질은 인슐린 유사 성장 인자-I (insulin-like growth factor-I), 인터루킨 12 베타 체인 (interleukin 12 β chain), 인터페론 감마 (interferon-γ), 또는 녹색 형광 단백질 (green fluorescent protein; GFP)인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. ibpA및/또는ibpB유전자를 증폭하거나 결핍시켜 목적단백질의 생성형태를 수용성 또는 불용성으로 조절하는 방법.
KR10-2003-0015965A 2003-03-14 2003-03-14 봉입체 결합 단백질을 코딩하는 유전자를 결핍시키거나 증폭시켜 목적 단백질을 제조하는 방법 Expired - Fee Related KR100530988B1 (ko)

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