KR20070101854A - 재조합 이중 가닥 ｒｎａ 뉴클레오캡시드의 생성 및 제조에유용한 세균 패키징 균주 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드(rdsRN)의 생성에 유용한 세균 패키징 균주를 제공한다. 상기 패키징 균주는 진핵 세포 또는 조직에서 백신 항원, 생물활성 단백질, 면역조절 단백질, 안티센스 RNA 및 촉매 RNA를 암호화하는 RNA의 생산에 유용하다. 재조합 ssRNA를 상기 균주 내로 도입시키고 패키징하여 rdsRN을 새로이(de novo) 형성시킨다.
재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드(rdsRN) 생성, 세균 패키징 균주

Description

재조합 이중 가닥 ＲＮＡ 뉴클레오캡시드의 생성 및 제조에 유용한 세균 패키징 균주 및 그의 용도{BACTERIAL PACKAGING STRAINS USEFUEL FOR GENERATION AND PRODUCTION OF RECOMBINANT DOUBLE-STRANDED RNA NUCLEOCAPSIDS AND USES THEREOF}
본 발명은 진핵 세포 또는 조직에서 백신 항원, 생물활성 단백질, 면역조절 단백질, 안티센스 RNA 및 촉매 RNA를 암호화하는 RNA의 제조를 위한 재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드(rdsRN)의 생성에 유용한 세균 패키징 균주를 제공한다. 특히, 본 발명은 재조합 ssRNA가 도입되고 패키징되어 상기 패키징 균주 내에서 복제되고 차례로 관심 RNA를 생산하는 rdsRN을 새로이(de novo) 형성하는 세균 패키징 균주를 제공한다.
바이러스 핵단백질 코어인 바이러스 뉴클레오캡시드는 상기를 생물 시스템에서 이종 유전자 서열을 발현하는데 가치 있게 할 수 있는 다수의 특징들을 갖는다. 완전한 바이러스의 외막 및 부착소가 결여된 뉴클레오캡시드는 핵산 서열을 단백질 막으로 싸서 복제하는 능력을 유지하는 바이러스 코어의 단백질 및 유전자 물질로 이루어진 비감염성 입자이다. 따라서 세포막, 부착소, 프로테아제, 및 모 바이러스의 다른 감염 또는 세포용해 인자를 암호화하는 서열의 제거에 의해 감염 또 는 환경 유포의 위험성을 경감시킬 수 있다. RNA 뉴클레오캡시드는 그의 복제 주기에서 DNA 단계를 나타내지 않고 따라서 외래 뉴클레오타이드 서열의, 상기 서열이 도입되는 세포 또는 유기체의 게놈 내로의 혼입 위험을 감소시키는 바이러스 전구체를 선택함으로써 상기와 같은 유전자 발현 시스템의 안전성을 더욱 개선시킨다. RNA 고유의 불안정성은 상기와 같은 뉴클레오캡시드 발현 시스템의 디자인에서 이중 가닥 RNA(본 발명에서 "dsRNA") 바이러스의 사용에 의해 취소될 수 있다. 더욱이, 비 뉴클레오캡시드 서열의 제거 및 dsRNA 바이러스 게놈의 전형적인 구획화는 결실된 서열을 대체하고 이종 RNA를 암호화하는 인공 게놈 구획의 디자인을, 관심 유전자를 발현하거나 관심 RNA를 생물 시스템 내로 전달하는 매력적인 수단으로 만든다. 따라서 재조합 뉴클레오캡시드 발현 시스템을 상기가 추가적인 뉴클레오캡시드의 생산만을 암호화하는데 필요한 서열, 관심 이종 서열, 및 세포에서 그의 증식 및 생산에 필요한 서열을 함유하도록 디자인할 수 있다.
시스토비리다에 과의 이중 가닥 RNA 파지(본 발명에서 "dsRP")는 전형적인 ds RNA 바이러스이다(Sinclair et al., J Virol. 16:685:1975); (Mgraw et al., J Virol. 58:142; 1986); (Gottlieb et al., Virology 163:183; 1988); (Mindich et al., J Virol. 62:1180; 1988); (Mindich, Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63, 149; 1999). 시스토비리다에 dsRP의 특징적인 특성은, 구획-L, 구획-M 및 구획-S로 나타내는 3 개의 이중 가닥 RNA(본 발명에서 "dsRNA") 구획(Mcgraw et al., 상기, 1986); (Gottlieb et al., 상기, 1988); (Mindich et al., 상기, 1988), 및 지질 함유 세포막(Sands and Lowlicht, Can J Microbiol, 22:154; 1976); (Bamford, and Palva, Biochim Biophys Acta, 601:245; 1980)으로 구성된 게놈이다. 상기 게놈 구획들은, 단백질 P1, P2, P4 및 P7로 구성되고 dsRNA 구획-L 상에서 암호화되는 유전자(예를 들어 GenBank Accession #AF226851)에 의해 생산되는 뉴클레오캡시드 코어 내부에 함유된다. 양성 가닥 RNA(본 발명에서 "mRNA")의 합성은 상기 뉴클레오캡시드 내부에서 일어나며 구획-L 상의 유전자-2에 의해 부분적으로 암호화된 RNA-의존성 RNA 폴리머라제에 의해 수행되고(Mindich et al., 상기, 1988); (Van Etten et al., J Virol, 12:464; 1973); 구획-L 상의 유전자-7은 또한 mRNA 합성에 한 역할을 한다(Mindich, et al., 상기, 1999).
dsRNA 파지의 상기 계열의 원형인 DsRP 파이-6은 통상적으로 슈도모나스 시린자에를 감염시키나(Mindich et al., 상기, 1999), 보다 최근에 단리된 dsRP 파이-8, 파이-11, 파이-12 및 파이-13은 에스케리키아 콜라이 균주 JM109(아메리칸 타입 티슈 컬쳐 콜렉션(본 발명에서 "ATCC") # 53323) 및 살모넬라 엔테리카 혈청형 타이피뮤리움(본 발명에서 "에스 타이피뮤리움"으로 나타냄)의 O-항원 음성 돌연변이체를 어느 정도 감염시키고 복제할 수 있다(Mindich et al., 상기, 1999); (Mindich et al. J. Bacteriol, 181:4505; 1999); (Hoogstraten et al., Virology, 272:218; 2000); (Qiao et al., Virology 275:218; 2000).
세균에서의 원형 dsRP 파이-6의 생활사가 개시되었다(Mindich, Adv Virus Res, 35:137; 1988); (Mindich, et al., 상기, 1999). 파이-6은 섬모에 결합하여 숙주 세포막과 접촉하여 뉴클레오캡시드를 원형질막 내로 융합 및 도입시킴으로써 숙주 세포를 감염시킨다. 이어서 상기 뉴클레오캡시드는 상기 원형질막 내로 운 반되며, 이는 단백질 P5의 엔도펩티다제 활성과 단백질 P8의 운반 성질을 필요로 하는 사건이다. 흥미롭게도, 완전한 P8 외피를 갖는 뉴클레오캡시드는 세균 원형질체 내로 자발적으로 들어가, 상기 원형질체를 제조하는 세균 균주의 자기형질감염을 발생시킬 수 있다(Qiao et al., Virology 227:103; 1997); (Olkkonen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 87:9173; 1990).
P8은 원형질체 내로 들어갈 때, 외피를 벗으며, 3 개의 dsRNA 구획을 함유하고 RNA-의존성 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 나머지 뉴클레오캡시드는 dsRNA 구획 L, M 및 S의 mRNA 사본을 합성하기 시작한다. 구획-L에 의해 생성된 단백질은 주로 프로캡시드 생산과 관련되며; 구획-M은 주로 결합 단백질의 합성에 기여하고 구획-S는 프로캡시드 외피 단백질(P8), 세포용해성 엔도펩티다제(P5), 및 지질 외막의 생성과 관련된 단백질(P9 및 P12)을 생산한다(Johnson and Mindich, J Bacteriol, 176:4124; 1994). dsRNA 구획의 패키징은 연속적인 방식으로 일어나며, 이때 구획-S는 빈 프로캡시드에 의해 인식되고 흡수되며; 구획-S를 함유하는 프로캡시드는 더 이상 상기 구획과 결합하지 않지만 이제 구획-M과 결합하고 이를 흡수할 수 있고; 구획 S 및 M을 함유하는 프로캡시드는 더 이상 상기 구획들과 결합하지 않지만 이제 구획-L과 결합하여 이를 흡수할 수 있으며, 그 결과 뉴클레오캡시드를 생성시킨다. 일단 상기 뉴클레오캡시드가 3 개의 단일 가닥 RNA(본 발명에서 "ssRNA") 구획을 모두 함유하면, 음성 RNA 가닥의 합성이 시작되어 dsRNA 구획을 생산하기 시작한다. 이어서 상기 뉴클레오캡시드는 단백질 5 및 8과 회합하고 마지막으로 지질 막으로 둘러싸여 파지 조립을 완료한다. 숙주 세포의 용해 는, 구획-M의 산물인 막 파괴 단백질 P10의 축적을 통해 일어나며 엔도펩티다제 P5를 필요로 하는 것으로 생각된다(Mindich et al., 상기, 1999).
dsRP 프로캡시드에서 상기의 조립 및 RNA 폴리머라제 활성은, 구획-L의 cDNA 사본을 발현한 이 콜라이 JM109 유도체로부터 정제된 프로캡시드가 정제된 ssRNA 구획 L, M 및 S를 패키징할 수 있으므로 숙주 단백질을 필요로 하지 않는다(Mindich et al., 상기, 1999); (Qiao et al., 상기, 1997). 상기 ssRNA 구획의 상기 생체 외 시스템에서의 흡수에 이어서, 리보뉴클레오타이드를 첨가한 결과 음성 가닥이 합성되고 성숙한 dsRNA 구획들이 생성되었다. 더욱 또한, dsRNA 합성의 완료 후에, P8은 뉴클레오캡시드와 회합하고, 상기 나타낸 바와 같이, 생성된 산물은 세균 원형질체에 들어가 생산적인 감염을 생성시킬 수 있다(Qiao et al., 상기, 1997).
선행 연구는 재조합 dsRP(본 발명에서 "rdsRP"라 칭함)의 생성을 개시한다(Mindich, Adv Virus Res 53:341:1999); (Onodera et al., J Virol 66:190; 1992). 유사한 rdsRP를, 가나마이신 내성 대립유전자를 dsRP 파이-6의 구획-M 내에 삽입하여 제작하였다. 상기 재조합 구획을 갖는 rdsRP를, 상기 재조합 구획-M을 발현한 플라스미드를 운반하는 JM109를 야생형 dsRP 파이-6으로 감염시켜 단리하였다. 이러한 접근법을 통해, 담체 상태를 숙주 세포에 확립시켰으며, 상기 숙주 세포에서는 감염성 rdsRP가 상기 담체 균주에 의해 연속적으로 생산되었다(Onodera et al., 상기, 1992); (Mindich, Adv Virus Res 53:341; 1999). 상기 담체 균주에 의해 생산된 파지의 플라크 형성 능력은 3 내지 5 회 플레이트 계대 접종 동안 유지되었으나; 추가적인 계대 접종 후 발생 파지는 더 이상 상기 담체 균주 상에 플라크를 형성시키지 않았으며 낮은 수준의 감염성 파지가 여전히 생산되었다(Onodera et al., 상기, 1992). 일부의 경우, 상당 수의 담체 균주들이 감염성 파지를 함께 생산하는 능력을 상실하였으며; 상기와 같은 세균 균주로부터의 dsRNA는 구획들 중 하나 이상에서 결실을 나타내었다(Onodera et al., 상기, 1992). 일례로, 구획-S가 결여된 돌연변이 파지가 파지 생산 능력을 상실한 상기와 같은 하나의 담체 파지로부터 단리되었다. 어떠한 경우에도 rdsRN을, 상기 시스템을 진핵 세포 또는 조직에서 발현하도록 적응시킬 목적으로 제작하지 않았다. 따라서, 상기 방법에 의해 생산된 rdsRP는 본질적으로 불안정하고 파지 조립 및 복제의 분석에 유용하지 않으며; 종래 기술에 의해 제공된 rdsRP는 생물공학 용도 및 대규모 제작에 적합하지 않다.
최근에, 진핵 세포에서 mRNA를 발현할 수 있는 rdsRP를 개발할 수 있고 상기와 같은 rdsRP가 진핵 세포 또는 조직에서 백신 항원, 생물활성 단백질, 면역조절 단백질, 안티센스 RNA 및 촉매 RNA의 발현에 유용할 수 있음이 제시되었다(미국 특허 출원 제 20040132678 호(Hone)(이후부터 20040132678), 이는 본 발명에 참고로 인용된다). 20040132678은 rdsRP의 유용성에 대한 광범위한 정보를 제공하며, 모델 rdsRP를 개시하고, 상기를 생성시키고 사용하기 위한 방법을 제안한다. 그러나, 20040132678은 rdsRP를 새로이 진수하는(launching) 방법, 또는 상기 rdsRP를 포함하고 복제하는 안정한 담체 균주를 생성시키고 단리하는 방법에 대한 지침은 제공하지 않는다. 일례로, 20040132678에서 rdsRP의 배치를, 플라스미드(이는 차 례로 관심 재조합 구획을 발현한다)를 운반하는 세균 형질전환체에서 모 dsRP를 복제함으로써 생성시킬 수 있다. 상기 설명으로부터 상기와 같은 rdsRP가 4 개의 dsRNA 구획(즉 3 개의 야생형 구획과 재조합 구획)을 함유하는지 혹은 상기와 같은 rdsRP가 3 개의 dsRNA 구획, 2 개의 야생형 구획 및 재조합 구획을 함유하는지는 불명확하다. 상기 어느 경우든, 상기 rdsRP가 증식을 위해 야생형 헬퍼 파지에 얼마나 의존성인지가 불명확하며; 상기 rdsRP가 상기 야생형 dsRP로부터 어떻게 분리될 수 있는지가 또한 불명확하다. 더욱 또한, 20040132678은 재조합 구획들을 dsRP에 안정하게 혼입시키는 특정한 방법을 제공하지 않으며, 단지 rdsRP의 후속적인 복제 및 안정한 생산을 위한 특정한 방법에 대한 불충분한 주목만을 제공할 뿐이다. 더욱이, 20040132678은 야생형 구획-M 및 구획-S가 모두 결여된 안정한 rdsRP 조성물을 제공하지 않는다. 최종적으로, 20040132678은 또한 구획-L을 발현하고 프로캡시드를 생산하며, 따라서 rdsRP를 새로이 진수하고 rdsRP를 안정하게 생산할 수 있는 패키징 균주를 제공하지 않는다.
따라서, 20040132678은 당해 분야의 숙련가들이 패키징 균주를 생성시키고 rdsRP를 안정하게 생산할 수 있게 하는 적합한 정보를 제공하지 않는다. 더욱 또한, 20040132678은 본 발명의 주제인 신규의 rdsRN 조성물, 또는 패키징 균주, 또는 rdsRN을 진수하고 안정하게 생산하고 사용하는 방법을 논의하거나 제시하지 않는다.
발명의 요약
본 발명에 따라, 재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드(rdsRN)는 작용성 이 중 가닥 RNA 바이러스 또는 박테리오파지 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 하나 이상의 dsRNA 구획 및 숙주(예를 들어 세균) 세포에서 선택성 표현형 돌연변이, 예를 들어 영양요구성 돌연변이, 세포벽 합성 돌연변이, 또는 동결 온도를 초과하는 온도에서의 생육을 방지하는 돌연변이를 보완하는(complement) 작용성 산물을 암호화하는 하나 이상의 유전자를 포함하는 하나 이상의 재조합 dsRNA 구획을 포함한다. 바람직하게는, 상기 dsRN 구획은 항원보강제의 존재 또는 부재 하에서 관심 이종 유전자, 예를 들어 면역원을 암호화하는 RNA를 포함하며, 이는 면역 반응을 유도하는 백신에 본 발명을 사용할 수 있게 하지만, 상기와 같은 rdsRN에 의해 생산되는 mRNA의 작용을 상기 작용으로 제한하지 않는다. 상기와 같이 생산된 RNA는 항원보강제, 면역조절 단백질, 치료 단백질, 다른 생물활성 단백질을 암호화하거나, 또는 상기 RNA 자체가 siRNA 또는 촉매 RNA로서 작용할 수 있다. rdsRN은 안정성 및 취급성 및 안전성 등에 관하여 rdsRP에 비해 이점을 갖는다. 상기 rdsRN은 선택성 표현형 돌연변이를 포함하여 상기 세균 패키징 균주 내에서 상기 rdsRN의 선택 및 유지를 허용하는 세균 패키징 균주 세포에 잠복한다.
본 발명의 예시적인 실시태양들을 도 1 내지 3에 도식적으로 나타낸다. 각각의 도 1 내지 3에서, (10)은 세균 세포를 나타내고; (20)은 세균 세포(10)의 게놈 DNA를 나타내고; (30)은 뉴클레오캡시드(패키징 활성 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질들로 구성됨)를 나타내고; (31)(뉴클레오캡시드(30) 내의 3 개의 파선)은 뉴클레오캡시드(30) 내에 함유된 dsRNA를 나타낸다. 마찬가지로, 도 1 내지 3 각각에서, (21)은 게놈 DNA(20) 중의 선택성 표현형 돌연변이를 나타낸다.
도 1 내지 3 각각에서 볼 수 있는 바와 같이, 2 개의 요소(40) 및 (41)는 dsRNA(31)와 시종일관 회합하고 있다. (40)은 선택성 표현형 돌연변이(21)를 보완하는 유전자 산물을 암호화하는 핵산 서열을 나타내고, (41)은 관심 RNA를 암호화하는 핵산 서열을 나타낸다.
세 번째 요소(42)는 도 1 내지 3에서 각각 발견되나, 그의 위치가 다양하다. (42)는 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자(예를 들어 패키징 활성 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자)를 암호화하는 핵산 서열을 나타낸다. 도 1은 핵산 서열(42)이 뉴클레오캡시드(30) 내부의 dsRNA 서열(31) 내에 위치함을 예시하는 본 발명의 실시태양을 예시한다. 본 발명의 또 다른 실시태양에서, 도 2에 예시된 바와 같이, 핵산 서열(42)이 세균 게놈 DNA(20) 내에 위치한다. 도 3에 예시된 본 발명의 더욱 또 다른 실시태양에서, 세균 세포(10)가 또한 플라스미드(70)를 포함하고 핵산 서열(42)이 플라스미드(70) 상에 위치한다.
본 발명의 목적은 세균 패키징 균주를 제공하는 것이며, 상기 균주는 상기 균주 중의 dsRP 프로캡시드를 암호화하는 서열 및 상기 균주의 돌연변이를 보완하는 작용성 유전자를 발현하는 rdsRN의 선택 및 유지를 가능하게 하는 돌연변이를 포함한다. 하나의 실시태양에서, 유전자 또는 RNA를 패키징, 생산 및/또는 전달하기 위한 세균 균주를 제공하며, 상기 균주는 a) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA; b) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 하나 이상의 뉴클레오캡시드; c) 상기 하나 이상의 뉴클레오캡시드 내에 함유된 dsRNA 서열로, 상기 RNA 서열은 적어도 i) 상기 하나 이상의 선택성 표 현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물, 및 ii) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA를 암호화하며; d) 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 목적은 rdsRNA를 생성시키는 방법을 제공하는 것이며, 이때 재조합 RNA 구획을 세균 패키징 균주에 도입시키고, 패키징시켜 진핵세포 번역 발현 카세트를 함유하는 재조합 뉴클레오캡시드를 제조하고, 이에 의해 상기 rdsRN을 새로이 진수한다.
본 발명의 추가의 목적은 세균 균주에서 안정하게 복제할 수 있는 rdsRN을 제공하는 것이다. 하나의 실시태양에서, a) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질, 및 b) 적어도 i) 유전자 산물 및 ii) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA를 암호화하는 dsRNA 서열을 포함하는 재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드(rdsRN)를 제공한다.
본 발명의 더욱 또 다른 목적은 양성 선택 대립유전자를 암호화하는 하나 이상의 rdsRNA 구획 및 작용성 진핵세포 번역 발현 카세트를 함유하는 rdsRN을 안정하게 생산하는 세균 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 알파바이러스 발현 카세트, 예를 들어 비 제한적으로 셈리키 포레스트 바이러스(Berglund et al., Vaccine 17:497; 1999) 또는 베네수엘라 말 뇌염(본 발명에서 "VEE"로 나타냄) 바이러스를 운반하는 rdsRN을 안정하게 생산하는 세균 균주를 제공하는 것이다(Davis et al., J Virol 70:3781; 1996); (Caley et al., J Virol 71:3031; 1997).
본 발명의 더욱 또 다른 목적에서, rdsRN을 진핵세포 및 조직에 투여하는 방법, 및 표적 세포 집단에서 면역 반응을 유도하거나 생물 효과를 일으키기 위한 rdsRN의 용도를 제공한다.
본 발명의 또 다른 목적은 rdsRN을 패키징할 수 있는 생 세균 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 더욱 또 다른 목적은 rdsRN을 안정하게 유지할 수 있는 생 세균 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 목적은 세균 벡터 균주에서 복제할 수 있는 rdsRN을 제공하는 것이다.
본 발명의 더욱 추가의 목적은 rdsRN을 포유동물 세포 및 조직으로 전달하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 더욱 추가의 목적은 표적 세포 또는 조직에서 면역 반응을 유도하거나 생물 효과를 일으키기 위한 rdsRN을 운반하는 상기 세균 벡터의 사용 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 숙주 세균에 의해 포함되는 선택성 표현형 돌연변이는 바람직한 실시태양에서 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이이다.
본 발명의 추가의 목적은 상기 세균 및/또는 상기 dsRN을 포함하는 일렉트로포레이션 매질을 제공하는 것이다. 더욱 추가의 실시태양에서, dsRNA의 성분을 암호화하는 다양한 플루오르화된 RNA를 제공한다.
본 발명의 상기 및 다른 목적은 본 원에 제공된 본 발명의 상세한 설명으로 부터 자명할 것이다. 예시적인 실시태양으로서, 세균 패키징 균주에서 프로캡시드를 발현하는 dsRP 파이-8의 구획-L을 암호화하는 서열 및 상기 균주에서 작용성 asd 유전자를 발현하는 rdsRN의 선택 및 유지를 가능하게 하는 asd 돌연변이를 포함하는 상기 균주를 개시한다. 더욱이, 백신 항원 및 정보제공 유전자를 암호화하는 원형 rdsRN을 개시하며 포유동물 환경에서 암호화된 항원 및 정보제공 유전자의 발현을 수행하는 상기 rdsRN의 능력을 입증한다.
도 1은 뉴클레오캡시드를 함유하는 세균 세포의 개략적인 표현으로, 여기에서 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열이 뉴클레오캡시드 내부의 dsRNA 서열 내에 위치한다.
도 2는 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열이 세균 세포의 게놈 DNA에 위치하고 있는, 뉴클레오캡시드를 함유하는 세균 세포의 개략적인 표현이다.
도 3은 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열이 플라스미드 상에 위치하고 있는, 뉴클레오캡시드를 함유하는 세균 세포의 개략적인 표현이다.
도 4는 다양한 파이-8 재조합 구획-S 및 -M(각각 rS, rS2 및 rM)의 발현 카세트를 나타낸다. 하기 실시예 섹션에 나타낸 바와 같이, 양성 선택 대립유전자는 asd 유전자이고 관심 유전자는 후보 마이코박테리움 결핵 항원 및 Hc-Red 형광 단백질을 암호화한다. rS 및 rS2는 pT7/T3-18의 PstI 부위 내로 클로닝되었다. rM은 KpnI/PstI 단편으로서 pcDNA3.1ZEO의 각각의 부위 내로 클로닝되었다. 모든 재조합 구획들은 T7 프로모터의 전사 조절 하에 놓였다.
도 5는 알파바이러스(셈리키 포레스트 바이러스) 자기증폭 복제단위(nsp1-4 및 레플리카제 결합 서열)를 포함하는 rS 발현 카세트를 나타낸다.
도 6은 세균 패키징 균주의 발생 및 작용의 개략도이다.
도 7은 개시된 패키징 균주 및 모 균주의 침입 특성을 제공한다.
도 8은 프로캡시드의 생체 내 조립을 나타내는 프로캡시드-특이 항혈청으로 탐침된 변성 전후의 에스 플렉스네리 MPC51pLM2653의 완전 세포 용해물의 면역블럿이다.
도 9는 조립된 프로캡시드를 나타내는 에스 플렉스네리 MPC51pLM2653의 전자 현미경사진이다.
도 10은 LSMtb4로 표시하는 rdsRN를 함유하는 패키징된 에스 플렉스네리 MPC51pLM2653의 RT-PCR로, 두 번째 가닥의 합성을 가리키는 (+) cDNA의 가닥 및 (-) 가닥의 존재를 나타낸다.
도 11은 자기증폭하는 뉴클레오캡시드 LSMtb4를 함유하는 에스 플렉스네리 MPC51의 전자 현미경 사진이다.
도 12는 야생형 구획 -S, -M 및 -L을 암호화하는 RNA를 갖는 슈도모나스 시린자에 균주의 일렉트로포레이션에 의해 재현된 야생형 박테리오파지 파이-8을 갖는 상기 균주의 전자 현미경 사진이다.
도 13은 진핵세포에 의한 항원85A의 발현을 나타내는, 항원85A 특이 항혈청으로 탐침된 LSMtb4로 표시하는 rdsRN를 함유하는 에스 플렉스네리 MPC51에 의한 침입 후 14 시간째의 HeLa 세포의 형광 현미경 사진이다.
도 14는 진핵 세포 내의 LSMHc-Red 생산된 mRNA로부터 번역된 Hc-Red 단백질의 직접적인 형광을 나타내는, LSMHc-Red로 표시하는 rdsRN을 갖는 에스 플렉스네리 MPC51에 의해 침입된 후 12 시간째의 HeLa 세포의 형광 현미경 사진이다.
도 15는 진핵 세포에서 Hc-Red 단백질의 발현을 입증하는, Hc-Red-특이 항혈청으로 탐침된 LSMHc-Red로 표시하는 rdsRN을 갖는 에스 플렉스네리 MPC51에 의해 침입된 후 12 시간째의 HeLa 세포의 형광 현미경 사진이다.
1. 세균 패키징 균주의 제작
본 발명은 세균 패키징 균주에서 작용성 이중 가닥 RNA 파지/바이러스(dsRP) 프로캡시드 단백질을 암호화하고 발현하여, 프로캡시드의 조립 및 dsRNA의 패키징을 허용하여 상기 패키징 균주 내에 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드(dsRN)를 형성시키는 DNA 서열을 함유하는 상기 균주를 제공한다. 또한, 상기 dsRNA를 관심 작용성 유전자, 예를 들어 트랜스유전자를 암호화하고 발현하는 서열을 함유하도록 유전자 가공할 수 있다. 따라서 상기 dsRNA는 재조합 dsRNA(rdsRNA)이며 상기 뉴클레오캡시드는 재조합 dsRN(rdsRN)이다. 상기 패키징 균주는 또한 상기 균주에서 선택성의 치명적인 결손을 생성시키는 유전자 돌연변이를 함유한다. 상기 rdsRN을 상기 돌연변이에 의해 생성된 선택성 결손을 보완하는 작용성 유전자를 암호화하고 발현하여 세균 패키징 균주 내에 상기 rdsRN의 선택 및 유지를 가능하게 하도록 유전자 가공한다.
상기 dsRNA 파지의 하기 요소들을 상기 rdsRN에 포함시킨다: 구획-L; 구획-S pac 서열; 구획-S RNA-의존성 RNA 폴리머라제 인식 서열; 구획-M pac 서열; 및 구획-M RNA-의존성 RNA 폴리머라제 인식 서열. 양성 선택 대립유전자를 하기와 같이 파지 내로 유전자 가공할 수 있다: 양성 선택 대립유전자를 예를 들어 구획-S 상의 유전자-8의 리보솜 결합 부위 또는 구획-M 상의 유전자-10의 리보솜 결합 부위 또는 이들 모두에 결합시킬 수 있다. 추가적인 관심 유전자를 작용성 dsRN의 생산에 필요하지 않은 상기 S 및 M 구획의 부분들을 치환시킴으로써 상기 S 및/또는 M 구획 내로 유전자 가공할 수 있다. 한편으로, 상기 S 및 M 구획을 완전히 제거하고 관심 서열을 치환시킬 수 있다. 본 발명에 사용된 바와 같이 "재조합 구획"은 유전적으로 가공된 S 및/또는 M 구획, 또는 상기 S 및/또는 M 구획을 대체하는 관심 서열을 지칭한다.
본 발명에 개시된 시스템은 임의의 이중 가닥 RNA 파지 또는 바이러스를 사용하여 작용할 수 있지만, 실시예 섹션에 개시된 예시적인 파이-8 rdsRN 시스템은 바람직하게는 하기 시스토비리다에 게놈(들)의 요소들을 사용하여 작용한다:
(i) 구획-L 및 상기 상의 모든 유전자,
(ii) 구획-S 및 -M의 pac 서열,
(iii) 구획-S 및 -M의 3-프라임 말단 폴리머라제 결합 서열,
(iv) 구획-S의 유전자 8.
상기 파이-8의 예에서, 유전자 8을 제외한 구획-S 및 -M 상의 모든 암호화 서열이 결실되며, 상기 서열은 rdsRN 시스템이 작용하는데 필요하지 않다. 또한, 관심 유전자의 발현에 필요하거나 바람직한 외부 서열, 예를 들어 IRES 요소, 각각 진핵 및 원핵 세포에서 번역 개시를 위한 Kozak 및 Shine-Dalgarno 서열, 폴리아데닐화 서열, 프로모터 서열, 증대 인자, 전사 종결자, 리더 펩타이드 서열, 및 단백질 정제용 분자 표지, 예를 들어 His 표지를 상기 재조합 구획에 포함시킬 수 있다.
본 발명의 실시에 따라, 구획-L을 염색체 외 발현 벡터에서 또는 세균 염색체 내로의 통합에 의해 상기 세균 패키징 균주 내로 도입시킬 수 있으며, 상기 제조합 구획을 하기 상세히 개시하는 바와 같이 일렉트로포레이션을 통해 세균 패키징 균주 내로 도입시킨다.
본 발명에서 상기 패키징 균주가 유래되는 세균 균주들은 중요하지 않지만, 상기 균주로는 비 제한적으로 캄필로박터 스페시즈, 네이세리아 스페시즈, 하에모필루스 스페시즈, 아에로모나스 스페시즈, 프란시셀라 스페시즈, 예르시니아 스페시즈, 클렙시엘라 스페시즈, 보르데텔라 스페시즈, 레지오넬라 스페시즈, 코리네박테리움 스페시즈, 시트로박터 스페시즈, 클라마이디아 스페시즈, 브루셀라 스페시즈, 슈도모나스 스페시즈, 헬리코박터 스페시즈, 또는 비브리오 스페시즈가 있다.
사용되는 특정한 캄필로박터 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 캄필로박터 균주의 예로는 비 제한적으로 씨 제주니(ATCC 번호 43436, 43437, 43438), 씨 하이오인테스티날리스(ATCC 번호 35217), 쎄 페투스(ATCC 번호 19438), 쎄 페칼리스(ATCC 번호 33709), 씨 도이레이(ATCC 번호 49349) 및 씨 콜라이(ATCC 번호 33559, 43133)가 있다.
사용되는 특정한 예르시니아 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 예르시니아 균주의 예로는 비 제한적으로 와이 엔테로콜리티카(ATCC 번호 9610) 또는 와이 페스티스(ATCC 번호 19428), 와이 엔테로콜리티카 Y대3-R2(al-Hendy et al., Infect. Immun., 60:870; 1992) 또는 와이 엔테로콜리티카 aroA(O'Gaora et al., Micro. Path., 9:105; 1990)가 있다.
사용되는 특정한 클렙시엘라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 클렙시엘라 균주의 예로는 케이 뉴모니아에(ATCC 번호 13884)가 있다.
사용되는 특정한 보르데텔라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 보르데텔라 균주의 예로는 비 페르투시스, 비 브론키셉티카(ATCC 번호 19395)가 있다.
사용되는 특정한 네이쎄리아 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 네이쎄리아 균주의 예로는 엔 메닌지티디스(ATCC 번호 13077) 및 엔 고노로에아에(ATCC 번호 19424), 엔 고노로에아에 MS11 aro 돌연변이체(Chamberlain et al., Micro. Path., 15:51-63; 1993)가 있다.
사용되는 특정한 아에로모나스 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 아에로모나스 균주의 예로는 에이 살미노시다(ATCC 번호 33658), 에이 슈베리(ATCC 번호 43700), 에이 하이드로필라, 에이 유크레노필라(ATCC 번호 23309)가 있다.
사용되는 특정한 프란시셀라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 프란시셀라 균주의 예로는 에프 툴라렌시스(ATCC 번호 15482)가 있다.
사용되는 특정한 코리네박테리움 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 코리네박테리움 균주의 예로는 씨 슈도투베르큘로시스(ATCC 번호 19410)가 있다.
사용되는 특정한 시트로박터 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 시트로박터 균주의 예로는 씨 프레운디(ATCC 번호 8090)가 있다.
사용되는 특정한 클라미디아 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 클라미디아 균주의 예로는 비 제한적으로 씨 뉴모니아에(ATCC 번호 VR1310)가 있다.
사용되는 특정한 하에모필루스 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 하에모필루스 균주의 예로는 에이치 인플루엔자에(Lee et al., J. Biol. Chem. 270:27151; 1995), 에이치 솜누스(ATCC 번호 43625)가 있다.
사용되는 특정한 브루셀라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 브루셀라 균주의 예로는 비 아보르투스(ATTC 번호 23448)가 있다.
사용되는 특정한 레지오넬라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 레지오넬라 균주의 예로는 엘 뉴모필라(ATCC 번호 33156) 또는 엘 뉴모필라 mip 돌연변이체(Ott, FEMS Micro. Rev., 14:161; 1994).
사용되는 특정한 슈도모나스 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 슈도모나스 균주의 예로는 피 아에루기노사(ATCC 번호 23267)가 있다.
사용되는 특정한 헬리코박터 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 헬리코박터 균주의 예로는 에이치 파이로리(ATCC 번호 43504), 에이치 무스텔라에(ATCC 번호 43772)가 있다.
사용되는 특정한 비브리오 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 비브리오 균주의 예로는 비브리오 콜레라에(ATCC 번호 14035), 비브리오 신시나티엔시스(ATCC 번호 35912), 브이 콜레라에 RSI 독성 돌연변이체(Taylor et al., J. Infect. Dis., 170:1518-1523; 1994); 및 브이 콜레라에 ctxA, ace, zot, cep 돌연변이체(Waldor J et al., Infect., Dis., 170:278-283; 1994)가 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명에서 패키징 균주가 발생하는 세균 균주는 패키징 균주로서 및 백신 벡터로서 모두 작용할 가능성을 갖는 세균, 예를 들어 엔테로박테리아세아에, 예를 들어 비 제한적으로 에스케리키아 스페시즈, 시겔라 스페시즈 및 살모넬라 스페시즈를 포함한다. 그람 양성 및 산-내성 패키징 및 벡터 균주를 리스테리아 모노시토제네스 또는 마이코박테리움 스페시즈로부터 유사하게 제작할 수 있다.
사용되는 특정한 에스케리키아 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 에스케리키아 균주의 예로는 에스케리키아 콜라이 DH5α, HB101, HS-4, 4608-58, 1184-68, 53638-C-17, 13-80, 및 6-81(예를 들어 문헌[Sambrook et al., 상기; Grant et al., 상기; Sansonett et al., Ann. Microbiol. Inst. Pasteur, 132A:351; 1982]을 참조하시오), 장독성 이 콜라이(예를 들어 문헌[Evans et al., Infect. Immun., 12:656; 1975]을 참조하시오), 장병원성 이 콜라이(예를 들어 문헌[Donnenberg et al., J. Infect. Dis., 169:831; 1994]을 참조하시오), 장침입성 이 콜라이(예를 들어 문헌[Small et al., Infect Immun., 55:1674; 1987]을 참조하시오) 및 장출혈성 이 콜라이(예를 들어 문헌[McKee and O'Brien, Infect. Immun., 63:2070; 1995]을 참조하시오)가 있다.
사용되는 특정한 살모넬라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 살모넬라 균주의 예로는 에스 티피(예를 들어 ATCC 번호 7251 참조), 에스 티피뮤리움(예를 들어 ATCC 번호 13311 참조), 살모넬라 갈리나룸(ATCC 번호 9184), 살로넬라 엔테리디티스(예를 들어 ATCC 번호 4931 참조), 및 살모넬라 티피뮤리움(예를 들어 ATCC 번호 6994 참조), 에스 티피 aroC, aroD 이중 돌연변이체(예를 들어 문헌[Hone et al., Vacc., 9:810-816; 1991]을 참조하시오), 에스 티피뮤리움 aroA 돌연변이체(예를 들어 문헌[Mastoeni et al., Micro. Pathol., 13:477-491; 1992]을 참조하시오)가 있다.
사용되는 특정한 시겔라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 시겔라 균주의 예로는 시겔라 플렉스네리(예를 들어 ATCC 번호 29903 참조), 시겔라 플렉스네리 CVD1203(예를 들어 문헌[Noriega et al., Infect. Immun. 62:5168; 1994]을 참조하시오), 시겔라 플렉스네리 15D(예를 들어 문헌[Sizemore et al., Science 270:299; 1995]을 참조하시오), 시겔라 손네이(예를 들어 ATCC 번호 29930 참조), 및 시겔라 다이센테리아에(예를 들어 ATCC 번호 13313 참조)가 있다.
사용되는 특정한 마이코박테리움 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 마이코박테리움 균주의 예로는 엠 투베르큘로시스 CDC1551 균주(예를 들어 문헌[Griffith et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. Aug; 152(2):808; 1995]을 참조하시오), 엠 투베르큘로시스 베이징 균주(Soolingen et al., 1995) H37Rv 균주(ATCC#25618), 엠 투베르큘로시스 판토테네이트 영양요구 균주(Sambandamurthy, Nat. Med. 2002 8(10):1171; 2002), 엠 투베르큘로시스 rpo V 돌연변이 균주(Collins et al., Proc Natl Acad Sci USA. 92(17):8036; 1995), 엠 투베르큘로시스 류신 영양요구 균주(Hondalus et al., Infect. Immun. 68(5):2888; 2000), BCG 덴마크 균주(ATCC#35733), BCG 일본 균주(ATCC#35737), BCG, 시카고 균주(ATCC#27289), BCG 코펜하겐 균주(ATCC#27290), BCG 파스퇴르 균주(ATCC#35734), BCG 글락소 균주(ATCC#35741), BCG 코노트 균주(ATCC#35745), BCG 몬트리올(ATCC#35746)이 있다.
사용되는 특정한 리스테리아 모노사이토제네스 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 리스테리아 모노사이토제네스 균주의 예로는 엘 모노사이토제네스 균주 10403S(Stevens et al., J. Virol 78:L8210-8218; 2004) 또는 돌연변이성 엘 모노사이토제네시스 균주, 예를 들어 (i) actA plcB 이중 돌연변이체(Peters et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology 35:243-253; 2003); (Angelakopoulous et al., Infect and Immunity 70:3592-3601; 2002); (ii) 알라닌 라세마제 유전자 및 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 유전자에 대한 dal dat 이중 돌연변이체(Thompson et al., Infect and Immunity 66:3552-3561; 1998)가 있다.
패키징 균주의 모체로서 작용하는 균주를 선택하고, 이어서 상기 균주를 유전자 조작하여 dsRP 프로캡시드를 발현하는 DNA 서열을 상기 균주 내에 도입시키고 돌연변이를 도입시켜 상기 균주에서 돌연변이를 보완하는 작용성 유전자를 발현하는 rdsRN의 선택 및 유지를 가능하게 한다.
일반적으로, 구획-L 중의 유전자들은 외피 암호화 단백질 유전자 8을 포함하여, 완전히 작용성인 프로캡시드를 생성시키는데 필요한 단백질을 암호화한다. 그러나, 파이-8 파지의 경우, 유전자 8은 구획 S 상에 위치하며, 상기 유전자 8 산물이 파이-8 프로캡시드의 조립에 필수적이지는 않지만, 효율적으로 자기복제성인 파이-8 뉴클레오캡시드는 작용성 유전자 8 산물을 필요로 한다. 따라서, 파이-8 파지를 본 발명의 실시에 사용하는 경우, 구획 S의 유전자 8을 바람직하게는 상기 구조물에 포함시킨다. 다른 파지의 경우, 유전자 8 활성은 구획 L 상에서 암호화되며, 따라서 구획-L mRNA를 발현하는 능력은 작용성 뉴클레오캡시드를 생산하기에 충분하다. 구획-L이 수득되는 특정한 dsRP는 본 발명에 중요하지 않으며, 여기에는 비 제한적으로 파이-6 구획-L(Genbank 수탁 번호 M17461), 파이-13 구획-L(Genebank 수탁 번호 AF261668), 또는 파이-8 구획-L(Genbank 수탁 번호 AF226851)이 있고, 엘 민디치 박사(Dr. L. Mindich, Department of Microbiology, Public Health Research Institute, NY, NY.)로부터 입수할 수 있다.
한편으로, 구획-L을 암호화하는 cDNA 서열을 어플라이드 바이오시스템스(Applied Biosystems) ABITM 3900 하이 쓰루풋 DNA 합성기(Foster City, CA 94404 U.S.A.) 및 제조사에서 제공한 과정을 사용하여 합성적으로 생성시킬 수 있다. 구획-L의 cDNA 사본 및 재조합 구획-S 및/또는 -M을 합성하기 위해서, 일련의 완전한 길이 서열의 부분 구획들을 당해 분야에 널리 공지된 과정을 사용하여 PCR에 의해 생성시키고 함께 연결시켜 완전한 길이의 구획을 형성시킨다(Ausubel et al., 상기, 1990). 간단히, 길이가 100 내지 200 뉴클레오타이드인 합성 올리고뉴클레오타이드(즉 바람직하게는 인접 서열을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드의 5' 및 3' 단부에서 일치하는 5'- 및 3' 단부의 서열을 갖는다)를 자동화된 DNA 합성기(예를 들어 어플라이드 바이오시스템스 ABITM 3900 하이 쓰루풋 DNA 합성기(Foster City, CA 94404 U.S.A.))를 사용하여 제조한다. 동일한 접근법을 사용하여, 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 상보적인 짝과 어닐링시켜 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 형성시킨다. 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 쌍(즉 인접 서열을 암호화하는 것)을 연결에 의해 결합시켜 보다 큰 단편을 형성시킨다. 이들 보다 큰 단편을 아가로스 젤 전기영동에 의해 정제하고 젤 정제 키트(E.g. The QIAEX(등록상표) II Gel Extraction System, Qiagen, Santa Cruz, CA, 목록 번호 12385)를 사용하여 단리시킨다. 이러한 과정을 완전 길이 DNA 분자가 생성될 때까지 반복한다. 각 라운드의 연결 후에, 상기 단편들을 PCR에 의해 증폭시켜 수율을 증가시킨다. 신 합성 유전자 제작 과정은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 그 밖에 어디에나 개시되어 있으며(Andre et al., 상기, 1998); (Haas et al., 상기, 1996); 한편으로, 합성 유전자를 예를 들어 미드랜드 서티파이드 리에이전트 캄파니(Midland Certified Reagent Co. Midland, TX)로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
본 발명이 변경되지 않은 구획-L 서열의 사용을 개시하고 있지만, 상기 서열의 불 활성화 또는 돌연변이 유도체를 생성시키는, 그러나 작용성 프로캡시드의 형성은 방해하지 않는 변경을 또한 실질적으로 본 발명의 의도로부터 이탈됨 없이 사용할 수 있음은 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다.
구획-L의 발현에 사용되는 특정한 프로모터는 본 발명에 중요하지 않으며 표적 균주에서 작용하는 임의의 프로모터, 예를 들어 비 제한적으로 유도성 프로모터, 예를 들어 PBAD(Genbank 수탁 번호 X81838) 및 PpagC(Genbank 수탁 번호 M55546) 또는 구성 프로모터, 예를 들어 PIpp(Genbank 수탁 번호 V00302) 및 PompA(Genbank 수탁 번호 X02006)일 수 있다.
구획-L을 발현 벡터, 예를 들어 pT7/T3-18(Ambion, Austin, TX, 목록 번호 7201)에서 패키징 균주에 도입시키거나, 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법(E.g. PCR, DNA 정제, 제한 엔도뉴클레아제 절단, 아가로스 젤 전기영동, 연결)을 사용하여 대립유전자 교환에 의해 염색체에 통합시킬 수 있다. 염색체 통합의 위치는 본 발명에 중요하지 않지만, 바람직한 실시태양에서 구획-L 발현 카세트를 암호화하는 DNA를, 유전자를 불활성화시키고 한정된 배양 조건 하에서 선택성 표현형(예를 들어 aroA(Genbank 수탁 번호 X00557), aroC(Genbank 수탁 번호 AY142231), leuD(Genbank 수탁 번호 L06666) asd(Genbank 수탁 번호 V00262), murI(Genbank 수탁 번호 AY520970) kdsA(Genbank 수탁 번호 AY174101) 및 htrB(Genbank 수탁 번호 AF401529)을 생성시키기 위해 염색체에 통합시킨다. 염색체 통합 과정 및 상기 돌연변이의 배양 방법은 문헌에 잘 보고되어 있다(Hamilton et al., J. Bacteriol. 171:4617; 1989); (Blomfield et al., Mol. Microbiol. 5:1447; 1991).
패키징 균주에 도입시키는 특정한 돌연변이는 본 발명에 중요하지 않으며 한정된 배양 조건 하에서 선택성 표현형을 생성시킬 수 있는 임의의 돌연변이, 예를 들어 비 제한적으로 영양요구 돌연변이, 예를 들어 aroA(Genbank 수탁 번호 X00557), aroC(Genbank 수탁 번호 AY142231), leuD(Genbank 수탁 번호 L06666) 또는 세포벽 합성에 필수적인 유전자 돌연변이, 예를 들어 asd(Genbank 수탁 번호 V00262) 또는 murI(Genbank 수탁 번호 AY520970) 또는 32 ℃보다 높은 온도에서 생육을 방해하는 돌연변이, 예를 들어 htrB(Genbank 수탁 번호 AF401529)일 수 있다.
임의의 널리 공지된 유전자 기법을 사용하여 돌연변이를 세균에 도입시킬 수 있다. 여기에는 비 제한적으로 화학제, 예를 들어 N-메틸-N'-나이트로-N-나이트로소구아니딘, 아크리딘 오렌지, 에티디움 브로마이드, 또는 자외선에의 비치사 노출을 사용하는 비특이적인 돌연변이가 있다(Miller(Ed), 1991, In: A short course in bacterial genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY). 한편으로, 돌연변이를 표준 유전자 기법, 예를 들어 Tn10 돌연변이, 박테리오파지-매개된 형질도입, 람다 파지-매개된 대립유전자 교환, 또는 접합 전달을 사용하여 도입시킬 수 있다(Miller(Ed), 상기, 1991); (Hone, et al., J. Infect. Dis.156:167; 1987); (Noriega, et al., Infect. Immun., 62:5168; 1994); (Hone, et al., Vaccine, 9:810; 1991); (Chatfield, et al., Vaccine 10:53; 1992); (Pickard, et al., Infect. Immun., 62:3984; 1994); (Odegaard, et al., J Biol Chem 272:19688; 1997); (Lee, et al., J. Biol. Chem., 270:27151; 1995); (Garrett, et al., J. Biol. Chem., 273:12457; 1998). 상기 돌연변이는 점 돌연변이, 코돈 치환, 또는 바람직하게는 비 복귀 결실 돌연변이일 수 있다. 결실 돌연변이는 단일 염기 돌연변이에서 전체 암호화 서열의 결실일 수 있다. 결실 돌연변이는 상기와 같은 돌연변이가 생성물에 보다 큰 안정성을 가져오므로 대규모 돌연변이에 이점을 갖는다.
상기 돌연변이를 구성적으로 발현시키거나 또는 유도성 프로모터, 예를 들어 온도 민감성 열 충격 계열의 프로모터, 또는 혐기적으로 유도되는 nirB 프로모터(Harborne et al., Mol. Micro., 6:2805; 1992) 또는 억제성 프로모터, 예를 들어 uapA(Gorfinkiel et al., J. Biol. Chem., 268:23376; 1993) 또는 gcv(Stauffer et al., J. Bact., 176:6159; 1994)의 조절하에 있을 수 있다. 적합한 방법의 선택은 표적 균주에 따라 변할 것이며 당해 분야의 숙련가들에게 잘 이해될 것이다.
rdsRN을 안정하게 함유하는 세균 벡터 균주의 성장에 특정한 배양 조건은 본 발명에 중요하지 않다. 예시를 목적으로, 돌연변이체를 세균 균주가 생육하기에 적합한 통상적인 배양 기법을 사용하여 액체 배지, 예를 들어 TS 배지(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 244620), 영양 브로쓰(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 233000), 트립신 간장 브로쓰(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 211822)에서 증식시킬 수 있다(Miller, 상기, 1991). 한편으로, 세균을 고체 배지, 예를 들어 영양 아가(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 212000), 트립신 간장 아가(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 236920) 또는 M9 최소 아가(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 248510) 상에서 배양할 수 있다.
마이코박테리움 백신 벡터 균주를 액체 배지, 예를 들어 미들브룩(Middlebook) 7H9(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 271310) 또는 셜튼(Saulton) 합성 배지에서, 바람직하게는 37 ℃에서 배양한다. 상기 균주를 정적 또는 교반된 배양물로서 유지시킬 수 있다. 또한, 마이코박테리움의 증식율을 올레산(0.06% v/v; Research Diagnostics 목록 번호 01257) 및 세제, 예를 들어 타이록사폴(0.05% v/v; Research Diagnostics 목록 번호 70400)을 첨가하여 향상시킬 수 있다. 마이코박테리움 배양물의 정제를 인산염 완충 염수(본 발명에서 PBS라 칭함)로 연속 희석한(예를 들어, 순수-10-8에서 10 배 단계) 마이코박테리움 배양물의 100 ㎕ 분액을 25 내지 30 ㎖의 고체 배지, 예를 들어 미들브룩 7H10(BD Microbiology, Cockeyesville, MD, 목록 번호 221174) 상에 균일하게 확산시켜 평가할 수 있다.
세균이 수확되는 600 ㎚에서의 광학 밀도는 본 발명에 중요하지 않으며 0.1 내지 5.0의 범위일 수 있고, 사용되는 특정 균주, 배지 및 배양 조건에 따라 변할 것이다.
2. rdsRNA 구획의 제작
앞서 강조한 바와 같이, 미국 특허 제 20040132678 호는 rdsRP의 생산을 진수하기 위해 헬퍼 파지(즉 야생형 dsRP)에 의존한다. 이러한 조건 하에서 20040132678에 제공된 방법은 야생형 구획-S 또는 야생형 구획-M을 함유하는 rdsRPd를 생성시킨다. dsRP의 용해 작용을 구획-S 및 -M에 함유시킨 경우, 상기와 같은 형태가 대규모 생산에 안정할 것인지의 여부는 명확하지 않다. 상기 방법이 상기 rdsRP로부터 야생형 dsRP를 분리시키는 방법도 또한 명확하지 않다. 더욱 또한, 20040132678은 rdsRN을 새로 진수하는 방법, 및 상기 rdsRN을 포함하고 복제하는 안정한 담체 균주를 생성시키고 단리하는 방법에 대한 지침을 제공하지 않는다.
전형적으로는, 약 10% 이하의 바이러스 게놈 크기 변화가 허용되며, 이는 재조합 바이러스 벡터 중의 게놈 크기의 융통성을 가능하게 한다(Domingo and Holland, Annu. Rev. Microbiol. 51:151; 1997). 본 발명의 실시에서, rdsRN 중의 rdsRNA 구획의 크기는 구획-S -M 및 -L +/- 대략10%의 합과 같다. 이러한 요점을 예시하기 위해서, 파이-8을 예로서 사용할 수 있다. 파이-8의 게놈 크기는 14,984 bp이며, 따라서 파이-8의 구획-L을 발현하는 패키징 균주에 안정한 rdsRN을 생성시키기 위해서, 상기와 같은 rdsRN 중의 재조합 구획(들)의 크기는 대략 7933±1500 bp일 것이다.
하기에 나타내는 바와 같이, 이러한 규칙은 단지 구획-L 및 4.5 kb rdsRNA 구획-S를 포함하는 파이-8로부터 유도된 rdsRN을 획득할 수 있으므로(Sun et al., Virology, 308:354; 2003) 엄격히 적용되지 않는다. 이는 rdsRN이 놀라울 정도의 게놈 융통성이 가능함을 암시한다. 상술한 예에서, 재조합 구획-S는 야생형 구획-S와 야생형 구획-M 모두로부터 유도된 서열들로 구성되었다. 상기 특정한 문헌 예에서, "로부터 유도된"(예를 들어 "야생형 구획-S로부터 유도된")은 야생형 파지의 게놈 서열로부터 기원하고 그의 야생형 유전자 또는 암호화 특징 순서로 재배열된 상기 재조합 rdsRNA 중에 존재하는 서열을 개시한다. 상기와 같은 서열을 RT-PCR에 의해 야생형 파지로부터 증폭시키고 클로닝하거나, 또는 야생형 파지에서 존재하는 공지된 서열을 기본으로 화학적으로 합성할 수 있다.
야생형 게놈 크기에 근접한 게놈 크기를 함유하는 조성물을 또한 제공할 수 있다. 하나의 접근법에서, 7933±1500 bp의 크기를 갖는 재조합 구획-S를 생성시킨다. 또 다른 접근법은 2 개의 rdsRNA 구획을 사용하며, 이때 하나는 구획-S 패키징 서열을 함유하고 다른 것은 구획-M 패키징 서열을 함유하며, 이때 상기 재조합 구획의 전체 크기는 7933±1500 bp이다(도 4). 상기 두 접근법에서, 하나 이상의 구획은 양성 선택 대립유전자를 함유하고 단일 또는 2 개의 재조합 구획은 진핵세포 발현 카세트를 지닌다.
바람직한 실시태양에서, rdsRNA 구획의 성분들을 예를 들어 하기 cDNA 및 DNA 서열을 결합시킴으로써 조립할 수 있다(도 4):
rdsRNA 구획-S:
1. φ-8 구획-S pac 서열 및 유전자 8(Hoogstraten et al., 상기, 2000).
2. 야생형 구획-S의 유전자 8의 리보솜 결합 부위에 결합된 양성 선택 대립유전자. 유전자 8은 뉴클레오캡시드와 결합된 채로 있을 수 있는 막 단백질을 암호화하며 야생형 구획-S의 제 1 개방 판독 프레임이다.
3. HpaI(불활성 단부 RE)가 IRES에 작용적으로 결합되는 ATG 개시 코돈을 제공하도록, 상기 IRES 서열에 대해 3-프라임에 배치된 HpaI, EcoRI, SalI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제(RE) 부위를 갖는 IRES 서열.
4. 소 폴리아데닐화 서열(pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA, 목록 번호 V860-20)으로부터 수득함).
5. φ-8 구획-S RNA-의존성 RNA 폴리머라제 인식 서열(Hoostraten et al, 상기, 2000).
6. φ-8 구획-M pac 서열(Hoogstraten et al., 상기, 2000).
7. 유전자-10의 리보솜 결합 부위에 결합된 양성 선택 대립유전자. 유전자 10은 야생형 구획-M의 제 1 개방 판독 프레임이고 φ-8의 막 단백질을 암호화한다.
8. HpaI(불활성 단부 RE)가 IRES에 작용적으로 결합되는 ATG 개시 코돈을 제공하도록, 상기 IRES 서열에 대해 3-프라임에 배치된 HpaI, EcoRI, SalI 및 NotI 제한 엔도뉴클레아제(RE) 부위를 갖는 IRES 서열.
9. 소 폴리아데닐화 서열(pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA, 목록 번호 V860-20)으로부터 수득함).
10. φ-8 구획-M RNA-의존성 RNA 폴리머라제 인식 서열(Hoostraten et al, 상기, 2000).
이론에 의해 범위를 제한하고자 하는 것은 아니지만, rdsRAN 구획-S의 크기가 7900 +/- 1500 bp를 초과하는 경우, rdsRNA 구획-M은 더 이상 패키징될 수 없으며, 따라서 7900 +/- 1500 pb를 초과하는 rdsRNA 구획-S가프로캡시드에서 형태 변화를 유도하여 구획-L의 인식 및 흡수를 가능하게 함으로써 야생형 게놈 크기의 +/-10% 게놈 크기를 갖는 rdsRN을 생성시킬듯하다.
상기 rdsRNA 구획을 암호화하는 cDNA 서열을 어플라이드 바이오시스템스 ABITM 3900 하이 쓰루풋 DNA 합성기(Foster City, CA 94404 U.S.A.)) 및 제조사가 제공한 과정을 사용하여 합성적으로 생성시킬 수 있다. 구획-L의 cDNA 사본 및 재조합 구획을 합성하기 위해서, 일련의 완전한 길이 서열의 구획들을 당해 분야에 널리 공지된 과정을 사용하여 PCR에 의해 생성시키고 함께 연결시켜 완전한 길이의 구획을 형성시킨다(Ausubel et al., 상기, 1990). 간단히, 길이가 100 내지 200 뉴클레오타이드인 합성 올리고뉴클레오타이드(즉 바람직하게는 인접 서열을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드의 5' 및 3' 단부에서 일치하는 5'- 및 3' 단부의 서열을 갖는다)를 자동화된 DNA 합성기(예를 들어 어플라이드 바이오시스템스 ABITM 3900 하이 쓰루풋 DNA 합성기(Foster City, CA 94404 U.S.A.))를 사용하여 제조한다. 동일한 접근법을 사용하여, 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 상보적인 짝과 어닐링시켜 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드를 형성시킨다. 이중 가닥 올리고뉴클레오타이드의 쌍(즉 인접 서열을 암호화하는 것)을 연결에 의해 결합시켜 보다 큰 단편을 형성시킨다. 이들 보다 큰 단편을 아가로스 젤 전기영동에 의해 정제하고 젤 정제 키트(E.g. The QIAEX(등록상표) II Gel Extraction System, Qiagen, Santa Cruz, CA, 목록 번호 12385)를 사용하여 단리시킨다. 이러한 과정을 완전 길이 DNA 분자가 생성될 때까지 반복한다. 각 라운드의 연결 후에, 상기 단편들을 PCR에 의해 증폭시켜 수율을 증가시킨다. 신 합성 유전자 제작 과정은 당해 분야에 널리 공지되어 있으며, 그 밖에 어디에나 개시되어 있으며(Andre et al., 상기, 1998); (Haas et al., 상기, 1996); 한편으로, 합성 유전자를 예를 들어 미드랜드 서티파이드 리에이전트 캄파니(Midland Certified Reagent Co. Midland, TX)로부터 상업적으로 구입할 수 있다.
양성 선택 대립유전자
상기 rdsRNA 구획에 통합되는 특정한 양성 선택 대립유전자는 본 발명에 중요하지 않으며, 상기 패키징 균주에서 유세한 음성 돌연변이를 복원할 수 있는 임의의 대립유전자, 예를 들어 비 제한적으로 상보적인 영양요구 돌연변이 유전자, 예를 들어 aroA(Genbank 수탁 번호 X00557), aroC(Genbank 수탁 번호 AY142231), leuD(Genbank 수탁 번호 L06666), 또는 세포벽 합성에 필수적인 유전자의 상보성 돌연변이 유전자, 예를 들어 asd(Genbank 수탁 번호 V00262) 또는 murI(Genbank 수탁 번호 AY520970), 또는 세포 분열에 필수적인 유전자의 상보성 돌연변이 유전자, 예를 들어 ftsZ(Genbank 수탁 번호 AF221946)일 수 있다.
IRES 서열의 공급원
5' 캡 개질제(핵에 통상적으로 첨가되어 핵 mRNA를 전사하고 리보솜 인식을 향상시킨다)가 결여된 mRNA 분자는 IRES 서열이 관심 유전자의 상부에 존재하지 않는 경우 진핵세포로 불충분하게 번역된다. 본 발명에 사용되는 특정한 IRES는 중요하지 않으며 IRES 서열을 함유하는 임의의 상업적으로 입수할 수 있는 벡터 또는 이용 가능한 임의의 방해되지 않는 서열 중에서 선택할 수 있다. 따라서, IRES 서열을 광범위하게 입수할 수 있으며 pIRES2-EGFP 중의 뉴클레오타이드 665-1251에 위치한 IRES의 5' 및 3' 단부에 특이적인 프라이머들을 사용하여 PCR에 의해 플라스미드 pIRES2-EGFP(Clontech, Palo Alto, CA, 목록 번호 63206)로부터 상업적으로 입수할 수 있다. 플라스미드 pIRES-EGFP 중의 서열을 플라스미드 pCITE4a(Novagen, Madison, WI, 목록 번호 69913; 또한 미국 특허 제 4,937,190 호를 참조하시오)로부터, 플라스미드 pCITE4a(pCITE4a의 완전한 서열을 novagen.com/docs/NDIS/69913-000.HTM의 웹사이트에서 입수할 수 있다); 플라스미드 pCITE4a-c(미국 특허 제 4,937,190); pSLIRES11(수탁: AF171227); pPV(수탁# Y07702); pSVIRES-N(수탁#: AJ000156); (Creancier et al., J. Cell Biol., 10: 275-281; 2000); (Ramos and Martinez-Sala, RNA, 10:1374-1383; 1999); (Morgan et al., Nucleic Acids Res., 20:1293-1299; 1992); (Tsukiyama-Kohara et al., J. Virol., 66: 1476-1483; 1992); (Jang and Wimmer et al., Genes Dev., 4:1560-1572; 1990), 또는 디시스트로닉(dicistronic) 레트로바이러스 벡터(수탁# D88622)에서; 또는 진핵 세포에서 발견되는, 예를 들어 엄격한 조직 특이성 조절을 위한 섬유아세포 생육 인자 2 IRES(Creancier, et al., 상기, 2000) 또는 미토콘드리아 H+-ATP 신타제의 베타 서브유닛에 대한 mRNA의 3'-번역되지 않은 부분의 리보솜 간 유입 부위(Izquierdo and Cuezva, Biochem. J., 346:849; 2000)에서 발견되는 뉴클레오타이드 16 내지 518로부터의 CITE의 5' 및 3' 단부에 특이적인 프라이머를 사용하여 PCR에 의해 수득할 수 있다. HCV IRES에 대한 IP가 없으므로, 플라스미드 pIRES-G(Hobbs, S.M. CRC Centre for Cancer Therapeutics, Institute of Cancer Research, Block F, 15, Cotswold Road, Belmont, Sutton, Surrey SM2 5NG, UK)가 IRES의 공급원으로서 작용할 수 있으며, 상기 플라스미드의 서열을 입수할 수 있다(Genebank 수탁 번호 Y11034).
더욱 또한, ncbi.nlm.nih.gov에 위치한 NCBI 뉴클레오타이드 데이터베이스 및 탐색 매개변수 "IRES not patent"를 사용한 인터넷 탐색은 IRES 서열을 함유하는 140 개 파일을 제공한다. 최종적으로, IRES cDNA를 어플라이드 바이오시스템스 ABITM 3900 하이 쓰루풋 DNA 합성기(Foster City, CA 94404 U.S.A.)) 및 제조사가 제공한 과정을 사용하여 합성적으로 제조할 수 있다. 큰 IRES 서열, 예를 들어 pCITE4a에서 502 bp IRES를 합성하기 위해서, 일련의 구획들을 당해 분야에 널리 공지된 과정을 사용하여 PCR에 의해 생성시키고 함께 연결하여 완전한 길이의 서열을 제조한다(Ausubel et al., 상기, 1990). 보다 작은 IRES 서열, 예를 들어 C형 간염 바이러스 중의 53 bp IRES(Genebank 수탁 번호 1KH6A)를 어플라이드 바이오시스템스 ABITM 3900 하이 쓰루풋 DNA 합성기(Foster City, CA 94404 U.S.A.)) 및 제조사가 제공한 과정을 사용하여 합성적으로 제조할 수 있다.
rdsRN에 삽입할 수 있는 관심 이종 유전자의 예
본 발명에서, 진핵세포 번역 발현 카세트 상에서 rdsRN 내로 도입된 관심 유전자는 면역원을 암호화할 수 있으며, 따라서 상기 rdsRN은 상기 면역원에 대한 면역 반응을 유도하는 백신으로서 작용할 수 있다. 상기 면역원은 바이러스, 세균 및 기생충 병원체로부터의 외부 면역원이거나, 내생 면역원, 예를 들어 비 제한적으로 자가면역 항원 또는 종양 항원일 수 있다. 상기 면역원은 완전한 길이의 천연 단백질, 외부 면역원과 내생 단백질 또는 유사물질 간의 키메릭 융합물, 바이러스, 세균 및 기생충 병원체로부터 기원하는 면역원의 단편 또는 그의 단편일 수 있다.
본 발명에 사용된 바와 같이 "외부 면역원"은 수용 동물 세포 또는 조직에서 통상적으로 발현되지 않는 단백질 또는 그의 단편, 예를 들어 비 제한적으로 바이러스 단백질, 세균 단백질, 기생충 단백질, 사이토킨, 케모킨, 면역조절제, 또는 치료제를 의미한다.
"내생 면역원"은 수용 동물 세포 또는 조직에 천연적으로 존재하는 단백질 또는 그의 일부, 예를 들어 비 제한적으로 내생 세포 단백질, 면역조절제 또는 치료제를 의미한다.
세포자멸은 프로그램화된 세포사이며 그의 유도 및 결과의 면에서 괴사성 세포사와 대단히 상이하다. 외부 항원을 함유하는 세포의 세포자멸은 상기와 같은 항원에 대한 세포 면역성의 강력한 공지된 자극이다. 항원 함유 세포의 세포자멸이 세포 면역성을 유도하는 과정을 때때로 교차 프라이밍이라 칭하였다(Heath, W.R., et al., Immunol Rev 1999:9; 2004, Gallucci, S.M et al., Nature Biotechnology. 5:1249; 1999, Albert, M.L. et al., Nature 392:86; 1988). 항원 특이적인 세포 매개된 면역성을 증가시키는 세포자멸의 유도 기전이 여러 가지 존재한다. 카스파제 8 매개된 세포자멸은 항원 특이적인 세포 면역 보호를 유도한다(Heath, W.R., et al., Immunol Rev 199:9; 2004). 세포질에서 rdsRN에 의한 카스파제 8의 발현은 높은 수준의 항원 특이적인 세포 면역성을 도출하는 rdsRN에 의해 발현된 외부 항원과 관련하여 프로그램화된 세포사를 유도하는 강력한 방법이 될 것이다. 사망 수용체-5(DR-5)(또한 TRAIL-R2(TRAIL 수용체 2) 또는 TNFR-SF-10B(종양 괴사 인자-상과 구성원 10B)로서도 공지됨)가 또한 카스파제 8 매개된 세포자멸을 매개한다(Sheridan, J.P., et al., Science 277:818; 1997). 리오바이러스 유도된 세포자멸은 TRAIL-DR5에 의해 매개되어 상기 바이러스의 후속적인 제거를 발생시킨다(Clarke, P.S. et al., J. Virol; 2000). rdsRN에 의한 DR-5의 발현은 rdsRN 발현된 항원에 대한 항원 특이적인 세포 면역성의 유도에 강력한 항원보강 효과를 제공해야 한다. 항원 발현 세포를 또한 Fas 연결(이는 항원 특이적인 세포 면역 반응의 유도에 강력한 자극이다)을 통해 세포자멸을 겪도록 유도할 수 있다(Chattergoon, M.A. et al., Nat Biotechnology 18:974; 2000). Fas 또는 Fas 세포질 도메인/CD4 외부도메인 융합 단백질을 발현하는 rdsRN은 rdsRN에 의해 발현되는 항원에 대해 세포자멸 및 항원 특이적인 세포 면역 반응을 유도할 것이다.
상술한 rdsRN 매개된 세포자멸에 의한 세포 면역성의 향상은 상기 rdsRN 자체에 의해 특이적으로 암호화된 항원으로 국한되지 않고 상기 rdsRN이 세포자멸의 특정한 매개인자를 발현하는 세포 중의 임의의 항원을 포함한다. 일례로서, rdsRN이 세포자멸을 유도하는 종양 세포로 전달되는 경우, 중요한 종양 항원에 대한 세포 면역성이 상기 종양 및/또는 전이의 제거, 감소 또는 예방과 함께 유도될 것이다.
본 발명의 추가의 실시태양에서 rdsRN이 세포자멸을 유도하는 능력과 함께 또는 상기 능력 없이, 강한 세포 면역 반응이 실리는 외부 항원을 암호화하고 생산하는 능력과 함께 내부 종양 또는 다른 세포 내부로 전달되는 경우, 상기 세포에 대한 강한 세포 반응이 생성될 것이다. 이러한 세포 반응은 후속적인 종양 및/또는 전이의 제거, 감소 또는 예방과 함께 면역 매개된 종양 세포 파괴, 추가로 상기 종양 또는 다른 중요한 항원에 대한 세포 면역성의 교차 프라이밍 및 유도를 도출할 것이다. 상기와 같은 외부 항원의 예는 강한 이종 세포 반응이 실리는 숙주 세포 HLA와 상이한 HLA 항원이다.
세포자멸을 유도하고 특정한 종양 항원을 전달할 수 있는 재조합 rdsRN은 상기 종양 항원에 대한 일부 허용성을 파괴하여 상기 rdsRN의 상기 종양 자체로의 직접적인 전달의 필요없이 종양 및/또는 전이를 제거, 감소 또는 예방함을 포함한, 상기 항원에 대한 강한 항원 특이적인 세포 반응을 유도할 것이다.
DNA 손상에 이은 세포자멸 또는 카스파제 9는 몇몇 항원에 대한 허용성을 유도한다(Hugues, S.E., et al., Immunity 16:169; 2002). 허용성의 유도는 자가면역 질병, 예를 들어 비 제한적으로 당뇨병, 류마티스성 관절염, 크론병, 염증성 장 질환 및 다발성 경화증의 억제 또는 예방에 중요하다. 세포, 예를 들어 비 제한적으로 β 췌장 세포, 결장직장 및 신경 세포에서 rdsRN에 의한 카스파제 9 또는 다른 세포자멸 매개된 허용성 유도 단백질의 생산은 제한된 세포자멸을 유도할 것이며 이는 상기 세포에서 자가면역성의 항원 표적에 대한 허용성을 유도하여 자가면역 질병 증상을 치료 또는 예방할 것이다. 자가면역 반응에 관련된 특이 항원의 동정은 상기 항원 및 카스파제 9 또는 상기 자가면역 질병의 치료 및/또는 예방을 도출하는 세포자멸 매개된 허용성을 유도할 수 있는 다른 분자의 rdsRN의 생산을 통해 상기 자가면역 표적 항원에 대한 허용성을 유도할 것이다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시태양은 세포자멸, 예를 들어 비 제한적으로 숙주 세포의 세포질에서 살모넬라 SopE(Genbank 수탁 번호 AAD54239, AAB51429 또는 AAC02071), 시겔라 IpaB(Genbank 수탁 번호 AAM89553 또는 AAM89536), 카스파제-8(Genbank 수탁 번호 AAD24962 또는 AAH06737) 등의 발현을 촉진하는 단백질을 발현하는 하나 이상의 유전자를 암호화하는 rdsRN을 제공하고 상기 rdsRN에 의해 발현된 항원과 관련하여 프로그램화된 세포사를 유도하여 표적 항원에 대한 높은 수준의 T 세포 매개된 면역성을 기원하는 강력한 방법을 부여한다. 한편으로, DR-5, 예를 들어 인간 DR-5(Genbank 수탁 번호 BAA33723), 헤르페스바이러스-6(HHV-6) DR-5 동족체(Genbank 수탁 번호 CAA58423) 등을 발현하는 하나 이상의 유전자를 암호화하여 표적 항원에 대한 항원 특이적인 세포 면역성을 유도하기 위한 강력한 항원보강 효과를 제공하는 rdsRN을 제조할 수 있다.
한편으로 또는 또한, 상기 면역원을 합성 유전자에 의해 암호화하고 통상적인 재조합 DNA 방법(상기 참조)을 사용하여 제작할 수 있다.
외부 면역원은 동물 숙주에 들어가거나, 콜로니화하거나, 복제하기 전 또는 도중에 임의의 바이러스, 세균 또는 기생충 병원체에 의해 발현되는 임의의 분자일 수 있으며; 상기 rdsRN은 바이러스, 세균 및 기생충 병원체로부터 기원하는 면역원 또는 그의 일부를 발현할 수 있다. 이러한 병원체는 인간, 가축 또는 야생 동물 숙주에서 감염성일 수 있다.
상기 바이러스 항원이 유도되는 바이러스 병원체로는 비 제한적으로 오쏘믹소바이러스, 예를 들어 인플루엔자 바이러스(분류 ID: 59771); 레트로바이러스, 예를 들어 RSV, HTLV-1(분류 ID: 39015), 및 HTLV-II(분류 ID: 11909), 파필로마비리다에, 예를 들어 HPV(분류 ID: 337043), 헤르페스바이러스, 예를 들어 EBV 분류 ID: 10295); CMV(분류 ID: 10358) 또는 헤르페스 단순 바이러스(ATCC#: VR-1487); 렌티바이러스, 예를 들어 HIV-1(분류 ID: 12721) 및 HIV-2(분류 ID: 11709); 라브도바이러스, 예를 들어 광견병; 피코르노바이러스, 예를 들어 폴리오바이러스(분류 ID: 12080); 폭스바이러스, 예를 들어 우두(분류 ID: 10245); 로타바이러스(분류 ID: 10912); 및 파르보바이러스, 예를 들어 아데노 관련 바이러스 1(분류 ID: 85106)가 있다.
바이러스 항원의 예를 비 제한적으로 인간 면역결핍 바이러스 항원 Nef(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository 목록 번호 183; Genbank 수탁 # AF238287), Gag, Env(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository 목록 번호 2433; Genbank 수탁 # U39362), Tat(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository 목록 번호 827; Genbank 수탁 # M13137), Tat의 돌연변이 유도체, 예를 들어 Tat-Δ31-45(Agwale et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:10037; 2002), Rev(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository 목록 번호 2088; Genbank 수탁 # L14572), 및 Pol(National Institute of Allergy and Infectious Disease HIV Repository 목록 번호 238; Genbank 수탁 # AJ237568) 및 gp120의 T 및 B 세포 에피토프(Hanke and McMichael, AIDS Immunol Lett., 66:177; 1999); (Hanke, et al., Vaccine, 17:589; 1999); (Palker et al., J. Immunol., 142:3612-3619; 1989) HIV-1 Env 및 gp120의 키메릭 유도체, 예를 들어 비 제한적으로 gp120과 CD4 간의 융합(Fouts et al., J. Virol. 2000, 74:11427-11436; 2000); HIV-1 env의 불활성화 또는 개질된 유도체, 예를 들어 비 제한적으로 gp140(Stamatos et al., J Virol, 72:9656-9667; 1998) 또는 HIV-1 Env 및/또는 그의 gp140의 유도체(Binley, et al., J Virol, 76:2606-2616; 2002); (Sanders, et al., J Virol, 74:5091-5100(2000)); (Binley, et al., J Virol, 74:627-643; 2000), B형 간염 표면 항원(Genbank 수탁 번호 AF043578); (Wu et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86:4726-4730; 1989); 로타바이러스 항원, 예를 들어 VP4(Genbank 수탁 # AJ293721); (Mackow et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 87:518-522; 1990) 및 VP7(GenBank 수탁 # AY003871); (Green et al., J. Virol., 62:1819-1823; 1988), 인플루엔자 바이러스 항원, 예를 들어 헤마글루티닌 또는 (GenBank 수탁 # AJ404627); (Pertmer and Robinson, Virology, 257:406; 1999); 핵단백질(GenBank 수탁 # AJ289872); (Lin et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 97:9654-9658; 2000) 헤르페스 단순 바이러스 항원, 예를 들어 티미딘 키나제(Genbank 수탁 # AB047378); (Whitley et al., In: New Generation Vaccines, pages 825-854)의 그룹에서 찾을 수 있다.
세균 항원이 유도되는 세균 병원체로는 비 제한적으로 마이코박테리움 스페시즈, 헬리코박터 파이로리, 살모넬라 스페시즈, 시겔라 스페시즈, 이 콜라이, 리켓차 스페시즈, 리스테리아 스페시즈, 레이오넬라 뉴모니아에, 슈도모나스 스페시즈, 비브리오 스페시즈, 바실러스 안트라시스 및 보렐리아 부르그도르페리가 있다.
세균 병원체의 보호 항원의 예로는 장독성 이 콜라의 체 항원, 예를 들어 CFA/I 가는털 항원(Yamamoto et al., Infect. Immun., 50:925-928; 1985) 및 열 불안정성 독소의 무독성 B-서브유닛(Klipstein et al., Infect. Immun., 40:888-893; 1983); 보르데텔라 페루투시스(Roverts et al., Vacc., 10:43-48; 1992), 비 페르투시스의 아데닐레이트 사이클라제-헤모리신(Guiso et al., Micro. Path., 11:423-431; 1991), 클로스트리듐 테타니의 테타누스 독소의 단편 C(Fairweather et al., Infect. Immun., 58:1323-1326; 1990), 보렐리아 부르그도르페리의 OspA(Sikand et al., Pediatrics, 108:123-128; 2001); (Wallich et al., Infect Immun, 69:2130-2136; 2001), 리켓차 프로와제키 및 리켓차 타이피의 보호성 파라결정성-표면층 단백질(Carl et al., Proc Natl Acad Sci USA, 87:8237-8241; 1990), 리스테리오리신(또한 "Llo" 및 "Hly"로서 공지됨) 및/또는 리스테리아 모노사이토젠의 초산화 디스뮤타제(또한 "SOD" 및 "p60"으로서 공지됨)(Hess, J., et al., Infect. Immun. 65:1286-92; 1997); Hess, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:1458-1463; 1996); (Bouwer et al., J. Exp. Med. 175:1467-71; 1992), 헬리코박터 파이로리의 우레아제(Gomez-Duarte et al., Vaccine 16, 460-71; 1998); (Corthesy-Theulaz, et al., Infection & Immunity 66, 581-6; 1998), 및 바실러스 안트라시스 보호 항원 및 치사 인자 수용체 결합 도메인(Price, et al., Infect. Immun. 69, 4509-4515; 2001)이 있다.
기생충 병원체가 유도되는 기생충 병원체로는 비 제한적으로 플라스모듐 스페시즈, 예를 들어 플라스모듐 팔시파룸(ATCC# 30145); 트립파노솜 스페시즈, 예를 들어 트립파노소마 크루지(ATCC# 50797); Giardia 스페시즈, 예를 들어 지아르디아 인테스티날리스(ATCC# 30888D); 부필루스 스페시즈, 바베시아 스페시즈, 예를 들어 바베시아 미크로티(ATCC# 30221); 엔타모에바 스페시즈, 예를 들어 엔타모에바 히스톨리티카(ATCC# 30015); 에이메리아 스페시즈, 예를 들어 에이메리아 막시마(ATCC# 40357); 레이슈마니아 스페시즈(분류 ID: 38568); 치스토솜 스페시즈, 브루지아 스페시즈, 파치다 스페시즈, 디로필라리아 스페시즈, 우체레리아 스페시즈 및 온코세레아 스페시즈가 있다.
기생충 병원체의 보호 항원의 예로는 플라스모듐 스페시즈의 써큠스포로조아이트 항원(Sadoff et al., Science, 240:336-337; 1988), 예를 들어 피 베르제리의 써큠스포로조아이트 항원 또는 피 팔시파룸의 써큠스포로조아이트 항원; 플라스모듐 스페시즈의 메로조아이트 표면 항원(Spetzler et al., Int. J. Pept. Prot. Res., 43:351-358; 1994); 엔타모에바 히스톨리티카의 갈락토스 특이성 렉틴(Mann et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88:3248-3252; 1991), 레이슈마니아 스페시즈의 gp63(Russell et al., J. Immunol., 140:1274-1278; 1988); (Xu and Liew, Immunol., 84:173-176; 1995), 레이슈마니아 메이저의 gp46(Handman et al., Vaccine, 18:3011-3017; 2000) 브루지아 말라이의 파라미오신(Li et al., Mol. Biochem. Parasitol., 49:315-323; 1991), 치스토소마 만소니의 트리오스-포스페이트 아이소머라제(Shoemaker et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89:1842-1846; 1992); 트리코스트론질루스 콜루브리포르미스의 분비된 글로빈형 단백질(Frenkel et al., Mol. Biochem. Parasitol., 50:27-36; 1992); 프라시올라 헤파티카의 글루타치온-S-트랜스퍼라제(Hillyer et al., Exp. Parasitol., 75:176-186; 1992), 치스토소마 보비스 및 에스 자포니쿰(Bashir et al., Trop. Geog. Med., 46:255-258; 1994); 및 치스토소마 보비스 및 에스 자포니쿰의 KLH(Bashir et al., 상기, 1994)가 있다.
앞서 언급한 바와 같이, rdsRN 백신은 내생 면역원을 암호화할 수 있으며, 이는 임의의 세포 단백질, 면역조절제, 또는 치료제 또는 그의 일부일 수 있고, 수용 세포, 예를 들어 비 제한적으로 종양, 이식 및 자가면역 면역원, 또는 종양, 이식 및 자가면역 면역원의 단편 및 유도체에서 발현될 수 있다. 따라서, 본 발명에서 dsRP는 종양, 이식편, 또는 자가면역 면역원, 또는 그의 일부 또는 유도체를 암호화할 수 있다. 한편으로, 상기 dsRP는 합성 유전자(상술한 바와 같이 제조됨)를 암호화하며, 상기 유전자는 종양 특이적이거나, 이식편 또는 자가면역 항원 또는 그의 일부를 암호화한다.
종양 특이 항원의 예로는 전립선 특이 항원(Gattuso et al., Human Pathol., 26:123-126; 1995), TAG-72 및 CEA(Guadagni et al., Int. J. Biol. Markers, 9:53-60; 1994), MAGE-1 및 티로시나제(Coulie et al., J. Immunothera., 14:104-109; 1993)가 있다. 최근에, 마우스에서 종양 항원을 발현하는 비 악성 세포에 의한 면역화가 백신 효과를 제공하며, 또한 동일한 항원을 나타내는 악성 종양 세포를 제거하는 면역 반응을 상기 동물에게 제공하는데 일조하는 것이 입증되었다(Koeppen et al., Anal. N.Y. Acad. Sci., 690:244-255; 1993).
이식 항원의 예로는 T 세포 상의 CD3 분자가 있다(Alegre et al., Digest. Dis. Sci., 40:58-64; 1995). CD3 수용체에 대한 항체 처리는 순환하는 T 세포를 신속히 제거하고 세포 매개된 이식 거부를 역전시키는 것으로 나타났다(Alegre et al., 상기, 1995).
자가면역 항원의 예로는 IAS β 쇄가 있다(Topham et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91:8005-8009; 1994). IAS β 쇄로부터의 18 개 아미노산 펩타이드에 의한 마우스의 백신화는 실험적인 자가면역 뇌척수염이 있는 마우스에게 보호 및 치료를 제공하는 것으로 나타났다(Topham et al., 상기, 1994).
또한, 항원보강제를 암호화하고 면역원에 대한 숙주 면역 반응을 증가시키는데 사용될 수 있는 rdsRNA 구획을 제작할 수 있다. 상기 rdsRNA에 의해 암호화된 특정한 항원보강제는 본 발명에 중요하지 않으며 콜레라 독소의 A 서브유닛(즉 CtxA; GenBank 수탁 번호 X00171, AF175708, D30053, D30052) 또는 그의 일부 및/또는 돌연변이 유도체(예를 들어 Ctx의 A 서브유닛의 A1 도메인(즉, CtxA1; GenBank 수탁 번호 K02679), 임의의 전통적인 비브리오 콜레라에(예를 들어 브이 콜레라에 균주 395, ATCC# 39541) 또는 E1 Tor 브이 콜레라에(예를 들어 브이 콜레라에 균주 2125, ATCC# 39050) 균주일 수 있다. 한편으로, 세균 아데노신 다이포스페이트-비로실화 외독소 계열의 일원인 임의의 세균 독소(Krueger and barbier, Clin. Microbiol. Rev., 8:34; 1995)를 CtxA 대신에 사용할 수 있으며; 예를 들어 장독성 에스케리키아 콜라이(GenBank 수탁# M35581)의 열 불안정성 독소의 A 서브유닛, 페르투시스 독소 S1 서브유닛(예를 들어 ptxS1, GenBank 수탁# AJ007364, AJ007363, AJ006159, AJ006157 등)이 있으며; 추가의 대안으로서, 상기 항원보강제는 보르데텔라 페르투시스(ATCC# 8467), 보르데텔라 브론치셉티카(ATCC# 7773) 또는 보르데텔라 파라페르투시스(ATCC# 15237)의 아데닐레이트 사이클라제 헤모리신 중 하나, 예를 들어 비 페르투시스(GenBank 수탁 번호 X14199), 비 파라페르투시스(GenBank 수탁 번호 AJ249835) 또는 비 브론치셉티카(GenBank 수탁 번호 Z37112)의 cyaA 유전자일 수 있다.
사이토킨 암호화 rdsRNA 구획을 또한 제작할 수 있다. 상기 rdsRNA에 의해 암호화된 특정한 사이토킨은 본 발명에 중요하지 않으며, 비 제한적으로 인터류킨-4(본 발명에서 "IL-4"라 칭한다; GenBank 수탁 번호 AF352783(쥐 IL-4) 또는 NM_000589(인간 IL-4), IL-5(GenBank 수탁 번호 NM_010558(쥐 IL-5) 또는 NM_000879(인간 IL-5), IL-6(GenBank 수탁 번호 M20572(쥐 IL-6) 또는 M29150(인간 IL-6), IL-10(GenBank 수탁 번호 NM_010548(쥐 IL-10) 또는 AF418271(인간 IL-10), IL-12p40(GenBank 수탁 번호 NM_008532(쥐 IL-12 p40) 또는 AY008847(인간 IL-12 p40), IL-12p-70(GenBank 수탁 번호 NM_008351/NM_008352(쥐 IL-12 p35/40) 또는 AF093065/AY008847(인간 IL-12 p35/40), TGFβ(GenBank 수탁 번호 NM_011577(쥐 TGFβ1) 또는 M60316(인간 TGFβ1), 및 TNFα Genbank 수탁 번호 X02611(쥐 TNFα) 또는 M26331(인간 TNFα)를 포함한다.
더욱 또한, 작은 억제 RNA 또는 안티센스 RNA는 표적 조직에서 단백질 발현의 조절을 위해 rdsRNA 구획에서 암호화될 수 있다.
진핵 세포 또는 조직에서 면역조절제를 발현할 수 있는 rdsRNA를 생성시키기 위한 작용성 발현 카세트의 도입을 위한 재조합 DNA 및 RNA 과정은 상기 개시되어 있다.
진핵세포 발현 카세트에서 암호화되는 예시적인 백신 구조물로서, 바이러스형 입자(본 발명에서 "VLP")를 바이러스 병원체에 대한 보호 면역 반응의 생성을 유도하도록 제작할 수 있다. 인플루엔자 VLP는 헤마글루티닌(HA), 뉴라미니다제(LA) 및 기질 단백질(M1 및 M2)을 암호화하는 유전자 서열의 플라스미드 발현에 따라 자가 조립되는 것으로 나타났다(Latham et al., J. Virol, 75:6154-6165; 2001). 상기와 같이 제작된 VLP는 또한 막 융합 및 발아하여 동물 모델에서 항체 생성 면역 반응 및 보호성 면역성을 더욱 강화시킬 수 있다(Pushko et al., Vaccine. 2005 Sep 2; [Epub ahead of print]). HIV VLP를 캡시드 단백질의 아미노산 146 내지 231을 암호화하는 최소 서열, 6 개의 아미노산 미리스틸화 서열, P2 펩타이드를 암호화하는 서열, GCN4 류신 지퍼 도메인, 및 gp160 외막 전구체로부터 유사하게 조립할 수 있다(Accola et al., J. Virol, 74:5395-5402; 2000). HPV의 주요 단백질 L1은 VLP의 다양한 세포 주로 자가 조립하고 체액 및 세포 면역성을 생성시켜, 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 매력적인 면역원으로 만드는 것으로 나타났다(Shi et al., J Virol., 75(21):10139-10148; 2001).
3. 알파바이러스 발현 카세트를 갖는 rdsRNA 구획의 제작
상기 나타낸 바와 같이, rdsRN은 관심 유전자에 작용적으로 결합된 플라스미드 pSFV1(Invitrogen Inc., Carlsbad, CA)으로부터의 셈리키 포레스트 바이러스(본 발명에서 "SFV"라 칭함) 자기 증폭 복제단위로 구성된 포유동물 번역 발현 카세트를 포함할 수 있다. SFV 비 구성 단백질 1-4(본 발명에서 "nsp1-4"라 칭함)를 암호화하는 유전자 및 pSFV1에서의 레플리카제 인식 부위를 PCR에 의해 증폭시키고 불활성 단부 연결에 의해 HpaI 부위 바로 하부 내로 삽입하고 rSeg-S 중의 IRES에 작용적으로 결합시켜 rSeg-S::SFV1을 생성시킨다(도 5). 플라스미드 rSeg-S::SFV1 중의 SmaI RE 부위는 상기 개략된 바와 같은 임의의 관심 외래 또는 내생 유전자에 대한 삽입 부위로서 작용할 수 있다.
양성 선택 대립유전자 및 알파바이러스 nsp1-4 및 증폭단위 약 8100 pb를 함유하는 rdsRNA 구획-S를 갖는 rdsRN에서, 구획-L의 흡수는 관심 유전자가 800 bp(즉 게놈 크기가 야생형 게놈보다 10% 이상 더 크다)를 초과할 때 방해됨을 주목한다. 모든 상황에서, 양성 선택 대립유전자 및 알파바이러스 nsp1-4 및 증폭단위를 함유하는 rdsRNA 구획-S를 갖는 rdsRN은 rdsRNA 구획-M을 필요로 하지 않음을 주목한다.
이러한 능력의 제한은 5-프라임 pac 서열이 결여된 구획-L의 개질된 유도체를 발현하는 패키징 균주를 생성시킴으로써 해결될 수 있다. 상기와 같은 서열은 프로캡시드 생산에 필요한 단백질을 발현하지만 뉴클레오캡시드에 패키징되지 않을 것이며, 이에 의해 상기 균주에서 생성된 rdsRN에 추가로 7000 bp의 용량을 제공할 것이다.
상기와 같은 구조물에서 개질된 구획-L을 발현 벡터, 예를 들어 pT7/T3-18(Ambion, Austin, TX, 목록 번호 7201)에 도입시키거나 또는 당해 분야의 숙련가들에게 공지된 방법을 사용하여 대립 유전자 교환에 의해 염색체에 통합시킬 수 있다(Hamilton et al., 상기, 1989); (Blomfield et al., 상기, 1991). 염색체 통합 위치는 본 발명에 중요하지 않지만, 바람직한 실시태양에서, 상기 구획-L 발현 카세트를 암호화하는 DNA를, 유전자를 불활성화시키고 한정된 배양 조건 하에서 선택성 표현형(예를 들어 aroA(Genbank 수탁 번호 X00557), aroC(Genbank 수탁 번호 AY142231), leuD(Genbank 수탁 번호 L06666) asd(Genbank 수탁 번호 V00262), murI(Genbank 수탁 번호 AY520970) kdsA(Genbank 수탁 번호 AY174101) 및 htrB(Genbank 수탁 번호 AF401529)을 생성시키기 위해 염색체에 통합시킨다. 염색체 통합 과정 및 상기 돌연변이의 배양 방법은 문헌에 잘 보고되어 있다(Hamilton et al., J. Bacteriol. 171:4617; 1989); (Blomfield et al., Mol. Microbiol. 5:1447; 1991).
4. rdsRN을 새로이 생성시키는 방법
상기 rdsRN을 프로캡시드 내로의 흡수에 이어서 rdsRNA를 생성시키는데 필요한 모든 정보를 암호화하는 RNA를 도입시킴으로써 패키징 균주에서 생성시킨다. rRNA를 직접 도입시키거나, 또는 비 복제 플라스미드 상에서 암호화시킬 수 있으며, 상기 플라스미드를 패키징 균주에 함께 도입시킬 수 있다. 구획-L을 암호화하는 유전자 및 따라서 프로캡시드는 플라스미드 상에서 상기 패키징 균주 중에 존재하거나 상기 패키징 균주의 염색체 내에 통합될 수 있다. 추가적인 선택권으로서, 양성 가닥 RNA 암호화 구획-L을 재조합 구획-S 및 -M을 암호화하는 양성 가닥 RNA와 함께 상기 패키징 균주에 도입시킬 수 있다. 일단 상기 프로캡시드가 구획-S 및 -M(이들은 충분한 크기를 가져야 하며 구획 L mRNA의 흡수 신호를 생성시키기에 적합한 패키징 서열을 나타내어야 한다)의 재조합 ssRNA(본 발명에서 ssRNA라 칭함)를 통합하였으면, 상기 후자를 통합시키고 모든 패키징된 ssRNA를 dsRNA로 전환시켜 rdsRN을 생성시킨다. 이 시점에서, 상기 rdsRN은 재조합 구획-S 및 -M mRNA 및 구획-L mRNA를 생성시킬 수 있으며; 후자는 상기 흡수하는 프로캡시드를 구성하는 단백질을 발현하고, 재조합 구획 및 구획-L mRNA를 통합하고, 이어서 dsRNA로 전환되어 추가의 rdsRN을 생성시킨다(도 6).
생체 외 합성된 재조합 구획 mRNA를 일렉트로포레이션에 의해 패키징 균주에 도입시킨다. 바람직하게는, 상기 RNA를 플루오르화된 rNTP(Durascribe, Epicentre, Madison, WI)를 사용하여 선형 DNA 주형으로부터 생체 외 전사하여 플루오르화된 RNA(이는 뉴클레아제-내성 RNA이다)를 생성시킨다. 플루오르화된 dUTP 및 dCTP를 각각 5 mM의 최종 농도로 반응 혼합물에 혼입시킨다. fNTP가 바람직하지만, 임의의 개질된 rNTP(뉴클레아제 내성을 부여한다), 예를 들어 티올 또는 아미노헥실 치환된 rNTP가 본 발명에 유용하다. 따라서, 당해 분야의 숙련가들은 플루오르화된 NTP 대신에 뉴클레아제 내성을 부여하는 임의의 개질된 NT를 대신 사용할 수 있다.
상기 RNA 또는 바람직하게는 플루오르화된 RNA는 적어도, 상기 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이 및 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 연결된 관심 RNA를 보완하는 유전자 산물을 암호화한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 플루오르화된 RNA는 상기 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이, 뉴클레오캡시드 생산의 안정성을 위한 유전자-8(서열식별번호 7); 및 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 연결된 관심 RNA를 보완하는 유전자 산물을 암호화한다.
상기 패키징 균주에 rdsRN을 진수하기 위해서, 하기를 포함하는 일렉트로포레이션 배지를 제조한다:
i) a) 하나 이상의 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA;
b) 프로캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열; 및
c) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 하나 이상의 프로캡시드
를 포함하는, rdsRN의 패키징, 진수 및 제조를 위한, 108 내지 1011 cfu/㎖ 밀도의 전기수용 세균 균주.
ii) 1 ng 내지 1 ㎎, 바람직하게는 1 mcg 내지 100 mcg, 보다 바람직하게는 5 mcg 내지 40 mcg의, 적어도 상기 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물을 암호화하는 RNA 및 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA.
바람직한 실시태양에서, 상기 rdsRN을 하기로 구성된 일렉트로포레이션 배지를 사용하여 상기 패키징 균주에 진수한다:
i) a) 하나 이상의 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA;
b) 프로캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열; 및
c) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 하나 이상의 프로캡시드
를 포함하는, rdsRN의 패키징, 진수 및 제조를 위한, 108 내지 1011 cfu/㎖ 밀도의 전기수용 세균 균주.
ii) 1 ng 내지 1 ㎎, 바람직하게는 1 mcg 내지 100 mcg, 보다 바람직하게는 5 mcg 내지 40 mcg의, 적어도 상기 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물, 뉴클레오캡시드 생산의 안정화를 위한 유전자-8(서열식별번호 7)을 암호화하는 RNA 및 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA.
한편으로, 상기 rdsRN을 하기로 구성된 일렉트로포레이션 배지를 사용하여 상기 패키징 균주에 진수한다:
i) a) 하나 이상의 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA를 포함하는, rdsRN의 패키징, 진수 및 제조를 위한, 108 내지 1011 cfu/㎖ 밀도의 전기수용 세균 균주;
1 ng 내지 1 ㎎, 바람직하게는 1 mcg 내지 100 mcg, 보다 바람직하게는 5 mcg 내지 40 mcg의, 적어도 상기 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물, 프로캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열, 뉴클레오캡시드 생산의 안정화를 위한 유전자-8(서열식별번호 7)을 암호화하는 RNA; 및 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA.
추가의 바람직한 실시태양에서, rdsRN을 하기로 구성된 일렉트로포레이션 배지를 사용하여 상기 패키징 균주에 진수한다:
i) a) 하나 이상의 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA;
b) 프로캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열; 및
c) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 하나 이상의 프로캡시드
를 포함하는, rdsRN의 패키징, 진수 및 제조를 위한, 108 내지 1011 cfu/㎖ 밀도의 전기수용 세균 균주.
ii) 1 ng 내지 1 ㎎, 바람직하게는 1 mcg 내지 100 mcg, 보다 바람직하게는 5 mcg 내지 40 mcg의, 적어도 상기 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물, 뉴클레오캡시드 생산의 안정화를 위한 유전자-8(서열식별번호 7)을 암호화하는 RNA; 및 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA.
더욱 추가의 바람직한 실시태양에서, rdsRN을 하기로 구성된 일렉트로포레이션 배지를 사용하여 상기 패키징 균주에 진수한다:
i) a) 하나 이상의 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA를 포함하는, rdsRN의 패키징, 진수 및 제조를 위한, 108 내지 1011 cfu/㎖ 밀도의 전기수용 세균 균주;
ii) 1 ng 내지 1 ㎎, 바람직하게는 1 mcg 내지 100 mcg, 보다 바람직하게는 5 mcg 내지 40 mcg의, 적어도 상기 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물, 프로캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열, 뉴클레오캡시드 생산의 안정화를 위한 유전자-8(서열식별번호 7)을 암호화하는 RNA; 및 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA.
상기 RNA 또는 바람직하게는 플루오르화된 RNA를 상기 패키징 균주에 일렉트로포레이션하는데 사용되는 방법은 본 발명에 중요하지 않으며 당해 분야에 널리 공지된 표준 과정을 사용하여 성취할 수 이TEk(Ausubel et al., 상기, 1990; Sambrook, 상기). 일렉트로포레이션에 이어서, 상기 일렉트로포레이션 매질을 개시된 바와 같이 회수 매질과 혼합하고(Ausubel et al., 상기, 1990; Sambrook, 상기) 37 ℃에서 30 분 내지 4 시간 동안, 바람직하게는 2 시간 동안 배양한다.
전기 형질전환체를 재조합 구획 중에 양성 선택 대립유전자를 포함하고 발현하는 균주의 생육만을 허용하는 조건 하에 고체 배지 상에서 단리한다(예를 들어 트립신처리된 간장 아가(본 발명에서는 TSA라 칭함), Difco, Detroit, MI).
rdsRN을 함유하는 세균 단리물을 25 내지 44 ℃ 범위의 온도에서 16 내지 96 시간 동안 배양하나; 상기 형질전환체를 처음에 28 ℃에서 48 시간 동안 배양하는 것이 바람직하다. 상기 선택성 고체 배지 상에서 증식하는 콜로니를 후속적으로 단리하고 표준 방법에 의해 정제시킨다(Ausubel et al., 상기, 1990); (Sambrook, 상기). 상기 선택된 단리물이 관심의 작용성 rdsRN을 수반하는지를 확인하기 위해서, 개별적인 단리물을, 비 제한적으로 가닥 특이성 패키징 서열의 양 및 음(두 번째)의 가닥 RNA 서열, 양성 선택 대립유전자, IRES 및관심 유전자를 특이적으로 증폭시키도록 고안된 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 선별한다. 분석을 위한 RNA 제조 방법, 예를 들어 하기와 같은 방법들이 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 개별적인 단리물을 액체 배지(예를 들어 트립신처리된 간장 브로쓰(본 발명에서 "TSB"라 칭함), Difco, MO)에서 배양하고 생성된 배양물을 600 ㎚에서의 광학 밀도가 멸균 TSB 대조군의 OD600에 비해 0.001 내지 4.0에 도달한 후에 수확할 수 있다. 뉴클레오캡시드를 다른 곳에 보고되어 있고 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법을 사용하여 상기와 같은 배양물로부터 단리시킨다(Gottlieb et al., J. Bacteriol 172:5774; 1990); (Sun et al., 상기, 2003). 상기와 같은 분석을 위한 PCR 프라이머를 클론 매니저(Clone Manager)(등록상표) 소프트웨어 버전 4.1(Scientific and Educational Software Inc., Durham, NC) 또는 OLIGO 4.0 프라이머 분석 소프트웨어(copyright Wojciech Rychlik)를 사용하여 디자인한다. 상기 소프트웨어는 조작되는 특정 DNA 단편과 상용성인 PCR 프라이머를 디자인할 수 있게 한다. RT-PCR을 바이오 래드 아이사이클러(Bio Rad iCycler, Hercules, CA)에서 수행하며 상기 RT-PCR에서 프라이머 어닐링, 연신 및 변성 시간을 표준 과정에 따라 정한다(Ausubel et al., 상기). 상기 RT-PCR 산물을 후속적으로 표준 과정을 사용하여 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석한다(Ausubel et al., 상기, 1990); (Sambrook, 상기). 양성 클론을 rdsRNA 구획이 균주에 안정하게 유지된 것을 가리키는 적합한 RT-PCR 패턴을 나타내는 것으로서 정의한다. 상기 RT-PCR 산물을 하기 개시하는 바와 같이, 표준 DNA 서열화 과정을 사용하여 추가로 평가할 수 있다.
목적하는 형질전환체를 동정하였으면, 개별적인 균주들을 보관 배지(10 내지 30%(v/v) 글리세롤을 함유하는 TS이다)에 보관한다. 세균 단리물을 멸균 면봉을 사용하여 고체 배지로부터 수확하고 보관 배지에 108 내지 109 cfu/㎖의 밀도로 현탁하고 상기 현탁액을 -80 ℃에서 보관한다.
정제된 rdsRN의 배치를 당해 분야에 널리 공지되고 그 밖에 다른 곳에 상세히 광범위하게 공개된 방법을 사용하여 상기 담체 균주로부터 정제한다(Mindich et al., J Virol 66, 2605-10; 1992); (Mindich, et al., Virology 212:213-217; 1995); (Mindich, et al., Bacteriology 181:4505-4508; 1999); (Qiao, et al., Virology 275:218-224; 2000); (Qiao, et al., Virology 227:103-110; 1997); (Olkkonen, et al., Proc Natl Acad Sci USA 87:9173-9177; 1990); (Onodera, et al., J Virol 66, 190-196; 1992).
5. 생체 내에서 생물 효과가 일어나도록 유도하기 위한 rdsRN의 용도
본 발명에 개시된 신규의 rdsRP 발현 시스템을 제형화하는데 사용되는 특정 방법은 본 발명에 중요하지 않으며 생리 완충액(Felgner et al., 미국 특허 # 5589466(1996); 알루미늄 포스페이트 또는 알루미늄 하이드록시포스페이트(예를 들어 Ulmer et al., Vaccine, 18:18; 2000), 모노포스포릴-지질 A(또한 MPL 또는 MPLA로서 지칭됨; Schneerson et al., J. Immunol., 147:2136-2140; 1991); (예를 들어 Sasaki et al., Immunol., 65; 3520-3528; 1997); (Lodmell et al., Vaccine, 18:1059-1066; 2000), QS-21 사포닌(Sasaki, et al., J. Virol., 72:4931; 1998); 덱사메타손(예를 들어 Malone, et al., J. Biol. Chem. 269:29903; 1994); CpG DNA 서열(Davis et al., J. Immunol., 15:870; 1998); 또는 리포폴리사카라이드(LPS) 길항물질(Hone et al., 상기 1997).
상기 rdsRN을 정맥 내, 근육 내, 피 내, 복강 내, 비 내 및 경구 접종 경로에 의해 진핵 세포, 동물 조직 또는 인간 조직에 직접 투여할 숭 lTEk. 본 발명에 개시된 rdsRN 구조물을 표적 세포 또는 조직에 도입시키는데 사용되는 특정한 방법은 본 발명에 중요하지 않으며 앞서 개시된 백신화 과정(Wolff, et al., Biotechniques 11:474-85; 1991); (Johnston and Tang, Methods Cell Biol 43:353-365; 1994); (Yang and Sun, Nat Med 1:481-483; 1995); (Qiu, et al., Gene Ther. 3:262-8; 1996); (Larsen, et al., J. Virol. 72:1704-8; 1998); (Shata and Hone, J. Virol. 75: 9665-9670; 2001); (Shata et al., Vaccine 20:623-629; 2001); (Ogra, et al., J Virol 71:3031-3038; 1997); (Buge, et al., J. Virol. 71:8531-8541; 1997); (Belyakov, et al., Nat. Med. 7, 1320-1326; 2001); (Lambert, et al., Vaccine 19:3033-3042; 2001); (Kaneko, et al., Virology 267:8-16; 2000); (Belyakov, et al., Proc Natl Acad Sci USA 96; 4512-4517; 1999) 중에서 선택할 수 있다.
본 발명에 의해 포함되는 특정한 생물 효과들로는 비 제한적으로 보호 또는 조절 면역 반응, 치료 반응, 및 숙주 단백질의 발현의 하향조절(예를 들어 siRNA) 또는 발현의 상향조절(예를 들어 사이토킨 발현)이 있다. 초기에, rdsRN을 102 내지 109 뉴클레오캡시드 입자로 투여하고, 적합한 경로, 예를 들어 경구, 비 내, 피하, 근육 내 또는 침입성 세균 벡터(Sizemore et al., Science. 1995 Oct 13; 270(5234): 299-302)를 통해 투여한다. 투여 회수는 개별적인 rdsRN의 효능에 따라 변하며 2- 내지 4-주 간격으로 1 호, 2 회 또는 3 회 투여 섭생일 수 있다. 각각의 발현 연구는 관심 유전자를 함유하지 않는 음성 대조용 rdsRN을 포함하며, 관심 유전자를 암호화하는 DNA 백신 벡터는 양성 대조군으로 사용할 수 있다.
생물 시스템에서 rdsRN 암호화된 유전자 발현의 생물 효과를 측정하는 방법들은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. 예로서, gp120에 대한 혈청 IgG 및 IgA 반응을 측정하기 위해서, 혈청들을 백신 접종 전 및 접종 후 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 및 80일째에 수거한다. 약 400 내지 500 ㎕의 혈액을 각 마우스의 꼬리 정맥으로부터 개별적인 튜브에 모으고 얼음 상에서 4 시간 동안 배양하여 응고시킨다. 5 분간 마이크로퓨즈에서 원심분리 후에, 상기 혈청을 새로운 튜브로 옮기고 -80 ℃에서 보관한다. 관심 유전자에 의해 발현되는 항원에 대한 점막 IgG 및 IgA 반응을 백신접종 전 및 접종 후 규칙적인 간격으로 수확되는 배설물 펠릿 및 질 세척물을 사용하여 측정한다(Srinivasan et al., Biol. Reprod. 53:462; 1995); (Staats et al., J. Immunol. 157:462; 1996). 표준 ELISA를 사용하여 혈청 및 점막 샘플 중의 gp120에 대한 IgG 및 IgA 반응을 정량화한다(Abacioglu et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:371; 1994); (Pincus et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 12:1041; 1996). 오브알부민을 음성 대조용 항원으로서 각각의 ELISA에 포함시킬 수 있다. 또한, 각각의 ELISA는 적합한 대로, 양성 대조용 혈청, 배설물 펠릿 또는 질 세척 샘플을 포함할 수 있다. 상기 양성 대조용 샘플을 개시된 바와 같이 10 ㎍의 콜레라 독소와 혼합한 관심 유전자에 의해 발현된 항원 10 ㎍과 비 내로 백신 접종한 동물로부터 수확한다(Yamamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:5267; 1997). 끝점 역가를 음성 대조군 열 + 3 개의 표준 오차 값의 평균보다 큰 490 ㎚에서의 흡광도 증가를 생성시킨 최종 혈청 희석의 역수를 취하여 계산한다.
세포 면역성을 측정하기 위해서, 림프 조직으로부터의 풍부한 CD4+ 및 CD8+ T 세포의 세포 현탁액을 사용하여 사이토킨-특이 ELISPOT 분석에 의해 항원 특이적 T 세포 반응을 측정한다(Wu et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 13:1187; 1997). 상기와 같은 분석은 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IFN-γ를 분비하는 항원 특이적 T세포의 수를 평가할 수 있다. 모든 ELISPOT 분석을 개시되고(Wu et al., Infect. Immun. 63:4933; 1995) 앞서 사용된 바와 같이(Xu-Amano et al., J. Exp. Med. 178:1309; 1993) 상업적으로 입수할 수 있는 포착 및 검출 mAb(R&D Systems and Pharmingen)를 사용하여 수행한다(Okahashi et al., Infect. Immun. 64:1516; 1996). 각각의 분석은 마이토젠(Con A) 및 오브알부민 대조군을 포함한다.
6. 표적 세포 또는 조직에서 면역 반응을 유도하거나 생물 효과를 일으키기 위한 redRN을 수반하는 세균 벡터의 용도
rdsRN을 표적화된 진핵 세포, 조직 또는 유기체의 암호화된 서열에 전달하고 상기를 발현하는 것은 비 병원성 또는 감독된 세균 백신 벡터에 수반된 rdsRN을 접종하여 수행할 수 있다. 관심 생물 반응은 비 제한적으로 보호 또는 조절 면역 반응, 치료 반응, 및 및 숙주 단백질의 발현의 하향조절(예를 들어 siRNA) 또는 발현의 상향조절(예를 들어 사이토킨 발현)이다.
본 발명에서 세균 백신 벡터가 유도되는 세균 종은 본 발명에 중요하지 않으며, 비 제한적으로 캄필로박터 스페시즈, 네이세리아 스페시즈, 하에모필루스 스페시즈, 아에로모나스 스페시즈, 프란시셀라 스페시즈, 예르시니아 스페시즈, 클렙시엘라 스페시즈, 보르데텔라 스페시즈, 레지오넬라 스페시즈, 코리네박테리움 스페시즈, 시트로박터 스페시즈, 클라마이디아 스페시즈, 브루셀라 스페시즈, 슈도모나스 스페시즈, 헬리코박터 스페시즈, 또는 비브리오 스페시즈가 있다.
사용되는 특정한 캄필로박터 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 캄필로박터 균주의 예로는 비 제한적으로 씨 제주니(ATCC 번호 43436, 43437, 43438), 씨 하이오인테스티날리스(ATCC 번호 35217), 쎄 페투스(ATCC 번호 19438), 쎄 페칼리스(ATCC 번호 33709), 씨 도이레이(ATCC 번호 49349) 및 씨 콜라이(ATCC 번호 33559, 43133)가 있다.
사용되는 특정한 예르시니아 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 예르시니아 균주의 예로는 비 제한적으로 와이 엔테로콜리티카(ATCC 번호 9610) 또는 와이 페스티스(ATCC 번호 19428), 와이 엔테로콜리티카 Y대3-R2(al-Hendy et al., Infect. Immun., 60:870; 1992) 또는 와이 엔테로콜리티카 aroA(O'Gaora et al., Micro. Path., 9:105; 1990)가 있다.
사용되는 특정한 클렙시엘라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 클렙시엘라 균주의 예로는 케이 뉴모니아에(ATCC 번호 13884)가 있다.
사용되는 특정한 보르데텔라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 보르데텔라 균주의 예로는 비 페르투시스, 비 브론키셉티카(ATCC 번호 19395)가 있다.
사용되는 특정한 네이쎄리아 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 네이쎄리아 균주의 예로는 엔 메닌지티디스(ATCC 번호 13077) 및 엔 고노로에아에(ATCC 번호 19424), 엔 고노로에아에 MS11 aro 돌연변이체(Chamberlain et al., Micro. Path., 15:51-63; 1993)가 있다.
사용되는 특정한 아에로모나스 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 아에로모나스 균주의 예로는 에이 살미노시다(ATCC 번호 33658), 에이 슈베리(ATCC 번호 43700), 에이 하이드로필라, 에이 유크레노필라(ATCC 번호 23309)가 있다.
사용되는 특정한 프란시셀라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 프란시셀라 균주의 예로는 에프 툴라렌시스(ATCC 번호 15482)가 있다.
사용되는 특정한 코리네박테리움 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 코리네박테리움 균주의 예로는 씨 슈도투베르큘로시스(ATCC 번호 19410)가 있다.
사용되는 특정한 시트로박터 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 시트로박터 균주의 예로는 씨 프레운디(ATCC 번호 8090)가 있다.
사용되는 특정한 클라미디아 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 클라미디아 균주의 예로는 비 제한적으로 씨 뉴모니아에(ATCC 번호 VR1310)가 있다.
사용되는 특정한 하에모필루스 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 하에모필루스 균주의 예로는 에이치 인플루엔자에(Lee et al., J. Biol. Chem. 270:27151; 1995), 에이치 솜누스(ATCC 번호 43625)가 있다.
사용되는 특정한 브루셀라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 브루셀라 균주의 예로는 비 아보르투스(ATTC 번호 23448)가 있다.
사용되는 특정한 레지오넬라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 레지오넬라 균주의 예로는 엘 뉴모필라(ATCC 번호 33156) 또는 엘 뉴모필라 mip 돌연변이체(Ott, FEMS Micro. Rev., 14:161; 1994).
사용되는 특정한 슈도모나스 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 슈도모나스 균주의 예로는 피 아에루기노사(ATCC 번호 23267)가 있다.
사용되는 특정한 헬리코박터 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 헬리코박터 균주의 예로는 에이치 파이로리(ATCC 번호 43504), 에이치 무스텔라에(ATCC 번호 43772)가 있다.
사용되는 특정한 비브리오 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 비브리오 균주의 예로는 비브리오 콜레라에(ATCC 번호 14035), 비브리오 신시나티엔시스(ATCC 번호 35912), 브이 콜레라에 RSI 독성 돌연변이체(Taylor et al., J. Infect. Dis., 170:1518-1523; 1994); 및 브이 콜레라에 ctxA, ace, zot, cep 돌연변이체(Waldor J et al., Infect., Dis., 170:278-283; 1994)가 있다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명에서 패키징 균주가 발생하는 세균 균주는 패키징 균주로서 및 백신 벡터로서 모두 작용할 가능성을 갖는 세균, 예를 들어 엔테로박테리아세아에, 예를 들어 비 제한적으로 에스케리키아 스페시즈, 시겔라 스페시즈 및 살모넬라 스페시즈를 포함한다. 그람 양성 및 산-내성 패키징 및 벡터 균주를 리스테리아 모노시토제네스 또는 마이코박테리움 스페시즈로부터 유사하게 제작할 수 있다.
사용되는 특정한 에스케리키아 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 에스케리키아 균주의 예로는 에스케리키아 콜라이 DH5α, HB101, HS-4, 4608-58, 1184-68, 53638-C-17, 13-80, 및 6-81(예를 들어 문헌[Sambrook et al., 상기; Grant et al., 상기; Sansonett et al., Ann. Microbiol. Inst. Pasteur, 132A:351; 1982]을 참조하시오), 장독성 이 콜라이(예를 들어 문헌[Evans et al., Infect. Immun., 12:656; 1975]을 참조하시오), 장병원성 이 콜라이(예를 들어 문헌[Donnenberg et al., J. Infect. Dis., 169:831; 1994]을 참조하시오), 장침입성 이 콜라이(예를 들어 문헌[Small et al., Infect Immun., 55:1674; 1987]을 참조하시오) 및 장출혈성 이 콜라이(예를 들어 문헌[McKee and O'Brien, Infect. Immun., 63:2070; 1995]을 참조하시오)가 있다.
사용되는 특정한 살모넬라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 살모넬라 균주의 예로는 에스 티피(예를 들어 ATCC 번호 7251 참조), 에스 티피뮤리움(예를 들어 ATCC 번호 13311 참조), 살모넬라 갈리나룸(ATCC 번호 9184), 살로넬라 엔테리디티스(예를 들어 ATCC 번호 4931 참조), 및 살모넬라 티피뮤리움(예를 들어 ATCC 번호 6994 참조), 에스 티피 aroC, aroD 이중 돌연변이체(예를 들어 문헌[Hone et al., Vacc., 9:810-816; 1991]을 참조하시오), 에스 티피뮤리움 aroA 돌연변이체(예를 들어 문헌[Mastoeni et al., Micro. Pathol., 13:477-491; 1992]을 참조하시오)가 있다.
사용되는 특정한 시겔라 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 시겔라 균주의 예로는 시겔라 플렉스네리(예를 들어 ATCC 번호 29903 참조), 시겔라 플렉스네리 CVD1203(예를 들어 문헌[Noriega et al., Infect. Immun. 62:5168; 1994]을 참조하시오), 시겔라 플렉스네리 15D(예를 들어 문헌[Sizemore et al., Science 270:299; 1995]을 참조하시오), 시겔라 손네이(예를 들어 ATCC 번호 29930 참조), 및 시겔라 다이센테리아에(예를 들어 ATCC 번호 13313 참조)가 있다.
사용되는 특정한 마이코박테리움 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 마이코박테리움 균주의 예로는 엠 투베르큘로시스 CDC1551 균주(예를 들어 문헌[Griffith et al., Am. J. Respir. Crit. Care Med. Aug; 152(2):808; 1995]을 참조하시오), 엠 투베르큘로시스 베이징 균주(Soolingen et al., 1995) H37Rv 균주(ATCC#25618), 엠 투베르큘로시스 판토테네이트 영양요구 균주(Sambandamurthy, Nat. Med. 2002 8(10):1171; 2002), 엠 투베르큘로시스 rpo V 돌연변이 균주(Collins et al., Proc Natl Acad Sci USA. 92(17):8036; 1995), 엠 투베르큘로시스 류신 영양요구 균주(Hondalus et al., Infect. Immun. 68(5):2888; 2000), BCG 덴마크 균주(ATCC#35733), BCG 일본 균주(ATCC#35737), BCG, 시카고 균주(ATCC#27289), BCG 코펜하겐 균주(ATCC#27290), BCG 파스퇴르 균주(ATCC#35734), BCG 글락소 균주(ATCC#35741), BCG 코노트 균주(ATCC#35745), BCG 몬트리올(ATCC#35746)이 있다.
사용되는 특정한 리스테리아 모노사이토제네스 균주는 본 발명에 중요하지 않다. 본 발명에 사용될 수 있는 리스테리아 모노사이토제네스 균주의 예로는 엘 모노사이토제네스 균주 10403S(Stevens et al., J. Virol 78:L8210-8218; 2004) 또는 돌연변이성 엘 모노사이토제네시스 균주, 예를 들어 (i) actA plcB 이중 돌연변이체(Peters et al., FEMS Immunology and Medical Microbiology 35:243-253; 2003); (Angelakopoulous et al., Infect and Immunity 70:3592-3601; 2002); (ii) 알라닌 라세마제 유전자 및 D-아미노산 아미노트랜스퍼라제 유전자에 대한 dal dat 이중 돌연변이체(Thompson et al., Infect and Immunity 66:3552-3561; 1998)가 있다.
이 콜라이, 살모넬라, 마이코박테리아, 시겔라 및 리스테리아를 감독시키는 방법은 본 발명에 중요하지 않으며 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다(Evans et al., 상기, 1975); (Noriega et al., 상기, 1994); (Hone et al., 상기, 1991).
일단 비 병원체 또는 감독된 세균 백신 벡터 균주가 선택되었으면, 상기 균주를 rdsRN 패키징 균주로서 작용하도록 변경시킨다. 이를 상기 균주에서 dsRP 프로캡시드를 발현하는 구획-L 서열을 도입시킴을 수반하는 상기 상세히 개시한 전력 및 상기 균주에서 돌연변이에 의해 발생하는 결손을 보완하는 작용성 유전자를 발현하는 rdsRN의 선택 및 유지를 가능하게 하는 돌연변이를 사용하여 수행한다.
목적하는 rdsRN을 패키징하고 안정하게 유지하는 균주를 생성시키기 위해서, 생체 외 합성된 재조합 구획 RNA(들)를 일렉트로포레이션에 의해 패키징 균주에 도입시키고 형질전환체를 재조합 구획에서 양성 선택 대립유전자를 포함하고 발현하는 균주의 생육만을 허용하는 조건 하에 고체 배지에서 단리시킨다(예를 들어 트립신 처리된 간장 아가는 야생형 유전자가 게놈 결손을 보완하는 경우 asd 및 murI 돌연변이체의 생육만을 허용한다, Difco, Detroit, MI, 목록 번호 244520). rdsRNA 구획의 생성, 생체 외 mRNA 합성 및 일렉트로포레이션 방법은 모두 상기에 제공되어 있다. 상기 단리물이 관심 rdsRN을 수반하는지를 확인하기 위해서, 개별적인 단리물을 액체 배지(예를 들어 TS, Difco, Detroit, MI, 목록 번호 244620)에서 배양하고 뉴클레오캡시드를 다른 곳에 보고되어 있고 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 방법을 사용하여 상기와 같은 배양물로부터 단리시킨다(Gottlieb et al., J. Bacteriol 172:5774; 1990); (Sun et al., 상기, 2003). dsRNA를 상기 상세히 논의된 바와 같이, 상업적으로 입수할 수 있는 RNA 추출 키트를 사용하여 상기 뉴클레오캡시드로부터 단리하고 재조합 구획 내에서 한정된 단편들을 증폭시키는 프라이머, 예를 들어 비 제한적으로 양성 선택 대립유전자, IRES 및 관심 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 선별한다. 양성 클론은 rdsRNA 구획이 균주에 안정하게 유지된 것을 가리키는 적합한 RT-PCR 패턴을 나타내는 것으로서 정의한다.
rdsRN을 안정하게 함유하는 세균 벡터 균주의 성장에 특정한 배양 조건은 본 발명에 중요하지 않다. 예시를 목적으로, 돌연변이체를 세균 균주가 생육하기에 적합한 통상적인 배양 기법을 사용하여 액체 배지, 예를 들어 TS 배지(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 244620), 영양 브로쓰(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 233000), 트립신 간장 브로쓰(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 211822)에서 증식시킬 수 있다(Miller, 상기, 1991). 한편으로, 세균을 고체 배지, 예를 들어 영양 아가(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 212000), 트립신 간장 아가(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 236920) 또는 M9 최소 아가(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 248510) 상에서 배양할 수 있다.
마이코박테리움 백신 벡터 균주를 액체 배지, 예를 들어 미들브룩(Middlebook) 7H9(Difco, Detroit, MI, 목록 번호 271310) 또는 셜튼(Saulton) 합성 배지에서, 바람직하게는 37 ℃에서 배양한다. 상기 균주를 정적 또는 교반된 배양물로서 유지시킬 수 있다. 또한, 마이코박테리움의 증식율을 올레산(0.06% v/v; Research Diagnostics 목록 번호 01257) 및 세제, 예를 들어 타이록사폴(0.05% v/v; Research Diagnostics 목록 번호 70400)을 첨가하여 향상시킬 수 있다. 마이코박테리움 배양물의 정제를 인산염 완충 염수(본 발명에서 PBS라 칭함)로 연속 희석한(예를 들어, 순수-10-8에서 10 배 단계) 마이코박테리움 배양물의 100 ㎕ 분액을 25 내지 30 ㎖의 고체 배지, 예를 들어 미들브룩 7H10(BD Microbiology, Cockeyesville, MD, 목록 번호 221174) 상에 균일하게 확산시켜 평가할 수 있다.
본 발명의 rdsRN과 함께 투여되는 세균 백신 벡터의 양은 환자의 종뿐만 아니라 치료하려는 질병 또는 증상에 따라 변할 것이다. 일반적으로, 사용되는 투여량은 약 103 내지 1011의 생육 가능한 유기체, 바람직하게는 약 103 내지 109의 생육 가능한 유기체일 것이다.
rdsRN을 함유하는 세균 벡터를 일반적으로는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제와 함께 투여한다. 사용되는 특정한 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제는 본 발명에 중요하지 않다. 희석제의 예로는 포스페이트 완충 염수, 위산을 완충시키기 위한 완충제, 예를 들어 슈크로스를 함유하는 시트레이트 완충제(pH 7.0), 바이카보네이트 완충제(pH 7.0) 단독(Levine et al., J. Clin. Invest., 79:888-902; 1987); (Black et al., J. Infect. Dis., 155:1260-1265; 1987), 또는 아스코브산, 락토오스 및 임의로 아스파탐을 함유하는 바이카보네이트 완충제(pH 7.0)(Levine et al., Lancet, II: 467-470; 1988)가 있다. 담체의 예에는 단백질, 예를 들어 탈지유에서 발견되는 바와 같은 단백질, 설탕, 예를 들어 슈크로스, 또는 폴리비닐피롤리돈이 있다. 전형적으로는 상기 담체를 약 0.1 내지 90%(w/v)의 농도, 바람직하게는 1 내지 10%(w/v)의 범위로 사용할 수 있다.
벡터 균주의 생물학적 활성을 적합한 동물 모델(예를 들어 BATS/cJ 마우스, 토끼, 기니 피그 또는 붉은 털 원숭이)에서 평가한다. 처음에, rdsRN 벡터 균주를 102 내지 109 cfu의 투여량으로 투여하고, 적합한 경로에 의해 투여한다(예를 들어 이 콜라이, 살모넬라 및 시겔라를 위 내 또는 비 내로 제공하는 반면, rBCG 벡터는 피하 주입한다). 투여 회수는 개별적인 벡터 균주의 효능, 및 관심의 암호화된 재조합 산물의 결합가에 따라 변할 것이다.
rdsRN 암호화된 생성물에 대한 면역 및 다른 생물 반응의 측정 방법은 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지되어 있다. gp120에 대한 혈청 IgG 및 IgA 반응을 측정하기 위해서 혈청들을 백신 접종 전 및 접종 후 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 및 80일째에 수거한다. 약 400 내지 500 ㎕의 혈액을 각 마우스의 꼬리 정맥으로부터 개별적인 튜브에 모으고 얼음 상에서 4 시간 동안 배양하여 응고시킨다. 5 분간 마이크로퓨즈에서 원심분리 후에, 상기 혈청을 새로운 튜브로 옮기고 -80 ℃에서 보관한다. 관심 유전자에 의해 발현되는 항원에 대한 점막 IgG 및 IgA 반응을 백신접종 전 및 접종 후 규칙적인 간격으로 수확되는 배설물 펠릿 및 질 세척물을 사용하여 측정한다(Srinivasan et al., Biol. Reprod. 53:462; 1995); (Staats et al., J. Immunol. 157:462; 1996). 표준 ELISA를 사용하여 혈청 및 점막 샘플 중의 gp120에 대한 IgG 및 IgA 반응을 정량화한다(Abacioglu et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 10:371; 1994); (Pincus et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 12:1041; 1996). 오브알부민을 음성 대조용 항원으로서 각각의 ELISA에 포함시킬 수 있다. 또한, 각각의 ELISA는 적합한 대로, 양성 대조용 혈청, 배설물 펠릿 또는 질 세척 샘플을 포함할 수 있다. 상기 양성 대조용 샘플을 개시된 바와 같이 10 ㎍의 콜레라 독소와 혼합한 관심 유전자에 의해 발현된 항원 10 ㎍과 비 내로 백신 접종한 동물로부터 수확한다(Yamamoto et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94:5267; 1997). 끝점 역가를 음성 대조군 열 + 3 개의 표준 오차 값의 평균보다 큰 490 ㎚에서의 흡광도 증가를 생성시킨 최종 혈청 희석의 역수를 취하여 계산한다.
세포 면역성을 세포 내 사이토킨 염색(또한 세포 내 사이토킨 세포측정이라 칭함) 또는 ELISPOT(Letsch A. et al., Methods 31:143-49; 2003)에 의해 측정할 수 있다. 상기 두 방법 모두 항원 특이적 면역 반응의 정량화를 허용하지만, ICS는 또한 항원 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 표현형에 의해 특성화하는 능력이 동시에 부가된다. 상기와 같은 분석은 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IFN-γ를 분비하는 항원 특이적 T세포의 수를 평가할 수 있다. 모든 ELISPOT 분석을 개시되고(Wu et al., Infect. Immun. 63:4933; 1995) 앞서 사용된 바와 같이(Xu-Amano et al., J. Exp. Med. 178:1309; 1993) 상업적으로 입수할 수 있는 포착 및 검출 mAb(R&D Systems and Pharmingen)를 사용하여 수행한다(Okahashi et al., Infect. Immun. 64:1516; 1996). 각각의 분석은 마이토젠(Con A) 및 오브알부민 대조군을 포함한다.
7. 재조합 DNA 기법
패키징 균주, 세균 벡터 및 rdsRN의 제작에 사용되는 재조합 DNA 과정, 예를 들어 비 제한적으로 PCR, 제한 엔도뉴클레아제(본 발명에서 "RE"라 칭함) 절단, DNA 연결, 아가로스 젤 전기영동, DNA 정제, 및 다이데옥시뉴클레오타이드 서열화(Miller, A Short Course in Bacterial Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1992); (Bothwell et al., 상기); 및 (Ausubel et al., 상기), 박테리오파지-매개된 형질도입(de Boer, 상기); (Miller, 상기, 1992) 및 (Ausubel et al., 상기), 또는 화학물질(Bothwell et al., 상기); (Ausubel et al., 상기); (Felgner et al., 상기); 및 Farhood, 상기), 일렉트로포레이션(Bothwell et al., 상기); (Ausubel et al., 상기); (Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; 1992) 및 물리적 형질전환 기법(Johnston et al., 상기); (Bothwell et al., 상기)이 다른 곳에 개시되어 있다. 상기 유전자를 파지(de Boer et al., Cell, 56:641-649; 1989), 플라스미드 벡터(Curtiss et al., 상기) 상에 통합시키거나 또는 표적 균주의 염색체(Hone et al., 상기)에 접합할 수 있다.
유전자 서열을 어플라이드 바이오시스템스 ABITM 3900 하이 쓰루풋 DNA 합성기(Foster City, CA 94404 U.S.A.)) 및 제조사가 제공한 과정을 사용하여 합성적으로 생성시킬 수 있다. 큰 서열, 즉 200 bp 초과의 서열을 합성하기 위해서 일련의 완전한 길이의 구획들을 당해 분야에 널리 공지된 과정을 사용하여 PCR에 의해 생성시키고 함께 연결시켜 완전한 길이의 서열을 제조한다. 그러나, 보다 작은 서열, 즉 200 bp 미만의 서열을 어플라이드 바이오시스템스 ABITM 3900 하이 쓰루풋 DNA 합성기(Foster City, CA 94404 U.S.A.)) 및 제조사가 제공한 과정을 사용하여 단일 라운드로 합성적으로 생성시킬 수 있다.
재조합 플라스미드를 바이오래드 진-펄서(BioRad Gene-Pulser)(등록상표) 세트(BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 200 Ω, 25 μF 및 2.5 kV에서 사용하여 일렉트로포레이션에 의해 세균 균주에 도입시킨다. cDNA 서열을 확인하기 위한 뉴클레오타이드 서열화를 표준 자동화된 서열화 기법(어플라이드 바이오시스템스 자동화된 서열화기, 모델 373A)에 의해 수행한다. DNA 서열화 및 폴리머라제 쇄 반응(본 발명에서 "PCR"이라 칭함)을 위한 DNA 프라이머를 어플라이드 바이오시스템스 ABITM 3900 하이 쓰루풋 DNA 합성기(Foster City, CA 94404)를 사용하여 합성한다.
하기 실시예는 단지 예시를 목적으로 제공되며, 결코 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 재조합 DNA 과정
제한 엔도뉴클레아제(본 발명에서 "RE"; New England Biolabs, Beverly, MA), T4 DNA 리가제(New England Biolabs, Beverly, MA) 및 Taq 폴리머라제(Life Technologies, Gaithersburg, MD)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하였으며; 플라스미드 DNA를 제조사의 프로토콜(Qiagen, Santa Clarita, CA)에 따라 소규모(Qiagen MiniprepR 키트, Santa Clarita, CA) 또는 대규모(Qiagen MiniprepR 키트, Santa Clarita, CA) 플라스미드 DNA 정제 키트를 사용하여 제조하고; 뉴클레아제 부재, 분자 생물학 등급 탈이온수, 트리스-HCl(pH 7.5), EDTA pH 8.0, 1M MgCl2, 100%(v/v)에탄올, 초순수 아가로스, 및 아가로스 젤 전기영동 완충제를 라이프 테크놀로지스(Gaithersburg, MD)로부터 구입하였다. RE 절단, PCR, DNA 연결 반응 및 아가로스 젤 전기영동을 잘 공지된 과정에 따라 수행하였다(Sambrook, et al., 상기, 1989); (Ausubel, et al., 상기, 1990). 하기 실시예에 개시된 각각의 재조합 플라스미드의 DNA 서열을 확인하기 위한 뉴클레오타이드 서열화를 어플라이드 바이오시스템스 자동화된 서열화기, 모델 373A를 사용하여 통상적인 자동화된 DNA 서열화 기법에 의해 수행하였다.
PCR 프라이머를 인티그레이티드 DNA 테크놀로지스(Coralville, IA) 또는 매릴랜드 바이오폴리머 퍼실리티 대학(Baltimore, MD)으로부터 구입하거나 또는 어플라이드 바이오시스템스 DNA 합성기(모델 373A)를 사용하여 합성하였다. PCR 프라 이머를 200 μM의 농도로 사용하고 PCR 반응을 위한 어닐링 온도를 클론 관리 소프트웨어 버전 4.1(Scientific and Educational Software Inc., Durham, NC) 또는 OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어 버전 4.0을 사용하여 측정하였다. PCR을 바이오 래드 아이사이클러(Hercules, CA)에서 수행하였다. 증폭용 PCR 프라이머를 클론 매니저(등록상표) 소프트웨어 버전 4.1(Scientific and Educational Software Inc., Durham, NC) 또는 OLIGO 프라이머 분석 소프트웨어 버전 4.0을 사용하여 디자인한다. 상기 소프트웨어는 PCR 프라이머의 디자인을 가능하게 하며 조작하려는 특정 DNA 단편과 상용성인 RE 부위를 식별한다. PCR을 바이오 래드 아이사이클러(Hercules, CA)에서 수행하고, 상기 PCR에서 프라이머 어닐링, 연신 및 변성 시간을 표준 과정에 따라 지정하였다(Ausubel et al., 상기). 상기 RE 절단 및 PCR을 후속적으로 표준 과정을 사용하여 아가로스 젤 전기영동에 의해 분석하였다(Ausubel et al., 상기); (Sambrook, 상기). 양성 클론은 적합한 RE 패턴 및/또는 PCR 패턴을 나타내는 것으로서 정의되었다. 상기 과정을 통해 식별된 플라스미드를 상술한 바와 같이 표준 DNA 서열화 과정을 사용하여 추가로 평가할 수 있다.
에스케리키아 콜라이 균주 Top10 및 DH5α를 인비트로전(Carlsbad, CA)으로부터 구입하고 균주 SCS110을 스트라타진(La Jolla, CA)으로부터 구입하였다. 이들은 하기 실시예에 개시된 재조합 플라스미드의 숙주로서 작용하였다. 재조합 플라스미드를 개시한 바와 같이 진 펄서 세트(BioRad Laboratories, Hercules, CA)를 200 Ω, 25 μF 및 1.8 kV에서 사용하거나 화학적 형질전환을 사용하여 일렉트 로포레이션에 의해 이 콜라이에 도입시켰다.
세균 균주를 달리 나타내지 않는 한 적합한 온도에서 트립신 간장 아가(Difco, Detroit, MI) 또는 트립신 간장 브로쓰(Difco, Detroit, MI) 상에서 증식시켰다. 배지에 필요에 따라 암피실린 100 ㎍/㎖, 가나마이신 50 ㎍/㎖, 및/또는 클로람페니콜 20 ㎍/㎖(Sigma, St. Louis, MO)을 보충하였다. 세균 균주를 30%(v/v) 글리세롤을 함유하는 트립신 간장 브로쓰(Difco)(Sigma, St Louis, MO)에 약 109 콜로니-형성 단위(본 발명에서 "cfu"라 칭함)/㎖에서 -80 ℃에서 보관하였다.
시약 목록
$(p.43)(트립신 간장 브로쓰/트립신 간장 아가/플라스미드 DNA 정제 키트/글리세롤/송아지 장 알칼리성 포스파타제/폴리머라제/정제 키트/다이아미노피멜산/세포 배양물 용해 시약/라이소자임/칼륨 포스페이트/염화 마그네슘/전사 키트/비오틴화된 RNA 밀레니움 마커/나일론 멤브레인/완충제/염화 마그네슘/암모늄 아세테이트/염화 나트륨/염화 칼륨/다이티오쓰레이톨/폴리에틸렌 글리콜/억제제/비오틴/리보뉴클레아제)
실시예 2: asd 돌연변이를 보완하고 형광 정보제공 유전자 및 마이코박테리움 결핵 항원 및 LCMV 항원을 발현하는 rdsRNA 구획의 제작
상기 연구의 목적은 파이-8의 dsRNA 게놈을 근거로 원형 rdsRN에 통합시킬 수 있는 재조합 구획을 발생시키는 것이었다(Mindich et al., J. Bacteriol, 181:4505; 1999); (Mindich, Microbiol. Mol. Biol. Rev, 63:149; 1999); (Hoogstraten et al., Virology, 272:218; 2000); (Sun et al., Virology, 308:354; 2003). 상기 논의된 바와 같이, 파이-8 게놈은 3 개의 구획, 즉 S, M 및 L로 이루어진다. 현형 rdsRN을 야생형 구획 L(본 발명에서 "wtL"이라 칭함)에 의해 암호화된 RNA-의존성 RNA 폴리머라제는 재조합 구획-M 및 -S(본 발명에서 각각 "rM" 및 "rS"라 칭함)에 클로닝된 승객 유전자를 발현하도록 제작한다. rM과 rS는 모두 각각 유전자 10 및 8의 세균 리보솜 결합 부위에 결합된 야생형 아스파트산 세미알데하이드 데하이드로게나제 유전자(본 발명에서 "asd"라 칭함, GenBank #V00262)(도 4 참조), 및 C형 간염 바이러스의 IRES에 작용적으로 결합된 관심 유전자(즉 형광 단백질 HcRed 및 마이코박테리아 항원 TBS)를 암호화한다. 구획-M 및 -S 상의 파지 구조 유전자는 초기에 rM 또는 rS에 통합되지 않지만 rS의 asd 대립유전자는 나중의 본 발명의 구체화에서 야생형 구획-S의 유전자 8로 대체되어 상기 rdsRN을 안정화시킴에 주목한다. 상기 asd 대립유전자 및 IRES::HcRed 및 Mtb 항원 암호화 서열은 각각 pac 및 음성 가닥 RNA 합성 개시 서열을 암호화하는 5-프라임 및 3-프라임 번역되지 않은 서열에 인접해 있다. 즉, rM 상의 정보제공된 유전자는 구획-M의 5-프라임 pac 서열 및 구획-M의 3-프라임 말단 서열에 인접해 있다. 유사하게, rS는 상기 구획-S의 5-프라임 pac 서열 및 구획-S 유전자의 3-프라임 말단 서열에 인접한 정보제공된 유전자들로 이루어진다(도 5). 이러한 형태는 단지 rdsRN의 생산을 허용할 뿐이며 파지도 rdsRP 입자도 형성시키지 않음에 주목한다.
재조합 구획의 제작을 합성 DNA 및 표준 재조합 DNA 기법, 예를 들어 실시예 1에 개시된 바와 같이, PCR, RT-PCR, 부위 지향 돌연변이, 제한 효소 절단, 젤 전기영동, 연결, 다이데옥시뉴클레오타이드 서열화, 세균 형질전환을 사용하여 수행하였다.
재조합 구획-S(rS)를 미들랜드 서티파이드 리에이전트 캄파니(Midland, TX)에 의해 합성하였다. 5- 및 3-프라임 서열을 하기 개시된 변경을 사용하여 파이-8 구획-S(친절하게도 레오나드 민디치 박사(Dr. Leonard Mindich)에 의해 제공됨, GenBank 수탁 번호 AF226853)의 cDNA 사본으로부터 유도하였다. 5-프라임에서 3-프라임 배향으로, rS(서열식별번호 1)는 하기의 융합된 성분들로 이루어진다(도 4):
(i) 유전자 8의 S pac 서열 및 리보솜 결합 부위(본 발명에서 "RBS"라 칭함)는 구획-S의 처음 187 개 뉴클레오타이드이고(GenBank 수탁 번호 AF226853) 프로캡시드에 의한 흡수에 필요하다(Hoogstraten et al., 상기; 2000). 상기 RBS는 원핵 세포에서 번역의 개시에 필요하다.
(ii) Δasd 이콜라이 균주 X6212에서 양성 선택을 위해 상기 RBS에 작용적으로 결합된 asd 유전자. 상기 asd 서열을 GenBank 수탁 번호 V00262의 염기 240 내지 1343으로부터 획득하였다.
(iii) 진핵 세포에서 번역 개시를 위한 C형 간염 바이러스 내부 리보솜 참가 부위. 상기 서열은 GenBank 수탁 번호 AJ242651의 염기 36-341에 걸쳐 있다.
(iv) 승객 유전자의 삽입을 위한 복합 클로닝 부위(MCS).
(v) rS mRNA의 폴리아데닐화를 위한 셈리키 포레스트 바이러스 3' 번역되지 않은 부분; GenBank 수탁 번호 V01398의 뉴클레오타이드 1-261.
(vi) 파이-8 구획-S 3-프라임 말단 서열, 즉 구획-S의 염기 3081-3192(GenBank 수탁 번호 AF226853), RNA 안정성 및 음성 가닥 RNA 합성의 개시 전에 파이-8 폴리머라제 결합에 필요하다.
상기 성분들로 구성된 합성 DNA 단편(서열식별번호 1)을 실시예 1에 개시된 바와 같이 T4 DNA 리가제를 사용하여 PstI-절단된 pT7/T3-18 DNA(목록 번호 7201, Ambion, Austin, TX)에 결합시켰다. 연결에 이어서, DNA를 일렉트로포레이션을 사용하여(실시예 1) 이 콜라이 균주 DH5α-E(Invitrogen, Carlsbad, CA, 목록 번호 11319-019)에 도입시키고 형질전환체를 37 ℃에서 16 내지 24 시간 동안 암피실린(100 ㎍/㎖)이 보충된 TSA 상에서 배양하여 단리시켰다. 성공적인 연결 산물을, 단일 콜로니를 멸균 이쑤시개로 찌르고 상기 이쑤시개를 암피실린(100 ㎍/㎖)이 보충된 멸균 TSB에 놓아 접종한 2 ㎖ 배양물로부터 대단히 비틀린 DNA를 단리시켜 동정하고; 상기 배양물을 37 ℃에서 16 내지 24 시간 동안 교반(200 opm)하면서 배양하였다. 원심분리 후에 액체 상등액은 버리고 세균 펠릿을 미니프레프(등록상표) 플라스미드 DNA 정제 키트(Qiagen, Valencia, CA, 목록 번호 27106)의 용액 P1 100 ㎕에 현탁시켰다. 이어서 플라스미드 DNA를 제조사의 설명에 따라 추출하고 정제하였다(Qiagen, Valencia, CA, 목록 번호 27106 설명 매뉴얼 참조). 상기 정제된 플라스미드 DNA를 제조사의 설명에 따라 상기 제조사가 제공한 완충제를 사용하여 제한 엔도뉴클레아제 PstI(New England Biolabs, Beverly, MA, 목록 번호 R140S)로 절단하고 37 ℃에서 1 시간 동안 배양하였다. 생성된 DNA 단편을 개시된 바와 같이 아가로스 젤 전기영동에 의해 분획화하고(실시예 1 참조) 적합한 패턴을 나타내는 플라스미드를 다이데옥시뉴클레오타이드 서열화에 의해 추가로 특성화하였다(실시예 1). 상기 과정은 rS를 암호화하는 DNA를 수반하는 플라스미드 pT7/T3-18을 갖는 4 개의 독립적인 단리물을 동정하였다. 상기 단리물 중의 플라스미드를 AF1이라 표시하며 상기 플라스미드를 포함하는 4 개의 단리물을 암피실린(100 ㎍/㎖)이 보충된 TSA 상에 스트리킹하고 37 ℃에서 16 내지 24 시간 동안 배양하였다. 세균을 후속적으로 멸균 면봉(Puritan, Guilford, ME, 목록 번호 25-8061WC)을 사용하여 수확하고 30%(v/v) 글리세롤을 함유하는 TSB에 약 10 cfu/㎖의 밀도로 현탁시키고 -80 ℃에서 1 ㎖ 분액에 보관하였다.
두 번째 rS(rS2)를 C형 간염 IRES에 의해 BglII부위 옆에 결합된 파이-8 wt 구획-S 서열(GenBank 수탁 번호 AF226853)의 bp 1-1294 및 상술한 바와 같은(rS2, 서열식별번호 3) rS(bp1301-2020)의 하부 서열의 PCR 증폭에 의해 제작하였다. 상기 구조물을 pT7T3-18의 PstI 부위에 연결시키고 이 콜라이 Top10내로 형질전환시켰다. 형질전환체를 상술한 바와 같이 분석하고 6 개의 옳은 단리물을 pAF1S2로 표시하였다.
재조합 구획-M(rM, 서열식별번호 2)은 rS와 유사하나, 단 5-프라임 pac 및 3-프라임 말단 서열은 wt 구획-M, GenBank 수탁 번호 AF226852의 각각 뉴클레오타이드 1-262 및 4677-4741로부터 유도되었다. 따라서, rS처럼, rM은 파이-8 5-프라임 pac 및 3-프라임 말단 서열에 인접한 외부 서열로 이루어진다(도 4). 상기 2060 bp rM(서열식별번호 2)을 플라스미드 pcDNA3.1zeo(Invitrogen, 목록 번호 V860-20, Carlsbad, CA)의 KpnI 및 PstI 부위(New England Biolabs, Beverly, MA, 각각 목록 번호 R142S 및 R0140S) 내로 클로닝하였다. 적합한 삽입물을 갖는 재조합 플라스미드를 rS에 대해 사용된 과정을 사용하여 동정하고 새로운 플라스미드를 pAF19로 표시하였다.
진핵세포 발현 카세트를 제작하기 위해서, pAF1을 HpaI 및 NotI(New England Biolabs, Beverly, MA, 목록 번호 R0105S)으로 절단하였다. 상기 RE는, 일단 연결되었으면 Hc-Red 유전자와 마이코박테리아 항원 패키지가 HCV IRES의 바로 아래에서 상기에 작용적으로 결합하도록 MCS 내에 직접적인 클로닝 부위를 생성시켰다. 절단에 이어서, 선형화된 플라스미드의 단부를 송아지 장 알칼리성 포스파타제(New England Biolabs, Beverly, MA, 목록 번호 M0290S)로 탈인산화시켜 재순환을 방지한다. 이어서 상기 탈인산화된 플라스미드를 0.8% 아가로스 젤에서의 전기영동에 이어서 젤 추출에 의해 정제하였따.
2.0 kb 마이코박테리아 항원 융합 서열(TBS)을 아큐프라임(Accuprime) DNA 폴리머라제(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 HpaI 및 NotIRE 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 플라스미드 pAdApt35.Bsu.TB.S(Crucell)로부터 PCR 증폭시켰다. 상기 증폭된 서열의 크기를 아가로스 젤 전기영동에 의해 확인하였으며 제조사의 설명에 따라 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, 목록 번호 28106, Valencia, CA)를 사용하여 정제하였다.
TB.S를 암호화하는 단편을 T4 DNA 리가제((New England Biolabs, 목록 번호 M0202S)를 사용하여 탈인산화된 pAF1 내로 연결하고 생성된 플라스미드를 pSTB2로 표시하였다.
상기 TBS 항원 융합 서열 및 HC-Red 암호화 서열을 유사하게 상기와 같은 재조합 DNA 과정을 사용하여 pAF19 상에서 운반되는 rM 중의 HpaI 부위 내로 유사하게 삽입하였다. 생성된 플라스미드를 pMTB7 및 pMHc-Red로 표시하였다.
플라스미드 pSTB2 및 pLM2775(야생형 구획-S)를 RE의 SphI 및 PsiI로 선형화하고 생성된 선형화된 단편들을 아가로스 젤 전기영동 및 추출에 의해 정제하였다. 플라스미드 pMTB7 및 pMHc-Red를 SphI 및 PsiI로 유사하게 선형화하였다. 상기 4 개의 RE 절단물 각각으로부터 선형화된 DNA 서열을 제조사의 설명에 따라 듀라스크라이브(Durascribe) T7(Epicentre, Madison, WI) 생체 외 전사 반응에서 주형으로서 사용하여 wtS, rS 암호화 항원 TBS, rM 암호화 항원 TBS 및 rM 암호화 Hc-Red의 플루오르화된 RNA 전사물을 생성시켰다.
세 번째 세트의 rdsRNA 구획을 유사하게, 림프구 맥락수막염 바이러스(본 발명에서 "LCMV")의 당단백질 항원 GP-1 및 GP-2를 발현하도록 제작하였다. 1511 bp 단편을 상기 LCMV 게놈의 큰 염색체 상에 위치한 GP 폴리단백질 전구체를 암호화하는 플라스미드 pCMV-GP로부터 PCR 증폭시켰다. 상기 서열을 아큐프라임 DNA 폴리머라제(Invitrogen, Carlsbad, CA) 및 HpaI 및 NotIRE 부위를 포함하는 프라이머를 사용하여 증폭시켰다. 상기 증폭된 서열의 크기를 아가로스 젤 전기영동에 의해 확인하였으며 제조사의 설명에 따라 QIAquick PCR 정제 키트(Qiagen, 목록 번 호 28106, Valencia, CA)를 사용하여 정제하였다. 플라스미드 pAF1S2 및 pAF19를 RE의 HpaI 및 NotI(New England Biolabs, Beverly, MA, 목록 번호 R0105S)로 선형화하고 송아지 장 포스파타제(New England Biolabs, Beverly, MA, 목록 번호 M0290S)를 사용하여 탈포스포릴화하였다. GP 암호화 서열을 HpaI 및 NotI로 유사하게 절단하고 선형화된 pAF1S2 및 AF19 플라스미드에 연결시켜 플라스미드 pSGP1 및 pMGP2를 생성시켰다. 따라서 상기 플라스미드는 각각 rS2 및 rM의 HCV IRES에 작용적으로 결합된 GP 폴리단백질 전구체 유전자를 암호화한다.
pSGP1 및 pMGP2를 생체 외 전사 주형으로서 작용하도록 각각 RE의 KpnI 및 PsiI로 절단하였다. 플루오르화된 RNA 전사물을 제조사의 설명에 따라 듀라스크라이브 T7(Epicentre, Madison, WI) 생체 외 전사 키트를 사용하여 각각의 플라스미드로부터 생성시켰다. 상기와 같이 생성된 전사물은 rS2 및 rM 모두에서 GP-1 및 GP-2 항원 서열을 암호화하였다.
실시예 3: 원형 패키징 및 전달 균주의 제작
본 연구의 목적은 원형 세균 패키징 균주를 생성시키는 것이었다. 시겔라 플렉스네리 15D는 비 복귀 염색체 asd 마커 삽입 결실 돌연변이를 포함하여 아스파테이트 세미알데하이드 데하이드로게나제(본 발명에서 "ASD"라 칭함)의 생산에 결함을 발생시키며 따라서 세포벽 성분 다이아미노피멜산(본 발명에서 "DAP"라 칭함)을 합성하는 능력이 부족하다(Sizemore et al., Vaccine. 1997 Jun; 15(8):804-7). 생육은 유전자 상보성의 부재 하에서 DAP 50 ㎍/㎖을 갖는 배양 배지의 보충을 필요로 한다(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 목록 번호 D1377).
시겔라를 단지 예로서 선택하였지만, 그의 침입 특성 및 점막 면역 세포에 대한 천연 친화성은 또한 상기를 이상적인 전달 벡터로 만든다. asd 돌연변이가 resRN 암호화된 asd 대립유전자에 의해 보완되므로, 포유동물 세포에 입장 후 용해되고 rdsRN을 방출시키기 위해 상기 균주를 감독시키는 두 번째 염색체 병변을 생성시키는 것이 또한 필요하였다. 대략 1 kb의 murI 유전자(글루타메이트 라세마제를 암호화함)의 상부 및 하부 부분을 PCR에 의해 증폭시키고, PCR 프라이머 암호화된 NheI 부위의 연결에 의해 결합시키고 프라이머 암호화된 SstI 및 XbaI 부위에서 pCVD442(refX)에 연결시켰다. 생성된 플라스미드를 에스 플렉스네리 15D의 접합에 의해 운반하였다. 공동 통합물을 항생제 내성, 슈크로즈 감수성 및 PCR 분석에 의해 동정하고, 당해 분야의 숙련가들에게 널리 공지된 수단에 의해 분해하여 asd, murI 균주 MPC51을 생성시켰다. 상기 murI 돌연변이는 상기 세포를 펩티도글리칸 성분인 D-글루타메이트를 합성할 수 없게 만들고 정상적인 생육을 획득하기 위해 D-글루타메이트 50 ㎍/㎖을 갖는 M9 최소 생육 배지의 보충을 요한다. 더욱이, HeLa 세포 침입 분석은 상기 균주가 침입성이지만 연장된 세포 내 생존을 가능하지 않음을 밝혀내었다(도 7).
상기 영양요구성 요건이 rdsRN에서 암호화된 asd의 발현을 통해 트랜스로 보완될 수 있는지를 측정하기 위해서, 에스 플렉스네리 MPC51을 pLM2653(SP6 프로모터의 조절 하에서 wtL mRNA를 발현하고 프로캡시드를 조립하는데 필요하고 충분한 파이-8 단백질을 생산하는 플라스미드)으로 형질전환시켰다(Sun et al., Vriology, 308:354, 2003). 플라스미드 pLM2653을 일렉트로포레이션에 의해 도입시키고 암 피실린 100 ㎍/㎖을 가하여 선택하였다.
MPC51pLM2653에서 프로캡시드 조립을 천연 및 SDS-변성된 세포 용해물의 차별 여과에 의해 평가하였으며, 이를 프로캡시드 단백질에 특이적인 항혈청으로 면역블럿팅하여 분석하였다(도 8). 간단히, 각 프로캡시드의 예상 MW가 15 MDa이므로, 프로캡시드 단백질(87 kDa 및 34 Da)은 용해물을 10% SDS로 처리하지 않는 한 100 kDa 컷오프 멤브레인을 통과하지 못하며, 이는 조립체를 가리킨다(도 8). 더욱또한, 가늘게 분할된 MPC51pLM2653의 투과형 전자현미경사진은 다수의 대략 60 nM의 프로캡시드 입자를 명확히 밝혀내었다(도 9).
실시예 4: 원형 패키징 균주 내로의 rdsRNA 구획을 암호화하는 ssRNA 의 도입 및 상기 균주에서 rdsRN 의 작용성 자기 복제의 진수
본 실시예의 연구 목적은 세균 패키징 균주에서 rdsRN의 진수 및 유지에 대한 접근법을 개발하는 것이었다. 선택된 전략은 패키징 균주 에스 플렉스네리 MPC51pLM2653(실시예 3)를 실시예 2에 개시된 rM 및 rS 구조물을 암호화하는 생체 외 합성된 ssRNA(+)로 형질전환시킴을 포함한다. MPC51pLM2653에 입장 후, 상기 ssRNA(+)를 프로캡시드에 패키징하고 음성 가닥 합성을 완료하여 rdsRN을 생성시킨다(도 6). 이어서 상기 rdsRN은 wtL, rM 및 rS mRNA를 암호화하는 mRNA(즉 상기 rdsRN으로부터 담체 균주의 세포질 내로 수동적으로 분비되는 ssRNA(+))를 합성한다(도 6). 이들 전사물은 wtL, rM 및 rS의 발현을 통해 보다 많은 프로캡시드를 생산하며, 상기 모두 작용성 asd 유전자를 운반하고, MPC51에서 asd 돌연변이를 보완하며, 이에 의해 생육을 위한 DAP 요건을 제거한다. 상기 wtL, rM 및 rS mRNA 를 또한 프로캡시드 내로 패키징하여 추가적인 rdsRN을 형성시킨다.
MPC51pLM2653의 전기수용 세포를 표준 기법을 사용하여 제조하였다(Ausube et al., 상기). 간단히, 단일 클론을 37 ℃에서 암피실린(100 ㎍/㎖), 가나마이신(50 ㎍/㎖) 및 DAP 50 ㎍/㎖(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, 목록 번호 D1377)이 보충된 M9 배지에서 증식시켰다. 50 ㎖의 배양물을 OD600<0.1에서 개시시키고 세포를 지수 증식기 동안 OD600 0.3 내지 0.6에서 수확하였다. 세포를 빙냉 5 mM EDTA, 10% 글리세롤(v/v)로 1 회 세척하고 이어서 빙냉 10%(v/v) 글리세롤로 3 회 세척하고, 각 세척에 이어서 4000 x g에서 원심분리를 수행하였다. 최종 세척 및 회전 후에, 세포를 10%(v/v) 글리세롤에 재현탁시키고, 200 ㎕ 분액으로 분배하고 -80 ℃에서 보관하였다.
MPC51 pLM2653의 일렉트로포레이션에 사용된 rS 및 rM의 ssRNA(+)를 실시예 2에 개시된 바와 같이, 각각 DNA 주형으로서 선형화된 pSTB2 및 pMTB7을 사용하여 생체 외에서 합성하였다. MPC51 pLM2653 세포를 2 ㎍ ssRNA(+)(1.0 ㎍ rS + 1.0 ㎍ rM)과 함께 일렉트로포레이션시켰다. 일렉트로포레이션을 200 Ω, 25 mcF 및 1.8 kV에서 진-펄서(Gene-Pulser)(BioRad, Hercules, CA)를 사용하여 수행하였다. 세포를 28 ℃에서 50 ㎍/㎖ DAP가 보충되고 항생제는 없는 SOC 배지(cat #15544-034, Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 2 시간 동안 회수하였다. 후속적으로, 상기 세포를 적합한 항생체를 갖고 50 ㎍/㎖의 D-글루타메이트 및 0.1 ㎍/㎖의 DAP(MPC51 pLM2653의 생육을 지원하는데 필요한 DAP의 최소 농도 이하)가 보충된 M9 아가 상에 확산시켰다. 세포를 25 내지 27 ℃에서 증식시킨 다음 상기 세포를 M9 Ap/Kn/D-글루타메이트로 옮기고 DAP를 0.01 ㎍/㎖으로 보충하거나 회수하였다. 상기 세포를 22 내지 25 ℃에서 배양하였으며, 생성 콜로니는 pLM2653으로 인해 암피실린 내성이었고 rS 및 rM 상에서의 asd 유전자의 발현으로 인해 DAP-의존성이었다.
생육 특성을 개선시키기 위해서, MPC51pLM2653을 유전자 8의 공급원으로서 pLM2775를암호화하는 야생형 구획-S 및 pMTB7로부터 생체 외 전사된 ssRNA와 함께 일렉트로포레이션시켰다. 상기 과정 및 후속의 증식 단계를 상술한 바와 같이 수행하여 LSMtb4로 표시하는 rdsRN을 갖는 DAP-의존성 MPC51 균주를 생성시켰다(도 10).
유사하게, MPC51pLM2653을 유전자 8의 공급원으로서 pLM2775를암호화하는 야생형 구획-S, 및 rM의 IRES에 작용적으로 결합된 Hc-Red 단백질을 암호화하는 pMHc-Red로부터 생체 외 전사된 ssRNA와 함께 일렉트로포레이션시켰다. 상기 과정 및 후속의 증식 단계를 상술한 바와 같이 수행하여 LSMHc-Red로 표시하는 rdsRP를 갖는 DAP-의존성 MPC51 균주를 생성시켰다.
세 번째 예에서, LCMV GP 항원을 암호화하는 rS2(유전자-8을 포함한다) 구조물로부터 생체 외 전사된 ssRNA를 사용하여 상기 wtS로부터의 유전자-8 서열의 필요성을 경감시켰다. 에스 플렉스네리 MPC51pLM2653을 상술한 실시예에서와 같이 pSGP1 및 pMGP2로부터 생체 외 전사된 RNA와 함께 일렉트로포레이션시켰다. 후속의 증식 단계를 상술한 바와 같이 수행하여 LSgpMgp로 표시하는 rdsRN을 갖는 DAP- 의존성 MPC51 균주를 생성시켰다. rdsRN의 존재를, 전체 세포 용해물을 뉴클레오캡시드 특이 항혈청으로 면역블럿팅시키고 rS2 및 rM의 (+) 및 (-) 가닥에 특이적인 프라이머를 사용한 RT-PCR에 의해 확인하였다.
MPC51과 생체 외 전사된 ssRNA 중의 rS 및 rM의 임의의 조합과의 일렉트로포레이션은 wtL ssRNA 또는 wtL을 암호화하는 플라스미드에 동반되지 않는 한 형질전환체를 생성시키지 않거나, 또는 표적 균주를 wtL을 암호화하는 플라스미드로 앞서 형질전환시킴은 주목할만하다. 더욱 또한, 생체 외 전사된 ssRNA의 MPC51pLM2653의 일렉트로포레이션 전에 RNAse A에 의한 처리는 형질전환체를 회수하지 못한다. rdsRN을 생성시키는 수단으로서 RNA 일렉트로포레이션의 효율 및 휴능을 입증하는 추가의 예로서, 3 개의 야생형 구획 모두의 생체 외 전사물을 상술한 바와 동일한 방법에 의해 슈도모나스 시린자에(파이-8의 천연 숙주) 내로 일렉트로포레이션시켰다. 상기에 의해 일렉트로포레이션으로부터 유도된 피 시린자에 세포 내의 야생형 파지 입자의 투과형 전자 현미경 가시화 및 일렉트로포레이션으로부터 유도된 세균 밭 중의 플라크의 형성에 의해 입증되는 바와 같이 야생형 용해성 박테리오파지 파이-8이 재생성되었다(도 12).
DAP-의존성은 각각의 rdsRN에 의해 암호화된 rS 및/또는 rM RNA 상의 asd+ 유전자의 증폭으로부터 생성되는듯하다. 실제로, - 또는 + 가닥 RNA의 증폭에 특이적인 프라이머를 사용하여 상술한 rdsRN을 수반하는 균주로부터의 전체 RNA에 대한 RT-PCR 분석은 rS 및 rM의 cDNA의 회수를 발생시킨다. 파지에서 - 가닥 합성 은 오직 3 개의 게놈 구획 모두의 흡수 후에 발생함을 상기하라. rdsRN의 LSMtb4 및 LSMHc-Red를 수반하는 에스 플렉스네리 MPC51은 본원 제출 시에 연속적인 배양물에서 3 개월 이상 DAP-의존성으로 남아있었다. 최종적으로, 상기 구조물은 투과형 전자 현미경검사에 의해 가시적인 조립된 뉴클레오캡시드 및 면역블럿팅에 의해 검출 가능한 캡시드 단백질을 계속해서 생산한다.
따라서, 요약하자면, 상기 결과는 MPC51pLM2653에서 asd 결실의 보완은 패키징 균주 내 rdsNC의 패키징 및 자기복제 기능 및 RNA 흡수의 결과임을 입증한다. 이러한 발견은 상기 과정이 생성 균주 중에 유지되는 rdsRN을 생성시킴을 추가로 입증한다.
실시예 5: 포유동물 세포에서 rdsRN 암호화된 서열의 발현
본 발명의 범위를 세균 패키징 균주의 사용에 의한 포유동물 조직 또는 유기체로의 rdsRN의 전달로 제한하지 않지만, 예시를 위해서 감독된 침입성 세균 시겔라 플렉스네리 MPC51을, 상기가 다수의 조직 배양 세포 주 및 동물 모델에서 천연적으로 침입성이므로 상기를 사용할 것을 결정하였다. 상기 균주를, rdsRN의 진핵 세포 세포질 내로의 방출을 위해서 실시예 3에 개시된 바와 같이 공학처리하여 진핵 세포의 침입 및 세포 내 이입 소포의 이탈 후 세균 세포의 용해를 일으켰다.
최우선의 증거로서, rdsRN LSMtb4를 갖는 MPC51을 선택하였다. 상기 rdsRN 구조물은 TBS라 표시하는 엠 결햅 항원 패키지를 암호화한다. 상기 패키지의 정확한 조성은 본 발명에 중요하지 않지만, 설명을 위해서 상기 항원 패키지의 성분은 단백질 항원 85A를 암호화하는 서열이다. 실시예 2에 개시된 바와 같이, 상기 항원 패키지를 HCV IRES 서열에 연결시키고 상기 서열의 번역 조절 하에 둔다. 상기 rdsRN을 수반하는 세균 균주 내의 TBS 구조물(MPC51+LSMtb4)의 발현 부재를 항원 85A에 대해 탐침된 완전 세포 용해물의 다클론 항혈청(Abcam, Cambridge, UK)에 의한 면역블럿에 의해 확인하였다.
HeLa 세포(Invitrogen, Carlsbad, CA)를 DMEM + 10% 소 태아 혈청(FBS)(Invitrogen, Carlsbad, CA) + 1% 항생체/항진균 용액(Invitrogen, Carlsbad, CA)에서 37 ℃, 5% CO2에서 6 웰 조직 배양 플라스크에서 커버 슬립상에서 60% 이상의 융합율로 증식시켰다. 동시에, 에스 플렉스네리 MPC51+LSMtb4를 28 ℃에서 M9 50 ㎖에서 진탕시키면서 0.6 이상의 OD600로 증식시켰다. 침입 분석 24 시간 전에, 배지를 HeLa 세포로부터 제거하고 DMEM + 10% FBS로 대체하였다. 칩습 2 시간 전에 HeLa 세포 배지를 DMEM으로 대체하고 세균 배양물을 희석하고 37 ℃에서 정적으로 증식시켰다. 이어서 상기 조직 배양 배양기 중의 O2 농도를 N2로 1%로 감소시키고, DMEM 중의 MPC51+LSMtb4의 PBS 세척 현탁액을 100의 감염 배수(MOI)로 HeLa 배양물에 가하고 1 시간 동안 배양시켰다. 동시에, 유사하게 제조된 에스 플렉스네리 15D(asd) 및 MPC51pLM2653의 세균 현탁액을 동일한 방식으로 HeLa 세포의 웰에 가하였다.
1 시간 침입 배양 후에, HeLa 세포를 PBS로 2 회 세척하고, 배양 배지(DMEM+FBS)를 대체시키고 1 시간 동안 150 ㎍/㎖ 젠타마이신 설페이트(Sigma, St. Louis, MO)를 보충시켜 침입되지 않고 따라서 HeLa 세포에 의해 보호되지 않은 임의의 남은 세균 세포를 죽였다. 젠타마이신은 상기 농도에서 광범위하게 항균성이나 진핵 세포막을 통과하지 못한다. 1 시간 후에, 배양 배지를 새로운 DMEM+FBS로 대체하고 조직 배양 세포를 37 ℃, 5% CO2에서 14 시간 동안 배양시켰다.
이어서 HeLa 세포가 있는 커버 슬립을 제거하고, PBS(pH 7.4) 중의 2% 파라폼알데하이드로 고정시키고, PBS(pH 7.4) 중의 0.1% 트리톤 X-100으로 침투시키고, PBS(pH 7.4) 중의 3% BSA, 5% 규정 염소 혈청, 0.05% 나트륨 아지드로 2 시간 동안 차단시키고 PBS(pH 7.4) 중의 1% BSA, 3% NGS, 0.05% 나트륨 아지드로 1:100으로 희석한 항원85A 특이 항혈청(IgY)(Abcam, Cambridge, MA)으로 탐침시켰다. 이어서 세포를 BPS(pH 7.4) 중의 1% BSA, 3% NGS, 0.05% 나트륨 아지드로 1:100 희석한 FITC-접합 토끼 항-IgY(Abcam, Cambridge, MA)으로 역 탐침시키고 형광 현미경검사로 검사하였다. 어떠한 세균, 에스 플렉스네리 15D, 또는 MPC51pLM2653에도 노출시키지 않은 대조용 HeLa 세포 그룹은 항원 85A 발현을 가리키는 형광을 나타내지 않았다. 침입성 MPC51+LSMtb4에 노출된 HeLa 세포는 밝게 형광을 발하였으며 이는 TBS 항원 융합 단백질의 일부로서 세포에서 항원 85A 발현을 가리킨다(도 13). 항원 85A 발현을 시겔라 패키징/담체 균주에서 검출할 수 없고 살아있는 시겔라가 14 시간 배양 후 회수되지 않음을 다시 주목하는 것이 중요하다. 이는 rdsRN 생상된 재조합 구획 mRNA의 포유동물 번역의 명백한 증거이다.
상술한 바와 유사한 방식으로, HeLa 세포 침입을 MPC51+LSMHc-Red(그의 rM 구획 상에 암호화된 직접 형광 Hc-Red 유전자의 서열을 갖는다)로 수행하였다. 침입 노출 12 시간 후에, HeLa 세포 커버 슬립을 고정시키고 형광 현미경검사에 의해 관찰하였다. 에스 플렉스네리 15D 및 MPC51pLM2653 대조군들은 Hc-Red 형광을 나타내지 않은 반면; MPC51+LSMHc-Red 노출된 HeLa 세포는 직접적인 형광을 나타내었다(도 14). 상기 형광이 Hc-Red 발현에 기인한다는 추가의 증거로서, HeLa 세포를 고정시키고 Hc-Red 특이 항체로 탐침시키고 2 차 항체 접합물로 역탐침시켰다. 다시, MPC51+LSMHc-Red에 노출된 세포만이 형광성이었다(도 15). 더욱이, Hc-Red 발현을 면역블럿이나 MPC51+LSMHc-Red 단독의 직접적인 형광 현미경 분석에 의해 검출할 수 없었다. 상기 조합된 결과는 rdsRN 암호화된 RNA가 포유동물 세포에서 단백질로 번역된 단백질의 형광의 직접적인 관찰 및 면역 검출에 의한 증거를 제공한다. 최종적으로, 이 시점에서 살아있는 시겔라가 전혀 회수되지 않거나 또는 단지 소수 회수될 수 있고, 노출된 RNA는 유한 반감기를 가지며, 오직 (+) 가닥 또는 mRNA만이 암호화된 단백질로 번역될 수 있으므로, 번역된 메시지의 출처는 HeLa 세포 내부의 패키징/전달 균주의 용해 후 rdsRN에 의해 생산된 mRNA임이 명백한 것으로 보인다.
실시예 6. 재조합 구획-S 및 재조합 구획- S2 의 예시적인 서열
도 4를 참고로, 하기는 재조합 구획-S(rS)의 제작을 위해 본 발명의 실시에 사용된 예시적인 서열들이다.
PstI:
ctgcag
박테리오파지 파이-8 구획-S pac 및 유전자-8의 리보솜 결합 부위 187(구획-S의 염기 1-187, GenBank 수탁 번호 AF226853):
Figure 112007046820540-PCT00001
Figure 112007046820540-PCT00002
(서열식별번호: 1) → asd 유전자에 연결
이 콜라이 asd(GenBank 수탁 번호 V00262의 염기 240-1343):
Figure 112007046820540-PCT00003
Figure 112007046820540-PCT00004
(서열식별번호: 2) → IRES에 연결
C형 간염 바이러스-IRES(GenBank 수탁 번호 AJ242651의 염기 36-341):
Figure 112007046820540-PCT00005
Figure 112007046820540-PCT00006
(서열식별번호: 3) → 복합 클로닝 부위에 연결
복합 클로닝 부위 및 종결 코돈:
Figure 112007046820540-PCT00007
(서열식별번호: 4) → 번역되지 않은 SFV-3'에 연결
셈리키 포레스트 바이러스-3-프라임 번역되지 않은 부분(GenBank 수탁 번호 V01398의 염기 1-262):
Figure 112007046820540-PCT00008
Figure 112007046820540-PCT00009
(서열식별번호: 5) → φ8 구획-S 3' RNA pol 결합 부위에 연결
파이-8 구획-S 3-프라임 폴리머라제 결합 부위(GenBank 수탁 번호 AF226853의 염기 3081-3192):
Figure 112007046820540-PCT00010
Figure 112007046820540-PCT00011
(서열식별번호: 6)
PstI:
ctgcag
도 4를 참고로, 하기는 야생형 파지 파이-8의 유전자 8을 암호화하는 재조합 구획-S2(rS2)의 제작을 위해 본 발명의 실시에 사용된 예시적인 서열들이다.
PstI:
ctgcag
박테리오파지 파이-8 구획-S pac(GenBank 수탁 번호 AF226853의 bp 1-187):
Figure 112007046820540-PCT00012
(서열식별번호: 1)
구획-S의 박테리오파지 파이-8 유전자 8(GenBank 수탁 번호 AF226853의 bp 188-1291):
Figure 112007046820540-PCT00013
Figure 112007046820540-PCT00014
(서열식별번호: 7)
BglII
agatct
→ IRES에 연결
C형 간염 바이러스-IRES(GenBank 수탁 번호 AJ242651의 염기 36-341):
Figure 112007046820540-PCT00015
Figure 112007046820540-PCT00016
(서열식별번호: 3) → 복합 클로닝 부위에 연결
복합 클로닝 부위 및 종결 코돈:
Figure 112007046820540-PCT00017
(서열식별번호: 4) → 번역되지 않은 SFV-3'에 연결
셈리키 포레스트 바이러스-3-프라임 번역되지 않은 부분(GenBank 수탁 번호 V01398의 염기 1-262):
Figure 112007046820540-PCT00018
Figure 112007046820540-PCT00019
(서열식별번호: 5) → φ8 구획-S 3' RNA pol 결합 부위에 연결
파이-8 구획-S 3-프라임 폴리머라제 결합 부위(GenBank 수탁 번호 AF226853의 염기 3081-3192):
Figure 112007046820540-PCT00020
Figure 112007046820540-PCT00021
(서열식별번호: 6)
PstI:
ctgcag
실시예 7. 재조합 구획-M의 예시적인 서열
도 4를 참고로, 하기는 재조합 구획-M의 제작을 위해 본 발명의 실시에 사용된 예시적인 서열들이다.
KpnI:
ggtacc → 구획 M pac에 연결
구획 M pac 서열 및 유전자 10의 리보솜 결합 부위(GenBank 수탁 번호 AF226852의 염기 1-262)
Figure 112007046820540-PCT00022
Figure 112007046820540-PCT00023
(서열식별번호: 8) → BglII에 연결
BglII
agatct → asd 유전자에 연결
이 콜라이 asd(GenBank 수탁 번호 V00262의 염기 240-1343)
Figure 112007046820540-PCT00024
Figure 112007046820540-PCT00025
Figure 112007046820540-PCT00026
(서열식별번호: 9) → AscI에 연결
AscI:
ggcgcgcc → HCV-IRES에 연결
C형 간염 바이러스-IRES(GenBank 수탁 번호 AJ242651의 염기 36-341)
Figure 112007046820540-PCT00027
Figure 112007046820540-PCT00028
(서열식별번호: 10) → 복합 클로닝 부위에 연결
복합 클로닝 부위:
Figure 112007046820540-PCT00029
(서열식별번호: 11) → 번역되지 않은 SFV-3'에 연결
셈리키 포레스트 바이러스-3-프라임 번역되지 않은 부분(GenBank 수탁 번호 V01398의 염기 1-262):
Figure 112007046820540-PCT00030
Figure 112007046820540-PCT00031
(서열식별번호: 12) → 파이-8 3-프라임 폴리머라제 결합 부위에 연결
파이-8 구획 M 3-프라임 폴리머라제 결합 부위(GenBank 수탁 번호 AF226852의 염기 4677-4741):
Figure 112007046820540-PCT00032
(서열식별번호: 13) → PstI에 연결
PstI:
ctgcag
실시예 8. rdsRN 의 추출 및 정제
균주 MPC51 LSMtb4가 뉴클레오캡시드를 생산함을 입증하기 위해서, 단일 클론을 28 ℃에서 암피실린(100 ㎍/㎖), 가나마이신(50 ㎍/㎖) 및 D-글루타메이트(50 ㎍/㎖)이 보충된 M9 배지에서 증식시켰다. 배양물을 OD600<0.1에서 개시시키고 세포를 지수 증식기 동안 OD600 0.6 내지 0.8에서 수확하였다. 세포를 8000 rpm에서 5 분간 원심분리에 의해 수확하였다. 세포를 용해시키기 위해서, 세균을 PBS 5 ㎖에 재 현탁시키고 프렌치 압력 셀(Thermo Electron)에서 20,000 psi에서 용해시켰다. 용해물을 8,000 x g에서 5 분간 원심분리시키고 상등액을 10 mM 인산 칼륨(pH 7.3; Sigma, St. Louis, MO, 목록 번호 P5379) 및 1 mM 염화 마그네슘(Sigma, St. Louis, MO, 목록 번호 M1028)을 함유하는 10 내지 30%(w/v) 슈크로스 구배에 적용시켰다. 상기 구배를 아반티(Avanti) J-30i 원심분리기(Beckman Coulter, Fullerton, CA, 목록 번호 363118)에서 JS24.15 로터에 두었다. 23,000 rpm 및 23 ℃에서 90 분간 원심분리시킨 후에, 상기 뉴클레오캡시드는 예리한 밴드를 형성하였으며 이를 수거하고 -80 ℃에서 별도로 보관하였다. 상기 튜브의 나머지 내용물을 1 ㎖ 분액으로 분획화하고 -80 ℃에서 보관하였다. 상기 분액 중의 rdsRN의 존재를 캡시드-특이 항혈청에 의한 면역블럿팅 및 (+) 및 (-) 가닥 LSMtb4 RNA를 증폭하도록 디자인된 프라이머를 사용하여 RT-PCR에 의해 확인하였다.
개선된 rdsRN 정제 과정을 하기와 같이 디자인하였다. rdsRN LSMtb4를 갖는 에스 플렉스네리 MPC51의 500 ㎖ 배양물을 28 ℃에서 OD600=0.8로 증식시키고 세포를 펠릿화하였다. 상기 rdsRN을 다단계 여과 및 원심분리 공정을 사용하여 정제할 것이다. 상기 세포 펠릿을 먼저 인벤시스(Invensys) APV 미세유동화 기(Lake Wills, WI)를 사용하여 용해시키고 원심분리에 의해 등명화할 것이다. 이어서 등명화된 상등액을 0.45 ㎛의 기공 크기 요소(Millipore #P2HV MPC 05, 또는 등가물)를 갖는 펠리콘 시스템(Millipore Inc., Billerica, MA)을 사용하여 접선 흐름 여과(TFF)에 의해 처리할 것이다. 이어서 자유 핵산을 벤조나제로 절단할 것이다(25 ℃에서 30 분간).
이어서 두 번째 여과 단계를 사용하여 rdsRN을 농축시키고 배지 성분, 절단된 핵산, 및 뉴클레아제를 세척할 것이다. 100 kDa 나선 감김 한외여과 모듈(Millipore #CDUF 006 LH, 또는 등가물)을 사용하는 접선 흐름 여과를 사용하여 생성물을 농축시키고 완충제를 인산염 완충 염수 또는 다른 고객 선택된 명시 완충제로 교환할 것이다. 접선 흐름 여과에 이어서, 부분 정제된 rdsRN의 절반을 NaCl 및 PEG의 첨가에 의해 침전시키고, 이어서 소량의 포스페이트 완충제(Hoogstraten et al., Virology, 272:218-224, 2000)에 재현탁시킬 것이다. 이어서 2 회의 작은 분석 규모 구배 정제를 상기 PEG 침전 및 재현탁된 물질의 일부(10 내지 25%)를 사용하여 실행할 것이다. 재현탁된 rdsRN을 예비제조한 슈크로스 및 옵티-프레프 구배 상에 층상화하고 밤새 원심분리시킬 것이다. rdsRN 밴드(면역 블럿 및 RT-PCR 분석에 의해 확인됨)를 수거하고 상기 구배 물질을 계약 실험실에 의해 명시된 완충제에 대한 투석에 의해 제거하였다. 이어서 정제된 물질(구배 전 및 후 모두)을 Q-이온 교환 크로마토그래피 및/또는 액티클린 이톡스(Acticlean Etox)TM(Sterogene, Carlsbad, CA)를 사용하여 처리하여 잔류 내독소 를 제거할 것이다(필요한 경우).
분액들을 각 정제 공정의 단계에서 취하고 면역 블럿 및 RT-PCR에 의해 분석할 것이다.
실시예 9. 마우스에서 rdsRN 의 면역원성
본 발명이 박테리오파지의 RNA-의존성 RNA 폴리머라제를 기본으로 하는 경우, 본 발명은 파이-8 폴리머라제가 진핵세포에서 작용성인지의 여부를 측정하는 것에 관한 것이다. rS 및 rM 상에서 암호화된 마이코박테리아 항원 패키지 TBS에 대한 항체 반응을 유도하는 정제된 뉴클레오캡시드의 능력을 6 내지 8 주된 BALB/c 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME, 목록 번호 000651)를 정제된 뉴클레오캡시드로 백신접종하여 시험할 것이다. 각각이 5 마리의 마우스로 이루어진 5 개 그룹을 하기와 같이 백신접종할 것이다: 10 ㎍ 빈 프로캡시드, 10 ng 뉴클레오캡시드, 100 ng 뉴클레오캡시드, 1 ㎍ 뉴클레오캡시드, 및 10 ㎍ 뉴클레오캡시드. 상기 마우스를 0일째에 최초 백신접종하고, 14일째 및 42일째에 2 회 추가접종을 제공할 것이다. 모든 백신접종은 뉴클레오캡시드를 각 마우스의 뒷다리에 근육 내로 주입할 것이다.
상기 TBS 항원에 대한 체액 반응을 측정하기 위해서, 혈청을 각 백신접종 전 및 접종 후 10일 간격으로 수거할 것이다. 마우스당 약 10 ㎕의 혈액을 각 마우스의 꼬리 정맥으로부터 개별적인 튜브에 수거하고 얼음 상에서 4 시간 배양하여 응고시켰다. 5 분간 원심분리기에서 원심분리시킨 후에, 혈청을 새로운 튜브로 옮기고 -20 ℃에서 보관할 것이다.
고체 상 ELISA를 사용하여 상기 TBS 항원에 대한 IgG 반응을 정량화할 것이다. 정제된 용해성 마이코박테리아 항원을 PBS에 2 ㎍/㎖의 농도로 현탁하고 이를 사용하여 96-웰 미세적정 ELISA 플레이트를 코팅한다. 상기 플레이트를 4 ℃에서 밤새 배양한 다음 0.05%(v/v) TBS-트윈 용액으로 4 회 세척한다. 이어서 상기 플레이트를 실온에서 1 시간 동안 블롯토(PBS 중의 5%(w/v) 무 지방 분유)로 차단한다. 이어서 플레이트를 TBS-트윈 용액으로 상기와 같이 세척한다. 혈청을 블롯토로 희석하고 1:30에서 시작하여 3 배 연속 희석물을 상기 플레이트에 중복하여 가하여 웰당 부피를 100 ㎕로 한다. 면역 전 혈청을 음성 대조군으로서 각각의 ELISA에 포함시킨다. 플레이트를 실온에서 2 시간 동안 배양한 다음 TBS-트윈 용액으로 4 회 세척한다. 검출을 위해, 2 차 항체는 알칼리성 포스파타제 표지된 친화성 정제된 염소 항-마우스 IgG(중쇄 특이성)(Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, NY, 목록 번호 SBA103004)이다. 상기 2 차 항체를 TBS, 2%(w/v) 무지방 분유, 및 5%(v/v) 양 혈청으로 1:2000 희석하고, 이중 100 ㎕를 각 웰에 가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. 기질 100 ㎕에서 연속적인 15 분 배양에 이은 인비트로젠의 ELISA 증폭 시스템(목록 번호 19589-019)의 100 ㎕ 증폭기에 의해 색상을 전개시킨다. 흡광도를 490 ㎚에서 스펙트라맥스(SpectraMax) 미세플레이트 분광광도계(Molecular Devices, Sunnyvale, CA)를 사용하여 측정한다. 끝점 역가를 음성 대조군 열 + 3 개의 표준 오차 값의 평균보다 큰 490 ㎚에서의 흡광도 증가를 생성시킨 최종 혈청 희석의 역수를 취하여 계산한다.
세포 면역성을 세포 내 사이토킨 염색(또한 세포 내 사이토킨 세포측정이라 칭함) 또는 ELISPOT(Letsch A. et al., Methods 31:143-49; 2003)에 의해 측정할 수 있다. 상기 두 방법 모두 항원 특이적 면역 반응의 정량화를 허용하지만, ICS는 또한 항원 특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포를 표현형에 의해 특성화하는 능력이 동시에 부가된다. 상기와 같은 분석은 IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IFN-γ를 분비하는 항원 특이적 T세포의 수를 평가할 수 있다(Wu et al., AIDS Res. Hum. Retrovir. 13:1187; 1997). ELISPOT 분석을 개시되고(Wu et al., Infect. Immun. 63:4933; 1995) 앞서 사용된 바와 같이(Xu-Amano et al., J. Exp. Med. 178:1309; 1993) 상업적으로 입수할 수 있는 포착 및 검출 mAb(R&D Systems and Pharmingen)를 사용하여 수행한다(Okahashi et al., Infect. Immun. 64:1516; 1996). 각각의 분석은 마이토젠(Con A) 및 오브알부민 대조군을 포함한다.
실시예 10: 구획-L 발현
상기 실시예 3 및 4에 개시된 바와 같이, 구획-wL을 염색체 외 복제 플라스미드로서 세균 패키징 균주 내에 도입시킨다. 명백히, 보다 안정한 wtL의 발현 방법은 세균 염색체 내로의 통합에 의한 것이다. pac 서열이 결여된 wtL의 불활성화된 사본을 상기 염색체에 통합시켜 프로캡시드 생산 균주를 생성시킬 수 있으며, 이 경우 완전한 길이의 야생형 또는 재조합 구획-L RNA를 후속적으로 rM 및 rS RNA와 함께 통합물로 일렉트로포레이션시켜 3 개의 모든 구획들의 패키징을 완성해야 한다. 한편으로, 완전한 길이의 wtL을 염색체에 통합시킴으로써 후속적으로 wtL RNA를 일렉트로포레이션에 의해 도입시킬 필요성을 제거한다.
염색체 통합은 온도 감수성 플라스미드(본 발명에서 "TS"라 칭함)를 사용하여 동종 재조합에 의해 성취될 수 있으며, 상기 플라스미드는 비 허용 온도(42 ℃ 이상)가 아닌, 오직 허용 온도(30 ℃)에서만 복제할 수 있다(Kretschmer et al., J. Bacteriol. 124:225; 1975); (Hashimoto and Sekiguchi, J. Bacteriol. 127:1561;1976). TS 플라스미드의 예로는 pMAK705, pTSA29, pTSC29, pTSK29가 있으며, 이들은 모두 pSC101 유도체이다(Hamilton et al., J. Bacteriol. 171:4617; 1989); (Phillips, Plasmid 41:78; 1999).
대립유전자 교환에서 TS 플라스미드의 사용은 다른 곳에 상세히 개시되어 있다(Hashimoto and Sekiguchi, J. Bacteriol. 127:1561; 1976); (Hamilton et al., J. Bacteriol. 171:4617; 1989); (Phillips, Plasmid 41:78; 1999). 간단히, 상기 wtL 서열을 결실시키는 유전자의 서열에 인접하도록 TS 플라스미드 내에 클로닝시킨다. 이어서 상기 클로닝된 유전자를 갖는 플라스미드를 표적 세균 내로 일렉트로포레이션시키고 세포를 42 ℃에서 증식시켜 통합체의 형성을 허용한다, 즉 염색체의 동종 서열과 플라스미드 간에 초기 재조합 사건을 허용한다. 통합체를 상기 세포를 상기 플라스미드 상에서 운반되는 항생체 마커가 보충된 배지 상에서 증식시킴으로써 선별한다. 상기 플라스미드가 42 ℃에서 복제하지 않는 경우, 오직 통합체만이 항생제 내성일 것이다. 통합체는 염색체의 플라스미드 복제 기원을 수반하며, 상기로부터의 복제는 통합체가 후속적으로 항생제의 존재 하에 30 ℃에서 증식될 때 세포에 유해하다. 따라서, 30 ℃에서 두 번째 재조합 사건(분해) 이 일어나 플라스미드를 재생시킨다. 이어서 단일 콜로니를 42 ℃에서 항생제 내성에 대해 시험하며, 따라서 항생제 감수성 콜로니가 더 이상 염색체에 플라스미드 통합되지 않게 한다. 상기 두 번째 재조합에 의해 생성된 플라스미드의 세포를 치유하기 위해서, 상기 세포를 항생제 없이 42 ℃에서 증식시킨다.
더욱 또 다른 접근법에서, 실시예 3에서와 같이 TS 플라스미드를 사용하여 wtL을 발현시킬 수 있으나, 세균을 오직 허용 온도에서 증식시킨다. 상기 wtL을 세균 프로모터, 예를 들어 T7의 조절 하에서 클로닝하며, 상기는 30 ℃에서 발현된다.
일렉트로포레이션에 의한 rM 및 rS RNA의 도입에 이어서, wtL에 의해 암호화된 프로캡시드는 상기 두 RNA를 모두 패키징하고 복제한다. 이어서 세포를 42 ℃에서 항생제 없이 증식시켜 상기 플라스미드의 세포를 치유할 수 있다. 생성된 플라스미드 부재 세포는 계속해서 RNA를 복제할 것이며 항생제 내성의 도입과 같이 플라스미드와 관련된 조절 걱정이 없는 세균 백신 벡터로서 사용될 수 있다.
본 발명을 그의 특정한 실시태양을 참고로 상세히 개시하였지만, 당해 분야의 통상적인 숙련가에게 다양한 변화 및 변경이 상기의 진의 및 범위로부터 이탈됨 없이 상기 중에서 수행될 수 있음은 자명할 것이다.
<110> AERAS GLOBAL TB VACCINE FOUNDATION <120> Bacterial Packaging Strains Useful for Generation and Production of Recombinant Double-Stranded RNA Nucleocapsids <130> 08560016aa <150> US10/999,074 <151> 2004-11-30 <160> 13 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 187 <212> DNA <213> Bacteriophage phi 7-9 <400> 1 gaaattttca aatcttttga ctatttcgct ggcatagctc ttcggagtga agccttccct 60 gaaaggcgcg aaggtcccca ccagctcggg gtgattcgtg acatttcctg ggatctcgga 120 gtcagctttg tctctaggag actgagcgtt cggtctcagg tttaaactga gattgaggat 180 aaagaca 187 <210> 2 <211> 1104 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggtatggtcg gctccgttct catgcaacgc 60 atggttgaag agcgcgactt cgacgccatt cgccctgtct tcttttctac ttctcagctt 120 ggccaggctg cgccgtcttt tggcggaacc actggcacac ttcaggatgc ctttgatctg 180 gaggcgctaa aggccctcga tatcattgtg acctgtcagg gcggcgatta taccaacgaa 240 atctatccaa agcttcgtga aagcggatgg caaggttact ggattgacgc agcatcgtct 300 ctgcgcatga aagatgacgc catcatcatt cttgaccccg tcaatcagga cgtcattacc 360 gacggattaa ataatggcat caggactttt gttggcggta actgtaccgt aagcctgatg 420 ttgatgtcgt tgggtggttt attcgccaat gatcttgttg attgggtgtc cgttgcaacc 480 taccaggccg cttccggcgg tggtgcgcga catatgcgtg agttattaac ccagatgggc 540 catctgtatg gccatgtggc agatgaactc gcgaccccgt cctctgctat tctcgatatc 600 gaacgcaaag tcacaacctt aacccgtagc ggtgagctgc cggtggataa ctttggcgtg 660 ccgctggcgg gtagcctgat tccgtggatc gacaaacagc tcgataacgg tcagagccgc 720 gaagagtgga aagggcaggc ggaaaccaac aagatcctca acacatcttc cgtaattccg 780 gtagatggtt tatgtgtgcg tgtcggggca ttgcgctgcc acagccaggc attcactatt 840 aaattgaaaa aagatgtgtc tattccgacc gtggaagaac tgctggctgc gcacaatccg 900 tgggcgaaag tcgttccgaa cgatcgggaa atcactatgc gtgagctaac cccagctgcc 960 gttaccggca cgctgaccac gccggtaggc cgcctgcgta agctgaatat gggaccagag 1020 ttcctgtcag cctttaccgt gggcgaccag ctgctgtggg gggccgcgga gccgctgcgt 1080 cggatgcttc gtcaactggc gtaa 1104 <210> 3 <211> 309 <212> DNA <213> Hepatitis C virus <400> 3 atcactcccc tgtgaggaac tactgtcttc acgcagaaag 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780 gaacgggttg ctgggccgac gcagggtgat gtccccgtgc tcacacctcc gccaggtcga 840 ttcaccttca ccggtgaggg cgaccatcgt cccgatttcg cacaactcgc tcgccagaac 900 gacactgatg gcgttgtgcg gatcattgaa ctggatcgca ttccagatgc aaggaaaata 960 ttagtcgatg gtgaccatga ctacttgctg gacgccgctc aacagcgcgt cgctgccgat 1020 atcggggtat cgcccgagtc agtaggtcga ttcgctgctc tggtagccag tatcatcaac 1080 gcgaaggaga agcgttcgtg atgc 1104 <210> 8 <211> 262 <212> DNA <213> Bacteriophage phi 7-9 <400> 8 gaaattttca aagtctttcg gcaataaggg tggaaatttc aaagagggtc gagccgacga 60 acctctgtag aaccgggaag tgcctgtctt tacttgcgag agcaattgaa ctagggcagc 120 accgggggtc gataagcgca gaagtgaggc gcggggattg aagcaaatca cctaagcgta 180 aacgacggac ctcgagggtg gcggagtcta cataggatcc cctagctact agacagaaac 240 cattcctaac aaggagatgc ac 262 <210> 9 <211> 1104 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 atgaaaaatg ttggttttat cggctggcgc ggtatggtcg gctccgttct catgcaacgc 60 atggttgaag agcgcgactt cgacgccatt cgccctgtct tcttttctac ttctcagctt 120 ggccaggctg cgccgtcttt tggcggaacc 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13 <211> 65 <212> DNA <213> Bacteriophage phi 7-9 <400> 13 actgttgata aacaggaccc ggaagggtaa cccgagaggg ggagtgaggc ttcggcctcc 60 acttc 65

Claims (83)

  1. 유전자 또는 RNA를 패키징, 생산 및/또는 전달하기 위한 세균 균주로,
    a) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA;
    b) 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열;
    c) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 하나 이상의 뉴클레오캡시드; 및
    d) 상기 하나 이상의 뉴클레오캡시드 내에 함유된 dsRNA 서열
    을 포함하고, 상기 dsRNA 서열이 적어도:
    i) 상기 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물, 및
    ii) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA
    를 암호화하는 세균 균주.
  2. 제 1 항에 있어서, 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열이 하나 이상의 뉴클레오캡시드 내에 존재하는 세균 균주.
  3. 제 1 항에 있어서, 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열이 게놈 DNA 내에 존재하는 세균 세포.
  4. 제 1 항에 있어서, 플라스미드를 또한 포함하고, 뉴클레오캡시드 생산에 필 요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열이 상기 플라스미드의 일부인 세균 세포.
  5. 제 1 항에 있어서, 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열이 RNA 파지 또는 그의 작용성 돌연변이체의 구획(segment)-L을 포함하는 균주.
  6. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 뉴클레오캡시드 내에 함유된 dsRNA 서열이 RNA의 구획-S 또는 RNA 파지 또는 바이러스의 구획-M의 적어도 일부, 또는 이들 모두를 포함하는 세균 균주.
  7. 제 6 항에 있어서, 구획-S의 일부가 구획-S pac 서열인 세균 균주.
  8. 제 6 항에 있어서,
    구획-S의 일부가 구획-S RNA 의존성 폴리머라제 인식 서열인 세균 균주.
  9. 제 6 항에 있어서, 구획-M의 일부가 구획-M pac 서열인 세균 균주.
  10. 제 6 항에 있어서, 구획-M의 일부가 구획-M RNA 의존성 폴리머라제 인식 서열인 세균 균주.
  11. 제 1 항에 있어서, 선택성 표현형 돌연변이가 영양요구성 돌연변이인 세균 균주.
  12. 제 11 항에 있어서, 영양요구성 돌연변이가 aroA, aroC, leuD, asd 및 murI로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 세균 균주.
  13. 제 1 항에 있어서, 선택성 표현형 돌연변이가 세포벽 합성 돌연변이인 세균 균주.
  14. 제 13 항에 있어서, 세포벽 합성 돌연변이가 asd 및 murI로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 세균 균주.
  15. 제 1 항에 있어서, 선택성 표현형 돌연변이가 32 ℃ 초과의 온도에서 생육을 방지하는 돌연변이인 세균 균주.
  16. 제 15 항에 있어서, 32 ℃ 초과의 온도에서 생육을 방지하는 선택성 표현형 돌연변이가 htrB인 세균 균주.
  17. 제 1 항에 있어서, RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성 및 파지 또는 바이러스 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 단백질이 파이-6, 파이-7, 파이-8, 파이-9, 파이-10, 파이-11, 파이-12 및 파이-13으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 파지로부터 유래되는 세균 균주.
  18. 제 1 항에 있어서, 캄필로박터(Campylobacter), 나이세리아(Neisseria), 하에모필루스(Haemophilus), 아에로모나스(Aeromonas), 프란시셀라(Francisella), 예르시니아(Yersinia), 클렙시엘라(Klebsiella), 보르데텔라(Bordetella), 레지오넬라(Legionella), 코리네박테리움(Corynebacterium), 클라미디아(Chlamydia), 브루셀라(Brucella), 슈도모나스(Pseudomonas), 헬리코박터(Helicobacter), 시트로박터(Citrobacter), 비브리오(Vibrio), 에스케리키아(Escherichia), 시겔라(Shigella), 살모넬라(Salmonella), 리스테리아(Listeria) 및 마이코박테리움(Mycobacterium)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 세균 종으로부터 유래하는 세균 균주.
  19. 제 1 항에 있어서, 관심 RNA가 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 항원, 이식편 항원, 자가면역 항원, 항원보강제 및 사이토킨으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단백질을 암호화하는 세균 균주.
  20. a) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질, 및
    b) 적어도
    i) 유전자 산물 및
    ii) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA
    를 암호화하는 dsRNA 서열
    을 포함하는 재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드(rdsRN).
  21. 제 20 항에 있어서, 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 또한 포함하는 rdsRN.
  22. 제 21 항에 있어서, 핵산 서열이 RNA 파지 또는 그의 작용성 돌연변이체의 구획-L을 포함하는 rdsRN.
  23. 제 20 항에 있어서, dsRNA 서열이 RNA 파지의 구획-S 또는 RNA 파지의 구획-M의 적어도 일부, 또는 이들 모두를 포함하는 rdsRN.
  24. 제 23 항에 있어서, 구획-S의 일부가 구획-S pac 서열, 유전자 8 또는 야생형 구획-S인 rdsRN.
  25. 제 23 항에 있어서, 구획-S의 일부가 구획-S RNA 의존성 폴리머라제 인식 서열인 rdsRN.
  26. 제 23 항에 있어서, 구획-M의 일부가 구획-M pac 서열인 rdsRN.
  27. 제 23 항에 있어서, 구획-M의 일부가 구획-M RNA 의존성 폴리머라제 인식 서열인 rdsRN.
  28. 제 20 항에 있어서, 유전자 산물이 숙주 세포에서 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 rdsRN.
  29. 제 28 항에 있어서, 표현형 돌연변이가 aroA, aroC, 및 leuD로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 rdsRN.
  30. 제 20 항에 있어서, 관심 유전자가 세포벽 합성 돌연변이를 암호화하는 rdsRN.
  31. 제 30 항에 있어서, 세포벽 합성 돌연변이가 asd 및 murI로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 rdsRN.
  32. 제 20 항에 있어서, 관심 유전자가 32 ℃ 초과의 온도에서 생육을 방지하는 돌연변이인 rdsRN.
  33. 제 32 항에 있어서, 관심 유전자가 htrB인 rdsRN.
  34. 제 20 항에 있어서, RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질이 파이-6, 파이-8 및 파이-13으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 파지로부터 유래되는 rdsRN.
  35. 제 20 항에 있어서, 관심 RNA가 바이러스 항원, 세균 항원, 기생충 항원, 종양 항원, 이식편 항원, 자가면역 항원, 항원보강제 및 사이토킨으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단백질을 암호화하는 rdsRN.
  36. 제 20 항에 있어서, dsRNA 서열 중 하나 이상이 플루오르화된 rdsRN.
  37. a) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA;
    b) 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열;
    c) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 하나 이상의 뉴클레오캡시드; 및
    d) 상기 뉴클레오캡시드 내에 함유된 dsRNA 서열
    을 포함하고, 상기 RNA 서열이 적어도:
    i) 유전자 산물, 및
    ii) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 RNA
    를 암호화하는
    세균 세포를 포함하는 백신 제제.
  38. 제 37 항에 있어서, dsRNA 서열 중 하나 이상이 플루오르화된 백신 제제.
  39. a) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질;
    b) 적어도
    i) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물, 및
    ii) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 면역원을 암호화하는 RNA; 및
    iii) 파지 또는 바이러스 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열
    을 암호화하는 dsRNA
    를 포함하는, 재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드(rdsRN)
    를 포함하는 백신 제제.
  40. 세균 패키징 균주로서 사용하기 위한 재조합 세균의 생산 방법으로,
    하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 세균의 게놈 DNA 내로 도입시키는 단계;
    상기 세균을 작용성 이중 가닥 RNA 파지 뉴클레오캡시드 단백질을 암호화하는 DNA를 함유하도록 유전자 가공하는 단계; 및
    상기 세균 내로
    i. 상기 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 작용성 산물을 암호화하는 하나 이상의 유전자; 및
    ii. 작용성 이중 가닥 RNA 파지 뉴클레오캡시드 단백질
    을 암호화하는 mRNA 구획을 삽입하는 단계
    를 포함하는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, mRNA 구획이 관심 유전자를 또한 암호화하는 방법.
  42. dsRP 프로캡시드를 발현하는 하나 이상의 DNA 서열 및 돌연변이를 보완하는 작용성 유전자를 발현하는 rdsRN을 선택하고 유지할 수 있게 하는 상기 돌연변이를 갖는 돌연변이 세균.
  43. 제 14 항에 있어서, 세균벽 합성 돌연변이가 asd인 세균 균주.
  44. 제 17 항에 있어서, RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성 및 파지 또는 바이러스 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열을 갖는 단백질이 파지 파이-8로부터 유래되고 파지 파이-8의 유전자 8을 포함하는 세균 균주.
  45. 제 18 항에 있어서, 시겔라로부터 유래되는 세균 균주.
  46. 제 19 항에 있어서, 단백질이 세균 항원인 세균 균주.
  47. 제 46 항에 있어서, 세균 항원이 결핵 항원인 세균 세포.
  48. 제 31 항에 있어서, 세포벽 합성 돌연변이가 asd인 rdsRN.
  49. 제34 항에 있어서, RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질이 파지 파이-8로부터 유래되고 파지 파이-8의 유전자 8을 포함하는 rdsRN.
  50. 제 35 항에 있어서, 단백질이 세균 항원인 rdsRN.
  51. 제 50 항에 있어서, 세균 항원이 결핵 항원인 rdsRN.
  52. 제 1 항에 있어서, 관심 RNA가 세포자멸 증대 단백질을 암호화하는 세균 균주.
  53. 제 52 항에 있어서, 세포자멸 증대 단백질이 카스파제 8, 사망 수용체-5, Fas 및 Fas 세포질 도메인/CD4 외부도메인 융합 단백질로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 세균 균주.
  54. 제 1 항에 있어서, 관심 RNA가 허용성 유도 단백질을 암호화하는 세균 균주.
  55. 제 54 항에 있어서, 허용성 유도 단백질이 카스파제 9인 세균 균주.
  56. 제 20 항에 있어서, 관심 RNA가 세포자멸 증대 단백질을 암호화하는 재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드.
  57. 제 20 항에 있어서, 관심 RNA가 허용성 유도 단백질을 암호화하는 재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드.
  58. 제 1 항에 있어서, dsRNA가 뉴클레아제 내성 RNA를 포함하는 세균 균주.
  59. 제 58 항에 있어서, 뉴클레아제 내성 RNA가 플루오르화된 RNA인 세균 균주.
  60. 제 20 항에 있어서, dsRNA가 뉴클레아제 내성 RNA를 포함하는 재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드.
  61. 제 60 항에 있어서, 뉴클레아제 내성 RNA가 플루오르화된 RNA인 재조합 이중 가닥 RNA 뉴클레오캡시드.
  62. rdsRN을 패키징, 진수(launching) 및 생산하기 위한 세균 균주로,
    a) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA;
    b) 프로캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열; 및
    c) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 하나 이상의 프로캡시드
    를 포함하는 세균 균주.
  63. rdsRN을 진수시키기 위한 플루오르화된 RNA 서열로, 적어도
    i) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물, 및
    ii) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA
    를 암호화하는 서열.
  64. 적어도
    i) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물;
    ii) 뉴클레오캡시드 산물의 안정화를 위한 유전자-8(서열식별번호: 7); 및
    ii) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA
    를 암호화하는 플루오르화된 RNA 서열.
  65. 적어도
    i) 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자
    ii) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물;
    iii) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA
    를 암호화하는 플루오르화된 RNA 서열.
  66. 적어도
    i) 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자
    ii) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물;
    iii) 뉴클레오캡시드 생산의 안정화를 위한 유전자-8(서열식별번호: 7); 및
    iv) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA
    를 암호화하는 플루오르화된 RNA 서열.
  67. i) a) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA;
    b) 프로캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열; 및
    c) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 하나 이상의 프로캡시드
    를 포함하는, rdsRN을 패키징, 진수 및 생산하기 위한 세균 균주; 및
    ii) 적어도
    a) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물, 및
    b) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA
    를 암호화하는 플루오르화된 RNA 서열
    을 포함하는 일렉트로포레이션 배지.
  68. i) a) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA;
    b) 프로캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열; 및
    c) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 하나 이상의 프로캡시드
    를 포함하는, rdsRN을 패키징, 진수 및 생산하기 위한 세균 균주; 및
    ii) 적어도
    a) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물;
    b) 뉴클레오캡시드 생산의 안정화를 위한 유전자-8(서열식별번호: 7); 및
    c) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA
    를 암호화하는 플루오르화된 RNA 서열
    을 포함하는 일렉트로포레이션 배지.
  69. i) a) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 포함하는 게놈 DNA;
    b) 프로캡시드 생산에 필요한 유전자를 암호화하는 핵산 서열; 및
    c) RNA 패키징 및 RNA 폴리머라제 활성을 갖는 단백질을 포함하는 하나 이상의 프로캡시드
    를 포함하는, rdsRN을 패키징, 진수 및 생산하기 위한 세균 균주; 및
    ii) 적어도
    a) 뉴클레오캡시드 생산에 필요한 유전자;
    b) 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이를 보완하는 유전자 산물;
    c) 뉴클레오캡시드 생산의 안정화를 위한 유전자-8(서열식별번호: 7); 및
    d) 진핵세포 번역 개시 서열에 작용적으로 결합된 관심 RNA
    를 암호화하는 플루오르화된 RNA 서열
    을 포함하는 일렉트로포레이션 배지.
  70. 제 1 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 세균 균주.
  71. 제 28 항에 있어서, 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 rdsRN.
  72. 제 37 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 백신 제제.
  73. 제 39 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 백신.
  74. 제 40 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 방법.
  75. 제 62 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 세균 균주.
  76. 제 63 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 플루오르화된 RNA 서열.
  77. 제 63 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 플루오르화된 RNA 서열.
  78. 제 64 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 플루오르화된 RNA 서열.
  79. 제 65 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 플루오르화된 RNA 서열.
  80. 제 66 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 플루오르화된 RNA 서열.
  81. 제 67 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 일렉트로포레이션 배지.
  82. 제 68 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 일렉트로포레이션 배지.
  83. 제 69 항에 있어서, 하나 이상의 선택성 표현형 돌연변이가 비 복귀성 선택성 표현형 돌연변이인 일렉트로포레이션 배지.
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