KR20090025902A - 1,4-부탄디올 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한1,4-부탄디올의 제조방법 - Google Patents

1,4-부탄디올 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한1,4-부탄디올의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 1,4-부탄디올(1,4-butanediol) 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한 1,４-부탄디올의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 미생물 변이체는 숙신산 생성능을 가지는 미생물에서 숙신산(succinate)을 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate)로 전환하는 효소의 유전자와 4-하이드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 효소의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하며, 본 발명의 제조방법은 이러한 변이체를 탄수화물을 포함하는 배지에서 배양한 다음, 상기 배양액으로부터 1,4-부탄디올을 수득하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에 따르면 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 사용되고 있는 1,4-부탄디올을 생물학적 공정을 이용하여 제조하는 것이 가능하다.
4-하이드록시부티레이트, 1,4-부탄디올, 숙신산, 변이체

Description

1,4-부탄디올 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 제조방법{Mutants having a producing ability of 1,4-butanediol and method for preparing 1,4-butanediol using the same}
본 발명은 글루코스 등으로부터 1,4-부탄디올을 생성할 수 있는 미생물 변이체 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 제조방법에 관한 것이다.
생분해성 고분자 물질은 심각한 공해문제의 한 축을 이루는 합성고분자 소재를 대체할 수 있는 대안으로 제시되고 있으며, 이에 따라 다양한 생분해성 고분자 물질이 개발되고 있다. 그 중 하나인, 폴리-베타-하이드록시부탄산(poly-β-hydroxybutyrate)은 영양불균형 상태에서 다양한 미생물들이 축적하는 생분해성 고분자 물질로서 생분해성, 내습성, 압전성 그리고 생체적합성 등 우수한 특성을 갖고 있다. 그 중, 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate)는 폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 대표적인 예로, 폴리에스테르와 유사한 특성을 지니고 있어, 결정질의 플라스틱으로부터 고탄성의 고무에 이르기까지 폭넓은 물성을 나타내므로, 미생물 분해성 플라스틱으로서 많은 연구가 진행 중이다.
또한, 4-하이드록시부티레이트는 1,4-부탄디올(1,4-butanediol), 감마뷰티로 락톤(gammabutyrolactone, GBL), THF 등의 다양한 탄소수 4개의 화학물질로 쉽게 전환될 수 있다. 특히, 상기 1,4-부탄디올은 다양한 화학물질은 고분자, 솔벤트, 정밀화학 중간물질 등으로 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 쓰이고 있다. 현재 대부분의 탄소수 4개 화학물질은 1,4-부탄디올, 말레익 안하이드라이드 등으로부터 유래되어 합성되고 있지만, 유가가 올라감에 따라 생산비용이 증대되고 있어 화학생산공정을 보완 및 대체하는 공정의 개발이 요구되고 있는 실정이다. 이에, 상기 화학생산공정의 대안으로 생물학적 공정이 제시되고 있다.
한편, 숙신산은 탄소수 4개의 디카복실릭 산으로서 미생물이 혐기조건에서 배양될 때 생산되는 유기산의 일종이다. 현재 다양한 미생물이 숙신산 생산균주로서 이용되고 있으며, 효율적인 발효공정 및 분리정제공정의 개발에 따라 생산가격이 낮아지고 있는 추세이다. 또한, 숙신산으로부터 4-하이드록시부티레이트가 생성될 수 있으며, 일단 생성된 4-하이드록시부티레이트는 다양한 탄소수 4개의 유기산으로 유도될 수 있다.
숙신산의 생산 효율을 높이기 위한 방법과 관련된 대표적인 특허 출원으로는 국제특허 출원 공개번호 WO 2005/052135이 있고, 상기 특허 출원에서는 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생산하는 루멘 박테리아 변이균주 및 이를 이용한 숙신산의 제조방법에 대하여 개시하고 있다. 또한, 대한민국 특허출원 출원번호 제10-2004-60149호에서는, 숙신산을 고농도로 생산할 수 있는 대장균 변이체의 제조방법이 개시되어 있고, 대한민국 특허출원 제10-2005-0076301호, 제10-2005-0076317호 및 제10-2005-0076348호에서는 신규 유전자를 이용한 숙신산 의 제조방법에 대하여 개시되어 있다.
이에, 당업계에서는 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 사용되고 있는 탄소수 4개의 화학물질인 1,4-부탄디올 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 생물학적 제조방법이 절실하게 요구되고 있는 실정이다.
따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 글루코스 등의 탄수화물로부터 1,4-부탄디올을 높은 효율로 생성할 수 있는 미생물 변이체 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기 기술적 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 숙신산 생성능을 가지는 미생물, 바람직하게는 숙신산 고생성능을 가지는 미생물에서 숙신산(succinate)을 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate)로 전환하는 효소의 유전자와 4-하이드록시부티레이트를 1,4-부탄디올(1,4-butanediol)로 전환하는 효소의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 1,4-부탄디올 고생성능을 가지는 변이체 및 이러한 변이체를 이용한 1,4-부탄디올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 4-하이드록시부틸-CoA로부터 1,4-부탄디올을 생성하는데 효율적인 서열번호 8 또는 서열번호 9의 부틸-CoA 디하이드로게나제 유전자 및 이를 포함하는 재조합벡터를 제공한다.
이하 본 발명에 대해 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 숙신산을 생산할 수 있는 미생물을 이용하여 1,4-부탄디올을 제조하고자 예의 노력한 결과, 클로스트리디움(Clostridium) 균주로부터 유래된 4-하이드록시부티레이트 생합성 관련 유전자 및/또는 1,4-부탄디올 생합성 관련 유전자를 숙신산을 생산할 수 있는 미생물에 도입시켜, 1,4-부탄디올 생성 미생물 변이 체를 수득하고, 상기 미생물 변이체가 1,4-부탄디올을 효율적으로 생산하는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 숙신산 생성능을 가지는 미생물은 특히 숙신산 고생성능을 가지는 미생물이 바람직하며, 이러한 미생물로는 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것이 더욱 바람직하고, 상기 박테리아는 루멘박테리아, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속, 대장균 등이 더욱 더 바람직하다.
상기 루멘박테리아로는 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA)와 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl)가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가진 루멘박테리아가 이용될 수 있다.
또한 상기 루멘박테리아로는 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl), 포스포트랜스아세틸화효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산 키나제를 코딩하는 유전자(ackA)가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가진 루멘박테리아가 이용될 수 있다.
또한 상기 루멘박테리아로는 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl) 및 포스포피루브산 카르복실라제를 코딩하는 유전자(ppc)가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가진 루멘박테리아가 이용 될 수 있다.
상기 루멘박테리아로는 맨하이미아 속(Mannheimia sp .), 액티노바실러스 속(Actinobacillus sp .) 및 언에어로바이오스피리륨 속(Anaerobiospirillum sp .)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하나, 이에 국한되는 것은 아니다. 상기 루멘박테리아 중에서 특히 맨하이미아 속(Mannheimia sp .)이 더욱 바람직하며, 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E(KCTC 0769BP), 맨하이미아 속 LPK(KCTC 10558BP), LPK4 및 LPK7(KCTC 10626BP)이 본 발명의 목적 상 더욱 더 바람직하다.
상기 대장균으로는 포도당 인산전이효소를 코딩하는 유전자(ptsG) 및 피루베이트 키나아제를 코딩하는 유전자(pykA 및 pykF)가 모두 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가진 대장균을 이용하는 것이 바람직하며, 특히 대장균 변이체는 W3110GFA를 이용하는 것이 더욱 바람직하다.
전술한 숙신산 고생성 미생물 중 루멘박테리아는 국제 특허출원 공개번호 WO 2005/052135에 개시된 방법대로 제조할 수 있다. 즉, 루멘 박테리아의 일종인 Mannheimia succiniciproducens 55E에서 젖산 탈수소화효소 유전자(ldhA)와 피루브산-개미산 분해효소 유전자(pfl)를 결실시켜 변이균주인 Mannheimia sp. LPK(KCTC 10558BP)를 제작하고, 상기 LPK 균주에서 포스포트랜스아세틸화효소 유전자(pta)와 아세트산 키나제 유전자(ackA) 및 포스포피루브산 카르복실라제 유전자(ppc)를 각각 결실시켜 변이균주들(Mannheimia sp. LPK7 및 LPK4)을 제작한 다음, 이를 혐기적 조건에서 배양하면 숙신산이 고수율로 생산되는 것을 확인할 수 있다.
또한, 본 발명의 숙신산 고생성 미생물 중, 대장균은 한국특허 공개번호 10-2006-0011345에 개시된 방법대로 제조할 수 있다. 즉, 박테리오파아지 레드오페론(red operon, exo-beta-gam)을 발현하는 재조합 발현벡터 pTrcEBG로 형질전환된 W3110 균주에서 포도당 인산전이효소(glucose phophotransferase)를 코딩하는　유전자(ptsG)와 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 코딩하는 두 개의 유전자(pykA, pykF)를 결실시켜, 대장균 변이균주 W3110GFA를 수득하여, 이를 혐기적 조건에서 배양하면 모균주인 W3110 균주를 사용하는 경우보다 W3110GFA를 사용하는 경우 생산성이 크게 향상되는 것을 확인할 수 있다.
상기 숙신산을 4-하이드록시부티레이트로 전환하는 효소의 유전자와 상기 숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자는 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri) 유래인 것이 바람직하며, 상기 4-하이드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 효소의 유전자는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 유래인 것이 바람직하다. 물론 클로스트리디움 클루이베리 및 클로스트리디움 아세토부틸리쿰이 4-하이드록시부티레이트 및 1,4-부탄디올을 생산하는 것은 아니지만 상기 균주에서 클로닝된 효소들이 4-하이드록시부티레이트 및 1,4-부탄디올 생산에 중요한 역할을 한다.
또한 상기 숙신산을 4-하이드록시부티레이트로 전환하는 효소의 유전자는 Cat1(succinyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, SucD(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 4-hbD(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코 딩하는 유전자 및 GHB(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는, 상기 Cat1를 코딩하는 유전자는 서열번호 1, SucD를 코딩하는 유전자는 서열번호 2, 4hbD를 코딩하는 유전자는 서열번호 3 및 GHB를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 가진다.
예를 들어, 본 발명에 따른 미생물 변이체는 Cat1를 코딩하는 유전자; SucD를 코딩하는 유전자; 및 4hbD를 코딩하는 유전자를 갖거나, 또는 Cat1를 코딩하는 유전자; SucD를 코딩하는 유전자; 및 GHB를 코딩하는 유전자를 갖을 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 숙신산을 효율적으로 이용하는 것이 매우 중요한 데 이것을 충족하기 위해, 숙신산 고생성 미생물 중 재조합 대장균을 이용할 때 석시닉 세미알데하이드를 석시네이트로 전환하는데 관여하는 gabD(succinic semialdehyde dehydrogenase)가 소실시키는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명에 따른 미생물 변이체는 또한 숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자가 결실되어 있는 것이 바람직하며, 상기 유전자는 GabD(succinic semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자인 것이 더욱 바람직하다. 이러한 GabD를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 염기서열을 가지나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 미생물 체내로 빠져나온 숙신산의 효율적인 체내전달을 위해 숙신산의 전달(transport)에 관여하는 DctA 효소를 증폭시키는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명에 따른 미생물 변이체는 또한 숙신산의 운송에 관여하는 DctA(C4- dicarboxylate transport protein)를 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것이 바람직하며, 이러한 DctA를 코딩하는 유전자는 서열번호 11의 염기서열을 가지는 것이 더욱 바람직하다.
상기 4-하이드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 효소의 유전자는 4-하이드록시부티레이트-CoA 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자와 4-하이드록시부티레이트-CoA를 환원하는 알코올 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자; 또는 포스포트랜스부틸라아제를 코팅하는 유전자, 부티릴 카이네이즈를 코팅하는 유전자와 4-하이드록시부티레이트-CoA를 환원하는 알코올 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자인 것이 바람직하다.
상기 4-하이드록시부티레이트-CoA 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 것이 바람직하며, 이 대신에 포스포트랜스부틸라아제(ptb)(서열번호 6)와 부티릴 카이네이즈(BuK)(서열번호 7)을 이용하여 4-하이드록시부티레이트를 4-하이드록시부티레이트-CoA로 전환할 수 있다.
또한 상기 알코올 디하이드로게나제는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 유래 부틸-CoA 디하이드로게나제인 것이 바람직하며, 상기 부틸-CoA 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 8(CAP0035) 또는 서열번호 9(CAP0162)의 염기서열을 가지는 것이 더욱 더 바람직하다. 본 발명에 따른 서열번호 8 및 서열번호 9의 유전자들은 본 발명에 따른 미생물 변이체에서 1,4-부탄디올을 생성하는데 매우 유용하며, 따라서 본 발명은 부틸-CoA 디하이드로게나제를 코딩하는 이러한 유전자 자체뿐만 아니라 이러한 유전자를 함유하는 재조 합벡터를 제공한다.
용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 본 발명에서, 상기 벡터로는 플라스미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 코스미드 벡터, YAC(Yeast Artificial Chromosome) 벡터 등이 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상 플라스미드 벡터를 이용하는 것이 바람직하다. 그러한 목적에 사용될 수 있는 전형적인 플라스미드 벡터는 (a) 숙주세포당 수백 개의 플라스미드 벡터를 포함하도록 복제가 효율적으로 이루어지도록 하는 복제 개시점, (b) 플라스미드 벡터로 형질전환된 숙주세포가 선발될 수 있도록 하는 항생제 내성 유전자 및 (c) 외래 DNA 절편이 삽입될 수 있는 제한효소 절단부위를 포함하는 구조를 지니고 있다. 적절한 제한효소 절단부위가 존재하지 않을지라도, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오타이드 어댑터(adaptor) 또는 링커(linker)를 사용하면 벡터와 외래 DNA를 용이하게 라이게이션(ligation)할 수 있다.
따라서 본 발명은 예를 들어 숙신산 생성능을 가지는 미생물, 바람직하게는 숙신산 고생성능을 가지는 미생물에서 GabD를 코딩하는 유전자가 결실되어 있고, Cat1을 코딩하는 유전자, SucD를 코딩하는 유전자, 4hbD(또는 GHB)를 코딩하는 유전자, 4-하이드록시부티레이트-CoA 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 및 부틸-CoA 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 모두 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 1,4-부탄디올 고생성능을 가지는 미생물 변이체를 제공한다.
또한 본 발명은 숙신산 생성능을 가지는 미생물, 바람직하게는 숙신산 고생 성능을 가지는 미생물에서 4-하이드록시부티레이트-CoA 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자(또는 포스포트랜스부틸라아제를 코딩하는 유전자와 부티릴 카이네이즈를 코딩하는 유전자) 및 부틸-CoA 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 1,4-부탄디올 생성능을 가지는 미생물 변이체 및 이러한 미생물 변이체를 이용한 1,4-부탄디올의 제조방법을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 변이체를 탄수화물을 포함하는 배지에서 배양한 다음 상기 배양액으로부터 1,4-부탄디올을 수득하는 것을 특징으로 하는 1,4-부탄디올의 제조방법을 제공한다.
이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 숙신산을 고농도로 생산할 수 있는 미생물을 이용하여 화학산업 전반에 걸쳐 중요하게 사용되고 있는 탄소수 4개의 화학물질인 1,4-부탄디올 생성능을 가지는 변이체 및 이를 이용한 1,4-부탄디올의 생물학적 제조방법을 제공하는 효과가 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
특히, 본 발명의 설명에서는 루멘박테리아 중, Mannheimia 속 균주로부터 유전자를 결실시킨 숙신산 고농도 생성 변이균주 Mannheimia sp . LPK(KCTC 10558BP), LPK7 및 LPK4과 대장균 및 대장균 변이균주 W3110GFA를 이용하여 1,4-부탄디올을 제조하는 방법만을 예시하였으나, 다른 루멘박테리아 균주를 사용하여 숙신산 고생성 변이균주를 수득하고, 이 미생물에 1,4-부탄디올 생성과 관련된 유전자를 도입 또는 증폭하여 1,4-부탄디올을 제조하는 것 역시 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
또한, 하기 실시예에서는 특정 배지와 배양방법만을 예시하였으나, 문헌에 보고된 바와 같이(Lee et al ., Bioprocess Biosyst . Eng ., 26:63, 2003; Lee et al., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 58:663, 2002; Lee et al ., Biotechnol . Lett., 25:111, 2003; Lee et al ., Appl . Microbiol . Biotechnol ., 54:23, 2000; Lee et al ., Biotechnol . Bioeng ., 72:41, 2001), 유청(whey), CSL(corn steep liguor) 등의 당화액과 다른 배지를 사용한 경우나, 유가배양(fed-batch culture), 연속배양 등 다양한 방법을 사용하는 것도 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 숙신산 고생성능을 가지는 미생물의 제조방법
1-1. 숙신산 고생성능을 가지는 루멘박테리아의 제조
본 발명의 숙신산 고생성 미생물인 루멘박테리아는 국제특허 출원 공개번호 WO 2005/052135에 개시된 방법대로 제조하였다. 즉, 루멘 박테리아의 일종인 Mannheimia succiniciproducens 55E에서 젖산 탈수소화효소 유전자(ldhA)와 피루브산-개미산 분해효소 유전자(pfl)를 결실시켜 변이균주인 Mannheimia sp. LPK(KCTC 10558BP)를 제작하였고, 상기 LPK 균주에서 포스포트랜스아세틸화효소 유전자(pta) 와 아세트산 키나제 유전자(ackA) 및 포스포피루브산 카르복실라제 유전자(ppc)를 각각 결실시켜 변이균주들(Mannheimia sp. LPK7 및 LPK4)을 제작하였다.
1-2. 숙신산 고생성능을 가지는 대장균의 제조
본 발명의 숙신산 고생성 미생물인 대장균은 한국특허 출원 공개번호 10-2006-0011345에 개시된 방법대로 제조하였다. 즉, 박테리오파아지 레드오페론(red operon, exo-beta-gam)을 발현하는 재조합 발현벡터 pTrcEBG로 형질전환된 W3110 균주에서 포도당 인산전이효소(glucose phophotransferase)를 코딩하는　유전자(ptsG)와 파이루베이트 키나제(pyruvate kinase)를 코딩하는 두 개의 유전자(pykA, pykF)가 결실시켜, 대장균 변이균주 W3110GFA를 수득하였다.
실시예 2: 1,4- 부탄디올 전환 효소 클로닝
2-1. 4-하이드록시부티레이트 전환 효소(Cat1, SucD 및 4hbD)를 코딩하는 유전자의 클로닝
본 발명자들은 클로스트리디움 클루이베리 DSM 555로부터 Cat1, SucD 및 4hbD을 코딩하는 유전자 오페론을 클로닝하고자 알려진 유전자 시퀀스 (L21902)에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합 효소반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 cat1 , sucD , 4 hbD 유전자를 증폭시켰다. PCR 증폭실험에 사용한 프라이머는 다음과 같다.
서열번호 12: Cat1f-SacI
5'-tttcccgagctc TGTGAGGCGATTAAATGAGTAAAGGGATAAAG
서열번호 13: 4hbDb-XabI
gc tctaga tta gat aaa aaa gag gac att tca caa tat gg
발현 벡터를 만들기 위해 상기 증폭된 cat1 , sucD , 4 hbD 유전자 오페론을 SacI/XbaI 로 절단한 pTacLacI 발현 벡터에 삽입함으로써 pTacLac4HB1를 제조하였다. pTacLacI 벡터는 pTac99A 벡터(Park and Lee, J. Bacteriol. 185, 5391-5397, 2003)를 SspI으로 절단하여 SspI으로 절단한 pTrc99A(Amersham Pharmacia Biotech)에 라이게이션하여 제작하였다. pTacLacI 벡터는 pTrc99A와 시퀀스가 동일하며 벡터의 Multi Cloning sites(MCS)에서 pTrc99A에 존재하였던 NcoI 제한효소 인식부위가 사라진 것을 특징으로 하며 MCS가 EcoRI으로 시작한다.
2-2. 숙신산의 운송에 관여하는 DctA를 코딩하는 유전자의 클로닝
대장균에서 숙신산의 운송에 관여하는 DctA를 코딩하는 유전자의 클로닝을 위하여 대장균 W3110로부터 DctA을 코딩하는 유전자 dctA을 클로닝하고자 알려진 유전자 시퀀스(NC_000913) 에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 DNA 중합 효소반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 dctA 유전자를 증폭시켰다. PCR 증폭실험에 사용한 프라이머는 다음과 같다.
서열번호 14: DctAf-EcoRI
ggaattc ATGAAAACCTCTCTGTTTAAAAGC
서열번호 15: DctAb-XbaI
gc tctaga tta aga gga taa ttc gtg cgt ttt gcc
발현 벡터를 만들기 위해 상기 증폭된 dctA 유전자를 p10499A(Park et al. (2002) FEMS Microbiol. Lett 214: 217-222) 발현 벡터에 EcoRI/XbaI 로 절단해 삽 입함으로써 p10499DctA를 제조하였다.
2-3. 4-하이드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 효소를 코딩하는 유전자의 클로닝
클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum)에서 부티릭 산(butyric acid)을 부탄올로 전환하는 효소인 서열번호 8 및 9의 부틸-CoA 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자를 클로닝하기 위해 알려진 유전자 시퀀스(NC_003030)에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합 효소반응 (polymerase chain reaction, PCR)으로 cap0035, cap0162 유전자를 증폭시켰다. PCR 증폭실험에 사용한 프라이머는 다음과 같다.
서열번호 16: CAP0035f-SacI
tttcccgagctc atgaaagttacaaatcaaaaa
서열번호 17: CAP0035b-XbaI
gc tctaga tta aaa tgc ttt tat ata gat
서열번호 18: CAP0162f-EcoRI
GGA ATT C atgaaagtcacaacagtaaag
서열번호 19: CAP0162b-XbaI
gc tctaga tta agg ttg ttt ttt aaa
발현 벡터를 만들기 위해 상기 증폭된 cap0035 및 cap0162 유전자를 SacI/XbaI, EcoRI/XbaI으로 절단한 pTacLacI 발현 벡터에 각각 삽입함으로써 pTacLacCAP35 및 pTacLacCAP162를 제조하였다.
4-하이드록시부티레이트를 4-하이드록시부티레이트-CoA로 전환하기 위해 서열번호 5에 해당하는 유전자 Cat2를 증폭하기 위해 서열번호 5에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합 효소반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 Cat2 유전자오페론을 증폭시켰다. PCR 증폭실험에 사용한 프라이머는 다음과 같다.
서열번호 20: cat2f-EcoRI
ggaattc ATGGAGTGGGAAGAGATATATAAAGAG
서열번호 21: cat2b-BamHI
cg ggatcc tta aaa tct ctt ttt aaa ttc att cat taa tg
발현 벡터를 만들기 위해 상기 증폭된 cat2 유전자를 EcoRI/BamHI으로 절단한 pTacLacI 발현 벡터에 삽입함으로써 pTacLacCat2를 제조하였다.
4-하이드록시부티레이트를 4-하이드록시부티레이트-CoA로 전환하기 위해 서열번호 6 및 7에 해당하는 유전자 ptb와 buk를 증폭하기 위해 서열번호 6 및 7에 기초하여 합성된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여, DNA 중합 효소반응(polymerase chain reaction, PCR)으로 ptb 및 buk 유전자오페론을 증폭시켰다. PCR 증폭실험에 사용한 프라이머는 다음과 같다.
서열번호 22: ptbf-EcoRI
ggaattc ATGATTAAGAGTTTTAATGAAATTATCATG
서열번호 23: bukb-XbaI
gc tctaga tta ttt gta ttc ctt agc ttt ttc ttc tcc
발현 벡터를 만들기 위해 상기 증폭된 ptb 및 buk 유전자오페론을 EcoRI/XbaI으로 절단한 pTacLacI 발현 벡터에 삽입함으로써 pTacLacPtbBuk를 제조하였다. pTacLacPtbBuk벡터를 SspI으로 절단하여 tac promoter와 ptb 및 buk 유전자, 전사 종결자(transcription terminator)를 포함한 유전자 조각을 얻은 다음, 그 유전자 조각을 EcoRV로 절단한 pBBR1MCS2(Kovach et al ., Gene, 166:175, 1995) 벡터에 삽입하여 pMCS2TacPtbBuk 벡터를 제작하였다.
실시예 3: 1,4- BDO 수득
pTacCAP162와 pMCS2Tacptbbuk 벡터들을 각각 electroporation을 이용해 대장균 XL1-Blue에 동시에 형질전환시키고, 앰피실린 100ug/ml 과 카나마이신 50ug/ml을 함유하는 LB 평판 배지에 도말하여 37℃에서 밤새 배양하였다. 배양된 콜로니를 100ug/ml을 함유하는 LB액체 배지 3ml이 포함된 15ml 튜브(Falcon, USA)에 접종하고, 37℃에서 200rpm으로 밤새 진탕배양하여 종균을 배양하였다. 이렇게 배양된 종균을 다시 100ml 2% 글루코스 및 앰피실린 100ug/ml를 포함하는 LB 액체배지에 접종하고 37℃에서 200rpm으로 진탕배양하여 OD600이 0.7이 되었을 때, IPTG를 최종농도 1mM이 되게 첨가하여 단백질 발현을 유도한 후 밤새 배양하였다.
그 후, 배양액을 원심분리한 후 상등액을 제거하고 MR 배지로 1회 세척을 수행한 후 다시 50ml 2% 글루코스, 및 2% 감마-하이드록시부티로락톤(hydroxybutyrolactone), 1mM IPTG를 함유한 MR 배지로 재현탁을 수행하고 혼합가스(5% H2, 5% CO2, N2 balance)로 약 30분 동안 퍼징을 수행하여 혐기조건을 조성 하였다. 이렇게 조성된 배양액을 약 3일 동안 37℃에서 200rpm으로 밤새 진탕배양하고 원심분리하여 상등액을 수득하였다. 수득한 상등액을 2배로 농축한 후 GC분석 시료로 이용하여 분석을 수행하여 1,4-부탄디올의 생성을 확인하였다. 분석 조건은 아래와 같으며, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
Column : AT-Waw (0.53 mm ID x 15 mL, 1.2 um u.f. capillary)
Gas Flow rate : Column(He) : 4.0 mL/min
Oven temperature : Initial Value & Time : 50℃, 5 min
Program Rate : 10℃/min
Final Value & Time : 250℃, 5 min
Injector temperature : 250℃
Detector temperature : 250℃
Injector Split ratio : 20/1
Injection volume : 1.0uL
도 3에 나타나는 바와 같이, 1,4-부탄디올이 생성되었음을 확인할 수 있었다.
도 1은 숙신산으로부터 4-하이드록시부티레이트를 생산하는 경로를 나타낸 모식도이다.
도 2는 숙신산으로부터 생성된 4-하이드록시부티레이트를 통하여 1,4-부탄디올을 생산하는 경로를 나타낸 모식도이다.
<110> LG CHEM, LTD. <120> Mutants having a producing ability of 1,4-butanediol and method for preparing 1,4-butanediol using the same <130> 2007-0596 (LGC07-094) <160> 23 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1617 <212> DNA <213> Cat1-coding gene <400> 1 atgagtaaag ggataaagaa ttcacaattg aaaaaaaaga atgtaaaggc tagtaatgtg 60 gcagaaaaga ttgaagagaa agttgaaaaa acagataagg ttgttgaaaa ggcagctgag 120 gttactgaaa aacgaattag aaacttgaag cttcaggaaa aagttgtaac agcagatgtg 180 gcagctgata tgatagaaaa cggtatgatt gttgcaatta gcggatttac tccttccggg 240 tatcctaaag aagtacctaa agcattgact aaaaaagtta atgccttaga ggaagaattc 300 aaggtaacac tttatacagg ttcatctaca ggagccgata tagacggaga atgggcaaaa 360 gcaggaataa tagaaagaag aattccatat cagacaaatt ctgatatgag gaaaaaaata 420 aatgatggtt ctattaagta tgctgatatg catttaagcc atatggctca atatattaat 480 tattctgtaa ttcctaaagt agatatagct ataatagagg cagtagctat tacagaagaa 540 ggggatatta ttccttcaac aggaattgga aatacagcta cttttgtgga aaatgcagat 600 aaggtaatag tggaaattaa tgaggctcaa ccgcttgaat 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gctgcaccat ggtgctgaag 540 cccgccagtc agacgccgtt ctctgcgctg gcgctggcgg agctggcgat ccgcgcgggc 600 gttccggctg gggtatttaa cgtggtcacc ggttcggcgg gcgcggtcgg taacgaactg 660 accagtaacc cgctggtgcg caaactgtcg tttaccggtt cgaccgaaat tggccgccag 720 ttaatggaac agtgcgcgaa agacatcaag aaagtgtcgc tggagctggg cggtaacgcg 780 ccgtttatcg tctttgacga tgccgacctc gacaaagccg tggaaggcgc gctggcctcg 840 aaattccgca acgccgggca aacctgcgtc tgcgccaacc gcctgtatgt gcaggacggc 900 gtgtatgacc gttttgccga aaaattgcag caggcagtga gcaaactgca catcggcgac 960 gggctggata acggcgtcac catcgggccg ctgatcgatg aaaaagcggt agcaaaagtg 1020 gaagagcata ttgccgatgc gctggagaaa ggcgcgcgcg tggtttgcgg cggtaaagcg 1080 cacgaacgcg gcggcaactt cttccagccg accattctgg tggacgttcc ggccaacgcc 1140 aaagtgtcga aagaagagac gttcggcccc ctcgccccgc tgttccgctt taaagatgaa 1200 gctgatgtga ttgcgcaagc caatgacacc gagtttggcc ttgccgccta tttctacgcc 1260 cgtgatttaa gccgcgtctt ccgcgtgggc gaagcgctgg agtacggcat cgtcggcatc 1320 aataccggca ttatttccaa tgaagtggcc ccgttcggcg gcatcaaagc ctcgggtctg 1380 ggtcgtgaag gttcgaagta tggcatcgaa gattacttag aaatcaaata tatgtgcatc 1440 ggtctttaa 1449 <210> 11 <211> 1287 <212> DNA <213> DctA-coding gene <400> 11 atgaaaacct ctctgtttaa aagcctttac tttcaggtcc tgacagcgat agccattggt 60 attctccttg gccatttcta tcctgaaata ggcgagcaaa tgaaaccgct tggcgacggc 120 ttcgttaagc tcattaagat gatcatcgct cctgtcatct tttgtaccgt cgtaacgggc 180 attgcgggca tggaaagcat gaaggcggtc ggtcgtaccg gcgcagtcgc actgctttac 240 tttgaaattg tcagtaccat cgcgctgatt attggtctta tcatcgttaa cgtcgtgcag 300 cctggtgccg gaatgaacgt cgatccggca acgcttgatg cgaaagcggt agcggtttac 360 gccgatcagg cgaaagacca gggcattgtc gccttcatta tggatgtcat cccggcgagc 420 gtcattggcg catttgccag cggtaacatt ctgcaggtgc tgctgtttgc cgtactgttt 480 ggttttgcgc tccaccgtct gggcagcaaa ggccaactga tttttaacgt catcgaaagt 540 ttctcgcagg tcatcttcgg catcatcaat atgatcatgc gtctggcacc tattggtgcg 600 ttcggggcaa tggcgtttac catcggtaaa tacggcgtcg gcacactggt gcaactgggg 660 cagctgatta tctgtttcta cattacctgt atcctgtttg tggtgctggt attgggttca 720 atcgctaaag cgactggttt cagtatcttc aaatttatcc gctacatccg tgaagaactg 780 ctgattgtac tggggacttc atcttccgag tcggcgctgc cgcgtatgct cgacaagatg 840 gagaaactcg gctgccgtaa atcggtggtg gggctggtca tcccgacagg ctactcgttt 900 aaccttgatg gcacatcgat atacctgaca atggcggcgg tgtttatcgc ccaggccact 960 aacagtcaga tggatatcgt ccaccaaatc acgctgttaa tcgtgttgct gctttcttct 1020 aaaggggcgg caggggtaac gggtagtggc tttatcgtgc tggcggcgac gctctctgcg 1080 gtgggccatt tgccggtagc gggtctggcg ctgatcctcg gtatcgaccg ctttatgtca 1140 gaagctcgtg cgctgactaa cctggtcggt aacggcgtag cgaccattgt cgttgctaag 1200 tgggtgaaag aactggacca caaaaaactg gacgatgtgc tgaataatcg tgcgccggat 1260 ggcaaaacgc acgaattatc ctcttaa 1287 <210> 12 <211> 44 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cat1f-SacI primer <400> 12 tttcccgagc tctgtgaggc gattaaatga gtaaagggat aaag 44 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 4hbDb-XabI primer <400> 13 gctctagatt agataaaaaa gaggacattt cacaatatgg 40 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DctAf-EcoRI primer <400> 14 ggaattcatg aaaacctctc tgtttaaaag c 31 <210> 15 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DctAb-XbaI primer <400> 15 gctctagatt aagaggataa ttcgtgcgtt ttgcc 35 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAP0035f-SacI primer <400> 16 tttcccgagc tcatgaaagt tacaaatcaa aaa 33 <210> 17 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAP0035b-XbaI primer <400> 17 gctctagatt aaaatgcttt tatatagat 29 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAP0162f-EcoRI primer <400> 18 ggaattcatg aaagtcacaa cagtaaag 28 <210> 19 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CAP0162b-XbaI primer <400> 19 gctctagatt aaggttgttt tttaaa 26 <210> 20 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cat2f-EcoRI primer <400> 20 ggaattcatg gagtgggaag agatatataa agag 34 <210> 21 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> cat2b-BamHI primer <400> 21 cgggatcctt aaaatctctt tttaaattca ttcattaatg 40 <210> 22 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ptbf-EcoRI primer <400> 22 ggaattcatg attaagagtt ttaatgaaat tatcatg 37 <210> 23 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bukb-XbaI primer <400> 23 gctctagatt atttgtattc cttagctttt tcttctcc 38

Claims (32)

  1. 숙신산 생성능을 가지는 미생물에서, 숙신산(succinate)을 4-하이드록시부티레이트(4-hydroxybutyrate)로 전환하는 효소의 유전자와 4-하이드록시부티레이트를 1,4-부탄디올(1,4-butanediol)로 전환하는 효소의 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 1,4-부탄디올 고생성능을 가지는 변이체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 숙신산 생성능을 가지는 미생물은 숙신산 고생성능을 가지는 박테리아, 효모 및 곰팡이로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 박테리아는 루멘박테리아, 코리네박테리움(Corynebacterium) 속, 브레비박테리움(Brevibacterium) 속 및 대장균으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 루멘박테리아는 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA)와 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl)가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  5. 제3항에 있어서, 상기 루멘박테리아는 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl), 포스포트랜스아세틸화효소를 코딩하는 유전자(pta) 및 아세트산 키나제를 코딩하는 유전자(ackA)가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  6. 제3항에 있어서, 상기 루멘박테리아는 젖산 탈수소화효소를 코딩하는 유전자(ldhA), 피루브산-개미산 분해효소를 코딩하는 유전자(pfl) 및 포스포피루브산 카르복실라제를 코딩하는 유전자(ppc)가 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  7. 제3항에 있어서, 상기 루멘 박테리아는 맨하이미아 속(Mannheimia sp .), 액티노바실러스 속(Actinobacillus sp .) 및 언에어로바이오스피리륨 속(Anaerobiospirillum sp .)으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  8. 제7항에 있어서, 상기 루멘 박테리아는 맨하이미아 속(Mannheimia sp .)인 것을 특징으로 하는 변이체.
  9. 제8항에 있어서, 상기 루멘 박테리아는 맨하이미아 숙시니시프로듀슨스 MBEL55E(KCTC 0769BP), 맨하이미아 속 LPK(KCTC 10558BP), LPK4 및 LPK7(KCTC 10626BP)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  10. 제3항에 있어서, 상기 대장균은 포도당 인산전이효소를 코딩하는 유전자(ptsG) 및 피루베이트 키나아제를 코딩하는 유전자(pykA 및 pykF)가 모두 결실되어 있고, 혐기적 조건에서 다른 유기산은 거의 생성하지 않으면서 숙신산을 고농도로 생성하는 특성을 가지는 것을 하는 변이체.
  11. 제10항에 있어서, 대장균 변이체는 W3110GFA인 것을 특징으로 하는 변이체.
  12. 제1항에 있어서, 상기 숙신산을 4-하이드록시부티레이트로 전환하는 효소의 유전자는 클로스트리디움 클루이베리(Clostridium kluyveri) 유래인 것을 특징으로 하는 변이체.
  13. 제1항에 있어서, 상기 숙신산을 4-하이드록시부티레이트로 전환하는 효소의 유전자는 Cat1(succinyl-CoA transferase)를 코딩하는 유전자, SucD(succinate semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자, 4hbD(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자 및 GHB(4-hydroxybutyrate dehydrogenase)를 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 변이체.
  14. 제13항에 있어서, 상기 Cat1를 코딩하는 유전자는 서열번호 1, SucD를 코딩하는 유전자는 서열번호 2, 4hbD를 코딩하는 유전자는 서열번호 3 및 GHB를 코딩하는 유전자는 서열번호 4의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  15. 제13항에 있어서, 상기 변이체는 Cat1를 코딩하는 유전자; SucD를 코딩하는 유전자; 및 4hbD를 코딩하는 유전자 또는 GHB를 코딩하는 유전자를 갖는 것을 특징으로 하는 변이체.
  16. 제1항에 있어서, 상기 4-하이드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 효소의 유전자는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 유래인 것을 특징으로 하는 변이체.
  17. 제1항에 있어서, 상기 4-하이드록시부티레이트를 1,4-부탄디올로 전환하는 효소의 유전자는 4-하이드록시부티레이트-CoA 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자와 4-하이드록시부티레이트-CoA를 환원하는 알코올 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자; 또는 포스포트랜스부틸라아제를 코팅하는 유전자, 부티릴 카이네이즈를 코팅하는 유전자 및 4-하이드록시부티레이트-CoA를 환원하는 알코올 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 변이체.
  18. 제17항에 있어서, 상기 4-하이드록시부티레이트-CoA 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자는 서열번호 5의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  19. 제17항에 있어서, 상기 포스포트랜스부틸라아제를 코팅하는 유전자와 부티릴 카이네이즈를 코팅하는 유전자는 각각 서열번호 6 및 서열번호 7의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  20. 제17항에 있어서, 상기 알코올 디하이드로게나제는 클로스트리디움 아세토부틸리쿰(Clostridium acetobutylicum) 유래 부틸-CoA 디하이드로게나제인 것을 특징으로 하는 변이체.
  21. 제20항에 있어서, 상기 부틸-CoA 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 8 또는 서열번호 9의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  22. 제1항에 있어서, 상기 변이체는 숙신산 세미알데히드(succinate semialdehyde)를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
  23. 제22항에 있어서, 숙신산 세미알데히드를 숙신산으로 전환하는데 관여하는 유전자는 GabD(succinic semialdehyde dehydrogenase)를 코딩하는 유전자인 것을 특징으로 하는 변이체.
  24. 제23항에 있어서, 상기 GabD를 코딩하는 유전자는 서열번호 10의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  25. 제1항에 있어서, 숙신산의 운송에 관여하는 DctA(C4-dicarboxylate transport protein)를 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
  26. 제25항에 있어서, 상기 DctA를 코딩하는 유전자는 서열번호 11의 염기서열을 가지는 것을 특징으로 하는 변이체.
  27. 숙신산 생성능을 가지는 미생물에서 Cat1을 코딩하는 유전자; SucD를 코딩하는 유전자; 4hbD를 코딩하는 유전자 또는 GHB를 코딩하는 유전자; 4-하이드록시부티레이트-CoA 트랜스퍼라제를 코딩하는 유전자 또는 Ptb를 코딩하는 유전자와 Buk를 코팅하는 유전자; 및 부틸-CoA 디하이드로게나제를 코딩하는 유전자가 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 1,4-부탄디올 고생성능을 가지는 미생물 변이체.
  28. 제27항에 있어서, 상기 변이체는 GabD를 코딩하는 유전자가 결실되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
  29. 제27항에 있어서, 상기 변이체는 숙신산의 운송에 관여하는 DctA(C4-dicarboxylate transport protein)를 코딩하는 유전자가 추가로 도입 또는 증폭되어 있는 것을 특징으로 하는 변이체.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항의 변이체를 탄수화물을 포함하는 배지에서 배양한 다음, 상기 배양액으로부터 1,4-부탄디올을 수득하는 것을 특징으로 하는 1,4-부탄디올의 제조방법.
  31. 서열번호 8 또는 서열번호 9의 염기서열을 가지는 부틸-CoA 디하이드로게나제 유전자.
  32. 제28항의 유전자를 함유하는 재조합벡터.
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