KR20110083301A

KR20110083301A - Ｒｏｍｏ1 단백질에 대한 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 그 용도

Info

Publication number: KR20110083301A
Application number: KR1020100003463A
Authority: KR
Inventors: 유영도
Original assignee: 고려대학교 산학협력단
Priority date: 2010-01-14
Filing date: 2010-01-14
Publication date: 2011-07-20
Anticipated expiration: 2030-01-14
Also published as: KR101142418B1

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 서열 중 8번~20번 사이에 존재하는 에피토프 및 44번~56번 사이에 존재하는 에피토프 중 하나 이상을 인식하여 Romo1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 Romo1 단백질에 대한 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 그 용도에 관한 것이다.

Description

Ｒｏｍｏ1 단백질에 대한 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 그 용도{ANTIBODY AGAINST ROMO1, HYBRIDOMA PRODUCING THE SAME AND USES THEREOF}

본 발명은 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 Romo1 (Reactive Oxygen Species Modulator 1) 단백질에 대한 항체 및 그 이용에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 서열번호 1의 서열 중 8번~20번 사이에 존재하는 에피토프 및 44번~56번 사이에 존재하는 에피토프 중 하나 이상을 인식하여 Romo1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 Romo1 단백질에 대한 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 그 용도에 관한 것이다.

세포 내에서 지나친 활성 산소의 증가는 각종 질병의 원인이 된다. 특히 비 이상적으로 증가된 활성 산소는 만성 염증(chronic inflammation)을 유발하는데, 이러한 만성 염증은 암(cancer), 노화(aging), 관절염(arthritis), 경화(sclerosis), 알쯔하이머(Alzheimer's disease), 당뇨(diabetes), 섬유증(fibrosis), 대장염(inflammatory bowel diseases) 등의 주요 원인으로 작용한다.

활성 산소의 생성은 주로 미토콘드리아에서의 활성산소 누출(ROS leakage)에 의하며, 이 활성 산소가 인체의 각종 질병을 유도한다. 미토콘드리아 유래의 활성산소가 질병에 밀접한 관계를 갖고 있기는 하지만, 그 활성산소의 생성기전은 아직 잘 규명되어 있지 않다. 이와 관련하여 최근 미토콘드리아에 위치한 단백질인 Romo1이 발견되었고, 이것이 미토콘드리아에서 활성 산소를 생성하는데 중요한 역할을 하는 것으로 보고되었다. (Chung Y.M. et al., Biochem Biophys Res Commun. 347: 649-655, 2006)

비정상적인 활성 산소의 증가가 질병에 관여하는 대표적인 예가 TNF-알파 유도 질병이다. TNF-알파는 염증을 일으키는 중요한 인자인데, 그 양이 조절되지 않고 지속적으로 증가하거나 그 신호전달경로가 지나치게 활성화되면 만성 염증을 유발하게 되고, 이러한 만성 염증이 TNF-알파 유도 질병을 유발한다. 이 때, TNF-알파에 의하여 유도되는 질병의 예로는 패혈증(sepsis), 당뇨병(diabetes), 골다공증(osteoporosis), 이식 거부 반응(allograft rejection), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases), 허혈성 질환(ischemia/reperfusion injury), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis), 신경세포 퇴화 질환(ischemic stroke, Alzheimer's disease, Parkinson's disease) 등이 있다(Balkwill F. et al., Nature 431:405-406, 2004; Chen G and David V.G. Science 296:1634, 2002).

최근 본 발명자들은 TNF-알파가 Romo1을 통하여 활성 산소를 생성한다는 것과 세포 사멸을 유도한다는 것을 밝혀내고 이를 2009년 7월에 특허출원하였다 (한국 특허출원번호 제10-2009-0062255호). 즉, Romo1이 외부 스트레스에 의해 양적으로 증가하면, TNF-알파에 의한 과도한 활성산소 생성 및 세포사멸 유도가 촉진되고, 그 결과 만성 염증 및 TNF-알파 유도 질병이 유발된다. 따라서 Romo1에 대한 항체를 개발하면, 이를 이용하여 Romo1 단백질을 검출함으로써, TNF-알파에 의해 유도되는 질병을 미리 진단할 수 있다.

종래 알려진 Romo1에 대한 항체로는 미국의 시그마-알드리치(SIGMA-ALDRICH) 회사가 생산판매 중인 폴리클로날 항체가 있다. 상기 항체는 서열번호 1에 기재된 Romo1 단백질의 아미노산 서열 중 31개의 아미노산 서열을 토끼에 주사하여 생산한 것이다. 그러나 상기 항체는 면역조직화학법에만 사용이 가능할 뿐 웨스턴 블로팅 등에는 사용할 수 없어 그 이용에 한계가 있다. 또한 면역조직화학법으로 분석하는 경우에도, 상기 항체를 이용하면 Romo1 단백질이 핵에 위치하는 것으로 보여지는데, Romo1 단백질은 미토콘드리아에 위치하는 것으로 보고되어 있다.

따라서 당업계에서는 Romo1에 대한 특이성이 높으면서도 웨스턴 블로팅 등을 포함한 여러 분석 방법 또는 검출 방법에 제약 없이 사용 가능하여 정확한 실험 결과를 도출할 수 있는 새로운 항체의 개발이 절실히 필요하다.

본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 Romo1 단백질에 대해 높은 특이성을 가지면서, 웨스턴 블로팅, 면역형광, 면역조직화학(염색)법, 효소면역분석법(ELISA) 등 여러 가지의 분석 방법 또는 검출 방법에 사용 가능하여 정확한 실험 결과를 도출하는 새로운 Romo1 항체를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 Romo1에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 Romo1에 대한 항체의 용도, 특히 상기 항체를 포함하는 TNF-알파 유도 질병의 진단용 조성물 및 진단 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호가 KCLRF-BP-00226인 하이브리도마에 의하여 생산되는, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 Romo1 단백질에 대한 항체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00226의 하이브리도마를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 항체를 포함하는, TNF-알파 유도 질병의 진단용 조성물 및 진단 키트를 제공한다.

또한 본 발명은 상기의 항체를 이용하여 TNF-알파 유도 질병의 마커인 Romo1 단백질을 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 항체는 Romo1 단백질을 특이적으로 인식할 수 있고, 웨스턴 블로팅, 면역형광, 면역조직화학법, 효소면역분석법(ELISA) 등을 포함한 다양한 종류의 분석 방법 또는 검출 방법에 제약 없이 사용 가능하므로, Romo1의 이상 발현이 원인이 되는 질병, 예컨대 Romo1과 TNF-알파에 의하여 유도되는 질병을 정확히 예방 및 진단하는데 유용하다. 또한, 본 발명의 항체는 시료 내의 Romo1 단백질을 특이적으로 인식하여 이를 검출 및 분리하는데 이용될 수 있다.

도 1은 Romo1 단백질의 아미노산 서열(서열번호1)에 대해 항원성을 분석한 결과이다.
도 2는 HeLa 세포주에 Romo1 siRNA를 주입(transfection)하여 Romo1 단백질 양을 감소시킨 후, 실시예 2에서 수득한 본 발명의 Romo1 항체를 이용하여 Romo1 단백질을 측정한 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 3은 HeLa 세포주에 Romo1 siRNA를 주입하여 Romo1 단백질 양을 감소시킨 후, 시그마-알드리치에서 구입한 Romo1에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 Romo1 단백질을 측정한 웨스턴 블로팅 결과이다.
도 4는 Romo1 단백질의 세포 내 발현을 Romo1 단백질에 대한 항체를 이용하여 염색한 면역형광 실험 결과이다.
도 5는 HEK 293 세포에서 TNF-알파를 처리하여 TNF-알파 신호를 주었을 경우 Romo1이 TNF-알파 신호전달경로에서 세포 사멸 신호를 전달하는 complex II 구성 단백질인 RIP, TRADD, TRAF2, FADD 단백질과 결합한다는 것을 보여주는 웨스턴 블로팅 결과이다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명한다.

본 발명은 Romo1 단백질에 대한 항체, 구체적으로는 수탁번호가 KCLRF-BP-00226인 하이브리도마에 의하여 생산되는, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 Romo1 단백질에 대한 항체를 제공한다.

*서열번호 1:

MPVAVGPYGQSQPSCFDRVKMGFVMGCAVGMAAGALFGTFSCLRIGMRGRELMGGIGKTMMQSGGTFGTFMAIGMGIRC

본 명세서에서, 용어 “Romo1 단백질”은 Romo1 단백질 그 자체, 그의 유전자 재조합 단백질 및 이들의 인공변이체나 돌이변이체 뿐만 아니라, Romo1 단백질의 천연 형태 및 이의 기능적 등가물을 포함한다.

Romo1 단백질은 본 발명자들이 세계 최초로 그 기능을 규명한 것이다. 처음에는 상기 단백질이 항암제 내성에 관여하는 것을 밝혀내어 Chemp-1 (Chemoresistant Protein-1)이라 명명하였지만, 후속 연구에서 상기 단백질이 활성산소도 생성한다는 사실을 발견하여, 그 명칭을 Chemp-1에서 Romo1으로 변경하였다(Chung Y.M. et al., Biochem Biophys Res Commun. 347: 649-655, 2006).

상기한 연구에 이어, 본 발명자들은 최근 TNF-알파가 염증성 질병을 유도할 때 그 중간 신호전달 경로에서 Romo1이 중요한 역할을 한다는 사실을 발견하였다(한국 특허출원번호 제10-2009-0062255호). 따라서 본 발명자들은 Romo1이 TNF-알파에 의해 유도되는 질병의 진단에서 새로운 표적으로 이용이 가능함을 깨닫고, 그러한 발견을 기초로 상기 Romo1 단백질에 대한 항체를 생산하였다.

본 발명에 따른 Romo1 단백질에 대한 항체는, 서열번호 1의 서열 (Romo1 단백질의 아미노산 서열) 중 8번~20번 사이에 존재하는 에피토프 및 44번~56번 사이에 존재하는 에피토프 중 하나 이상을 인식하여, Romo1 단백질에 특이적으로 결합한다.

서열번호 1의 8번~20번 아미노산 서열(YGQSQPSCFDRVK; 펩타이드1)과 44번~56번 아미노산 서열(RIGMRGRELMGGI; 펩타이드2)은, 본 발명자들이 Romo1 단백질의 아미노산 서열에 대해 항원성(antigenicity)을 분석한 결과, 그 항원성이 가장 높게 나온 부분들로, 본 발명자는 이들 펩타이드를 이용하여 본 발명에 따른 항체를 제조하였다. 따라서 본 발명에 따른 항체는 상기의 펩타이드1, 펩타이드2 또는 이들을 포함하는 단편, 그리고 Romo1 단백질에 대하여 높은 결합 특이성을 갖는다.

한편 본 발명에 따른 항체는 하나의 항원, 즉 Romo1 단백질에 대한 항체로서, 전체 항체 형태일 뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다.

전체 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 구조이며, 각각의 경쇄는 중쇄와 다이설파이드 결합으로 연결되어 있다. 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ), 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

항체 분자의 기능적인 단편이란, 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등을 포함한다. 항체 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변영역 및 중쇄의 첫 번째 불변영역(CH1)을 가지는 구조로, 1개의 항원 결합부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C 말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루고 있다. Fv는 중쇄 가변영역 및 경쇄 가변영역만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로, Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 국제공개특허 WO 88/10649, WO 88/106630, WO 88/07085 및 WO 88/09344 등에 개시되어 있다. dsFv(이쇄 Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변영역과 경쇄 가변영역이 연결되어 있고, scFv(단쇄 Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변영역과 단쇄의 가변영역이 공유결합으로 연결되거나 또는 C 말단에서 바로 연결되어 있어서 dsFv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다.

이러한 항체 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하여 Fab를 얻을 수 있고, 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 바람직하게는 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

이와 같은 본 발명의 Romo1 단백질에 대한 항체는 일반적인 융합 방법(fusion method)에 의해 만들어질 수 있다. 본 발명의 항체를 분비하는 하이브리도마를 만들기 위해, 융합되는 두 세포 집단 중 하나의 집단은 Romo1 단백질 또는 그 펩타이드 단편을 주사한 마우스와 같은 면역학적으로 적합한 숙주 동물로부터의 세포를 이용하고, 나머지 하나의 집단으로는 암 또는 골수종 세포주를 이용한다. 이러한 두 집단의 세포들을 폴리에틸렌글리콜과 같은 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있는 방법에 의해 융합시키고 나서 항체-생산 세포를 표준적인 조직 배양 방법에 의해 증식시킨다. 한계 희석법(limited dilution technique)에 의한 클로닝에 의해 균일한 세포집단을 수득하고 나서 Romo1 단백질 또는 그 펩타이드 단편에 대해 특이적인 항체를 생산할 수 있는 하이브리도마를 표준 기술에 따라 시험관 내에서 또는 생체 내에서 대량으로 배양한다.

상기한 하이브리도마가 생산하는 항체는 정제하지 않고 이를 포함하는 세포 배양액 상태로 사용할 수도 있고, 본 발명이 속하는 기술분야에 잘 알려져 있는 방법에 따라 정제하여 사용할 수도 있다. 상기 항체의 정제는, 예를 들어 겔 전기영동, 투석, 염침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 정제 방법을 이용하여 배양 배지 또는 복수액으로부터 실시될 수 있다.

본 발명에 따른 항체를 생산하는 하이브리도마는 Romo1-AS-1로 명명된 후 2010년 1월 5일자로 수탁되어 수탁번호 KCLRF-BP-00226를 부여받았다.

한편 본 발명자들은 HeLa 세포주에 Romo1 siRNA를 주입(transfection)하여 Romo1의 단백질 양을 감소시킨 후, 본 발명의 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅 방법으로 분석한 결과, 시그마-알드리치사의 기존 항체와 달리, 본 발명의 항체는 웨스턴 블로팅 방법으로도 Romo1 단백질을 잘 분석할 수 있음을 확인하였다. 또한 본 발명의 항체를 이용하여 면역형광법으로 Romo1 단백질의 세포 내 발현을 조사한 결과, 종래 알려진 바와 같이 Romo1 단백질이 미토콘드리아에 위치함을 확인하였다.

따라서 본 발명의 Romo1에 대한 항체는, 웨스턴 블로팅, 면역형광 뿐만 아니라 면역조직화학법, 효소면역분석법 등 다양한 분석방법 및 검출방법에 자유로이 이용되어 Romo1 단백질을 효과적으로 검출 또는 분리할 수 있다.

나아가 본 발명자들은 Romo1 siRNA를 이용하여 Romo1 발현을 감소시킬 경우, TNF-알파에 의하여 생성되는 활성산소의 증가가 차단되고, TNF-알파에 의한 세포사멸이 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 실험 결과는 Romo1이 TNF-알파에 의한 활성산소 생성 및 TNF-알파에 의한 세포사멸에서 중요한 매개체라는 것을 보여준다. TNF-알파에 의하여 유도되는 세포사멸은 TNF-알파에 의해 유도되는 염증성 질병과 직접적으로 연관되어 있으므로(Leist M and Jaattela M. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2: 589598, 2001), 상기 실험 결과에 의하면, Romo1은 TNF-알파에 의해 유도되는 질병의 진단마커가 될 수 있다.

따라서, 본 발명에서는 상술한 Romo1 단백질에 대한 항체를 포함하는, Romo1의 이상 발현이 원인이 되거나 또는 Romo1의 이상 발현을 초래하는 여러 질병, 바람직하기로는 TNF-알파 유도 질병의 진단용 조성물 및 진단 키트를 제공한다.

구체적으로, 상기 TNF-알파 유도 질병의 예로는 패혈증, 당뇨병, 골다공증, 이식 거부 반응, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환, 허혈성 질환, 폐 섬유증, 신경세포 퇴화 질환 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 진단용 조성물 및 진단 키트에는 본 발명의 항체 뿐만 아니라, Romo1 단백질을 선별적으로 인지할 수 있는 한, 다른 항체, 예를 들어 폴리클로날 항체, 키메릭-항체, 인간화-항체, 모노클로날 항체 뿐만 아니라 모노클로날 항체의 단편 등도 사용될 수 있다. 이러한 항체 단편은 F(ab')2, Fab, Fab', Fv 단편 등을 포함한다.

또한 본 발명의 진단용 조성물 및 진단 키트에는 면역학적 분석에 사용되는 도구/시약이 포함될 수 있다. 이러한 도구/시약으로는 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등이 포함된다. 또한 표지 물질이 효소인 경우에는 효소 활성을 측정할 수 있는 기질 및 반응 정지제를 포함할 수 있다.

적합한 담체로는, 이에 한정되지는 않으나, 가용성 담체, 예를 들어 당 분야에 공지된 생리학적으로 허용되는 완충액, 예를 들어 PBS; 불용성 담체, 예를 들어 폴리스티렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 가교 덱스트란, 폴리사카라이드, 라텍스에 금속을 도금한 자성 미립자와 같은 고분자, 기타 종이, 유리, 금속, 아가로스 및 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 진단용 조성물 및 진단키트에 사용하기 위한 검정 시스템은, 이에 한정되는 것은 아니나, ELISA 플레이트, 딥-스틱 디바이스, 면역크로마토그래피 시험 스트립, 방사분할 면역검정 디바이스, 플로우-쓰로우(flow-through) 디바이스 등을 포함한다.

또한 본 발명은 상기한 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜, 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 TNF-알파 유도 질병의 마커를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에서, 용어“TNF-알파 유도 질병의 마커”란 세포조직에서 이를 검출하고 비교분석을 통해 TNF-알파에 의해 유도되는 염증성 질병을 확인할 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 항체를 포함하거나 이를 사용하는 조성물, 진단 키트 및 방법에서 “TNF-알파 유도 질병의 마커”는 Romo1 단백질을 지칭한다.

본 발명에서 사용된 용어 “생물학적 시료”란 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 뇌척수액, 조직 부검 시료(뇌, 피부, 림프절, 척수 등), 세포 배양 상등액 또는 상층액 등을 들 수 있지만 이에 제한되지는 않는다. 상기 생물학적 시료는, 인간, 토끼, 돼지, 쥐 등의 각종 동물로부터 채취할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 이들 생물학적 시료를 조작하거나 조작하지 않은 상태로 본 발명의 항체와 반응시켜서 TNF-알파 유도 질병의 진단에 사용할 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어 “항원-항체 복합체”는 생물학적 시료 중의 Romo1 단백질의 존재 또는 부재를 확인하기 위한, 상기 단백질과 이를 인지하는 항체의 결합물을 의미한다. 바람직하게는 상기 항원-항체 복합체는 Romo1 단백질-본 발명에 따른 항체의 복합체이다.

이러한 항원-항체 복합체의 형성 및 검출은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포 분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 단백질 칩(Protein Chip) 또는 키트 등에 의해 이루어질 수 있으며 이로 제한되지는 않는다. 바람직하게는 웨스턴 블로팅, 효소면역흡착법, 단백질 칩 또는 키트 등을 이용한다.

항원-항체 복합체의 형성을 정성 또는 정량적으로 측정가능하게 하는 라벨에는 효소, 형광물, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 레독스 분자 및 방사선 동위원소 등이 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.

검출 라벨로 이용가능한 효소에는 β-글루쿠로니다제, β-D-글루코시다제, β-D-갈락토시다제, 우레아제, 퍼옥시다아제, 알칼라인 포스파타아제, 아세틸콜린에스테라제, 글루코즈 옥시다제, 헥소키나제와 GDPase, RNase, 글루코즈 옥시다제와 루시페라제, 포스포프럭토키나제, 포스포에놀피루베이트 카복실라제, 아스파르테이트 아미노트랜스페라제, 포스페놀피루베이트 데카복실라제, β-라타마제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 형광물에는 플루오레신, 이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리테린, 피코시아닌, 알로피코시아닌, o-프탈데히드, 플루오레스카민 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 리간드에는 바이오틴 유도체 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다. 발광물에는 아크리디늄 에스테르, 루시페린, 루시퍼라아제 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 미소입자에는 콜로이드 금, 착색된 라텍스 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 레독스 분자에는 페로센, 루테늄 착화합물, 바이올로젠, 퀴논, Ti 이온, Cs 이온, 디이미드, 1,4-벤조퀴논, 하이드로퀴논, K₄W(CN)₈, [Os(bpy)₃]²⁺, [RU(bpy)₃]²⁺, [MO(CN)₈]^4- 등이 있으며 이로 제한되지 않는다. 방사성 동위원소에는 ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶Cl, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵I, ¹³¹I, ¹⁸⁶Re 등이 있으며 이로 제한되지 않는다.

이하 본 발명의 구성을 실시예를 들어 설명하나, 본 발명의 권리범위가 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

실시예 1: Romo1 아미노산 서열의 항원성 분석 및 에피토프(epitope) 결정

서열번호 1로 기재된 Romo1 단백질의 아미노산 서열에 대해, dnastar software (DNASTAR)를 이용하여 Jameson-Wolf 항원성 인덱스(antigenity index) 수치를 구하여 Romo1에서 항원성이 있다고 예상되는 부분들을 분석하였다 (Jameson and Wolf, 1988 B.A. Jameson and H. Wolf, The antigenic index: a novel algorithm for predicting antigenic determinants, CABIOS 4 (1988), pp. 181186).

그 결과, 도 1에서 보는 바와 같이, 서열번호 1의 서열 중 8번~20번 아미노산 서열(YGQSQPSCFDRVK; 펩타이드1)과 44번~56번 아미노산 서열(RIGMRGRELMGGI; 펩타이드2)이 항원성이 가장 높은 것으로 나타났다. 따라서 이들 부분을 에피토프로 선정하고, 각각 펩타이드를 합성하였다.

실시예 2: Romo1 단백질에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주의 제조 및 상기 항체의 정제

<2-1> 하이브리도마 세포주의 제조 및 항체 생성 여부(항원-항체 반응성) 확인

실시예 1에서 에피토프로 선정한 두 개의 펩타이드를(펩타이드1, 펩타이드2)를 BALB/c 생쥐에 피하 주사하였다. 제1차 주사에서는 두 개의 펩타이드(각각 10 ㎍)를 CFA(Complete Freund’s Adjuvant; Sigma-Aldrich)와 함께 주사하였다. 이어서 IFA(Incomplete Freund’s adjuvant; Sigma-Aldrich)를 상기 펩타이드와 함께 2주 간격으로 3회 추가 주사하였다. 14일 후 면역증강제(adjuvant) 없이 펩타이드만 추가 주사한 다음, 다시 3일 후 비장세포(splenocytes)를 마우스의 골수종 세포(ATCC CRL-1645)와 융합시켰다. 융합시킨 세포를 96-well plate에서 HAT 배지(Sigma-Aldrich)을 이용하여 배양한 후, Romo1 단백질에 대한 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주를 ELISA 방법를 이용하여 아래와 같이 선별하였다.

먼저 상기 펩타이드1, 펩타이드2를 각각 3 ug/ml씩 96-well plate의 well에 별도로 코팅한 후, 위에서 수득한 하이브리도마의 세포 배양액 100 ㎕를 각각 1/10씩 연속으로 희석하여 각 well에 첨가하였다. 3회 세척 후, 2차항체로 50 ㎕의 HRP-컨쥬게이티드 염소 항-마우스 면역글로불린 항체[horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse immunoglobulin (IgG) (Fc-specific) antibody; Pierce]를 첨가한 후 37℃에서 1시간 동안 항온 반응시켰다. 다시 3회 세척 후 0.04% 오르토-페닐렌디아민 디하이드로클로라이드(ortho-phenylenediamine dihydrochloride)와 0.012% H₂O₂를 포함하는 0.2 M 시트레이트(citrate)-PO₄버퍼(pH 5.0)를 첨가하였다. 이어서 2.5 M H₂SO₄ 용액으로 반응을 중지시킨 후 490 nm의 파장에서의 흡광도를 ELISA reader(SOFTmaxPRO; Molecular Devices, United States)를 이용하여 측정하였다.

그 결과를 아래 표1 및 표2에 나타내었다. 표1은 펩타이드1(8번~20번 아미노산 서열)을 96-well plate에 코팅하고, 쥐에서 얻은 하이브리도마의 세포 배양액을 그에 첨가하여 490nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과이다. 표1의 결과를 보면, 실험한 배양액은, Romo1 펩타이드를 주사하지 않은 생쥐에서 얻은 비교 하이브리도마 배양액보다 흡광도가 높게 나타나 펩타이드1, 즉 이를 포함하는 Romo1 단백질에 대한 항체가 제대로 생성되었음을 알 수 있다.

	비교 하이브리도마	Romo1 항체 생산 하이브리도마
10^4*	0.144	2.601

(*: 배양액을 10,000배 희석하였다는 것을 나타냄)

표2는 펩타이드2(44번~56번 아미노산 서열)을 96-well plate에 코팅하고, 쥐에서 얻은 하이브리도마의 세포 배양액을 그에 첨가하여 490nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과이다. 표2의 결과를 보면, 펩타이드1에 대한 실험 결과와 마찬가지로, 실험한 배양액은, Romo1 펩타이드를 주사하지 않은 생쥐에서 얻은 비교 하이브리도마 배양액보다 흡광도가 높게 나타나 펩타이드2, 즉 이를 포함하는 Romo1 단백질에 대한 항체가 생성되었음을 알 수 있다.

	비교 하이브리도마	Romo1 항체 생산 하이브리도마
10^4	0.144	1.701

상기에서 실험한 하이브리도마를 본 발명의 Romo1 항체 생성 하이브리도마로 선정하고, 이를 수탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00226를 부여받았다.

<2-2> Romo1 단백질에 대한 항체의 정제

본 발명의 하이브리도마로 선별한 세포를 5일간 배양[기본배지: DMEM(Gibco 11995-065), 완전배지: 10%(v/v) FBS가 첨가된 DMEM]한 후 세포배양액을 2,500rpm으로 5분간 4℃에서 원심분리하여 상층액을 취해 항체 정제용으로 이용하였다. 이어서 단백질 G-아가로스(Protein G-agarose; Sigma-Aldrich)를 60㎕ 취한 다음 NETN 버퍼 (20mM Tris buffer(pH 8.0), 100mM NaCl, 1mM EDTA, 0.5% NP-40)를 이용하여 2회 세척하였다. 세척 방법으로 원심분리(5,000 rpm, 1분, 4℃)를 하여 단백질 G-아가로스를 침전시킨 후 상층액을 버렸다. 이와 같은 방법을 1회 더 반복하였다. 그 다음 20mM 소듐 포스페이트 버퍼 400㎕를 이용하여 단백질 G-아가로스를 다시 2회 세척하였다. 단백질 G-아가로스를 포함하는 침전물에 세포 배양액 400㎕를 첨가한 후 4℃에서 2시간 동안 항체를 흡착시켰다. PBS 버퍼와 원심분리를 이용하여 항체가 흡착된 단백질 G-아가로스를 2회 세척하였다. 세척 후 항체가 흡착된 단백질 G-아가로스에 글리신 버퍼(pH 3.0) 30㎕를 첨가하여 항체를 단백질 G-아가로스로부터 분리시켰다. 원심분리 후 상층액을 취하여 Romo1에 대한 항체로 이용하였다.

상기에서 수득한 Romo1 단백질에 대한 항체를 이용하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

실험예 1: Romo1 단백질에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블로팅

<1-1> 세포배양

자궁경부암세포(HeLa)와 인간 배아신장세포(HEK 293)를 미국세포주은행(ATCC)에서 구입하였다. 이들 세포를, 10% 태아송아지 혈청, 페니실린 100 units/ml, 및 스트렙토마이신 100 ㎍/ml을 함유하는 DMEM/F12 배양 배지(GIBCO/BRL, Grand Island, NY)에서 배양시켰다.

<1-2> Romo1 siRNA의 세포내 주입 - Romo1 단백질의 발현 감소

HeLa 세포를 6 well plate에 1 x 10⁵씩 분주한 후 배양하여 24 시간 후에 항생제가 들어 있지 않은 무혈청 배지로 1회 세척하였다. 이어서 control siRNA, Romo1 siRNA(100 nM)를, lipofectamine 5 ㎕를 넣어 상기 세포에 첨가하였다. 6시간 후 무혈청 배지로 2회 세척한 후 혈청 배지를 첨가하여 상기 세포를 배양하였다.

Romo1 siRNA 염기 서열은 다음과 같다: 5’-CUA CGG ACA GUC CCA GCC A (dTdT)-3’ (sense) and 5’-UGG CUG GGA CUG UCC GUA G (dTdT)-3’(antisense).

<1-3> 웨스턴 블로팅

암세포를 수확하여 인산염 억제제(1 mM 소듐 오르도 바나데이트, NaF 30 mM, 페닐 메틸술포닐 플루오리드 1 mM, NaPPi 30 mM)를 포함하는 RIPA 완충액(NaCl 150 mM, 1 % Nonidet P-40, 0.5 % 데옥시콜린산, 0.1 % SDS, Tris 50 mM, pH 8.0)으로 가용화시켰다. 단백질 농도를 바이로라드 단백질 어세이 킷트(BioRad, Hercules, CA)에 의해 결정하였다. 10% 소듐 도데실 설페이트-폴리아크릴아마이드 겔(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel)에 각각 50 ㎍씩 로딩하여 전기 영동을 실시한 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮겼다. 상기 멤브레인을 5% 스킴 밀크(skim milk)가 포함된 PBS-T 버퍼(50 mM Tris, pH8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween-20)로 상온에서 블로킹하고, 단백질 발현을 보고자 하는 Romo1에 대한 항체를 1시간 반응시킨 후 PBS-T 버퍼로 세 번 세척하였다. 이어서 HRP(horse radish peroxidase)가 결합되어 있고 쥐에서 만들어지는 항체에 결합할 수 있는 2차 항체(Sigma-Aldrich)를 반응시키고 ECL 검출 키트(Amersham, USA)로 검출하였다.

<1-4> 비교실험

한편 비교실험을 위해 시그마-알드리치에서 구입한 Romo1에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 상기와 동일한 실험을 수행하였다.

그 실험결과를 도 2 및 도 3에 나타내었다.

도 2는 HeLa 세포주에 Romo1 siRNA를 주입(transfection)하여 Romo1 단백질 양을 감소시킨 후, 실시예 2에서 수득한 본 발명의 Romo1 항체를 이용하여 Romo1 단백질을 측정한 웨스턴 블로팅 결과도이다. 비교군으로 control siRNA를 주입하여 발현량이 감소하지 않은 Romo1 단백질을 본 발명의 Romo1 항체를 이용하여 측정하였다. 도 2로부터, 본 발명의 항체는 웨스턴 블로팅 방법에 의해 Romo1 단백질을 잘 검출 또는 분석할 수 있음을 알 수 있다.

도 3은 HeLa 세포주에 Romo1 siRNA를 주입하여 Romo1 단백질 양을 감소시킨 후, 시그마-알드리치에서 구입한 Romo1에 대한 폴리클로날 항체를 이용하여 Romo1 단백질을 측정한 웨스턴 블로팅 결과도이다. 이 때에도 마찬가지로 비교군으로 control siRNA를 주입하여 발현량이 감소하지 않은 Romo1 단백질을 상기의 폴리클로날 항체를 이용하여 측정하였다. 도 3의 결과로부터 종래의 Romo1에 대한 폴리클로날 항체는 웨스턴 블로팅 방법에 의해 Romo1 단백질을 검출하지 못함을 알 수 있다. 이 때, 11kDa에서 보여지는 밴드는 비특이적인 밴드이다.

실험예 2: Romo1 단백질에 대한 항체를 이용한 면역형광

0.1% 젤라틴으로 코팅된 커버 글래스를 준비하여 6 well plate에 놓았다. HeLa 세포주를 2 X 10⁴ cells/well 로 분주한 다음 하루 동안 배양하였다. 배양한 세포를 PBS로 세척한 후 4% 포름알데히드 PBS(formaldehyde PBS)로 10분간 실온에서 고정(fixation)시키고 PBS로 세척하였다. Permeabilisation 용액(0.1% Triton X-100 in 0.1% sodium citrate) 1 ㎖로 10분간 얼음에서 배양(incubation)한 다음, 다시 PBS로 2회 세척하였다. 이어서 0.1% BSA/0.1% Tx-100/PBS 용액으로 30분간 블로킹 하고 PBS로 2회 세척하였다. 항체 처리는 실시예 2에서 수득한 Romo1 항체를 1% BSA/PBS-Tx(0.1%)로 1:200으로 희석하여 37℃ 배양기에서 60분간 배양함으로써 수행하였다. 그 뒤 PBS로 2회 세척하였다. 이어서 anti-mouse IgG을 1% BSA/PBS-Tx(0.1%)로 1:250으로 희석하여 37℃ 배양기에서 60분간 배양한 다음 PBS로 2회 세척하였다. 핵을 염색하기 위해 DAPI(biotium, CA, #40011)를 2 ㎍/㎖의 농도로 빛이 차단된 실온에서 15분간 배양한 다음 PBS로 세포를 세척하였다. 슬라이드 글래스 위에 마운팅 배지(mounting medium)(H-1000, Vector shield, Vector Laboratories, CA) 20 ㎕를 놓고 세포가 고정되어 있는 커버 글래스로 덮었다. 커버 글래스를 슬라이드 글래스 위에 투명 매니큐어로 마운팅(mounting) 시키고 건조한 다음 현광 현미경(Olympus LX71 microscope)으로 관찰하였다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4는 Romo1 단백질의 세포 내 발현을 Romo1 항체를 이용하여 염색한 면역형광 실험 결과도이다. 도 4에서 A는 Mito-G를 이용하여 미토콘드리아를 염색하여 미토콘드리아의 세포 내 위치를 보여주는 결과도이다. B는 Romo1 단백질에 대한 항체를 이용하여 Romo1 단백질 염색을 보여주는 결과도이다. C는 핵을 DAPI로 염색한 후 A그림과 B그림을 중복시킨 후 보여주는 결과도이다. 상기 도 4의 결과로부터 알 수 있듯이, 본 발명의 항체는 면역형광 분석법에 의해서도 Romo1 단백질을 잘 검출한다.

결과적으로, 본 발명의 항체는 Romo1 단백질에 대해 높은 결합 특이성을 가지고, 웨스턴 블로팅, 면역형광, ELISA 등 여러 가지의 분석방법에 제약 없이 이용 가능함으로써, Romo1 단백질의 발현 분석, 검출 또는 분리 등이 요구되는 기술분야에서 효과적으로 사용될 수 있음을 알 수 있다.

실험예 3: TNF-알파에 의하여 유도되는 활성산소 증가와 세포 사멸에서 중간 매개체로서의 Romo1의 역할 규명

<3-1> 세포배양 및 Romo1 siRNA의 세포내 주입

상기 실험예 1의 <1-1> 및 <1-2>와 동일하게 수행하였다.

<3-2> 활성산소 계측

0.1% 젤라틴으로 코팅된 커버 글래스를 준비하여 6 well plate에 놓았다. 세포를 well 당 2 x 10⁴개 분주하였다. 24 시간 배양한 후 CHX와 TNF-알파를 처리하였다. 활성산소의 정량을 위하여 활성산소 프로브(probe)인 DCF-DA(2,7-dichlorofluorescein diacetate)를 10 μM의 농도로 30분간 호일로 빛을 차단시키고, 37℃ 항온기에서 세포에 처리한 후, 상기 세포를 PBS로 2번 세척하였다. 슬라이드 글래스 위에 마운팅 배지(H-1000, Vector shield, Vector Laboratories, CA) 20 ㎕를 놓고 세포가 고정되어 있는 커버 글래스를 덮었다. 커버 글래스를 슬라이드 글래스 위에 투명 매니큐어로 마운팅시키고 건조한 후 현광 현미경(Olympus LX71 microscope)으로 관찰하였다. 활성산소는 Metamorph software를(Universal Imaging, Westchester, PA) 이용하여 계측하였다.

<3-3> TNF-알파 처리 후 세포 사멸율 계측

세포를 6 well plate에 1 x 10⁵씩 분주한 후 배양하여 24 시간 후에 항생제가 들어 있지 않은 무혈청 배지로 1회 정도 세포를 세척한 다음 control siRNA, Romo1 siRNA(100 nM)를, lipofectamine 5 ㎕를 넣어 세포에 첨가하였다. 6시간 후 무혈청 배지로 2 회 세척한 후 혈청 배지를 첨가하여 세포를 배양하였다. 24 시간 후 trypsin-EDTA를 처리하여 세포를 떼어낸 후 6 well plate에, 배지 2 ml에 세포 수가 2 x 10⁴수가 되도록 하여 분주하였다. TNF-알파와 CHX를 처리한 후 trypan blue(0.4%)와 섞어서 살아있는 세포수를 측정하였다.

<3-4> 면역침전분석(Immunoprecipitation assay) 및 웨스턴 블로팅

Romo1에 Flag DNA를 연결한 Romo1-Flag 혼성 유전자를 세포에 주입한 후 수확하여 인산염 억제제(1 mM 소듐 오르도 바나데이트, NaF 30 mM, 페닐 메틸술포닐 플루오리드 1 mM, NaPPi 30 mM)을 포함하는 RIPA 완충액(NaCl 150 mM, 1 % Nonidet P-40, 0.5 % 데옥시콜린산, 0.1 % SDS, Tris 50 mM, pH 8.0)으로 가용화시켰다. 단백질 농도를 바이로라드 단백질 에세이 킷트(BioRad, Hercules, CA)에 의해 결정하였다. Flag 항체를 첨가하여 Romo1-Flag 단백질과 결합시켰다. Romo1-Flag에 결합한 Flag 항체에 protein A agarose를 첨가하여 Romo1-Flag 단백질, Romo1-Flag 항체, protein A agarose의 복합체를 형성하게 하였다. 원심분리(4℃ 1min, 5,000rpm)를 수행하여 이 복합체를 침전시켰다. PBS(phosphate-buffered saline) 완충 용액으로 3회 세척한 후, SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리한 다음, 단백질들을 니트로셀룰로오스 멤브레인으로 옮기고 RIP, TRADD, TRAF2, FADD, Bcl-xL, Flag 단백질을 각각의 항체를 사용하여 웨스턴 블로팅을 실시하였다.

그 실험결과는 하기와 같다.

표 3은 자궁경부암세포(HeLa)에서 Romo1 siRNA를 이용하여 Romo1 발현을 감소시켰을 경우 TNF-알파(20 ng/ml)에 의하여 증가하는 활성산소가 차단된다는 것을 보여주는 결과이다. 이는, TNF-알파를 처리한 후, 형광현미경을 이용하여 관찰한 후, 활성 산소의 양을 계측한 결과이다. 표 3에서는 TNF-알파를 처리하지 않은 활성 산소의 양을 1로 정하고 TNF-알파를 처리 후 시간에 따른 활성 산소 생성 양을 상대적으로 나타내었다. BHA(butylated hydroxyanisole)는 항 산화제로서 양성대조군(positive control)으로 사용되었다.

Control siRNA: 대조군(control siRNA 100 nM)을 세포에 주입한 실험 결과치.

Romo1 siRNA: Romo1 siRNA(100 nM)를 세포에 주입한 실험 결과치.

BHA: BHA 100 uM 농도로 TNF-알파를 처리 30 분전에 세포에 처리한 실험 결과치.

Cycloheximide(CHX)는 TNF-알파를 처리 30 분전에 10 μg/ml 농도로 세포에 처리하였다.

시간	Control siRNA	Romo1 siRNA	BHA
0	1.0	1.0	1.0
15분	1.0	1.1	1.1
30분	1.2	1.3	1.1
1시간	1.4	1.3	1.1
2시간	1.5	1.1	1.2
4시간	2.1	1.2	1.0
6시간	2.5	1.3	1.0

표 4는 인간 배아신장세포(HEK 293)에서 Romo1 siRNA를 이용하여 Romo1의 발현을 감소시켰을 경우 TNF-알파(20 ng/ml)에 의하여 증가하는 활성 산소가 차단된다는 것을 보여주는 결과이다. TNF-알파를 처리한 후 형광 현미경을 이용하여 관찰한 후 활성 산소의 양을 계측하였다. 표 4에서는 TNF-알파를 처리하지 않은 활성산소의 양을 1로 정하고 TNF-알파를 처리 후 시간에 따른 활성 산소 생성 양의 상대적 변화를 나타냈다. BHA는 항 산화제로서 양성대조군으로 사용되었다.

Romo1 siRNA: Romo1 siRNA(100 nM)를 세포에 주입한 실험 결과치.

BHA: BHA 100 μM 농도로 TNF-알파를 처리 30 분전에 세포에 처리한 실험 결과치.

시간	Control siRNA	Romo1 siRNA	BHA
0	1.0	1.0	1.0
15분	1.2	1.2	1.3
30분	1.3	1.3	1.4
1시간	1.5	1.1	1.1
2시간	2.1	1.2	1.2
4시간	2.4	1.2	1.1
6시간	2.8	1.2	0.8

표 5는 HeLa 세포에서 Romo1 siRNA를 이용하여 Romo1 발현을 감소시켰을 경우 TNF-알파에 의하여 유도되는 세포 사멸이 차단된다는 것을 세포 계수(cell counting) 실험 기법을 이용하여 보여주는 결과이다. 표 5에서는 TNF-알파를 처리하지 않은 세포의 수를 1로 정하고 TNF-알파를 처리 후 시간에 따른 세포 수의 상대적 변화를 나타내었다. BHA는 항 산화제로서 양성대조군으로 사용되었다.

Romo1 siRNA: Romo1 siRNA(100 nM)를 세포에 주입한 실험 결과치.

시간	Control siRNA	Romo1 siRNA	BHA
0	1.00	1.00	1.00
3시간	0.65	0.92	0.90
6시간	0.29	0.63	0.68
9시간	0.11	0.50	0.52

도 5는 HEK 293 세포에서 TNF-알파를 처리하여 TNF-알파 신호를 주었을 경우 Romo1이 TNF-알파 신호전달경로에서 세포 사멸 신호를 전달하는 complex II 구성 단백질인 RIP, TRADD, TRAF2, FADD 단백질과 결합한다는 것을 웨스턴 블로팅 실험 기법을 이용하여 보여주는 결과도이다. Romo1에 Flag DNA를 연결한 Romo1-Flag 혼성 유전자를 세포에 주입한 후 Flag 항체를 이용하여 Romo1-Flag 단백질을 침전(immunoprecipitation)시켰다. TNF-알파 신호에 반응하여 Romo1과 결합하는 단백질을 확인하기 위하여 RIP, TRADD, TRAF2, FADD 항체를 이용하여 TNF-알파 처리 후 시간에 따른 웨스턴 블로팅을 수행하였다. Lysate는 침전하지 않고 세포 추출액을 웨스턴 블로팅을 수행한 결과도이다. β-actin은 웨스턴 블로팅에서 동일한 양의 단백질을 사용하였다는 것을 보여준다.

상기한 실험결과들은 Romo1이 TNF-알파에 의한 활성산소 생성 및 TNF-알파에 의한 세포사멸에서 중요한 매개체가 된다는 것을 보여준다. 또한 TNF-알파를 처리할 경우, 세포 사멸 경로에서 complex II(RIP, TRADD, TRAF2, FADD 단백질들의 결합체)가 형성되고, 이 complex II가 세포 사멸을 유도하게 되는데, 상기의 <3-4>의 실험 결과는 상기 complex II가 미토콘드리아에 위치하는 Romo1과 결합을 하여 TNF-알파의 신호를 전달한다는 것을 보여준다. 따라서 이러한 결과로부터 Romo1은 TNF-알파에 의해 유도되는 질병의 진단마커가 될 수 있고, 본 발명에 따른 Romo1에 대한 항체를 이용하면 상기 질병을 미리 진단 및 예방할 수 있음을 알 수 있다.

한국세포주연구재단

KCLRFBP00226

20100105

<110> Korea University Research and Business Foundation <120> ANTIBODY AGAINST ROMO1, HYBRIDOMA PRODUCING THE SAME AND USES THEREOF <130> HY091831 <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 79 <212> PRT <213> Protein of Reactive Oxygen Species Modulator 1 <400> 1 Met Pro Val Ala Val Gly Pro Tyr Gly Gln Ser Gln Pro Ser Cys Phe 1 5 10 15 Asp Arg Val Lys Met Gly Phe Val Met Gly Cys Ala Val Gly Met Ala 20 25 30 Ala Gly Ala Leu Phe Gly Thr Phe Ser Cys Leu Arg Ile Gly Met Arg 35 40 45 Gly Arg Glu Leu Met Gly Gly Ile Gly Lys Thr Met Met Gln Ser Gly 50 55 60 Gly Thr Phe Gly Thr Phe Met Ala Ile Gly Met Gly Ile Arg Cys 65 70 75

Claims

수탁번호가 KCLRF-BP-00226인 하이브리도마에 의하여 생산되는, 서열번호 1로 기재된 아미노산 서열을 갖는 Romo1 (Reactive Oxygen Species Modulator 1) 단백질에 대한 항체.
제1항에 있어서,
상기 항체는 서열번호 1의 서열 중 8번~20번 사이에 존재하는 에피토프 및 44번~56번 사이에 존재하는 에피토프 중 하나 이상을 인식하여 Romo1 단백질에 대해 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 하는 항체.
제1항의 항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00226의 하이브리도마.
제1항의 항체를 포함하는, TNF-알파 유도 질병의 진단용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 TNF-알파 유도 질병은 패혈증(sepsis), 당뇨병(diabetes), 골다공증(osteoporosis), 이식 거부 반응(allograft rejection), 다발성 경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 염증성 장질환(inflammatory bowel diseases), 허혈성 질환(ischemia/reperfusion injury), 폐 섬유증(pulmonary fibrosis) 및 신경세포 퇴화 질환(ischemic stroke, Alzheimer's disease, Parkinson's disease)으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항의 항체를 포함하는, TNF-알파 유도 질병의 진단 키트.
제6항에 있어서,
상기 TNF-알파 유도 질병은 패혈증, 당뇨병, 골다공증, 이식 거부 반응, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환, 허혈성 질환, 폐 섬유증 및 신경세포 퇴화 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 키트.
제1항의 항체를 생물학적 시료와 접촉시켜, 항원-항체 복합체 형성을 검출함으로써 TNF-알파 유도 질병의 마커인 Romo1 단백질을 검출하는 방법.
제8항에 있어서,
상기 TNF-알파 유도 질병은 패혈증, 당뇨병, 골다공증, 이식 거부 반응, 다발성 경화증, 류마티스성 관절염, 염증성 장질환, 허혈성 질환, 폐 섬유증 및 신경세포 퇴화 질환으로 이루어지는 군에서 선택되는 것을 특징으로 방법.
제8항에 있어서,
상기 항원-항체 복합체는 Romo1 단백질-제1항의 항체의 복합체이고,
상기 복합체 형성의 검출은 효소면역분석법(ELISA), 웨스턴 블로팅(Western Blotting), 면역형광(Immunofluorescence), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry staining), 유세포 분석법(Flow cytometry), 면역세포화학법, 방사능면역분석법(RIA), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 면역확산분석법(Immunodiffusion assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay) 또는 단백질 칩(Protein Chip)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.