KR20090085122A - 베타 락타마제의 용도 - Google Patents

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타피오 코르코라이넨
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Abstract

베타 락탐 항생물질 및 베타 락타마제 억제제의 복합물로 항생 치료하는 것과 관련된 장에서의 부작용을 감소시키는데 A류 베타 락타마제를 사용할 수 있다.

Description

베타 락타마제의 용도{Use of beta-lactamase}
본 발명은 장관(intestinal tract)에서 정상적인 미생물군(microbiota)에 대한 항생물질의 위해영향을 저감하는 것에 관련된 것이다. 더욱 상세하게는 이것은 장 내에서 부작용을 줄이기 위한 치료제(medicament) 제조용 A류의 베타 락타마제의 용도에 대한 것이다. 또한 장내에서 흡수되지 않은 베타 락타마제 항생물질의 부작용을 줄이는 방법이 제공된다.
베타 락탐 항생물질은 박테리아성 감염에 대해 가장 광범위하게 사용되고 있는 항생물질이다. 이들은 모두 공통된 구조적 특징을 공유하고 있다. 즉, 베타 락탐 핵을 포함하고 있다. 베타 락탐 항생물질은 숙주에 대해 매우 낮은 독성을 가지는 반면, 박테리아의 세포벽의 생합성을 저해한다. 그러나 베타 락탐을 이용한 치료에 있어서 문제점 중 하나는 많은 박테리아들이 소위 베타 락타마제라고 하는 효소를 생산하는데, 이것은 베타 락탐 고리의 아미드 결합을 수화시킴으로써 베타 락탐 항생물질을 비활성화 시킬 수 있다.
그람 양성 및 그람 음성 박테리아의 베타 락타마제 생산 균주가 광범위하게 증가하여 베타 락탐 항생물질의 유용성을 제한해왔다. 따라서, 베타 락타마제 억제제와 베타 락탐 항생물질의 복합물(combination)을 포함하는 의약 조성물이 개발되어 베타 락타마제 생산 박테리아와 상관없이 효과적인 치료를 제공하였다. 공지된 조합은 아목실린(amoxicillin) 및 클라불란산(clavulanic acid), 암피실린(ampicillin) 및 설박탐(sulbactam), 피페라실린(piperacillin) 및 타조박탐(tazobactam), 및 티카실린(ticarcillin) 및 클라불란산(clabulanic acid)이다(Higgins 등, 2004).
항생물질의 처치(treatment)와 관련된 다른 문제로는 상기 항생물질이 장관에 도달하였을 때, 이들이 장 미생물군(microbiota)에 대한 선발압을 행함으로써 항생물질 내성을 촉진하는 것이다. 경구뿐만 아니라 비경구적으로 투여된 베타 락탐은 장내 미생물군(microbiota)의 조성에 위해(adverse) 영향을 미치는데, 짐작하건대 이들이 감지할 수 있을 정도의 농도로 담즙(bile)으로 분비되기 때문이다. 담즙으로부터 이들은 소화관(gut)으로 방출되어 정상적인 장내 미생물상(intestinal microflora)의 붕괴를 유발할 수 있다. 숙주와 장내 미생물군(microbiota)의 생리적 균형에 대한 교란은 항생물질 관련 설사(diarrhea), 반코마이신(vancomycin) 내성 엔테로코시(enterococci)와 같은 병원성 박테리아의 과성장, 파생된 그람-음성 간균 또는 정상적인 장내 미생물군 내의 항생물질 내성 또는 병원균의 확산 및 발현을 일으킬 수 있다(Sullivan 등, 2001 , Donskey, 2006).
장내 미생물군(intestinal microbiota)의 교란을 줄이기 위한 전략 중 하나 는 비경구적 항생물질로 치료 중 담즙 분비를 최소화하는 항미생물제(antimicrobial)를 선발하는 것이다(Rice 등, 2004). 다른 전략은 프로 바이오틱스(probiotics)의 사용을 포함한다. 비병원성 효모인 사카로마이세스 보울라르디(Saccharomyces boulardii)와 락토바실러스 람노수스 GG(Lactobacillus rhamnosus GG (LGG))와 같은 복합 락트산 발효 박테리아를 포함한 많은 수의 여러 프로바이오틱스가 성인 및 아동의 항생물질 관련 설사를 줄이고 방지하는 차원에서 검토되어 왔다. S. 보울라르디(S. boulardii) 처치는 C. 디피실(C. difficile) 감염으로 인한 성인의 재발성 항생물질 관련 설사를 방지하는 것으로 나타났으며, LGG는 아동의 항생물질 관련 설사의 처치에 유용한 것으로 나타났다(Katz, 2006). 또 다른 전략으로는 소의 초유를 기반으로 한 면역유제품을 포함하는 것인데, 이것은 다양한 항생물질 관련 장 감염(intestinal infections)에 대한 예방에 있어서 효과적인 것으로 확인되고 있다(Korhone emd, 2000).
소화관에서 베타 락탐 항생물질의 위해 영향을 피하기 위한 또 다른 전략으로는 항생물질과 베타 락타마제를 함께 투여하는 것이다. 베타 락타마제의 경구 투여는 위-장관(gastro-intestinal tract)에서 흡수되지 않은 베타 락탐을 비활성화시켜 장내 정상적인 미생물군의 변형이나 및 베타 락탐 내성 박테리아의 과성장과 같은 부작용을 줄일 수 있다. 상기 베타 락타마제는 편리하게는 위 장관의 원하는 부분에 방출되도록 제조된다(WO 93/13795)
개과(canines)에 대한 비경구 암피실린 치료와 관련하여 경구 투여된 베타 락타마제는 혈청내의 암피실린의 농도(level)에 영향을 미치지 않고 용량 의존적 방법(dose dependent manner)으로 담즙성 배출 암피실린을 분해시키고 있다(Harmoinen 등, 2003). 더욱이, 베타 락타마제 치료는 개 치료 모델에 대해 수일간 비경구 암피실린의 치료를 하는 동안 배설물의 미생물군(microbiota)에 항생물질로 야기되는 변형(alterations)을 방지하는 것으로 설명되고 있다(Harmoinen 등, 2004). 또한, 베타 락타마제 결장(colon)대상 투약 형태(dosage form)를 사용함으로써 유사한 결과를 얻기도 했다(US 2005/249716).
Harmoinen 등에 의해서 2003년과 2004년에 수행된 연구에서 사용된 베타 락타마제는 재조합 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) 베타 락타마제(PneP)로 앰블러 분류(Ambler class) A류 효소에 속하는 것이다(Ambler, 1980). 이것은 페니실린(penicillins), 암피실린(ampicillin) 및 아목실린(amoxicillin)과 같은 아미노페니실린(animopenicillins), 및 피페라실린(piperacillin)과 같은 유레이도페니실린(ureidopenicillin)에 대한 높은 가수분해 활성을 가진다. 그러나 이것은 설박탐(sulbactam), 클라불란산(clavulanic acid) 및 타조박탐(tazobactam)과 같은 일반적인 베타 락타마제 억제제에 의해 쉽게 비활성화된다.
베타 락타마제 억제제는 베타 락타마제 생산 박테리아가 생산한 베타 락탐의 비활성화를 방지하는데 효과가 있다. 그러므로 베타 락타마제 억제제는 베타 락탐과 복합될 수 있다. 일반적으로, 상기 복합물(combination)의 두 성분은 모두 인체의 다양한 체액 및 조직에서와의 다소 유사한 약동학적 파라미터(pharmacokinetic parameters)를 가지며, 소실 반감기(elimination half-lives)를 갖는데, 이것은 복합 제제(combination preparations)의 치료적 효용성에 있어서 필수적인 것으로 간 주된다. 그러나, 담즙성 소실에 있어서, 상기 베타 락탐과 베타 락타마제 억제제의 약동학적 특성은 다양한 것으로 확인되었다. 예를 들어, 혈청에서 암피실린에 대한 설박탐의 비율은 거의 일정한 것(약 1:2)으로 나타난 반면, 담즙에서는 설박탐/암피실린 비율이 1:3 에서 1:13의 범위를 보였다(Wildfeuer 등, 1988). 담즙에서 그들의 비율이 매우 다양하나, 베타 락탐과 베타 락타마제 억제제의 복합물(combination)은 담관(biliary tract)에서의 감염에 대한 치료에 안전하고 효과적이라고 여겨지고 있다(Morris 등, 1986., Brogard 등, 1989, Westphal 등, 1997).
상기로부터, 베타 락탐 항생물질의 효과는 항생물질을 비활성화시키고, 베타 락타마제의 효과를 줄이는 베타 락타마제 억제제와 복합(combination)함으로써 증강된다고 결론지어질 수 있다. 또한, 장관내의 미생물군을 교란하는 것과 같은 항생물질 처치의 위해한 부작용을 줄이는 여러 방법이 제시되고 있다. 또한, 위해한 부작용이 없는 더욱 효과적인 항생물질 처치가 필요하다. 본 발명은 이러한 필요성을 충족시킨다. 이것은 베타 락탐 항생물질의 사용과 관련된 균교대감염(superinfections) 및 항생물질 내성의 증가 위험을 저감시킨다.
본 발명은 베타 락탐 항생물질 치료에 대한 것으로, 베타 락타마제 생산 박테리아에 의한 비활성화에 민감하지 않고, 장(intestine)에서 정상적인 미생물상(microbiological flora)의 균형을 교란시키지 않는다. 현재 베타 락타마제 항생물질 및 베타 락타마제 억제제를 복합하는 항생물질 처치에 있어서, 베타 락타마제가 장의 잔여 베타 락탐을 비활성화시키는데 효과적이라는 것이 확인되었다. 베타 락탐과 이의 억제제가 부분적으로는 담즙을 통해 소장으로 몸에서 제거되고, 상기 억제제는 생체 외 조건에서 베타 락타마제를 비활성화시키는 것으로 알려져 있기 때문에 이는 매우 놀라온 것이다.
본 발명은 베타 락탐 항생물질과 베타 락타마제 억제제의 복합(combination) 처치에 따른 장에서의 부작용을 저감하기 위한 치료제 제조를 위한 A류의 베타 락타마제의 용도를 제공한다.
또한 본 발명은 A류 베타 락타마제의 효과적인 양을 그것이 필요한 환자에 투여하여, 베타 락탐 항생물질과 베타 락타마제 억제제의 복합 처치에 따른 장에서의 부작용을 저감하기 위한 방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시 형태는 종속항(들)에 규정된다. 본 발명의 다른 목적, 상세 내용 및 잇점은 하기 도면, 발명의 상세한 설명 및 실시예를 통해 뚜렷해질 것이다.
본 발명은 베타 락탐 항생물질과 베타 락타마제 억제제의 복합 치료 후 흡수되지 않고 남아있는 베타 락탐 항생물질이 장의 미생물군에 미치는 위해 영향을 줄이기 위한 치료제의 제조를 위한 경구적으로 투여되는 베타 락타마제의 용도에 대한 것이다. 경구적으로 투여되는 베타 락타마제의 의약 조성물(pharmaceutical composition)은 회장 및 결장의 말단 부분에서 베타 락탐/베타 락타마제 억제제의 복합물이 주요 장의(intestinal) 미생물군에 미치는 영향을 줄이고, 따라서, 장의 미생물군의 생태학적 균형을 유지하게 하기 위한 것이다. 따라서, 베타 락타마제 치료를 채택함으로서, 소장 및 결장에서의 미흡수 잔여 베타 락탐/베타 락타마제 억제제와 관련된 부작용이 예방된다.
베타 락타마제
베타 락타마제는 EC 3.5.2.6.에 따라 분류된 베타 락탐 가수분해 효소이다. 상기 베타 락타마제는 이들의 아미노산 시퀀스에 따라서, A, B, C 및 D류로 더 분류된다(Ambler, 1980). 또한, A, C 및 D류는 이들의 활성 부위(active site)에 세린(serine) 잔기를 갖고 있기 때문에 세린 베타 락타마제로도 불린다. 이들의 일차 구조에 따라, 기질 또는 촉매작용의 인지에 중요한 세개의 보존된 펩타이드 서열이 3차 구조의 비교에 의해 확인되었다(Colombo 등, 2004).
베타 락타마제 요소
1 2 3
A류 SXXK SD(N/S/G) (K/R/H)(T/S)G
C류 SXXK YAN KTG
D류 SXXK SXV K(T/S)G
상기 첫번째 요소는 모든 세린 베타 락타마제에 있어서 동일하다. 이것은 활성 부위 세린(S) 및 리신(K)를 함유하고 있는데, 이의 사이드 체인은 상기 활성 부위를 가리킨다. 상기 두번째 요소는 촉매적 공동(catalytic cavity)의 한쪽 측면을 형성한다. 이것은 A류 베타 락타마제의 소위 SDN 고리인 것이다. 상기 SDN 고리는 몇 개의 예외를 제외하고는 A류 효소중에서 거의 변화하지 않는다. 세번째 요소는 베타판(beta sheet)의 가장 안쪽에 있으며, 촉매적 공동(catalytic)의 반대 벽을 형성한다. 이것은 일반적으로 KTG이다. 예외적으로는 리신(K)이 히스티딘(H) 또는 아르기닌(R)로 치환될 수 있으며, 여러 A류 베타 락타마제에서 트레오닌(T)는 세린(S)로 치환될 수 있다(Matagne 등, 1998).
본 발명의 일실시형태에 따라서, A류 베타 락타마제는 바실러스(Bacillus) 종(species)에서 유래될 수 있다. 본 발명의 구체적인 일실시형태에 따라, 상기 A류 베타 락타마제는 바실러스 리케니포미스 PenP(Bacillus licheniformis PenP)이다. 이 효소는 Izui 등(1980)에 의해 기술된 것으로, 바실러스 리케니포미스 749/C(ATCC 25972)로 부터 유래된 것이다. 상기 균주 749/C에서 유래된 PenP 아미노산 시퀀스는 시퀀스 번호 P00808로 Swiss-Prot 단백질 시퀀스 데이터베이스에 규정되어 있다. 또한 본 명세서에서는 시퀀스 식별 번호 1로 기록하였다. 상기 대응되는 PenP 유전자(gene)의 뉴클레오타이드 시퀀스는 DDBJ/EMBL GeneBank 데이터베이스에 시퀀스 V00093으로 되어 있다. 상기 B. 리케니포미스 베타 락타마제는 지질단백질(lipoprotein)로, 상기 단백질 부분이 상기 막 외부에서 접혀져 있는 형식으로 지방산 꼬리를 통해 상기 바실러스의 세포질 막에 고정되어 있다. 시퀀스 식별 번호 1은 상기 26 아미노산 긴 시그널 시퀀스(long signal sequence)를 포함한 상기 단백질의 전체 아미노산 시퀀스를 밝힌 것이다. 이 형태는 전구체 지질 단백질이다. 디아실글리세리드(Diacylglyceride)는 공유결합에 의해 27 위치에 있는 시스테인(C)의 NH2 말단에 연결되어 지질단백질의 형태를 이룬다.
또한, 상기 세포 외부에서 분비된 더 짧은 형태의 단백질이 있다. 이들을 엑소폼(exoform)이라고 한다. 상기 엑소폼은 상기 세포벽이나 배양 배지(culture medium)에서 프로테아제의 가수분해 활성의 결과이다.
본문에서 사용되는 "PenP"는 상기 아미노산 시퀀스(시퀀스 식별번호 1)의 베타 락타마제 활성 단편 및/또는 변종(variant)를 포함한다. 특히, 이것은 상기 시퀀스의 N-말단 절단형(N-truncated form)으로, 이것은 아미노 말단에서 절단되었다는 것을 의미한다. 또한 N-절단형에 있어서, 이것은, 이것이 베타 락타마제 활성을 갖는 한, 하나 또는 그 이상의 아미노산 결손(deletion), 치환(substitution) 및/또는 삽입(insertions)을 포함한다. 상기 변형(modifications)은 자연적으로 발생한 변종(variations)이거나 돌연변이일 수 있고, 또는 유전공학에 의해 유도된 인공적인 변형일 수 있다. 별도로 아미노 말단에서 절단된 형태인 엑소폼은 B.리케니포미스의 성장 배지에서 발견되었다. 이러한 엑소폼은 또한 PenP에 포함된다. Matagne 등(1991)에는 천연 숙주인 B. 리케니포미스 749/C에 의해서 생산된 세포외 형태에서 미세불균일성(microheterogeneity)의 다양한 정도가 기재되어 있다. 다른 N-말단 아미노산 잔기를 갖는 5개의 다른 분비된 엑소폼을 다음과 같이 확인하였다.
SQPAEKNEKTEMKDD... . .KALNMNGK (아미노산 35-49...300-307 )
EKTEMKDD... . .KALNMNGK (아미노산 42-49...300-307)
KTEMKDD... . .KALNMNGK (아미노산 43-49...300-307)
EMKDD... . .KALNMNGK (아미노산 45-49...300-307 )
MKDD... . .KALNMNGK (아미노산 46-49...300-307)
이니셜 아미노산 잔기는 볼드체로 표시하였다. 상기 C 말단 아미노산 잔기는 상기 오른쪽에 표시하였다. 상기 아미노산 위치는 시퀀스 식별 번호 1을 참조하라. 상기 35 위치의 세린(S)에서 시작하는 엑소폼은 B. 리케니포미스 베타 락타마제의 "대량 분비 형태(large secreted form)"로 불리며, 43 위치의 리신(K)에서 시작하는 것은 "소량 분비 형태(small secreted form)"라고 한다. 상기 첫번째 알파 나선(α1-나선)은 48 위치의 아스파르탐산(D)에서 시작하고, 마지막 알파 나선(α11-나선)의 마지막은 303 위치의 아스파라긴산(N)에서 종료된다. 본 발명의 구체적인 일실시형태에 따르면, PenP는 적어도 48 내지 303 아미노산을 포함하며, 이것은 상기 단백질의 2차 구조에 참여한다(Knox 등, 1991). 본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 상기 아미노산 48 내지 303 중 하나 또는 그 이상은 결손되었거나 치환되었다.
또한 본 발명의 다른 실시형태에 따르면 상기 PenP의 아미노 말단은 NH2-KTEMKDD로 시작한다(시퀀스 식별 번호 1의 아미노산 43-49). 이 소위 ES-베타L 엑소폼(ES-betaL exoform)은 Gebhard 등(2006)이 기술한 바와 같이 21개 까지의 인접한 잔기를 결여할 수 있다. 본 발명의 다른 실시형태에 따르면, 상기 아미노 말단은 시퀀스 식별번호 1의 글루탐산(E)로 시작하며, 특히, 이것은 NH2-EMKDD(시퀀스 식별 번호 1의 아미노산 45-49)로 시작하거나 또는 NH2-MKDD(시퀀스 식별번호 1의 아미노산 46-49)로 시작한다.
상기 PenP 단백질의 카르복실 말단에 있는 네 개의 마지막 아미노산 MNGK-COOH는 2차 구조의 일부가 아니며, 따라서, 또한 활성을 잃지 않으면서 결손될 수 있다. 또 다른 실시형태에서는 9개 까지의 C-말단 아미노산이 결손될 수 있다. 상기 C-말단 절단 형태의 단백질은 Santos 등(2004)에 의해서 기술된 바 있다.
상기 베타 락타마제에 대해 상기된 모든 다른 형태는 베타 락타마제 활성을 갖는 단백질의 형태와 함께 PenP에 포함된다. 본 발명의 특정한 일 실시형태에 있어서, 상기 베타 락타마제는 시퀀스 식별 번호 1 또는 이의 베타 락타마제 활성 단편, 특히, 27 위치에서 시작되는 단백질의 성숙한 단편, 바람직하게는 상기 시퀀스 식별 번호 1의 46 또는 46 위치와 상응하는 위치에서 시작되는 단백질의 N-절단 단편과 적어도 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 97, 98, 또는 99%의 동일성(identity)을 갖는 아미노산 시퀀스를 갖는다. 상기 시퀀스 동일성은 Altschul 등(1997)에 기술된 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)를 사용하여 결정되었다.
베타 락타마제 활성은 O'Callaghan 등(1972)에 기술된 니트로세핀 검정(nitrocefin assay)에 의해서 결정될 수 있다.
상기 A류 베타 락타마제는 편리하게는 재조합 단백질로서 생산된다. 바람직하게는 이것은, B. 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens), B. 푸무리스(B. pumulis) 또는 B. 서브틸리스(subtilis)와 같은 의약 상품 제공용으로 적당한 바실러스 숙주 균주(strain)에서 생산된다. WO 03/040352에는 비포자형성 B. 서브틸리스 균주을 이용하여 베타 락타마제를 생산하는 방법이 기술되어 있다. 상기 단백질은 또한 과잉생산에 의해 B.리케니포미스에서 균일하게 생산될 수 있다.
제제(formulation)
상기 베타 락타마제는 편리하게는, 위장 내성 베타 락타마제환과 같은, 장용제피(enteric coated)의 경구 투여용 의약 조성물로 제조되어, 목적하는 베타 락타마제 제제(formulation)을 얻게된다. 본 발명의 일실시형태에 따르면, 편리하게는 상기 베타 락타마제는 경질캡슐제(hard gelatine capsules)에 채워진 장용제피환으로 투여된다. 장용제피용 투약 형태(dosage form)는 의약 산업계에서 경구용 제품 중 잘 알려져 있다. 상기 장용 제피형 약품(drug products)은 위장에서 분해되지 않고 소장, 즉, 십이지장(duodenum), 공장(jejunum) 및/또는 회장(ileum)에서 투약 형태의 내용물이 방출되도록 고안되었다. 장용제피의 고형 제제를 적용하는 이유는 약 물질(drug substance)을 위의 효소의 분해 작용이나 위의 낮은 pH 환경으로부터 보호하고, 또는 약 물질에 의한 자극이 위점막에 염증을 일으키거나 구역, 출혈을 일으키지 않도록 하고, 또는 약 물질을 소장의 대상 부위에 녹지 않은 형태로 전달하기 위한 것이다. 이러한 기준을 바탕으로, 장용 제피 약품은 방출이 지연되는 투약 형태의 일종으로 간주될 수 있다. 수성 기반의 코팅 형태는 친수성 PenP 단백질의 코팅 프로세스에 가장 바람직한 물질로 보인다. 장용 특성을 달성하기 위해 사용되는 수용성 폴리머로는 일반적으로 유드라짓(Eudragit)®과 같은 폴리메타크릴레이트, 듀오드셀(Duodcell)®와 같은 셀룰로오스 에테르 또는 아쿠아테릭(Aquateric)®과 같은 셀룰로오스 에스테르인 폴리머 기반 셀룰로오스, 또는 오파드라이(Opadry)®와 같은 폴리비닐 아세테이트 공중합체( copymers ) 등이 있다.
처치 방법
A류 베타 락타마제는 베타 락탐 항생물질을 베타 락타마제 억제제와 함께 사용함으로써 유발되는 장의 부작용을 줄이기 위해 사용된다. 장용 제피형 베타 락타마제는 흡수되지 않은 베타 락탐 항생물질을 제거하는 데 필요한 양이 장에서 방출되고 이에 의해 상기 항생물질의 위해 영향이 감소한다. 상기 베타 락타마제는, 예를 들어, 반코마이신 내성 엔테로코코스(enterococci)와 같은 병원성 박테리아의 과성장, 그람 음성 바실러스를 생산하는 파생된 베타 락타마제 또는 정상적인 장 미생물군 또는 병원균 사이에서 항생물질 내성의 확산 및 출현을 유발하는, 숙주와 장 미생물군의 간의 생태학적 균형의 교란과 관련된 항생물질을 감소시키거나 방지한다. 따라서, 베타 락타마제는 클로스트리디움 디피실레(Clostridium difficile) 및 병원성 효모에 의한 중복 감염을 피할 수 있도록 하는데, 이것은 통상의 면역 반응이 억제된 환자에 있어서 매우 중요하다. 상기 대상이 되는, 장용 제피형 베타 락타마제는 바람직하게는 비경구적으로 또는 가능한한 경구적으로 투여되는 항생물질 및 베타 락타마제 억제제와 관련하여 경구적으로 제시된다. 상기 베타 락타마제로 치료되는 대상은 사람 또는 가축과 같은 동물로 베타 락탐 항생물질을 베타 락타마제와 함께 복합하여 치료된다.
항생물질 및 억제제
"베타 락탐 항생물질"은 항박테리아성 화합물로 4 원자 베타 락탐(아제티딘-2-온(azetidin 2-one)) 고리를 포함한다. 베타 락탐 항생물질은 공지기술에서 잘 알려져 있으며, 이것은 천연, 반합성이거나 합성에서 유래될 수 있다. 상기 베타 락탐 항생물질은 일반적으로, 그들의 구조적인 특성에 따라서, 페니실린(penicillins), 세팔로스포린(cephalosporins), 세파마이신(cephamycins), 옥사 베타락탐(oxa betalactams), 카르바페넴(carbapenems), 카르바세펨(carbacephems) 및 모노박탐(monobactams)으로 분류된다. 바람직하게는 상기 항생물질은 비경구적으로 투여되는 것이다. 상기 베타 락탐 항생물질은 적당한 베타 락타마제 억제제와 복합된다. 이러한 목적에 알맞은 항생물질(antibiotics)로는 예를 들어 페니실린 G를 포함하는 페니실린, 아목실린 및 암피실린과 같은 아미노페니실린, 피페라실린과 같은 유레이도페니실린(ureidopenicillin) 또는 티카르실린(ticarcillin)과 같은 알파-카르복시페니실린이 있다.
"베타 락타마제 억제제"는 베타 락탐 항생물질을 가수분해 할 수 있는 베타 락타마제를 억제할 수 있는 화합물(compound)이다. 그러나, 상기 억제제들은, 필연적인 것은 아니지만, 일반적으로 베타 락탐 항생물질과 구조적으로 연관되어 있고 그 자체로는 항박테리아성 활성이 약하나, 복합 치료에 있어서 그들의 기능은 실제 항생물질 형태가 박테리아성 베타 락타마제에 의해 비활성화되는 것으로부터 보호한다. 본문에서, 상기 억제제는 특히 A류 베타 락타마제에 대한 억제제이다. 적절한 억제제로는 예를 들어, 설박탐(sulbactam), 클라불란산(clavulanic acid) 및 타조박탐(tazobactam)이 있다. 클라불란산은 천연 유사 물질이고, 반면에 설박탐과 타조박탐은 반합성이다. 대부분의 억제제들은 비경구적, 즉, 정맥으로 또는 근육으로 투여된다. 클라불란산은 또한 경구적으로 투여될 수 있다. 몇개의 베타 락탐 항생물질/베타 락타마제 억제제 복합들은 공지 기술이며 임상적으로 사용되고 있다.
상기 항생물질 및 상기 억제제는 편리하게는 혼합물(mixture)로 투여된다. 상업적으로 입수 가능한 베타 락타마제 억제제는 다양한 베타 락탐과 복합(combination)되어 임상적으로 사용된다. 클라불란산은 아목실린 또는 티카르실린과 복합되어 사용되며, 이와 유사하게 설박탐은 암피실린과, 타조박탐은 피페라실린과 복합된다. 다른 복합도 가능하다. 베타 락타마제는 경구적으로 동시에 투여되거나 또는 항생물질-억제제 복합 치료 전에 투여된다. 바람직하게는 베타 락탐/억제제 복합물이 동시에 투여된다.
투여량(Dosages)
베타 락탐과 베타 락타마제 억제제의 복합의 투여에 의한 장 미생물군의 교란의 정도 및 부작용의 발생은 약 투여량(dosage), 투여 경로 및 베타 락탐과 상기 억제제의 약동학(pharmacokinetic)/역학(dynamic) 특성과 같은 다양한 요소에 좌우된다. 상기 베타 락타마제는 소장(small intestine) 및 결장(colon)의 잔여 미흡수 베타 락탐에 의한 부작용을 저감시키기에 충분한 양으로 투여된다. 상기 실험에서, 체중 1kg당 베타 락타마제 약 0.1mg의 1회 분량(dose)이 공장 미즙(jejunal chyme)에서 암피실린과 아목실린을 검측 한계치 이하의 농도로 낮추는데 효과적인 반면에, 페니실린을 제거하는데는 더 많은 1회 분량이 필요하였다. 베타 락타마제의 적절한 1회 분량은 체중 1kg당 0.1 내지 1.0, 바람직하게는 0.2 내지 0.4mg인 것이다.
상기 발명은 또한 다음의 제한적이지 않은 실시예에 의해 더욱 잘 설명된다. 그러나, 이것은 상기의 설명 및 실시예에에 따른 실시형태로 설명적인 목적을 위해서만 제공되는 것이고, 본 발명의 목적 범위 내에서 다양한 변형이 가능하다. 상기 실험 결과는 베타 락탐/베타 락타마제 억제제 복합 치료에 있어서 미흡수 베타 락탐에 대한 베타 락타마제의 뛰어난 효과를 보여준다. 상기 결과는 바실러스 리케니포미스 베타 락타마제의 용도가 베타 락탐과 베타 락타마제 억제제를 복합한 항생물질을 치료하는 것에 확대될 수 있다는 것을 뒷받침한다.
도 1은 분비 벡터 pKHT 141에서 복제된 바실러스 리케니포미스 베타 락타마제 유전자의 뉴클레오타이드 시퀀스 및 추론된 아미노산 시퀀스이다.
도 2는 경구적으로 투여된 베타 락타마제의 존재 또는 비존재의 경우, 암피실린/설박탐을 복합하여 비경구적으로 투여한 후 개(비글종)의 공장 미즙에서의 암피실린 농도이다.
도 3은 경구적으로 투여된 베타 락타마제의 존재 또는 비존재의 경우, 아목 실린/클라불란산을 복합하여 비경구적으로 투여한 후 개(비글종)의 공장 미즙에서의 아목실린의 농도이다.
도 4 및 도 5는 다양한 투여량으로 경구적으로 투여된 베타 락타마제의 존재 또는 비존재의 경우, 피페라실린/타조박탐을 복합하여 비경구적으로 투여한 후 개(비글종)의 공장 미즙에서의 피페라실린 농도 이다.
실시예 1
바실러스 리케미포미스 749/C에서 유래된 재조합 베타 락타마제를 이 실험에 사용하였다. 상기 단백질은 WO 03/040352에 기재된 비포자형성(non-sporulating) 바실러스 서브틸리스 균주에서 생산되었다.
분비 벡터 pKTH141가 사용되었는데, 이것은 강력한 생장 프로모터(amyQp), 리보솜 결합 부위(RBS) 및 B. 아밀로리쿠에파시엔스(B. amyloliquefaciens) E18 아밀라제 유전자(amyQ)의 시그널 시퀀스 암호화 부위(amyQss)를 수행하는 발현 카세트(expression cassette)를 포함한다. 또한, HindⅢ 부위가 있는 합성 올리고 뉴클레오타이드가 시그널 시퀀스 암호화 부위의 3'말단에 직접 삽입되었다. 따라서, 상기 외래의 단백질을 암호화하는 삽입은 알파 아밀라아제의 시그널 시퀀스와 같은 동일한 리딩 프레임(reading frame)으로 번역되는 방식으로 HindⅢ 부위로 복제된다. 상기 HindⅢ 올리고 뉴클레오 타이드는 3개의 아미노산 잔기(NH2-QAS)를 암호화 하는데, 이것은 성숙한 단백질의 NH2-말단 확장을 포함하는 것으로 예상된다.
시퀀셜 아미노산 잔기 43-307(시퀀스 식별 번호 1)을 암호화하는 상기 바실러스 리케니포미스 베타 락타마제 구조 유전자(penP)는 주형(template)으로 B. 리케미포니스 염색체 DNA(chromosomal DNA)를 가진 HindⅢ 제한 부위를 포함하는 적절한 프라이머를 이용하여 PCR로 증폭되었다. 상기 증폭된 단편은 이후 HindⅢ로 절단되고, pKHT141의 대응되는 부위와 연결되어 AmyQ 시그널 펩타이드 및 PenP 단백질간의 프레임 융합이 이루어졌다. 상기 베타 락타마제 유전자의 뉴클레오타이드 시퀀스를 자동 DNA 서열 분석기를 사용해서 이중 탈산소 사슬 절단법(dideoxy chain termination method)으로 결정하였다. 상기 재조합 B. 리케니포미스 749/C 베타 락타마제 유전자의 완전한 뉴클레오타이드 및 추론된 아미노산 시퀀스를 시퀀스 식별 번호 2 및 3에 수록하였고, 도 1에 나타내었다.
도 1에서, 상기 선 아래에 괄호 안에 있는 것은 아미노산 잔기를 말한다. NH2-QAS 확장을 암호화하는 HindⅢ 복제 부위는 뉴클레오타이드 시퀀스 위에 기재되어져 있다. 상기 예상되는 시그널 펩타이드 분열 부위(cleavage site)는 -31의 위치의 알라닌 이후이다.
상기 오픈 리딩 프레임(open reading frame)은 amyQ 유전자의 31개 아미노산 잔기 긴 시그널 시퀀스를 처치하는 299 아미노산 폴리펩타이드를 암호화한다. 상기 시그널 펩타이드의 절단부위는 -1 위치의 알라닌 이후에 위치할 것으로 예상된다. 성숙한 베타 락타마제는 +1 위치의 글루타민(Q) 에서 시작되는 것으로 예상되었다. 따라서, 성숙한 베타 락타마제는 NH2-QAS 확장이 HindⅢ 복제 부위에 의해서 암호화되어 있는 268 아미노산 잔기를 함유할 것으로 예상된다.
정제된 재조합 베타 락타마제의 NH2-말단 시퀀스는 단백질 서열 분석기(sequenator)를 가진 자동화된 에드만 분해(Edman degradation)에 의해 결정되었다. 분석은 재조합 베타 락타마제가 이의 추론된 아미노 말단에서 상기 NH2-QASKT 펜타펩타이드가 결여되어 있음을 밝혔다. 상기 결과는 상기 재조합 베타 락타마제 단백질의 절단된 형태(truncated form)가 상기 박테리아 세포벽 및 상기 배양기(culture madium)에 모두 존재하는 단백질 가수분해 효소의 번역후 활동에 의해 생성되는 것을 나타낸다. 결론적으로, 상기 정제된 재조합 베타 락타마제의 주요 부분은 263 아미노산 잔기를 포함하고, 분자량은 29.3kDa이다. 상기 결정된 아미노 말단 시퀀스는 추론된 아미노산 시퀀스에서 내려온 5개의 아미노산 잔기 이후에서 시작한다. 상기 정제된 재조합 베타 락타마제의 최초의 아미노산 잔기는 도 1에 나타난 바와 같이 +6 위치의 글루탐산(E)이다.
상기 정제된 효소 단백질을 P1A로 명명하였다. 이것은 필수적으로 (적어도 약 95 중량%) 시퀀스 식별 번호 1의 45 에서 307 시퀀셜 아미노산 잔기로 구성된다. 상기 나머지들은 필수적으로 시퀀스 식별 번호 1의 46 에서 307 시퀀셜 아미노산 잔기로 구성된다. 상기 베타 락타마제는 Harmoinen 등(2004)에 의해 수행된 연구에서 사용된 환과 거의 동일한 장용제피형 환으로 투여되었다.
B. 리케니포미스 베타 락타마제의 성능, 즉 암피실린/설박탐 복합하여 비경구적으로 치료하는 동안 소장에서 담즙성 배출 암피실린(biliary excreted ampicillin)을 제거하는 성능을 실험용 개를 통해 조사하였다. 분석을 위한 표본을 수집할 수 있도록 유문에서 약 170cm 말단에 유두판막(nipple valve)를 외과적인 방법으로 실험용 개(비글종)의 공장에 삽입하였다. 상기 장 수술은 장의 운동성을 변화시키지 않았다. 상기 실험 전체에 6 마리의 개(비글종)이 사용되었다. 상기 실험은 다음과 같이 두 단계의 처치가 순차적으로 수행되었다. 첫번째 실험에서, 암피실린과 설박탐의 복합물(체중 1kg당 암피실린 40mg, 설박탐 20mg)의 1회 분량을 사료 배급 이후 두번 연속하여 정맥으로 투여하였으며, 투여 간격은 6시간 20분이었다. 7일 후, 첫번째 실험과 유사하게 두 번째 실험을 수행하였는데, 여기서는 암피실린/설박탐 주사 10분 전에, 추가적으로 동일한 개에게 베타 락타마제를 경구적으로 투여하였다. 체중 1kg 당 약 0.1mg의 활성 베타 락타마제를 함유한 장용제피형 환의 단일회(single dose)가 사용되었다.
공장 미즙의 표본이 다양한 시간대에서 수집되었다. 미즙 표본을 즉시 냉각시켜 분석할때 까지 영하 70℃의 온도로 저장하였다. 상기 미즙 표본을 고상 시료 추출기(solid phase extraction)으로 세척하였다. 암피실린의 정량(quantificiaton)을 위해서 UV 검출과 함께 역상 고성능 액체 크로마토그래피(reversephase high performance liquid chromatography (HPLC))을 사용하였다.
상기 얻어진 결과는, 베타 락타마제 치료(therapy)를 하지 않고 수행된 첫번째 실험의 공장의 표본에서 높은 수준의 암피실린이 검출된 반면, 두번째 실험에서 는 경구적으로 투여된 베타 락타마제가 공장의 암피실린 수준을 정량 한계(limit of quantification)(공장 미즙 1g 당 암피실린 10㎍) 미만으로 감소시킨다는 것을 보여주었다.
도 2는 경구적으로 투여된 베타 락타마제 환(활성 베타 락타마제의 1회 분량이 체중 1kg 당 약 0.1 mg인 것)의 정맥으로 암피실린/설박탐을 복합 투여(체중 1kg 당 암피실린 40mg 및 설박탐 20mg)한 후 개(비글종, 개체수=6)의 공장 미즙의 암피실린 농도에 대한 효과를 보여준다. 상기 두 실험의 값은 다른 시간대에 따른 평균 미장의 암피실린 농도로 나타내었다. 실험 1에서 암피실린 값은 베타 락탐 치료 없이 6시간의 투여 간격으로 두고 암피실린/설박탐을 두 번 투여한 후 얻은 공장의 암피실린 농도이다. 개(비글종)은 실험 2에서 동시에 베타 락타마제 치료와 함께 암피실린/설박탐 복합물로 치료되었다. 상기 사용된 베타 락타마제의 1회 분량이 첫번째 암피실린/설박탐 치료 동안 개(비글종)에서 공장의 암피실린의 대부분을 제거할 수 있었고, 상기 두번째의 베타 락타마제 치료와 함께 암피실린/설박탐을 치료한 것에서는 농도가 낮아져 정량치 미만으로 잔존하였다.
상기 결과는 잔여 담즙 분비 베타 락타마제 억제제가 베타 락타마제의 활성에 제한된 영향을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 2
비경구적으로 아목실린을 클라불란산과 복합하여 치료하는 동안 상기 B. 리케니포미스 베타 락타마제 P1A의 답즙 분비 아목실린을 비활성화 시키는 유효성에 대해, 체중 1kg당 아목실린 25mg 및 클라불란산 5mg이 포함된 아목실린/클라불란산 복합의 단일회(single dose)에 HPLC 분석 방법이 아목실린의 분석에 적절하게 조정(정량 한계치가 공장 미즙 1g당 2㎍임)이 된 것을 제외하고는 실시예 1과 거의 유사한 방법을 통해 조사하였다
상기에서 얻은 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 아목실린/클라불란산 복합물(체중 1kg당 아목실린 25 mg 및 클라불란산 5mg)을 정맥 투여한 후, 경구적으로 투여된 베타 락타마제 환이 비글 개(n=6)공장 미즙 내 아목실린의 농도에 미치는 영향을 보여준다. 상기 두 실험의 값은 다른 시간대에서의 평균적인 공장의 아목실린 농도를 나타낸다. 실험 1에서 아목실린 값은 아목실린/클라불란산이 베타 락타마제 치료 없이 6시간 간격으로 분리하여 두번 투여한 후 달성된 공장의 아목시실린 농도를 나타내는 것이다. 경구 베타 락타마제 치료는 실험 2의 아목실린/클라불란산 복합물의 비경구적 치료와 결합되었다.
비경구적 아목실린/클라불란산 복합물 치료 동안 베타 락타마제 처치(treatment)는 답즙성 배출 아목실린의 대부분을 제거할 수 있다는 것이 확인되었다. 몇 몇 공장 표본에서 발견된 미량의 아목실린은 베타 락타마제의 1회 분량을 늘림으로서 제거될 수 있다. 상기 결과는 B. 리케니포미스 베타 락타마제가 비경구적 아목실린/클라불란산의 사용에 관한 부작용을 줄일 수 있는 강력한 약 물질 후보임을 보이는 것이다.
실시예 3
개(비글종)를 베타 락타마제 치료와 함께, 동시에 또는 단독으로, 피페라실린/타조박탐 복합물로 처치하였다. 상기 실험은, 피페라실린/타조박탐 복합의 단일회(single dose)에 체중 1kg당 피페라실린 100mg 및 타조박탐 12.5mg이 함유되었다는 것과 HPLC 분석 방법이 피페라실린 분석에 적절하게 조정(정량 한계치가 공장 미즙 1g당 10㎍임)이 된 것을 제외하고는 실시예 1 및 2와 거의 유사한 방법을 통해 수행되었다.
상기 결과를 도 4에 나타내었다. 상기 도 4는 피페라실린/타조박탐 복합물 (체중 1kg당 피페라실린 100mg 및 타조박탐 클라불란산 12.5mg)을 정맥 투여한 후 경구적으로 투여된 베타 락타마제 환이 비글 개(n=6)dml 공장 미즙 내 피페라실린의 농도에 미치는 영향을 보여준다. 상기 두 실험의 값은 다른 시간대에서의 평균적인 공장의 피페라실린 농도를 나타낸다. 상기 두 실험의 값은 다른 시간대에서의 평균적인 공장의 피페라실린 농도를 나타낸다. 실험 1에서 피페라실린 값은 피페라실린/타조박탐이 베타 락타마제 치료 없이 6시간 투여 간격으로 두 번 분리 투여된 후 달성된 공장의 피페라실린 농도를 나타내는 것이다. 개(비글종)은 실험 2에서 베타락타마제 치료와 동시에 피페라실린/타조박탐 복합물로 처치하였다.
상기 베타 락타마제를 사용하지 않은 실험 결과(실험 1)은 개(비글종)에서 피페라실린의 담즙제거가 암피실린 또는 아목실린의 제거보다 상당히 높은 것으로 나타났다. 그러나, 상기 베타 락타마제 처치는 공장의 피페라실린 농도를 모든 시간대에서 감소시켰다. 그러나, 피페라실린 농도는 상기 베타 락타마제 처치(실험 2) 전체를 통해 검측될 정도로 잔존하였다. 따라서, 상기에서 얻은 결과는 비경구 적 피페라실린/타조박탐 복합 치료 동안 베타 락타마제 치료(therapy)가 공장의 피페라실린을 제거할 수 있다는 것을 보여준다. 그러나 상기 장용 제피형 환 내 베타 락타마제의 양은 정량 한계치 미만의 공장 피페라실린 농도를 제거할 수 있는 정도의 복용량 제형(dosage formulation)을 달성할 수 있도록 증가되어야 한다.
상기 실험은 베타 락타마제 환의 단일회(single dose)가 약 체중 1kg당 활성 베타 락타마제 약 0.3mg 을 함유한 것, 페페라실린/타조박탐 복합물의 단일회에 체중 1kg당 피페라실린 65.6mg 및 타조박탐 9.4mg이 함유된 것을 제외하고는 반복되었다. 상기 실험결과는 도 5에 나타내었는데, 상기 도 5는 베타 락타마제가 공장의 피페라실린을 제거하는데에 매우 효과적이라는 점을 나타낸다.
참고문헌
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Claims (14)

  1. 베타 락탐 항생물질 및 베타 락타마제 억제제의 복합물로 처치하는 것과 관련된 장에서의 부작용을 저감하기 위한 치료제(medicament) 제조용 A류 베타 락타마제의 용도.
  2. 제1항에 있어서, 상기 A류 베타 락타마제는 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis) PenP인 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  3. 제1항에 있어서, 상기 베타 락탐 항생물질은 페니실린, 아미노페니실린, 유레이도페니실린 및 카르복시페니실린으로 이루어진 그룹에서 선택된 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  4. 제3항에 있어서, 상기 베타 락탐 항생물질은 페니실린 G, 암피실린, 아목실린, 피페라실린 및 티카르실린으로 이루어진 그룹에서 선택된 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  5. 제1항에 있어서, 상기 억제제는 상기 A류 베타 락타마제에 대한 억제제인 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  6. 제5항에 있어서, 상기 억제제는 설박탐, 클라불란산 및 타조박탐으로 이루어진 그룹에서 선택된 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 베타 락탐 항생물질 및 베타 락타마제 억제제의 복합물은 암피실린과 설박탐; 아목실린과 클라불란산; 피페라실린과 타조박탐; 및 티카르실린과 클라불란산;으로 이루어진 그룹에서 선택된 복합물인 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베타 락타마제는 바실러스 리케니포미스 749/C(ATCC 25972)에서 유래된 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베타 락타마제는 재조합 베타 락 타마제인 것으로, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 아밀로리쿠에파시엔스, 바실러스 푸물리스 또는 바실러스 리케니포미스에서 생산된 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 베타 락타마제는 경구용 의약 조성물로 제조되는 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  11. 제10항에 있어서, 상기 의약 조성물은 장용 제피형 조성물인 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  12. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 베타 락탐 항생물질 및 베타 락타마제 억제제는 비경구적으로 투여되는 것인 A류 베타 락타마제의 용도.
  13. A류 베타 락타마제의 유효량을 필요로 하는 대상체(환자 subject)에 투여하여, 베타 락탐 항생물질과 베라 락타마제 억제제의 복합물로 처치하는 것과 관련된 장에 서의 부작용을 저감시키는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 A류 베타 락타마제는 바실러스 리케니포미스 PenP인 것인 장에서의 부작용을 저감시키는 방법.
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