KR20100109099A

KR20100109099A - 암 특이 면역반응 유도능을 갖는 수지상 세포의 제조 방법,이 수지상 세포를 포함하는 암의 예방, 치료, 또는 전이 억제용 약제학적 조성물 및 키트

Info

Publication number: KR20100109099A
Application number: KR1020090027522A
Authority: KR
Inventors: 배용수; 민미경; 성영림; 장진아; 윤선옥
Original assignee: 주식회사 중외제약
Priority date: 2009-03-31
Filing date: 2009-03-31
Publication date: 2010-10-08

Abstract

본 발명은 암 특이면역반응 유도능력이 현저히 향상된 성숙 수지상세포의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 성숙 수지상세포를 포함하는 암의 예방, 치료 또는 전이 억제용 약제학적 조성물 및 상기 방법에 의해 제조된 성숙 수지상세포와 이미퀴모드를 포함하는 약제학적 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면 암 특이면역반응 유도능력이 현저히 향상되고, 독성이 매우 적은 안전한 성숙 수지상세포를 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 성숙 수지상세포는 암의 치료, 예방 및 전이억제 효과가 매우 뛰어나다. 본 발명의 약제학적 키트에 사용되는 이미퀴모드는 암특이적 성숙 수지상세포 투여에 의한 암의 면역 치료, 예방 효능 및 암 전이 억제 효능을 놀라울 정도로 향상시킨다.

자가유래, 성숙 수지상 세포, 간암 특이 항원, 이미퀴모드, 알다라크림, 간암, 세포성 면역반응

Description

암 특이 면역반응 유도능을 갖는 수지상 세포의 제조 방법, 이 수지상 세포를 포함하는 암의 예방, 치료, 또는 전이 억제용 약제학적 조성물 및 키트{Method for Preparing Dendritic Cells Having Potential to Induce Cancer Specific Immune Response, Pharmaceutical Composition and Kit for Treating or Preventing Cancer or Inhibiting Cancer Metastasis Comprising the Same}

본 발명은 암 특이 면역반응 유도능력이 향상된 성숙 수지상세포의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조된 성숙 수지상세포를 포함하는 암의 예방, 치료 또는 암 전이 억제용 약제학적 조성물, 및 상기 방법에 의해 제조된 성숙 수지상 세포와 면역보조제를 포함하는 약제학적 키트에 관한 것이다.

현재까지 알려진 암치료방법의 대부분은 수술, 항암제, 그리고 방사선 치료등이다. 그러나, 이러한 치료는 완치가 어려우며 많은 부작용이 수반된다. 특히, 전이암이나 재발암은 대부분의 경우 수술이 불가능하며, 화학적 치료제에 대한 저항을 보임으로써 치료의 한계를 나타낸다.

최근에는 수지상세포(Dendritic cells)와 같은 면역세포를 이용한 암 치료 요법에 대해서 연구 및 개발이 이루어지고 있다. 수지상세포는 식세포작용(phagocytosis) 혹은 흡수작용(pinocytosis)을 통해 외부항원을 포획하여 활성화된 후 항원특이적인 T 세포활성을 유도하며, 외부항원 포획 후 활성화 될 때 자체의 MHC(major histocompatibility complex) 분자 혹은 보조자극인자 (costimulatory factor)의 발현이 증가되어 세포성 면역을 유도하는 것으로 알려져 있다. 수지상세포가 세포성 면역을 유도하는 과정은 다음과 같다. 항원에 감작된 성숙 수지상세포는 i) 회귀 수용체(homing receptor)를 다량 발현하므로 2차 면역기관으로 이동하며, ii) 수지상세포 특이 C-C chemokine(DC-CK1)을 발현하여 미활성 상태의 T 세포(naive T cells)를 모이게 하며, iii) MHC에 제시된 항원과 T 세포 수용체(TCR)의 직접적인 상호작용을 통해 항원정보를 전달하여 iv) 항원 특이적인 T 세포의 활성을 유도한다.

한편, 간암은 세계에서 5 번째 고빈도로 발병하는 예후가 불량한 암에 속한다. 현재 사용되는 치료법은 주로 간절제술 및 간이식과 같은 외과적 요법과 고주파 열치료술(Readiofrequency ablation), 국소적 알코올 주입술(percutaneous ethanol injection) 및 간동맥 화학색전술(transarterial chemoembolization)과 같은 비외과적 요법으로 대별된다. 이러한 치료방법은 간암의 병기, 간기능 및 환자의 활동도에 따라 선택된다. 간세포암을 유발하는 원인으로써 HBV, HCV 와 같은 간염바이러스, 아플라톡신과 같은 독소, 알코올 과다섭취 및 약물 오남용 등이 있으며, 지역적으로는 한국, 중국, 일본을 포함하는 동아시아에서 빈발한다. 간암의 진행단계는 20-40 여년에 걸쳐 주로 바이러스, 알코올 등에 의한 만성 간염이 진행되어 간경화가 발생하고, 이어서 간암이 진행되게 된다. 이러한 간암 치료에 있어서 문제점은 국소적 재발, 간내 재발 및 전이의 발생이다. 이러한 문제를 해결하기 위한 대안으로써 전신적인 간암치료제 개발 및 면역치료가 대두되고 있다. 최근에 이르러 간암치료제 개발은 주로 표적치료제 및 인간화항체 치료제를 중심으로 다른 암종에서 허가를 받은 후 적응증을 확대하는 방식으로 진행된다. 면역치료의 경우는 국제적 가이드라인에 따라 주로 진행성 간암에 대해 평가되어왔다. 1990년도에서 현재에 이르기까지 간세포암에 대한 면역치료의 임상연구는 다음과 같은 전략으로 분류될 수 있다(1). ⅰ) 사이토카인 기반 임상시험을 통한 면역세포의 비특이적인 활성화 유도, ⅱ) 세포기반 임상시험으로서 자가유래 수지상세포, 사이토카인으로 유도된 말초혈액세포 (cytokine induced PBL), TIL (tumor infilterated lymphocyte) 적용 등, ⅲ) 인간화항체 기반 임상시험, ⅳ) 자가유래 암세포 백신(autologous tumor cell vaccine), v) 펩타이드 백신 등이다.

일반적으로 전구세포로부터 성숙화 수지상 세포 백신을 제작하는 과정은 크게 두 단계로 나누어진다. 제 1 단계 배양은 여러 혈액 유래의 세포로부터 미성숙 수지상 세포로 분화를 유도하는 배양으로서 분화 유도 물질 (사이토카인 또는 다른 세포-분화 촉진제)을 처리하여 배양 최종일에 미성숙 수지상 세포로서 수확하는 것이다. 제 2 단계 배양은 이러한 미성숙 수지상 세포에 암 또는 병원균-특이 항원 처리를 하는 배양으로서 항원과 함께 수지상 세포 성숙화 인자를 배양액에 첨가함으로써 항원 특이 면역 유도성을 취득한 백신으로서 성숙된 수지상 세포를 수확하 는 것이다. 상기 수지상 세포 성숙화 인자는 일반적으로 임상 연구자의 선택에 따라 다르지만 대체로 특정 조성의 사이토카인 칵테일 (cytokine cocktail) 또는 비특정 조성의 활성 단핵구 배양액 (MCM: monocyte-conditioned medium, 3) 등이 많이 사용되고 있다. 이외에도 전구세포 분리과정 없이 수지상 세포를 생체로부터 직접 분리하여 항원 감작을 통한 체외 활성화 단계(ex vivo conditioning)를 통해 백신으로 사용될 수도 있다.

수지상세포를 이용한 면역치료의 임상연구에 있어서 암 특이적 면역반응을 활성화시키기 위해 주로 종양 용해물(tumor lysate) 혹은 암 특이 항원 등이 수지상세포의 감작화에 사용되고 있다(2). 항원 단백질에 의한 보다 효과적인 수지상 세포의 성숙을 위해서 세포 표면 표적화 방법 혹은 막투과성 펩타이드(membrane translocating peptide)의 융합을 통해 이러한 문제를 극복하는 연구가 진행되어왔다(3). 이러한 측면에서 HIV-1 TAT 단백질의 PTD (protein translocating domain, YGRKKRRQRRR)에 대한 연구가 있었다(4). 한편, PTD로부터 유래되어 막투과성을 가지지만, 변경된 구조에 의하여 핵으로 이동하지 않고 세포질내에 잔류하는 일련의 CTP (cytoplasmic transduction peptide) 후보가 제작되었다(WO 2003-097671, 5).

이미퀴모드(1-(2-methylpropyl)-1H-imidazo[4,5-c]quinolin-4-amine)는 면역반응조절제(immune response modifier)로서 사용되는 화합물이다. 이미퀴모드의 작용 메카니즘은 명확히 밝혀져 있지 않으나, 이미퀴모드가 병원체의 인지에 관여하는 세포 표면 수용체인 TLR(toll-like receptor)-7 에 결합하여 면역세포들을 활성화시킨다고 알려져 있다(6). TLR-7을 통해 이미퀴모드에 의해 활성화된 세포들 은 인터페론-알파(interferon-α), 인터류킨(interleukin)-6 및 TNF( tumor necrosis factor)-α등의 사이토카인을 분비한다(7). 이미퀴모드를 피부에 적용하는 경우 랑게르한스 세포(Langerhans cells)를 활성화시키게 되고 이들 세포는 국부의 림프노드로 이동하여 후천적 면역 시스템을 활성화시키된다. 이미퀴모드에 의해 활성화되는 다른 세포들로는 자연살해세포(natural killer cells), 대식세포(macrophages) 및 B-림프구(B-lymphocytes)가 있다(8). 최근 새로운 연구결과에 의하면, 이미퀴모드의 항-세포증식효과(anti-proliferation effect)는 면역 시스템 활성화와는 전혀 다른 메카니즘에 의해 발생되는 것으로 밝혀지고 있는데 이러한 효과는 OGFr(opioid growth factor receptor)의 수준을 증가시킴으로써 발생된다. siRNA 기술에 의해 OGFr 기능을 차단하면 이미퀴모드의 항-세포증식 효과도 사라진다(9). 이미퀴모드는 전신 투여시의 부작용 때문에 주로 크림 형태로 국소 투여용으로 사용되고 있으며, 알다라(Aldara)라는 상표명으로 시판되고 있는 이미퀴모드 5％ 크림은 1997년 미국 FDA에서 노인성 각화증 (actinic keratosis), 표피기저세포암(superficial basal cell carcinoma), 외부생식기사마귀(external genital warts) 등의 치료제로 승인되어 치료용 의약품으로 사용되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 암 치료용 수지상세포 치료제를 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과 미성숙 수지상세포를 펩타이드 YGRRARRRRRR와 융합된 암 특이항원 단백질의 존재하에서 성숙화시켜 제조한 성숙 수지상세포가 우수한 암 특이 면역반응 유도능력을 가져 암의 예방, 치료 효능 및 암 전이 억제 효능을 가짐을 확인하였고, 상기 성숙 수지상세포 치료제 투여 시에 이미퀴모드(imiquimod)를 면역 보조제로서 병용하게 되면 암의 면역 치료, 예방 또는 전이 억제 효능을 매우 우수하게 증대시킬 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 우수한 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포의 제조방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 또는 암의 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포와 이미퀴모드를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 또는 암의 전이 억제용 약제학적 키트를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법 또는 암의 전이 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 목적은 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포와 이미퀴모드를 병용 처치하는 단계를 포함하는 암의 치료 또는 예방 방법 또는 암의 전이 억제 방법을 제공한다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포의 제조 방법을 제공한다: (a) 미성숙 수지상 세포를 펩타이드 YGRRARRRRRR와 융합된 암 특이 항원 단백질에 감작하여 성숙화 시키는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 성숙화된 수지상세포를 분리하는 단계.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 전이 억제용 약 제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포를 포함하는 약제학적 조성물; 및 (b) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약제학적 키트를 제공한다.

[화학식 1]

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 상기 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포를 포함하는 약제학적 조성물; 및 (b) 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 포함하는 암의 전이 억제용 약제학적 키트를 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계를 포함하는 수지상세포를 이용한 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪 는 수용자에게 투여하는 단계를 포함하는 수지상세포를 이용한 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 수지상세포를 이용한 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다: (a) 상기 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계; 및 (b) 성숙 수지상세포를 투여한 부위에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 적용하는 단계; 또는 (a′) 성숙 수지상세포를 투여하려는 암을 겪는 수용자의 투여 부위에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 적용하는 단계; 및 (b′) 상기 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 다음의 단계를 포함하는 수지상세포를 이용한 암 전이를 억제하는 방법을 제공한다: (a) 상기 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계; 및 (b) 성숙 수지상세포를 투여한 부위에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 적용하는 단계; 또는 (a′) 성숙 수지상세포를 투여하려는 암을 겪는 수용자의 투여 부위에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 적용하는 단계; 및 (b′) 상기 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계.

이하에서 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포의 제조 방법을 제공한다: (a) 미성숙 수지상 세포를 펩타이드 YGRRARRRRRR와 융합된 암 특이 항원 단백질에 감작하여 성숙화 시키는 단계; 및 (b) 상기 단계 (a)의 성숙화된 수지상세포를 분리하는 단계.

본 명세서에서 용어 "수지상세포(dendritic cell)"는 MHC (major histocompatibility complex)를 통하여 T 세포에 항원을 제시할 수 있는 전문적 항원제시세포를 의미한다.

본 명세서에서 용어 "성숙 수지상세포 (mature dendritic cell)"는 미성숙 수지상세포를 엑스 비보(ex vivo)에서 항원 감작시킨 후 적합한 사이토카인 등으로 성숙 분화시킨 것을 의미한다. 이하에서 수지상 세포는 필요에 따라 "DC" 로, 성숙 수지상 세포는 "mDC"로 기재한다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, 암 특이 면역반응 유도 능력을 갖는 자가 유래 성숙 수지상 세포는 미성숙 수지상세포를 암 특이 항원의 존재하에 성숙화 유도 배양하여 제조할 수 있다. 미성숙 수지상세포는 인간의 기관, 조직, 골수 또는 혈액에 존재하는 전구세포를 분화 유도하여 제조할 수도 있고, 생체로부터 직접 분리할 수도 있다. 본 발명에서 이용되는 수지상 세포는 바람직하게는 골수성 수지상 세포 (myeloid DC)이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 미성숙 수지상 세포는 수 지상세포의 전구세포를 적합한 사이토카인의 존재 하에서 미성숙 단계까지 분화시켜 얻는다. 미성숙 분화에 사용되는 적합한 사이토카인은 예를 들어 GM-CSF (Granulocyte macrophage colony stimulating factor)와 IL (Interleukin)-4, 또는 GM-CSF와 IL-13 또는 GM-CSF와 IL-7를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 가장 보편적으로 이용되는 사이토카인은 GM-CSF 와 IL-4 의 혼합물이다. 첨가되는 사이토카인의 적합한 양은 수지상 세포로의 분화를 하는 데 충분한 양으로서 각 연구자의 실험실에서 최적화 실험을 통하여 정해질 수 있으며, 일반적으로 각기 100 U/㎖-1000 U/㎖ 농도 범위내에서 다양하게 적용되고 있다.

수지상 세포의 전구세포의 미성숙 수지상세포로의 분화 유도에 이용되는 배지는 동물세포의 배양에 이용되는 일반적인 배지를 사용할 수 있다. 바람직하게는, 혈청(예컨대, 우태아 혈청, 말 혈청 및 인간 혈청)이 함유된 배지이다. 본 발명에서 이용될 수 있는 배지는, 예를 들어, RPMI 시리즈(예컨대, RPMI 1640), Eagles's MEM (Eagle's minimum essential medium, Eagle, H. Science 130:432(1959)), α-MEM (Stanner, C.P. et al., Nat. New Biol. 230:52(1971)), Iscove's MEM (Iscove, N. et al., J. Exp. Med. 147:923(1978)), 199 배지 (Morgan et al., Proc. Soc. Exp. Bio. Med. 73:1(1950)), CMRL 1066, RPMI 1640 (Moore et al., J. Amer. Med. Assoc. 199:519(1967)), F12 (Ham, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53:288(1965)), F10 (Ham, R.G. Exp. Cell Res. 29:515(1963)), DMEM (Dulbecco's modification of Eagle's medium, Dulbecco, R. et al., Virology 8:396(1959)), DMEM과 F12의 혼합물(Barnes, D. et al., Anal. Biochem. 102:255(1980)), Way-mouth's MB752/1 (Waymouth, C. J. Natl. Cancer Inst. 22:1003(1959)), McCoy's 5A (McCoy, T.A., et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 100:115(1959)) 및 MCDB 시리즈(Ham, R.G. et al., In Vitro 14:11(1978))를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 배지에는, 다른 성분, 예를 들어, 항산화제(예컨대, β-머캅토에탄올)가 포함될 수 있다. 배지 및 배양에 대한 일반적인 설명은 R. Ian Freshney, Culture of Animal Cells, Alan R. Liss, Inc., New York (1984)에 기재되어 있으며, 이 문헌은 본 명세서에 참조로서 삽입된다.

본 발명에서 이용되는 성숙 수지상세포는 미성숙 수지상세포를 펩타이드 YGRRARRRRRR와 융합된 적합한 암 특이항원 단백질과 사이토카인의 존재 하에 배양 및 성숙화 유도시켜 얻는다. 본 발명에서 미성숙 수지상세포의 성숙화 유도에 적합한 사이토카인은 예를 들어 TNF (Tumor necrosis factor)-α, IFN (Interferon)-γ, IL-1β, IL-6, PGE2 (Prostaglandin E2) 이거나 이들의 혼합물 형태일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 수지상 세포의 성숙화 유도를 위해 배지에 Poly I:C (polyinosinic:polycytidylic acid)가 더 추가될 수 있다. 또한, CpG, SAC (inactivated Staphylococcus aureus), SEB (Staphylococcal enterotoxin B) 또는 LPS (lipopolysaccharide)와 같은 세균 유래 물질로 자극을 강화할 수도 있다.

성숙화에서 사용될 수 있는 배지는, 수지상세포의 전구세포의 미성숙 분화 유도에 이용되는 배지를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명의 성숙화 유도 시에 사용되는 암 항원은 간암 특이항원이다.

본 발명의 성숙 수지상 세포는 미성숙 수지상 세포를 펩타이드 YGRRARRRRRR와 융합된 간암 특이항원 단백질의 존재 하에 성숙화시켜 얻은 세포로서, 간암 특이적 면역반응 유도 능력을 갖는다.

본 발명에서 사용될 수 있는 간암 특이항원 단백질은 예를 들어 펩타이드 YGRRARRRRRR와 융합된 AFP (Alpha-Fetoprotein), GPC 3 (Glypican-3), MAGE 1 (Melanoma Associated Gene Family A1), NY-ESO-1(cancer/testis antigen), Aurora-A (serine/threonine protein kinase involved in centrosome formation during mitosis), 및 Gankyrin (liver-specific oncoprotein involved in cell cycle regulation)를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 간암 특이항원 단백질은 펩타이드 YGRRARRRRRR와 융합된 AFP, GPC 3 또는 MAGE 1이고, 보다 바람직하게는 펩타이드 YGRRARRRRRR와 융합된 서열목록 제 1 서열의 AFP 아미노산 서열 중 20-346 서열, 서열목록 제 2 서열의 GPC 3아미노산 서열 중 33-358 서열, 또는 서열목록 제 3 서열의 MAGE1 아미노산 서열이다.

본 발명에서 사용된 펩타이드 YGRRARRRRRR는 암 항원 단백질의 N 말단 또는 C 말단에 융합될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 펩타이드가 암 항원 단백질의 N 말단에 태깅(tagging)된 융합 단백질을 성숙화 배양 시에 사용할 경우 역가가 향상된 수지상세포 백신을 제조할 수 있다.

본 발명은 (a) 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포의 약제 학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 성숙 수지상세포는 상기 설명된 본 발명의 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 제조된 세포이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 암은 간암이다.

본 발명의 성숙 수지상세포의 제조방법에서 설명된 바와 같이 미성숙 수지상세포를 펩타이드 YGRRARRRRRR 와 융합된 간암 특이항원 단백질 존재 하에 성숙화시켜 얻은 성숙 수지상세포는 간암특이항원이 세포의 표면에 제시된 상태로서 휴지상태의 CD4⁺ T 세포를 Th1 세포로 분화시키고 또한 휴지상태의 CD8⁺ T 세포를 활성화된 세포 독성 세포 (CTL)로 분화시킴으로써 간암세포에 대한 특이적 세포면역반응(cell immunity)을 유도할 수 있다. 따라서, 상기 설명된 본 발명의 방법에 의해 제조된 펩타이드 YGRRARRRRRR 와 융합된 간암 특이항원 단백질에 감작된 성숙 수지상 세포는 간암의 면역 치료 또는 예방에 매우 효과적이다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 사용될 수 있는 성숙 수지상세포는 수용자의 미성숙 수지상 세포로부터 유래한 자가 유래 (autologous) 또는 동종유래 (allogenic)의 수지상 세포이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 수지상 세포는 자가유래 수지상 세포이다. 자가유래 수지상세포는 수용자의 세포에서 유래한 것이므로 수용자에게 치료 또는 예방 목적으로 투여할 시 면역거부 반응의 문제가 없고 안전하다는 이점이 있다.

본 발명은 (a) 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

상기 설명된 본 발명의 방법에 의해 제조된 펩타이드 YGRRARRRRRR와 융합된 암 특이항원 단백질에 감작된 성숙 수지상세포는 암의 치료 또는 예방 뿐만 아니라 놀랍게도 암의 전이 억제에도 매우 효과적으로 사용될 수 있다. 또한 독성이 매우 적어 안전한 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 간암의 전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 본 발명은 간암의 폐전이 억제용 약제학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 약제학적 조성물에서 사용될 수 있는 성숙 수지상세포는 수용자의 미성숙 수지상 세포로부터 유래한 자가 유래 (autologous) 또는 동종유래 (allogenic)의 수지상 세포이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 수지상 세포는 자가유래 수지상 세포이다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구로 투여된다. 비경구로 투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물은 적용되는 질환의 종류에 따라, 투여 경로가 결정되는 것이 바람직하다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 10³- 1 x 10⁸cells/kg (체중)이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

본 발명은 (a) 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포를 포함하는 약제학적 조성물; 및 (b) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성 물을 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약제학적 키트(pharmaceutical kit)를 제공한다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 화합물은 1-(2-메틸프로필)-1H-이미다졸[4,5-c]퀴놀린-4-아민이며, "이미퀴모드(imiquimod)" 라고도 불리운다.

상기 "이미퀴모드"를 함유하는 조성물은 본 발명의 성숙 수지상 세포를 포함하는 약제학적 조성물과 병용 투여되어 수지상 세포에 의한 암의 면역 치료 또는 면역 예방 효능을 현저히 향상시킨다.

화학식 1의 화합물 함유 조성물에서 상기 화합물의 함유량은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 화학식 1의 화합물 함유 조성물 대비 1-10 중량％, 보다 바람직하게는 3-7 중량％이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 화학식 1 화합물 함유 조성물은 피부적용 형태의 제형을 가지며, 가장 바람직하게는 크림(cream) 형태이다. 크림 형태 의 이미퀴모드 함유 조성물은 유효성분인 이미퀴모드 화합물 이외에 이소스테아르산, 세틸 알코올, 스테아릴 알코올, 백색페트롤라툼, 폴리소르베이트 60, 소르비탄 모노스테아레이트, 글리세린, 잔탄 검, 정제수, 벤질 알코올, 메틸파라벤, 프로필파라벤 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 화학식 1 화합물 함유 조성물의 투여 방식은 특별히 한정되지 않으나, 본 발명의 바람직한 구현예에 의하면 수지상 세포의 투여 부위에 도포하는 방식으로 적용한다.

본 발명은 (a) 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포를 포함하는 약제학적 조성물; 및 (b) 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 포함하는 암의 전이 억제용 약제학적 키트를 제공한다.

화학식 1의 화합물 함유 조성물은 상기 설명한 성숙 수지상 세포를 포함하는 약제학적 조성물과 병용 투여되어 놀랍게도 암의 전이를 현저히 억제한다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 암의 전이는 간암의 전이이다.

본 발명의 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 간암의 전이는 간암의 폐 전이이다.

본 발명의 방법에서 암 특이항원에 감작시킨 자가 유래 성숙 수지상 세포를 수용자에 투여한 후 또는 투여하기 전에, 투여 부위에 상기 화학식 1의 화합물 함 유 조성물을 적용한다.

본 발명의 방법에서 화학식 1 화합물 함유 조성물의 적용 방식은 특별히 한정되지 않으며 바람직하게는 자가유래 성숙 수지상 세포를 투여하는 피부에 도포하여 적용할 수 있고, 적용 횟수는 1회 뿐만 아니라 적합한 횟수로 2회 이상 다수 회 도포할 수 있다.

본 발명의 방법에서 자가유래 수지상 세포 함유 조성물과 화학식 1 화합물 함유 조성물의 병용 사용 대상인 수용자는 동물, 바람직하게는 포유동물이며, 보다 바람직하게는 인간이다.

상기 본 발명의 암의 치료 또는 예방용 약제학적 키트 또는 암 전이 억제용 약제학적 키트에 사용될 수 있는 성숙 수지상세포는 수용자의 미성숙 수지상 세포로부터 유래한 자가 유래 (autologous) 또는 동종유래 (allogenic)의 수지상 세포이다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 수지상 세포는 자가유래 수지상 세포이다.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 수지상세포를 이용한 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다: (a) 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계; 및 (b) 성숙 수지상세포를 투여한 부위에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 적용하는 단계; 또는 (a′) 성숙 수지상세포를 투여하려는 암을 겪는 수용자의 투여 부위에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 적용하는 단계; 및 (b′) 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계.

본 발명은 다음의 단계를 포함하는 수지상세포를 이용한 암 전이를 억제하는 방법을 제공한다: (a) 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계; 및 (b) 성숙 수지상세포를 투여한 부위에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 적용하는 단계; 또는 (a′) 성숙 수지상세포를 투여하려는 암을 겪는 수용자의 투여 부위에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 적용하는 단계; 및 (b′) 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계.

본 발명의 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, 상기 간암의 전이는 간암의 폐전이이다.

본 발명은 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계를 포함하는 수지상세포를 이용한 암의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 의하면, 상기 성숙 수지상세포는 상기 설명된 본 발명의 성숙 수지상세포의 제조 방법에 의해 제조된 것이다.

본 발명은 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 암을 겪는 수용자에게 투여하는 단계를 포함하는 수지상세포를 이용한 암의 전이를 억제하는 방법을 제공한다.

상기 본 발명의 암의 치료 또는 예방 방법 또는 암의 전이를 억제하는 방법에서 사용되는 성숙 수지상세포는 바람직하게는 자가 유래 수지상 세포이다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다.

(i) 본 발명의 성숙 수지상세포의 제조방법에 의해 현저히 향상된 암 특이면역반응 유도능력을 갖으며, 독성이 매우 적어 안전한 수지상세포를 제조할 수 있다.

(ii) 본 발명은 암 특이면역반응 유도능력을 갖는 수지상세포의 암, 특히 간암의 치료, 예방 또는 암 전이 억제 용도를 제공한다.

(iii) 본 발명의 약제학적 키트는 성숙 수지상 세포에 의한 면역치료에 이미퀴모드의 병용 치료의 용도를 제시한다.

(iv) 본 발명의 약제학적 키트에서 이미퀴모드의 병용 처리는 수지상세포 투여에 의한 암의 면역 치료, 예방 효능 및 암 전이 억제 효능을 놀랍게 향상시킨다.

본 발명의 성숙 수지상세포의 제조방법에 의하면 암 특이면역반응 유도능력이 현저히 향상된 성숙 수지상세포를 제조할 수 있다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 성숙 수지상세포는 암의 치료, 예방 및 전이억제 효과가 매우 뛰어날뿐만 아니라, 독성이 매우 적어 안전하다. 본 발명의 약제학적 키트에 사용되는 이미퀴모드와 본 발명의 성숙 수지상세포를 포함하는 약제학적 조성물의 병용 투여는 암의 면역 치료, 예방 효능 및 암의 전이 억제를 놀라울 정도로 향상시킨다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험 재료 및 방법

실시예 1-1: 재조합 항원 단백질의 제조

인간 유래 간암 세포주 및 유방암 세포주인 HepG2, SK-BR-3으로부터 cDNA를 합성하여 간암 특이 항원인 AFP (alpha-fetoprotein)와 MAGE 1 (melanoma associated gene family A1), GPC 3 (glypican3)를 클로닝하였다.

발현부위는 AFP의 경우 서열목록 제 1 서열에 개시된 전장 아미노산 서열 중 20-346 아미노산 서열, GPC 3의 경우 서열목록 제 2 서열에 개시된 전장 아미노산 서열 중 33-358 아미노산 서열을 선택하였고, MAGE 1의 경우는 서열목록 제 3 서열에 개시된 전장 아미노산 서열을 선택하였다. 또한, 펩타이드 YGRRARRRRRR을 상기 선택한 단백질에 융합시킨 항원 단백질을 사용하였다.

YGRRARRRRRR 펩타이드-융합 발현벡터에 합성한 항원 cDNA를 클로닝한 후, 대장균 발현균주인 BL21-DE3에 형질전환시키고, YGRRARRRRRR 펩타이드-융합 항원 단백질을 안정적으로 발현하는 형질전환체를 선별하였다. 각 융합항원을 발현하는 형질전환 균주를 엠피실린을 포함하는 LB 배지에서 배양하면서, 0.1-0.5 mM IPTG (isopropylthio-β-D-galactoside; Sigma사)을 첨가하여 각 융합 단백질의 발현을 유도하였다. 균주 배양액을 원심분리하여 균체를 회수한 후, 초음파 파쇄 및 원심분리 과정을 통해 균체로부터 봉입체(inculsion body) 형태의 재조합 항원 단백질을 얻었다. 얻은 단백질을 세정 완충액 (50mM Tris, 100mM NaCl, 0.05％ Triton X-100, pH 8.0)으로 수회 세정하여 엔도톡신 (endotoxin)을 최대한 제거하였다. 이어서, 6M Gn-HCl 용액 (6M Guanidin-HCl, 100mM NaCl, 50mM Tris, pH8.0)을 첨가하여, 봉입체(inclusion body)를 충분히 용해시켰다. 재조합 단백질에 존재하는 His-tag을 이용한 단백질의 분리를 위해 Ni-NTA agarose affinity column을 사용하였다. 단백질의 용출은 이미다졸(imidazole) 농도 구배(100mM-1M)를 이용하였으며, 분리된 단백질은 Gel filteration column(Hiprep^TM 16/60 sephacryl^TM S-100 HR, Amersham-Pharmacia)을 통해 추가 정제하였다. 이어서, PBS를 이용한 투석을 통해 이미다졸(imidazole) 및 용출용액에 포함되었던 우레아(urea)를 제거하였다. 정제한 단백질을 Ultra-filteration (Vivaspin 20, Satorius co.)을 사용하여 적정 농도로 농축하였으며, 농축한 단백질을 적정량으로 분주하여 -80℃에 보관하였다. 정제한 단백질의 확인을 위해 SDS-PAGE 분석을 통해 해당 단백질 밴드를 확인하였으며, 항-His 항체(Qiagene)를 이용한 웨스턴 블롯(Western blot)을 통해 정제한 단백질이 항-His 항체에 특이적으로 반응하는 것을 확인하였다(도 1 참조).

실시예 1-2: 인간유래 간암항원을 발현하는 종양 세포주의 준비

간암 마우스모델에 사용하는 종양 세포주로서, 인간 AFP, MAGE 1, GPC 3를 안정적으로 발현하도록 진핵세포 발현벡터(pcDNA3.1, Invitrogen사)를 통해 형질전환된 C3H 마우스 계열과 동종의 간암세포주 MH134 세포주를 사용하였다.

실시예 1-3: 수지상 세포의 제조를 위한 골수세포(미성숙 수지상세포의 전구세포)의 분리

마우스(C3H 계) 골수 세포 (bone marrow cell)는 대퇴골과 경골로부터 얻었다. 대퇴골과 경골을 얻기 위해서 먼저 마우스를 경추 탈구법에 의해 희생시키고 70％ 에탄올을 이용하여 수술 부위를 소독하였다. 대퇴골과 경골을 분리하여 70％ 에탄올에 약 30초간 담구어 소독하고 인산염 완충 용액(phosphate buffered saline: PBS)에 세척하여 RPMI-1640 배지에 담가 두었다. 멸균된 수술용 가위를 이용하여 대퇴골과 경골의 양쪽 끝을 절단하고 1 cc 주사기에 RPMI-1640 배지를 넣 어 절단된 부위에 바늘끝을 삽입하여 밀어낸 후 50 ㎖ 튜브에 받아 골수세포를 모았다. 모은 세포들을 원심분리하여 골수세포를 1회 세척하고 골수세포내 포함된 적혈구를 제거하였다. 적혈구 제거 후, 2 회 원심분리하여 세척시킨 후에 다음 실험에 이용할 때까지 얼음에 보관하였다.

실시예 1-4: 미성숙 수지상세포로의 분화 유도 배양

미성숙 수지상세포로의 분화를 위한 배지로서 10％ FBS(fetal bovine serum; Life technologies)를 포함하는 RPMI-1640 배지에 10 ng/㎖의 마우스 재조합 인터루킨-4 (mouse recombinant interluekin-4, mrIL-4; CreaGene INC.)와 10 ng/㎖의 마우스 재조합 대식세포/과립구 콜로니 성장 촉진 인자(mouse recombinant granulocyte/macrophage colony stimulatory factor, mrGM-CSF; CreaGene INC.)가 첨가된 배지를 이용하여 37℃ CO₂ 배양기에서 위에서 분리한 골수세포(미성숙 수지상세포의 전구세포)를 2 일간 배양하였다. 수지상세포의 전구세포는 바닥에 붙어 자라는 흡착성 성질(plastic adherence)을 가지므로, 2 일간 배양한 후에 비흡착성 세포를 흡착성 세포로부터 분리함으로써 수지상 세포의 전구세포를 비-전구세포로부터 분리해 내었다. 비흡착성 세포를 제거한 후, 다시 동일한 수지상 세포 분화 배지를 2 ㎖ 채워준 후에 수지상 세포 분화 배양을 수행하였다. 이때 2-3 일에 한 번씩 배지의 일부를 교환하여 수지상 세포의 분화에 필요한 사이토카인이 결핍되지 않도록 하였다. 미성숙 수지상 세포는 6-7 일째에 얻었다.

실시예 1-5: 항원특이적 성숙 수지상세포를 위한 항원처리 및 성숙화 유도배양

미성숙 수지상세포에 적정농도의 YGRRARRRRRR 펩타이드-융합된 각각의 간암 특이 항원 단백질로 처리 후 4 시간 시점에 성숙화 배지를 첨가하였다. 성숙화에 사용되는 배지는 수지상세포 분화배지에 마우스 재조합 인터페론-감마 (mouse recombinant interferon (IFN)-γ; Endogen)와 마우스 재조합 종양괴사인자-알파 (mouse recombinant tumor necrosis factor (TNF)-α; Endogen), 그리고 polyI:C (Sigma사)가 더 첨가된 조성이었다. 6-7 일째에 마우스 수지상 세포의 분화배지를 항원이 일정농도로 첨가된 성숙화 배지로 교체하고 CO₂배양기에서 수지상세포 성숙화 배양을 수행하였다. 최종 산물인 성숙 수지상세포는 바닥에 붙지 않는 비흡착성 세포로서 제조 최종일에 비흡착성의 부유 세포를 수확하여 얻었다. 성숙화된 수지상세포는 인산염 용액을 이용하여 3회 세척 후 다음 실험에 이용하였다.

성숙화된 수지상세포의 성숙화 정도는 세포 크기, 과립성 및 CD11c, CD40, CD54, CD80, CD86, Class II의 발현 여부를 통해 판단하였고, 수지상 세포의 순도는 CD14의 발현여부로 확인하였다. 수지상세포의 표면 항원 발현은 유세포 형광측정기를 통해 분석하였다.

실시예 2-1: 실험 동물

실험 동물은 한국 Orient-Bio사 또는 일본 Charles River사로부터 6주령 암 컷 C3H 마우스를 공급받아 실험에 사용하였다. 동물을 수용하는 사육 케이지는 마우스용 폴리카보네이트 케이지를 사용하였으며, 사육 케이지당 4 마리씩 수용하였다. 실험기간 동안 설치류 사료와 고압증기 멸균된 증류수를 자유 섭취시켰다. 사육환경은 온도 20.0 - 24.3℃, 습도 36.9 - 67.4％, 환기횟수는 시간 당 12 - 15회 및 12 시간 자동 조명 (조명 : 08:00 - 20:00, 조도 150 - 300 lux)으로 유지하였다. 각 동물의 개체 식별은 귀 표식법으로 하였으며, 각 케이지에 개체 식별카드를 부착하고 실험군, 동물번호를 표시하여 구분하였다.

실시예 2-2: 인간유래 간암항원을 발현하는 세포주에 의한 고형암 형성 및 암 전이 유도

각기 인간 AFP 또는 인간 MAGE 1, 인간 GPC 3을 안정적으로 발현하는 세포주 (이하 MH134/AFP 또는 MH134/MAGE 1, MH134/GPC 3로 표기)를 10％ FBS와 400 μg/㎖의 G418이 첨가된 RPMI-1640 배지를 이용하여 100 mm 플레이트에서 배양/유지하였다. 2-3 차례 계대 배양 후 실험 전날 새로운 배지로 갈아주어 세포의 생존률을 최적화 하였다. 생리식염수 주사액으로 세포를 현탁시키고 살아있는 세포의 수가 1.5 X 10⁵/100㎕가 되도록 조정하여 1 cc 주사기에 흡입시켜 간암 항원 발현 세포주 주사제를 준비하였다. 마우스 개체의 주사할 부위 피부를 알코올 솜으로 소독하였고 마우스의 좌측 등배부의 피하 조직에 주사바늘이 약 45ㅀ 각도가 되도록 삽입하고 간암 세포주를 주사하였다. 간암 항원 발현 세포주가 주사된 시점으로부터 2-3 일 간격으로 고형암 형성 유무를 관찰하였으며, 고형암의 크기는 캘리퍼스(Caliper)를 사용하여 측정하고, 장축 X 단축² X 0.52 계산식에 따라 크기를 환산하였다. 그리고 암 전이를 유도하는 개체의 경우에서는 보정기를 이용하여 마우스를 고정시키고 질식사가 발생하지 않도록 어느 정도 움직일 수 있게 하였다. 알코올 솜을 이용하여 꼬리 전체를 아래로 쓸어주며 소독을 실시하였다. 주사침을 찌를 부위의 정맥이 위로 향하게 하여 고정하고 간암 항원 발현 세포주가 들어 있는 주사제 (0.75 X 10⁵/100μl)를 15°이내의 각도를 유지하여 꼬리의 정맥 내로 삽입시키고 주사침과 정맥이 평행이 유지되도록 하여 내용물을 삽입하였다. 주사 완료 후 약 10초 간 지혈을 유지하고 마우스의 상태를 확인한 후 케이지에 넣었다. 각 실험군과 표식을 확인하고 다음 실험을 진행하였다.

실험예 1: 항원 특이적 성숙 수지상세포 및/또는 이미퀴모드 처리에 의한 예방 또는 방어면역유도

실시예 1-5에서 제조된 간암항원 재조합 단백질을 감작시켜 성숙된 수지상 세포를 멸균 PBS 용액에 현탁시키고 살아 있는 수지상세포의 수가 1 X 10⁶/100㎕ 가 되도록 하였다. 실험군에 따라 상기 수지상세포 현탁액 혹은 PBS 용액 100 ㎕ 를 1회 투여량으로 정하고 1 주에 한번 씩 2 회에 걸쳐 마우스의 오른쪽 등배부(right flank) 에 투여하였다. 이 때 마우스는 수지상세포 투여 2-3 일 전 면도기를 사용하여 제모하였다. 알다라 크림 (5％ 이미퀴모드 크림, iNOVA Pharmaceuticals)을 도포할 경우에는 수지상 세포 혹은 PBS 를 투여하기 전날, 투여 당일, 투여 다음날에 걸쳐 일정량의 알다라 크림을 취하여 수지상세포 혹은 PBS 용액이 투여된 부위에 30 초간 문질러 도포하였다. 수지상 세포 혹은 PBS 최종 투여 1 주일 후에, 실시예 2-2 와 같이 PBS 에 현탁된 적정량의 간암 항원 발현 세포주(MH134/AFP, MH134/MAGE 1, MH134/GPC 3) 혼합액(1.5 X 10⁵cells/100㎕)를 수지상세포가 투여된 반대편 등배부에 피하주사하였다. 상기와 같이 구축된 고형암 예방 혹은 방어모델에서 항원 특이적 성숙 수지상세포 및/또는 이미퀴모드 병용처리에 의한 항암효과를 조사하였다.

실험군으로는 항원특이적 성숙수지상 세포 단독 투여군(Ag-DC, n=8), 알다라크림 단독 투여군(PBS + 알다라 크림, n=8) 및 항원 특이적 성숙수지상 세포 + 알다라 크림 병용 투여군(Ag-DC + 알다라 크림, n=8) 이며, 대조군은 PBS 용액 투여군 이다.

실험예 2: 항원 특이적 성숙 수지상세포 및/또는 이미퀴모드 처리에 의한 치료면역유도

먼저, 실시예 2-2 와 같이 PBS 에 현탁된 적정량의 간암 항원 발현 세포주(MH134/AFP, MH134/MAGE 1, MH134/GPC 3) 혼합액(1.5 X 10⁵cells/100㎕)을 마우스 왼쪽 등배부(left flank) 에 피하주사 혹은 정맥 주사하였다. 암세포 주입 후 2일 및 9일 시점에서 실시예 1-5에서 제조된 간암항원 재조합 단백질을 감작시켜 성 숙된 수지상 세포를 멸균 PBS 용액에 현탁시키고 살아 있는 수지상세포의 수가 1 X 10⁶/100㎕ 가 되도록 하였다. 실험군에 따라 상기 수지상세포 현탁액 혹은 PBS 용액 100 ㎕ 를 1회 투여량으로 정하고 마우스의 오른쪽 등배부(right flank) 에 투여하였다. 이 때 마우스는 수지상세포 투여 2~3 일 전 면도기를 사용하여 제모하였다. 알다라 크림 (5％ 이미퀴모드 크림, iNOVA Pharmaceuticals)을 도포할 경우에는 수지상 세포 혹은 PBS 를 투여하기 전날, 투여 당일, 투여 다음날에 걸쳐 일정량의 알다라 크림을 취하여 수지상세포 혹은 PBS 용액이 투여된 부위에 30 초간 문질러 도포하였다. 상기와 같이 구축된 고형암 치료 및 암전이 치료 모델에서 항원 특이적 성숙 수지상세포 및/또는 이미퀴모드 병용처리에 의한 항암 면역효과를 조사하였다.

실험예 3: 폐 조직의 분리 및 고정 후 암 전이 중 폐 전이 병소의 관찰

실험예 2에서 구축된 암전이 치료 모델에서 암 세포주의 정맥주사에 의한 암전이 유도 이후 18 일째 되는 날 마우스를 경추탈구법에 의해 희생시키고 70％ 에탄올을 이용하여 전신 소독하고 고정하였다. 이어서, 복부의 정중선을 기준으로 피 부를 H 절개하여 양쪽으로 벌려 고정하고 다시 복막을 정중선으로 절개하여 양쪽으로 제키어 고정시켰다. 장내 기관형태의 이상 유무를 확인한 후 횡격막을 가르고 늑연골을 따라서 흉골을 잘라 일부를 고정하고 흉강을 관찰하였다. 폐조직을 채취하여 인산염 완충 용액에 세척하여 혈액응고 조직을 제거한 후에 고정액인 Bouin's fixative (Sigma사)에 담구어 간암 항원 발현 세포주에 의한 폐전이 병소를 관찰하였다.

실험예 4: 간암 항원 특이적인 T 세포 증식, Th1 사이토카인 분비능 및 CTL 유도능실험

실험예 1 및 2에서 사용된 대조군과 실험군 마우스를 경추탈구법으로 안락사시키고 비장을 취한 후 분리된 비장이 건조되지 않도록 RPMI-1640 배지에 보관하였다. 각각의 비장을 취하여 70μm 그물망에 통과시켜 부유조직을 제거하고 1회 원심분리하여 세포를 수획한 후, 0.83％ 염화암모늄 용액으로 현탁시켜 적혈구를 제거하였다. 준비한 비장림프구(splenocyte)를 나일론 울 컬럼(nylon wool column)과 한 시간 동안 반응시켜 T 림프구만을 분리하였고, 비흡착성 분획을 받아 CD3 항원에 대한 유세포 형광 분석을 수행하여 85％ 이상이 T 세포로 이루어졌음을 확인하고 다음 실험에 이용하였다. 효능 T 세포 (Effector T cell) 자극을 위해 준비된 항원제시세포 (APC, antigen presenting cells)와 5:1 비율로 혼합하여 5 일 간 배양하였다. APC는 실험일로부터 2 일 전에 다음과 같은 방법으로 준비하였다. 정상 마우스의 비장을 취해 적혈구를 제거하고 3μg/㎖의 Concanavalin A로 48 시간 자극하였다. 자극 후 적정량의 간암 항원 재조합 단백질(YGRRARRRRRR-AFP, YGRRARRRRRR-MAGE 1, YGRRARRRRRR-GPC 3)을 처리하여 24 시간 배양하였다. 24 시간 배양 후 Mitomycin C를 40 분간 처리하고, 3 회 세척하여 APC를 준비하였다. 효능 T 세포 (Effector T cell)과 APC와의 공배양 5 일 중 3 일째 일부를 취해 MTT 분석을 통해 T 세포 증식 분석(T cell proliferation assay)를 수행하였다. 또한, 배양 4일 째 배양배지를 일부 취하여 Th1 type /Th2 type 사이토카인(IFN-gamma, IL-4)의 분비량을 확인하였다. 배양 5 일 후에 Histopaque (Sigma)을 이용하여 죽은 세포를 제거하고 효능 T 세포(Effector T cell)을 분리하여 간암 항원을 발현하는 타겟 세포(MH134/AFP, MH134/GPC 3, MH134/MAGE 1 혼합세포)와 효능 T 세포(effector T cell)의 비율 (E:T ratio)이 5:1, 10:1, 20:1 그리고 40:1 되도록 혼합하고 4 시간 배양하였다. Promega사의 비-방사성 증식 분석 키트(Non-Radioactive Proliferation assay kit)의 지침서에 따라 실험을 수행하고 비용해율(specific lysis rate)을 계산하였다.

실험예 5: 본 발명의 성숙 수지상세포의 안전성시험

본 발명에 따른 실시예 1-5에서 제조한 성숙 수지상세포의 안전성을 시험하기 위해 마우스(Balb/C, 암수 6 주령)를 이용하여 단회 피하투여독성시험, 반복 피하투여독성 시험 및 면역독성시험을 수행하였다. 이는 GLP 시험기관으로 인증된 (주)바이오톡스텍(Biotoxtec co.)에서 실시하였다. 단회 피하투여독성시험은 투여용량에 따라 4 시험군으로 시험하였으며, 군당 암ㅇ수 각 5 마리씩 총 40 마리를 실험에 사용하였다. 대조군은 생리적 식염주사액을 처리하였으며, 시험군은 각각 2.5 X 10⁵, 7.5 X 10⁵, 2.5 X 10⁶ 용량을 피하경로로 투여하였다. 이 후 14일 동안 사망률, 일반증상, 체중변화를 관찰하고, 14일 후 부검하여 육안적 부검소견 및 조직병리학적 검사를 수행하였다. 반복 피하투여독성시험 및 면역독성시험을 위해 투여용량에 따라 3 시험군으로 시험하였으며, 군당 암ㅇ수 각 10 마리를 사용하였다. 대조군은 생리적 식염주사액이 처리되었으며, 시험군은 각각 5 X 10⁴, 5 X 10⁵용량을 피하경로로 투여하였다. 대조군 및 5 X 10⁵용량 투여군의 경우는 회복군을 포함하며 이는 군당 암ㅇ수 각 5마리를 사용하였다. 투여주기는 주당 1회, 5주간 반복투여하였으며, 본 시험군은 최종투여 1주일 후 부검, 회복군은 4주 후 부검하였다. 시험항목으로는 일반증상, 체중변화, 사료섭취량, 안과학적 검사, 뇨검사, 혈액학적 검사, 혈액생화학적 검사, 장기중량, 부검 및 조직병리학적 검사, 면역독성 시험은 비장 내 림프구 분석으로서 CD3e, CD4, CD8a 및 CD45R/B220의 항체를 이용하여 T 세포, B 세포의 활성화 여부를 시험하였고, 비장 내의 자연살해세포(NK cell) 활성화 분석을 수행하였다.

실험 결과

실험예 1 및 실험예 4 결과: 고형암 예방 또는 방어 면역 유도

마우스 간암모델에서 고형암에 대한 예방 또는 방어 면역을 확인하기 위한 실험으로, 대조군으로서 PBS를 투여한 마우스군 (n=8)과 본 발명에 따른 수지상세 포 치료제를 투여한 마우스군 (n=8), 알다라크림만 처리한 마우스군 (n=8), 본 발명에 따른 수지상세포 치료제와 알다라크림을 병용 처리한 마우스군 (n=8)에 적정량 (1.5 X 10⁵cells/head)의 간암항원 발현세포주를 피하에 투여하고 종양성장을 2-3일 간격으로 관찰하였다. 고형암의 크기는 장축과 단축의 크기를 캘리퍼스(Caliper)를 사용하여 장축 X 단축² X 0.52 로 산출하였다. 실험 결과, 본 발명에 따른 수지상세포 치료제 및 수지상세포 치료제와 알다라 크림을 함께 처리한 마우스 실험군의 경우 각각은 PBS 대조군이나 알다라 크림만을 처리한 실험군보다 현저한 고형암 성장의 억제효과가 나타났다. 특히, 수지상세포 치료제 및 알다라 크림을 병용처리한 실험군의 3 마리 (CR: 43％)에서는 피하주사된 세포주가 고형암으로 형성되지 못하였고, 다른 3 마리 (PR: 43％)에서는 PBS 대조군 평균 고형암 크기의 70％ 미만 크기로 다른 대조군 및 실험군의 고형암과 비교하여 매우 작은 크기로 종양을 형성하였다(도 2a - 도 2c 참조).

또한, 암 유도된 개체에 대한 본 발명의 따른 성숙 수지상세포에 의한 수명연장효과를 확인하기 위해 2-3일 간격으로 지속적으로 마우스의 생존여부를 조사하였다. 종양 유도된 마우스에 대해서, 종양 유도 후 40일 경 PBS 대조군의 경우에 모두 폐사하였지만, 본 발명에 따른 수지상 세포 치료제 투여 개체는 50％를 유지하고 있으며, 본 발명에 따른 수지상세포와 알다라크림 병용 투여군은 80％ 이상을 유지하고, 특히 병용 투여군의 경우에, 50일 이후에도 계속하여 수명연장효과를 나타내었다(도 2d 참조).

상기 방어 모델에서의 고형암 성장 억제 효과는 실험군 마우스 개체에서 세포성 면역반응과 관련된 ⅰ) 간암항원 특이적인 T 세포의 증식반응, ii) Th1 주도적 면역반응으로 예상되는 IFN-γ의 발현 및 iii) CTL 활성 결과와 상관성이 있는 것으로 예상되었고, 이를 확인하기 위해 다음의 실험을 행하였다. 마지막 수지상세포 치료제 투여가 끝나고 각각 1 주일, 2 주일, 혹은 3 주일이 지났을 때 대조군과 각 실험군의 마우스 1 마리씩을 희생하여 얻어진 비장 유래 T 림프구의 활성을 조사하였다. 본 발명에 따른 수지상세포 치료제 및 수지상세포와 알다라크림의 병용 투여로 처리된 마우스군들에서 분리된 비장 T 림프구의 경우, PBS로 처리된 마우스군들에서 유래한 T 림프구보다 높은 비율로 증식된 것이 관찰되었다(도 3 참조). 또한 Th1 주도적 세포성 면역반응을 유추할 수 있는 인 비트로(in vitro) 상의 IFN-γ 및 IL-4의 수치비교에서도 같은 결과를 나타냈다(도 4a 및 도 4b 참조). 또한, 항원을 발현하는 표적 세포에 대한 용해 활성(cytotoxic T lymphocyte activity)에 있어서도, 본 발명에 따른 수지상세포 치료제로 처리된 마우스 및 본 발명에 따른 수지상세포와 알다라크림의 병용 투여로 처리된 마우스가 대조군에 비하여 훨씬 높음을 확인하였고, 특히 병용 투여군이 가장 높았음을 확인하였다(도 5 참조).

실험예 2 및 실험예 4 결과: 고형암 치료 면역 유도

마우스 간암모델에서 고형암에 대한 치료면역을 확인하기 위한 실험으로 적정량의 간암항원 발현 세포주를 28 마리의 마우스에 피하주사하여 고형암을 형성시 켰다. 고형암 형성 후, PBS를 투여받은 마우스군 (n=7)과 본 발명에 따른 수지상세포 치료제를 투여받은 마우스군 (n=7), 알다라크림만 처리된 마우스군 (n=7), 본 발명에 따른 수지상세포 치료제와 알다라크림이 병용 처리된 마우스군(n=7)에 있어 항암 효과를 조사하였다. 평가지표로써 암 조직내 암세포 밀도(도 7a) 및 고형암 성장(도 7b)를 관찰하였다. 본 발명에 따른 수지상세포 치료제로 처치된 마우스 및 본 발명에 따른 수지상세포 및 알다라크림으로 병용 처리된 마우스군에서 암조직내 암세포의 밀도가 낮아졌음을 확인하였으며, 특히 병용 처리된 마우스군에서의 암조직내 암세포의 밀도가 현저히 낮아졌음을 확인하였다(도 7a). 또한, 고형암 성장에 있어서서는 본 발명에 따른 수지상세포 및 알다라크림으로 병용 처리된 마우스군의 경우 매우 억제되고 있음을 확인하였다(도 7b). 이러한 결과는 본 발명에 따른 수지상세포에 의한 치료효과는 고형암 크기 억제 측면 보다는 종양을 구성하는 실질세포(viable tumor cells)의 밀도측면에서 치료학적인 성질 변화를 보여주고 있는 것이며, 알다라크림을 병용 처리할 경우 종양성장 억제 및 암조직 내 실질세포수 저하 측면에서 매우 효과적임을 보여주는 것이다.

상기 치료 면역 모델에서의 각 대조군 및 실험군 마우스 개체로부터 유래된 비장을 사용한 간암항원 특이적인 T 세포의 증식실험, CTL 활성실험, Th1/Th2 사이토카인 분석을 통해 본 발명에 따른 수지상 세포 치료제 및 알다라크림의 병용 처리군에 의한 치료효과를 T 세포 활성과 관련된 세포성 면역반응과 관련지어 추가적으로 실험 확인하였다. 이러한 실험 결과는 마지막 수지상세포 투여가 끝나고 일주일이 지났을 때 대조군과 각 실험군의 마우스 1 마리씩을 희생하여 얻어진 비장 유래 T 림프구의 활성을 조사하여 얻었다. 본 발명에 따른 수지상세포를 투여한 마우스군들에서 분리된 비장 T 림프구의 경우, PBS를 투여받은 마우스군들에서 유래한 T 림프구보다 높은 비율로 증식함이 관찰되었다(도 8 참조). 또한, 수지상 세포 치료제 + 알다라크림을 병용 투여한 마우스군에서 간암항원을 발현하는 표적세포에 대한 Th1 주도적 세포독성 효과가 더욱더 높아짐을 확인하였다(도 9, 도 10a 및 도 10b 참조). 알다라 크림만 처리한 마우스군에서 분리한 T 림프구의 CTL 유도는 세포수 부족으로 제외하였다. 이 밖에 대조군 및 실험군들의 인근 임파절을 적출하여 단일세포 현탁액을 제조한 후, 유세포 분석을 통해 면역세포군의 비율을 조사했을 때 병용군의 경우 대조군에 비해 CD8+ T 세포의 소폭 상승 및 현저한 T reg 세포의 감소가 관찰되었다.

실험예 3 결과: 전이암 치료 면역 유도

간암 마우스 모델에서 전이암에 대한 치료면역을 확인하기 위해 정맥경로로 간암항원을 발현하는 암세포주를 먼저 주사하여 암전이를 유도하고, 암전이 유도된 각 마우스 개체에 PBS 투여, 본 발명에 따른 수지상세포 치료제 단독투여, 본 발명에 따른 수지상세포 치료제 및 알다라크림 병용 투여 및 알다라크림 단독투여하였다. 종양세포 투여 후 18-20 일째에 폐조직을 분리하여 Bouin's fixative 용액으로 고정하여 암전이 중 폐전이 병소를 관찰하였다(도 6a 및 도 6b, n=8). 간암특이 항원을 발현하는 MH134 종양세포의 암전이 모델의 특징은 전이 결절(nodule)의 개수가 비교적 일정하지 않고 무작위(random) 범위의 분포를 보였다(도 6b). 따라 서 각 개체에서 발생한 폐 콜로니(lung colony)의 개수를 평균하지 않고, 발생된 폐 콜로니(lung colony)수의 분포에 따라 임의로 범위를 정하고 그 해당 범위에 콜로니가 발생된 개체수를 세어 전이억제 효과를 판정하였다(도 6a). 간암 특이 항원을 발현하는 MH134의 콜로니(colony)는 매끄러운 형태(smooth type)이며, 넓은 반점 형태이어서 콜로니(colony) 개수가 30 개 이상이 되면, 서로 융합되어 계수가 곤란하였다. 본 발명에 따른 수지상세포 치료제로 처리된 경우 및 알다라크림과의 병용 투여군에서 각각 모두 우수한 폐전이 억제 효과를 보였으며, 특히 본 발명에 따른 수지상세포 치료제 + 알다람크림 병용 처리한 마우스군의 경우, 3 마리(37.5％)는 폐전이 병소가 전혀 관찰되지 않았고 다른 5 마리 (62.5％)도 콜로니(colony) 수가 5 개를 넘지 않았다(도 6a 참조).

실험예 5의 결과: 수지상세포 치료제의 안전성 확인

본 발명에 따른 성숙 수지상세포의 단회피하투여독성의 경우, 암 수 시험물질 투여군에서 투여에 기인한 사망례, 일반증상의 이상 및 유의성 있는 체중의 변화는 관찰되지 않았다. 부검결과, 암 수 시험물질 투여군에서 육안적 이상소견은 관찰되지 않았다. 따라서, 장기조직에 대한 조직병리학적 검사를 실시하지 않았다. 결과적으로 본 발명에 따른 성숙 수지상세포를 Balb/C 마우스에 단회피하 투여한 결과, 시험물질에 의한 사망례가 관찰되지 않아 개략의 치사량은 암 수 각 2.5 X 10⁶ cells/head 이상으로 판단되었다. 반복 피하투여독성의 결과로서 시험물질투 여군에서 일반증상, 체중, 사료섭취량, 안과학적 검사, 뇨검사, 혈액학적 검사, 장기중량 측정 및 부검결과 시험물질 투여에 의한 변화는 인정되지 않았다. 조직병리학적 시험결과, 시험군 암수 5 X 10⁴, 5 X 10⁵ cells/head의 경우, 투여부위의 세포침윤이 관찰되어 시험물질에 의한 것으로 판단되었다. 하지만, 회복군의 투여부위에서 암컷 5 X 10⁵ cells/head 투여군의 1 례에서만 관찰되어 투여부위에 의한 자극은 회복되는 것으로 판단되었다. 면역독성 시험결과, 비장 내 림프구 활성화 및 자연살세포 활성화에 있어 암ㅇ수 시험물질 투여군에서 시험물질에 의한 영향은 없는 것으로 판단되었다. 따라서, 마우스 크레아박스-에치씨씨의 무독성량(NOAEL)은 5 X 10⁵cells/head 이상으로 판단된다.

일반적으로 간암을 대상으로 한 임상시험에 있어 수지상 세포의 투여용량이 0.5 - 50 X 10⁶ cells/individual 의 수준으로 행해지고 있는 바, 일반적으로 사용되는 최대 투여용량은 5 X 10⁷ cells/individual 이다. 임상 예정용량을 최대 투여량인 5 X 10⁷ cells/individual으로, 안환자의 체중을 50 kg 으로 가정했을 때, 본 발명에 따른 성숙 수지상세포의 치사량은 임상 최대 시험예정용량의 100배 이상이며, 무독성량은 임상 최대 시험 예정용량의 20 배 이상임을 알 수 있으며, 이로서 본 발명에 따른 성숙 수지상세포는 독성이 매우 적어 안전한 것임을 알 수 있다.

결론

본 실험을 통해 고형암 혹은 암전이 마우스 모델에서 펩타이드 YGRRARRRRRR 와 융합된 암 항원 단백질로 감작하여 성숙화된 수지상세포는 매우 우수한 종양 예방 및 치료 효과와 암 전이 억제 효과가 있음을 증명하였으며, 알다라크림를 병용 사용할 경우 종양성장 억제 및 암 전이 억제의 효과가 극대화될 수 있음을 증명하였다.

인간 간암항원을 안정적으로 발현하는 암 세포주를 제작하고 동일한 조직 적합성을 갖는 마우스계를 선택하여 피하 및 꼬리정맥 주입을 통해 피하 고형암 및 암전이를 유도한 동물 모델을 제작하였고, 이 동물모델에 펩타이드 YGRRARRRRRR 와 융합된 간암항원 단백질로 감작하여 성숙화된 수지상세포 치료제 투여 및 알다라크림을 병용 투여했을 때, 피하 고형암의 예방 및 치료 효과가 우수함을 알 수 있었고, 폐전이 병소수가 우수하게 저하됨을 확인할 수 있었다. 특히, 고형암 예방모델에서는 종양성장 억제뿐 아니라 종양의 완전한 제거 효과를 보였으며, 결과적으로 수명연장에 있어 현저한 효과를 나타냄을 알 수 있었다. 즉, 본 발명에 따른 수지상 세포치료제 및 이미퀴모드의 병용 요법을 사용하여 우수한 종양크기의 감소 효과 뿐만 아니라 궁극적으로 수명연장효과를 유도할 수 있었다. 보다 구체적으로, 실제 간암 등의 암치료의 경우 수술적 및/또는 비수술적 요법에 의한 1 차 치료 이후 초기경과는 좋으나 재발율이 매우 높은 실정에서 1차적인 암 치료(tumor burden의 제거 등) 후, 본 발명에 따른 수지상세포 치료제 투여 및 알다라크림의 병용 투여시에 잔존하는 미세 암세포에 의한 2차적인 암의 재발을 예방 혹은 억 제(2^nd tumor prevention)하는데 효과적으로 작용할 수 있음을 강력히 제시하는 결과이다.

특히, 암 전이 치료모델에 있어 본 발명에 따른 성숙 수지상세포 처치에 의하여 암세포가 정맥 내 주사된 후 폐조직으로 이동된 종양세포에 의한 폐 콜로니(lung colony) 형성 유도를 효과적으로 저해하는 것을 확인하였다. 또한, 이 효과는 이미퀴모드와의 병용 투여 시 더욱 현저하였다. 결과적으로 본 발명에 따른 성숙 수지상세포 투여 및 알다라크림의 병용 투여가 암의 전이 억제에 매우 효과적임을 암시한다.

본 발명에 따른 항암 효과의 증대를 T 세포의 면역성 측면에서 간암항원 특이적인 T 세포 증식 유도, CTL 반응 시험 및 Th1/Th2 사이토카인 분석에 의해 추가적으로 확인하였다.

피하 고형암 치료모델의 경우 종양증식이 공격적인 만큼 본 발명에 따른 성숙 수지상세포 처치에 의한 종양크기 자체에 대한 억제 효과는 다소 낮은 것처럼 관찰되었으나, 종양조직 분석을 통해 종양 내 실질세포는 밀도적인 측면에서 매우 감소되어 있음을 확인하였다. 결론적으로 본 발명에 따른 성숙 수지상세포를 수술적 혹은 비수술적 치료 후의 암환자에게 처리할 경우, 항암면역유도를 통해 암전이 및 재발을 억제할 수 있는 항암효과를 얻을 수 있으며 이러한 본 발명에 따른 수지상세포 치료제의 투여와 함께 알다라크림을 병용하면, 수지상 세포의 간암에 대한 면역치료 효과를 극대화할 수 있음을 실험적으로 증명하였다.

또한, 본 발명에 따른 성숙 수지상세포의 단회피하투여독성, 반복피하투여독성 및 면역독성의 시험을 수행하였으며, 모든 항목에서 안전성이 우수함을 확인하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

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도 1은 수지상 세포 감작에 사용되는 CTP-융합 간암특이항원(YGRRARRRRRR-AFP, YGRRARRRRRR-GPC 3, YGRRARRRRRR-MAGE 1)를 정제한 후 SDS-PAGE 분석 후 웨스턴블롯(western blot)을 통해 확인한 결과이다.

도 2a는 마우스 간암 방어모델에서 본 발명에 따른 성숙 수지상세포와 알다라크림 병용 투여에 의한 고형암 형성 억제 효과를 보여준다. 방어모델에서는 대조군으로서 PBS를 투여받은 마우스군(n=8, PBS), 수지상세포 치료제를 투여받은 마우스군 (n=8, Ag-DC), 알다라크림만 처리된 마우스군(n=8, PBS + Aldara), 수지상세포 치료제와 알다라크림을 병용 처리한 마우스군(n=8, Ag-DC + Aldara)에 적정량(1.5 X 10⁵cells/head)의 간암항원 발현 세포주를 피하에 투여하고 종양성장을 2-3일 간격으로 관찰하였다. 도 2b는 마우스 간암 방어모델에서 실험군 및 대조군 각 개체 마우스에서의 종양의 크기를 보여주는 사진이다. 도 2c는 마우스 간암 방어모델에서 실험군 및 대조군 각 개체 마우스에서의 종양 형성 억제 결과를 보여준다. NR: 대조군(PBS 처리군) 종양평균크기의 70% 이상, PR: 대조군 종양평균크기의 70% 미만, CR: 종양이 전혀 형성되지 않은 경우임. 도 2d는 마우스 간암 방어모델에서 실험군 및 대조군 각 개체 마우스의 수명을 측정한 결과이다.

도 3은 마우스 간암 방어 모델의 대조군 및 시험군 각 개체 마우스의 비장림 프구(splenocyte)에서 분리한 T 세포에 대해 간암 특이적인 T 세포의 증식 분석을 MTT 분석을 통해 행한 결과이다. PBS: PBS 투여 마우스 대조군, Ag-DC: 수지상세포 치료제 투여한 마우스군, Ag-DC + aldara: 수지상세포 치료제와 알다라크림을 병용 처리한 마우스군, PBS + Aldara: 알다라크림만 처리한 마우스군이다.

도 4a 및 도 4b는 마우스 간암 방어 모델의 대조군 및 시험군 각 개체 마우스의 비장림프구(splenocyte)에서 분리한 T 세포를 간암 특이 항원 제시 세포와 배양한 후 T 세포로부터의 IFN-γ과 IL-4의 분비량을 측정한 결과이다. PBS: PBS 투여 마우스 대조군, Ag-DC: 수지상세포 치료제 투여한 마우스군, Ag-DC + aldara: 수지상세포 치료제와 알다라크림을 병용 처리한 마우스군, PBS + Aldara: 알다라크림만 처리한 마우스군이다.

도 5는 마우스 간암 방어 모델의 대조군 및 시험군의 각 개체 마우스에서 CTL 활성을 측정한 결과를 보여준다. PBS: PBS 투여 마우스 대조군, Ag-DC: 수지상세포 치료제 투여한 마우스군, Ag-DC + aldara: 수지상세포 치료제와 알다라크림을 병용 처리한 마우스군, PBS + Aldara: 알다라크림만 처리한 마우스군.

도 6a 및 도 6b는 마우스 폐전이 치료 모델의 대조군 및 시험군 각 개체 마우스에서 수지상세포 및 알다라크림의 병용 처리에 의한 폐전이 병소 억제효과를 보여준다. PBS: PBS 투여 마우스 대조군, Ag-DC: 수지상세포 치료제 투여한 마우스 군, Ag-DC + aldara: 수지상세포 치료제와 알다라크림을 병용 처리한 마우스군, PBS + Aldara: 알다라크림만 처리한 마우스군.

도 7a는 마우스 간암 치료 모델의 대조군 및 시험군 각 개체 마우스의 암조직에서 암세포 밀도를 조직학적으로 관찰한 결과이다. PBS: PBS 투여 마우스 대조군, Ag-DC: 수지상세포 치료제 투여한 마우스군, Ag-DC + aldara: 수지상세포 치료제와 알다라 크림을 병용 처리한 마우스군, PBS + Aldara: 알다라 크림만 처리한 마우스군. 도 7b는 수지상세포 및 알다라 크림의 병용 처리의 고형암 형성 억제 효과를 마우스 간암 치료 모델의 대조군 및 시험군 마우스에서의 종양 크기 측정을 통해 확인한 결과이다. PBS: PBS 투여 마우스 대조군, Ag-DC: 수지상세포 치료제 투여한 마우스군, Ag-DC + aldara: 수지상세포 치료제와 알다라크림을 병용 처리한 마우스군, PBS + Aldara: 알다라크림만 처리한 마우스군.

도 8은 마우스 치료 모델의 대조군 및 시험군 각 개체 마우스로부터 얻은 비장림프구(splenocyte)에서 분리한 T 세포에 대해 MTT 분석을 통한 T 세포 증식 분석(T cell proliferation assay)을 행한 결과이다. PBS: PBS 투여 마우스 대조군, Ag-DC: 수지상세포 치료제 투여한 마우스군, Ag-DC + aldara: 수지상세포 치료제와 알다라크림을 병용 처리한 마우스군, PBS + Aldara: 알다라크림만 처리한 마우스군.

도 9은 마우스 치료 모델의 대조군 및 시험군 각 개체 마우스로부터 얻은 비장 T 림프구의 CTL 활성을 측정한 결과이다. PBS: PBS 투여 마우스 대조군, Ag-DC: 수지상세포 치료제 투여한 마우스군, Ag-DC + aldara: 수지상세포 치료제와 알다라크림을 병용 처리한 마우스군, PBS + Aldara: 알다라크림만 처리한 마우스군.

도 10a 및 도 10b는 마우스 치료 모델의 대조군 및 시험군 각 개체 마우스로부터 얻은 T 림프구의 Th1 주도적 면역반응으로 인한 IFN-γ 및 IL-4의 분비량 증가를 보여준다. PBS: PBS 투여 마우스 대조군, Ag-DC: 수지상세포 치료제 투여한 마우스군, Ag-DC + aldara: 수지상세포 치료제와 알다라크림을 병용 처리한 마우스군, PBS + Aldara: 알다라크림만 처리한 마우스군.

<110> CHOONGWAE PHARM. Co. <120> Method for Preparing Dendritic Cells Having Potential to Induce Cancer Specific Immune Response, Pharmaceutical Composition and Kit for Treating or Preventing Cancer or Inhibiting Cancer Metastasis Comprising the Same <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 327 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Thr Leu His Arg Asn Glu Tyr Gly Ile Ala Ser Ile Leu Asp Ser Tyr 1 5 10 15 Gln Cys Thr Ala Glu Ile Ser Leu Ala Asp Leu Ala Thr Ile Phe Phe 20 25 30 Ala Gln Phe Val Gln Glu Ala Thr Tyr Lys Glu Val Ser Lys Met Val 35 40 45 Lys Asp Ala Leu Thr Ala Ile Glu Lys Pro Thr Gly Asp Glu Gln Ser 50 55 60 Ser Gly Cys Leu Glu Asn Gln Leu Pro Ala Phe Leu Glu Glu Leu Cys 65 70 75 80 His Glu Lys Glu Ile Leu Glu Lys Tyr Gly His Ser Asp Cys Cys Ser 85 90 95 Gln Ser Glu Glu Gly Arg His Asn Cys Phe Leu Ala His Lys Lys Pro 100 105 110 Thr Pro Ala Ser Ile Pro Leu Phe Gln Val Pro Glu Pro Val Thr Ser 115 120 125 Cys Glu Ala Tyr Glu Glu Asp Arg Glu Thr Phe Met Asn Lys Phe Ile 130 135 140 Tyr Glu Ile Ala Arg Arg His Pro Phe Leu Tyr Ala Pro Thr Ile Leu 145 150 155 160 Leu Trp Ala Ala Arg Tyr Asp Lys Ile Ile Pro Ser Cys Cys Lys Ala 165 170 175 Glu Asn Ala Val Glu Cys Phe Gln Thr Lys Ala Ala Thr Val Thr Lys 180 185 190 Glu Leu Arg Glu Ser Ser Leu Leu Asn Gln His Ala Cys Ala Val Met 195 200 205 Lys Asn Phe Gly Thr Arg Thr Phe Gln Ala Ile Thr Val Thr Lys Leu 210 215 220 Ser Gln Lys Phe Thr Lys Val Asn Phe Thr Glu Ile Gln Lys Leu Val 225 230 235 240 Leu Asp Val Ala His Val His Glu His Cys Cys Arg Gly Asp Val Leu 245 250 255 Asp Cys Leu Gln Asp Gly Glu Lys Ile Met Ser Tyr Ile Cys Ser Gln 260 265 270 Gln Asp Thr Leu Ser Asn Lys Ile Thr Glu Cys Cys Lys Leu Thr Thr 275 280 285 Leu Glu Arg Gly Gln Cys Ile Ile His Ala Glu Asn Asp Glu Lys Pro 290 295 300 Glu Gly Leu Ser Pro Asn Leu Asn Arg Phe Leu Gly Asp Arg Asp Phe 305 310 315 320 Asn Gln Phe Ser Ser Gly Glu 325 <210> 2 <211> 326 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly 1 5 10 15 Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val 20 25 30 Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys 35 40 45 Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala 50 55 60 Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln 65 70 75 80 Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 85 90 95 Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe 100 105 110 Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp 115 120 125 Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro 130 135 140 Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu 145 150 155 160 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe 165 170 175 Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln 180 185 190 Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile 195 200 205 Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu 210 215 220 Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys 225 230 235 240 Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly 245 250 255 Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu 260 265 270 Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu 275 280 285 Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys 290 295 300 Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser 305 310 315 320 Gln Gln Arg Gln Tyr Arg 325 <210> 3 <211> 309 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ser Leu Glu Gln Arg Ser Leu His Cys Lys Pro Glu Glu Ala Leu 1 5 10 15 Glu Ala Gln Gln Glu Ala Leu Gly Leu Val Cys Val Gln Ala Ala Ala 20 25 30 Ser Ser Ser Ser Pro Leu Val Leu Gly Thr Leu Glu Glu Val Pro Thr 35 40 45 Ala Gly Ser Thr Asp Pro Pro Gln Ser Pro Gln Gly Ala Ser Ala Phe 50 55 60 Pro Thr Thr Ile Asn Phe Thr Arg Gln Arg Gln Pro Ser Glu Gly Ser 65 70 75 80 Ser Ser Arg Glu Glu Glu Gly Pro Ser Thr Ser Cys Ile Leu Glu Ser 85 90 95 Leu Phe Arg Ala Val Ile Thr Lys Lys Val Ala Asp Leu Val Gly Phe 100 105 110 Leu Leu Leu Lys Tyr Arg Ala Arg Glu Pro Val Thr Lys Ala Glu Met 115 120 125 Leu Glu Ser Val Ile Lys Asn Tyr Lys His Cys Phe Pro Glu Ile Phe 130 135 140 Gly Lys Ala Ser Glu Ser Leu Gln Leu Val Phe Gly Ile Asp Val Lys 145 150 155 160 Glu Ala Asp Pro Thr Gly His Ser Tyr Val Leu Val Thr Cys Leu Gly 165 170 175 Leu Ser Tyr Asp Gly Leu Leu Gly Asp Asn Gln Ile Met Pro Lys Thr 180 185 190 Gly Phe Leu Ile Ile Val Leu Val Met Ile Ala Met Glu Gly Gly His 195 200 205 Ala Pro Glu Glu Glu Ile Trp Glu Glu Leu Ser Val Met Glu Val Tyr 210 215 220 Asp Gly Arg Glu His Ser Ala Tyr Gly Glu Pro Arg Lys Leu Leu Thr 225 230 235 240 Gln Asp Leu Val Gln Glu Lys Tyr Leu Glu Tyr Arg Gln Val Pro Asp 245 250 255 Ser Asp Pro Ala Arg Tyr Glu Phe Leu Trp Gly Pro Arg Ala Leu Ala 260 265 270 Glu Thr Ser Tyr Val Lys Val Leu Glu Tyr Val Ile Lys Val Ser Ala 275 280 285 Arg Val Arg Phe Phe Phe Pro Ser Leu Arg Glu Ala Ala Leu Arg Glu 290 295 300 Glu Glu Glu Gly Val 305

Claims

다음의 단계를 포함하는 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포의 제조 방법:

(a) 미성숙 수지상 세포를 펩타이드 YGRRARRRRRR와 융합된 암 특이 항원 단백질에 감작하여 성숙화 시키는 단계; 및

(b) 상기 단계 (a)의 성숙화된 수지상세포를 분리하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)는 수지상 세포의 성숙화 유도 사이토카인인 TNF(Tumor necrosis factor)-α, IFN(Interferon)-γ, IL(Interleukin)-1β, IL-6, PGE2(Prostaglandin E2) 또는 이들의 혼합물의 존재 하에 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 암 특이 항원은 간암 특이 항원인 것을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 상기 간암 특이 항원은 AFP (Alpha-Fetoprotein), GPC 3 (Glypican-3), MAGE 1 (Melanoma Associated Gene Family A1), NY-ESO-1(cancer/testis antigen), Aurora-A (serine/threonine protein kinase involved in centrosome formation during mitosis), 또는 Gankyrin (liver-specific oncoprotein involved in cell cycle regulation)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 간암 특이 항원은 AFP (Alpha-Fetoprotein), GPC 3 (Glypican-3) 또는 MAGE 1 (Melanoma Associated Gene Family A1)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 간암 특이 항원은 서열목록 제 1 서열의 AFP 아미노산 서열 중 20-346 서열, 서열목록 제 2 서열의 GPC 3 아미노산 서열 중 33-358 서열, 또는 서열목록 제 3 서열의 MAGE1 아미노산 서열인 것을 특징으로 하는 방법.
(a) 상기 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약제학적 조성물.
제 7 항에 있어서, 상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 상기 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포의 약제학적 유효량; 및 (b) 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 조성물.
제 9 항에 있어서, 상기 암 전이는 간암의 전이인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 10 항에 있어서, 상기 간암의 전이는 간암의 폐전이인 것을 특징으로 하는 조성물.
(a) 상기 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상 세포를 포함하는 약제학적 조성물; 및 (b) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 포함하는 암의 치료 또 는 예방용 약제학적 키트.

[화학식 1]
제 12 항에 있어서, 상기 암은 간암인 것을 특징으로 하는 약제학적 키트.
(a) 상기 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 암 특이 면역반응 유도능력을 갖는 성숙 수지상세포를 포함하는 약제학적 조성물; 및 (b) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물을 함유하는 조성물을 포함하는 암 전이 억제용 약제학적 키트.

[화학식 1]
제 14 항에 있어서, 상기 암 전이는 간암의 전이인 것을 특징으로 하는 약제학적 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 간암의 전이는 간암의 폐전이인 것을 특징으로 하는 약제학적 키트.