KR20110060903A

KR20110060903A - 지속성이 변경된 클로스트리듐 신경독

Info

Publication number: KR20110060903A
Application number: KR1020117006528A
Authority: KR
Inventors: 위르겐 프레베르트
Original assignee: 메르츠 파마 게엠베하 운트 코. 카가아
Priority date: 2008-08-29
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2011-06-08
Also published as: JP2012500638A; EP2337790A1; RU2524429C2; US20110189158A1; CN102131823A; CA2733283A1; US8748151B2; RU2011111700A; US20140187755A1; JP5746624B2; MX2011001823A; AU2009286973A1; IL210845A0; ES2592314T3; US8895713B2; AU2009286973B2; BRPI0916964A2; EP2337790B1; WO2010022979A1

Abstract

본 발명은 (a) 클로스트리듐 톡신의 신경 독성 성분의 HC 도메인 또는 이의 단편; (b) 클로스트리듐 톡신의 신경 독성 성분의 제1 LC 도메인 또는 이의 단편; 및 (c) 클로스트리듐 톡신의 신경 독성 성분의 1 이상의 추가의 LC 도메인 또는 이의 단편을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 여기서 제1 및 1 이상의 추가의 LC 도메인은 서로 동일 또는 상이할 수 있고, 상기 제1 및 상기 1 이상의 추가의 LC 도메인의 상기 단편 각각은 여전히 단백질 분해 활성을 나타낸다.

Description

지속성이 변경된 클로스트리듐 신경독{CLOSTRIDIAL NEUROTOXINS WITH ALTERED PERSISTENCY}

본 발명은 상당하는 야생형 신경독에 비해 단백질 구조가 변경된 클로스트리듐 신경독(clostridial toxin), 예컨대 보툴리눔 신경독에 관한 것이다. 상기 단백질 구조의 차이로 인해 특히 활성의 기간 이동, 예컨대 활성 또는 지속성의 연장이 발생한다.

화학적 탈신경(chemodenervation)은 신경이 표적 조직, 예컨대 근육, 샘 또는 다른 신경을 자극하는 것을 예방하기 위한 약제의 사용을 지칭한다. 화학적 탈신경은 예컨대 페놀, 에틸 알콜 또는 보툴리눔 톡신으로 수행된다. 화학적 탈신경은 예컨대 1 또는 2 개의 대근육 또는 몇 개의 소근육 내 편재화된 경직을 갖는 환자에게 적절하다. 이는 근육 연축 및 통증과 같은 증상 및 반사 항진을 경감시키는 데에 사용될 수 있다.

화학적 탈신경제는 신경 근육 접합부에서 신경 근육 전달을 차단하여, 영향을 받는 근육의 마비 또는 불완전 마비(paresis)를 초래한다. 용어 "불완전 마비"는 본 명세서에서 하기에 운동의 부분 손실 또는 운동 손상에 의해 대표되는 상태로서 정의된다. 이는 아세틸콜린(ACh) 합성 또는 방출의 억제를 통한 연접 이전 작용에 의해, 또는 아세틸콜린 수용체에서의 연접 이후 작용에 의해 달성된다. 연접 이전에 작용하는 약물의 예는 보툴리눔 톡신, 테트로도톡신 및 테타누스 톡신이다.

용어 "화학적 탈신경"은 또한 화학적 탈신경제에 의해 직간접적으로 유도되는 모든 영향을 포함하며, 따라서 상기 화학적 탈신경제의 상류, 하류 또는 장기 효과를 포함한다. 따라서, 연접 이전 효과는 또한 척수 또는 구심 뉴런을 통한 연접 이후 효과, 조직 효과 및/또는 간접 효과도 포함한다.

하나의 화학적 탈신경제인 보툴리눔 톡신은 이제까지 가장 많이 공지된 독성 화합물 중 하나이지만, 과거에는 대다수의 병태 및 장애의 치료에 사용되어 왔으며, 이들 중 일부는 예컨대 PCT/EP 2007/005754에 개시되어 있다. 또한, 보툴리눔 톡신 A 단백질 복합체를 기본으로 하는 보툴리눔 톡신 A형의 상업적인 형태는 상표명 Botox®(Allergan Inc.) 및 상표명 Dysport(Ipsen® Ltd.)로 각각 입수 가능하다. 고도로 정제된 톡신 제제를 주성분으로 하며 단리된 형태의 착화 단백질이 없는 보툴리눔 톡신 A형의 신경 독성 성분을 포함하는 약학적 조성물은 상표명 Xeomin®로 Merz Pharmaceuticals GmbH로부터 독일에서 상업적으로 입수 가능하다.

무산소 그람 양성 박테리아인 클로스트리듐 보툴리눔은 효능있는 폴리펩티드 신경독인 보툴리눔 톡신을 생성하는데, 이것은 인간 및 동물에서 보툴리눔 독소증으로 지칭되는 신경 마비 질병을 일으킨다. 클로스트리듐 보툴리눔의 포자는 흙에서 발견되며, 대다수의 경우 보툴리눔 독소증의 원인인 홈 베이스 통조림 공장의 부적절하게 살균 및 밀봉된 음식 용기에서 성장할 수 있다. 보툴리눔 톡신 A(BoNT/A)는 인간에게 공지된 가장 치명적인 천연 생물학적 제제이다. 약 50 pg의 보툴리눔 톡신(정제된 신경독 복합체) 혈청형 A는 마우스에서 LD₅₀이다. 그러나, 이의 독성 효과에도 불구하고, 보툴리눔 톡신 복합체 뿐 아니라 순수한 신경독은 다수의 질병에서 치료제로서 사용되어 왔다.

보툴리눔 톡신은 또한 "보툴리눔 톡신 복합체"로도 지칭되는 톡신 복합체를 함께 형성하는 다른 박테리아 단백질(비독성 "착화 단백질" 또는 "클로스트리듐 단백질")과 관련된 보툴리눔 톡신(신경 독성 성분)의 독성 특성을 담당하는 일반적으로 단백질 형태의 용해된 클로스트리듐 배양물로부터 방출된다. 보툴리눔 톡신 복합체는 자연에서 준안정적인데, 이는 이의 안정성이 예컨대 염 농도 및/또는 pH와 같은 다양한 인자에 따라 달라지기 때문이다.

복합체의 분자량은 약 300,000 내지 약 900,000 Da, 즉 300 kDa 내지 약 900 kDa로 변경될 수 있다. 착화 단백질은 예컨대 다양한 적혈구 응집소이다. 이 톡신 복합체의 단백질은 그 자체로는 독성이 아니지만, 신경 독성 성분에 대한 안정성을 제공한다고 여겨지며, 보툴리눔 중독에서 구강 독성을 담당한다. 몇 가지 보툴리눔 톡신의 항원적으로 구별되는 혈청형, 즉 보툴리눔 톡신 A, B, C1, D, E, F 및 G가 있다. 보툴리눔 톡신 혈청형 A, B, C1, D, E, F 또는 G가 언급될 때마다, 혈청형 A1, A2, A3, A4 등과 같은 혈청형의 또한 공지된 변이체가 포함된다.

높은 독성을 담당하는 클로스트리듐 톡신의 성분은 신경 독성 성분 또는 단백질(Mw 약 150 kD, 혈청형에 따른 정확한 분자량)이다. 몇 가지 상이한 혈청형은 이의 아미노산 서열이 상이하지만, 모두 유사한 구조를 갖는다: 1 이상의 디설피드 결합에 의해 연결될 수 있는 약 50 kDa의 경쇄(LC) 및 약 100 kDa의 중쇄(HC)[재검토를 위해 예컨대 문헌(Simpson LL, Ann Rev Pharmacol Toxicol. 2004; 44:167-93) 참고]. 보툴리눔 톡신 복합체의 신경 독성 성분은 원래 단일 폴리펩티드 사슬로서 형성된다. 예컨대 혈청형 A의 경우, 폴리펩티드의 단백질 분해 과정으로 디설피드 결합에 의해 연결된 중쇄 및 경쇄로 구성된 이사슬 폴리펩티드 형태의 활성화 폴리펩티드가 생성된다. 인간에서, 중쇄는 연접 이전 콜린성 신경 말단에의 결합, 및 세포에의 톡신의 내재화를 매개한다. 경쇄는 아연-엔도펩티다아제로서 작용하고 막 융합을 담당하는 특정 단백질(SNARE 복합체)를 제거하면서 독성 효과를 담당하는 것으로 여겨진다[예컨대 문헌(Montecucco C, Shiavo G., Rosetto O: The mechanism of action of tetanus and Botulinum neurotoxins. Arch Toxicol. 1996; 18 (Suppl.): 342-354) 참고].

본 출원 전체에서 사용된 바의 용어 "보툴리눔 톡신"은 임의의 다른 클로스트리듐 단백질이 결여된 신경 독성 성분을 지칭하지만, "보툴리눔 톡신 복합체"도 지칭한다. 용어 "보툴리눔 톡신"은 본 명세서에서 톡신 복합체와 신경 독성 성분 사이의 구별이 필요없거나 요구되지 않을 경우 사용된다. "BoNT" 또는 "NT"는 보통 각각 보툴리눔 신경독 또는 신경독에 대한 약자로서 사용된다. 보툴리눔 톡신 복합체의 신경 독성 소단위는 본 문헌에서 "신경 독성 성분" 또는 "착화 단백질이 없는 신경 독성 성분"으로서 지칭된다. 보툴리눔 톡신 A형 및 B형의 신경 독성 성분의 생성은 예컨대 국제 특허 출원 WO 00/74703에 개시되어 있다.

몇 가지 혈청형은 이의 치료 효과 지속 기간이 상이하며, 보툴리눔 톡신 A 약물의 통상적인 활성 기간은 인간에게 근육내 주입할 경우 3 내지 4 개월이다. 하나의 경우, 기간은 12 개월을 초과하여 연장될 수도 있다. 땀샘의 치료 동안, 심지어 27 개월의 활성도 보고되어 있다[문헌(Bushara K., Botulinum toxin and rhinorrhea, Otolaryngol. Head. Neck. Surg., 1996; 114(3):507 and Laryngoscope 109: 1344 1346:1999)]. 보툴리눔 톡신 C1형에 대한 활성 기간은 보툴리눔 톡신 A의 활성 기간에 필적한다[문헌(Elepra et al., 1997 & 2002)]. 놀랍게도, 작용 기간은 인간에 비해 설치류(예컨대 마우스)에서 훨씬 짧으며, 보툴리눔 톡신 A에 대해 약 1 내지 2 개월, 보툴리눔 톡신 B에 대해 21 일, 그리고 보툴리눔 톡신 E에 대해 겨우 4 일이다[문헌(DePaiva et al., 1999, Juradinski et al., 2001)].

2003년에 분석한 Foran 등에 따르면, 래트의 소뇌 뉴런 상의 실험관내 작용 기간은, 보툴리눔 톡신 A에 대해 31 일 초과, 보툴리눔 톡신 C1형에 대해 25 일 초과, 보툴리눔 톡신 B형에 대해 약 10 일, 보툴리눔 톡신 F형에 대해 약 2 일, 그리고 보툴리눔 톡신 E형에 대해 겨우 0.8 일로서 글루타메이트 세포외 유출의 억제의 1/2 배로 밝혀졌다.

인간에서 예컨대 근육 긴장 이상(예컨대 사경, 안검 연축)의 치료 동안 보툴리눔 톡신 A형의 활성 기간은 3 내지 4 개월이다. 이 기간 후, 환자는 보툴리눔 톡신 함유 약물의 다른 주사를 받아야 한다. 신경독의 작용 기간을 연장시키는 것이 환자에게 크게 유리할 수 있다. 그렇게 함으로써, 연간 필요한 주사의 수 뿐 아니라 클로스트리듐 단백질의 전체량도 감소시킬 수 있다. 이는 외부 단백질에 대한 항체의 생성 위험을 감소시킬 수 있다. 따라서, 지속성이 연장된 보툴리눔 톡신을 제공하는 것이 요망된다.

그러나, 항상 장기간의 마비 상태가 요망되는 것은 아니다. 예컨대 특정 미용적 치료의 경우, 종종 단지 일시적인 "미세 조정"이 필요하다. 지속성의 감소를 달성하기 위해, 의사는 종래 기술의 방법에서 혈청형의 양의 감소 또는 전환을 제한하였다. 이러한 기술은 불만족스러운 결과를 가져오는 것으로 밝혀졌으며, 상이한 신경독 혈청형의 활성 역동학 뿐 아니라 항원성 모두의 깊은 지식을 필요로 하였다. 따라서, 지속성이 "고유하게" 조정된 신경독의 제공은 주요한 개선점일 수 있다.

US 2003/0219462, EP1849801 및 WO 02/08268은 천연 신경독에 류신 또는 티로신을 기본으로 하는 모티브가 첨가된 변형된 보툴리눔 톡신을 개시한다.

이들 변경에 대한 아이디어는, 특정 류신 또는 티로신을 기본으로 하는 모티브가 표적 세포의 내부 막으로의 특정 아형의 신경 독성 성분의 경쇄의 편재화를 가능하게 한다는 관찰을 기초로 한 것이다. 이 기전이 특정 경쇄의 지속성을 변화시킨다고 가정하였다. 그러나, 이제까지 본 발명자들은 이러한 효과에 대한 어떠한 증거도 제공하지 못 했고, 모든 가정이 부정확하다는 새로운 실험도 제시하지 못 했다.

또한, 모티브의 첨가로 막 편재화가 일어날 수 있는 특정 경우라도, 이러한 접근은 보툴리눔 톡신 A의 변형에 적용 가능하지 않다. 이는 보툴리눔 톡신 A형의 천연 경쇄가 이미 내부 세포 막에 편재화되어서, 막에 대한 추가의 구속이 추가의 이익을 제공하지 않기 때문이다.

따라서, 본 발명은 상이한 경로를 제공한다. 본 출원에 개시된 바와 같이, 여전히 단백질 분해 활성을 갖는 신경독에 대한 제2 경쇄의 첨가로 활성 기간의 변경이 초래됨이 밝혀졌다. 사용되는 혈청형의 조합에 따라, 기간이 연장되어 딱 맞는 신경독의 생성이 가능해질 수 있다. 혈청형이 지속성과는 독립적이어서 더욱 표준화된 치료를 가능하게 하는 다양한 신경독을 의사하게 제공할 수 있는 것으로 생각된다.

발명의 개요

본 발명은 활성, 즉 지속성이 증가 또는 연장된 클로스트리듐 신경독, 일구체예에서 보툴리눔 톡신에 관한 것이다. 따라서, 제1 측면에서, 본 출원은

(a) 클로스트리듐 톡신의 신경 독성 성분의 HC 도메인 또는 이의 단편;

(b) 클로스트리듐 톡신의 신경 독성 성분의 제1 LC 도메인 또는 이의 단편; 및

(c) 클로스트리듐 톡신의 신경 독성 성분의 1 이상의 추가의 LC 도메인 또는 이의 단편

을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 제1 및 1 이상의 추가의 LC 도메인은 서로 동일 또는 상이할 수 있고, 상기 제1 및 상기 1 이상의 추가의 LC 도메인의 상기 단편 각각은 여전히 단백질 분해 활성을 나타낸다.

일구체예에서, 단위 및/또는 도메인은 결합, 펩티드 링커, 화학적 링커, 디설피드 결합을 통해, 또는 이의 2 이상의 조합을 통해 연결된다.

일구체예에서, 상기 LC 및/또는 HC 도메인의 아미노산 서열은 혈청형 A, B, C, D, E, F 또는 G의 보툴리눔 톡신의 신경 독성 성분의 아미노산 서열과 50% 이상 동일하다.

다른 구체예에서, 상기 LC 및/또는 HC 도메인의 아미노산 서열은 파상풍 톡신(파상풍 독소)의 아미노산 서열과 50% 이상 동일하다.

일구체예에서, 제1 및/또는 제2 LC 도메인 및/또는 HC 도메인은 1 이상의 변형을 포함한다.

일구체예에서, 변형은 돌연변이이거나, 다른 구체예에서는 결손이거나, 또 다른 구체예에서는 삽입이거나, 또 다른 구체예에서는 첨가이거나, 또는 또 다른 구체예에서는 아미노산 교환이거나, 또는 추가의 구체예에서는 이의 2 이상의 조합이다.

일구체예에서, 본 발명은 폴리펩티드에 관한 것으로서, 여기서 HC 도메인이 유래하는 야생형 신경독에 비해 결합능을 강화하도록 신경독의 강글리오시드 결합 도메인 및/또는 단백질 수용체 결합 도메인이 변형된다.

일구체예에서, 폴리펩티드는 LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C 및 LCTeNT-LCBoNT/A-HCBoNT/A로 구성된 군에서 선택된다.

또 다른 구체예에서, 변형은 화학적 변형이며, 화학적 변형은 인산화, 페길화(pegylation), 당화, 인산화, 설페이트화(sulfatation), 메틸화, 아세틸화, 지질화(lipidation), 수산화, 아미드화를 포함하는 군에서 선택될 수 있거나, 또는 추가의 구체예에서는 이의 2 이상의 조합일 수 있다. 추가의 구체예에서, 지질화는 미리스토일화(myristoylation), 팔미토일화(plamitoylation), 이소프레닐화(isoprenylation) 또는 글루코실-포스파티딜리노시톨의 결합이거나, 또는 추가의 구체예에서, 이의 2 이상의 조합일 수 있다.

본 발명은 또한 상기 언급한 폴리펩티드 중 임의의 것에 대해 특이적인 항체를 개시한다.

본 발명은 또한 상기 언급한 폴리펩티드 중 임의의 것을 코딩하는 핵산을 개시한다. 본 발명은 또한 상기 핵산 또는 이의 단편을 포함하는 벡터를 개시한다. 상기 핵산 또는 상기 벡터를 포함하는 숙주 세포도 본 명세서에 개시된다.

본 발명은 또한 상기 언급한 바의 숙주 세포를 배양하는 단계, 상기 핵산 또는 벡터에 의해 코딩된 상기 폴리펩티드를 생성 및 정제하는 단계, 및 임의로 상기 폴리펩티드를 약학적 조성물로 제제화하는 단계를 포함하는 폴리펩티드의 제조 방법을 개시한다.

본 발명은 또한 상기 언급한 폴리펩티드 또는 상기 언급한 방법에 의해 얻을 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 개시한다. 본 발명은 또한 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 상기 조성물을 개시한다. 다른 구체예에서, 조성물은 pH 완충제, 부형제, 동결 방지제, 보존제, 진통제, 안정화제 또는 이의 임의의 조합을 추가로 포함한다. 일구체예에서, 조성물은 동결 건조물(lyophilisate)로서 제공된다. 다른 구체예에서, 조성물은 용액으로서 제공된다.

본 발명은 또한 요법 치료에 사용하기 위한 상기 조성물을 개시한다.

본 발명은 또한 요법 치료에 사용하기 위한 약제의 제조를 위한 상기 조성물의 용도를 개시한다.

일구체예에서, 상기 요법 치료는 국소성 근긴장 이상, 경직 또는 분비를 억제하여 치료할 수 있는 병태의 치료를 포함한다.

본 발명은 또한 미용적 치료를 위한 상기 조성물의 용도를 개시한다. 이러한 미용적 치료에 있어서, 치료하고자 하는 병태, 예컨대 주름 또는 미간 주름(glabella frown line)으로 심리적으로 고통받는 특정 포유 동물이 양호하게 치료될 수 있다.

발명의 상세한 설명

본 발명은

(b) 제1 LC 도메인 또는 이의 단편; 및

(c) 1 이상의 추가의 LC 도메인 또는 이의 단편

을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 제1 및 제2 LC 도메인은 서로 동일 또는 상이할 수 있다.

특히, 본 발명은

을 포함하는 폴리펩티드에 관한 것으로서, 상기 제1 및 1 이상의 추가의 LC 도메인은 서로 동일 또는 상이할 수 있고, 상기 제1 및 상기 1 이상의 추가의 LC 도메인의 상기 단편 각각은 여전히 단백질 분해 활성을 나타낸다.

놀랍게도, 1 이상의(추가의) 경쇄(LC)를 상기 정의한 바의 클로스트리듐 신경독의 신경 독성 성분의 1 이상의 중쇄(HC) 및 1 이상의 경쇄(LC)를 포함하는 폴리펩티드에 첨가하면 야생형 톡신에 비해 톡신 활성의 지속성이 증가, 즉 연장된 폴리펩티드가 생성됨이 발견되었다.

이론에 구속시키려는 것은 아니지만, 세포 표면에의 결합 후, 양쪽 경쇄를 세포로 이동시키면 세포 내 단백질 분해 활성 단백질의 농도가 증가하여 신경독의 활성 뿐 아니라 지속성 모두 증가한다고 가정하였다.

즉, 본 발명의 폴리펩티드의 긴 지속성을 요망하는 경우, 당업자는 HC 및 LC 도메인의 특정 조합, 예컨대 지속성이 긴 혈청형으로부터 유래하는 LC 도메인을 사용하라고 지시받는다. 다른 구체예에서, 특정한 다른 LC 도메인 또는 단편, 예컨대 지속성이 더 짧은 혈청형으로부터 유래한 것들을 조합하여 더 짧은 지속성이 달성된다.

본 명세서에 사용된 바의 용어 "지속성"은 신경 독성 성분의 작용 기간을 나타낸다. 일반적으로, 이는 활성 제제가 이의 출발 활성에 비해 이의 활성의 1/2만을 나타낼 때까지의 기간이다. 따라서, 용어 "지속성"은 대사 과정으로 인해 출발 단백질의 농도의 1/2만이 활성화되는 시점, 즉 단백질이 대사화될 때까지의 반감기를 정의하는 용어 "활성의 반감기" 또는 용어 "대사 안정성의 반감기"와 동의어로 사용될 수 있다. 단백질의 반감기는 치료 효과의 지속 기간과 상호 관련 있으므로, 용어 "지속성"도 세포 기능을 갖는 신경 독성 성분에 의해 초래되는 간섭 또는 영향의 지속 기간을 간접적으로 포함한다.

당업자는 지속성을 측정하기 위한 다양한 분석을 알고 있다. 본 발명의 교시에 따르면, 지속성은 마우스 러닝(running) 분석을 이용하여 측정할 수 있다[문헌(Keller JE., 2006, Neuroscience. 139(2):629-37)]. 이 분석으로 지속성을 운동 활성과 상호 관련시킬 수 있다. 대안적으로, 지속성은 SNAP-25 분할 분석을 이용하여 측정할 수 있는데, 이 분석은 단백질 분해 활성을 지속성과 상호 관련시킬 수 있다. 상기 기재한 분석 중 하나에서 지속성 증가가 측정될 수 있으면, 지속성 증가 효과가 충족되며, 여기서 SNAP-25 분할 분석이 바람직하다.

용어 "지속성 증가" 및 "지속성 연장"은 본 명세서에서 교환 가능하게 사용된다.

지속성과 관련하여 본 발명의 폴리펩티드에 대한 추가 LC 사슬 또는 LC 사슬 단편의 영향을 측정하기 위해, 본 발명의 폴리펩티드를 상기 추가(추가의) LC 사슬이 부족한 상당하는 폴리펩티드와 비교한다. 이는 예컨대 추가 LC 사슬이 결손된 본 발명의 폴리펩티드일 수 있다. 당업자에게 공지된 지속성 분석 중 임의의 것을 지속성 측정에 사용할 수 있다. 일구체예에서, 지속성은 상기 본 명세서에 또는 본 발명을 예시하는 실시에에 기재된 바와 같이 측정한다.

다른 구체예에서, 단작용 신경독 혈청형의 지속성의 연장이 고려된다. 예컨대 혈청형 E의 지속성은, 예컨대 혈청형 A와 같은 장기 활성 혈청형의 경쇄를 첨가하여 야생형 보툴리눔 톡신 A와 유사한 지속성을 갖는 신경독을 생성시켜 연장할 수 있다. 신경독의 항원 에피토프의 대부분은 중쇄 소단위 상에 위치하기 때문에, 이 변형은 특정 혈청형에 대해 면역 반응을 발전시킨 환자에서 신경독을 적용하는 데에 사용할 수 있다. 이에 의해 이전 활성 기간을 유지시켜 상이한 혈청형을 제공하는 이점을 조합한다.

상기 기재한 바와 같이, 용어 "HC 도메인" 및 "LC 도메인"은 야생형 또는 재조합 기원의 신경독의 신경 독성 성분의 중쇄 및 경쇄를 각각 지칭한다. 또한, 일부 구체예에서, HC 및/또는 LC 도메인은 상이한 혈청형 및/또는 상이한 톡신으로부터 유래한다. 이 정의에는 경쇄 및 중쇄의 단편도 포함된다. HC 및 LC 도메인은 추가로 하위 도메인으로 더 하위 분류될 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바의 용어 "추가의 LC 도메인 또는 이의 단편"은 1 이상, 예컨대 제2의 LC 도메인을 지칭한다. 본 발명의 교시에 따르면, 본 발명의 폴리펩티드는 추가 LC 도메인 또는 이의 단편을 더 포함할 수 있다. 예컨대, 본 발명의 폴리펩티드는 클로스트리듐 톡신의 신경 독성 성분의 HC 도메인 및 제1 LC 도메인 또는 이의 단편 및 제2 LC 도메인 또는 이의 단편 및 제3 LC 도메인 또는 이의 단편을 포함할 수 있다.

일구체예에서, 상기 제1 및 상기 추가의 LC 도메인의 상기 단편은 야생형 LC의 단백질 분해 활성을 나타낸다.

상기 지속성 증가 효과를 달성하기 위해, (US 2003/0219462, EP1849801 및 WO 02/08268에 개시된 바의) 추가의 류신 또는 티로신을 기본으로 하는 모티브는 필요하지도 요구되지도 않는다. 따라서, 일구체예에서, 추가 경쇄는 상기 모티브 중 어느 것도 갖지 않는다.

일구체예에서, 변형된 신경독은 몇 개의 아미노산을 포함하는 류신을 기본으로 하는 모티브를 함유하지 않으며, 여기서 류신을 기본으로 하는 모티브의 아미노 말단에서 출발하는 제1의 5개의 아미노산은 "5개 한 벌의 아미노산"을 형성하고, 다음의 2개의 아미노산은 "2개 한 벌의 아미노산"을 형성하며, 여기서 5개 한 벌의 아미노산은 글루타메이트 및 아스파르테이트로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 아미노산을 포함하고; 2개 한 벌의 아미노산은 이소류신 및 류신으로 구성된 군에서 선택되는 1 이상의 아미노산을 포함한다.

다른 구체예에서, 변형된 신경독은 서열 FEFYKLL, EEKRAIL, EEKMAIL, SERDVLL, VDTQVLL, AEVQALL, SDKQNLL, SDRQNLI1 ADTQVLM, SDKQTLL, SQIKRLL, ADTQALL 및 NEQSPLL 중 어느 것도 포함하지 않는다.

본 명세서에서 사용된 바의 용어 "∼과 동일"은 동일한 아미노산 서열, 즉 100% 아미노산 서열 상동성을 갖는 LC 도메인을 지칭한다. 따라서, 본 명세서에서 사용된 바의 "동일"한 제2 LC 도메인은 상기 제1 LC 도메인에 대한 아미노산 서열이 동일함을 의미한다. 한편, "상이한" 제2 도메인은 예컨대 제1 LC 도메인에 비해 100% 미만의, 즉 99.95% 이하의 서열 상동성을 갖는 제2 LC 도메인을 지칭한다. "상이한 LC 도메인"은 제1 LC 도메인과는 상이한 아미노산 서열, 즉 예컨대 아미노산이 치환된 아미노산 서열을 갖는 LC 도메인 또는 상이한 혈청형의 LC 도메인이다. 상이한 LC 도메인의 다른 예는 N 또는 C 말단에서의 절단 또는 내부 결손을 갖는 LC 도메인이다. 상이한 LC 도메인의 또 다른 예는 화학적 변형을 갖는 LC 도메인이다. 따라서, "상이한 LC 도메인"은 각각 제1 LC 도메인에 비해 동일 또는 상이한 혈청형으로부터 유래할 수 있다. 상기를 또한 "제3" 또는 임의의 다른 추가 LC 도메인에 적용한다.

일구체예에서, 모든 HC 및 LC 도메인의 혈청형은 보툴리눔 톡신 A형에서 유래하고, 다른 구체예에서, 제2 경쇄는 혈청형 C1의 것이다. 그러나, 혈청형 A, B, C1, D, E, F 및 G의 모든 가능한 조합이 본 출원에 의해 커버되며, 당업자는 공개된 상이한 혈청형의 지속성을 기준으로 적당한 조합을 선택할 수 있음이 당업자에게는 명백하다. 사용되는 중쇄 및 경쇄의 혈청형의 조합도 수도 본 발명에 의해 제한되지 않는다. 따라서, 다른 구체예에서, 더 긴 융합 단백질, 즉 3개 초과의 소단위를 갖는 융합 단백질, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 LC 도메인을 포함하는 단백질 연쇄 동일 서열(concatemer)이 고려된다.

클로스트리듐 보툴리눔의 예컨대 신경독 A의 HC 및 LC 도메인은 상이한 하위 도메인(subdomain)을 포함한다. HC 도메인은 예컨대 3개의 하위 도메인, 즉 카르복시 말단에 위치한 후속의 25 kDa HC_CN 하위 도메인 및 25 kDa HC_CC 하위 도메인을 갖는 아미노산 말단 50 kDa 전위 하위 도메인을 포함한다. HC_N-, HC_CN 및 HC_CC 도메인을 함께 HC 도메인으로 지칭한다.

각각의 도메인의 각각의 아미노산 범위를 하기 표 1에 상이한 BoNT/A 혈청형 및 이의 변이에 대해 나타낸다.

본 명세서에서 사용된 바의 용어 "LC 도메인의 단편"은 생물학적 활성을 갖는 LC 도메인의 단편을 지칭한다. 본 명세서에서 사용된 바의 생물학적 활성을 갖는 단편은 바람직하게는 야생형 LC의 단백질 분해 활성, 즉 예컨대 신탁신(syntaxin), SNAP-25 또는 시냅토브레빈(synaptobrevin)과 같은 SNARE 복합체의 폴리펩티드를 분할할 수 있는 단백질 분해 활성을 여전히 나타내는 단편이다. 따라서, 생물학적 활성은 예컨대 SNAP-25 단백 분해 효소 분석, LD₅₀ 분석, HDA 분석 등에 의해 시험할 수 있다. 따라서, SNAP-25 분석에서 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 초과 및 100% 이하의 상당하는 야생형 LC 도메인의 단백질 분해 활성을 나타내는 임의의 LC 도메인을 본 발명의 범위 내에서 "생물학적으로 활성이 있는" 또는 "단백질 분해 활성을 나타내는" 것으로 고려한다.

적절한 SNAP-25 분석은 예컨대 "GFP-SNAP25 형광 방출 분석"(WO/2006/020748) 또는 "개선된 SNAP25 엔도펩티다아제 면역 분석"[문헌(Jones et al., Journal of Immunological Method, Volume 329, Issues 1-2, 1 January 2008, Pages 92-101)]이다.

본 명세서에서 사용된 바의 "HC 도메인의 단편"은 생물학적 활성을 갖는 HC 도메인의 단편을 지칭한다. 더욱 상세하게는, 이는 단편이 유래하는 천연 HC 도메인 수용체에 여전히 결합할 수 있는 단편이다. 또한, 상기 단편은 또한 이에 부착된 LC 도메인을 전위시킬 수 있다.

따라서, 단편은 1, 2, 3, 5 개 또는 10, 50 또는 100 개 이하의 아미노산이 결손된 폴리펩티드이다. 여기서 결손은 C 또는 N 말단에서의 결손이거나 또는 내부 결손이다.

일부 구체예에서, HC 및/또는 LC 도메인은 예컨대 돌연변이, 결손, 삽입, 첨가 또는 아미노산 교환에 의해 추가로 변형된다. 추가의 구체예에서, HC 및/또는 LC는 예컨대 인산화, 페길화, 당화, 인산화, 설페이트화, 메틸화, 아세틸화, 지질화(미리스토일화, 팔미토일화, 이소프레닐화, 글루코실-포스파티딜이노시톨의 결합), 수산화, 아미드화 또는 임의의 다른 적절한 변형에 의해 추가로 화학적으로 변형된다. 추가로, 신경독의 강글리오시드 결합 도메인 및/또는 결합 도메인은 일구체예에서, HC 도메인이 유래하는 야생형 신경독에 비해 결합능을 강화하도록 변형된다. 일부 구체예에서, HC 및/또는 LC는 간단화된 정제 절차를 가능하게 하는 표지(tag) 서열, 즉 다른 아미노산 서열을 포함한다.

용어 "정제 방법"은 단백질 정제 분야에 공지된 모든 방법을 포함한다. 신경독의 정제 방법의 예는 본 명세서에서 참고로 인용하는 DasGupta & Sathyamoorthy의 간행물 및 WO2000074703에 기재되어 있다. 재조합 신경 독성 성분의 정제에 유용한 단백질 정제 방법의 추가의 안내를 위해, 하기 "문헌" 부분에 기재된 문헌(Walker et al., 2002; Harris et al. 1989 and Scopes et al., 1994)을 참고하라.

용어 "폴리펩티드의 생성"은 폴리펩티드의 생성에 필요한 모든 단계, 즉 예컨대 코딩 핵산의 생성, 상기 핵산의 벡터에의 삽입, 시험관내 폴리펩티드 및/또는 숙주 세포의 발현, 생체 내 폴리펩티드의 변형 및/또는 생체내 폴리펩티드의 정제 및/또는 상기 폴리펩티드를 함유하는 조성물의 생성을 포함한다. 이에 의해, 용어 "발현" 또는 "유전자 발현"은 본 명세서에서 DNA 서열과 같은 유전자 내 유전성(inheritable) 정보가 단백질 또는 RNA와 같은 기능성 유전자 생성물로 제조되는 과정으로서 정의된다.

일구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드에 추가의 수용체 결합 부위를 삽입하여 증가된 지속성 외에 새로운 응용, 예컨대 알러지 또는 통증의 치료에 적절한 특이적인 결합 부위를 갖는 신경독에의 응용을 가능하게 하는 추가의 특성을 갖는 신경독을 제공하는 것이 고려될 수 있다(WO 2007/13839). 대안적으로, 본 발명의 폴리펩티드를 특이적인 세포 유형, 더욱 특정한 예에서 본 발명의 HC 도메인으로 표적화하기 위해 HC 도메인 내에 위치하는 천연 결합 부위를 변경할 수 있다.

일구체예에서, 제2 경쇄는 제1 경쇄의 N 말단에 연결된다. 이 연결은 결합을 통해 직접적으로 또는 링커를 통해 간접적으로 이루어질 수 있다. 일반적으로, 도메인 사이의 결합은 다른 것 중에서 직접 결합 또는 펩티드 링커, 화학적 링커 또는 디설피드 결합을 통한 결합을 포함하는 상이한 소단위를 함께 유지하기에 적절한 임의의 실체(entity)를 통해 달성될 수 있다. 상기 결합은 분할 가능하거나 분할 불가능한 결합일 수 있다. 분할 가능한 결합은 예컨대 서열 특이적 단백 분해 효소에 의해 분할 가능한 결합이다. 분할 불가능한 결합은 세포 흡입 후에 안정한, 즉 분할 불가능한 결합에 의해 연결된 몇 개의 LC 도메인이 세포질로의 전위 후에도 서로 결합된 상태로 남아 있는 결합이다.

용어 "결합", "결합들" 또는 "결합하는"은 상이한 폴리펩티드 사슬을 서로 연결하는 임의의 가능성을 기술한다. 일구체예에서, 상기 결합은 화학적 결합, 예컨대 공유 결합(예컨대 디설피드 결합), 극성 공유 결합, 이온 결합, 배위 공유 결합, 굽은 결합(bent bond), 3c-2e 및 3c-4e 결합, 1개 및 3개 전자 결합, 방향족 결합, 금속 결합, 분자간 결합, 영구 쌍극자 대 영구 쌍극자 결합, 수소 결합, 순간적 쌍극자 대 유도 쌍극자(반데르 발스) 결합 및/또는 양이온-pi 상호 작용이다. 상기 언급한 바와 같이, 이 정의는 직접 결합 뿐 아니라, 화학적 링커를 통한 간접 결합도 포함한다.

"화학적 링커"는 본 명세서에서 본 발명의 폴리펩티드의 상이한 소단위를 연결하기에 적절한 화학적 수단에 의해 생성된 분자 실체로서 정의된다. 이 화학적 결합은 예컨대 당업계에 공지된 이작용성 제제에 의해 달성될 수 있다. 다른 구체예에서, 화학적 결합은 야생형에서의 중쇄 및 경쇄 사이의 연결과 유사한 디설피드 결합에 의해 달성된다. 또 다른 구체예에서, 디설피드 결합의 도입은 경쇄에 중쇄의 서열(예컨대 BoNT/A의 aa 449-459)을 포함하는 시스테인을 도입하여 달성된다. 이러한 화학적 링커의 추가의 비제한적인 예는 카르복실산, 에톡실화 다가 알콜, 폴리비닐 피롤리딘, 폴리에틸렌 글리콜 등이다.

"펩티드 링커"는 본 명세서에서 본 발명의 폴리펩티드의 상이한 소단위를 서로 연결하는, 길이가 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50 개 또는 100 개 이하인 아미노산의 펩티드로서 정의된다. 일구체예에서, 상기 펩티드 링커는 2 이상의 시스테인을 포함한다. 다른 구체예에서, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 개 또는 20 개 이하의 히스티딘을 포함하고, 다른 구체예에서 링커는 단백 분해 효소 분할 부위이다. 추가의 구체예에서, 링커는 재조합 방법에 의해 완전 융합 단백질을 생성시킬 수 있다.

다른 구체예에서, 단백 분해 효소 분할 부위, 예컨대 DE102005002978에 기재된 것과 같은 대장균 단백 분해 효소(이 단백 분해 효소에 제한되지 않음)에 의해 절단될 수 있는 부위를 제1 경쇄와 제2 경쇄 사이에 도입할 수 있다. 다른 구체예에서, 단백 분해 효소 분할 부위는 세린 단백 분해 효소(예컨대 키모트립신, 트립신, 엘라스타아제, 서브틸리신), 트레오닌 단백 분해 효소, 시스테인 단백 분해 효소(예컨대 파파인, 카텝신, 카스파아제, 칼파인), 아스파르트산 단백 분해 효소(예컨대 HIV-단백 분해 효소, 키모신, 레닌, 카텝신, 펩신, 플라스멥신), 금속 단백 분해 효소 또는 글루탐산 단백 분해 효소 또는 이의 임의의 조합에 대한 인지 부위 중 어느 하나이다.

당업자는 본 발명이 야생형 중쇄(들) 및 경쇄(들)의 사용에 적절한 뿐 아니라, 재조합 펩티드 및/또는 혼성 신경 독성 성분이 본 발명에 포함됨도 이해할 것이다. 따라서, 일구체예에서, 1 이상이 중쇄, 적어도 제1 경쇄 및 적어도 제2 경쇄의 융합 단백질이 고려되는데, 여기서 사용된 도메인의 1 이상, 일부 또는 전부는 재조합에 의해 생성되고, 다른 구체예에서, 혼성 펩티드, 즉 상이한 혈청형 유래의 하위 도메인(예컨대 상이한 혈청형 또는 심지어 상이한 톡신, 예컨대 파상풍 톡신, 콜레라 톡신 또는 백일해 톡신의 전위 도메인 및 결합을 포함하는 중쇄)으로 구성된 펩티드가 사용된다.

다른 구체예에서, 다른 클로스트리듐 톡신, 예컨대 클로스트리듐 비퍼멘탄스(bifermentans), 상이한 혈청형의 클로스트리듐 보툴리눔, 클로스트리듐 디피사일(difficile), 클로스트리듐 히스톨리티쿰(histolyticum), 클로스트리듐 클루이베리(kluyveri), 클로스트리듐 노비이(novyi), 클로스트리듐 오에데마티엔스(oedematiens), 클로스트리듐 퍼프린젠스(perfringens), 클로스트리듐 라모숨(ramosum), 클로스트리듐 스포로겐스(sporogenes), 클로스트리듐 테타니(tetani), 클로스트리듐 터티움(tertium) 또는 클로스트리듐 웰치이(welchii)의 경쇄(들)를 사용할 수 있고, 예컨대 일구체예에서, 파상풍 톡신[파상풍 독소 또는 연축 형성(spasmogenic) 톡신으로도 지칭됨] 뿐 아니라 상이한 톡신의 임의의 변이 및 혈청형도 사용된다. 또한, 중쇄의 세포 결합부를 융합 단백질에 다른 표적 도메인, 즉 다른 세포 특이성을 부여하는 폴리펩티드 서열로 교환할 수 있다(예컨대 WO 2007/13839). 또한, 본 발명의 또 다른 구체예는 분자 또는 생화학적 방법, 더욱 바람직하게는 결손, 삽입, 아미노산 교환 또는 연장에 의해 변경된 중쇄 및 경쇄를 사용한다.

일구체예에서, HC(즉, 중쇄의 N-말단부)의 전위 하위 도메인의 혈청형은 제1 LC의 것과 동일한 혈청형이다.

일구체예에서, LC 도메인의 SNARE-복합체 분할능이 가장 중요하다. 따라서, 일구체예에서, 융합 단백질의 LC 도메인 중 하나가 역시 SNARE-복합체 분할능을 갖는 임균에서 유래하는 IGA 단백 분해 효소로 교환된다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 또한 예컨대 특히 1 이상의 표면 또는 용매에 노출된 아미노산(들)의 페길화, 당화, 설페이트화, 인산화 또는 임의의 다른 변형에 의해 화학적으로 변형된 신경독에 관한 것이다.

또한, 다른 구체예에서, 신경독은 간단화된 정제 방법을 가능하게 하는 표지 서열을 갖는다. 이러한 공지된 라벨링 방법은 본 발명의 폴리펩티드에 공유 또는 비공유 결합되고 친화도 크로마토그래피, 비드 또는 다른 분리 방법을 통한 정제를 가능하게 하는 동일한 소분자 또는 펩티드, 예컨대 비오틴, 스트렙타비딘, Strep-표지, His-표지, 항원, 항체-단편 등을 사용한다.

상기 기술한 바와 같이, 일부 구체예에서, 융합 단백질은 재조합 도메인을 함유하거나 완전히 재조합에 의해 생성된다. 보툴리눔 톡신의 모든 혈청형의 모든 중쇄 및 경쇄의 DNA 서열은 공개적인 데이터베이스로부터 입수 가능하다. 따라서, 이들 데이터베이스 정보에 의존하여 중쇄 및 경쇄에 대한 소정 유전자를 보유하는 벡터를 구성하는 것이 고려된다. 그 다음, 벡터는 예컨대 대장균에서 발현되어 융합 단백질을 생성시킨다. 다른 구체예에서, 벡터는 예컨대 효모, 곤충 세포 또는 CHO 세포와 같은 다른 발현 시스템에서 발현될 수 있다. 다른 구체예에서, 단백질 도메인은 개별적으로 생성된 후 화학적 방법에 의해 추후에 연결된다. 그 다음, 생성된 단백질은 공지된 단백질 정제 방법에 의해 단리된 후, 필요할 경우 추가로 가공(예컨대 분할, 화학적 결합 또는 처리)되어 약학적 제제 내 활성제로서 사용된다.

일구체예에서, 변형된 신경독을 추가로 변형하여 이의 수용체에 대한 이의 결합 친화도를 변경(즉, 증가 및 감소)시킨다. 결합 친화도는 천연 신경독, 즉 클로스트리튬 보툴리눔으로부터 유래하고 야생형 아미노산 서열을 갖는 신경독과 비교해 측정할 수 있다. 대안적으로, 상기 신경독의 단편을 사용하여 결합 분석을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 상기 신경독은 클로스트리튬 보툴리눔으로부터 얻을 수 있다. 친화도가 증가된다는 것은, 본 발명에 따른 신경독이 비변형 신경독에 비해 더 낮은 해리 상수를 가짐을 의미한다. 바람직하게는, 천연 신경독은 하기에 상세히 정의된 임의의 아형 A를 비롯한 혈청형 A의 보툴리눔 신경독이다. 아미노산 서열이 클로스트리튬 보툴리눔으로부터 얻은 보툴리눔 신경독과 동일한 재조합에 의해 생성된 혈청형 A의 보툴리눔 신경독은 클로스트리튬 보툴리눔으로부터 얻은 천연 보툴리눔 신경독과 약리학적으로 동일 또는 유사하게 거동한다. 이러한 재조합 신경독은 예컨대 대장균에서 생성될 수 있으며, 보통 "재조합 보툴리눔 신경독"으로 지칭된다. 클로스트리튬 보툴리눔으로부터 단리한 신경독 또는 재조합 단백질 발현에 의해 얻은 신경독을 사용하여 결합 분석을 수행할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 폴리펩티드, 활성 단편 또는 유도체는 형질막 관련 분자, 막 횡단 단백질, 시냅스 수포 단백질, 시냅토태그민 패밀리의 단백질 또는 시냅스 수포 당단백질 2(SV2), 바람직하게는 시냅토태그민 I 및/또는 시냅토태그민 Il 및/또는 SV2A, SV2B 또는 SV2C, 특히 바람직하게는 인간 시냅토태그민 I 및/또는 인간 시냅토태그민 II 및/또는 인간 SV2A, SV2B 또는 SV2C에 특이적으로 결합한다. 결합은 바람직하게는 시험관 내에서 측정한다. 당업자는 제1 단백질(신경독)과 제2 단백질(수용체) 사이의 결합 친화도를 측정하기 위한 다양한 분석을 알고 있다. 임의의 이러한 분석은 수용체 결합에 대한 돌연변이의 효과 측정에 유용할 수 있다. 이러한 분석 중 하나가 본 발명의 교시에 따라 바람직한 GST-풀 다운 분석(GST-pull-down-assay)이다. 이 분석은 본 발명의 실시예에 기재되어 있다. 표면 플라스몬 공명도는 결합 친화도의 연구에 사용할 수 있다. 따라서, 실험 조건은 예컨대 문헌[Yowler et al., Biochemistry 43(2004), 9725-9731]에 기재되어 있다. 또한, 결합 친화도는 등온 미세 열량계를 이용하여 평가할 수 있다. 일구체예에서, HC 도메인이 유래하는 야생형 신경독에 비해 결합능을 강화하도록 신경독의 강글리오시드 결합 도메인 및/또는 단백질 수용체 결합 도메인을 변형한다. 참고 문헌으로서, 본 문헌에서 전체를 참고로 인용하는 WO2006/027207 A1, WO 2006/114308 A1 및 PCT/EP2008/006151(EP 07 014 785.5)을 참고한다.

다른 구체예에서, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상 및 60% 이하, 70% 이하, 80% 이하, 90% 이하, 100% 이하의 서열 상동성을 나타내는 보툴리눔 톡신의 이소형, 동족체, 오르토로그(ortholog) 및 파라로그(paralog)도 포함된다. 서열 상동성은 신뢰 가능한 결과를 얻기에 적절한 임의의 알고리즘에 의해, 예컨대 FASTA 알고리즘[문헌(W.R. Pearson & D.J. Lipman PNAS (1988) 85:2444-2448)]을 이용하여 계산할 수 있다. 서열 상동성은 2개의 LC 도메인 또는 이의 단편과 같은 2개의 도메인 또는 2개의 폴리펩티드를 비교하여 계산할 수 있다.

일구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하기 중 하나이다: LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNTVC, LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C 및 LCTeNT-LCBoNT/A-HCBoNT/A.

이들 중에서, 우수한 단백질 분해 활성 및 안정성으로 인해, 이전에 언급된 변형된 신경독, 특히 추가 경쇄 A형을 갖는 구성물을 언급하려고 한다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드에 특이적으로 결합할 수 있는 항체에 관한 것이다.

용어 "항체"는 본 명세서에서 본 발명의 폴리펩티드(예컨대 아미노산, 1차, 2차 또는 3차 구조 요소, 에피토프, 단편 등)에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 단백질 또는 폴리펩티드에 대해 사용된다. 항체의 예는 감마-글로불린 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM, 이의 단편, 이의 변형된 버전 등; 또한 V, D, J 유전자의 임의의 유전자 생성물, T 세포 수용체, B 세포 수용체 등이다. 단쇄 항체 또는 인간화 항체와 같은 변형된 항체도 포함된다. 항원은 바로 항체에 의해 결합되는 이의 능력에 의해 정의되기 때문에, 이는 매우 이종인 군을 대표한다. "항원"에 대한 예는 단백질; 올리고펩티드; 당, 지질, 지질단백질, 세포, 바이러스 또는 박테리아 표면 분자, 거대 분자 등이다. 용어 "특이적인"은 상이한 구조 패턴 사이를 구별짓기에 충분히 높은 결합 친화도를 나타내며, 즉, 항원에 대한 친화도 사이의 차이는 항원 또는 에피토프가 아닌 기준 구조에 대한 친화도보다 적어도 10 배, 20 배, 10² 배, 10³ 배, 10⁴ 배, 10⁵ 배, 10⁶ 배, 10⁷ 배, 10⁸ 배, 10⁹ 배 이하 높아야 함을 나타낸다. 일구체예에서, 상기 기준 구조는 혈청형 A 내지 G의 신경독이 아니다. 본 발명의 항체는 본 발명의 폴리펩티드에 대해 특이적이다. 일구체예에서, 이는 야생형 신경독(즉, 혈청형 A 내지 G) 및/또는 당업계에 공지된 다른 신경독 및/또는 신경독 단편에 결합하지 않으며, 다른 구체예에서, 상기 항체는 야생형 신경독 및/또는 다른 신경독에 대해 상당히 감소된 친화도로 결합하지만, 친화도의 차이는 충분히 커서 정제, 톡신 불활성화 및/또는 검출 방법에 여전히 적절하다. 본 발명의 항체의 예는 추가 LC 도메인(들) 및/또는 추가 LC 도메인(들)의 변형을 인지하는 항체이다.

이러한 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 생성시킬 수 있다. 또한, 공지된 신경독 및/또는 단편이 아닌(또는 이보다 훨씬 적은 정도로) 본 발명의 폴리펩티드를 인지하는 항체를 긍정적으로 그리고 부정적으로 선택하는 몇 가지 방법이 공지되어 있다. 예로서, 본 명세서에서 이하에 그 전체를 참고로 인용하는 문헌 WO2005/063817, WO2003/029458 및 WO2002/086096을 참고하라.

상기 항체는 일구체예에서 정제, 톡신 불활성화 및/또는 검출 방법에 적절하다. 이러한 항체의 적용에 대한 예는 예컨대 HDA(hemidiaphragma assay), 면역 침전, 친화도 크로마토그래피, 웨스턴 블롯 등이다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 일구체예에서, 상기 핵산은 예컨대 촉진제, 강화제, 박테리아 요소, IRES 영역, 말단 캡핑 구조 등과 같이 당업계에 공지된 추가 서열을 포함한다. 이 핵산 분자는 hnRNA, mRNA, RNA1 DNA, PNA, LNA 및/또는 변형된 핵산 분자 등일 수 있다. 핵산은 원형, 선형이거나 또는 게놈으로 통합될 수 있다. 또한, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 개의 LC 도메인을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 DNA-연쇄 동일 서열도 포함된다.

본 발명은 또한 본 발명의 폴리펩티드의 실험실내 및/또는 생체내 발현에 적절한 벡터를 포함한다. 그런데, 생체내 벡터는 일시적이거나 및/또는 안정하게 발현될 수 있다. 일구체예에서, 벡터는 또한 조절 요소 및/또는 선택 마커를 포함한다. 상기 벡터는 일구체예에서 바이러스 기원을 기초로 하고, 다른 구체예에서 파지 기원을 기초로 하며, 또 다른 구체예에서 박테리아 기원을 기초로 한다.

본 발명은 또한 상기 벡터, 특히 본 발명의 폴리펩티드를 발현하기에 적절한 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포를 포함한다. 일구체예에서, 상기 숙주 세포는 클로스트리듐 기원의 것이고, 다른 구체예에서, 상기 숙주 세포는 재조합 발현을 위한 표준 세포, 예컨대 대장균 등으로부터 유래한다. 일구체예에서, 폴리펩티드는 숙주 세포 내부에서 변형된다(즉, 글리코실화, 인산화, 단백 분해 효소에 의한 가공 등). 따라서 양쪽 예비 폴리펩티드, 임의의 중간 단백질 생성물 뿐 아니라 최종 폴리펩티드는 본 발명에 포함된다.

본 발명의 폴리펩티드는 조성물 또는 약학적 조성물의 일부일 수 있다. "약학적 조성물"은 의약 또는 진단물로서 사용하기 위한 활성 성분이 함유 또는 포함된 제제이다. 이러한 약학적 조성물은 인간 환자에 대한 진단 또는 치료 투여(즉, 근육내 또는 피하 주입에 의한 투여)에 적절할 수 있다.

본 발명에 사용되는 이 약학적 조성물은 단독 활성 성분으로서 본 발명의 폴리펩티드(즉, 변형된 신경 독성 성분)를 포함할 수 있거나, 또는 추가의 약학적 활성 성분, 예컨대 히알루론산 또는 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리에틸렌글리콜을 함유할 수 있으며, 이러한 조성물은 적절한 pH 완충제, 특히 아세트산나트륨 완충제 및/또는 동결 보호제인 폴리알콜에 의해 임의로 pH 안정화된다.

본 발명의 일구체예 내에서, 약학적 제제는 본 발명의 폴리펩티드의 일부인 신경 독성 성분 이외에는 보툴리눔 톡신 복합체에서 발견되는 단백질을 함유하지 않는 것으로 고려된다. 본 발명의 폴리펩티드의 전구체는 분할 또는 미분할될 수 있지만, 특정 해당 구체예에서 전구체는 중쇄 및 경쇄로 분할되었다. 상기에서 지적한 바와 같이, 폴리펩티드는 야생형 서열의 것일 수 있거나, 또는 1 이상의 잔기가 변형될 수 있다. 변형은 예컨대 폴리펩티드의 흡수 또는 안정성에 유리할 수 있는 예컨대 당화, 아세틸화, 아실화 등에 의한 화학적 변형을 포함한다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드의 폴리펩티드 사슬은 대안적으로 또는 추가로 1 이상의 아미노산 잔기의 첨가, 치환 또는 결손에 의해 변형될 수 있다.

일구체예에서, 마우스 LD₅₀ 분석에서 측정시 본 발명의 폴리펩티드는 본 발명의 폴리펩티드 ng 당 10 내지 500 LD₅₀ 단위의 생물학적 활성을 갖는다. 다른 구체예에서, 본 발명의 폴리펩티드는 ng당 약 150 LD₅₀ 단위의 생물학적 활성을 갖는다. 일반적으로, 본 발명의 약학적 조성물은 본 발명의 폴리펩티드를 약 6 pg 내지 약 30 ng의 양으로 포함한다.

단리된 형태의 보툴리눔 톡신 A형의 신경 독성 성분을 포함하는 약학적 조성물은 상표 Xeomin® 하에서 Merz Pharmaceuticals GmbH로부터 독일에서 상업적으로 입수 가능하다. 보툴리눔 톡신 A형 및 B형의 신경 독성 성분의 제조는 예컨대 국제 특허 출원 WO 00/74703 및 WO 2006/133818에 개시되어 있다. 당업자는 본 명세서에 언급된 본 발명의 폴리펩티드에 상기 조성물을 채용할 수 있다.

일구체예에서, 상기 조성물은 본 발명의 폴리펩티드의 재구성 용액이다. 다른 구체예에서, 조성물은 수크로오스 또는 인간 혈청 알부민 또는 양쪽을 더 포함하며, 다른 구체예에서, 인간 혈청 알부민 대 수크로오스의 비는 약 1:5이다. 다른 구체예에서, 상기 인간 혈청 알부민은 재조합 인간 혈청 알부민이다. 대안적으로, 상기 조성물은 인간 혈청 알부민과 같은 포유 동물에서 유래된 단백질을 함유하지 않는다. 이러한 용액은 혈청 알부민을 비단백질성 안정화제로 대체함으로써 충분한 신경독 안정성을 제공할 수 있다(하기 문헌).

본 특허 출원 내에서, 상기 언급한 변형된 신경 독성 성분을 주성분으로 하는 의약을 사용할 수 있다.

보툴리눔 톡신을 주성분으로 하는 의약의 조성 및 투여에 관해 그리고 보툴리눔 톡신의 신경 독성 성분을 주성분으로 하는 의약의 조성, 투여 및 투여 빈도에 관해, PCT/EP2007/005754를 참고하라.

약학적 조성물은 동결 건조 또는 진공 건조, 재구성될 수 있거나, 또는 용액 중에 존재할 수 있다. 재구성시, 일구체예에서 재구성 용액은 살균 생리 식염수(0.9% NaCl)를 첨가하여 제조한다.

이러한 조성물은 추가의 부형제를 포함할 수 있다. 용어 "부형제"는 약학적 조성물에 존재하는 활성 약학 성분 이외의 약학적 조성물에 존재하는 물질을 지칭한다. 부형제는 완충제, 담체, 부착 방지제, 진통제, 결합제, 붕해제, 충전제, 희석제, 보존제, 비히클, 시클로덱스트린 및/또는 장 확장성 약물(bulking agent), 예컨대 알부민, 젤라틴, 콜라겐, 염화나트륨, 보존제, 동결 방지제 및/또는 안정화제일 수 있다.

"pH 완충제"는 조성물, 용액 등의 pH 값을 특정 값으로 또는 특정 pH 범위로 조정할 수 있는 화학적 물질을 지칭한다. 일구체예에서, 이 pH 범위는 pH 5 내지 pH 8, 다른 구체예에서, pH 7 내지 pH 8, 또 다른 구체예에서, pH 7.2 내지 pH 7.6, 또 다른 구체예에서 pH 7.4일 수 있다. 다른 구체예에서, 약학적 조성물은 재구성 또는 주입시 pH가 약 4 내지 7.5이고, 또 다른 구체예에서 약 pH 6.8 내지 pH 7.6이며, 추가의 구체예에서, pH 7.4 내지 pH 7.6이다.

일구체예에서, 조성물은 또한 1 내지 100 mM, 다른 구체예에서, 10 mM의 아세트산나트륨 완충제를 함유한다.

상기 언급한 제공된 pH 범위는 통상적인 예일 뿐이며, 실제 pH는 상기 제공된 수치 값 사이의 임의의 간격을 포함할 수 있다. 본 발명의 교시에 따른 적절한 완충제는 예컨대 인산나트륨 완충제, 아세트산나트륨 완충제, TRIS 완충제 또는 상기 pH 범위 내에 있는 완충제에 적절한 임의의 완충제이다.

"안정화하는", "안정화하다" 또는 "안정화"는 재구성 또는 수성 용액인 약학적 조성물 내 활성 성분, 즉 생물학적으로 활성인 본 발명의 폴리펩티드가 약학적 조성물에 혼입되기 전보다 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 초과 및 약 100% 이하의 독성을 가짐을 의미한다.

이러한 안정화제의 예는 젤라틴 또는 알부민이고, 일구체예에서, 인간 기원의 것이거나 또는 재조합 공급원으로부터 얻은 것이다. 비인간 또는 비동물 공급원 유래의 단백질도 포함된다. 안정화제는 화학적 수단 또는 재조합 유전학에 의해 변형될 수 있다. 본 발명의 일구체예에서, 이노시톨, 만니톨과 같은 알콜을 동결 방지제 부형제로서 사용하여 동결 건조 동안 단백질을 안정화시키는 것이 고려된다.

본 발명의 다른 구체예에서, 안정화제는 히알루론산 또는 폴리비닐피롤리돈(Kollidon®), 히드록시에틸 전분, 알기네이트 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 비단백질성 안정화제일 수 있으며, 이러한 조성물은 적절한 pH 완충제에 의해, 특히 아세트산나트륨 완충제 또는 동결 방지제 또는 양쪽에 의해 임의로 pH 안정화시킨다. 상기 조성물은 언급한 안정화제 이외에 물 및 1 이상의 폴리알콜, 예컨대 만니톨 또는 소르비톨 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 이는 단당류, 이당류 또는 고급 다당류, 예컨대 글루코오스, 수크로오스 또는 프룩토오스를 더 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 현저한 안정성을 갖는 더 안전한 조성물로서 고려된다.

본 발명의 약학적 조성물 중 히알루론산을 일구체예에서 본 발명의 폴리펩티드와 200 U/㎖ 보툴리눔 톡신 용액 중 ㎖당 0.1 내지 10 ㎎, 특히 1 ㎎의 히알루론산의 양으로 배합한다.

본 발명의 조성물에 존재할 경우 폴리비닐피롤리돈(Kollidon®)을 본 발명의 폴리펩티드와, 200 U/㎖ 본 발명의 폴리펩티드 용액 중 ㎖당 10 내지 500 ㎎, 특히 100 ㎎ 폴리비닐피롤리돈을 포함하는 재구성 용액을 제공하는 양으로 배합한다. 다른 구체예에서, 재구성은 8 ㎖ 이하의 용액 중에서 실시한다. 이로서 농도가 25 U/㎖ 본 발명의 폴리펩티드 용액 중 ㎖당 12.5 ㎎ 폴리비닐피롤리돈으로 낮아진다.

본 발명의 약학적 조성물 중 폴리에틸렌글리콜을 일구체예에서 200 U/㎖ 보툴리눔 톡신 용액 중 ㎖당 10 내지 500 ㎎, 특히 100 ㎎ 폴리에틸렌글리콜의 양으로 본 발명의 폴리펩티드와 배합한다. 다른 구체예에서, 본 발명의 용액은 1 내지 100 mM, 또 다른 구체예에서, 10 mM의 아세트산나트륨 완충제를 함유한다

본 발명에 따른 약학적 조성물은 일구체예에서 약 +8℃ 내지 약 -20℃의 온도에서 보관시 6 개월, 1 년, 2 년, 3 년 및/또는 4년 기간 동안 실질적으로 변화하지 않는 효능을 유지한다. 추가로, 기재한 약학적 조성물은 재구성시 약 20 내지 약 100%의 효능 또는 % 회복율을 가질 수 있다.

"동결 방지제"는 재구성 또는 수성 용액인 약학적 조성물 내 활성 성분, 즉 생물학적으로 활성인 본 발명의 폴리펩티드가 약학적 조성물에 동결 건조되기 전보다 약 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 초과 및 약 100% 이하의 독성을 갖는 활성 성분을 생성시키는 부형제를 지칭한다.

다른 구체예에서, 조성물은 다가 화합물, 예컨대 다가 알콜을 동결 방지제로서 함유할 수 있다. 사용할 수 있는 다가 알콜의 예는 예컨대 이노시톨, 만니톨 및 다른 비환원 알콜을 포함한다. 조성물의 일부 구체예는 단백질성 안정화제를 포함하지 않거나, 또는 종종 동결 방지제로서 사용되는 트레할로오스 또는 말로트리오스 또는 락토오스 또는 수크로오스 또는 관련 당 또는 탄수화물 화합물을 포함하지 않는다.

용어 "보존제(들)"는 각각 미생물, 곤충, 박테리아 또는 상기 조성물 내의 다른 오염 유기체의 성장 또는 생존을 방지하는 물질 또는 물질의 군을 지칭한다. 보존제는 또한 상기 조성물을 원하지 않는 화학적 변화로부터 방지한다. 본 특허의 범위에서 사용할 수 있는 보존제는 당업자에게 공지된 현 기술의 모든 보존제이다. 사용할 수 있는 보존제의 예는 특히 예컨대 벤질 알콜, 벤조산, 벤잘코늄 클로라이드, 프로피온산칼슘, 질산나트륨, 아질산나트륨, 아황산염(이산화황, 이황화나트륨, 아황산수소칼륨 등), 이나트륨 EDTA, 포름알데히드, 글루타르알데히드, 규조토, 에탄올, 메틸 클로로이소티아졸리논, 부틸화 히드록시아니솔 및/또는 부틸화 히드록시톨루엔을 포함한다.

용어 "진통제"는 말초 및 중추 신경계에 대해 다양한 방식으로 작용하는 진통 약물에 관한 것으로, 특히 Paracetamol®(아세트아미노펜), 비스테로이드 항염증 약물(NSAID), 예컨대 살리실레이트, 마취성 약물, 예컨대 모르핀, 마취 특성을 갖는 합성 약물, 예컨대 Tramadol® 및 다양한 다른 것들을 포함한다. 예컨대 리도카인, 벨질 알콜, 벤조산 및 기타와 같은 국소 진통 효과를 갖는 임의의 화합물도 포함된다.

일구체예에서, 진통제는 조성물의 일부이며, 다른 구체예에서, 진통제는 화학적 탈신경제로의 치료 전, 치료 동안 또는 치료 후에 투여한다.

용어 "동결 건조"는 본 문헌에서 본 발명의 폴리펩티드를 함유하는 용액의 처리에 사용되는데, 이 용액은 조성물의 고상 성분만이 남겨질 때까지 동결 및 건조시킨다. 이 처리의 동결 건조된 생성물을 이에 따라 본 문헌에서 "동결 건조물"로서 정의한다.

본 문헌에서, 용어 "재구성"은 본 발명의 폴리펩티드의 동결 건조된 조성물의 가용화 과정으로서 정의된다. 예컨대 모든 필요 성분이 이미 동결 건조물에 함유되어 있을 경우, 이는 적절량의 살균수를 첨가하여 수행할 수 있다. 또는, 그렇지 않을 경우, 살균 염수 용액만을 첨가하거나, 또는 적용 가능할 경우 예컨대 pH 완충제, 부형제, 동결 방지제, 보존제, 진통 안정화제 또는 이의 임의의 조합을 포함하는 성분을 첨가하여 수행할 수 있다. 상기 언급한 "염수 용액"의 염수는 염 용액, 예컨대 염화나트륨(NaCl) 용액 또는 등장성 염화나트륨 용액(즉, 0.9%의 염화나트륨 농도)이다. 최종 "재구성"이 직접적 또는 간접적(예컨대 희석 후, 환자에게 투여 가능함)이 되도록 하는 방식으로 가용화를 수행한다. 신경독을 예컨대 등장성 매질에, 예컨대 등장성 염수 또는 살균 염수에 재구성할 수 있다.

근육 또는 외분비샘의 과다 활동 콜린성 신경 분포와 관련된 임의의 병태의 치료를 위한 본 발명의 폴리펩티드의 투여를 수반하는 본 발명의 개념은 주목할 만 하며, 본 발명의 폴리펩티드는 시냅스 틈새에의 아세틸콜린 분비를 차단한다. 따라서, 본 발명에 의해 제공되는 치료는 하기 증상 중 임의의 것에 관련되어 있을 수 있으며, 이들 중 대부분은 문헌[Dressier D (2000)(Botulinum Toxin Therapy. Thieme Verlag, Stuttgart, New York)]에 상세히 기재되어 있다:

■ 근 긴장 이상

■ 두개근 긴장 이상

● 눈꺼풀 연축

● 구하악부근 긴장 이상

○ 턱 개방형

○ 턱 폐쇄형

● 이갈기

● 메이그 증후군(Meige syndrome)

● 설근 긴장 이상

● 눈꺼풀 개방의 실행증

■ 경근 긴장 이상

● 목 앞으로 숙여짐(antecollis)

● 목후굴

● 측경(laterocollis)

● 사경

■ 인두근 긴장 이상

■ 후두근 긴장 이상

● 연축성 발성 장애/내전근 유형

● 연축성 발성 장애/외전근 유형

● 연축성 호흡 곤란

■ 사지근 긴장 이상

● 팔 근육 긴장 이상

○ 작업 특이적(task specific) 근 긴장 이상

■ 필기 경련

■ 음악가 경련

■ 골퍼 경련

● 다리 근육 긴장 이상

○ 넙다리 내전, 넙다리 외전

○ 무릎 굽힘, 무릎 신전

○ 발목 굽힘, 발목 신전

○ 안쪽 말발 변형

● 발 근육 긴장 이상

○ 굽혀진 발가락

○ 발가락 굽힘

○ 발가락 신전

● 몸통 근육 긴장 이상

○ 피사 증후군

○ 벨리 댄서 근 긴장 이상

● 단편성 근 긴장 이상

● 반쪽 근 긴장 이상

● 전신 근 긴장 이상

■ 루백(lubag)에서의 근 긴장 이상

■ 피질 기저핵 변형에서의 근 긴장 이상

■ 루백에서의 근 긴장 이상

■ 지연성 근 긴장 이상

■ 척수소뇌성 실조증에서의 근 긴장 이상

■ 파킨슨병에서의 근 긴장 이상

■ 헌팅턴병에서의 근 긴장 이상

■ 헬러포르덴 스파츠병(Hallervorden Spatz disease)에서의 근 긴장 이상

■ 도파 유도성 운동 이상/도파 유도성 근 긴장 이상

■ 지연성 운동 이상/지연성 근 긴장 이상

■ 발작성 운동 이상/근육 긴장 이상

● 운동 유발성

● 비운동 유발성

● 활동 유도성

■ 구개근 경련

■ 간대성 근경련

■ 근파동

■ 경축

■ 양성 근육 경련

■ 유전성 턱 진전

■ 역설성 턱 근육 활성

■ 반저작성 연축

■ 비대 인두 근육병

■ 교근 비대증

■ 전경골 비대증

■ 안진

■ 진동시

■ 다한증

■ 핵상 주시 마비

■ 부분 간질 지속증

■ 연축성 사경 수술의 계획

■ 외전근 성대 마비

■ 난치성 돌연변이성 발성 장애

■ 상부 식도 조임근 기능 장애

■ 성대 주름 육아종

■ 말더듬

■ 질드라투렛 증후군(Gilles de la Tourette syndrom)

■ 중이 간대성 근경련

■ 보호성 후두 폐쇄

■ 후두전적출(postlaryngectomy) 스피치 실패

■ 보호성 안검 하수증

■ 안검 내반

■ 오디 괄약근 기능 장애

■ 유사 이완 불능(pseudoachalasia)

■ 비이완 불능성 식도 운동 장애

■ 질경련

■ 수술후 부동화(postoperative immobilisation)

■ 떨림

■ 비뇨생식기 질병s

● 방광 기능 장애

● 과민성 방광

○ 요실금

○ 요폐

○ 경직 방광

■ 위장병

■ 배뇨근 조임근 협동 장애

■ 방광 조임근 연축

■ 반연굴 연축

■ 신경 재분포 운동 이상

■ 미용적 용도

■ 까마귀 발모양

● 찌푸린 얼굴

● 얼굴 비대칭

● 턱끝 오목

● 미간 주름

● 이마 선

● 넓은 목근

● 흡연자 선

● 마리오네뜨 선

● 교근 올림

■ 강직 인간 증후군

■ 파상풍

■ 전립샘 질환

● 전립샘 비대

● 전립샘암

■ 비만증 치료

■ 유아성 뇌성 마비

■ 사시

■ 혼합(mixed)

■ 마비

■ 수반(concomitant)

■ 망막 박리 수술 후

■ 백내장 수술 후

■ 무수정체증에서

■ 근염성 사시

■ 근육병증 사시

■ 해리 수직 편위

■ 사시 수술에 대한 보조약으로서

■ 내사시

■ 외사시

■ 이완 불능

■ 항문 열창

■ 외분비샘 과다 활성

■ 프로이(Frey) 증후군

■ 악어 눈물 증후군

■ 다한증

● 겨드랑

● 손바닥

● 발바닥

■ 콧물

■ 상대적인 과다 침 분비

● 졸중에서

● 파킨슨병에서

● 근위축 측삭 경화에서

■ 경직성 병태

● 뇌염 및 척수염에서

○ 자가 면역 과정

■ 다발 경화증

■ 횡단 척수염

■ 데빅 증후군

○ 바이러스 감염

○ 박테리아 감염

○ 기생충 감염

○ 진균 감염

● 유전성 경직 하반신 마비에서

● 졸중후 증후군

○ 반구형 경색증

○ 뇌간 경색증

○ 척수 경색증

● 중추 신경계 외상에서

○ 반구형 변병

○ 뇌간 변병

○ 척수 변병

● 중추 신경계 출혈에서

○ 뇌내 출혈

○ 거미막하 출혈

○ 경막하 출혈

○ 척수내 출혈

● 신생물에서

○ 반구형 종양

○ 뇌간 종양

○ 척수 종양

■ 두통

● 편두통

● 긴장성 두통

● 부비동 두통

● 만성 두통

■ 및/또는 탈모.

환자의 병태를 개선시키기 위한 유효량으로 일구체예에서 몇 회 보툴리눔 톡신을 포함하는 약학적 조성물을 투여한다. 본 발명의 폴리펩티드의 지속성에 따라 더 낮거나 높은 용량이 필요함을 알아야 하며, 따라서, 하기 용량 기준은 원래 목적만을 위한 것이다.

통상적으로, 환자에게 투여되는 용량은 환자당 약 1,000 단위 이하이지만, 일반적으로 400 단위를 초과하지 않을 것이다. 일구체예에서, 범위는 약 80 내지 약 400 단위이다. 이 값은 일구체예에서 어른 환자에게 유효하다. 어린이에 대해서는, 각각의 용량은 25 내지 800 단위이고, 다른 구체예에서는 50 내지 400 단위이다.

상기 단위는 최대 총 용량에 관한 것이며, 근육당 용량 단위는 일구체예에서 3 내지 6 단위/㎏ 체중(b.w.) 이내이고, 소근육에 대해서는 0.5 내지 2 U/㎏ b.w이며, 다른 구체예에서는 0.1 내지 1 U/㎏ b.w이다. 일반적으로 주입 부위당 50 U를 초과하지 않으며, 근육당 100 U를 초과하지 않아야 한다.

본 발명의 일구체예에서, 투여되는 보툴리눔 톡신의 유효량은 어른에서는 500 U의 본 발명의 폴리펩티드를 초과하며, 어린이에서는 15 U/㎏ 체중을 초과한다.

투여 빈도에 대해서는, 재주입 간격은 변형된 신경독의 지속성에 따라 크게 달라진다. 따라서, 본 발명에 따르면, 투여되는 의약은 3 내지 6 개월의 간격으로 재투여되고, 다른 구체예에서, 의약은 2 주 내지 3 개월 미만의 간격으로 재투여된다. 그러나, 신경독의 변형에 따라, 다른 구체예에서는, 6 개월 초과 내지 12 개월 이하의 치료 또는 2 주보다 짧은 기간이 고려된다.

보툴리눔 톡신을 주성분으로 하는 의약의 조성 및 투여에 관해, 그리고 보툴리눔 톡신의 신경 독성 성분을 주성분으로 하는 의약의 조성, 투여 및 빈도에 관해, US 60/817,756을 본 명세서에서 참고로 인용한다.

상기 기재한 값은 본 발명에서 사용되는 바의 의약의 투여에 대한 일반적인 가이드라인으로서 이해되야 하지만, 이는 최종적으로는 투여되는 톡신의 양 및 투여 빈도 모두를 결정하는 치료를 담당하는 의사의 몫이다.

보툴리눔 톡신을 주성분으로 하는 의약은 병에 걸린 근육에 직접 주입할 수 있다. 적절한 주입 부위를 찾기 위해, 의사가 이를 찾는 것을 돕는 몇 가지 수단이 존재한다. 본 발명에서, 근전도 검사(EMG)가 안내하는 주입, 촉진(palpation)이 안내하는 주입, CT/MRI가 안내하는 주입 뿐 아니라, 초음파 촬영(초음파)이 안내하는 주입과 같은 최고의 주입 부위를 갖기 위한 모든 방법이 적용 가능하다. 이들 방법 중에서, 일구체예에서는 어린이 치료시 후자의 방법을 선택한다. 초음파 촬영이 안내하는 주입에 관한 상세한 설명에 대해서는, 본 발명자들은 문헌[Berweck "Sonography-guided injection of botulinum toxin A in children with cerebral palsy", Neuropediatric 2002 (33), 221-223]을 참고한다.

용어 "주입"은 당업자가 피부에 침투하여 표적 부위에 활성 제제를 투여 가능하게 하는 임의의 과정으로서 정의된다. 불완전한 수의 "주입"의 예는 피하, 근육내, 정맥내, 경막내, 동맥내 등이다.

본 명세서에 사용된 용어론은 특정 구체예만을 설명하려는 목적을 위한 것이며 한정하려 하는 것이 아님을 이해해야 한다. 명세서 및 청구 범위에 사용된 바의 단수형 "a", "an" 및 "the"는 문맥이 명백히 지시하지 않는 한 복수에 대한 지칭을 포함함을 알아야 한다.

문헌:

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본 발명을 이제 본 명세서에서 하기에 기재하는 비제한적인 실시예에 의해 추가로 예시한다.

실시예

실시예 1 - 발현 플라스미드의 구성

보툴리눔 톡신 A의 중쇄의 DNA 서열을 PCR에 의해 클로스트리튬 보툴리눔 A형(데이터베이스 번호 AAA23262)의 염색체 DNA로부터 증폭시켰다. 5' 말단에서 트롬빈의 인지 서열을 코딩하는 서열을 첨가하였다. 3' 말단에서 추후 정제에 적절한 친화도 표지 펩티드(예컨대 His-표지 또는 Strep-표지)를 코딩하는 DNA 서열을 첨가하였다. DNA가 발현 플라스미드에 삽입되었다. 제1 및 제2 경쇄에 대한 DNA 서열은 또한 혈청형 A의 것이었고, 이를 PCR을 통해 클로스트리튬 보툴리눔 A형(데이터베이스 번호 AAA23262)의 염색체 DNA로부터 유사한 방식으로 증폭시켰다. 그 다음, 경쇄의 서열을 트롬빈 인지 서열(TE)의 발현 플라스미드 상류에 연속적으로 2 회 도입하였다. 이에 따라 전체적으로 서열은 하기 코딩 구조를 나타냈다: LC-LC-TE-HC-표지.

실시예 2 - 대장균에서의 융합 단백질의 생성

융합 단백질을 대장균 TG1으로 전환시켰다. 4 시간 동안 21℃에서 유도를 수행하였다. 그 다음, 융합 단백질을 제조자 프로토콜에 따라 StrepTactin-Sepharose(IBA GmbH, Goettingen) 컬럼 크로마토그래피를 통해 정제하였다. 그 다음, 융합 단백질을 중쇄와 2개의 경쇄 사이의 펩티드 결합을 분할하는 부동태화 트롬빈(Thrombin-Sepharose)에 의해 활성화시켰다. 단백질의 소단위는 디설피드 결합을 통해서만 연결된 채로 남아 있었다.

실시예 3 - 지속성 시험(짧은 발가락 폄근, EDB)

0.1 ㎖ 생리 식염수에 용해된 4 단위의 Xeomin®(Merz Pharmaceuticals GmbH)를 시험인의 오른쪽 EDB에, 그리고 4 단위의 변형된 보툴리눔 톡신(보툴리눔 톡신 A형의 추가의 경쇄와 컨쥬게이트된 보툴리눔 톡신 A형의 융합 단백질)을 왼쪽 EDB에 도포하였다. 각각 30 일 후 "복합 근육 활동 전위"(CMAP)를 전기 생리학적으로 측정하였다. 90 일 후, 오른쪽 EDB의 CAMP의 정도는 (출발 활성에 비해) 약 40% 감소한 반면, 왼쪽 EDB에서는 그 정도가 약 70% 감소하였다. 오른쪽에서는 CAMP가 150 일 후 40%에 도달하였다.

실시예 4 - 지속성의 연장

사경 경련을 앓고 있는 환자를 Botox®(Allergan, Inc.)(240 단위)로 치료하였다. 환자는 감소된 보툴리눔 톡신의 활성으로 인해 신경과에서 매 10 내지 12 주마다 치료를 받아야 했다. 그 다음, 환자에게 240 단위의 변형된 신경독(보툴리눔 톡신 A형의 추가 융합 경쇄를 갖는 보툴리눔 톡신 A형)을 주입하였다. 환자는 제1 치료 후 18 주까지 추가의 주입을 받을 필요가 없었다.

Claims

(a) 클로스트리듐 톡신(clostridial toxin)의 신경 독성 성분의 HC 도메인 또는 이의 단편;
(b) 클로스트리듐 톡신의 신경 독성 성분의 제1 LC 도메인 또는 이의 단편; 및
(c) 클로스트리듐 톡신의 신경 독성 성분의 1 이상의 추가의 LC 도메인 또는 이의 단편
을 포함하는 폴리펩티드로서, 상기 제1 및 1 이상의 추가의 LC 도메인은 서로 동일 또는 상이할 수 있고, 상기 제1 및 상기 1 이상의 추가의 LC 도메인의 상기 단편 각각은 여전히 단백질 분해 활성을 나타내는 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 도메인은 결합, 펩티드 링커, 화학적 링커, 또는 이의 2 이상의 조합을 통해 연결되는 것인 폴리펩티드.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 LC 및/또는 HC 도메인(들)의 아미노산 서열은 혈청형 A, B, C, D, E, F 또는 G의 보툴리눔 톡신의 신경 독성 성분의 아미노산 서열과 50% 이상 동일한 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, HC 또는 1 이상의 LC 도메인 또는 HC 및 1 이상의 LC 도메인은 1 이상의 변형을 포함하는 것인 폴리펩티드.
제4항에 있어서, 변형은 돌연변이, 결손, 삽입, 첨가 또는 아미노산 교환 또는 이의 2 이상의 조합인 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, HC 도메인이 유래하는 야생형 신경독에 비해 결합능을 강화하도록, 신경독의 강글리오시드 결합 도메인 및/또는 단백질 수용체 결합 도메인이 변경되는 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A, LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C, LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C 및 LCTeNT-LCBoNT/A-HCBoNT/A로 구성된 군에서 선택되는 것인 폴리펩티드.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리펩티드에 특이적인 항체.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리펩티드를 코딩하는 핵산.
제9항의 핵산 또는 이의 단편을 포함하는 벡터.
제9항의 핵산 또는 제10항의 벡터를 포함하는 숙주 세포.
제11항의 숙주 세포를 배양하는 단계, 상기 핵산 또는 벡터로 코딩된 상기 폴리펩티드를 생성 및 정제하는 단계, 및 임의로 상기 폴리펩티드를 약학적 조성물로 제제화하는 단계를 포함하는, 폴리펩티드의 생성 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 폴리펩티드, 또는 제12항의 방법에 의해 얻을 수 있는 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
제13항에 있어서, 요법 치료에 사용하기 위한 것인 조성물.
미용적 치료를 위한, 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항의 폴리펩티드 또는 제13항의 조성물의 용도.