KR20120002992A - 파이토스테롤／파이토스타놀 인지질 에스테르의 제조 방법 - Google Patents

파이토스테롤／파이토스타놀 인지질 에스테르의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 a) 약 10% 내지 약 70%의 식물 인지질을 포함하는 인지질 조성물; 지질 아실트랜스퍼라제; 및 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀; 및 선택적으로 물을 혼합하여, 반응 조성물 내에 적어도 5 w/w%의 물을 포함하는 반응 조성물을 제조하는 단계; 및 b) 적어도 하나의 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 분리하거나 정제하는 단계;로 이루어진 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르의 제조 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 방법으로 제조된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 포함하는 조성물 및 식품 개인 보호 용품(화장품) 조성물에 관한 것이다.

Description

파이토스테롤／파이토스타놀 인지질 에스테르의 제조 방법 {Method for producing phytosterol/phytostanol phospholipid esters}
본 발명은 지질 아실트랜스퍼라제를 이용하여 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 제조하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 제조하기 위한 지질 아실트랜스퍼라제의 용도에 관한 것이다.
파이토스테롤 에스테르를 마요네즈 또는 마가린과 같은 식품에 통합시켜 콜레스테롤을 저하시키는 효과가 잘 알려져있다. 파이토스테롤 에스테르 또는 파이토스타놀 에스테르가 풍부한 식품 생성물은 통상 기능성 식품으로 예를 들면 강화된 마가린 등으로 일컬어진다. 파이토스테롤 에스테르 또는 파이토스타놀 에스테르는 화장품과 같은 개인 보호 용품 산업에 사용될 수도 있다. 식품 또는 다른 적용에 있어서 스테롤 또는 스타놀이 제거된 것보다는 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르를 사용하는 것이 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르가 더욱 안정하기 때문에 바람직하다.
스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르는 종래에는 이에 상응하는 스테롤/스타놀 화합물을 지방산과 함께 화학적 에스테르화 반응을 통해 생성하였다. 스테롤 에스테르의 생성을 위한 효소 반응은 잘 알려져 있으나 유기 용매 및/또는 분자체를 일반적으로 필요로 한다. 또한 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르를 특히 식품 적용과 같은 특정한 적용에 사용하기 전에는 종종 몇 단계의 정제 공정을 필요로 한다.
고객 및 회사들은 좀 더 적합한 생산 공정을 요구하여왔으며 이는 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르를 화합물과 유기 용매 시스템을 사용하여 제조하는 것보다 더욱 환경 친화적이고 지속적인 방법을 요구하였던 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 더욱 환경 친화적인 방법으로 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 생성하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 한 측면은 다음 설명 및 청구범위에 나타난 발명에 관한 것이다.
본 발명은 적어도 약 10 내지 약 70%의 식물 인지질과 적어도 약 5%의 물을 포함하는 인지질 조성물에 아실트랜스퍼라제와 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀을 결합시킴으로써 수용액 상의 환경에서 지질 아실트랜스퍼라제의 용도에 의해 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 더욱 간편하고 효과적으로 생성하는 놀라운 방법을 발견한 것이다.
본 방법은 지속적이며 환경 친화적이고 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 생성하기 위한 간편한 방법을 제공하는 것이다.
도 1은 Asn80Asp 변이가 도입된 변이 Aeromonas salmonicida 성숙 지질 아실 트랜스퍼라제(GCAT) 아미노산 서열(서열번호: 16)을 나타낸 것이다. 즉 80번 아미노산 잔기는 성숙된 서열이다.
도 2는 Aeromonas hydrophila (ATCC #7965)의 지질 아실 트랜스퍼라제 아미노산 서열(서열번호: 1)을 나타낸 것이다.
도 3은 데이터베이스 버전 6으로부터 pfam00657 콘센서스 서열(서열번호: 2)을 나타낸 것이다.
도 4는 생물체 Aeromonas hydrophila (P10480; GI:121051)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 3)을 나타낸 것이다.
도 5는 생물체 Aeromonas salmonicida (AAG098404; GI:9964017)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 4)를 나타낸 것이다.
도 6은 생물체 Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank 접근 번호:NP_631558)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 5)를 나타낸 것이다.
도 7은 생물체 Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank 접근 번호: CAC42140)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 6)를 나타낸 것이다.
도 8은 생물체 Saccharomyces cerevisiae (Genbank 접근 번호:P41734)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 7)를 나타낸 것이다.
도 9은 생물체 Ralstonia (Genbank 접근 번호: AL646052)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 8)를 나타낸 것이다.
도 10은 보존적 가상 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] Scoe1 NCBI 단백질 접근 번호 CAB39707.1 GI:4539178의 아미노산 서열(서열번호: 9)을 나타낸 것이다.
도 11은 보존적 가상 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] Scoe2 NCBI 단백질 접근 번호 CAC01477.1 GI:9716139의 아미노산 서열(서열번호: 10)을 나타낸 것이다.
도 12는 추정 분비 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] Scoe3 NCBI 단백질 접근 번호 CAB88833.1 GI:7635996의 아미노산 서열(서열번호: 11)을 나타낸 것이다.
도 13은 추정 분비 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] Scoe4 NCBI 단백질 접근 번호 CAB89450.1 GI:7672261의 아미노산 서열(서열번호: 12)을 나타낸 것이다.
도 14는 추정 지단백 [Streptomyces coelicolor A3(2)] Scoe5 NCBI 단백질 접근 번호 CAB62724.1 GI:6562793의 아미노산 서열(서열번호: 13)을 나타낸 것이다.
도 15는 GDSL-리파아제 [Streptomyces rimosus] Srim1 NCBI 단백질 접근 번호 AAK84028.1 GI:15082088의 아미노산 서열(서열번호: 14)을 나타낸 것이다.
도 16은 Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC#14174)로부터 지질 아실 트랜스퍼라제의 아미노산 서열(서열번호: 15)를 나타낸 것이다.
도 17은 보존적 가상 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] Scoe1 NCBI 단백질 접근 번호 CAB39707.1 GI:4539178의 아미노산 서열(서열번호: 19)을 나타낸 것이다.
도 18은 Aeromonas hydrophila 지질 아실 트랜스퍼라제 유전자의 변이를 위해 사용되는 융합 컨스트럭트의 아미노산 서열(서열번호: 25)를 나타낸 것이다. 밑줄 친 아미노산은 자일라나제의 시그널 펩타이드이다.
도 19는 Streptomyces로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제 효소의 펩타이드 서열(서열번호: 26)을 나타낸 것이다.
도 20는 Thermobifida로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제 효소의 펩타이드 서열(서열번호: 27)을 나타낸 것이다.
도 21는 Thermobifida로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제 효소의 펩타이드 서열(서열번호: 28)을 나타낸 것이다.
도 22는 Corynebacterium efficiens GDSx 300 아미노산으로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드 서열(서열번호: 29)을 나타낸 것이다.
도 23은 Novosphingobium aromaticivorans GDSx 284 아미노산으로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드 서열(서열번호: 30)을 나타낸 것이다.
도 24는 Streptomyces coelicolor GDSx 269 아미노산으로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드 서열(서열번호: 31)을 나타낸 것이다.
도 25는 Streptomyces avermitilis / GDSx 269 아미노산으로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드 서열(서열번호: 32)을 나타낸 것이다.
도 26은 Streptomyces로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제 효소의 폴리펩타이드 서열(서열번호: 33)을 나타낸 것이다.
도 27은 생물체 Aeromonas hydrophila (P10480; GI:121051) (명백하게 성숙된 서열)로부터 수득된 아미노산 서열(서열번호: 34)을 나타낸 것이다.
도 28은 변이 Aeromonas salmonicida 성숙 지질 아실 트랜스퍼라제(GCAT) (명백하게 성숙된 서열)의 아미노산 서열(서열번호: 35)을 나타낸 것이다.
도 29는 Streptomyces thermosacchari로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 36)이다.
도 30는 Streptomyces thermosacchari로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 37)이다.
도 31는 Thermobifida fusca/GDSx 548로부터 유래된 아미노산 서열(서열번호: 38)이다.
도 32는 Thermobifida fusca로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 39)이다.
도 33은 Thermobifida fusca/GDSx로부터 유래된 아미노산 서열(서열번호: 40)이다.
도 34는 Corynebacterium efficiens/GDSx 300로부터 유래된 아미노산 서열(서열번호: 41)이다.
도 35는 Corynebacterium efficiens로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 42)이다.
도 36은 S. coelicolor/ GDSx 268로부터 유래된 아미노산 서열(서열번호: 43)이다.
도 37은 S. coelicolor로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 44)이다.
도 38은 S. avermitilis로부터 유래된 아미노산 서열(서열번호: 45)이다.
도 39는 S. avermitilis로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 46)이다.
도 40은 Thermobifida fusca/GDSx로부터 유래된 아미노산 서열(서열번호: 47)이다.
도 41은 Thermobifida fusca/GDSx로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 48)이다.
도 42는 L131, S. avermitilis 및 T. fusca의 동족체의 배열을 나타낸 것으로 GDSx 모티프(L131내의 GDSY와 S. avermitilis 및 T. fusca), GANDY 박스, GGNDA 또는 GGNDL, HPT 블록(보존된 촉매 히스티딘으로 여겨짐)의 보존을 나타내고 있다.
도 43은 Candida parapsilosis로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제의 아미노산 서열(서열번호: 17)을 나타낸다.
도 44는 Candida parapsilosis로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제의 아미노산 서열(서열번호: 18)을 나타낸다.
도 45는 시그널 서열(preLAT - 1 내지 87 부위)을 포함하는 Aeromonas salmonicida로부터 유래된 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 49)를 나타낸다.
도 46은 생물체 Aeromonas hydrophila로부터 수득할 수 있는 본 발명에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 50)을 나타낸다.
도 47은 생물체 Aeromonas salmonicida로부터 수득할 수 있는 본 발명에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 51)을 나타낸다.
도 48은 생물체 Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank 접근 번호: NC_003888.1:8327480..8328367)로부터 수득할 수 있는 본 발명에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 52)을 나타낸다.
도 49는 생물체 Streptomyces coelicolor A3(2) (Genbank 접근 번호: AL939131.1:265480..266367)로부터 수득할 수 있는 본 발명에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 53)을 나타낸다.
도 50은 생물체 Saccharomyces cerevisiae (Genbank 접근 번호: Z75034)로부터 수득할 수 있는 본 발명에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 54)을 나타낸다.
도 51은 생물체 Ralstonia로부터 수득할 수 있는 본 발명에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 55)을 나타낸다.
도 52는 보존적 가상 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] NCBI 단백질 접근 번호 CAB39707.1 GI:4539178의 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 56)을 나타낸 것이다.
도 53은 보존적 가상 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] Scoe2 NCBI 단백질 접근 번호 CAC01477.1 GI:9716139의 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 57)을 나타낸 것이다.
도 54는 추정 분비 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] Scoe3 NCBI 단백질 접근 번호 CAB88833.1 GI:7635996의 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 58)을 나타낸 것이다.
도 55는 추정 분비 단백질 [Streptomyces coelicolor A3(2)] Scoe4 NCBI 단백질 접근 번호 CAB89450.1 GI:7672261의 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 59)을 나타낸 것이다.
도 56은 추정 지단백 [Streptomyces coelicolor A3(2)] Scoe5 NCBI 단백질 접근 번호 CAB62724.1 GI:6562793의 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 60)을 나타낸 것이다.
도 57은 GDSL-리파아제 [Streptomyces rimosus] Srim1 NCBI 단백질 접근 번호 AAK84028.1 GI:15082088의 단백질을 코드화한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 61)을 나타낸 것이다.
도 58은 Aeromonas hydrophila (ATCC #7965)로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 62)을 나타낸 것이다.
도 59는 Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida (ATCC#14174)로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 63)을 나타낸 것이다.
도 60은 자일라나제 시그널 펩타이드를 포함하는 Aeromonas hydrophila로부터 효소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 24)을 나타낸 것이다.
도 61은 Asn80Asp 변이를 지닌 Aeromonas salmonicida 성숙된 지질 아실 트랜스퍼라제(GCAT)의 아미노산 서열(서열번호: 68)을 나타낸 것으로 이 때 아미노산 잔기 80은 성숙된 서열 내에 있다. 후-번역 변형을 행한 후에 서열번호: 68의 아미노산 잔기 235와 236은 공유 결합 되어 있지 않으며 이는 후-번역 변형에 따른 것이다. 2 개의 펩타이드가 형성되었으며 하나 또는 그 이상의 S-S 브릿지를 지닌다. 서열번호: 68 내의 아미노산 잔기 236은 본 명세서 내의 서열번호: 16의 아미노산 잔기 274와 상응한다.
도 62는 스테롤 검 상 반응물의 TLC 분석을 나타낸 것이다.
도 63은 A. salmonicida로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화한 뉴클레오타이드 서열(서열번호: 69)을 나타낸 것이다.
도 64는 Asn80Asp 변이를 지닌 Aeromonas salmonicida 변이 지질 아실 트랜스퍼라제(GCAT)의 아미노산 서열을 나타낸 것으로 이 때 아미노산 잔기 80은 성숙된 서열 내에 있다. 서열번호: 70과 같은 후-번역 변형을 행한 후에 서열번호: 70의 아미노산 잔기 235와 236은 공유 결합 되어 있지 않으며 이는 후-번역 변형에 따른 것이다. 2 개의 펩타이드가 형성되었으며 하나 또는 그 이상의 S-S 브릿지를 지닌다. 서열번호: 70 내의 아미노산 잔기 236은 본 명세서 내의 서열번호: 16의 아미노산 잔기 275와 상응한다.
도 65는 Asn80Asp 변이를 지닌 Aeromonas salmonicida 변이 지질 아실 트랜스퍼라제(GCAT)의 아미노산 서열을 나타낸 것으로 이 때 아미노산 잔기 80은 성숙된 서열 내에 있다. 서열번호: 71과 같은 후-번역 변형을 행한 후에 서열번호: 71의 아미노산 잔기 235와 236은 공유 결합 되어 있지 않으며 이는 후-번역 변형에 따른 것이다. 2 개의 펩타이드가 형성되었으며 하나 또는 그 이상의 S-S 브릿지를 지닌다. 서열번호: 71 내의 아미노산 잔기 236은 본 명세서 내의 서열번호: 16의 아미노산 잔기 276와 상응한다.
도 66은 Asn80Asp 변이를 지닌 Aeromonas salmonicida 변이 지질 아실 트랜스퍼라제(GCAT)의 아미노산 서열을 나타낸 것으로 이 때 아미노산 잔기 80은 성숙된 서열 내에 있다. 서열번호: 72과 같은 후-번역 변형을 행한 후에 서열번호: 72의 아미노산 잔기 235와 236은 공유 결합 되어 있지 않으며 이는 후-번역 변형에 따른 것이다. 2 개의 펩타이드가 형성되었으며 하나 또는 그 이상의 S-S 브릿지를 지닌다. 서열번호: 72 내의 아미노산 잔기 236은 본 명세서 내의 서열번호: 16의 아미노산 잔기 277와 상응한다.
도 67은 활성 부위 내에 글리세롤을 지닌 1IVN.PDB 결정 구조의 리본 형상을 나타낸 것이다. 본 도면은 Deep View Swiss-PDB viewer을 통해 작성되었다.
도 68은 활성 부위 내에 글리세롤을 지닌 Deep View Swiss-PDB viewer을 통한 1IVN.PDB 결정 구조의 측면도를 나타낸 것이다. 글리세롤 활성 부위의 10Å 이내의 아미노산 잔기를 검정색으로 표시한다.
도 69는 활성 부위 내에 글리세롤을 지닌 Deep View Swiss-PDB viewer을 통한 1IVN.PDB 결정 구조의 평면도를 나타낸 것이다. 글리세롤 활성 부위의 10Å 이내의 아미노산 잔기를 검정색으로 표시한다.
도 70은 배열 1을 나타낸다.
도 71은 배열 2를 나타낸다.
도 72와 73은 A. hydrophila 효소를 위한 데이터베이스 서열인 P10480을 통해 1IVN to P10480 배열을 나타낸 것이다. 이 배열은 PFAM 데이터베이스를 통해 수득되었으며 모델 구축 과정에 사용된다.
도 74는 A. hydrophila 효소를 위한 데이터베이스 서열인 P10480 배열을 나타낸 것이다. 이 서열은 모델 구축과 부위 선택을 묘사하고 있으며 이 때 서열번호 : 25의 전체 단백질 서열을 사용한 것으로 서열번호: 34에 동등한 성숙된 단백질이 잔기 19에서 시작되며 A. sal은 Aeromonas salmonicida(서열번호: 4) GDSX 리파아제를 나타낸 것이며 A. hyd는 Aeromonas hydrophila(서열번호: 34) GDSX 리파아제를 나타내고 콘센서스 서열은 두 서열간에 다른 부위를 *표시로 나타내었다.
본 발명의 첫 번째 측면은
a) 약 10% 내지 약 70%의 식물 인지질을 포함하는 인지질 조성물; 지질 아실트랜스퍼라제; 및 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀; 및 선택적으로 물을 혼합하여, 적어도 2 w/w%의 물을 포함하는 반응 조성물을 제조하는 단계; 및
b) 적어도 하나의 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 분리하거나 정제하는 단계;
로 이루어진 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 측면은
a) 약 10% 내지 약 70%의 식물 인지질 및 적어도 약 2%의 물을 포함하는 인지질 조성물; 지질 아실트랜스퍼라제; 및 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀;을 혼합하여 반응 조성물을 제조하는 단계 및
b) 적어도 하나의 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 분리하거나 정제하는 단계;
로 이루어진 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 a) 적어도 약 10% 내지 약 70%의 식물 인지질을 포함하는 인지질 조성물, b) 적어도 약 2%의 물 및 c) 첨가된 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀을 포함하는 반응 조성물로부터 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 생성하기 위한 지질 아실트랜스퍼라제의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 측면은 적어도 약 10% 내지 약 70%의 식물 인지질 및 적어도 약 5%의 물을 포함하는 인지질 조성물에 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀을 첨가시켜 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 생성하기 위한 지질 아실트랜스퍼라제의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 식품 및/또는 식품 재료에 본 발명에 따른 방법 및/또는 용도에 의해 수득된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 포함하는 식품을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 개인 보호용품 예를 들면 화장품 성분에 본 발명에 따른 방법 및/또는 용도에 의해 수득된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 포함하는 개인 보호용품 예를 들면 화장품을 제조하기 위한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 방법 및/또는 용도에 의해 수득된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 포함하는 식품을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 방법 및/또는 용도 또는 선택적으로 화장품 희석제, 첨가제 또는 담체를 포함하여 수득된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 포함하는 개인 보호용품 예를 들면 화장품을 제공하는 것이다.
첨가되는 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀의 함량은 반응 조성물 전체 함량 또는 전체 조성에 대해 적어도 5% 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 식품 또는 식품 성분과 혼합되는 것이 바람직하다.
본 발명의 또다른 실시태양에서 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 약제학적 희석제, 담체 또는 첨가제 또는 화장품 희석제, 담체 또는 첨가제와 혼합되는 것이 바람직하다.
바람직한 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀은 다음 구조 특징 중 하나 이상을 지니는 것이다.
ⅰ) 3-베타 하이드록시 그룹 또는 3-알파 하이드록시 그룹; 및/또는 ⅱ) 시스 위치 내의 A:B 고리, 트랜스 위치 내의 A:B 고리 또는 C5-C6가 불포화됨을 특징으로 한다.
바람직한 파이토스테롤은 알파-시토스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 5,6-디하이드로스테롤, 브라시카스테롤, 알파-스피나스테롤, 베타-스피나스테롤, 감마-스피나스테롤, 델타스피나스테롤, 후코스테롤, 디모스테롤, 아스코스테롤, 세레비스테롤, 에피스테롤, 아나스테롤, 아베나스테롤, 클리오나스테롤, 하이포스테롤, 콘드릴라스테롤, 데스모스테롤, 찰리노스테롤, 포리퍼라스테롤, 클리오나스테롤, 스테롤글리코사이드 및 다른 천연 또는 합성 이성체 또는 유도체에서 선택된 하나 또는 그 이상이 바람직하다.
바람직한 파이토스타놀은 알파-시토스타놀, 베타-시토스타놀, 스티그마스타놀, 에르고스타놀, 캄페스타놀, 5,6-디하이드로스타놀, 브라시카스타놀, 알파-스피나스타놀, 베타-스피나스타놀, 감마-스피나스타놀, 델타스피나스타놀, 후코스타놀, 디모스타놀, 아스코스타놀, 세레비스타놀, 에피스타놀, 아나스타놀, 아베나스타놀, 클리오나스타놀, 하이포스타놀, 콘드릴라스타놀, 데스모스타놀, 찰리노스타놀, 포리퍼라스타놀, 클리오나스타놀, 스타놀글리코사이드 및 다른 천연 또는 합성 이성체 또는 유도체에서 선택된 하나 또는 그 이상이 바람직하다.
본 발명에 사용되는 적합한 파이토스타놀은 미국 특허 제 6,866,837호의 실시예에 개시된 방법으로부터 스테롤의 수소화를 통해 얻어진 것이다.
또 한 측면에서 인지질 조성물에 첨가되거나 혼합되는 파이토스테롤 및 또는 파이토스타놀은 하나 또는 그 이상의 파이토스테롤, 하나 또는 그 이상의 파이토스타놀 또는 적어도 하나의 파이토스테롤과 적어도 하나의 파이토스타놀의 혼합물일 수 있다.
적합한 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀은 인지질 조성물 내에서 자연적으로 존재하지 않는 외인성 물질이다. 이는 인지질 조성물에 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀이 첨가됨을 의미한다. 따라서 '파이토스테롤의 첨가' 또는 '파이토스타놀의 첨가'라는 용어는 인지질 조성물 내에 자연적으로 존재하지 않는 외인성 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀을 의미하는 것이다. 비록 인지질 조성물 내에 자연적으로 존재하는 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀이 있다 하더라도 외인성 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀을 인지질 조성물에 첨가하거나 혼합하는 것이 바람직하다. 첨가되는 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀의 함량은 적합하게는 예를 들면 반응 혼합물 및/또는 반응 조성물과 같은 반응 조성물 내에서 식물 인지질과 파이토스테롤/파이토스타놀을 1:1 비율로 혼합하는 것이다. 이 경우 인지질 또는 파이토스테롤/파이토스타놀은 반응의 속도를 제한하지는 않는다.
바람직한 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀의 첨가량은 반응 혼합물 또는 전체 혼합물 또는 전체 조성물에 대해 적어도 5% 이상 또는 적어도 10% 이상, 또는 적어도 15% 이상, 또는 적어도 20% 이상이다.
바람직한 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀의 첨가량은 반응 혼합물 또는 전체 혼합물 또는 전체 조성물에 대해 약 30% 이하, 적합하게는 약 25% 이하, 더욱 적합하게는 약 21% 이하이다.
본 발명의 방법 또는 용도에 사용되는 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀은 바람직하게는 예를 들면 대두유 탈취 증류물(SODD)과 같은 천연 원료의 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀이다.
라이소-인지질은 본 발명의 방법 또는 용도를 위해 생성되는 것이 바람직하다.
라이소-인지질이 생성되었을 때 라이소-인지질은 정제되거나 분리된 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 '인지질 조성물'은 적어도 약 10% 내지 약 70%의 식물 인지질을 포함하는 조성물이다.
적합한 인지질 조성물은 하나 또는 그 이상의 식물 인지질을 포함할 수 있다. 한 측면에서 인지질 조성물은 둘 또는 그 이상, 바람직하게는 셋 또는 그 이상의 식물 인지질의 혼합물이다.
또 한 측면에서 인지질 조성물은 약 10% 내지 약 65%의 식물 인지질을 포함하고 바람직하게는 약 10% 내지 약 50%이고 더욱 바람직하게는 약 10% 내지 약 40%의 식물 인지질을 포함하는 것이다.
또 한 측면에서 인지질 조성물은 적어도 약 10%의 식물 인지질을 포함하고 바람직하게는 적어도 약 20% 식물 인지질을 포함하고 바람직하게는 적어도 약 30% 식물 인지질을 포함한다.
또 한 측면에서 인지질 조성물은 많아도 약 70%의 식물 인지질을 포함하고 바람직하게는 많아도 약 60% 식물 인지질을 포함하고 바람직하게는 많아도 약 50%, 바람직하게는 많아도 약 40%의 식물 인지질을 포함한다.
또 한 측면에서 본 발명에 따른 인지질 조성물은 적어도 약 10% 내지 약 70%의 식물 인지질과 적어도 약 2%의 물을 포함하는 조성물이다.
또 한 측면에서 인지질 조성물은 적어도 약 5%의 물, 또는 적어도 약 10%의 물, 적어도 약 20%의 물을 포함한다.
또 한 측면에서 인지질 조성물은 많아도 약 30%의 물, 또는 많아도 약 40%의 물, 많아도 약 50%의 물을 포함한다.
인지질 및 물뿐만 아니라 인지질 조성물은 트리글리세라이드 또는 유리지방산과 같은 성분을 하나 또는 그 이상 더욱 포함할 수 있다.
본 명세서 내의 '식물 인지질'이라는 용어는 식물로부터 수득하거나 수득 가능한 인지질이다. 적합한 식물 인지질로서는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린 또는 포스파티딜글리세롤에서 선택되니 하나 또는 그 이상의 인지질이다.
인지질 조성물은 상기 성분을 서로 혼합하여 제조할 수 있다.
적합한 인지질 조성물은 예를 들면 소야빈 오일, 카놀라 오일, 코튼시드 오일, 팜 오일, 코코넛 오일, 라이스브란 오일, 피넛 오일, 올리브 오일, 사프플라워 오일, 팜 케르넬 오일, 포도씨 오일 또는 해바라기 오일에서 선택된 하나 또는 둘 이상의 식물 또는 식물 오일로부터 수득된 식물 인지질을 포함한다.
더욱 바람직하게는 인지질 조성물 내의 식물 인지질은 소야빈 오일, 해바라기 오일, 또는 포도씨 오일, 또는 카놀라 오일에서 선택되어 수득될 수 있는 오일이다.
더욱 바람직하게는 인지질 조성물 내의 식물 인지질은 소야빈 오일, 해바라기 오일, 또는 포도씨 오일에서 수득할 수 있는 1종 또는 2종의 것이다.
더욱 바람직하게는 인지질 조성물 내의 식물 인지질은 소야빈 오일로부터 수득할 수 있는 것이다.
본 발명은 식물 공정의 부산물을 출발물질로 사용할 수 있기 때문에 더욱 유리하다.
예를 들면 본 발명에 사용되는 인지질 조성물은 조(crude) 식물 오일의 탈 검(de-gumming) 부산물일 수 있다. 이러한 조 식물 오일의 탈 검은 탈 검 식용유와 검 상 물질의 부산물을 생성하는 정제 공정 도중 또는 이전에 수행될 수 있다. 이러한 공정을 통해 크루드 오일은 예를 들면 화학적 탈 검 방법, 효소적 탈 검 방법, 물 탈 검 방법, 총 탈 검 방법 및 슈퍼 탈 검 방법에 의해 탈 검 되고 포스파타이드를 제거한다. 이때 포스파타이드는 예를 들면 오일로부터의 인지질과 같은 극성 지질의 혼합물 내에 존재한다. 또한 검 상 물질로는 인지질 또는 물 트리글리세라이드 유리지방산과 같은 다른 성분이 혼합된 인지질의 혼합 극성 지질이다. 검 조성물 또는 검 상 조성물의 수분 함량은 10 내지 40% (w/w)이다. 인지질의 함량은 검 조성물 또는 검 상 물질의 10 내지 70% (w/w)이다. 따라서 본 발명에 따른 인지질 조성물의 하나의 실시태양은 식물 오일의 탈 검 공정으로부터 수득되거나 수득될 수 있는 검상 물질 또는 검 조성물 일 수 있다.
본 발명에 사용되는 인지질 조성물은 크루드 식물 오일의 정제 공정의 또다른 부산물일 수 있다. 즉 소프스톡(soapstock)이다. 소프스톡은 산 및/또는 알칼리 예를 들면 수산화나트륨과 함께 크루드 식물 오일의 처리를 통해 수득될 수 있는 부산물이다. 소프스톡의 수분 함량은 10 내지 65% 또는 10 내지 70%(w/w)이다. 소프스톡의 인지질 함량은 10 내지 70% 범위이다. 따라서 본 발명에 따른 하나의 실시태양에 있어서 인지질 조성은 식물 오일의 산 및/또는 알칼리 처리로부터 수득되거나 수득될 수 있는 소프스톡 일 수 있다.
인지질 조성물이 검 조성물 또는 검 상 조성물 또는 소프스톡인 경우 검 조성물 또는 소프스톡은 지질 아실트랜스퍼라제, 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀 및 선택적으로 물과 혼합하기 전에 정제 또는 건조 또는 용매 분획 또는 상기 방법 중 둘 이상의 결합을 통해 처리한다.
하나의 실시태양에서 본 명세서에 사용되는 인지질 조성은 없거나 매우 낮은 수분 함량을 지닌 건조 조성물이다. 이와 같은 인지질 조성물은 건조 검상 조성물 똔는 건조 소프스톡을 포함할 수 있다. 하나의 실시태양에서 물은 반응 조성물 내에 혼합되어 반응 조성물이 적어도 2%, 바람직하게는 적어도 5%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%의 물을 포함할 수 있다.
또다른 실시태양에서 인지질 조성물은 천연적으로 그 자체에 약간의 물을 포함하며 예를 들면 적어도 2%의 물, 바람직하게는 적어도 5%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%의 물을 포함할 수 있다. 이와 같은 인지질 조성물은 검 상과 소프스톡 조성물을 포함하며 이들은 건조되지 않은 것이다. 또하나의 실시태양에서 인지질 조성물 자체가 충분한 물을 포함하고 있다면 반응 조성물에 추가적 물의 공급이 불필요하다. 이때 반응 조성물은 적어도 2%의 물을 포함하는 것이다. 그러나 반응 조성물의 물 함량이 필요하다면 추가적 물의 공급이 요구된다. 반응 조성물은 반드시 적어도 2%의 물, 바람직하게는 적어도 5%, 더욱 바람직하게는 적어도 10%, 더욱 바람직하게는 적어도 20%의 물을 포함하여야 한다.
적합한 인지질 조성물은 인지질 조성물이 지질 아실트랜스퍼라제 및/또는 파이토스테롤 또는 파이토스타놀과 혼합하기 전에 식물 인지질과 물을 포함하는 것이다. 이러한 실시태양에서 물은 인지질 조성물을 형성하기 위해서 동시에 인지질과 함께 혼합되어야 하며 때로는 인지질과 효소 및/또는 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀과 혼합 후에 첨가될 수도 있다.
본 발명의 인지질 조성물은 의심할 바 없이 예를 들면 크루드 식물 오일, 즉 통상 0.2% 이하의 수분 함량과 3% 이하의 인지질 함량을 지닌 크루드 오일은 아니고 정제된 식용유 통상 없거나 매우 낮은 즉 100ppm 보다 낮은 인지질을 포함하는 정제 식용유는 아니다.
적합한 인지질 조성물이 약 30 내지 70℃, 바람직하게는 40 내지 60℃, 바람직하게는 40 내지 50℃, 더욱 바람직하게는 40 내지 45℃에서 지질 아실트랜스퍼라제와 함께 혼합되어 인큐베이트 시킨다.
또다른 실시태양에서 본 발명의 방법 및/또는 용도는 바람직하게는 약 60℃ 이하, 더욱 바람직하게는 약 65℃ 이하, 더욱 바람직하게는 약 70℃ 이하에서 수행한다.
인지질 조성물 및/또는 반응 조성물의 적합한 온도는 효소 혼합시 가장 바람직한 온도이다.
인지질 조성물 및/또는 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀 및/또는 물은 가열되거나 원하는 온도로 냉각될 수 있고 이는 효소 첨가 전 또는 효소 첨가 기간 중에 행해진다. 따라서 하나의 실시태양에서 본 발명에 따른 방법은 인지질 조성물 및/또는 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀 및/또는 물의 냉각 또는 가열을 포함하는 추가적 공정을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 공정에서 인지질 조성물 또는 반응 조성물 내의 바람직한 수분 함량은 적어도 약 2% (w/w) 이상이다.
하나의 실시태양에서 반응 조성물 또는 인지질 조성물의 수분 함량은 바람직하게는 적어도 약 5% (w/w), 적어도 약 10% (w/w), 적어도 약 20% (w/w)이다.
본 발명에 따른 또다른 실시태양에서 인지질 조성물 내의 수분 함량은 약 2% (w/w) 내지 약 60% (w/w), 바람직하게는 약 5% (w/w) 내지 약 50% (w/w)이다.
예를 들면 혼합되는 시간과 같은 적합한 반응 시간은 바람직하게는 교반과 함께 적어도 하나의 식물 인지질로부터의 아실 그룹이 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀에 이전되어 하나 또는 그 이상의 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 제공하기에 충분한 시간이다.
반응에 적합한 시간은 적어도 5% 트랜스퍼라제 활성, 바람직하게는 적어도 10% 트랜스퍼라제 활성, 더욱 바람직하게는 적어도 15%, 20%, 25%, 26%, 28%, 30%, 40%, 50%, 60%, 75%, 85% 또는 95%의 트랜스퍼라제 활성을 발휘하기에 효과적인 시간이다. 이때 % 트랜스퍼라제 활성은 예를 들면 총 효소 활성 중의 트랜스퍼라제 활성의 %를 나타내는 것으로 다음 프로토콜에 의해 결정될 수 있다.
본 발명에서 파이토스테롤의 % 전환은 적어도 1%, 바람직하게는 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%이다.
반응 시간은 적어도 50%의 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀이 반응 조성물 또는 혼합물 내에서 에스테르화시킬 수 있는 충분한 시간이다. 이때 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 더욱 바람직하게는 적어도 90%의 에스테르화가 가능한 시간이다. 특정한 경우 반응 시간은 반응 조성물 또는 혼합물 내에서 적어도 95% 또는 적어도 98%의 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀 에스테르화 시킬 수 있는 시간이다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 파이토스테롤의 % 전환율은 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%이다.
예를 들면 반응 조성물 또는 혼합물의 적합한 반응 시간은 바람직하게는 교반시키면서 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 분리 정제하기 전까지 시간이며 약 10분 내지 약 6일, 적합하게는 약 12시간 내지 약 5일 정도이다.
하나의 실시태양에서 반응 시간은 약 10분 내지 약 180분 사이이고 바람직하게는 약 15분 내지 180분, 바람직하게는 약 15분 내지 60분, 바람직하게는 약 15분 내지 35분, 바람직하게는 약 30분 내지 180분, 바람직하게는 약 30분 내지 60분이다.
하나의 실시태양에서 반응 시간은 약 24시간 내지 5일 사이일 수 있다. 하나의 실시태양에서 본 방법은 약 pH 4.5 이상, 약 pH 5 이상 또는 약 pH 6 이상에서 수행될 수 있다.
바람직하게는 본 방법이 약 pH 4.6 내지 약 pH 10.0에서 수행되는 것이며 바람직하게는 약 pH 5.0 내지 약 pH 10.0, 바람직하게는 약 pH 6.0 내지 약 pH 10.0, 바람직하게는 약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0, 바람직하게는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.5, 바람직하게는 약 pH 5.5 내지 약 pH 6.0 사이에서 수행되는 것이다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 방법은 약 pH 5.3 내지 약 pH 8.3에서 수행되는 것이다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 방법은 약 pH 6.0 내지 약 pH 6.5, 바람직하게는 약 pH 6.3에서 수행되는 것이다.
더욱 적합한 본 발명의 방법 및 또는 용도의 pH는 중성(약 pH 5.0 내지 약 pH 7.0)에서 수행하는 것이다.
하나의 실시태양에서 '분리'라는 용어는 반응 혼합물 및/또는 반응 조성물 내에서 적어도 하나의 다른 성분을 지닌 물질로부터 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 분리하는 것이다.
하나의 실시태양에서 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 반응 혼합물 또는 반응 조성물 내의 하나 또는 그 이상의 다른 성분으로부터 분리될 수 있다. 이 측면에서 '분리된' 또는 '분리'라는 용어는 반응 혼합물 또는 반응 조성물 내에 적어도 하나의 다른 성분으로부터 완전히 유리된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 의미하거나 반응 조성물 내에 적어도 하나의 다른 성분으로부터 완전히 유리시킴을 의미한다.
한 측면에서 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 분리되거나 분리되어진 형태이다.
또다른 측면에서 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 정제되거나 정제되어진 형태이다.
한 측면에서 '정제'라는 용어는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르가 처리되어 상대적으로 순수한 상태를 의미하며 예를 들면 적어도 약 51% 순도 또는 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90% 또는 적어도 약 95% 또는 적어도 약 98% 순도를 지님을 의미한다.
혼합물의 다른 성분으로부터 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 분리 또는 정제하는 과정은 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 분리 또는 정제 방법은 예를 들면 추출, pH 조절, 분별화, 세척, 원심분리 및/또는 증류와 같은 하나 또는 그 이상의 단위 조작에 의해 수행될 수 있다.
하나의 실시태양에서 인지질 조성물, 효소 및 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀은 동시에 스트림으로 펌프되거나 실질적으로 동시에 믹서를 통해 보관 탱크로 이송될 수 있다.
적합한 효소는 공정의 기간 또는 종료 시 불활성화 된 것이다.
효소는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르의 분리 또는 정제 후 또는 전에 불활성화 될 수 있다.
적합한 효소는 75 내지 85℃에서 10분간 가열하거나 92℃ 이상의 온도로 가열함으로써 열 불활성화 될 수 있다.
적합한 효소는 인지질 조성물에 0.01-100 TIPU-K/g 용량으로 첨가될 수 있으며 적합한 효소의 용량은 약 0.05 내지 10 TIPU-K/g, 바람직하게는 약 0.05 내지 1.5 TIPU-K/g, 더욱 바람직하게는 약 0.2 내지 1.0 TIPU-K/g 인지질 조성이다.
지질 아실트랜스퍼라제의 적합한 용량은 0.01 TIPU-K units/g 내지 5 TIPU-K units/g 인지질 조성물이다. 하나의 실시태양에서 지질 아실트랜스퍼라제는 약 0.1 내지 1 TIPU-K units/g 인지질 조성물 범위일 수 있고 더욱 바람직하게는 지질 아실트랜스퍼라제의 용량이 약 0.1 내지 0.5 TIPU-K units/g 인지질 조성물 범위이다. 더욱 바람직한 지질 아실트랜스퍼라제의 용량은 약 0.1 내지 0.3 TIPU-K units/g 인지질 조성물이다.
포스포리파아제 활성, TIPU-K
기질 : 1.75% L- 식물 포스파티딜콜린 95% (441601, Avanti Polar Lipids), 6.3 % Triton X-100 (#T9284, Sigma) 및 50 mm Hepes pH 7.0에 용해된 5 mM CaCl2.
에세이 절차 : 샘플, 칼리브레이션 및 대조군은 10 mM Hepes pH 7.0, 0.1% Triton X-100 (#T9284, Sigma)에 희석되었다. 에세이는 Konelab Autoanalyzer (Thermo, Finland)에 의해 수행된다. 에세이는 30℃에서 수행되었으며 34 μL의 기질은 180초간 일정하게 온도유지되었다. 그 후 4 μL 샘플을 첨가하였다. 효소 활성화는 600초간 지속되었으며 효소 반응 동안 유리된 지방산의 함량은 NEFA C kit (999-75406, WAKO, Germany)에 의해 측정되었다. 113 μL NEFA A가 첨가되고 혼합물은 300초간 인큐베이션 시킨다. 그 후 56 μL NEFA B를 첨가하고 혼합물을?? 300초간 인큐베이션 시킨다. OD 520 nm에서 측정되었다. 효소 활성(μmol FFA/minmL)을 표준 효소 제제에 기반하여 계산하였다. 효소 활성 TIPU-K는 에세이 조건 하에서 분당 생성되는 유리 지방산의 마이크로몰 수로 계산한다.
참고를 위해 본 발명의 또다른 측면에서 더 적합한 방법이 논의될 것이며 본 섹션에서의 가르침은 각각의 섹션에 개시된 사항을 한정하는 것은 아니다.
장점
본 발명은 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르를 생성하기 위한 지속적이고 환경 적합한 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 장점은 종래의 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르의 제조방법에 비해 더 낮은 온도에서 수행 가능한 것이다.
본 발명의 또다른 장점은 반응이 예를 들면 물 베이스 시스템과 같은 수용액 시스템에서 진행되는 것이다. 따라서 본 발명의 공정 중에 유기 용매를 사용할 필요는 없다. 이는 종래 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르를 제조하기 위한 방법에 비해 월등히 우수한 것이다. 특히 수용액 시스템의 사용은 예를 들면 유기 용매의 제거와 같은 과도한 정제 및 분리 공정을 감소시킬 수 있다. 따라서 본 발명 혼합물 자체는 직접적으로 공업적 조성물로 사용하기는 적합지 않은 성분을 전혀 지니지 않는 것이다. 따라서 식품 또는 사료 조성물 또는 개인 보호 용품 예를 들면 화장품 조성물에 유용한 것이다. 따라서 본 발명의 방법은 스테롤 에스테르 및 스타놀 에스테르가 사용 전에 간단히 농축될 수 있는 장점을 지닌 것이다.
본 발명의 또다른 이점은 다른 식물 가공의 부산물을 사용할 수 있는 방법이다. 따라서 저가치 조성물로부터 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르와 같은 고부가가치 제품을 폐기물을 절감하여 형성할 수 있다. 예를 들면 본 발명에 사용되는 인지질 조성물은 검 조성물 또는 소프스톡일 수 있으며 이들은 모두 식용유 정제의 부산물로 발생하는 것이다. 또한 본 발명에 사용되는 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀은 대두유 탈취 증류물(SODD)일 수 있다.
본 발명의 또다른 이점은 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르의 효소 합성 기간 중에 유기 용매를 사용하지 않고 고수율로 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르의 생성을 가능케 하는 것이다.
본 발명의 또다른 이점은 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르를 제조하는 통상의 공정에 사용되는 온도보다 낮은 온도에서 수행할 수 있는 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르의 생성 방법을 제공하는 것이다. 따라서 이와 같은 이점은 종래의 스테롤, 스타놀, 스테롤 에스테르 또는 스타놀 에스테르 생성에 비해 더욱 낮은 산화 스트레스를 노출시키는 환경 하에서 스테롤, 스테롤 에스테르 또는 스타놀, 스타놀 에스테르를 생성할 수 있는 것이다. 따라서 또다른 장점은 본 발명에 따라 제조되는 스테롤 에스테르 및/또는 스타놀 에스테르가 생성되는 부산물을 최소화하여 생성할 수 있는 것으로 이는 화학적 촉매 방법에 비해 스테롤, 스테롤 에스테르 또는 스타놀, 스타놀 에스테르를 열 및 산화 분해로부터 보호할 수 있기 때문에다. 이 결과 단순한 정제와 분리 공정이 가능하다.
지질 아실트랜스퍼라제
본 발명에는 어느 지질 아실트랜스퍼라제도 사용할 수 있다.
예를 들면 본 발명에 사용될 수 있는 지질 아실트랜스퍼라제는 WO2004/064537, WO2004/064987, WO2005/066347, WO2006/008508 또는 WO2008/090395에 개시된 방법에 따라 수득된 것이다. 상기 문헌은 본 발명에 참조문헌으로 통합되어있다.
본 발명에 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제는 천연 지질 아실트랜스퍼라제 또는 변이 지질 아실트랜스퍼라제일 수 있다.
'지질 아실트랜스퍼라제'라는 용어는 본 명세서 내에서 다음과 같은 지질 아실트랜스퍼라제 활성을 지닌 효소를 의미하며 일반적으로는 E.C. 2.3.1.x로 표시되는 것이며 예를 들면 E.C. 2.3.1.43이다. 또한 효소는 지질의 아실 그룹을 아실 수용체 분자로서 스테롤 및 또는 스타놀에 바람직하게는 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀에 전이시킬 수 있는 것이다.
적합한 지질 아실트랜스퍼라제는 효소 분류 E.C. 2.3.1.43으로 분류되는 것이다.
본 발명의 방법 또는 용도에 사용되는 바람직한 지질 아실트랜스퍼라제는 상기한 바와 같은 인지질로부터 아실 그룹을 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀에 이전시킬 수 있는 효소이다.
본 발명에 따른 '아실 수용체'는 바람직하게는 물이 아니다.
바람직하게는 아실 수용체의 일부는 인지질 조성물 내에 자연적으로 발견되는 것이다. 선택적으로 또는 바람직하게는 예를 들면 아실 수용체가 인지질 조성물로부터 외인성인 것으로 인지질 조성물에 첨가될 수 있는 것이다. 만약 아실 수용체의 양이 아실트랜스퍼라제 반응의 속도를 제한하지 않는다면 이는 특히 중요하다.
본 발명에 있어서 지질 아실트랜스퍼라제가 반응하는 지질 기질은 예를 들면 레시틴, 포스파티딜콜린 및/또는 포스파티딜에탄올아민과 같은 인지질에서 선택된 1종 이상의 지질을 들 수 있다.
본 명세서 내에서 지질 기질은 '지질 아실 도너'로 언급된다. 레시틴이라는 용어는 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜세린 및 포스파티딜글리세롤을 포괄하는 용어로 사용된다.
본 발명에 사용되는 바람직한 지질 아실트랜스퍼라제는 수용액 환경에서 인지질에 높은 인지질 트랜스퍼라제 활성을 지닌 것으로 확인된다. 본 발명에 사용되는 바람직한 지질 아실트랜스퍼라제는 파이토스테롤 및/또는 파이토스테놀 트랜스퍼라제 활성을 지닌 것이다.
본 발명의 방법 또는 용도에 사용되는 적합한 효소는 하기 Transferase Assay (스테롤:인지질) (TrU) 사용을 통해 결정된다.
트랜스퍼라제 활성의 결정
Transferase Assay (스테롤:인지질) (TrU)
기질 : 50 mg 베타-시토스테롤 (Sigma S5753) 및 클로로포름에 용해시킨 450 mg Soya phosphatidylcholine(PC), Avanti #441601, 클로로포름은 진공 하에서 40℃에서 증발한다.
300 mg PC: 베타-시토스테롤 9:1을 40℃에서 10 ml 50mM HEPES 완충액 pH 7에 분산시킨다.
효소화:
250 ㎕ 기질을 40℃에서 리드와 함께 글래스에 첨가한다. 25 ㎕ 효소 용액을 첨가하고 40℃에서 10분간 교반하면서 인큐베이션 시킨다. 효소를 첨가하고 에세이 내의 2~5 % 베타-시토스테롤을 에스테르화 시킨다.
또한 효소 용액 대신에 25 ㎕ 물을 대조군으로 분석하였다.
10분 후에 5ml의 헥산:이소프로판올 3:2 용액을 첨가하였다.
베타-시토스테롤 에스테르의 함량은 Cholesteryl 스테아레이트 (Sigma C3549) 표준품을 측정 기준으로 사용하여 HPTLC로 분석하였다.
트랜스퍼라제 활성은 에세이 조건 하에서 분당 베타-시토스테롤 에스테르 형성량에 의해 계산된다.
1 트랜스퍼라제 유니트(TrU)는 주어진 트랜스퍼라제 에세이에 상응하여 pH 7, 40℃에서 분당 생성되는 베타-시토스테롤 에스테르의 마이크로 몰 함량으로 정의된다.
바람직하게는 방법 및 용도에 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제는 적어도 25 TrU/mg 효소 단백질의 mg 효소 당 특정 트랜스퍼라제 유니트(TrU)를 지닌다.
본 발명에 사용되는 적합한 지질 아실트랜스퍼라제의 용량은 g 인지질 조성물 당 0.05 내지 50 TrU, 더 바람직하게는 0.5 내지 5 TrU 함량이다.
본 발명의 방법 및 용도에 사용되기 위한 더욱 바람직한 효소는 하기 프로토콜에 의해 정의되는 지질 아실-트랜스퍼라제 활성을 지닌 것이다.
% 아실트랜스퍼라제 활성 측정을 위한 프로토콜 :
본 발명에 따른 특정 함량의 스테롤/스타놀과 지질 아실트랜스퍼라제를 지닌 인지질 조성물을 첨가하고 CHCl3:CH3OH이 2:1로 혼합된 용매를 사용하여 다음 효소 반응을 행한다. 지질 물질이 포함된 유기 상을 분리하고 다음에 기재된 절차에 따라 GLC 및 HPLC에 의해 분석하였다. GLC 및 HPLC 분석으로부터 유리지방산의 함량과 하나 또는 그 이상의 스테롤/스타놀 에스테르 함량이 측정되었다. 대조군 인지질 조성물은 본 발명에 따른 효소를 첨가하지 않았으며 다음 방법에 의해 분석한다.
계산 : 스테롤/스타놀 에스테르 및 유리지방산의 증가를 GLC 및 HPLC 분석 결과를 통해 계산할 수 있다.
Δ% 지방산＝% 지방산(효소)－% 지방산(대조군)
Mv 지방산 ＝지방산의 평균 분자량
A＝Δ% 스테롤 에스테르/Mv 스테롤 에스테르(이때 Δ% 스테롤 에스테르 = % 스테롤/스타놀 에스테르(효소)－% 스테롤/스타놀 에스테르(대조군) 및 Mv 스테롤 에스테르 ＝ 스테롤/스타놀 에스테르의 평균 분자량)
트랜스퍼라제 활성은 전체 효소 활성의 퍼센트로 계산되었다.
% 트랜스퍼라제 활성＝A × 100 / A＋Δ% 지방산 (Mv 지방산)
에세이를 위해 사용된 효소 용량은 바람직하게는 0.2 TIPU-K/g 인지질 조성물, 바람직하게는 0.08 TIPU-K/g 인지질 조성물, 더욱 바람직하게는 0.01 TIPU-K/g 인지질 조성물이다. 인지질 조성물 내의 인지질 수준 및/또는 스테롤의 % 전환율은 바람직하게는 0.5 시간 뒤에, 더욱 바람직하게는 1 시간, 2 시간, 4시간, 20시간, 더욱 바람직하게는 20시간 이후에 측정한다.
본 발명에 사용된 지질 아실트랜스퍼라제는 트랜스퍼라제 활성이 적어도 15%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%를 지닌 것으로 본 명세서 내의 % 아실트랜스퍼라제 활성 측정을 위한 프로토콜에 의해 측정된 것이다.
또한 인지질 조성물 내의 활성은 다음 방법의 프로토콜 '지질 아실트랜스퍼라제를 확인하기 위한 프로토콜'의 방법에 의해 지질 아실트랜스퍼라제 효소를 확인하는 것이 바람직하게 본 발명의 방법에서 채택될 수 있다.
지질 아실트랜스퍼라제 확인을 위한 프로토콜
본 발명의 지질 아실트랜스퍼라제는 다음과 같은 것이다.
ⅰ) 대두유 내에 존재하는 인지질을 제거한 후 식물 스테롤(1%), 물(1%) 및 포스파티딜콜린(2%)을 보충시킨 것, 식물 스테롤, 물, 포스파티딜콜린은 대두유를 용해시켜 교반하면서 95℃로 가열함으로써 얻어지고 오일을 40℃로 냉각한 후 효소를 첨가시킨다. 시료를 40℃에서 교반하면서 유지시킨 후 0.5, 1, 2, 4 및 20시간 후에 꺼내어 TLC로 분석한다.
ⅱ) 첨가된 스테롤의 스테롤 에스테르로의 전환(% 전환) : 상기 ⅰ)에서 지시된 방법을 사용한다.
에세이를 위해 사용하는 효소의 용량은 0.2 TIPU-K/g 오일, 바람직하게는 0.08 TIPU-K/g 오일, 더욱 바람직하게는 0.01 TIPU-K/g 오일이다. 오일 내에 존재하는 인지질의 함량 및/또는 스테롤의 전환율은 바람직하게는 0.5 시간 후에, 1시간 후에, 2시간, 4시간, 20시간, 20시간 이후에 측정한다.
하나의 측면에서 본 발명의 방법 또는 용도에 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제는 GDSX 모티프 및/또는 GANDY 모티프를 포함한다.
바람직하게는 본 발명에 사용되는 아실트랜스퍼라제 활성을 지니는 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 GDSX 모티프의 아미노산 서열을 지닌다. 이때 X는 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S의 아미노산 잔기 중에 하나 이상이다.
지질 아실트랜스퍼라제를 코드화하는 핵산 서열 또는 본 발명에 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제는 다음과 같은 미생물로부터 수득 가능하거나 수득할 수 있는 것이다. Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas 및 Candida에서 수득할 수 있는 것이다. 더욱 바람직하게는 Aeromonas 속의 미생물로부터 수득 가능한 것이다.
본 발명의 한 측면에서 지질 아실트랜스퍼라제는 다음과 같은 핵산의 발현을 통해 수득할 수 있는 지질 아실트랜스퍼라제 활성을 지닌 폴리펩타이드일 수 있다.
(a) 서열번호: 49의 핵산 서열을 지닌 핵산 서열 또는 상기 핵산 서열과 75% 이상의 상동성(바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 상동성을 지닌)을 지닌 핵산 서열;
(b) 서열번호: 16 또는 서열번호: 68의 폴리펩타이드 서열을 코드화하는 핵산 또는 상기 폴리펩타이드 서열과 70% 이상의 상동성(바람직하게는 80% 이상의 상동성, 더욱 바람직하게는 90% 이상의 상동성)을 지닌 폴리펩타이드 서열을 코드화한 핵산;
(c) 서열번호: 49의 핵산 서열을 포함하는 핵산 프로브에 중립적 또는 엄격한 조건 하에서 혼성화 될 수 있는 핵산; 또는
(d) 상기 (a), (b) 또는 (c)의 핵산 서열의 단편으로 구성된 핵산;
이다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 내에서 서열번호: 49의 뉴클레오타이드 서열을 지닌 핵산 서열의 발현에 의해 수득될 수 있는 폴리펩타이드이다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 지질 아실트랜스퍼라제는 서열번호: 68, 서열번호: 16, 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 15, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 19, 서열번호: 34, 서열번호: 35로 나타나는 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드 또는 상기 서열과 적어도 75% 이상의 상동성을 지닌 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드에서 선택된 것이다.
또 한 측면에서 본 발명에 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제는 서열번호: 68 또는 서열번호: 16으로 나타난 아미노산 서열을 지니는 폴리펩타이드 또는 상기 아미노산 서열의 적어도 75% 이상의 상동성, 바람직하게는 적어도 80% 이상의 상동성,바람직하게는 적어도 85% 이상의 상동성, 바람직하게는 적어도 95% 이상의 상동성, 바람직하게는 적어도 98% 이상의 상동성을 지닌 아미노산 서열을 지닌 폴리펩타이드인 지질 아실트랜스퍼라제 활성을 지니는 폴리펩타이드이다.
또 한 측면에서 본 발명에 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제는 서열번호: 49로 나타난 뉴클레오타이드 서열에 의해 코드화 되거나 상기 뉴클레오타이드 서열의 적어도 75% 이상의 상동성, 바람직하게는 적어도 80% 이상의 상동성,바람직하게는 적어도 85% 이상의 상동성, 바람직하게는 적어도 95% 이상의 상동성, 바람직하게는 적어도 98% 이상의 상동성을 지닌 뉴클레오타이드 서열에 의해 코드화 되는 지질 아실트랜스퍼라제 활성을 지니는 폴리펩타이드이다.
한편 본 발명에 사용되는 방법 또는 용도를 위해 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제를 코드화하는 핵산 서열은 서열번호: 68로 나타난 아미노산 서열을 포함하는 지질 아실트랜스퍼라제를 코드화하는 서열이거나 상기 아미노산 서열의 75% 이상 상동성을 지니는 서열을 코드화하는 서열이다. 또한 지질 아실트랜스퍼라제를 코드화하는 핵산 서열은 서열번호: 68로 나타난 아미노산 서열을 지닌 지질 아실트랜스퍼라제를 코드화하는 서열이다.
본 발명의 방법 또는 용도에 사용되는 바람직한 지질 아실트랜스퍼라제는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis)를 서열번호: 49의 뉴클레오타이드 서열 또는 적어도 75% 이상(바람직하게는 적어도 80% 이상, 바람직하게는 적어도 85% 이상, 바람직하게는 적어도95% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상)의 상동성을 지니는 뉴클레오타이드 서열로 형질전환시킨 바실러스 리체니포르미스의 발현을 통해 수득되는 것이다. 이때 바실러스 리체니포르미스는 배양되고 생성된 지질 아실트랜스퍼라제는 분리된다.
본 발명의 방법 또는 용도에 따른 지질 아실트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 35로 나타난 Aeromonas salmonicida 지질 아실트랜스퍼라제의 아미노산 서열 중에 N-80에 상응하는 위치에 아스파트산 잔기를 포함하는 아실트랜스퍼라제 서열을 코드화 한 뉴클레오타이드 서열에 관한 것이다.
본 발명의 방법 또는 용도에 따른 지질 아실트랜스퍼라제의 아미노산 서열은 서열번호: 35로 나타난 Aeromonas salmonicida 지질 아실트랜스퍼라제의 아미노산 서열 중에 N-80에 상응하는 위치에 아스파트산 잔기를 포함하는 아실트랜스퍼라제에 관한 것이다.
더욱 상세하게는 본 발명의 방법에 적합한 다른 아실트랜스퍼라제는 pFam00657 컨센서스 서열(서열번호: 2) 배열 또는 예를 들면 서열번호: 16과 같은 GDSX 아실트랜스퍼라제 배열에 의해 GDSX, GANDY 및 HPT 블록의 존재를 확인할 수 있는 것이다. 본 발명에 적합성을 판단하기 위해 예를 들면 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상의 전체 효소 활성 중에 상기 아실트랜스퍼라제 활성을 지닌 것이다. 이와 같은 아실트랜스퍼라제는 본 명세서에 기재된 % 아실트랜스퍼라제 활성을 측정하기 위한 프로토콜을 사용하여 그 활성을 측정할 수 있다.
본 발명에 사용된 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 다음과 같은 특성을 지니는 것이다.
상기 전이된 에스테르 이전 활성을 지닌 아실트랜스퍼라제 효소로서 지질 아실 도너의 오리지널 에스테르 본드의 아실 부분은 새로운 에스테르를 형성하기 위해 아실 수용체에 이전되는 것을 특징으로 하는 효소; 및
GDSX 아미노산 서열 모티프를 지니는 효소로서 X는 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S의 아미노산 잔기 중 하나 또는 그 이상인 효소이다.
바람직하게는 GDSX 모티프의 X가 L 또는 Y인 경우이다. 더욱 바람직하게는 GDSX 모티프의 X가 L인 경우이다. 따라서 본 발명의 바람직한 효소는 GDSL의 아미노산 서열 모티프를 지닌 효소이다.
GDSX 모티프는 4개의 보존된 아미노산을 포함하는 것이다. 바람직하게는 모티프 내의 세린이 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 촉매 세린으로 작용한다. 바람직하게는 GDSX 모티프의 세린은 Brumlik & Buckley (Journal of Bacteriology Apr. 1996, Vol. 178, No. 7, p 2060-2064)에 개시된 Aeromonas hydrophila 지질 아실트랜스퍼라제 내에서 세린-16과 상응하는 위치에 있는 것이다.
본 발명의 GDSX 모티프를 지닌 단백질인지 여부를 결정하기 위해 서열은 바람직하게는 본 발명에 참고문헌으로 통합되어있는 WO2004/064537 또는 WO2004/064987에 개시된 절차에 따른 pfam 데이터베이스의 hidden markov 모델 프로파일(HMM 프로파일)을 통해 비교하는 것이다.
바람직하게는 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 Pfam00657 콘센서스 서열(WO2004/064537 또는 WO2004/064987의 상세한 설명을 참조바람)을 사용하여 배열된 효소이다.
바람직하게는 pfam00657 도메인 패밀리의 hidden markov 모델 프로파일(HMM 프로파일)과의 긍정적 매치를 통해 GDSL 또는 GDSX 도메인의 존재를 표시할 수 있다.
본 발명에 사용된 지질 아실트랜스퍼라제가 Pfam00657 콘센서스 서열과 매치되는 배열을 지녔을 때 GDSX 블록, GANDY 블록, HPT 블록에서 적어도 하나, 바람직하게는 적어도 하나 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 둘 이상의 블록을 지님을 확인할 수 있다. 적합한 지질 아실트랜스퍼라제는 GDSX 블록과 GANDY 블록을 포함하는 것이다. 한편 효소가 GDSX 블록과 HPT 블록을 포함할 숫 있다. 바람직하게는 효소는 적어도 하나의 GDSX 블록을 포함하는 것이다. 상세한 사항은 WO2004/064537 또는 WO2004/064987을 참조하기 바란다.
GANDY 모티프의 잔기는 바람직하게는 GANDY, GGNDA, GGNDL에서 선택될 수 있으며 더욱 바람직하게는 GANDY 모티프 이다.
pfam00657 GDSX 도메인은 다른 효소로부터 이 도메인의 존재를 구별하기 위한 단백질을 특정 확인자로 포함한다.
pfam00657 콘센서스 서열은 도 3에 서열번호: 2로 나타나 있다. 이는 데이터베이스 버전 6 pfam 패밀리 00657의 확인을 통해 확인할 수 있으며 이를 본 명세서에서는 pfam00657.6이라고 언급한다.
콘센서스 서열은 pfam 데이터베이스의 최근 버전을 통해 업데이트 할 수 있다(WO2004/064537 또는 WO2004/064987 참고 바람).
하나의 실시태양에서, 본 발명의 방법과 용도에 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 다음과 같은 기준을 사용하여 특징지어지는 지질 아실트랜스퍼라제이다.
(ⅰ) 에스테르 이전 활성으로 전이되는 아실트랜스퍼라제 활성을 지닌 효소로서 지질 아실 도너의 오리지널 에스테르 본드의 아실 부분이 아실 수용체로 이전되어 새로운 에스테르를 형성하는 효소이다.
(ⅱ) GDSX 아미노산 서열 모티프를 지니는 효소로서 X는 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S에서 선택된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기이다.
(ⅲ) 도 2 및 도 4에 서열번호: 1 또는 서열번호: 3으로 나타난 Aeromonas hydrophila 지질 아실트랜스퍼라제 효소 내의 His-309에 상응하는 위치에 히스티딘 잔기를 지니거나 His-309를 포함하는 효소이다.
바람직하게는 GDSX 모티프의 X 아미노산 잔기는 L이다.
서열번호: 3 또는 서열번호: 1에 있어서 첫 번째 18개의 아미노산 잔기는 시그널 시퀀스를 형성한다. His-309는 시그널 시퀀스를 포함하는 단백질의 전체 길이 서열 내의 위치이며 시그널 시퀀스를 제외한 단백질 합성 부위만의 서열로서는 His-291로 표시되는 위치이다.
하나의 실시태양에서, 본 발명의 방법 및 용도에 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 도 4에 나타난 서열번호: 3 또는 도 2에 나타난 서열번호: 1에서 Aeromonas hydrophila 지질 아실트랜스퍼라제 효소 서열 중 Ser-34, Asp-306 및 His-309에 상응하는 위치에서 Ser-34, Asp-306 및 His-309를 포함하거나 각각의 세린 잔기, 아스파트산 잔기 및 히스티딘 잔기를 3개의 촉매 활성 부위로 포함하는 효소이다. 상기한 바와 같이, 서열번호: 3 또는 서열번호: 1의 서열 중 첫 번째 18개의 아미노산 잔기는 시그널 시퀀스를 형성한다. Ser-34, Asp-306 및 His-309는 전체 길이의 서열 중에 위치이며 시그널 시퀀스를 제외한 단백질 합성 부위의 서열 위치로는 Ser-16, Asp-288 및 His-291에 상응한다. pfam00657 컨센서스 서열 내 도 3에 나타난 서열번호: 2의 서열 중에서는 활성 잔기 부위는 Ser-7, Asp-345 및 His-348에 상응한다.
본 발명의 하나의 실시태양에서, 본 발명에 사용되는 방법 또는 용도에 따른 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 다음과 같은 기준에 의해 특징되어지는 효소이다.
에스테르 이전 활성으로 전이된 아실 트랜스퍼라제 활성을 지니는 효소로서 이때 첫 번째 지질 아실 도너의 오리지널 에스테르 본드의 아실 부분은 아실 수용체로 이전되어 새로운 에스테르를 형성하는 효소이고; 효소는 서열번호: 3 또는 서열번호: 1로 나타난 Aeromonas hydrophila 지질 아실트랜스퍼라제 효소 내에서 적어도 Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-134 및 His-309를 지니거나 Gly-32, Asp-33, Ser-34, Asp-306 및 His-309의 각각의 상응하는 위치에 글라이신, 아스파트산, 세린, 아스파트산 및 히스티딘 잔기를 포함하는 효소이다.
본 발명에 사용된 방법 및 용도에 적합한 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 하기 뉴클레오타이드 서열 중 하나에 의해 코드화되는 것이다.
(a) 서열번호: 36으로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (b) 서열번호: 38로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (c) 서열번호: 39로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (d) 서열번호: 42로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (e) 서열번호: 44로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (f) 서열번호: 46으로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (g) 서열번호: 48로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (h) 서열번호: 49로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (i) 서열번호: 50으로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (j) 서열번호: 51로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (k) 서열번호: 52로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (l) 서열번호: 53으로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (m) 서열번호: 54로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (n) 서열번호: 55로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (o) 서열번호: 56으로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (p) 서열번호: 57로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (q) 서열번호: 58로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (r) 서열번호: 59로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (s) 서열번호: 60으로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (t) 서열번호: 61로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (u) 서열번호: 62로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (v) 서열번호: 63으로 나타난 뉴클레오타이드 서열; (w) 또는 서열번호: 36, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 42, 서열번호:44, 서열번호: 46, 서열번호: 48, 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51, 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62 또는 서열번호: 63의 서열 중 하나와 적어도 70% 이상, 바람직하게는 75% 이상의 상동성을 지닌 뉴클레오 타이드 서열이다.
더욱 바람직하게는 서열번호: 36, 서열번호: 38, 서열번호: 39, 서열번호: 42, 서열번호:44, 서열번호: 46, 서열번호: 48, 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51, 서열번호: 52, 서열번호: 53, 서열번호: 54, 서열번호: 55, 서열번호: 56, 서열번호: 57, 서열번호: 58, 서열번호: 59, 서열번호: 60, 서열번호: 61, 서열번호: 62 또는 서열번호: 63의 서열 중 어느 하나와 적어도 80% 이상, 바람직하게는 적어도 85% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상, 더욱 바람직하게는 적어도 95% 이상의 상동성을 지닌 뉴클레오타이드 서열이다.
본 발명에 사용되는 방법 및 용도에 적합한 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 다음 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상을 포함하는 지질 아실트랜스퍼라제이다.
(ⅰ) 서열번호: 68로 나타난 아미노산 서열; (ⅱ) 서열번호: 3으로 나타난 아미노산 서열; (ⅲ) 서열번호: 4로 나타난 아미노산 서열; (ⅳ) 서열번호: 5로 나타난 아미노산 서열; (ⅴ) 서열번호: 6으로 나타난 아미노산 서열; (ⅵ) 서열번호: 7로 나타난 아미노산 서열; (ⅶ) 서열번호: 8로 나타난 아미노산 서열; (ⅷ) 서열번호: 9로 나타난 아미노산 서열; (ⅸ) 서열번호: 10으로 나타난 아미노산 서열; (ⅹ) 서열번호: 11로 나타난 아미노산 서열; (xi) 서열번호: 12로 나타난 아미노산 서열; (xii) 서열번호: 13으로 나타난 아미노산 서열; (xiii) 서열번호: 14로 나타난 아미노산 서열; (xiv) 서열번호: 1로 나타난 아미노산 서열; (xv) 서열번호: 15로 나타난 아미노산 서열; (xvi) 서열번호: 16으로 나타난 아미노산 서열; (xvii) 서열번호: 17로 나타난 아미노산 서열; (xviii) 서열번호: 18로 나타난 아미노산 서열; (xix) 서열번호: 34로 나타난 아미노산 서열; (xx) 서열번호: 35로 나타난 아미노산 서열; 또는 서열번호: 68, 서열번호: 1, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14 또는 서열번호: 15, 서열번호: 16, 서열번호: 17, 서열번호: 18, 서열번호: 34 또는 서열번호: 35로 나타난 아미노산 서열 중 하나와 적어도 75% 이상, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 이상의 상동성을 지닌 아미노산 서열이다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 방법 및 용도에 따른 지질 아실트랜스퍼라제는 레시틴:콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(LCAT) 또는 예를 들면 분자적 진화에 의해 변이된 변이체와 같은 LCAT 변이체일 수 있다.
적합한 LCAT는 공지의 기술로부터 수득할 수 있는 것이며 포유류, 래트, 마우스, 치킨, Drosophila melanogaster, 아라비돕시스, 벼와 같은 식물, 선형동물, 곰팡이 및 효모로부터 수득될 수 있다.
본 발명에 따른 방법 및 용도에 적합한 지질 아실트랜스퍼라제 효소는 Aeromonas 속으로부터 분리된 아실트랜스퍼라제이며 더욱 바람직하게는 Aeromonas hydrophila 또는 A. salmonicida에서 분리된 효소이고 가장 바람직하게는 A. salmonicida에서 분리된 효소이다.
상기 아실트랜스퍼라제의 시그널 펩타이드는 트랜스퍼라제 발현 기간 동안 절단되는 것이 당업자에게 널리 인식되어있다. 시그널 펩타이드는 서열번호: 1, 3, 4, 15 및 16에 나타난 서열 중 1 내지 18 사이의 아미노산 잔기이다. 따라서 가장 바람직한 영역은 서열번호: 1 및 서열번호: 3 (A. hydrophilia)의 19 내지 335 아미노산 잔기이다. 또한 서열번호: 4, 서열번호: 15 및 서열번호: 16 (A. salmonicida)의 19 내지 336 아미노산 잔기이다. 서열번호 34와 35는 각각 A. hydrophilia 와 A. salmonicida로부터 유래된 지질 아실트랜스퍼라제의 단백질 전사 서열을 나타내는 것으로 이들은 번역 후 더 이상의 변형은 이루어지지 않는다.
본 발명의 방법 및 용도의 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제는 Thermobifida 속 미생물 더욱 바람직하게는 T. fusca 미생물로부터 분리될 수 있으며 서열번호: 27, 28, 38, 40 또는 47 의 아미노산 서열을 지니거나 서열번호: 39 또는 서열번호: 48의 뉴클레오타이드 서열을 지니는 핵산에 의해 코드화 되는 것이다.
본 발명에 따른 방법 및 용도에 사용되는 지질 아실트랜스퍼라제는 Streptomyces 속 미생물 바람직하게는 S. avermitis 미생물로부터 분리 될 수 있으며 더욱 바람직하게는 서열번호: 32 의 아미노산 서열을 지니는 것이다. 본 발명에 사용할 수 있는 Streptomyces 속으로부터 다른 가능한 효소는 서열번호: 5, 6, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 26, 31, 33, 36, 37, 43 또는 45 의 아미노산 서열을 지니는 효소이거나 서열번호: 52, 53, 56, 57, 58, 59, 60 또는 61 의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코드화되는 효소이다.
본 발명에 사용되는 효소는 Corynebacterium 속으로부터 분리될 수 있으며 바람직하게는 C. efficiens 로부터 분리된 것이며 서열번호: 29 또는 서열번호: 41 아미노산 서열을 지니거나 서열번호: 42의 뉴클레오타이드 서열에 의해 코드화 된 것이다.
본 발명에 따른 하나의 실시태양에서 지질 아실트랜스퍼라제는 Streptomyces 균주 L130 또는 L131 로부터 수득할 수 있거나 수득 가능한 것으로 덴마크 코펜하겐 K DK-1001 랑게브로가드에 소재하는 Danisco A/S 에 의해 스코틀랜드 아베르딘 마챠 스트리트 23 St 에 소재하는 National Collection of Industrial, Marine and Food Bacteria (NCIMB) 에 미생물 기탁에 관한 국제 조약인 부다페스트 조약에 의거 각각 입수번호 NCIMB 41226 및 NCIMB 41227 로 기탁하였다.
본 발명에 따른 하나의 실시태양에서 효소는 예를 들면 E.C. 3.1.1.32 로 분류되는 포스포리파아제 A1 또는 E.C. 3.1.1.4 로 분류되는 포스포리파아제 A2 와 같은 포스포리파아제가 아닌 것이 바람직하다.
변이 지질 아실 트랜스퍼라제
본 발명에 따른 방법과 용도에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화 하는 뉴클레오타이드 서열은 바람직하게는 변이 지질 아실 트랜스퍼라제와 같은 지질 아실 트랜스퍼라제이다.
변이 효소는 인지질에 증가된 활성을 나타내고 예를 들면 증가된 가수분해 활성 및/또는 증가된 트랜스퍼라제 활성을 통해 인지질에 증가된 트랜스퍼라제 활성을 나타낼 수 있다.
바람직한 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 상기 정의한 지질 아실 트랜스퍼라제의 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형에 의해 제조 될 수 있다.
본 발명의 방법 및 용도에 사용되는 적합한 지질 아실 트랜스퍼라제는 변이 지질 아실 트랜스퍼라제일 수 있으며 이 때 상기 효소는 GDSX 아미노산 모티프를 지니는 효소로써 이 때 X 는 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S 의 아미노산 잔기 중 1종 이상이다. 변이 효소는 WO 2005/066347 에 정의된 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7 로 정의된 모 서열에 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형을 포함 할 수 있다.
예를 들면 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 GDSX 아미노산 모티프를 지닌 효소로써 특징지어질 수 있으며 이 때 X 는 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S 의 아미노산 잔기의 1종 이상이고 또한 변이 효소는 모 서열과 비교하여 하나 이상의 아미노산 변형을 지닌 것으로 상세하게는 모 서열인 WO 2005/066347 에서 정의된 세트 2 또는 세트 4 또는 세트 6 또는 세트 7 내에서 하나 이상의 아미노산 잔기가 변형된 것이고, 이 때 모 서열은 본 명세서 내에 정의된 P10480 의 구조 모델 구조 배열을 통해 확인 할 수 있으며 이 때 모 서열은 WO 2005/066347에서 정의된 1IVN.PDB 및/또는 1DEO.PDB 에 코디네이트되는 P10480 결정구조의 구조 배열을 지니는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법 및 용도에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제의 또 다른 실시태양에서 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 GDSX 아미노산 모티프를 지닌 효소로써 특징 지어질 수 있으며 이 때 X 는 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S 의 아미노산 잔기의 1종 이상이며, 모 서열의 하나 이상의 아미노산 변형을 지닌 것으로 모 서열이 도 3 에 나타난 서열번호: 2 의 pfam 콘센서스 서열의 배열을 지니고 WO 2005/066347 에 정의된 바와 같이 P10480 구조 모델에 의해 변형 시켰을 때 최적 오버랩을 통해 확인 할 수 있는 것이다.
본 발명의 방법 및 용도의 적합한 지질 아실 트랜스퍼라제는 다음과 같은 아미노산 서열을 지니는 지질 아실 트랜스퍼라제의 변이체로 되어 있는 것이다. 서열번호: 34, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호:1, 서열번호: 15, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 또는 서열번호: 35 로 나타난 아미노산 서열의 변이체 중 WO 2005/066347에서 정의 된 세트 2, 세트 4, 세트 6 또는 세트 7 로 정의 된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 변형은 제외되는 것으로 서열번호: 34 의 서열 배열을 통해 확인 할 수 있다.
한편 본 발명의 지질 아실 트랜스퍼라제는 서열번호: 34, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 1, 서열번호: 15, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 또는 서열번호: 35 로 나타난 아미노산 서열의 변이체 중 WO 2005/066347에서 정의 된 세트 2, 세트 4, 세트 6 또는 세트 7 로 정의 된 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 변형은 제외되는 것으로 상기 아미노산 모 서열은 본 명세서 내에 정의된 P10480 의 구조 모델 구조 배열을 통해 확인 할 수 있으며 이 때 모 서열은 WO 2005/066347에서 정의된 1IVN.PDB 및/또는 1DEO.PDB 에 코디네이트되는 P10480 결정구조의 구조 배열을 지니는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법 및 용도의 적합한 지질 아실 트랜스퍼라제는 다음과 같은 아미노산 서열을 지니는 지질 아실 트랜스퍼라제의 변이체로 되어 있는 것이다. 서열번호: 34, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호:1, 서열번호: 15, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 33, 또는 서열번호: 35 로 나타난 아미노산 서열의 변이체 중 WO 2005/066347에서 정의 된 세트 2 로 정의되는 아미노산 잔기의 변형은 제외되는 것으로 모 서열이 서열번호: 2 의 pfam 콘센서스 서열의 배열을 지니고 WO 2005/066347 에 정의된 바와 같이 P10480 구조 모델에 의해 변형 시켰을 때 최적 오버랩을 통해 확인 할 수 있는 것이다.
바람직한 모 서열은 서열번호: 34 및/또는 서열번호:15 및/또는 서열번호: 35 에 나타난 아미노산 서열을 지니거나 이에 상동적인 서열이다.
바람직한 지질 아실 트랜스퍼라제는 서열번호: 34 또는 서열번호: 35 의 아미노산 서열의 변이체이다. 단 WO 2005/066347에서 정의된 세트 2, 세트 4, 세트 6 또는 세트 7 에 정의된 하나 이상의 아미노산 잔기의 변형은 제외된다.
본 발명의 방법 또는 용도의 사용되는 또 다른 적합한 지질 아실 트랜스퍼라제의 변이는 PCT/IB2009/054535 에 개시되어 있다.
지질 아실 트랜스퍼라제의 3차원 구조는 밝혀지고 있으며 지질 아실 트랜스퍼라제가 더욱 성공적으로 변이 시킬 수 있는 흥미로운 구조임을 확인하였다. 특히 지질 아실 트랜스퍼라제의 3차원 구조는 동굴(cave) 및 계곡(canyon) 구조를 지니고 있고 이를 형성하는 잔기들은 다음과 같다.
효소내의 케이브 영역의 변화는 효소 기질 사슬 길이 특이성을 변화시킨다.
효소내의 캐년 영역 특히 바람직한 변형이며 효소 기질 특이성을 증진시키거나 변화시키는데 매우 중요한 것으로 알려져있다.
본 발명자들은 특히 캐년 영역에 다수의 변형을 행함으로써 향상된 특성을 지니는 흥미로운 변이체를 확인하였다. 이들은 변이는 31, 27, 85, 86, 119 및 120번 잔기 위치에서 발견되고 가장 바람직한 변이는 31 및/또는 27 잔기 위치의 변이이다.
변이 지질 아실 트랜스퍼라제 효소는 모 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열의 적어도 90% 상동성을 지니는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코드화된다. 또한 적어도 하나의 변형 적합하게는 적어도 두 개의 변형이 아미노산 서열을 코드화하는 위치에서 이루어지고 이 때 변형 아미노산 위치는 a)효소의 캐년 영역 및/또는 b)삽입 사이트 1 및/또는 c)삽입 사이트 2 위치이고 이는 효소의 1차 또는 3차 구조의 변형을 의미하고 이에 따라 하기 서열번호: 16 또는 서열번호: 68 로 나타난 효소의 캐년 영역, 삽입 사이트 1 또는 삽입 사이트 2 에 상응하는 것이다.
하나의 실시태양에서 캐년 영역 및/또는 삽입 사이트 1 및/또는 삽입 사이트 2 에 위치한 변형은 이에 상응하는 아미노산 서열 내에서 캐년 영역 및/또는 삽입 사이트 1 및/또는 삽입 사이트 2 위치의 아미노산 서열의 코드화와 상응하는 것이다.
하나의 실시태양에서 지질 아실 트랜스퍼라제는 적어도 하나의 변형 바람직하게는 적어도 두 개의 변형을 27, 31, 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 232, 235 및/또는 236 위치의 아미노산 서열에 상응하는 위치에서 지닐 수 있다. 바람직하게는 27, 31, 85, 86, 119 및/또는 120 위치의 아미노산 서열에 상응하는 위치의 변형이고 더욱 바람직하게는 27 및/또는 31 위치의 아미노산 서열에 상응하는 변형이다. 이 때 위치번호는 서열번호: 16 으로 나타난 효소의 동일 위치에 상응하는 1차원 또는 3차원 구조를 기반으로 배열될 때 정의되는 것이다.
또 다른 실시태양에서 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 적어도 하나의 다른 변형과 함께 27 및/또는 31 위치에 코드화된 아미노산 서열을 변형한 것이다. 이 때 위치번호는 서열번호: 16 으로 나타난 효소의 동일 위치에 상응하는 1차원 또는 3차원 구조를 기반으로 배열될 때 정의되는 것이다.
더욱 적합하게는 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 23, 81, 82, 289, 227, 229, 233, 33, 207, 130 위치에서 선택된 하나 이상의 추가적 변형을 포함할 수 있고 이 때 위치번호는 서열번호: 16 으로 나타난 효소의 동일 위치에 상응하는 1차원 또는 3차원 구조를 기반으로 배열될 때 정의되는 것이다.
본 발명에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제 아미노산 서열은 변형된 골격(backbone)을 지닐 수 있으며 하나의 변형 바람직하게는 둘 이상의 변형이 a)효소의 캐년 영역 및/또는 b)삽입 사이트 1 및/또는 c)삽입 사이트 2 의 위치에 존재 할 수 있으며 상기 효소의 캐년 영역 및/또는 b)삽입 사이트 1 및/또는 c)삽입 사이트 2 이는 서열번호:16 또는 서열번호:68 에 나타난 효소의 캐년 영역, 삽입 사이트 1 또는 삽입 사이트 2 에 상응하는 1차 또는 3차 구조에 근거하여 배열되는 것이다.
하나의 실시태양에서 바람직하게는 캐년 영역 및/또는 삽입 사이트 1 및/또는 삽입 사이트 2 에 위치하는 변형이고 이는 캐년 영역 및/또는 삽입 사이트 1 및/또는 삽입 사이트 2 위에 코드화된 아미노산 서열에 상응하는 것이다.
지질 아실 트랜스퍼라제 아미노산 서열 골격(backbone)은 변형 될 수 있으며 하나의 변형 바람직하게는 둘 이상의 변형이 27, 31, 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 232, 235 및/또는 236 위치의 아미노산 서열에 상응하는 위치에서 지닐 수 있다. 바람직하게는 27, 31, 85, 86, 119 및/또는 120 위치의 아미노산 서열에 상응하는 위치의 변형이고 더욱 바람직하게는 27 및/또는 31 위치의 아미노산 서열에 상응하는 변형이다. 이 때 위치번호는 서열번호: 16 으로 나타난 효소의 동일 위치에 상응하는 1차원 또는 3차원 구조를 기반으로 배열될 때 정의되는 것이다.
또 다른 실시태양에서 지질 아실 트랜스퍼라제 아미노산 서열 골격(backbone)은 변형 될 수 있으며 하나의 변형 바람직하게는 둘 이상의 변형을 포함 할 수 있으며 적어도 하나의 추가적 변형과 함께 27 및/또는 31 위치에 코드화된 아미노산 서열을 변형한 것이다. 이 때 위치번호는 서열번호: 16 으로 나타난 효소의 동일 위치에 상응하는 1차원 또는 3차원 구조를 기반으로 배열될 때 정의되는 것이다.
한편 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 23, 81, 82, 289, 227, 229, 233, 33, 207, 130 위치의 하나 이상의 추가적 변형이 가능하고 이 때 위치번호는 서열번호: 16 으로 나타난 효소의 동일 위치에 상응하는 1차원 또는 3차원 구조를 기반으로 배열될 때 정의되는 것이다.
본 발명에 사용된 변형 또는 변이 지질 아실 트랜스퍼라제가 제공 될 수 있으며 이는 서열번호: 16 또는 서열번호:68 에 나타난 Aeromonas salmonicida 로 부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제에 적어도 70% 이상 상동성을 지닌 것이고 기질 사슬 길이 특이성을 결정하는 세그먼트는 변형된 지질 아실 트랜스퍼라제의 촉매 트리아드의 Asp 잔기의 N-말단에 인접하여 있는 것으로 이는 서열번호: 16 또는 서열번호: 68 의 Aeromonas salmonicida 유래 지질 아실 트랜스퍼라제에 관련된 길이 변화를 부여한다.
바람직한 변형은 예를 들면 모 효소의 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트를 다른 지질 아실 트랜스퍼라제의 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트로 치환하는 것과 같은 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트의 아미노산 삽입 또는 치환을 포함하며 이는 변형된 지질 아실 트랜스퍼라제를 생성 가능케 한다. 바람직하게는 이러한 변형은 지질 아실 트랜스퍼라제의 이전에 의해 아실 사슬의 길이를 증가시키는 것이다.
바람직한 지질 아실 트랜스퍼라제의 변형은 서열번호: 16 또는 서열번호: 68 로 나타나는 Aeromonas salmonicida 로부터 유래된 지질 아실 트랜스퍼라제와 적어도 90% 이상 상동성을 지니는 아미노산 서열을 지니는 것이다.
변형 이전에 지질 아실 트랜스퍼라제 변이 효소를 코드화한 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 69, 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51, 서열번호: 62, 서열번호: 63 또는 서열번호: 24 로 나타난 뉴클레오타이드 서열이거나; 상기 서열번호: 69, 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51, 서열번호: 62, 서열번호: 63 또는 서열번호: 24 뉴클레오타이드 서열의 적어도 70% 이상 상동성 바람직하게는 적어도 80% 이상 더욱 바람직하게는 적어도 90% 이상 더욱더 바람직하게는 적어도 95% 이상 상동성을 지닌 뉴클레오타이드 서열 이거나; 상기 서열번호: 69, 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51, 서열번호: 62, 서열번호: 63 또는 서열번호: 24 뉴클레오타이드 서열과 관련하여 유전코드의 퇴화(degeneration) 에 의한 뉴클레오타이드 서열이거나; 서열번호: 69, 서열번호: 49, 서열번호: 50, 서열번호: 51, 서열번호: 62, 서열번호: 63 또는 서열번호: 24 로 나타난 뉴클레오타이드 서열을 중립적 또는 엄격한 조건하에서 혼성화 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열이다.
더욱 바람직한 실시태양에서 변이 아실 트랜스퍼라제는 서열번호: 49 또는 서열번호: 69 의 전체 길이를 실질적으로 혼성화하거나 서열번호: 49 또는 서열번호: 69 의 상보체를 중립적 또는 엄격한 조건하에서 혼성화하여 수득되는 핵산 서열 바람직하게는 분리 또는 재조합된 핵산 서열에 의해 코드화된 효소이다. 상기 코드화된 폴리펩타이드는 31번 위치에서 Q, H, N, T, F, Y 또는 C에서 선택된 아미노산 잔기; 86번 위치에서 R, Y, S, V, I, A, T, M, F, C 또는 L에서 선택된 아미노산 잔기; 27번 위치에서 R, G, H, K, Y, D, N, V, C, Q, L, E, S 또는 F에서 선택된 아미노산 잔기; 85번 위치에서 H, R, D, E 에서 선택된 아미노산 잔기; 119번 위치에서 T 또는 I 에서 선택된 아미노산 잔기; 120번 위치에서 K 또는 E 에서 선택된 아미노산 잔기; 122번 위치에서 S, L, A, F, W, Y, R, H, M 또는 C 에서 선택된 아미노산 잔기; 201번 위치에서 R 인 아미노산 잔기; 245번 위치에서 S 인 아미노산 잔기; 235번 위치에서 A 또는 V 인 아미노산 잔기; 232번 위치에서 G 또는 S 인 아미노산 잔기; 236번 위치에서 G 또는 E 인 아미노산 잔기에서 선택된 적어도 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 것으로 상기 위치는 서열번호: 16 에 근거한 아미노산 서열에 상응하는 것이다.
변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 지질 아실 트랜스퍼라제의 활성을 지닌 프로-펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며 서열번호: 16 또는 서열번호: 68에 나타난 아미노산 서열과 적어도 90% 이상 바람직하게는 적어도 95% 이상 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상 더욱더 바람직하게는 적어도 99% 이상의 상동성을 지닌 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 이들 서열의 27, 31, 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 232, 235 및/또는 236 위치에 하나 또는 그 이상의 변형을 지닐 수 있으며 바람직하게는 27, 31, 85, 86, 119 및/또는 120 위치의 변형이며 더욱 바람직하게는 27 및/또는 31 위치의 변형을 포함할 수 있다.
변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 지질 아실 트랜스퍼라제의 활성을 지닌 서열번호: 16 또는 서열번호: 68에 나타난 프로-펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며 그러나 상기 아미노산 서열의 27, 31, 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 232, 235 및/또는 236 위치에 하나 또는 그 이상의 변형, 바람직하게는 27, 31, 85, 86, 119 및/또는 120 위치의 변형, 더욱 바람직하게는 27 및/또는 31 위치의 변형을 제외할 수 있다.
변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 지질 아실 트랜스퍼라제의 활성을 지닌 프로-펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함할 수 있으며 서열번호: 16 또는 서열번호: 68에 나타난 아미노산 서열과 적어도 90% 이상 바람직하게는 적어도 95% 이상 더욱 바람직하게는 적어도 98% 이상 더욱더 바람직하게는 적어도 99% 이상의 상동성을 지닌 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 또한 이들 서열의 27 및/또는 31 위치의 변형과 더불어 추가적 변형을 포함할 수 있으며 이 때 위치번호는 서열번호: 16 으로 나타난 효소의 동일 위치에 상응하는 1차원 또는 3차원 구조를 기반으로 배열될 때 정의되는 것이다.
적합한 하나 이상의 추가적 변형은 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 23, 81, 82, 289, 227, 229, 233, 33, 207, 130 위치에 하나 또는 그 이상의 변형을 포함할 수 있으며 이 때 위치번호는 서열번호: 16 으로 나타난 효소의 동일 위치에 상응하는 1차원 또는 3차원 구조를 기반으로 배열될 때 정의되는 것이다.
바람직한 실시태양에서 서열번호: 16 또는 서열번호: 68 로 나타난 아미노산 서열을 지니는 지질 아실 트랜스퍼라제 활성을 지닌 프로-펩타이드 또는 폴리펩타이드를 포함하는 지질 아실 트랜스퍼라제는 27번 위치 및/또는 31번 위치의 변형과 추가적 변형을 하나 또는 그 이상 지닌 것을 제외할 수 있다.
적합한 하나 이상의 추가적 변형은 85, 86, 122, 119, 120, 201, 245, 23, 81, 82, 289, 227, 229, 233, 33, 207, 130 위치에 하나 또는 그 이상의 변형을 포함할 수 있으며 이 때 위치번호는 서열번호: 16 으로 나타난 효소의 동일 위치에 상응하는 1차원 또는 3차원 구조를 기반으로 배열될 때 정의되는 것이다.
지질 아실 트랜스퍼라제는 예를 들면 지질 트랜스퍼라제의 활성을 지니는 폴리-펩타이드는 펩타이드 성숙 후 추가적 후-번역 변형을 지닐 수 있다. 예를 들면 서열번호: 68은 서열번호: 16과 실질적으로 동일한 것으로 오직 차이는 서열번호: 68이 후-번역 및/또는 후-전사 변형을 통해 38개 아미노산을 제거한 것 뿐이다. 따라서 서열번호: 16의 폴리-펩타이드는 예를 들면 특정 숙주 세포 내에서 프로-펩타이드로 사용될 수 있으며 이는 후-번역 및/또는 후-전사 변형에 의해 성숙된 펩타이드의 추가적 공정을 요구하는 것이다. 예를 들면 분리 사이트와 같은 정확한 변형이 후-번역 및/또는 후-전사 변형의 측면에서 숙주 종류에 의존하여 약간 변화할 수 있는 것이다. 따라서 프로-펩타이드는 성숙된 펩타이드와 균등할 수 있으며 이는 동일한 지질 아실 트랜스퍼라제 활성을 지닌 폴리펩타이드이다. 현재까지 알려진 바에 의하면 분리 사이트는 예를 들면 1, 2 또는 3 잔기만큼 몇 개의 잔기로 이전될 수 있으며 서열번호: 16과 비교하여 서열번호: 68에 나타난 분리 사이트를 비교함으로써 인지할 수 있다. 다시 말하면 235-ATR 위치 내지 273 위치(RRSAS)에서의 분리는 예를 들면 232, 233, 234, 235, 236, 237 또는 238 잔기 위치에서 시작하여 270, 271, 272, 273, 274, 275 또는 276 잔기 위치에서 종료되어 분리 될 수 있는 것이다. 이는 약 38개의 아미노산의 분리 제거가 어떤 경우에 있어서는 30 내지 45개 아미노산 잔기의 분리제거 또는 34~42개 잔기, 또는 36~40개 잔기의 분리제거가 가능한 것으로 가장 바람직하게는 38개 아미노산의 분리제거이다.
하나의 실시태양에서, 1차 구조의 상동성을 확립하기 위해서는 지질 아실트랜스퍼라제의 아미노산 서열을 서열번호: 16 또는 서열번호: 68로 나타난 지질 아실트랜스퍼라제 효소의 1차 서열과 직접 비교하여야 하며 특히 모든 지질 아실트랜스퍼라제의 알려진 불변 서열의 대부분 또는 모두는 더욱 비교되어야 한다. 보존된 잔기를 배열한 후에 예를 들면 보존된 잔기의 임의적 추가 또는 결실을 통한 변형을 제외한 배열을 유지하면서 필요한 삽입 또는 결실을 수행하여야 하며 이들 서열은 서열번호: 16 또는 서열번호: 68로 정의된 1차 서열과 아미노산 상동성을 지니는 잔기로 이루어져야 한다. 바람직한 실시태양에서 이러한 보존된 잔기의 배열은 100% 보존되어야 한다. 그러나 때로는 75% 이상의 배열 보존 또는 적어도 50% 이상의 보존 잔기의 보존이 균등한 잔기로 적합할 수도 있다. 바람직한 실시태양에서 촉매 세린 및 히스티딘 잔기의 보존은 유지되어야 한다. 보존된 잔기는 다른 미생물 뿐만 아니라 Aeromonas 속과 같은 미생물에서 유래된 지질 아실트랜스퍼라제 특히 서열번호: 16 또는 서열번호: 68에 나타난 지질 아실트랜스퍼라제의 아미노산 잔기와 상응하는 것으로 이루어진다.
서열번호: 16 또는 서열번호: 68로 이루어진 모 지질 아실트랜스퍼라제의 정렬을 위해 서열 배열은 http://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.html을 통해 수행될 수 있다. 따라서 서열번호: 68 또는 서열번호: 16에 정의된 아미노산 서열의 하나 또는 그 이상에 상응하는 모 지질 아실트랜스퍼라제 폴리펩타이드의 변이를 통한 균등한 아미노산은 결정되어지고 이에 따라 변형될 수 있다. 당업자는 쌍렬 배열을 사용하여 이와 같은 세팅 기준을 충족시킬 수 있다. 상응하는 잔기는 모든 서열의 전체 길이를 커버하는 배열을 통해 '니들'을 사용하여 확인될 수 있다. 그러나 '물'을 사용하여 두 서열간의 유사성의 최적 영역을 확인하는 것이 가능하다.
한편, 모 서열의 서열번호: 16 또는 서열번호: 68의 서열과 낮은 1차 서열 상동성을 나타내는 경우에는 서열번호: 16 또는 서열번호: 68의 정의된 아미노산에 상응하는 모 지질 아실트랜스퍼라제의 변형 내에서 상응하는 아미노산을 서열번호: 16 또는 서열번호: 68, 바람직하게는 서열번호: 68의 구조 모델의 구조 배열을 결정함으로써 확인할 수 있다.
따라서 균등한 잔기는 지질 아실트랜스퍼라제의 3차원 구조 수준의 상동성을 결정함으로써 확인할 수 있으며 3차원 구조는 X선 크리스탈로그라피를 통해 결정될 수 있다. 본 명세서 내에서 '균등한 잔기'라는 의미는 서열번호: 16 또는 서열번호: 68로 나타난 지질 아실트랜스퍼라제 특정 아미노산 잔기(N과 N, CA와 CA, C와 C 및 O와 O) 간의 주사슬 원자의 둘 또는 그 이상의 원자 일치를 통해 확인될 수 있는 것으로 정렬 후에 0.13nm 이내, 바람직하게는 0.1nm 이내의 원자 정렬이 요구된다. 정렬은 문제되는 지질 아실트랜스퍼라제의 비-수소 단백질 원자의 최대 원자 일치 오버랩을 부여할 수 있도록 위치되거나 오리엔트된 최적 모델을 통해 서열번호: 16 또는 서열번호: 68에 나타난 지질 아실트랜스퍼라제에 부여함으로써 성취될 수 있다. 현재까지 알려진 기술로서 최적 모델은 최고 해상도가 가능한 실험적 회절 데이터를 위해 최적 R 요인을 부여하는 크리스탈로그래피 모델이다. 서열번호: 16 또는 서열번호: 68에 나타난 지질 아실트랜스퍼라제의 특정 잔기에 기능적 및/또는 구조적으로 유사한 균등 잔기는 바람직한 배치(conformation)을 채택한 지질 아실트랜스퍼라제의 아미노산 잔기로 정의될 수 있고 이때 이들 아미노산은 기질 특이성 예를 들면 서열번호: 16 또는 서열번호: 68에 나타난 지질 아실트랜스퍼라제의 특정 잔기에 부여된 기질 결합 및/또는 촉매 기능을 변화시킬 수 있는 단백질 구조의 변화, 변형 또는 모듈화를 통해 이루어지는 것이다. 또한 3차 구조가 X선 크리스탈로그래피에 의해 확인되었을 경우에 지질 아실트랜스퍼라제의 아미노산 잔기들이 유사한 위치를 점유하고 있는 것은 비록 주어진 잔기의 주사슬 원자가 상동성 위치를 점유하는지 기준에 따라서는 상동성 기준을 만족하지 못한다 할지라도 잔기의 적어도 2개의 곁사슬 원자의 원자 코디네이트가 서열번호: 16 또는 서열번호: 68에 나타난 지질 아실트랜스퍼라제의 곁사슬 원자에 상응하는 0.13 nm 이낸내에 존재한다면 상동성을 지닌 것으로 판단된다.
서열번호: 68로 나타난 지질 아실트랜스퍼라제(이는 N80D 변이를 포함하는 Aeromonas salmonicida 지질 아실트랜스퍼라제이다)의 3차원 구조 코디네이트는 PCT/IB2009/054535에 기재되어있고 3차 구조 수준의 균등 잔기 결정을 통해 확인된다.
유사한 대장균 티오에스테라제 구조 비교를 통해 Aeromonas salmonicida 지질 아실트랜스퍼라제 내에 마지막 베타 스트랜드와 ASP-X-X_HIS 모티프 사이에 큰 삽입이 있다. 이러한 삽입은 아실 효소 중간체의 지방족 사슬을 결합시키는 큰 캐비티(이하 '케이브'로 언급됨)의 창출을 가능케 한다. 서열 및 영역 크기의 모듈화는 작거나 큰 '케이브' 또는 아실 효소 중간체의 지방족 사슬을 위한 캐비티를 야기시키며 이때 아실 사슬은 효소로부터 이전된 것이다. 따라서 이러한 효소가 엔지니어링될 수 있고 다른 길이의 아실 사슬을 적합하게 이전할 수 있다.
대장균 티오에스테라제(PDB 엔트리 1IVN)에 관련하여 Aeromonas salmonicida 지질 아실트랜스퍼라제에서 4개의 삽입이 발견되었으며 이는 모든 구조에 공통된 일반적 2차 구조 엘레멘트를 연결하는 것이다.
서열번호: 68로 나타난 지질 아실트랜스퍼라제 내의 이와 같은 삽입된 아미노산은 다음 표 1에 나타난 것과 일치한다.
지질 아실트랜스퍼라제 내의 삽입
삽입 잔기
삽입 1 22-36
삽입 2 74-88
삽입 3 162-168
삽입 4 213-281
PCT/IB2009/054535에 기술된 바와 같이 지질 아실트랜스퍼라제 내에는 기질과 결합하는 큰 표면을 지니고 있으며 Ser 16과 His 291에 의해 분리되는 2개의 영역으로 나눌 수 있다. 이때 Ser 16과 His 291은 Asp 288과 함께 촉매 활성 트리아드로 특징지어진다. 이 두 개의 영역은 깊은 채널로 이루어진 '캐년'(이하 캐년으로 언급함)과 그 분자를 통해 형성된 함몰된 캐비티 또는 '케이브'로 구성된다.
캐년을 형성하는 잔기는 다음 표 2에 나타나있다.
CANYON 잔기
삽입 1 M23, M27, Y30, L31
세그먼트 1 F42, G67, G68
삽입 2 D80, P81, K82, Q84, V85, I86
세그먼트 2a Y117, A119, Y120
삽입 4 G229, Y230, V231
케이브를 형성하는 잔기는 다음 표 3에 나타나있다.
CAVE 잔기
세그먼트 1 D15, S16, L18
세그먼트 2 2W111, A114, L115, L118
세그먼트 3 P156, D157, L158, Q160, N161
세그먼트 4 F206, A207, E208, M209, L210
세그먼트 5 M285, F286, V290, H291, P292, V295
세그먼트 3과 4는 각각 삽입 3과 4에 선행하고 세그먼트 5는 삽입 4에 바로 인접하여 따른다. 삽입 4와 5는 케이브를 형성하는데 기여하고 따라서 케이브는 삽입 1과 삽입 2로 형성되는 캐년과는 상이한 것이다. 반면 삽입 3과 4는 오버레잉 구조를 형성한다. 삽입 4과 삽입 4는 케이브를 커버한다.
하나의 실시태양에서 본 발명에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제는 캐년, 케이브, 삽입 1, 삽입 2, 삽입 3 또는 삽입 4의 하나 이상의 아미노산 잔기에 모디파이 함으로써 변형될 수 있다.
또 하나의 실시태양에서 지질 아실 트랜스퍼라제의 아실 사슬 결합 캐비티의 입체구조는 더 큰 케이브를 형성하기 위해 아미노산 잔기를 변경함으로써 변화시킬 수 있다. 이것은 상기에 기술한 2차 구조의 일반적 형상을 연결하는 영역의 크기를 모듈레이트 함으로써 행해진다. 특히 케이브의 크기는 효소의 마지막(다섯번째) 베타 스트랜드와 효소활성 트리아드의 부분인 Asp-X-X-His 모티프 사이에 있는 영역에 아미노산 변경에 의해 변형 될 수 있다.
지질 아실 트랜스퍼라제의 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트는 효소의 베타-5-스트랜드와 효소의 촉매 트리아드의 Asp 잔기 사이에 놓여있는 연속적인 아미노산 영역이다. 이 때 Asp 잔기는 Asp-Xaa-Xaa-His 모티프의 한 부분이다.
Aeromonas salmonicida 지질 아실 트랜스퍼라제의 3차원 입체 구조와 대장균 티오에스테라제(1IVN_A; GID:33357066의 접근번호로 NCBIs Genbank 데이터베이스에 기탁되어있다)의 3차원 입체 구조는 3층 alpha/beta/alpha 구조를 나타내고 있으며 여기서 베타-쉬트는 각각의 지질 아실 트랜스퍼라제 효소의 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트를 결정하는 다섯 개의 평행 스트랜드로 구성되어 있다.
Aeromonas salmonicida 지질 아실 트랜스퍼라제의 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트는 효소의 촉매 트리아드인 Asp 잔기의 N-말단에 바로 인접해있다. 그러나 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트의 길이는 Asp 잔기와 효소의 베타-5-스트랜드 사이에 거리에 따라 변화될 수 있다. 예를 들면 지질 아실 트랜스퍼라제의 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트는 약 13개의 아미노산, 19개의 아미노산 및 약 70개의 아미노산 길이를 각각 지닐 수 있다. 이와 같이 지질 아실 트랜스퍼라제에 따라서 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트는 10 내지 70개의 아미노산 길이를 지닐 수 있으며 예를 들면 아미노산 길이 10 내지 30개, 30 내지 50개 또는 50 내지 70개 일 수 있다.
하기 표는 A. salmonicida의 지질 아실 트랜스퍼라제(GCAT)의 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트의 예시적 서열을 나타내는 것이다.
AEMLRDPQNFGLSDVENPCYDGGYVWKPFATRSV(서열번호: 73)
STDRQLSASPQERLAIAGNPLLAQAVASPMARRSA
SPLNCEGKMF
하나의 실시태양에서 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트의 아미노산 서열은 야생형 효소의 아미노산 서열과 같을 수도 있고 다를 수도 있다. 하나의 실시태양에서 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트는 야생형 지질 아실 트랜스퍼라제의 기질 사슬 길이 특이성 결정 세그먼트에 대해 적어도 약 70% 이상, 약 80% 이상, 약 90% 이상, 약 95% 이상의 상동성을 지닌다.
적합한 변이 효소가 자리지정 돌연변이에 의해 제조 될 수 있다.
적합한 변형은 다음의 위치에 하나 또는 그 이상의 변형을 포함하는 것이다. 즉 L031, I086, M027, V085, A119, Y120, W122, E201, F235, W232, A236, 및/또는 Q245의 위치의 변형이다.
특히 중요한 변형은 L31Q, H, N, T, F, Y 또는 C (바람직하게는 L31 Q); M27R, G, H, K, Y, D, N, V, C, Q, L, E, S 또는 F (바람직하게는 M27V); V85H, R, D 또는 E; I86R,Y, S, V, I, A, T, M, F, C 또는 L (바람직하게는 I86S or A); A119T 또는 I; Y120K 또는 E; W122S, L 또는 A (바람직하게는 W122L); E201R; Q245S; F235A 또는 V; W232G 또는 S; 및/또는 A236G 또는 E로의 변형을 포함한다.
하나의 실시태양에서 적어도 하나의 변형이 캐년내의 변형인 경우 하기 위치31, 27, 85, 86, 119, 120에서 선택된 하나 또는 그 이상의 변형이다.
특히 캐년내의 중요한 변형은 다음과 같은 변형 하나 또는 그 이상을 포함한다. L31Q, H, N, T, F, Y 또는 C (바람직하게는 L31 Q); M27R, G, H, K, Y, D, N, V, C, Q, L, E, S 또는 F (바람직하게는 M27V); V85H, R, D 또는 E; I86R,Y, S, V, I, A, T, M, F, C 또는 L (바람직하게는 I86S 또는 A); A119T 또는 I; Y120K 또는 E 에서 선택된 하나 이상의 변형을 포함하며 이는 추가적 변형과 결합될 수 있다.
하나의 실시태양에서 삽입 사이트 1의 변형은 31 위치 및/또는 27 위치의 하나 또는 그 이상의 변형이 바람직하다. 적합한 변형은 L31Q, H, N, T, F, Y 또는 C (바람직하게는 L31 Q) 및/또는 M27R, G, H, K, Y, D, N, V, C, Q, L, E, S 또는 F (바람직하게는 M27V)이다.
하나의 실시태양에서 삽입 사이트 2의 변형은 085 위치 및/또는 086 위치의 하나 또는 그 이상의 변형이 바람직하다. 적합한 변형은 V85H, R, D 또는 E 및/또는 I86R, Y, S, V, I, A, T, M, F, C 또는 L이다.
하나의 실시태양에서 삽입 사이트 4의 변형은 245 위치의 변형이 바람직하다. 적합한 변형은 Q245S이다.
하나의 실시태양에서 바람직한 변형은 적어도 삽입 사이트 1의 변형을 포함한다.
하나의 실시 태양에서 삽입 사이트 1의 변형에 추가하여 삽입 사이트 2 및/또는 삽입 사이트 4의 추가적 변형이 가능하며 이 때 변형 위치는 119, 120, 122, 201, 77, 130, 82, 120, 207, 167, 227, 215, 230, 289에서 선택된다.
추가적 실시태양에서 캐년 영역의 변형에 다음과 같은 삽입 사이트 4의 추가적 결합이 가능하며 이 때 변형 위치는 122, 201, 77, 130, 82, 120, 207, 167, 227, 215, 230, 289에서 선택된다.
바람직한 변형은 다음 위치에서 행해지는 것이다.
R130R, V, Q, H, A, D, L, I, K, N, C, Y, G, S, F, T 또는 M ; K82R, N, H, S, L, E, T, M 또는 G ; G121S, R, G, E, K, D, N, V, Q 또는 A; Y74Y 또는 W ; Y83 F 또는 P ; I77T, M, H, Q, S, C, A, E, L, Y, F, R 또는 V ; A207E ; Q167T, H, I, G, L 또는 M ; D227L, C, S, E, F, V, I, T, Y, P, G, R, D, H 또는 A ; N215G ; Y230A, G, V, R, I, T, S, N, H, E, D, Q, K; 또는 N289P이다.
또한 31, 27, 85, 86, 119, 120, 122, 201, 245, 235, 232 및/또는 236 위치에서 하나 또는 그 이상의 변형이 가능하고, 예를 들면 L31Q, H, N, T, F, Y 또는 C (바람직하게는 L31 Q); M27R, G, H, K, Y, D, N, V, C, Q, L, E, S 또는 F (바람직하게는 M27V); V85H, R, D 또는 E; I86R,Y, S, V, I, A, T, M, F, C 또는 L (바람직하게는 I86S 또는 A); A119T 또는 I; Y120K 또는 E; W122S, L 또는 A (바람직하게는 W122L); E201R; Q245S; F235A 또는 V; W232G 또는 S; 및/또는 A236G 또는 E 위치에서의 변형이다. 한편 130, 82, 121, 74, 83, 77, 207, 167, 227, 215, 230, 289 위치에서의 하나 또는 그 이상의 추가적 변형이 일어난 적합한 변이 지질 아실 트랜스퍼라제 일 수 있다. 이 때 추가적 변형 위치는 예를 들면 R130R, V, Q, H, A, D, L, I, K, N, C, Y, G, S, F, T 또는 M; K82R, N, H, S, L, E, T, M 또는 G; G121S, R, G, E, K, D, N, V, Q 또는 A; Y74Y 또는 W; Y83 F 또는 P; I77T, M, H, Q, S, C, A, E, L, Y, F, R 또는 V; A207E; Q167T, H, I, G, L 또는 M; D227L, C, S, E, F, V, I, T, Y, P, G, R, D, H 또는 A; N215G; Y230A, G, V, R, I, T, S, N, H, E, D, Q, K; 및/또는 N289P이다. 더욱 바람직한 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 130, 82, 77 또는 227 위치에서의 하나 또는 그 이상의 변형이다.
지질 아실 트랜스퍼라제 골격은 서열번호: 16으로 나타난 지질 아실 트랜스퍼라제 효소 내에서 1차 또는 3차 구조에 기인한 배열이며 바람직하게는 80번 위치에 D의 아미노산 잔기를 지닌 것이다. 따라서 N80D에 관련된 많은 결합의 변형이 알려져 있으며 만약 모 골격 80번 위치에 D 잔기를 포함하지 않거나 적합한 변형이 N80D를 나타내지 않았을 때에는 80번 위치에 D 잔기를 포함하는 변형이 이루어 질 수 있도록 변이 지질 아실 트랜스퍼라제에 N80D의 추가적 변형을 행한다.
만약 골격 또는 모 지질 아실 트랜스퍼라제가 N80D 변형을 포함하고 있다면 다른 변형은 N80D 변형에 관계없이 표현될 수 있으며 예를 들면 L31Q, N80D, W122L 변형은 L31Q, W122L로 표시 될 수 있다.
그러나 N80D 변형이 최적의 변형이기 때문에 효소 골격 또는 모 효소는 80번 위치에 아미노산 D 잔기를 이미 포함하여 사용되고 있다. 만약 상기 위치에 아미노산 D를 포함하지 않는 골격 예를 들면 서열번호: 1, 3, 4, 15, 34 또는 35의 지질 아실 트랜스퍼라제의 경우 N80D가 포함 되도록 추가적 변형을 행하는 것이 바람직하다.
서열번호: 68 또는 서열번호: 16의 모 서열에 배열을 통해 31번 위치의 치환이 바람직하고 이 때 치환되는 아미노산 잔기는 Q, H, Y 및 F 이고 바람직하게는 Q이다.
바람직한 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 다음과 같은 치환을 하나 또는 그 이상 포함하는 것이다. 27, 77, 80, 82, 85, 85, 86, 121, 122, 130, 167, 207, 227, 230 및 289 위치에서의 치환이다. 상기 치환위치는 서열번호: 68을 모 서열 배열로 하여 확인할 수 있다. 더욱 바람직하게는 서열번호: 68의 모 서열 배열내의 서열 위치 내에 86, 122 또는 130 위치에서의 아미노산 추가적 치환이다.
변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 다음과 같은 하나 또는 그 이상의 치환을 포함하는 것이다. I86 (A, C, F, L, M, S, T, V, R, I 또는 Y); W122 (S, A, F, W, C, H, L, M, R 또는 Y); R130 A, C, D, G, H, I, K, L, M, N, Q, T, V, R, F 또는 Y); 또는 이들의 결합이다.
변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 다음과 같은 치환을 포함하는 결합을 포함하는 것이다. 이 때 모 골격에서 80번 위치의 아미노산은 D로 변형되어 있으며 따라서 N80D는 표시하지 않는다.
L31Q, N80D, I86S, W122F;또는 L31Q, N80D, W122L;또는 L31Q, N80D, I86V, W122L;또는 L31Q, N80D, I86I, W122L;또는 L31Q, N80D, I86S, R130R;또는 L31Q, N80D, K82R, I86A;또는 L31Q, N80D, I86S, W122W;또는 L31Q, N80D, I86S, W122Y;또는 M27V, L31Q, N80D;또는 L31Q, N80D, I86A, W122L;또는 L31Q, N80D, W122L;또는 L31Q, N80D, I86S, G121S;또는 L31Q, N80D, I86S;또는 L31Q, N80D, K82R, I86S;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L, R130Y;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L, R130V;또는 L31Q, N80D, I86S;또는 L31Q, N80D, I86T, W122L;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L;또는 L31Q, N80D, W122L, R130Q;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L, R130R;또는 L31Q, N80D, I86S;또는 L31Q, N80D, G121R;또는 L31Q, N80D, I86A;또는 M27C, L31Q, N80D;또는 M27Q, L31Q, N80D;또는 L31Q, N80D, G121S;또는 L31Q, N80D, I86S, W122R;또는 L31Q, N80D, R130Q;또는 L31Q, N80D, I86S, W122H;또는 L31Q, N80D, I86M, W122L;또는 L31Q, N80D, R130N;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L;또는 L31Q, N80D, K82N;또는 L31Q, N80D, I86S, W122M;또는 L31Q, N80D, W122L;또는 L31Q, N80D, K82H;또는 L31Q, N80D, R130H;또는 L31Q, N80D, R130A;또는 L31Q, N80D, G121S;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L, R130D;또는 L31Q, N80D, I86M;또는 L31Q, Y74Y, N80D ;또는 L31Q, N80D, R130L;또는 L31Q, N80D, Y83F;또는 L31Q, N80D, K82S;또는 L31Q, I77T, N80D;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L, R130I;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L;또는 L31Q, N80D, I86F, W122L;또는 M27N, L31Q, N80D;또는 L31Q, N80D, Y83P;또는 L31Q, N80D, R130K;또는 L31Q, N80D, K82R, I86S, W122L;또는 L31Q, N80D, K82L;또는 L31Q, N80D, I86S, G121G;또는 L31Q, N80D, I86A, R130Q;또는 M27H, L31Q, N80D;또는 L31Q, N80D, W122L, A207E;또는 L31Q, N80D, W122L, R130L;또는 L31Q, N80D, K82E;또는 L31Q, N80D, G121E;또는 L31Q, N80D, W122L, R130R;또는 L31Q, I77M, N80D;또는 L31Q, N80D, K82T;또는 L31Q, N80D, W122L;또는 L31Q, N80D, W122H;또는 L31Q, N80D, Q167T;또는 L31Q, I77H, N80D;또는 L31Q, N80D, G121K;또는 L31Q, I77Q, N80D;또는 L31Q, N80D, W122L, R130N;또는 L31Q, N80D, W122L;또는 L31Q, N80D, G121D;또는 L31Q, N80D, R130T;또는 L31Q, N80D, R130T;또는 L31Q, N80D, K82M;또는 L31Q, N80D, Q167H;또는 L31Q, N80D, I86T;또는 L31Q, N80D, Q167I;또는 L31Q, N80D, I86C;또는 L31Q, N80D, Q167G;또는 M27L, L31Q, N80D;또는 L31Q, N80D, I86S, G121R;또는 L31Q, I77S, N80D;또는 L31Q, I77C, N80D;또는 L31Q, N80D, G121N;또는 L31Q, I77A, N80D;또는 L31Q, N80D, R130M;또는 L31Q, N80D, W122F;또는 M27G, L31Q, N80D;또는 L31Q, N80D, K82G;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L, R130K;또는 L31Q, N80D, R130A;또는 L31Q, N80D, I86I;또는 L31Q, I77E, N80D;또는 L31Q, N80D, D227L;또는 L31Q, N80D, V85H, N215G;또는 L31Q, N80D, I86A, W122L, R130N;또는 L31Q, I77R, N80D;또는 L31Q, N80D, I86F;또는 L31Q, N80D, I86Y, W122L;또는 M27K, L31Q, N80D;또는 L31Q, N80D, D227C;또는 L31Q, N80D, R130L;또는 L31Q, N80D, I86C, W122L;또는 L31Q, N80D, Q167L;또는 L31Q, N80D, V85H;또는 L31Q, N80D, Q167M;또는 M27D, L31Q, N80D;또는 L31Q, N80D, I86L;또는 L31Q, N80D, Y230A;또는 L31Q, N80D, W122R;또는 L31Q, N80D, Y230G;또는 L31Q, N80D, D227S;또는 L31Q, N80D, W122L, A207E, N289P;또는 L31Q, N80D, W122Y;또는 L31Q, N80D, I86L, W122L;또는 L31Q, N80D, K82R, I86S, G121S, R130Q;또는 L31Q, Y74W, N80D;또는 L31Q, N80D, R130F;또는 L31Q, N80D, G121V;또는 L31Q, N80D, W122L, R130M;또는 L31Q, N80D, R130V;또는 L31Q, N80D, Y230V;또는 L31Q, N80D, N215G;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L, R130N;또는 L31Q, N80D, Y230R;또는 M27E, L31Q, N80D;또는 L31Q, N80D, Y230I;또는 L31Q, N80D, I86S, W122L, R130S;또는 L31Q, N80D, K82R;또는 L31Q, N80D, D227E;또는L31Q, N80D, K82R, I86A, G121S;또는 L31Q, N80D, R130G;또는 L31Q, I77V, N80D;또는 L31Q, N80D, G121G;또는 L31Q, N80D, Y230T;또는 L31Q, N80D, K82R, I86S, R130N;또는 L31Q, N80D, D227F;또는 L31Q, N80D, I86A, G121R;또는 L31Q, N80D, I86S, R130N;또는 L31Q, N80D, W122C;또는 L31Q, N80D, Y230S;또는 L31Q, N80D, R130Y;또는 L31Q, N80D, R130C;또는 L31Q, I77L, N80D;또는 A119T, N80D;또는 A199A, N80D; G67A, N80D, V85H이다.
상기 위치는 서열번호: 68 또는 서열번호: 16의 모 서열 배열에 의해 확인 될 수 있다.
변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 모 서열 지질 아실 트랜스퍼라제의 31번 위치의 변형 선택적으로는 27, 77, 80, 82, 85, 85, 86, 121, 122, 130, 167, 207, 227, 230 및 289 위치의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 추가적 변형을 제외하고는 일치한다. 상기 위치는 서열번호: 68 또는 서열번호: 16의 모 서열 배열에 의해 확인 될 수 있다
변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 모 서열 지질 아실 트랜스퍼라제의 31번 위치의 변형 선택적으로는 86, 122 또는 130 위치의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기의 추가적 변형을 제외하고는 일치한다. 상기 위치는 서열번호: 68 또는 서열번호: 16의 모 서열 배열에 의해 확인 될 수 있다
하나의 실시태양에서 모 서열이 서열번호: 16 또는 서열번호: 68의 서열이거나 모 서열이 서열번호: 49 또는 서열번호: 69에 의해 암호화된 서열인 경우 변이 폴리펩타이드는 80번 위치의 변형을 제외하고는 상기 기재된 어느 하나의 변형을 지닐 수 있다. 이점에서 서열번호: 16 및 서열번호: 68의 서열 또는 서열번호: 49 또는 서열번호: 69에 의해 암호화된 폴리펩타이드의 서열은 80번 위치에 이미 아스파트산을 지닌 것으로 이들 서열은 서열번호: 16의 모 서열의 배열에 의해 확인 될 수 있다.
바람직한 변이 지질 아실 트랜스퍼라제 또는 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 적어도 모 서열 지질 아실 트랜스퍼라제 75% 이상 상동성을 지닌 것으로 바람직하게는 적어도 75% 이상, 적어도 80% 이상, 적어도 85% 이상, 적어도 90% 이상, 적어도 95% 이상 또는 적어도 98% 이상의 모 서열과 상동성을 지닌 것이다.
본 발명은 지질 아실 트랜스퍼라제 활성을 지닌 변이 폴리펩타이드에 관한 것으로 이 때 변이 폴리펩타이드는 모 서열 지질 아실 트랜스퍼라제와 비교 시 적어도 31번 위치에 변형을 지니는 것으로 이 때 31번 위치는 서열번호: 68 또는 서열번호: 16의 배열을 통해 확인 할 수 있는 것이다.
하나의 실시태양에서 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 다음 변형 및/또는 본 발명의 방법에 따른 변형을 지니는 것이다.
L31Q, N80D, W122L (골격의 80번 위치의 D는 이미 치환되었을 경우 L31Q, W122L으로 표시 될 수 있다) M27V, L31Q, N80D (골격의 80번 위치의 D는 이미 치환되었을 경우 N27V, L31Q으로 표시 될 수 있다) L31Q, N80D, K82R, I86A (골격의 80번 위치의 D는 이미 치환되었을 경우 L31Q, K82R, I86A으로 표시 될 수 있다) 및/또는 L31Q, N80D, I86S, W122F (골격의 80번 위치의 D는 이미 치환되었을 경우 L31Q, I86S, W122F으로 표시 될 수 있다).
개선된 성능
본 발명에 사용되는 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 모 서열(골격) 또는 변형되지 않은 지질 아실 트랜스퍼라제와 비교시 적어도 하나 이상의 개선된 성능을 지닌다.
본 명세서에 사용되는 '개선된 성능'이라는 용어는 a)지질 아실 트랜스퍼라제의 변화된 기질 특이성, 예를 들면 i)특정 화합물을 수용체로 사용할 수 있는 변화된 효소 능력으로 예를 들면 수용체 분자로써 카보하이드레이트를 사용할 수 있는 개선된 능력으로 이에 따라 카보하이드레이트 에스테르를 생성하는 효소능력이 향상된다, 또는 ii)포화 또는 불포화지방산을 기질로 사용할 수 있는 변화된 능력, 또는 iii)지질 기질의 Sn1 또는 Sn2 위치로부터 지방산을 이용할 수 있는 변이 지질 아실 트랜스퍼라제의 변화된 특이성, 또는 iv)변이효소내의 기질 사슬 길이 특이성의 변화; b)변화된 효소의 카이네틱스; 및/또는 c)아실 트랜스퍼라제 반응을 수행하기 위한 지속적이거나 향상된 효소능력에 반해 가수분해 반응을 더 낮추는 변이 지질 아실 트랜스퍼라제의 활성 등이다.
또 다른 개선된 성능은 예를 들면 pH 및/또는 온도 안정성 및/또는 계면활성 및/또는 산화 안정성의 개선 및/또는 변화에 관련되어있다. 실제로 본 발명에 따른 방법에 의해 변이 지질 아실 트랜스퍼라제를 생성한다면 pH, 온도, 단백질 안정성, 계면 안정성 및/또는 산화 안정성 중 하나 또는 그 이상이 다양한 정도의 안정성을 지닌 효소로 간주된다.
야생형(예를 들면 모 지질 아실 트랜스퍼라제) 및 변이형(예를 들면 변이 지질 아실 트랜스퍼라제) 단백질의 특성은 관심있는 특성에 기반한 여러 가지 방법에 의해 성취 될 수 있다.
변이 효소 측면에서 모 효소와 비교 시 개선된 트랜스퍼라제 활성 또는 동등하거나 감소된 가수분해 활성을 나타낸다. 다시 표현하면 적합한 변이 효소는 모 효소에 비해 하이드로릭 활성(예를 들면 트랜스퍼라제 : 가수분해활성)보다 더 높은 트랜스퍼라제 활성을 지니는 것이다. 적합한 변이 효소는 인지질 갈락토지질 또는 트리아실글리세롤을 포함하는 지질로부터 아실 수용체에 아실 그룹을 효과적으로 이전할 수 있으며 이는 지질의 단순 가수분해보다 높은 것이다.
본 발명에 사용된 적합한 지질 아실 트랜스퍼라제는 모 효소에 비해 극성 지질 위에 향상된 효소활성을 지닌 변이체이다. 극성 지질은 바람직하게는 인지질 및/또는 글리코지질이다. 바람직한 변이체는 라이소-극성 지질에는 낮거나 전혀 활성을 지니지 않는 변이체이다. 극성 지질 바람직하게는 인지질 및/또는 글리코지질에 향상된 활성을 나타냄으로써 가수분해 및/또는 트랜스퍼라제 활성 또는 이들 모두를 증가시킬 수 있다. 극성 지질에 대한 향상된 바람직한 활성은 트랜스퍼라제 활성의 증가이다.
본 발명에 사용하는 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 트리글리세라이드 및/또는 모노글리세라이드 및/또는 다이글리세라이드에 모 효소에 비해 감소된 활성을 나타낸다.
더욱 바람직하게는 변이 효소는 트리글리세라이드 및/또는 모노글리세라이드 및/또는 다이글리세라이드에 전혀 활성을 나타내지 않는 것이다.
세트의 정의
아미노산 세트 1:
아미노산 세트 1은 도 53 및 도 54의 1IVN에 나타난 아미노산이다.
Gly8, Asp9, Ser10, Leu11, Ser12, Tyr15, Gly44, Asp45, Thr46, Glu69, Leu70, Gly71, Gly72, Asn73, Asp74, Gly75, Leu76, Gln106, Ile107, Arg108, Leu109, Pro110, Tyr113, Phe121, Phe139, Phe140, Met141, Tyr145, Met151, Asp154, His157, Gly155, Ile156, Pro158
세트 1으로부터 및줄 친 부분은 매우 보존적인 모티프를 나타내는 것으로 예를 들면 GDSx와 촉매활성 잔기이다. 의심할 바 없이 세트 1은 1IVN 모델의 활성 사이트 내의 글리세롤 중심 탄소 원자의 10Å 이내의 아미노산 잔기를 의미한다.
아미노산 세트 2:
아미노산 세트 2는 P10480 성숙된 서열 내의 아미노산을 언급하는 것으로 아미노산 번호가 기재되어있다.
Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289 and Val290.
세트 1과 세트 2 간의 선택된 잔기를 다음 표 4 및 표 5에 비교하였다.
IVN 모델
IVN A.hyd 상동성		 P10480
성숙된 서열 잔기 번호
PFAM 구조
Gly8 Gly32
Asp9 Asp33
Ser10 Ser34
Leu11 Leu35 Leu17
Ser12 Ser36 Ser18
Lys22
Met23
Tyr15 Gly58 Gly40
Gly44 Asn98 Asn80
Asp45 Pro99 Pro81
Thr46 Lys100 Lys82
Asn87
Asn88
Glu69 Trp129 Trp111
Leu70 Val130 Val112
Gly71 Gly131
Gly72 Ala132 Ala114
Asn73 Asn133
Asp74 Asp134
Gly75 Tyr135 Tyr117
Leu76 Leu136 Leu118
Gln106 Pro174 Pro156
Ile107 Gly177 Gly159
Arg108 Gln178 Gln160
Leu109 Asn179 Asn161
Pro110 180 to 190 Pro162
Try113 Ser163
Ala164
Arg165
Ser166
Gln167
Lys168
Val169
Val170
Glu171
Ala172
Phe121 His198 Tyr197 Try179
His198 His180
Asn199 Asn181
Phe139 Met227 Met209
Phe140 Leu228 Leu210
Met141 Arg229 Arg211
Tyr145 Asn233 Asn215
Lys284
Met151 Met303 Met285
Asp154 Asp306
Gly155 Gly307 Gln289
Ile156 Val308 Val290
His157 His309
Pro158 Pro310
아미노산 세트 3:
아미노산 세트 3은 아미노산 세트 2와 동일한 것으로 다만 코딩 서열이 Aeromonas salmonicida (서열번호: 35)를 의미한다. 즉 세트 3은 18개의 추가적 아미노산 잔기를 포함하고 이는 성숙된 단백질(서열번호: 35) 서열에 비해 시그널 시퀀스(서열번호: 4)를 포함하는 단백질의 서열번호간의 차이를 반영하는 것이다.
Aeromonas salmonicida에서 성숙된 단백질의 GDSX (서열번호: 35)와 Aeromonas hydrophila에서 성숙된 단백질의 GDSX (서열번호: 34)는 다섯 개 아미노산이 상이하다. 이는 Thr3Ser, LYS182Gln, Glu309Ala, Thr310Asn 및 Gly318- 또한 salmonicida 잔기는 먼저 리스트되어 있고 hydrophila 잔기는 그 뒤에 리스트 되어있다. hydrophila 단백질은 오직 317 아미노산 잔기로 되어 있으며 318 위치에 잔기는 결핍되어 있다. Aeromonas salmonicida GDSX는 갈락토리피드 기질과 같은 극성 지질에서 hydrophila 단백질에 비해 상대적으로 높은 활성을 나타내고 모든 5개의 아미노산 위치에서 위치 스캐닝을 행하였다.
아미노산 세트 4:
아미노산 세트 4는 S3, Q182, E309, S310, 및 -318이다.
아미노산 세트 5:
F13S, D15N, S18G, S18V, Y30F, D116N, D116E, D157 N, Y226F, D228N Y230F이다.
아미노산 세트 6:
아미노산 세트 6는 Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn 87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318이다.
아미노산 세트 6에서 아미노산 번호는 P10480(서열번호: 3)내의 아미노산 잔기를 의미한다. -다른 서열 골격내의 상응하는 아미노산은 P10480 및/또는 1IVN의 구조 배열 및/또는 상동성 배열에 의해 결정될 수 있다.
아미노산 세트 7:
아미노산 세트 7은 Ser3, Leu17, Lys22, Met23, Gly40, Asn80, Pro81, Lys82, Asn 87, Asn88, Trp111, Val112, Ala114, Tyr117, Leu118, Pro156, Gly159, Gln160, Asn161, Pro162, Ser163, Ala164, Arg165, Ser166, Gln167, Lys168, Val169, Val170, Glu171, Ala172, Tyr179, His180, Asn181, Gln182, Met209, Leu210, Arg211, Asn215, Lys284, Met285, Gln289, Val290, Glu309, Ser310, -318, Y30X (여기서 X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W에서 선택된다), Y226X (여기서 X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W에서 선택된다), Y230X (여기서 X는 A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, 또는 W에서 선택된다), S18X (여기서 X는 A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W 또는 Y에서 선택된다), D157X (여기서 X는 A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y에서 선택된다).
아미노산 세트 7의 번호는 P10480 (서열번호: 3)내의 아미노산 잔기를 의미한다. -다른 서열 골격내의 상응하는 아미노산은 P10480 및/또는 1IVN의 구조 배열 및/또는 상동성 배열에 의해 결정될 수 있다.
적합한 변이 효소는 모 효소에 비해 다음의 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형을 포함하는 것이다. S3E, A, G, K, M, Y, R, P, N, T 또는 G /또는 E309Q, R 또는 A, 바람직하게는 Q 또는 R /또는 -318Y, H, S 또는 Y, 바람직하게는 Y이다.
바람직하게는 GDSX 모티프의 X는 L이다. 따라서 모 효소는 GDSL 아미노산 모티프를 포함한다.
바람직하게는 첫 번째 모 지질 아실 트랜스퍼라제는 다음의 아미노산 서열 중에 어느 하나인 것이다. 서열번호: 34, 서열번호: 3, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 1, 서열번호: 15, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 33 또는 서열번호: 35이다.
바람직하게는 두 번째 지질 아실 트랜스퍼라제는 다음의 아미노산 서열 중에 어느 하나인 것이다. 서열번호: 3, 서열번호: 34, 서열번호: 4, 서열번호: 5, 서열번호: 6, 서열번호: 7, 서열번호: 8, 서열번호: 9, 서열번호: 10, 서열번호: 11, 서열번호: 12, 서열번호: 13, 서열번호: 14, 서열번호: 1, 서열번호: 15, 서열번호: 25, 서열번호: 26, 서열번호: 27, 서열번호: 28, 서열번호: 29, 서열번호: 30, 서열번호: 32, 서열번호: 33 또는 서열번호: 35이다.
변이 효소는 모 효소에 비해 적어도 하나 이상의 아미노산 변형을 포함한다. 하나의 실시태양에서 변이 효소는 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개, 바람직하게는 적어도 6개, 바람직하게는 적어도 7개, 바람직하게는 적어도 8개, 바람직하게는 적어도 9개, 더욱 바람직하게는 적어도 10개의 모 효소에 비해 아미노산 변형을 포함한다.
본 명세서 내에서 언급되는 아미노산 잔기는 서열번호: 34 또는 서열번호: 35로 나타난 참조서열에 대한 변이 서열의 배열을 나타내는 것이다.
한 측면에서 바람직한 변이 효소는 다음 아미노산 치환의 하나 또는 그 이상을 포함한다.
S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y; 및/또는
L17A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
S18A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, W 또는 Y; 및/또는
K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 및/또는
M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
Y30A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V또는 W; 및/또는
G40A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
K82A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
W111A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 및/또는
V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W또는 Y; 및/또는
A114C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
Y117A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V또는 W; 및/또는
L118A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
P156A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
G159A, C, D, E, F, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
Q160A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
N161A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
P162A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
S163A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W또는 Y; 및/또는
A164C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
R165A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
S166A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W또는 Y; 및/또는
Q167A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
K168A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
V169A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W또는 Y; 및/또는
V170A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W또는 Y; 및/또는
E171A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
A172C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V또는 W; 및/또는
H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
N181A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
Q182A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W또는 Y, 바람직하게는 K; 및/또는
M209A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
L210 A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
R211 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
N215 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
Y226A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V또는 W; 및/또는
Y230A, C, D, E, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W; 및/또는
K284A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
M285A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
V290A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W또는 Y; 및/또는
E309A, C, D, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W또는 Y; 및/또는
S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W, 또는 Y이다.
덧붙여 C-말단 연장이 여기에 하나 또는 그 이상 가능하다. 바람직한 C-말단 추가 연장은 하나 또는 그 이상의 사슬형 아미노산을 포함한다. 바람직하게는 I, L, V 또는 G와 같은 비극성 아미노산이다. 따라서 본 발명의 변이 효소는 318I, 318L, 318V, 318G와 같은 C-말단 연장을 하나 또는 그 이상 포함할 수 있다.
바람직한 변이 효소는 감소된 포스파티딜콜린(PC)와 같은 인지질에 대한 가수분해활성을 나타내는 것이며 이는 인지질로부터 증가된 트랜스퍼라제 활성을 나타내는 것이다.
바람직한 변이 효소는 포스파티딜콜린(PC)와 같은 인지질에 대한 증가된 트랜스퍼라제 활성을 나타내고 이는 인지질에 대한 증가된 가수분해활성을 또한 나타낸다.
다음 잔기의 하나 또는 그 이상의 변형이 변이 효소가 인지질에 대한 월등히 향상된 트랜스퍼라제 활성을 야기시킨다.
S3, D157, S310, E309, Y179, N215, K22, Q289, M23, H180, M209, L210, R211, P81, V112, N80, L82, N88; N87이다.
인지질로부터 향상된 트랜스퍼라제 활성을 지니는 변이 효소를 다음과 같은 바람직한 변형을 통해 이룩할 수 있으며 이는 다음에 기재된 하나 또는 그 이상에서 선택된 것이다.
S3A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 N, E, K, R, A, P 또는 M, 더욱 바람직하게는 S3A;
D157A, C, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 D157S, R, E, N, G, T, V, Q, K 또는 C;
S310A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 S310T -318 E;
E309A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 E309 R, E, L, R 또는 A;
Y179A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, V 또는 W; 바람직하게는 Y179 D, T, E, R, N, V, K, Q 또는 S, 더욱 바람직하게는 E, R, N, V, K 또는 Q;
N215A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 N215 S, L, R 또는 Y;
K22A, C, D, E, F, G, H, I, L, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 K22 E, R, C 또는 A;
Q289A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 Q289 R, E, G, P 또는 N;
M23A, C, D, E, F, G, H, I, K, L N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 M23 K, Q, L, G, T 또는 S;
H180A, C, D, E, F, G, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 H180 Q, R 또는 K;
M209 A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 M209 Q, S, R, A, N, Y, E, V 또는 L;
L210A, C, D, E, F, G, H, I, K, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 L210 R, A, V, S, T, I, W 또는 M;
R211A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 R211T;
P81A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 P81G;
V112A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, N, P, Q, R, S, T, W 또는 Y; 바람직하게는 V112C;
N80A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 N80 R, G, N, D, P, T, E, V, A 또는 G;
L82A, C, D, E, F, G, H, I, M, N, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 L82N, S 또는 E;
N88A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 N88C;
N87A, C, D, E, F, G, H, I, K, L, M, P, Q, R, S, T, V, W 또는 Y; 바람직하게는 N87M 또는 G;
하나 또는 그 이상의 다음 잔기의 바람직한 변형이 변이 효소가 더욱 향상된 인지질에 대한 트랜스퍼라제 활성을 야기시킨다.
S3 N, R, A, G / M23 K, Q, L, G, T, S / H180 R /
L82 G / Y179 E, R, N, V, K 또는 Q / E309 R, S, L 또는 A
바람직한 변형은 N80D이다. 이는 서열번호: 35의 참조서열을 골격으로 사용할 때 특히 중요하다. 따라서 참조서열은 서열번호: 16 일 수도 있다. 이러한 변형에 하나 또는 그 이상의 추가적 변형을 결합시킬 수 있다. 따라서 본 발명의 바람직한 실시태양에서 본 발명에 사용되는 방법과 용도를 위한 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 35로 나타내는 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 서열일 수 있다. 또는 서열번호: 35와 75% 이상의 상동성, 85% 이상의 상동성, 90% 이상의 상동성, 95% 이상의 상동성, 98% 이상의 상동성, 99% 이상의 상동성을 지닌 서열일 수 있다.
상기한 바와 같이 본 명세서 내에서 특정 아미노산 잔기의 번호는 서열번호: 34 또는 서열번호: 35의 참조서열의 배열로부터 얻어진 변이 서열이다.
참고로 본 발명의 방법 또는 용도에 사용하는 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 서열번호: 16으로 나타난 아미노산 서열을 포함하는 지질을 코드화한 서열이거나 서열번호: 16 또는 서열번호: 68의 75% 이상의 상동성, 85% 이상의 상동성, 90% 이상의 상동성, 95% 이상의 상동성, 98% 이상의 상동성, 99% 이상의 상동성을 지닌 서열일 수 있다.
바람직한 실시태양에서 변이 효소는 서열번호: 70, 서열번호: 71 또는 서열번호: 72의 하나의 서열을 포함한다.
상동성의 정도는 동일한 서열 요소에 기인한다. 본 발명에 따른 아미노산 상동성의 정도는 이미 알려진 Vector NTI 10 (Invitrogen Corp.)과 같은 컴퓨터 프로그램을 통해 적합하게 결정될 수 있다. 또한 각각의 배열 코어는 바람직하게는 BLOSUM62를 통해 결정할 수 있으며 이는 갭 오픈 페널티 10.0과 갭 익스텐션 페널티 0.1 사이에 있다.
아미노산 서열에 관한 상동성의 정도는 적어도 20개의 연속적 아미노산 바람직하게는 적어도 30개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 적어도 40개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 적어도 50개의 연속적 아미노산, 바람직하게는 적어도 60개의 연속적 아미노산의 배열을 통해 결정한다.
아미노산 서열에 관한 상동성의 정도는 전체 서열을 통해 결정한다.
본 발명에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제 또는 지질 아실 트랜스퍼라제 효소를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같은 미생물 하나 또는 그 이상으로부터 유래할 수 있다. Aeromonas, Streptomyces, Saccharomyces, Lactococcus, Mycobacterium, Streptococcus, Lactobacillus, Desulfitobacterium, Bacillus, Campylobacter, Vibrionaceae, Xylella, Sulfolobus, Aspergillus, Schizosaccharomyces, Listeria, Neisseria, Mesorhizobium, Ralstonia, Xanthomonas, Candida, Thermobifida 및 Corynebacterium이다.
본 발명에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제 또는 지질 아실 트랜스퍼라제 효소를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같은 미생물 하나 또는 그 이상으로부터 유래할 수 있다. Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Streptomyces coelicolor, Streptomyces rimosus, Mycobacterium, Streptococcus pyogenes, Lactococcus lactis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus thermophilus, Streptomyces thermosacchari, Streptomyces avermitilis Lactobacillus helveticus, Desulfitobacterium dehalogenans, Bacillus sp, Campylobacter jejuni, Vibrionaceae, Xylella fastidiosa, Sulfolobus solfataricus, Saccharomyces cerevisiae, Aspergillus terreus, Schizosaccharomyces pombe, Listeria innocua, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitidis, Mesorhizobium loti, Ralstonia solanacearum, Xanthomonas campestris, Xanthomonas axonopodis, Candida parapsilosis, Thermobifida fusca 및 Corynebacterium efficiens이다.
본 발명에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제 또는 지질 아실 트랜스퍼라제 효소를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 다음과 같은 미생물 하나 또는 그 이상으로부터 유래할 수 있다. Aeromonas 속, Aeromonas hydrophila 또는 Aeromonas salmonicida이다.
본 발명에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제 또는 지질 아실 트랜스퍼라제 효소는 다음과 같은 미생물 하나 또는 그 이상으로부터 유래할 수 있다. Aeromonas 속, Aeromonas hydrophila 또는 Aeromonas salmonicida이다.
본 발명에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제의 효소 기능은 다음과 같은 에세이를 사용하여 확인할 수 있다.
본 명세서 내에 사용하는 '트랜스퍼라제'라는 용어는 '지질 아실 트랜스퍼라제'라는 용어와 교환하여 사용할 수 있다.
본 명세서 내의 지질 아실 트랜스퍼라제는 다음과 같은 작용, 인터에스테르화, 트랜스에스테르화, 알코올분해, 가수분해 등의 작용을 하는 효소를 의미한다.
'인터에스테르화'라는 용어는 지질 도너가 유리 아실 그룹이 아닌 경우 아실 그룹을 지질 도너 및 지질 수용체간에 이전하는 효소 촉매 활성을 의미한다.
'트랜스에스테르화'라는 용어는 지질 도너 (유리 지방산이 아닌)의 아실 그룹을 (물이 아닌) 아실 수용체에 이전하는 효소 촉매 활성을 의미한다.
'알코올분해'라는 용어는 알코올 ROH의 작용에 의해 산 유도체의 공유 결합을 효소 분해하는 것을 의미하며 이는 알코올의 H와 결합하는 하나의 프로덕트와 알코올의 OR 그룹과 결합하는 또 다른 프로덕트에 의해 수행되는 것이다.
본 명세서 내의 '알코올'이라는 용어는 하이드록시그룹을 포함하는 알킬화합물을 의미한다.
본 명세서 내의 '가수분해'라는 용어는 지질의 아실 그룹을 물 분자의 OH 그룹에 이전하는 효소 촉매 활성을 의미한다.
본 명세서 내의 '유리 지방산을 실질적으로 증가시키지 않거나 또는 증가시키지 않는'이라는 용어는 본 발명에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제가 바람직하게는 100% 트랜스퍼라제 활성을 지님을 의미한다. 이는 아실 도너로부터 100%의 아실 그룹이 가수분해 활성없이 아실 수용체에 이전되는 것을 의미한다. 그러나 현실적으로는 지질 아실 도너내의 100%보다 작은 아실 그룹이 아실 수용체로 이전 될 수 있다. 이 경우 바람직한 아실 트랜스퍼라제 활성은 적어도 5%, 바람직하게는 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 40%, 바람직하게는 적어도 50%, 바람직하게는 적어도 60%, 바람직하게는 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 80%, 바람직하게는 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 98%의 총 효소활성을 지니는 것이다. %트랜스퍼라제 활성 즉 총 효소활성에 대한 트랜스퍼라제 활성의 퍼센티지가 다음 Assay for Transferase Activity에 의해 결정될 수 있다.
본 발명의 한 측면에서 '유리 지방산을 실질적으로 증가시키지 않는'이라는 용어는 본 발명에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제에 의해 처리된 식용유내의 유리 지방산 함량이 본 발명에 사용된 지질 아실 트랜스퍼라제가 아닌 다른 효소를 사용할 때 식용유 내에 생성되는 유리 지방산의 함량보다 적음을 의미하는 것이고 예를 들면 종래 포스포리파아제 효소인 Lecitase Ultra™ (Novozymes A/S, Denmark)를 사용한 것 보다 유리 지방산이 적게 생성됨을 의미하는 것이다.
결합
본 발명에 따른 효소는 다른 하나 또는 그 이상의 적합한 효소와 함께 사용할 수 있다. 따라서 본 발명의 범위 내에서 본 발명에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제 효소는 적어도 하나의 반응 조성물 내에 존재하는 또 다른 효소 일 수 있다. 이와 같은 추가 효소는 예를 들면 엔도-또는 엑소아밀라제와 같은 전분 분해효소, 플루라나아제, 디브랜칭 효소, 자일라나제를 포함하는 헤미셀룰라제, 퍼옥시다제와 같은 옥시도리덕타제, 페놀 옥시다제, 글루코오즈 옥시다제, 피라노즈 옥시다제, 설푸하이드릴 옥시다제, 말토오즈를 산화시키는 것과 같은 탄수화물 옥시다제, 헥소오즈 옥시다제(HOX), 리파아제, 포스포리파아제, 글리코리파아제, 갈락토리파아제 및 프로테아제를 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서 본 발명의 지질 아실 트랜스퍼라제는 다음 리파아제 활성을 지닌 하나 또는 그 이상의 리파아제와 결합할 수 있다. 글리코리파아제 활성(E.C. 3.1.1.26) 트리아실글리세롤 리파아제 활성 (E.C. 3.1.1.3), 포스포리파아제 A2 활성 (E.C. 3.1.1.4) 또는 포스포리파아제 A1 활성 (E.C. 3.1.1.32)이다. 적합한 지방분해 효소는 이미 잘 알려져 있으며 예를 들면 다음과 같은 효소를 들 수 있다. LIPOPAN? F, LIPOPAN® XTRA 및/또는 LECITASE? ULTRA (Novozymes A/S, Denmark), 포스포리파아제 A2 (예를 들면 Biocatalysts사의 LIPOMOD 22L 포스포리파아제 A2, Genencor사의 LIPOMAX), LIPOLASE (Novozymes A/S, Denmark), YIELDMAX (Chr. Hansen, Denmark), PANAMORE (DSM) 또는 WO 03/97835, EP 0 977 869 또는 EP 1 193 314에 개시된 리파아제 등이다.
본 발명에 사용할 수 있는 지질 아실 트랜스퍼라제는 포스포리파아제 A1, 포스포리파아제 A2, 포스포리파아제 B, 포스포리파아제 C 및/또는 포스포리파아제 D와 같은 포스포리파아제 존재 하에 사용할 수 있다.
지질 아실 트랜스퍼라제와 하나 이상의 적합한 효소의 사용은 연속하여 또는 동시에 사용할 수 있으며 예를 들면 지질 아실 트랜스퍼라제의 처치는 하나 또는 그 이상의 적합한 효소 처치 이전, 동시 또는 연이어 수행할 수 있다.
연속적인 효소 처치의 경우 어떠한 실시 태양에서 첫 번째 사용된 효소를 제거하는 것이 유리하며 예를 들면 열불활화 또는 고정화된 효소의 사용을 두 번째 또는 세 번째 효소의 처치 이전에 행한다.
추가적 효소의 존재는 정교한 효소 추가의 결과이며 추가적 효소는 이전 반응에서 인지질 조성물이 노출된 결과에 따라 잔류수준 또는 오염수준의 존재에 의한 것일 수도 있다.
후-전사 및 후-번역 변형
본 발명에 따른 적합한 지질 아실 트랜스퍼라제는 뉴클레오타이드 서열 어느 하나에 의해 코드화 된 것이다.
사용되는 숙주세포에 따라 후-전사 및/또는 후-번역 변형이 이루어 질 수 있다. 본 발명의 방법 또는 용도에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제는 후-전사 및/또는 후-번역 변형을 수행할 수 있는 지질 아실 트랜스퍼라제를 포함한다.
예를 들면 도 45에 나타난 숙주세포(예를 들면 Bacillus licheniformis와 같은)내에서 서열번호: 49의 뉴클레오타이드 서열의 발현은 서열번호: 68로 나타난 아미노산 서열에 후-전사 및/또는 후-번역 변형을 야기한다.
서열번호: 68은 서열번호: 16과 동일한 것으로 다만 서열번호: 68은 약간의 아미노산 더욱 상세하게는 38개의 아미노산을 제거하기 위한 후-전사 및/또는 후-번역 변형을 수행하는 것이다. 특히 분자의 N-말단 및 C-말단 부분은 두 개의 시스테인에 의한 S-S 브릿지로 공유 연결되어 있다. 서열번호: 38의 아미노산 잔기 236과 아미노산 잔기 236은 후-번역 변형에 의해 연결된 공유결합이 아니다. 두 개의 펩타이드는 하나 또는 그 이상의 S-S 브릿지에 의해 함께 형성된다.
후-전사 및/또는 후-번역 변형의 정밀한 분리 사이트는 조금씩 변화할 수 있으며 예를 들면 오직 38개 아미노산의 제거(서열번호: 16에 비해 서열번호: 68의 경우)와 같이 적게 변화한다. 이는 분리 사이트가 몇 개 잔기 예를 들면 1,2 또는 3개 잔기 이동될 수 있으며 이는 서열번호: 16에 비교한 서열번호: 68의 서열내의 분리 사이트를 비교함으로써 인지할 수 있다. 다시 말하면 235-ATR 위치에서 273 (RRSAS) 위치로 분리는 예를 들면 232, 233, 234, 235, 236, 237 또는 238 잔기에서 시작하여 분리될 수 있다. 한편 분리는 약 38개의 아미노산을 제거할 수 있으며 어떤 경우에는 30 내지 45개 잔기 또는 34 내지 42개 잔기, 36 내지 40개 잔기 바람직하게는 38개의 잔기를 제거할 수 있다.
분리
한 측면에서 지질 아실 트랜스퍼라제는 회수/분리된 지질 아실 트랜스퍼라제이다. 따라서 생성된 지질 아실 트랜스퍼라제는 분리된 형태이다.
'분리'라는 용어는 적어도 하나의 다른 성분으로부터 실질적으로 분리되어 있는 단백질 서열을 의미하고 이는 자연 상태에서 결합되거나 발견되는 단백질 서열에서 다른 성분을 실질적으로 분리한 것이다.
하나의 측면에서 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 반응 혼합물 또는 반응 조성물내의 다른 성분으로부터 분리된 것이다. 이는 '분리'라는 용어는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르가 반응 혼합물 또는 반응 조성물 내의 다른 성분으로부터 적어도 유리된 것을 의미하거나 적어도 실질적으로 다른 성분으로부터 유리될 수 있는 처치를 행함을 의미한다.
한 측면에서 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 분리된 형태이다.
정제
한 측면에서 지질 아실 트랜스퍼라제는 정제된 형태이다.
또 다른 측면에서 본 발명에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 정제된 형태이다.
또 다른 측면에서 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 정제된 형태이다.
'정제된'이라는 용어는 효소 또는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르가 상대적으로 순수함을 의미하며 이는 적어도 51% 순도 또는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 순수한 것을 의미한다.
하나의 측면에서 '정제'라는 용어는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르가 상대적으로 순수함을 의미하며 이는 적어도 51% 순도 또는 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 순수한 것을 의미한다.
식품
본 명세서 내에서 '식품'이라는 용어는 인간 및/또는 동물의 소비에 적합한 물질을 의미한다. 따라서 '식품'이라는 용어는 '사료'라는 의미를 포함하는 것이다.
본 명세서 내에서 '식품'이라는 용어는 바람직하게는 소비할 수 있도록 식품의 형태를 갖춘 것을 의미한다. 한편 그러나 본 명세서에 사용되는 '식품'이라는 용어는 식품을 제조하는데 사용되는 하나 또는 그 이상의 물질을 의미할 수 있다. 예를 들면 '식품'이라는 용어는 도우로부터 생성된 베이크된 물품뿐만 아니라 상기 베이크된 물품의 제조를 위해 사용되는 도우에 필요한 물질을 포괄하는 의미로 사용된다.
본 발명의 바람직한 측면에서 식품은 하기 기재된 물품으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 식품을 의미한다. 달걀, 예를 들면 마요네즈, 샐러드 드레싱, 소스, 아이스크림, 에그 파우더 또는 난황 가공품과 같은 에그 기반물품; 빵, 케이크, 스위트 도우 제품, 라미네이트화 도우, 리퀴드 배터, 머핀, 도너츠, 비스켓, 크래커 또는 쿠키와 같은 베이크 제품; 초콜렛, 캔디, 캐러멜, 할라와, 무설탕 껌, 설탕껌, 버블껌, 소프트 버블껌, 츄잉껌을 포함하는 껌류 또는 푸딩과 같은 제과류; 소르벳을 포함하는 냉동식품, 아이스크림을 포함하는 냉동유제품 또는 아이스밀크; 치즈, 버터, 우유, 커피크림, 위핑크림, 카스타드크림, 밀크 드링크 또는 요구르트와 같은 유제품; 무스, 위핑베지터블크림, 육가공 제품을 포함하는 육류제품; 식용유 및 식용지방, 통기 및 비통기성 위핑제품, 수-상 에멀젼, 유-상 에멀젼, 마가린, 쇼트닝 저지방 및 최소지방 스프레드; 드레싱, 마요네즈, 딥, 크림베이스 소스, 크림베이스 수프, 음료, 스파이스 에멀젼 및 소스 등이다.
본 발명에 따른 적합한 식품은 케이크, 페스트리, 제과류, 초콜렛, 퍼지와 같은 가공식품을 포함한다.
본 발명에 따른 식품은 도우제품 또는 빵, 튀김류, 스낵, 케이크, 파이, 브라우니, 쿠키, 누들, 크래커와 같은 스낵제품, 그라함 스내커, 프레젤, 감자칩 및 파스타와 같은 물품을 포함한다.
또 다른 측면에서 본 발명에 따른 식품은 밀가루, 프리-믹스, 유지, 지방, 코코아 버터, 커피 와이트너, 샐러드 드레싱, 마가린, 스프레드, 피넛츠 버터, 소프트닝, 아이스크림, 쿠킹 오일과 같은 식물 유래 식품일 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명에 따른 식품은 유제품일 수 있으며 버터, 밀크, 크림, 자연치즈 또는 가공치즈, 다양한 형태의 치즈(슈레드, 블록, 슬라이스 또는 그레이트), 크림치즈, 아이스크림, 냉동 디저트, 요구르트, 요구르트 음료, 버터 지방, 무수 밀크 지방 또는 다른 유제품일 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명에 따른 식품은 육가공제품, 쿠킹 오일, 쇼트닝과 같은 동물로부터 유래된 식품일 수 있다.
또 다른 측면에서 본 발명에 따른 식품은 음료, 과실, 혼합과실, 야채 또는 와인일 수 있다. 이 경우 음료는 최대 20 g/l의 첨가된 파이토스테롤 에스테르를 포함한다.
다른 측면에서 본 발명에 따른 식품은 동물사료일 수 있다. 동물사료는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스탄올 에스테르, 바람직하게는 베타-시스토스테롤/스탄올 에스테르에 의해 강화된 것이다. 적합한 동물사료는 가금류 사료이다. 식품이 가금류 사료인 경우 가금류에 의해 생산하는 달걀내의 콜레스테롤 함량이 다른 사료에 의해 생성된 달걀내의 콜레스테롤 함량보다 낮아진다.
하나의 측면에서 사료는 달걀, 마요네즈, 샐러드 드레싱, 소스, 아이스크림, 에그 파우더, 변형된 난황 및 이들로부터 가공되는 달걀 기반물품에서 선택된 하나 또는 그 이상일 수 있다.
또 다른 측면에서 사료는 바람직하게는 마가린 또는 마요네즈이다.
본 명세서 내에 사용되는 '식품 물질'이라는 용어는 식품의 적어도 하나의 성분을 포함하는 것을 의미한다.
개인 보호 용품
파이토스테롤 및 파이토스탄올은 항염증 및 항홍반효과와 같은 강한 피부효과를 나타내며 생물학적 효과를 나타내므로 피부 미용 및 영양 물품으로 이용될 수 있다.
본 발명의 방법 또는 용도에 의해 제조되는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스탄올 에스테르는 인간에 필요한 화장용품 또는 화장용 에멀젼을 포함할 수 있다. 예를 들면 비누, 스킨 크림, 세안 크림, 안면 마스크, 스킨 클린저, 치약, 립스틱, 향수, 메이크업, 파운데이션, 블루셔, 마스카라, 아이쉐도우, 선크림 로션, 헤어 컨디셔너 및 헤어 염색제 등을 들 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명의 방법 또는 용도에 의해 제조되는 스테롤 에스테르 및/또는 스탄올 에스테르를 포함하는 약제학적 조성물이 제공될 수 있으며 이 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 첨가제 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 인간 또는 동물의 의학용도로 사용되는 것으로 일반적으로 하나 또는 그 이상의 약제학적으로 허용 가능한 희석제 담체 또는 첨가제를 포함한다. 치료용으로 사용 가능한 담체 또는 희석제는 약제학적 분야에 널리 알려져 있으며 예를 들면 Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985)에 기재되어 있다. 약제학적 담체 첨가제 또는 희석제의 선택은 투여 경로 및 표준 의학 프랙티스에 따라 선택될 수 있다. 담체 첨가제 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물은 적합한 결합제, 윤활제, 현탁화제, 코팅제, 용해제 등을 포함할 수 있다.
약제학적 조성물 내에는 보존제, 안정화제, 염료 및 향료 등을 포함할 수 있다. 보존제의 예로서는 소듐 벤조에이트, 소르브산 및 p-하이드록시벤조산 에스테르를 들 수 있다. 항산화제와 현탁화제를 역시 사용할 수 있다.
다양한 전달 시스템에 따라 다양한 조성물/제형이 개발될 수 있다. 예를 들면 본 발명의 약제학적 조성물은 미니 펌프 또는 점막 루트에 의해 투여되는 제형으로 제형화 될 수 있다. 또한 예를 들면 흡입용 코 스프레이 또는 에어로졸 형태일 수 있고 소화 가능한 용액 또는 상기 조성물을 정맥주사, 근육주사, 피하주사로 투여할 수 있는 제형으로 제제화 될 수 있다. 선택적으로 제형은 두 가지 경로에 의해 전달될 수 있도록 설계될 수 있다.
제제가 위 장관 내 점막을 통해 전달될 때 위 장관 경로에서 이송하는 동안 안정하게 유지되어야만 한다. 예를 들면 단백질 분해에 대한 저항성, 산pH에 대한 안정성 및 담즙산에 대한 저항성을 지녀야 한다.
약제학적 조성물은 적합하게는 여러 경로에 의해 투여할 수 있으며 흡입에 의한 투여, 좌제형, 로션 용액 크림 연고 더스팅 파우더와 같은 국소 투여형 피부 패치에 의한 투여, 첨가제로 전분 또는 유당을 포함하는 타블렛 형태로의 경구 투여 또는 캡슐 오블 또는 이들의 단독 또는 첨가제와의 혼합 투여, 착향제 또는 착색제를 포함하는 엘릭사, 용액 또는 현탁액, 예를 들면 정맥, 근육 또는 피하내와 같은 비경구적인 주입 등을 들 수 있다. 비경구적 투여로는 예를 들면 적절한 염 또는 단당류를 포함하는 혈액에 등장액으로 제형화 된 멸균 수용성 용액의 형태로 제조하는 것이 가장 바람직하다. 구강 또는 혀 밑의 투여를 위해 조성물은 통상적인 방법에 의해 제형화된 타블렛 또는 로젠제스일 수 있다.
바람직한 의학 조성물은 경구적 투여에 적합한 투여이다.
본 발명에 따른 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열의 클로닝
본 명세서 내에 정의된 특이적 성능을 지닌 폴리펩타이드 또는 적절한 변형을 지닌 폴리펩타이들 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 폴리펩타이드를 생성하는 어느 세포 또는 미생물로부터 분리될 수 있다. 각 종의 방법이 뉴클레오타이드 서열의 분리에 공지되어 있다.
예를 들면 게놈 DNA 및/또는 cDNA 라이브러리는 폴리펩타이드를 생성하는 생물체로부터의 염색체 DNA 또는 메신저 RNA를 사용하여 구축될 수 있다. 폴리펩타이드의 아미노산 서열이 알려져 있다면 표지화 된 올리고뉴클레오타이드 프로브를 합성하여 생물체로부터 준비된 게놈 라이브러리로부터 폴리펩타이드-코딩 클론의 확인을 위해 사용될 수 있다. 선택적으로 또 다른 알려진 폴리펩타이드 유전자와 상동성을 지닌 서열을 포함하는 표지된 올리고뉴클레오타이드 프로브는 폴리펩타이드-코딩 클론을 확인할 수 있다. 후자의 경우 혼성화와 세척조건은 낮은 스트랜전시를 사용한다.
한편 폴리펩타이드-코딩 클론은 게놈 DNA의 단편을 발현벡터 예를 들면 플라스미드에 삽입하여 확인할 수 있으며 효소-음성 박테리아를 얻어진 게놈 DNA 라이브러리로 형질전환 시키고 그 후 형질 전환된 박테리아를 폴리펩타이드에 길항하는 효소를 포함하는 한천 위에 플레이팅시켜 폴리펩타이드를 발현하는 클론을 확인할 수 있게 한다.
폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 이미 수립된 표준 방법 예를 들면 Beucage S.L. et al (1981) Tetrahedron Letters 22, p 1859-1869, 또는 Matthes et al (1984) EMBO J. 3, p 801-805에 기재된 방법에 의해 포스포로아미디트 방법으로 합성할 수 있다. 포스포로아미디트 방법은 예를 들면 자동 DNA 합성기에 의해 올리고뉴클레오타이드가 합성되고 정제, 어닐링, 라이게이트 및 적절한 벡터내에 클로닝된다.
뉴클레오타이드 서열은 게놈과 합성 기원을 혼합할 수 있고 합성과 cDNA 기원을 혼합할 수도 있으며 또는 게놈과 cDNA 기원을 혼합할 수도 있다. 이는 표준 기법에 따라 적절하게 합성, 게놈 또는 cDNA 기원 단편을 라이게이트 함으로써 제조된다. 각각의 라이게이트 단편은 전체 뉴클레오타이드 서열의 여러 부분과 상응한다. DNA 서열은 특정 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄반응(PCR)에 의해 제조될 수 있으며 이는 미국 특허 제4,683,202호 또는 Saiki R K et al (Science (1988) 239, pp 487-491)에 기재된 방법에 의해 행할 수 있다..
뉴클레오타이드 서열
본 발명은 본 명세서 내에 특이한 특성을 지닌 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 또한 포함한다. 본 명세서 내에 '뉴클레오타이드 서열'이라는 용어는 올리고뉴클레오타이드 서열 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 이의 변이체, 상동체, 단편 또는 그의 부분과 같은 유도체를 언급한다. 뉴클레오타이드 서열은 게놈 또는 합성 또는 재조합 기원일 수 있고 이는 센스 또는 안티센스 스트랜드를 나타내는 이중가닥 또는 단일가닥 일 수 있다.
본 발명에 관련한 '뉴클레오타이드 서열'이라는 용어는 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 및 RNA를 포함한다. 바람직하게는 DNA를 의미하며 더욱 바람직하게는 코딩 서열을 지닌 cDNA를 의미한다.
바람직한 실시태양에서 본 명세서 내에 정의된 특성을 지닌 폴리펩타이드를 코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 상기 서열이 자연적으로 결합된 서열에 연결되어 있거나 자연환경 내에서 연결될 수 있는 자연환경에 존재하는 천연형 뉴클레오타이드 서열을 커버하는 것은 아니다. 이는 바람직한 실시태양에서 비자연적인 뉴클레오타이드 서열을 의미하는 것으로 판단된다. 이에 반해 '천연형 뉴클레오타이드 서열'이라는 용어는 자연적으로 결합되어있는 전체 프로모터와 작동 가능하게 연결되어 있을 때의 자연상태에서 전체 뉴클레오타이드 서열을 의미한다. 따라서 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 천연 생물체 내의 뉴클레오타이드 서열에 의해 발현될 수 있으나 뉴클레오타이드 서열은 생물체 내에서 천연적으로 결합된 프로모터의 조절하에 발현되는 것은 아니다.
바람직한 폴리펩타이드는 천연 폴리펩타이드는 아니다. 이에 따라 '천연 폴리펩타이드'라는 용어는 자연적 뉴클레오타이드 서열에 의해 발현되었을 때 자연환 경 내에서 전체 폴리펩타이드를 의미한다.
본 명세서 내에서 정의된 특성을 지닌 폴리펩타이드를 코드화한 뉴클레오타이드 서열은 DNA 기술 예를 들면 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 그러나 본 발명의 선택적 실시태양에서 뉴클레오타이드 서열은 잘 알려진 방법 Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23 and Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225-232) 참조에 의해 화학적 방법을 사용하여 전체적 또는 부분적으로 합성될 수 있다.
분자 진화
일단 효소-코딩 뉴클레오타이드 서열이 분리되거나 뉴클레오타이드 서열을 코드화하는 잠정적 효소가 확인되면 뉴클레오타이드 서열을 선택적으로 변형하는 것이 바람직하다. 예를 들면 본 발명에 따라 효소를 제조하기 위한 서열 변이가 바람직하다.
변이는 합성 올리고뉴클레오타이드를 도입하므로 이루어진다. 이러한 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 올리고뉴클레오타이드는 원하는 변이 위치에 결합된다.
바람직한 방법은 Morinaga et al (Biotechnology (1984) 2, p646-649)에 개시되어 있으며 효소-코딩 뉴클레오타이드 서열에 변이를 도입하기 위한 다른 방법은 Nelson and Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, p 147-151)에 개시되어 있다.
상기한 바와 같이 자리 지정 돌연변이 대신에 Stratagene사의 GeneMorph PCR 변이 키트 또는 Clontech사의 Diversify PCR 랜덤 변이 키트와 같은 상업적인 키트를 사용하여 무작위로 변이를 도입할 수 있다. 최적 PCR 기반 변이 방법은 EP 0 583 265에 개시되어 있다. 이는 EP 0 866 796에 기재된 바와 같이 변이 DNA 아날로그를 사용하여 변이시키는 것이다. Error prone PCR 기법이 바람직한 특성을 지닌 지질 아실 트랜스퍼라제의 변이체 생산에 적합하다. WO0206457에는 리파아제의 분자 진화가 언급되 있다.
신규한 서열을 수득하는 세 번째 방법은 프래그먼트 논-아이덴티컬 뉴클레오타이드 서열이며 이는 제한효소 또는 Dnase I와 같은 효소를 사용하여 수득될 수 있고 기능적 단백질의 전체 뉴클레오타이드 서열을 유사하게 코딩한다. 한편 멀티플 논-아이덴티컬 뉴클레오타이드 서열을 사용하여 전체 뉴클레오타이드 서열의 유사성 내에서 변이를 도입할 수 있다. DNA 셔플링 및 패밀리 셔플링 기법이 바람직한 특성을 지닌 지질 아실 트랜스퍼라제 변이체를 생성하는데 적합하다. 셔플링을 수행하기 위한 바람직한 방법은 EP0 752 008, EP1 138 763, EP1 103 606에 개시되어 있으며 셔플링은 미국특허 제6,180,406호 및 WO 01/34835에 개시된 DNA 변이 또 다른 형태를 결합하여 수행할 수 있다.
따라서 자리 지정 또는 무작위 변이가 뉴클레오타이드 서열에 여러 위치에 도입될 수 있으며 이는 생체 내 또는 시험관 내에서 가능하고 이에 따른 여러 수단에 의해 코드화된 폴리펩타이드의 개선된 기능을 스크리닝 할 수 있다. 실코 및 엑소 관련 재조합 방법(WO 00/58517, US 6,344,328, US 6,361,974 참조)을 사용하여 예를 들면 분자 진화를 수행할 수 있고 이 때 생성된 변이체는 알려진 효소 또는 단백질과 매우 낮은 상동성을 지닌다. 이와 같이 수득된 변이체는 알려진 트랜스퍼라제 효소에 중요한 구조 유사체이나 매우 낮은 아미노산 서열 상동성을 지닌다.
제한되지 않는 예로써 덧붙여 폴리펩타이드 서열의 변이 또는 자연변이는 야생형 또는 다른 변이 또는 새로운 변이체를 생성하는 천연 변이체와 함께 재조합 될 수 있다. 이와 같은 새로운 변이체는 코드화된 폴리펩타이드의 개선된 특성에 따라 스크리닝 될 수 있다.
상기 언급하거나 유사한 분자 진화 방법의 적용을 통해 본 발명의 효소의 변이체의 선택 및 확인을 가능케 한다. 이때 변이체는 이미 알려진 단백질의 구조 또는 기능과 관계없이 바람직한 특성을 지니는 것으로 예측되지 않았지만 유용한 변이체의 생성을 가능케 한다. 따라서 효소 활성의 최적화 또는 변형을 위해 다수의 분자진화 기술을 적용할 수 있으며 예를 들면 다음과 같은 것을 들 수 있으나 이에 의해 제한되는 것은 아니다. 숙주세포 또는 시험관 내에서 최적화 된 발현 및/또는 활성, 증가된 효소 활성, 변화 기질 및/또는 제품 특이성, 증가 또는 감소된 효소 또는 구조 안정성, 변화 효소 활성/특이성 등을 들 수 있으며 이는 환경적 조건 예를 들면 온도 pH 기질에 따른 것이다.
당업자에게 자명하게 분자 진화 도구를 사용한 효소의 변화는 효소의 기능성을 향상시키기 위해 활용될 수 있다.
본 발명에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 적합하게는 변이 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 것이다. 예를 들면 지질 아실 트랜스퍼라제는 모 효소와 비교 시 적어도 하나의 아미노산 치환 결실 추가 등을 포함할 수 있다. 변이 효소는 적어도 1%, 2%, 3%, 5%, 10%, 15%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97%, 99%의 모 효소와 상동성을 지닌다. 적합한 모 효소는 에스테라제 또는 리파아제 활성을 지니는 것을 포함한다. 바람직하게는 모 효소의 pfam00657 컨센서스 서열의 배열을 지니는 것이다.
바람직한 실시태양에서 변이 지질 아실 트랜스퍼라제 효소는 GDSX, GANDY 및 HPT 블록 내에서 발견되는 pfam00657 컨센서스 서열 아미노산 잔기를 하나 또는 그 이상 지니는 것을 보유하거나 통합할 수 있다.
수용액 환경 내에서 매우 낮거나 전혀 지질 아실 트랜스퍼라제 활성을 지니지 않는 리파아제와 같은 효소는 트랜스퍼라제 활성을 도입하거나 증가시키기 위해 분자 진화 도구를 사용하여 변이 시킬 수 있다.
본 발명의 방법 또는 용도에 사용되는 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 적합한 뉴클레오타이드 서열은 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 것이며 이는 모 효소와 비교 시 인지질과 같은 극성 지질 위에서 형상 된 효소활성을 지니는 변이체 일 수 있다.
한편 변이 효소는 증가된 열안정성을 지닌다.
알려진 지질 아실 트랜스퍼라제의 변이체 또는 이들 변이체의 하나 또는 그 이상의 본 발명에 따른 방법 및 용도에 사용하기 적합한 것이고 또한 본 발명에 따른 효소 조성물 내에서 사용하기 적합한 것이다. 예를 들면 변이 지질 아실 트랜스퍼라제는 Hilton & Buckley J Biol. Chem. 1991 Jan 15: 266 (2): 997-1000; Robertson et al J. Biol. Chem. 1994 Jan 21; 269(3):2146-50; Brumlik et al J. Bacteriol 1996 Apr; 178 (7): 2060-4; Peelman et al Protein Sci. 1998 Mar; 7(3):587-99과 같은 알려진 문헌에 기재된 효소 일 수 있다.
아미노산 서열
본 발명은 본 발명의 방법 및 용도에 사용하기 위한 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열에 의해 코드화된 아미노산 서열의 사용을 포함할 수 있다.
본 명세서 내에서 '아미노산 서열'이라는 용어는 '폴리펩타이드' 및/또는 '단백질'과 동의어로 사용된다. 어떤 경우에서 '아미노산 서열'이라는 용어는 '펩타이드'와 동일한 의미로 사용된다.
아미노산 서열은 적합한 기원으로부터 제조/분리 될 수 있다. 또한 합성될 수 있으며 재조합 DNA 기술을 사용하여 제조 될 수 있다.
적합한 아미노산 서열은 표준 기술에 의해 분리된 폴리펩타이드로부터 수득할 수 있는 것이다.
분리 폴리펩타이드로부터 아미노산 서열의 결정을 위해 다음과 같은 적합한 방법을 사용할 수 있다.
정제된 폴리펩타이드는 동결 건조시키고 100㎍의 동결 건조물을 8M의 요소 및 0.4M의 탄산수소암모니아 혼합물 50㎕에 용해시키고 pH를 8.4로 조정한다. 용해된 단백질을 50℃에서 15분간 변성 및 감소시킨 후 질소 분위기 하에서 45 mM 디티오쓰레이톨 5㎕를 첨가한다. 실온에서 냉각한 후 100 mM 요도아세트아미드 5㎕를 첨가하여 시스테인 잔기를 질소 분위기 암흑 하에서 실온에서 15분간 유도체 합성시킨다.
135㎕의 물과 5㎕의 물에 용해된 5㎍의 엔도프로테인아제 Lys-C를 상기 반응 혼합물에 첨가하고 질소 분위기 하에서 37℃ 24시간 소화 분해를 시행한다.
수득된 펩타이드는 0.1% TFA를 물에 용해시킨 용액 A와 0.1% TFA를 아세토니트릴에 용해시킨 용액 B를 사용하여 VYDAC C18 컬럼 (0.46x15cm;10μm; The Separation Group, California, USA)으로 역상 HPLC시켜 분리한다. 선별된 펩타이드를 동일한 용매 시스템을 사용하여 Develosil C18 컬럼으로 재-크로마토그래피 시키고 N-말단 시퀀싱을 행한다. 서열 분석은 Applied Biosystems 476A 서열 분석기를 통해 수행하고 Applied Biosystems, California, USA의 제조자 지침서에 의거 펄스화 용액 사이클을 행한다.
서열 동일성 또는 서열 상동성
본 명세서 내에서 '상동성'이라는 용어는 대상 아미노산 서열과 대상 뉴클레오타이드 서열이 특정 상동성을 지님을 의미한다. '상동성'이라는 용어는 '동일성'과 일치하는 것이다.
상동적인 아미노산 서열 및/또는 뉴클레오타이드 서열은 기능적 활성을 보유하거나 및/또는 효소 활성을 지닌 폴리펩타이드를 제공할 수 있다.
본 명세서 내에서 상동적 서열은 적어도 75, 85 또는 90%의 동일성, 바람직하게는 적어도 95 또는 98%의 대상 서열에 대한 동일성을 지닌 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 통상 상동성은 대상 아미노산 서열에 대해 동일 활성 부위를 지님을 의미한다. 비록 상동성이 유사성 예를 들면 유사한 화학적 특성/기능을 지니는 아미노산 잔기와 같은 유사성으로 간주될 수 있으나 본 명세서 내에서는 상동성은 서열 일치성을 의미하는 것으로 표현된다.
본 명세서 내에서 상동적 서열은 적어도 75, 85 또는 90%의 동일성, 바람직하게는 적어도 95 또는 98%의 대상 서열에 대한 동일성을 지닌 폴리펩타이드를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 통상 상동성은 대상 서열에 대해 동일 활성 부위를 지님을 의미한다. 비록 상동성이 유사성 예를 들면 유사한 화학적 특성/기능을 지니는 아미노산 잔기와 같은 유사성으로 간주될 수 있으나 본 명세서 내에서는 상동성은 서열 일치성을 의미하는 것으로 표현된다.
상동성 비교는 눈으로 수행할 수 있고 통상은 사용가능한 서열비교 프로그램을 통해 수행한다. 상업적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램은 둘 또는 그 이상의 서열간의 % 상동성을 계산할 수 있다.
% 상동성은 연속적인 서열에 의해 계산될 수 있으며 예를 들면 하나의 서열을 다른 서열과 비교 시 상응하는 서열을 직접 비교하여 각각의 아미노산 서열과 다른 서열의 배열을 비교하는 것이다. 이를 '갭 없는'배열이라고 칭하고 통상 갭 없는 정열은 상대적으로 적은 수의 잔기를 지닌 서열을 비교할 때 행하는 것이다.
상기 비교법은 매우 간단하고 연속적인 방법이지만 예를 들면 삽입 결실과 같은 서열의 상동적인 페어에 다른 아미노산 잔기가 배열 속에 삽입되어 있다면 서열 비교에 실패할 수 있으며 따라서 전체적인 배열로 수행할 때 % 상동성의 대단한 감소가 실질적으로 나타날 수 있다. 따라서 대부분의 서열 비교는 상동성 스코어의 전체적인 비교를 통해 페널티 없이 가능한 삽입 및 결실의 가능성을 고려한 최적의 배열을 설계함으로써 이루어진다. 이와 같은 '갭'을 삽입한 서열의 배열을 통해 상동성의 극대화를 이룰 수 있다.
그러나 더욱 복잡한 방법은 '갭 페널티'를 배열 내에 각각의 갭에 발생시켜 판독하는 것으로 약간의 가능한 갭을 지닌 서열 배열을 동일한 아미노산 수에 따라 판독하는 것이며 이는 두 개의 비교 서열간에 더 높은 상관관계를 반영하고 많은 갭을 지닌 경우 더 높은 스코어를 나타낼 수 있다. '인근(affine) 갭 코스트'가 갭의 존재시 상대적으로 높은 비용을 부과하게 되고 갭 내의 각각의 연속적인 잔기를 위해 더 작은 페널티를 부과한다. 높은 갭 페널티는 당연히 적은 갭을 지닌 최적 배열을 생성할 수 있게 한다. 대부분의 배열 프로그램은 갭 페널티를 변형시킬 수 있으며 그러나 서열 비교 소프트웨어를 사용 시 적합한 디폴트 수치를 사용한다.
따라서 최대 % 상동성의 계산은 갭 페널티를 고려하여 최적 배열의 생성을 요구하는 것이다. 이와 같은 배열을 수행하기 위한 최적의 컴퓨터 프로그램은 Vector NTI Advance™ 11 (Invitrogen Corp.)을 들 수 있다. 다른 서열 비교를 수행하기 위한 프로그램의 예는 다음에 한정하는 것은 아니지만 BLAST 패키지 ( Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4th Ed - Chapter 18참조) 및 FASTA (Altschul et al 1990 J. Mol. Biol. 403-410)을 들 수 있다. BLAST 와 FASTA는 모두 온라인 검색 및 오프라인 검색(Ausubel et al 1999, pages 7-58 to 7-60 참조)에 사용 가능하다. 그러나 어떤 적용에 있어서는 Vector NTI Advance™ 11 프로그램이 가장 바람직하다. 새로운 서열 비교 도구로써 BLAST 2 서열이 단백질 및 뉴클레오타이드 서열 비교를 위해 활용된다. (FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; 및 FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187-8. 참조).
최종 % 상동성은 동일성에 의해 측정되지만 배열 프로세스 자체는 통상 전부 또는 무의 페어 비교에 근거하여 행하지는 않는다. 그 대신 스케일화된 유사성 스코어 매트릭스가 일반적으로 사용되며 화학적 유사성 또는 진화적 거리에 기반을 둔 각각의 페어 비교를 통해 스코어를 할당한다. 이와 같은 매트릭스의 예로는 BLOSUM62 매트릭스를 통상 사용하고 있고 이는 BLAST의 매트릭스 결점을 보완한 프로그램이다. Vector NTI 프로그램이 공공 디폴트 수치 또는 심볼 비교 테이블에 사용되고 있으며 상세하게는 제공된 사용자 지침을 참조하기 바란다. 특정 적용에 있어 Vector NTI Advance™ 11 패키지가 디폴트 수치를 사용하기에 가장 바람직한 것이다.
한편 퍼센트 상동성은 Vector NTI Advance™ 11 (Invitrogen Corp.)을 사용하여 멀티플 배열 형태를 계산할 수 있다. 이는 CLUSTAL (Higgins DG & Sharp PM (1988), Gene 73(1), 237-244)과 유사한 알고리즘을 사용하여 계산하는 것이다.
소프트웨어가 최적 배열을 생성하면 % 상동성 바람직하게는 % 서열 동일성을 계산할 수 있다. 소프트웨어는 서열 비교의 한 부분으로 이를 수행하고 숫자로 그 결과를 생성시킨다.
만약 서열 동일성을 결정할 때 갭 페널티를 사용한다면 이는 페어와이즈 배열보다 더 바람직한 디폴트 파라미터를 나타내는 프로그램이다. 예를 들면 다음 파라미터들이 BLAST 2의 페어와이즈 배열의 현행 디폴트 파라미터를 위해 고안되었다.
BLAST2 용 DNA 단백질
예상 THRESHOLD 10 10
워드 크기 11 3
스코어 파라미터
매치/비매치 스코어 2, -3 n/a
매트릭스 n/a BLOSUM62
갭 코스트 존재 : 5
연장 : 2		 존재 : 11
연장 :1
하나의 실시태양에서 뉴클레오타이드 서열 및/또는 아미노산 서열의 서열 동일성은 바람직하게는 상기 정의한 바와 같은 스코어링 파라미터 세트를 사용하여 BLAST2 (blastn)으로 측정한다.
본 발명의 목적에서 동일성의 정도는 동일한 서열 엘레멘트의 숫자에 근거한다. 본 발명에 따른 동일성의 정도는 아미노산 서열의 경우 Vector NTI Advance™ 11 (Invitrogen Corp.)와 같은 공지된 컴퓨터 프로그램 수단에 의해 결정하는 것이 적합하다. 페어와이즈 정렬을 위해 사용되는 스코어링 파라미터는 갭 존재 시 페널티를 11로 하고 갭 연장시 페널티를 1로 하는 BLOSUM62를 사용하는 것이 바람직하다.
뉴클레오타이드 서열에 관한 동일성의 정도는 바람직하게는 적어도 20개의 연속적 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 30개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 40개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 50개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 60개의 뉴클레오타이드, 바람직하게는 적어도 100개의 뉴클레오타이드의 연속적인 뉴클레오타이드 서열을 통해 결정한다.
가장 바람직한 뉴클레오타이드 서열의 동일성의 정도는 전체 서열을 통해 결정하는 것이다.
서열은 아미노산 잔기의 결실, 삽입, 치환을 지닐 수 있고 이는 작은 변화를 생성하지만 결과적으로는 기능적으로 균등한 물질들이다. 아미노산 치환은 극성의 유사성, 전하, 용해성, 소수성, 친수성 및/또는 물질의 2차 결합 활성과 같은 잔기의 양친매성 성질들을 고려하여 결정된다. 예를 들면 음전하 아미노산은 아스파트산과 글루탐산을 포함하고 양전하 아미노산은 라이신과 아르기닌을 포함하며 비전하 극성 헤드 그룹의 아미노산은 류신, 이소류신, 발린, 글라이신, 알라닌, 아스파라긴, 글루타민, 세린, 트레오닌, 페닐알라닌 및 타이로신과 같은 아미노산을 포함하여 유사한 소수성을 지니게 할 수 있다.
보존적 치환은 하기 표 7과 같은 것을 예를 들 수 있다. 두 번째 칼럼 내의 같은 블록안의 아미노산 바람직하게는 세 번째 칼럼 내의 동일선상의 아미노산이 서로 치환될 수 있다.
지방족 비극성 G A P
I L V
극성-비전하 C S T M
N Q
극성-전하 D E
K R
방향족 H F W Y
본 발명은 예를 들면 염기성 잔기를 염기성 잔기와 같은 동일 유사한 아미노산 잔기로 치환하거나 산성 잔기를 산성 잔기로, 극성 잔기를 극성 잔기로 유사하게 치환하는 것을 의미하는 상동적 치환을 포함할 수 있다. 이 때 상동적 치환이란 본 명세서 내에서는 치환과 배치 모두를 의미하며 현존하는 아미노산 잔기를 다른 잔기로 상호 교환하는 것을 의미한다. 비상동적 치환을 행할 수 있으며 예를 들면 한 클래스의 아미노산을 다른 비자연적인 아미노산 예를 들면 오르니틴(이하 Z로 언급한다), 디아미노부티르산 오르니틴(이하 B로 언급한다), 노르류신 오르니틴(이하 Q로 언급한다), 피릴알라닌, 티에닐알라닌, 나프틸알라닌 및 페닐글라이신으로 치환하는 것을 말한다.
배치는 비자연적 아미노산일 수 있다.
변이 아미노산 서열은 두 아미노산 잔기 사이에 메틸, 에틸 또는 프로필 그룹과 같은 알킬 그룹을 포함하는 서열로 된 적합한 스페이서 그룹을 포함할 수 있으며 이에 덧붙여 글라이신 또는 베타-알라닌 잔기와 같은 아미노산 스페이서를 포함할 수 있다. 추가적 변이 형태로써 펩토이드 형태의 아미노산 잔기를 하나 또는 그 이상 존재시킬 수 있으며 이는 당업자에게 널리 알려진 기술이다. '펩토이드 형태'라는 용어는 알파-탄소 치환 그룹이 알파-탄소 보다 질소 원자 잔기 위에 있는 변이 아미노산 잔기를 의미한다. 펩토이드 형태를 지닌 펩타이드를 제조하는 방법은 Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 및 Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134에 개시된 기술을 예를 들 수 있다.
본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드 서열 또는 본 명세서에 정의된 특성을 지닌 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열은 합성 또는 변형된 뉴클레오타이드를 그 내부에 포함할 수 있다. 다수의 다양한 형태의 올리고뉴클레오타이드 변형이 알려져 있다. 이는 분자의 3` 및/또는 5` 말단에 메틸포스포네이트, 포스포로티오에이트 골격 및/또는 아크리딘 또는 폴리라이신 사슬을 추가로 포함할 수 있는 것이다. 본 발명의 목적에서 본 명세서 내에 기재된 뉴클레오타이드 서열은 이와 같은 기술을 사용하여 변형될 수 있는 것이다. 이와 같은 변형은 생체 내 활성 또는 뉴클레오타이드 서열의 수명을 증진시키기 위해 수행될 수 있다.
본 발명은 본 명세서에 설명한 바와 같은 상보 서열, 유도체 단편 또는 그 유도체를 지닌 뉴클레오타이드 서열을 포괄한다. 만약 단편에 상보적인 서열은 다른 생물체 내에서 유사한 코드화 서열을 확인하기 위한 프로브로 사용할 수 있다.
본 발명의 서열과 100% 상동성을 지니지는 않는 폴리뉴클레오타이드도 본 발명의 범위에 포함되고 다른 방법으로 수득될 수 있다. 본 명세서 내의 다른 변이 서열은 다양한 인구로부터 개체의 각각 영역으로부터 얻어진 DNA 라이브러리를 프로빙함으로써 수득될 수 있다. 또한 다른 바이러스 박테리아 또는 세포 상동체 특히 포유류 세포 상동체 예를 들면 래트, 마우스, 소 및 영장류 세포 등이다. 상동적인 단편은 서열 내의 알려진 서열을 선택적으로 혼성화함으로써 얻어질 수 있다. cDNA 라이브러리 프로빙에 의해 수득되는 서열 또는 다른 동물 종류의 게놈 DNA 라이브러리로부터 수득되는 서열은 본 명세서에 첨부된 서열 목록내의 서열의 어느 하나의 전체 또는 부분을 포함하는 프로브에 의해 중간 내지 높은 스트래전시 조건 하에서 상기 라이브러리로부터 프로빙 될 수 있다. 유사한 방법이 종간 상동체를 수득하는데 적용될 수 있으며 본 발명의 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드의 대립 형질 변이체를 수득하는데 적용할 수 있다.
변이체와 균주/속 상동체는 본 발명의 서열 범위 내의 보존적 아미노산 서열을 코드화하는 변이체와 상동체 내의 목적 서열로부터 설계된 프라이머를 사용하여 PCR을 통해 수득될 수 있다. 보존 서열은 예측될 수 있으며 예를 들면 몇몇 변이체/동족체로부터 아미노산 서열의 배열을 예측할 수 있다. 서열 배열은 컴퓨터 소프트웨어를 이용하여 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면 GCG Wisconsin PileUp 프로그램이 널리 사용된다.
디제너레이트 PCR내 사용되는 프라이머는 하나 또는 그 이상의 디제너레이트된 위치를 지니며 알려진 서열에 대한 단일 서열 프라이머를 사용하여 클로닝 서열을 사용할 때 보다 더 낮은 스트래전트 조건 하에서 수행될 수 있다.
한편 폴리뉴클레오타이드는 특정 서열의 자리 지정 돌연변이에 의해 수득될 수 있다. 이 방법은 사일런트 코돈 서열 변경을 위해 유용하게 사용될 수 있으며 폴리뉴클레오타이드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포를 위해 최적 코돈을 선택하는데 유용하다. 다른 서열 변경은 제한 폴리펩타이드 인식 부위를 도입하기 위해 사용될 수 있고 또는 폴리뉴클레오타이드에 의해 코드화된 폴리펩타이드의 특성을 변경하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 서열은 예를 들면 PCR 프라이머와 같은 프라이머를 사용하여 생성될 수 있으며 프라이머는 선택적 증폭 반응에 사용될 수 있고 방사능 또는 비-방사능 표지를 사용하는 통상적인 수단에 의해 표지화된 라벨과 같은 프로브를 사용할 수 있다. 폴리뉴클레오타이드는 벡터내에서 클로닝될 수 있다. 프라이머 프로브 및 다른 단편들은 적어도 15개, 바람직하게는 적어도 20개, 적어도 25개, 적어도 30개 또는 40개의 뉴클레오타이드 길이를 지니는 것으로 본 명세서 내에서는 폴리뉴클레오타이드라는 용어로 통칭될 수 있다.
본 발명에 따른 프로브와 DNA 폴리뉴클레오타이드와 같은 폴리뉴클레오타이드는 재조합, 합성 또는 당업자에게 적용가능한 수단에 의해 생성될 수 있다. 이들은 표준 방법에 의해 클로닝될 수 있다.
일반적으로 프라이머는 합성 방법에 의해 생성될 수 있고 한번에 원하는 핵산 서열로부터 단계적으로 생성될 수 있다. 자동 기법에 의해 생성하는 기술이 이미 당업계에 알려져 있다.
긴 폴리뉴클레오타이드는 예를 들면 PCR 클로닝 기술과 같은 재조합 수단에 의해 생성될 수 있다. 이 기술은 클로닝을 원하는 지질 목적 서열의 절단부위를 예를 들면 15 내지 30개의 뉴클레오타이드로 구성된 프라이머 쌍을 이용하여 수행된다. 이에 따라 프라이머는 동물 또는 인간세포로부터 수득된 mRNA 또는 cDNA와 접촉 결합되고 원하는 영역의 증폭을 필요한 조건 하에서 중합효소 연쇄반응으로 행할 수 있게 한다. 그 후 예를 들면 아가로오즈 겔상에서 반응 혼합물을 정제함으로써 증폭된 단편을 분리하고 증폭된 DNA를 회수한다. 프라이머는 적절한 제한효소 인식부위를 함유하도록 설계되며 이에 따라 증폭된 DNA는 적절한 클로닝 벡터내에 클로닝 시킬 수 있다.
혼성화
본 발명은 본 발명의 서열 또는 그 서열에 상보적인 서열과 혼성화 할 수 있는 서열 또는 그 서열의 상보적인 서열의 용도를 포함하는 것이다.
본 명세서 내에 사용되는 '혼성화'라는 용어는 한 가닥의 핵산이 상보적인 가닥과 염기 페어링에 의해 결합하는 과정을 의미한다. 또한 중합효소 연쇄반응 기법에 의해 수행되는 증폭과정을 의미한다.
본 발명은 본 명세서 내에서 언급한 특정 서열에 상보적인 서열 또는 그의 유도체 단편 또는 그 단편의 유도체와 혼성화 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열의 용도를 포함한다.
본 발명은 본 명세서내에 언급된 뉴클레오타이드 서열에 혼성화 할 수 있는 상보적인 서열을 포함한다.
혼성화 조건은 뉴클레오타이드 결합 콤플렉스의 융점(Tm)에 기반하며 Berger 및 Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol. 152, Academic Press, San Diego CA)에 기재된 방법에 따르며 이 때 스트래전시는 다음에서 설명한다.
최대 스트래전시는 Tm-5℃(프로브의 융점보다 5℃이하)에서 발생한다. 높은 스트래전시는 융점(Tm)보다 약 5 내지 10℃ 이하이다. 중간정도 스트래전시는 융점(Tm)보다 약 10 내지 20℃ 하이다. 낮은 스트래전시는 융점(Tm)보다 약 20 내지 25℃ 이하이다. 당업자에게 알려진 바와 같이 높은 스트래전시 혼성화는 동일한 뉴클레오타이드 서열의 감지 및 확인에 사용할 수 있는 것이며 반면 중간정도 또는 낮은 스트래전시 혼성화는 폴리뉴클레오타이드 서열의 유사 또는 관련성을 감지 또는 확인하기 위해 사용하는 것이다.
바람직하게는 본 발명은 본 명세서 내에 기재된 특성을 지니는 폴리펩타이드를 코드화한 뉴클레오타이드 서열에 높은 조건 중간 조건 또는 낮은 스트래전시 조건 하에서 혼성화 할 수 있는 상보적 서열의 용도를 포함하는 것이다.
더욱 바람직하게는 높은 스트래전시 조건(예를 들면 65℃ 및 0.1xSSC {1xSSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na-시트레이트 pH 7.0})하에서 본 명세서 내에 기재된 특성을 지니는 폴리펩타이드를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 혼성화 할 수 있는 상보적 서열의 용도를 포함하는 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서 내에서 설명하는 상보적인 서열을 포함하는 본 명세서 내의 뉴클레오타이드 서열을 혼성화 할 수 있는 뉴클레오타이드 서열의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 명세서 내에서 설명하는 상보적인 서열을 포함하는 본 명세서 내의 뉴클레오타이드 서열을 혼성화 할 수 있는 상보적인 뉴클레오타이드 서열의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 범위 내에서 본 명세서 내에 뉴클레오타이드 서열과 중간 내지 최대 스트래전시 조건 하에서 혼성화 할 수 있는 폴리뉴클레오타이드 서열의 용도를 포함하는 것이다.
본 발명의 한 측면에서 스트래전시 조건(예를 들면 50℃ 및 0.2xSSC) 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 용도를 포함하는 것이다.
본 발명의 한 측면에서 높은 스트래전시 조건(예를 들면 65℃ 및 0.1xSSC) 혼성화할 수 있는 뉴클레오타이드 서열 또는 그 단편을 포함하는 뉴클레오타이드 서열의 용도를 포함하는 것이다.
폴리펩타이드의 발현
본 발명에 사용되는 뉴클레오타이드 서열 또는 본 명세서 내에 정의된 특성을 지닌 폴리펩타이드를 코드화한 뉴클레오타이드 서열은 재조합 전사 벡터를 통해 통합될 수 있다. 벡터는 뉴클레오타이드 서열을 양립할 수 있는 숙주 세포 내 및/또는 로부터 폴리펩타이드 형태로 전사하거나 발현하기 위해 사용하는 것이다. 발현은 프로모터/인핸서 및 다른 전사 조절 시그널을 포함하는 제어 서열을 사용하여 조절될 수 있다. 프로카리요트 프로모터와 진정핵 세포 내의 기능적 프로모터가 사용될 수 있다. 조직 특이성 또는 자극 특이성 프로모터도 사용될 수 있다. 카이메릭 프로모터도 상기한 둘 또는 그 이상의 다른 프로모터로부터 서열 엘레멘트를 포함시켜 사용할 수 있다.
재조합 숙주 세포에 의해 폴리뉴클레오타이드 서열 발현을 통해 생성되는 폴리펩타이드는 서열 및/또는 벡터에 따라 세포간에 분비되거나 축적됨으로써 수득된다. 코드화 서열은 특정 원핵세포 또는 진핵세포막을 통과하기 위해 물질의 직접 분비에 필요한 시그널 서열을 설계할 수 있다.
컨스트럭트
'컨스트럭트'라는 용어는 '콘쥬게이트' 또는 '카세트' 및 '하이브리드'와 유사한 용어로 사용되고 직접 또는 간접적으로 프로모터에 부착되어 본 발명에서 정의한 특성을 지닌 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 것이다. 간접적 부착의 예를 들면 인트론 스페이서 즉 Sh1-인트론 또는 the ADH 인트론과 같은 스페이서 그룹을 의미할 수 있으며 본 발명의 뉴클레오타이드 서열과 프로모터간에서 매개하는 것이다. '용융된'라는 용어는 같은 의미로 사용되며 직접 또는 간접 부착에 관련되는 것이다. 어떤 경우에는 이 용어는 야생형 유전자 프로모터와 결합되어 있는 단백질을 코드화하는 뉴클레오타이드 서열과의 자연적 결합을 의미하지 않는다. 물론 이 때 뉴클레오타이드 서열과 프로모터는 모두 자연 환경에 존재하는 것이다.
컨스트럭트는 유전적 컨스트럭트의 선별을 위한 마커를 포함하거나 발현시킬 수 있다.
어떤 적용에서 본 발명의 뉴클레오타이드 서열 또는 본 명세서 내에 정의된 특성을 지닌 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 컨스트럭트는 프로모터와 작동가능하게 연결되어 있다.
생물체
본 발명에 관련된 '생물체'라는 용어는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 본 명세서 내에 정의된 특성을 지닌 폴리펩타이드 및/또는 그들로부터 수득된 물질을 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 어느 생명체 일 수 있다.
본 발명에 관련된 '형질전환 생물체'라는 용어는 본 발명에 따른 뉴클레오타이드 서열 또는 본 명세서 내에 정의된 특성을 지닌 폴리펩타이드 및/또는 그들로부터 수득된 물질을 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 어느 생명체 일 수 있다. 또한 프로모터는 생물체 내에서 본 명세서에서 정의하는 특성을 지닌 폴리펩타이드를 코드화한 뉴클레오타이드 서열을 발현시킬수 있는 것이다. 바람직하게는 뉴클레오타이드 서열은 생물체의 게놈 내에 통합되어 있는 것이다.
'형질전환 생물체'라는 용어는 자연 환경 내에서 그 자체의 프로모터에 의해 조절될 때 자연 환경 내의 자연적 뉴클레오타이드 코딩 서열을 포함하지는 않는다.
따라서 본 발명의 형질전환 생물체는 본 명세서 내의 특성을 지닌 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열, 본 명세서 내의 컨스트럭트, 본 명세서 내의 벡터, 본 명세서 내의 플라스미드, 본 명세서 내의 세포 또는 그의 생성물의 결합을 하나 이상 포함하는 생물체를 의미한다. 예를 들면 형질전환 생물체는 자연 내의 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 서열과 관련되어 있지 않은 프로모터의 조절 하에 본 명세서에 정의된 특성을 지닌 폴리펩타이드를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 생물체를 의미한다.
숙주 세포
지질 아실 트랜스퍼라제는 진핵 세포 또는 원핵 세포 생물체와 같은 숙주 생물체 내에서 뉴클레오타이드 서열의 발현에 의해 생성될 수 있다.
본 발명의 하나의 실시태양에서 본 발명에 따른 지질 아실 트랜스퍼라제는 예를 들면 박테리아 세포 특히 바실러스속, 예를 들면 Bacillus licheniformis 숙주 세포(WO2008/090395-본 명세서 내에 참고 문헌으로 통합됨)에 의해 발현될 수 있는 것을 의미한다.
다른 숙주 세포로는 균주, 효모 또는 식물체 등을 들 수 있다.
숙주 세포/생물체의 형질전환
숙주 생물체는 원핵 세포 또는 진핵 세포 생물체이다.
적합한 원핵 세포 생물체의 예를 들면 대장균 또는 Bacillus licheniformis와 같은 박테리아 바람직하게는 B. licheniformis이다. 지질 아실 트랜스퍼라제를 코드화하는 뉴클레오타이드 서열로 Bacillus licheniformis의 형질전환은 본 명세서 내에 참고문헌으로 통합되어 있는 WO2008/090395에 개시되어 있다.
원핵 세포 숙주의 형질전환은 예를 들면 Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 상세히 개시되어 있다. 만약 원핵 세포 숙주를 사용하여 발현 시 인트론의 제거와 같은 형질전환 전에 적합한 변형이 뉴클레오타이드 서열에 필요할 수 있다.
형질전환 생물체의 또 다른 실시태양은 효모이다.
필라멘트 진균 세포는 여러 가지 공지된 방법에 따라 형질전환될 수 있으며 이 과정은 프로토프라스트 형성 및 프로토프라스트 형질전환을 포함하고 이에 따라 알려진 방법으로 세포벽을 재생시킨다. Aspergillus를 숙주 미생물로 사용한 방법은 EP 0 238 023에 개시되어 있다.
또 다른 숙주 생물체는 식물체이다. 식물체 형질전환에 사용되는 일반적 기법은 Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205-225) 및 Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)에 개시되어 있다. 추가적 식물 형질전환에 관해서는 EP-A-0449375을 참고 바란다.
본 발명의 하나의 예로써 본 발명에 첨부된 도면 및 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
(실시예 1)
파이토스테롤 에스테르 및 파이토스타놀 에스테르는 저콜레스테롤 효과를 지닌 기능성 성분으로 식품 산업을 포함한 산업에 다수 응용되고 있다.
파이토스테롤 에스테르 및 파이토스타놀 에스테르의 화학적 합성이 완성되었으나 유기 용매를 사용하여 수행되고 형성된 에스테르를 분리하기 위한 다수의 정제 공정을 필요로 한다.
본 발명자들은 파이토스테롤로부터 파이토스테롤 에스테르를 합성하고 파이토스타놀로부터 파이토스타놀 에스테르를 합성하기 위한 효소 촉매로서 지질 아실트랜스퍼라제 사용을 발명하게 된 것이다.
지질 도너는 인지질 조성물이다. 인지질 조성물은 적합하게는 소야 오일의 탈검 수(water)로부터 수득될 수 있는 검 상의 물질이다. 바람직하게는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 반응 조성물 또는 반응 혼합물로부터 분리 또는 정제되어야 하고 분리된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 사용한다. 즉 반응 조성물 또는 혼합물은 예를 들면 유기 용매와 같은 해로운 성분을 포함하지 않는 것으로 파이토스테롤 에스테르 또는 파이토스타놀 에스테르의 정제 및/또는 분리를 해소할 수 있는 것이다.
재료 및 방법
- KLM3’ - 글리세로인지질 콜레스테롤 아실트랜스퍼라제(FoodPro LysoMax Oil) (KTP 08015) - 활성 1300 LATU/g (Danisco A/S로부터 입수 가능)
- 브라질 산 대두유(Solae Aarhus로부터의 SYP)의 탈검 수(water degumming)로부터 수득된 검 상
- 건조 검 상, 로터리 증발기 위에 건조된 SYP
- 파이토스테롤 - Henkel Germany사의 Generol 122 N
HPTLC 분석
파이토스테롤 및 파이토스테롤 에스테르 샘플을 HPTLC를 이용하여 분석하였다.
적용 기구 : 자동 TLC 샘플 4, CAMAG
HPTLC 플레이트 : 20 x 10 cm, Merck no.1.05641. 사용하기 전 160℃에서 10분간 활성화시킴.
적용 : 3ml의 헥산:이소프로판올(3:2) 내에 용해된 0.2g의 검과 파이토스테롤의 반응 혼합물
0.3, 0.5 또는 1㎕의 시료를 HPTLC 플레이트에 적용시킨다.
0.1% 올레산, 0.1% 콜레스테롤 및 0.1% 콜레스테롤 에스테르를 포함하는 표준 용액(no.17)을 0.1, 0.3, 0.5, 0.8 및 1.5㎕ 적용하고 반응 혼합물 내의 파이토스테롤 및 파이토스테롤 에스테르를 계산하는데 사용한다.
TLC 적용자 :
운전 완충액 no.5: P-에테르 : 메틸:터셔리부틸케톤:아세트산 (70:30:1)
용출 : Camag로부터 제조된 Automatic Developing Chamber ADC2를 사용하여 플레이트위에 7cm 용출시킨다.
전개 :
플레이트를 Camag TLC 플레이트 히터 Ⅲ를 사용하여 160℃에서 6분간 건조시키고 냉각한 후 16% H3PO4 내의 6% 커프리 아세테이트에 침적시킨다. 또한 160℃에서 10분간 건조시킨 후 직접 측정한다. TLC 플레이트 위의 성분 밀도는 Camag TLC 스캐너 3를 사용하여 분석한다.
실험 :
파이토스테롤 에스테르의 효소 합성을 표 8에 나타난 레시피를 사용하여 수행한다.
스테롤 에스테르 합성을 위한 레시피
시료 1
(반응 조성물)		 시료 2
(반응 조성물)
건조 검 상 g 10
검 상(30.3% 물, 41.8% 인지질 및 27.9% 트리글리세라이드 및 지방산을 포함함) g 15
Generol 122N g 1 1
KLM’, 1300 TPU/g g 0, 1 0, 1
물 g 0, 2
검 상과 Generol 122N 각각을 서로 혼합한다. 시료 1에는 대부분의 파이토스테롤이 용해되어있다. 시료 2에는 파이토스테롤은 오직 부분적으로 용해되어있다. 효소(물을 첨가할 수 있음)를 첨가하고 시료를 55℃에서 인큐베이션 시킨 후 시료를 하루 및 나흘간 방치한다. 4일 후에 시료 1은 파이토스테롤을 지니지 않은 균질한 액상이었다. 시료 2 역시 거의 균질하였으나 액상은 아니었다.
시료 1의 반응 혼합물 내의 전체 수분 함량은 약 2.2% w/w 수분이었고 시료 2의 반응 혼합물 내의 전체 수분 함량은 약 28.5% w/w 수분이었다.
시료를 TLC에 의해 분석하고 파이토스테롤의 전환을 계산한 후 그 결과를 표 8 및 도 62에 나타낸다.
반응 시간 경과에 따른 파이토스테롤의 에스테르화 %
시료 반응 시간(일 수) 에스테르화 스테롤(%)
1 1 64.6
1 4 94.3
2 1 58.6
2 4 72.8
도 62는 검 상 반응생성물의 TLC 분석 결과를 나타낸 것이다.
표 9의 결과는 예를 들면 KLM 3'과 같은 지질 아실트랜스퍼라제가 모든 시료에서 파이토스테롤을 파이토스테롤 에스테르로 높은 전환을 나타냄을 확인시키고 있다. 90% 이상의 전환은 시료 1에서 관찰되었으며 생성물은 모든 스테롤 에스테르가 용해된 균질한 액상 물질로 나타난다. 시료 2에서도 파이토스테롤이 파이토스테롤 에스테르로 높게 전환됨을 나타낸다.
효소 용량의 적합한 조절에 의해 더 높은 전환과 더 적은 인큐베이션 시간이 가능할 것이다.
스테롤에스테르는 알려진 분리 또는 정제 방법에 의해 분리되거나 정제될 수 있다. 스테롤 에스테르는 식품 조성물 또는 식품 또는 알려진 개인보호용품 등에 사용될 수 있다.
하나의 실시태양에서 100℃의 열처리는 효소를 불활성화시키고 스테롤 에스테르 인지질 시료를 직접적으로 식품 적용 또는 어떠한 분리나 정제과정 없이 스테롤이 풍부한 개인보호용품에 사용할 수 있다.
결론
실험을 통해 예를 들면 오일의 탈 검 수로부터 수득할 수 있는 검 상과 같은 인지질 조성물 및 파이토스테롤로부터 지질 아실트랜스퍼라제에 의한 촉매 효소 반응에 의해 파이토스테롤 에스테르를 생성할 수 있음이 확인되었다. 파이토스테롤로부터 파이토스테롤 에스테르의 90% 이상의 전환이 가능하다.
(실시예 2 )
1 2 3
검 상(30.3% 물, 41.8% 인지질 및 27.9% 트리글리세라이드 및 지방산을 포함함) g 15 15 15
파이토스타놀 g 1 1 2
KLM’(지질 아실트랜스퍼라제), 1300 TPU/g g 0, 1 0, 1
탈 검 수로부터 얻어진 검 상을 55℃에서 가열한다. 나무로부터 분리된 식물 스타놀이 교반하면서 첨가된다. 지질 아실트랜스퍼라제(KLM3’)를 첨가하고 반응 혼합물을 55℃에서 교반하면서 인큐베이션시켰다. 20시간 후에 반응 혼합물을 효소를 불활성화시키기 위해 95℃로 가열한다. 시료를 스타놀 및 스타놀 에스테르를 위해 HPTLC 분석한다.
시료번호 1과 3에서 50% 이상의 스타놀이 에스테르화 되었고 시료번호 2에서는 아무런 스타놀 에스테르가 형성되지 않았다.
본 명세서 내에서 언급된 모든 문헌들은 참고문헌으로 통합되어있다. 본 발명의 방법 및 시스템에 기재된 다양한 변형과 변이가 당업자에게 본 발명의 범위와 정신을 벗어나지 않는 한 명백할 것이다. 비록 본 발명을 특정한 바람직한 실시태양에 관련하여 설명하였지만 청구된 발명은 특정한 실시태양에 한정되는 것은 아니다. 따라서 본 발명을 수행하기 위해 다양한 변형이 생화학 및 바이오테크놀로지 당업자에게 명백할 것이며 첨부하는 청구범위 내에서 의도됨을 확인한다.
NCIMB Ltd. NCIMB41226 20040623 NCIMB Ltd. NCIMB41227 20040623
<110> Danisco A/S <120> METHOD <130> P036169WO <150> GB 0905367.9 <151> 2009-03-27 <160> 112 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 335 <212> PRT <213> Aeromonas hydrophila <400> 1 Met Lys Lys Trp Phe Val Cys Leu Leu Gly Leu Val Ala Leu Thr Val 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asp Ser Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly 20 25 30 Asp Ser Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr 35 40 45 Leu Pro Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro 50 55 60 Val Trp Leu Glu Gln Leu Thr Lys Gln Phe Pro Gly Leu Thr Ile Ala 65 70 75 80 Asn Glu Ala Glu Gly Gly Ala Thr Ala Val Ala Tyr Asn Lys Ile Ser 85 90 95 Trp Asn Pro Lys Tyr Gln Val Ile Asn Asn Leu Asp Tyr Glu Val Thr 100 105 110 Gln Phe Leu Gln Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp Asp Leu Val Ile Leu 115 120 125 Trp Val Gly Ala Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly Trp Asn Thr Glu Gln 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp Ala Ala Asn Arg Met 145 150 155 160 Val Leu Asn Gly Ala Lys Gln Ile Leu Leu Phe Asn Leu Pro Asp Leu 165 170 175 Gly Gln Asn Pro Ser Ala Arg Ser Gln Lys Val Val Glu Ala Val Ser 180 185 190 His Val Ser Ala Tyr His Asn Gln Leu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Gln 195 200 205 Leu Ala Pro Thr Gly Met Val Lys Leu Phe Glu Ile Asp Lys Gln Phe 210 215 220 Ala Glu Met Leu Arg Asp Pro Gln Asn Phe Gly Leu Ser Asp Val Glu 225 230 235 240 Asn Pro Cys Tyr Asp Gly Gly Tyr Val Trp Lys Pro Phe Ala Thr Arg 245 250 255 Ser Val Ser Thr Asp Arg Gln Leu Ser Ala Phe Ser Pro Gln Glu Arg 260 265 270 Leu Ala Ile Ala Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln Ala Val Ala Ser Pro 275 280 285 Met Ala Arg Arg Ser Ala Ser Pro Leu Asn Cys Glu Gly Lys Met Phe 290 295 300 Trp Asp Gln Val His Pro Thr Thr Val Val His Ala Ala Leu Ser Glu 305 310 315 320 Arg Ala Ala Thr Phe Ile Ala Asn Gln Tyr Glu Phe Leu Ala His 325 330 335 <210> 2 <211> 361 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> pfam00657 consensus sequence <400> 2 Ile Val Ala Phe Gly Asp Ser Leu Thr Asp Gly Glu Ala Tyr Tyr Gly 1 5 10 15 Asp Ser Asp Gly Gly Gly Trp Gly Ala Gly Leu Ala Asp Arg Leu Thr 20 25 30 Ala Leu Leu Arg Leu Arg Ala Arg Pro Arg Gly Val Asp Val Phe Asn 35 40 45 Arg Gly Ile Ser Gly Arg Thr Ser Asp Gly Arg Leu Ile Val Asp Ala 50 55 60 Leu Val Ala Leu Leu Phe Leu Ala Gln Ser Leu Gly Leu Pro Asn Leu 65 70 75 80 Pro Pro Tyr Leu Ser Gly Asp Phe Leu Arg Gly Ala Asn Phe Ala Ser 85 90 95 Ala Gly Ala Thr Ile Leu Pro Thr Ser Gly Pro Phe Leu Ile Gln Val 100 105 110 Gln Phe Lys Asp Phe Lys Ser Gln Val Leu Glu Leu Arg Gln Ala Leu 115 120 125 Gly Leu Leu Gln Glu Leu Leu Arg Leu Leu Pro Val Leu Asp Ala Lys 130 135 140 Ser Pro Asp Leu Val Thr Ile Met Ile Gly Thr Asn Asp Leu Ile Thr 145 150 155 160 Ser Ala Phe Phe Gly Pro Lys Ser Thr Glu Ser Asp Arg Asn Val Ser 165 170 175 Val Pro Glu Phe Lys Asp Asn Leu Arg Gln Leu Ile Lys Arg Leu Arg 180 185 190 Ser Asn Asn Gly Ala Arg Ile Ile Val Leu Ile Thr Leu Val Ile Leu 195 200 205 Asn Leu Gly Pro Leu Gly Cys Leu Pro Leu Lys Leu Ala Leu Ala Leu 210 215 220 Ala Ser Ser Lys Asn Val Asp Ala Ser Gly Cys Leu Glu Arg Leu Asn 225 230 235 240 Glu Ala Val Ala Asp Phe Asn Glu Ala Leu Arg Glu Leu Ala Ile Ser 245 250 255 Lys Leu Glu Asp Gln Leu Arg Lys Asp Gly Leu Pro Asp Val Lys Gly 260 265 270 Ala Asp Val Pro Tyr Val Asp Leu Tyr Ser Ile Phe Gln Asp Leu Asp 275 280 285 Gly Ile Gln Asn Pro Ser Ala Tyr Val Tyr Gly Phe Glu Thr Thr Lys 290 295 300 Ala Cys Cys Gly Tyr Gly Gly Arg Tyr Asn Tyr Asn Arg Val Cys Gly 305 310 315 320 Asn Ala Gly Leu Cys Asn Val Thr Ala Lys Ala Cys Asn Pro Ser Ser 325 330 335 Tyr Leu Leu Ser Phe Leu Phe Trp Asp Gly Phe His Pro Ser Glu Lys 340 345 350 Gly Tyr Lys Ala Val Ala Glu Ala Leu 355 360 <210> 3 <211> 335 <212> PRT <213> Aeromonas hydrophila <400> 3 Met Lys Lys Trp Phe Val Cys Leu Leu Gly Leu Val Ala Leu Thr Val 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asp Ser Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly 20 25 30 Asp Ser Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr 35 40 45 Leu Pro Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro 50 55 60 Val Trp Leu Glu Gln Leu Thr Asn Glu Phe Pro Gly Leu Thr Ile Ala 65 70 75 80 Asn Glu Ala Glu Gly Gly Pro Thr Ala Val Ala Tyr Asn Lys Ile Ser 85 90 95 Trp Asn Pro Lys Tyr Gln Val Ile Asn Asn Leu Asp Tyr Glu Val Thr 100 105 110 Gln Phe Leu Gln Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp Asp Leu Val Ile Leu 115 120 125 Trp Val Gly Ala Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly Trp Asn Thr Glu Gln 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp Ala Ala Asn Arg Met 145 150 155 160 Val Leu Asn Gly Ala Lys Glu Ile Leu Leu Phe Asn Leu Pro Asp Leu 165 170 175 Gly Gln Asn Pro Ser Ala Arg Ser Gln Lys Val Val Glu Ala Ala Ser 180 185 190 His Val Ser Ala Tyr His Asn Gln Leu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Gln 195 200 205 Leu Ala Pro Thr Gly Met Val Lys Leu Phe Glu Ile Asp Lys Gln Phe 210 215 220 Ala Glu Met Leu Arg Asp Pro Gln Asn Phe Gly Leu Ser Asp Gln Arg 225 230 235 240 Asn Ala Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Val Trp Lys Pro Phe Ala Ser Arg 245 250 255 Ser Ala Ser Thr Asp Ser Gln Leu Ser Ala Phe Asn Pro Gln Glu Arg 260 265 270 Leu Ala Ile Ala Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln Ala Val Ala Ser Pro 275 280 285 Met Ala Ala Arg Ser Ala Ser Thr Leu Asn Cys Glu Gly Lys Met Phe 290 295 300 Trp Asp Gln Val His Pro Thr Thr Val Val His Ala Ala Leu Ser Glu 305 310 315 320 Pro Ala Ala Thr Phe Ile Glu Ser Gln Tyr Glu Phe Leu Ala His 325 330 335 <210> 4 <211> 336 <212> PRT <213> Aeromonas salmonicida <400> 4 Met Lys Lys Trp Phe Val Cys Leu Leu Gly Leu Ile Ala Leu Thr Val 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asp Thr Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly 20 25 30 Asp Ser Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr 35 40 45 Leu Pro Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro 50 55 60 Val Trp Leu Glu Gln Leu Thr Lys Gln Phe Pro Gly Leu Thr Ile Ala 65 70 75 80 Asn Glu Ala Glu Gly Gly Ala Thr Ala Val Ala Tyr Asn Lys Ile Ser 85 90 95 Trp Asn Pro Lys Tyr Gln Val Tyr Asn Asn Leu Asp Tyr Glu Val Thr 100 105 110 Gln Phe Leu Gln Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp Asp Leu Val Ile Leu 115 120 125 Trp Val Gly Ala Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly Trp Asn Thr Glu Gln 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp Ala Ala Asn Arg Met 145 150 155 160 Val Leu Asn Gly Ala Lys Gln Ile Leu Leu Phe Asn Leu Pro Asp Leu 165 170 175 Gly Gln Asn Pro Ser Ala Arg Ser Gln Lys Val Val Glu Ala Val Ser 180 185 190 His Val Ser Ala Tyr His Asn Lys Leu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Gln 195 200 205 Leu Ala Pro Thr Gly Met Val Lys Leu Phe Glu Ile Asp Lys Gln Phe 210 215 220 Ala Glu Met Leu Arg Asp Pro Gln Asn Phe Gly Leu Ser Asp Val Glu 225 230 235 240 Asn Pro Cys Tyr Asp Gly Gly Tyr Val Trp Lys Pro Phe Ala Thr Arg 245 250 255 Ser Val Ser Thr Asp Arg Gln Leu Ser Ala Phe Ser Pro Gln Glu Arg 260 265 270 Leu Ala Ile Ala Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln Ala Val Ala Ser Pro 275 280 285 Met Ala Arg Arg Ser Ala Ser Pro Leu Asn Cys Glu Gly Lys Met Phe 290 295 300 Trp Asp Gln Val His Pro Thr Thr Val Val His Ala Ala Leu Ser Glu 305 310 315 320 Arg Ala Ala Thr Phe Ile Glu Thr Gln Tyr Glu Phe Leu Ala His Gly 325 330 335 <210> 5 <211> 295 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 5 Met Pro Lys Pro Ala Leu Arg Arg Val Met Thr Ala Thr Val Ala Ala 1 5 10 15 Val Gly Thr Leu Ala Leu Gly Leu Thr Asp Ala Thr Ala His Ala Ala 20 25 30 Pro Ala Gln Ala Thr Pro Thr Leu Asp Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser 35 40 45 Tyr Ser Ala Gly Ser Gly Val Leu Pro Val Asp Pro Ala Asn Leu Leu 50 55 60 Cys Leu Arg Ser Thr Ala Asn Tyr Pro His Val Ile Ala Asp Thr Thr 65 70 75 80 Gly Ala Arg Leu Thr Asp Val Thr Cys Gly Ala Ala Gln Thr Ala Asp 85 90 95 Phe Thr Arg Ala Gln Tyr Pro Gly Val Ala Pro Gln Leu Asp Ala Leu 100 105 110 Gly Thr Gly Thr Asp Leu Val Thr Leu Thr Ile Gly Gly Asn Asp Asn 115 120 125 Ser Thr Phe Ile Asn Ala Ile Thr Ala Cys Gly Thr Ala Gly Val Leu 130 135 140 Ser Gly Gly Lys Gly Ser Pro Cys Lys Asp Arg His Gly Thr Ser Phe 145 150 155 160 Asp Asp Glu Ile Glu Ala Asn Thr Tyr Pro Ala Leu Lys Glu Ala Leu 165 170 175 Leu Gly Val Arg Ala Arg Ala Pro His Ala Arg Val Ala Ala Leu Gly 180 185 190 Tyr Pro Trp Ile Thr Pro Ala Thr Ala Asp Pro Ser Cys Phe Leu Lys 195 200 205 Leu Pro Leu Ala Ala Gly Asp Val Pro Tyr Leu Arg Ala 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Asn Gly Gln 245 250 255 Ser Lys Gly Tyr Leu Pro Val Leu Asn Ser Ala Thr 260 265 <210> 15 <211> 336 <212> PRT <213> Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida <400> 15 Met Lys Lys Trp Phe Val Cys Leu Leu Gly Leu Ile Ala Leu Thr Val 1 5 10 15 Gln Ala Ala Asp Thr Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly 20 25 30 Asp Ser Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr 35 40 45 Leu Pro Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro 50 55 60 Val Trp Leu Glu Gln Leu Thr Lys Gln Phe Pro Gly Leu Thr Ile Ala 65 70 75 80 Asn Glu Ala Glu Gly Gly Ala Thr Ala Val Ala Tyr Asn Lys Ile Ser 85 90 95 Trp Asn Pro Lys Tyr Gln Val Ile Asn Asn Leu Asp Tyr Glu Val Thr 100 105 110 Gln Phe Leu Gln Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp Asp Leu Val Ile Leu 115 120 125 Trp Val Gly Ala Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly Trp Asn Thr Glu Gln 130 135 140 Asp Ala Lys Arg Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp Ala Ala Asn Arg Met 145 150 155 160 Val Leu Asn Gly Ala Lys Gln Ile Leu Leu Phe Asn Leu Pro Asp Leu 165 170 175 Gly Gln Asn Pro Ser Ala Arg Ser Gln Lys Val Val Glu Ala Val Ser 180 185 190 His Val Ser Ala Tyr His Asn Lys Leu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Gln 195 200 205 Leu Ala Pro Thr Gly Met Val Lys Leu Phe Glu Ile Asp Lys Gln Phe 210 215 220 Ala Glu Met Leu Arg Asp Pro Gln Asn Phe Gly Leu Ser Asp Val Glu 225 230 235 240 Asn Pro Cys Tyr Asp Gly Gly Tyr Val Trp Lys Pro Phe Ala Thr Arg 245 250 255 Ser Val Ser Thr Asp Arg Gln Leu Ser Ala Phe Ser Pro Gln Glu Arg 260 265 270 Leu Ala Ile Ala Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln Ala Val Ala Ser Pro 275 280 285 Met Ala Arg Arg Ser Ala Ser Pro Leu Asn Cys Glu Gly Lys Met Phe 290 295 300 Trp Asp Gln Val His Pro Thr Thr Val Val His Ala Ala Leu Ser Glu 305 310 315 320 Arg Ala Ala Thr Phe Ile Glu Thr Gln Tyr Glu Phe Leu Ala His Gly 325 330 335 <210> 16 <211> 318 <212> PRT <213> Aeromonas salmonicida <400> 16 Ala Asp Thr Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly Asp Ser 1 5 10 15 Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro Val Trp 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Thr Lys Gln Phe Pro Gly Leu Thr Ile Ala Asn Glu 50 55 60 Ala Glu Gly Gly Ala Thr Ala Val Ala Tyr Asn Lys Ile Ser Trp Asp 65 70 75 80 Pro Lys Tyr Gln Val Ile Asn Asn Leu Asp Tyr Glu Val Thr Gln Phe 85 90 95 Leu Gln Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp Asp Leu Val Ile Leu Trp Val 100 105 110 Gly Ala Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly Trp Asn Thr Glu Gln Asp Ala 115 120 125 Lys Arg Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp Ala Ala Asn Arg Met Val Leu 130 135 140 Asn Gly Ala Lys Gln Ile Leu Leu Phe Asn Leu Pro Asp Leu Gly Gln 145 150 155 160 Asn Pro Ser Ala Arg Ser Gln Lys Val Val Glu Ala Val Ser His Val 165 170 175 Ser Ala Tyr His Asn Lys Leu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Gln Leu Ala 180 185 190 Pro Thr Gly Met Val Lys Leu Phe Glu Ile Asp Lys Gln Phe Ala Glu 195 200 205 Met Leu Arg Asp Pro Gln Asn Phe Gly Leu Ser Asp Val Glu Asn Pro 210 215 220 Cys Tyr Asp Gly Gly Tyr Val Trp Lys Pro Phe Ala Thr Arg Ser Val 225 230 235 240 Ser Thr Asp Arg Gln Leu Ser Ala Phe Ser Pro Gln Glu Arg Leu Ala 245 250 255 Ile Ala Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln Ala Val Ala Ser Pro Met Ala 260 265 270 Arg Arg Ser Ala Ser Pro Leu Asn Cys Glu Gly Lys Met Phe Trp Asp 275 280 285 Gln Val His Pro Thr Thr Val Val His Ala Ala Leu Ser Glu Arg Ala 290 295 300 Ala Thr Phe Ile Glu Thr Gln Tyr Glu Phe Leu Ala His Gly 305 310 315 <210> 17 <211> 465 <212> PRT <213> Candida parapsilosis <400> 17 Met Arg Tyr Phe Ala Ile Ala Phe Leu Leu Ile Asn Thr Ile Ser Ala 1 5 10 15 Phe Val Leu Ala Pro Lys Lys Pro Ser Gln Asp Asp Phe Tyr Thr Pro 20 25 30 Pro Gln Gly Tyr Glu Ala Gln Pro Leu Gly Ser Ile Leu Lys Thr Arg 35 40 45 Asn Val Pro Asn Pro Leu Thr Asn Val Phe Thr Pro Val Lys Val Gln 50 55 60 Asn Ala Trp Gln Leu Leu Val Arg Ser Glu Asp Thr Phe Gly Asn Pro 65 70 75 80 Asn Ala Ile Val Thr Thr Ile Ile Gln Pro Phe Asn Ala Lys Lys Asp 85 90 95 Lys Leu Val Ser Tyr Gln Thr Phe Glu Asp Ser Gly Lys Leu Asp Cys 100 105 110 Ala Pro Ser Tyr Ala Ile Gln Tyr Gly Ser Asp Ile Ser Thr Leu Thr 115 120 125 Thr Gln Gly Glu Met Tyr Tyr Ile Ser Ala Leu Leu Asp Gln Gly Tyr 130 135 140 Tyr Val Val Thr Pro Asp Tyr Glu Gly Pro Lys Ser Thr Phe Thr Val 145 150 155 160 Gly Leu Gln Ser Gly Arg Ala Thr Leu Asn Ser Leu Arg Ala Thr Leu 165 170 175 Lys Ser Gly Asn Leu Thr Gly Val Ser Ser Asp Ala Glu Thr Leu Leu 180 185 190 Trp Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ser Gly Trp Ala Ala Ala Ile 195 200 205 Gln Lys Glu Tyr Ala Pro Glu Leu Ser Lys Asn Leu Leu Gly Ala Ala 210 215 220 Leu Gly Gly Phe Val Thr Asn Ile Thr Ala Thr Ala Glu Ala Val Asp 225 230 235 240 Ser Gly Pro Phe Ala Gly Ile Ile Ser Asn Ala Leu Ala Gly Ile Gly 245 250 255 Asn Glu Tyr Pro Asp Phe Lys Asn Tyr Leu Leu Lys Lys Val Ser Pro 260 265 270 Leu Leu Ser Ile Thr Tyr Arg Leu Gly Asn Thr His Cys Leu Leu Asp 275 280 285 Gly Gly Ile Ala Tyr Phe Gly Lys Ser Phe Phe Ser Arg Ile Ile Arg 290 295 300 Tyr Phe Pro Asp Gly Trp Asp Leu Val Asn Gln Glu Pro Ile Lys Thr 305 310 315 320 Ile Leu Gln Asp Asn Gly Leu Val Tyr Gln Pro Lys Asp Leu Thr Pro 325 330 335 Gln Ile Pro Leu Phe Ile Tyr His Gly Thr Leu Asp Ala Ile Val Pro 340 345 350 Ile Val Asn Ser Arg Lys Thr Phe Gln Gln Trp Cys Asp Trp Gly Leu 355 360 365 Lys Ser Gly Glu Tyr Asn Glu Asp Leu Thr Asn Gly His Ile Thr Glu 370 375 380 Ser Ile Val Gly Ala Pro Ala Ala Leu Thr Trp Ile Ile Asn Arg Phe 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Pro Val Asp Gly Cys Gln His Asn Val Arg Ala Ser 405 410 415 Asn Leu Glu Tyr Pro Gly Thr Pro Gln Ser Ile Lys Asn Tyr Phe Glu 420 425 430 Ala Ala Leu His Ala Ile Leu Gly Phe Asp Leu Gly Pro Asp Val Lys 435 440 445 Arg Asp Lys Val Thr Leu Gly Gly Leu Leu Lys Leu Glu Arg Phe Ala 450 455 460 Phe 465 <210> 18 <211> 471 <212> PRT <213> Candida parapsilosis <400> 18 Met Arg Tyr Phe Ala Ile Ala Phe Leu Leu Ile Asn Thr Ile Ser Ala 1 5 10 15 Phe Val Leu Ala Pro Lys Lys Pro Ser Gln Asp Asp Phe Tyr Thr Pro 20 25 30 Pro Gln Gly Tyr Glu Ala Gln Pro Leu Gly Ser Ile Leu Lys Thr Arg 35 40 45 Asn Val Pro Asn Pro Leu Thr Asn Val Phe Thr Pro Val Lys Val Gln 50 55 60 Asn Ala Trp Gln Leu Leu Val Arg Ser Glu Asp Thr Phe Gly Asn Pro 65 70 75 80 Asn Ala Ile Val Thr Thr Ile Ile Gln Pro Phe Asn Ala Lys Lys Asp 85 90 95 Lys Leu Val Ser Tyr Gln Thr Phe Glu Asp Ser Gly Lys Leu Asp Cys 100 105 110 Ala Pro Ser Tyr Ala Ile Gln Tyr Gly Ser Asp Ile Ser Thr Leu Thr 115 120 125 Thr Gln Gly Glu Met Tyr Tyr Ile Ser Ala Leu Leu Asp Gln Gly Tyr 130 135 140 Tyr Val Val Thr Pro Asp Tyr Glu Gly Pro Lys Ser Thr Phe Thr Val 145 150 155 160 Gly Leu Gln Ser Gly Arg Ala Thr Leu Asn Ser Leu Arg Ala Thr Leu 165 170 175 Lys Ser Gly Asn Leu Thr Gly Val Ser Ser Asp Ala Glu Thr Leu Leu 180 185 190 Trp Gly Tyr Ser Gly Gly Ser Leu Ala Ser Gly Trp Ala Ala Ala Ile 195 200 205 Gln Lys Glu Tyr Ala Pro Glu Leu Ser Lys Asn Leu Leu Gly Ala Ala 210 215 220 Leu Gly Gly Phe Val Thr Asn Ile Thr Ala Thr Ala Glu Ala Val Asp 225 230 235 240 Ser Gly Pro Phe Ala Gly Ile Ile Ser Asn Ala Leu Ala Gly Ile Gly 245 250 255 Asn Glu Tyr Pro Asp Phe Lys Asn Tyr Leu Leu Lys Lys Val Ser Pro 260 265 270 Leu Leu Ser Ile Thr Tyr Arg Leu Gly Asn Thr His Cys Leu Leu Asp 275 280 285 Gly Gly Ile Ala Tyr Phe Gly Lys Ser Phe Phe Ser Arg Ile Ile Arg 290 295 300 Tyr Phe Pro Asp Gly Trp Asp Leu Val Asn Gln Glu Pro Ile Lys Thr 305 310 315 320 Ile Leu Gln Asp Asn Gly Leu Val Tyr Gln Pro Lys Asp Leu Thr Pro 325 330 335 Gln Ile Pro Leu Phe Ile Tyr His Gly Thr Leu Asp Ala Ile Val Pro 340 345 350 Ile Val Asn Ser Arg Lys Thr Phe Gln Gln Trp Cys Asp Trp Gly Leu 355 360 365 Lys Ser Gly Glu Tyr Asn Glu Asp Leu Thr Asn Gly His Ile Thr Glu 370 375 380 Ser Ile Val Gly Ala Pro Ala Ala Leu Thr Trp Ile Ile Asn Arg Phe 385 390 395 400 Asn Gly Gln Pro Pro Val Asp Gly Cys Gln His Asn Val Arg Ala Ser 405 410 415 Asn Leu Glu Tyr Pro Gly Thr Pro Gln Ser Ile Lys Asn Tyr Phe Glu 420 425 430 Ala Ala Leu His Ala Ile Leu Gly Phe Asp Leu Gly Pro Asp Val Lys 435 440 445 Arg Asp Lys Val Thr Leu Gly Gly Leu Leu Lys Leu Glu Arg Phe Ala 450 455 460 Phe His His His His His His 465 470 <210> 19 <211> 261 <212> PRT <213> Streptomyces coelicolor <400> 19 Met Ile Gly Ser Tyr Val Ala Val Gly Asp Ser Phe Thr Glu Gly Val 1 5 10 15 Gly Asp Pro Gly Pro Asp Gly Ala Phe Val Gly Trp Ala Asp Arg Leu 20 25 30 Ala Val Leu Leu Ala Asp Arg Arg Pro Glu Gly Asp Phe Thr Tyr Thr 35 40 45 Asn Leu Ala Val Arg Gly Arg Leu Leu Asp Gln Ile Val Ala Glu Gln 50 55 60 Val Pro Arg Val Val Gly Leu Ala Pro Asp Leu Val Ser Phe Ala Ala 65 70 75 80 Gly Gly Asn Asp Ile Ile Arg Pro Gly Thr Asp Pro Asp Glu Val Ala 85 90 95 Glu Arg Phe Glu Leu Ala Val Ala Ala Leu Thr Ala Ala Ala Gly Thr 100 105 110 Val Leu Val Thr Thr Gly Phe Asp Thr Arg Gly Val Pro Val Leu Lys 115 120 125 His Leu Arg Gly Lys Ile Ala Thr Tyr Asn Gly His Val Arg Ala Ile 130 135 140 Ala Asp Arg Tyr Gly Cys Pro Val Leu Asp Leu Trp Ser Leu Arg Ser 145 150 155 160 Val Gln Asp Arg Arg Ala Trp Asp Ala Asp Arg Leu His Leu Ser Pro 165 170 175 Glu Gly His Thr Arg Val Ala Leu Arg Ala Gly Gln Ala Leu Gly Leu 180 185 190 Arg Val Pro Ala Asp Pro Asp Gln Pro Trp Pro Pro Leu Pro Pro Arg 195 200 205 Gly Thr Leu Asp Val Arg Arg Asp Asp Val His Trp Ala Arg Glu Tyr 210 215 220 Leu Val Pro Trp Ile Gly Arg Arg Leu Arg Gly Glu Ser Ser Gly Asp 225 230 235 240 His Val Thr Ala Lys Gly Thr Leu Ser Pro Asp Ala Ile Lys Thr Arg 245 250 255 Ile Ala Ala Val Ala 260 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence motif <220> <221> VARIANT <222> (4) <223> Xaa may be any of the following amino acid residues Leu, Ala, Val, Ile, Phe, Tyr, His, Gln, Thr, Asn, Met or Ser. <400> 20 Gly Asp Ser Xaa 1 <210> 21 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence motif <220> <221> VARIANT <222> (2) <223> May be Gly <220> <221> VARIANT <222> (5) <223> May be Ala or Leu <400> 21 Gly Ala Asn Asp Tyr 1 5 <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence motif <220> <221> PEPTIDE <222> (2)..(3) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 22 Asp Xaa Xaa His 1 <210> 23 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Sequence motif <400> 23 Arg Arg Ser Ala Ser 1 5 <210> 24 <211> 1047 <212> DNA <213> Aeromonas hydrophila <400> 24 atgtttaagt ttaaaaagaa tttcttagtt ggattatcgg cagctttaat gagtattagc 60 ttgttttcgg caaccgcctc tgcagctagc gccgacagcc gtcccgcctt ttcccggatc 120 gtgatgttcg gcgacagcct ctccgatacc ggcaaaatgt acagcaagat gcgcggttac 180 ctcccctcca gcccgcccta ctatgagggc cgtttctcca acggacccgt ctggctggag 240 cagctgacca aacagttccc gggtctgacc atcgccaacg aagcggaagg cggtgccact 300 gccgtggctt acaacaagat ctcctggaat cccaagtatc aggtcatcaa caacctggac 360 tacgaggtca cccagttctt gcagaaagac agcttcaagc cggacgatct ggtgatcctc 420 tgggtcggtg ccaatgacta tctggcctat ggctggaaca cggagcagga tgccaagcgg 480 gttcgcgatg ccatcagcga tgcggccaac cgcatggtac tgaacggtgc caagcagata 540 ctgctgttca acctgccgga tctgggccag aacccgtcag ctcgcagtca gaaggtggtc 600 gaggcggtca gccatgtctc cgcctatcac aaccagctgc tgctgaacct ggcacgccag 660 ctggccccca ccggcatggt aaagctgttc gagatcgaca agcaatttgc cgagatgctg 720 cgtgatccgc agaacttcgg cctgagcgac gtcgagaacc cctgctacga cggcggctat 780 gtgtggaagc cgtttgccac ccgcagcgtc agcaccgacc gccagctctc cgccttcagt 840 ccgcaggaac gcctcgccat cgccggcaac ccgctgctgg cacaggccgt tgccagtcct 900 atggcccgcc gcagcgccag ccccctcaac tgtgagggca agatgttctg ggatcaggta 960 cacccgacca ctgtcgtgca cgcagccctg agcgagcgcg ccgccacctt catcgcgaac 1020 cagtacgagt tcctcgccca ctgatga 1047 <210> 25 <211> 347 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Fusion construct used for mutagenesis <400> 25 Met Phe Lys Phe Lys Lys Asn Phe Leu Val Gly Leu Ser Ala Ala Leu 1 5 10 15 Met Ser Ile Ser Leu Phe Ser Ala Thr Ala Ser Ala Ala Ser Ala Asp 20 25 30 Ser Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly Asp Ser Leu Ser 35 40 45 Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr Leu Pro Ser Ser 50 55 60 Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro Val Trp Leu Glu 65 70 75 80 Gln Leu Thr Lys Gln Phe Pro Gly Leu Thr Ile Ala Asn Glu Ala Glu 85 90 95 Gly Gly Ala Thr Ala Val Ala Tyr Asn Lys Ile Ser Trp Asn Pro Lys 100 105 110 Tyr Gln Val Ile Asn Asn Leu Asp Tyr Glu Val Thr Gln Phe Leu Gln 115 120 125 Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp Asp Leu Val Ile Leu Trp Val Gly Ala 130 135 140 Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly Trp Asn Thr Glu Gln Asp Ala Lys Arg 145 150 155 160 Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp Ala Ala Asn Arg Met Val Leu Asn Gly 165 170 175 Ala Lys Gln Ile Leu Leu Phe Asn Leu Pro Asp Leu Gly Gln Asn Pro 180 185 190 Ser Ala Arg Ser Gln Lys Val Val Glu Ala Val Ser His Val Ser Ala 195 200 205 Tyr His Asn Gln Leu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Gln Leu Ala Pro Thr 210 215 220 Gly Met Val Lys Leu Phe Glu Ile Asp Lys Gln Phe Ala Glu Met Leu 225 230 235 240 Arg Asp Pro Gln Asn Phe Gly Leu Ser Asp Val Glu Asn Pro Cys Tyr 245 250 255 Asp Gly Gly Tyr Val Trp Lys Pro Phe Ala Thr Arg Ser Val Ser Thr 260 265 270 Asp Arg Gln Leu Ser Ala Phe Ser Pro Gln Glu Arg Leu Ala Ile Ala 275 280 285 Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln Ala Val Ala Ser Pro Met Ala Arg Arg 290 295 300 Ser Ala Ser Pro Leu Asn Cys Glu Gly Lys Met Phe Trp Asp Gln Val 305 310 315 320 His Pro Thr Thr Val Val His Ala Ala Leu Ser Glu Arg Ala Ala Thr 325 330 335 Phe Ile Ala Asn Gln Tyr Glu Phe Leu Ala His 340 345 <210> 26 <211> 267 <212> PRT <213> Streptomyces sp. <400> 26 Met Arg Leu Thr Arg Ser Leu Ser Ala Ala Ser Val Ile Val Phe Ala 1 5 10 15 Leu Leu Leu Ala Leu Leu Gly Ile Ser Pro Ala Gln Ala Ala Gly Pro 20 25 30 Ala Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Asn Gly Ala Gly 35 40 45 Ser Tyr Ile Asp Ser Ser Gly Asp Cys His Arg Ser Asn Asn Ala Tyr 50 55 60 Pro Ala Arg Trp Ala Ala Ala Asn Ala Pro Ser Ser Phe Thr Phe Ala 65 70 75 80 Ala Cys Ser Gly Ala Val Thr Thr Asp Val Ile Asn Asn Gln Leu Gly 85 90 95 Ala Leu Asn Ala Ser Thr Gly Leu Val Ser Ile Thr Ile Gly Gly Asn 100 105 110 Asp Ala Gly Phe Ala Asp Ala Met Thr Thr Cys Val Thr Ser Ser Asp 115 120 125 Ser Thr Cys Leu Asn Arg Leu Ala Thr Ala Thr Asn Tyr Ile Asn Thr 130 135 140 Thr Leu Leu Ala Arg Leu Asp Ala Val Tyr Ser Gln Ile Lys Ala Arg 145 150 155 160 Ala Pro Asn Ala Arg Val Val Val Leu Gly Tyr Pro Arg Met Tyr Leu 165 170 175 Ala Ser Asn Pro Trp Tyr Cys Leu Gly Leu Ser Asn Thr Lys Arg Ala 180 185 190 Ala Ile Asn Thr Thr Ala Asp Thr Leu Asn Ser Val Ile Ser Ser Arg 195 200 205 Ala Thr Ala His Gly Phe Arg Phe Gly Asp Val Arg Pro Thr Phe Asn 210 215 220 Asn His Glu Leu Phe Phe Gly Asn Asp Trp Leu His Ser Leu Thr Leu 225 230 235 240 Pro Val Trp Glu Ser Tyr His Pro Thr Ser Thr Gly His Gln Ser Gly 245 250 255 Tyr Leu Pro Val Leu Asn Ala Asn Ser Ser Thr 260 265 <210> 27 <211> 548 <212> PRT <213> Thermobifida sp. <400> 27 Met Leu Pro His Pro Ala Gly Glu Arg Gly Glu Val Gly Ala Phe Phe 1 5 10 15 Ala Leu Leu Val Gly Thr Pro Gln Asp Arg Arg Leu Arg Leu Glu Cys 20 25 30 His Glu Thr Arg Pro Leu Arg Gly Arg Cys Gly Cys Gly Glu Arg Arg 35 40 45 Val Pro Pro Leu Thr Leu Pro Gly Asp Gly Val Leu Cys Thr Thr Ser 50 55 60 Ser Thr Arg Asp Ala Glu Thr Val Trp Arg Lys His Leu Gln Pro Arg 65 70 75 80 Pro Asp Gly Gly Phe Arg Pro His Leu Gly Val Gly Cys Leu Leu Ala 85 90 95 Gly Gln Gly Ser Pro Gly Val Leu Trp Cys Gly Arg Glu Gly Cys Arg 100 105 110 Phe Glu Val Cys Arg Arg Asp Thr Pro Gly Leu Ser Arg Thr Arg Asn 115 120 125 Gly Asp Ser Ser Pro Pro Phe Arg Ala Gly Trp Ser Leu Pro Pro Lys 130 135 140 Cys Gly Glu Ile Ser Gln Ser Ala Arg Lys Thr Pro Ala Val Pro Arg 145 150 155 160 Tyr Ser Leu Leu Arg Thr Asp Arg Pro Asp Gly Pro Arg Gly Arg Phe 165 170 175 Val Gly Ser Gly Pro Arg Ala Ala Thr Arg Arg Arg Leu Phe Leu Gly 180 185 190 Ile Pro Ala Leu Val Leu Val Thr Ala Leu Thr Leu Val Leu Ala Val 195 200 205 Pro Thr Gly Arg Glu Thr Leu Trp Arg Met Trp Cys Glu Ala Thr Gln 210 215 220 Asp Trp Cys Leu Gly Val Pro Val Asp Ser Arg Gly Gln Pro Ala Glu 225 230 235 240 Asp Gly Glu Phe Leu Leu Leu Ser Pro Val Gln Ala Ala Thr Trp Gly 245 250 255 Asn Tyr Tyr Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Asp Gly Ala Arg 260 265 270 Asp Tyr Tyr Pro Gly Thr Ala Val Lys Gly Gly Cys Trp Arg Ser Ala 275 280 285 Asn Ala Tyr Pro Glu Leu Val Ala Glu Ala Tyr Asp Phe Ala Gly His 290 295 300 Leu Ser Phe Leu Ala Cys Ser Gly Gln Arg Gly Tyr Ala Met Leu Asp 305 310 315 320 Ala Ile Asp Glu Val Gly Ser Gln Leu Asp Trp Asn Ser Pro His Thr 325 330 335 Ser Leu Val Thr Ile Gly Ile Gly Gly Asn Asp Leu Gly Phe Ser Thr 340 345 350 Val Leu Lys Thr Cys Met Val Arg Val Pro Leu Leu Asp Ser Lys Ala 355 360 365 Cys Thr Asp Gln Glu Asp Ala Ile Arg Lys Arg Met Ala Lys Phe Glu 370 375 380 Thr Thr Phe Glu Glu Leu Ile Ser Glu Val Arg Thr Arg Ala Pro Asp 385 390 395 400 Ala Arg Ile Leu Val Val Gly Tyr Pro Arg Ile Phe Pro Glu Glu Pro 405 410 415 Thr Gly Ala Tyr Tyr Thr Leu Thr Ala Ser Asn Gln Arg Trp Leu Asn 420 425 430 Glu Thr Ile Gln Glu Phe Asn Gln Gln Leu Ala Glu Ala Val Ala Val 435 440 445 His Asp Glu Glu Ile Ala Ala Ser Gly Gly Val Gly Ser Val Glu Phe 450 455 460 Val Asp Val Tyr His Ala Leu Asp Gly His Glu Ile Gly Ser Asp Glu 465 470 475 480 Pro Trp Val Asn Gly Val Gln Leu Arg Asp Leu Ala Thr Gly Val Thr 485 490 495 Val Asp Arg Ser Thr Phe His Pro Asn Ala Ala Gly His Arg Ala Val 500 505 510 Gly Glu Arg Val Ile Glu Gln Ile Glu Thr Gly Pro Gly Arg Pro Leu 515 520 525 Tyr Ala Thr Phe Ala Val Val Ala Gly Ala Thr Val Asp Thr Leu Ala 530 535 540 Gly Glu Val Gly 545 <210> 28 <211> 372 <212> PRT <213> Thermobifida sp. <400> 28 Met Gly Ser Gly Pro Arg Ala Ala Thr Arg Arg Arg Leu Phe Leu Gly 1 5 10 15 Ile Pro Ala Leu Val Leu Val Thr Ala Leu Thr Leu Val Leu Ala Val 20 25 30 Pro Thr Gly Arg Glu Thr Leu Trp Arg Met Trp Cys Glu Ala Thr Gln 35 40 45 Asp Trp Cys Leu Gly Val Pro Val Asp Ser Arg Gly Gln Pro Ala Glu 50 55 60 Asp Gly Glu Phe Leu Leu Leu Ser Pro Val Gln Ala Ala Thr Trp Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Tyr Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly Asp Gly Ala Arg 85 90 95 Asp Tyr Tyr Pro Gly Thr Ala Val Lys Gly Gly Cys Trp Arg Ser Ala 100 105 110 Asn Ala Tyr Pro Glu Leu Val Ala Glu Ala Tyr Asp Phe Ala Gly His 115 120 125 Leu Ser Phe Leu Ala Cys Ser Gly Gln Arg Gly Tyr Ala Met Leu Asp 130 135 140 Ala Ile Asp Glu Val Gly Ser Gln Leu Asp Trp Asn Ser Pro His Thr 145 150 155 160 Ser Leu Val Thr Ile Gly Ile Gly Gly Asn Asp Leu Gly Phe Ser Thr 165 170 175 Val Leu Lys Thr Cys Met Val Arg Val Pro Leu Leu Asp Ser Lys Ala 180 185 190 Cys Thr Asp Gln Glu Asp Ala Ile Arg Lys Arg Met Ala Lys Phe Glu 195 200 205 Thr Thr Phe Glu Glu Leu Ile Ser Glu Val Arg Thr Arg Ala Pro Asp 210 215 220 Ala Arg Ile Leu Val Val Gly Tyr Pro Arg Ile Phe Pro Glu Glu Pro 225 230 235 240 Thr Gly Ala Tyr Tyr Thr Leu Thr Ala Ser Asn Gln Arg Trp Leu Asn 245 250 255 Glu Thr Ile Gln Glu Phe Asn Gln Gln Leu Ala Glu Ala Val Ala Val 260 265 270 His Asp Glu Glu Ile Ala Ala Ser Gly Gly Val Gly Ser Val Glu Phe 275 280 285 Val Asp Val Tyr His Ala Leu Asp Gly His Glu Ile Gly Ser Asp Glu 290 295 300 Pro Trp Val Asn Gly Val Gln Leu Arg Asp Leu Ala Thr Gly Val Thr 305 310 315 320 Val Asp Arg Ser Thr Phe His Pro Asn Ala Ala Gly His Arg Ala Val 325 330 335 Gly Glu Arg Val Ile Glu Gln Ile Glu Thr Gly Pro Gly Arg Pro Leu 340 345 350 Tyr Ala Thr Phe Ala Val Val Ala Gly Ala Thr Val Asp Thr Leu Ala 355 360 365 Gly Glu Val Gly 370 <210> 29 <211> 300 <212> PRT <213> Corynebacterium efficiens <400> 29 Met Arg Thr Thr Val Ile Ala Ala Ser Ala Leu Leu Leu Leu Ala Gly 1 5 10 15 Cys Ala Asp Gly Ala Arg Glu Glu Thr Ala Gly Ala Pro Pro Gly Glu 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Ile Arg Glu Glu Gly Ala Glu Ala Ser Thr Ser Ile 35 40 45 Thr Asp Val Tyr Ile Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ala Ala Met Gly Gly 50 55 60 Arg Asp Gln Pro Leu Arg Gly Glu Pro Phe Cys Leu Arg Ser Ser Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Pro Glu Leu Leu His Ala Glu Val Thr Asp Leu Thr Cys Gln 85 90 95 Gly Ala Val Thr Gly Asp Leu Leu Glu Pro Arg Thr Leu Gly Glu Arg 100 105 110 Thr Leu Pro Ala Gln Val Asp Ala Leu Thr Glu Asp Thr Thr Leu Val 115 120 125 Thr Leu Ser Ile Gly Gly Asn Asp Leu Gly Phe Gly Glu Val Ala Gly 130 135 140 Cys Ile Arg Glu Arg Ile Ala Gly Glu Asn Ala Asp Asp Cys Val Asp 145 150 155 160 Leu Leu Gly Glu Thr Ile Gly Glu Gln Leu Asp Gln Leu Pro Pro Gln 165 170 175 Leu Asp Arg Val His Glu Ala Ile Arg Asp Arg Ala Gly Asp Ala Gln 180 185 190 Val Val Val Thr Gly Tyr Leu Pro Leu Val Ser Ala Gly Asp Cys Pro 195 200 205 Glu Leu Gly Asp Val Ser Glu Ala Asp Arg Arg Trp Ala Val Glu Leu 210 215 220 Thr Gly Gln Ile Asn Glu Thr Val Arg Glu Ala Ala Glu Arg His Asp 225 230 235 240 Ala Leu Phe Val Leu Pro Asp Asp Ala Asp Glu His 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efficiens <400> 41 Met Arg Thr Thr Val Ile Ala Ala Ser Ala Leu Leu Leu Leu Ala Gly 1 5 10 15 Cys Ala Asp Gly Ala Arg Glu Glu Thr Ala Gly Ala Pro Pro Gly Glu 20 25 30 Ser Ser Gly Gly Ile Arg Glu Glu Gly Ala Glu Ala Ser Thr Ser Ile 35 40 45 Thr Asp Val Tyr Ile Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ala Ala Met Gly Gly 50 55 60 Arg Asp Gln Pro Leu Arg Gly Glu Pro Phe Cys Leu Arg Ser Ser Gly 65 70 75 80 Asn Tyr Pro Glu Leu Leu His Ala Glu Val Thr Asp Leu Thr Cys Gln 85 90 95 Gly Ala Val Thr Gly Asp Leu Leu Glu Pro Arg Thr Leu Gly Glu Arg 100 105 110 Thr Leu Pro Ala Gln Val Asp Ala Leu Thr Glu Asp Thr Thr Leu Val 115 120 125 Thr Leu Ser Ile Gly Gly Asn Asp Leu Gly Phe Gly Glu Val Ala Gly 130 135 140 Cys Ile Arg Glu Arg Ile Ala Gly Glu Asn Ala Asp Asp Cys Val Asp 145 150 155 160 Leu Leu Gly Glu Thr Ile Gly Glu Gln Leu Asp Gln Leu Pro Pro Gln 165 170 175 Leu Asp Arg Val His Glu Ala Ile Arg Asp Arg Ala Gly Asp Ala Gln 180 185 190 Val Val Val Thr Gly Tyr Leu Pro Leu Val Ser Ala Gly Asp Cys Pro 195 200 205 Glu 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tcctgctgtt caacctgccc gacctgggcc 480 agaacccgtc cgcccgctcc cagaaggtcg tcgaggccgt ctcgcacgtg tccgcctacc 540 acaacaagct gctcctcaac ctcgcccggc agctcgcccc gacgggcatg gtcaagctgt 600 tcgagatcga caagcagttc gcggagatgc tgcgcgaccc ccagaacttc ggcctgagcg 660 acgtggagaa cccgtgctac gacggcggct acgtgtggaa gccgttcgcc acccggtccg 720 tctcgaccga ccggcagctg tcggccttct cgccccagga gcgcctggcg atcgctggca 780 acccgctcct ggcacaggcg gtagcttcgc cgatggcccg ccgctcggcc tcgcccctca 840 actgcgaggg caagatgttc tgggaccagg tccaccccac caccgtggtc cacgccgccc 900 tctcggagcg cgccgccacc ttcatcgaga cccagtacga gttcctcgcc cactagtcta 960 gaggatcc 968 <210> 49 <211> 1044 <212> DNA <213> Aeromonas salmonicida <400> 49 atgaaacaac aaaaacggct ttacgcccga ttgctgacgc tgttatttgc gctcatcttc 60 ttgctgcctc attctgcagc ttcagcagca gatacaagac cggcgtttag ccggatcgtc 120 atgtttggag atagcctgag cgatacgggc aaaatgtata gcaaaatgag aggctatctt 180 ccgtcaagcc cgccgtatta tgaaggccgc tttagcaatg gaccggtctg gctggaacaa 240 ctgacgaaac aatttccggg actgacgatc gctaatgaag 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ttggtcgcgc tgacagttca ggcagccgac 60 agccgtcccg ccttctcccg gatcgtgatg tttggcgaca gcctctccga taccggcaag 120 atgtacagca agatgcgcgg ttacctcccc tccagccccc cctactatga gggccgcttc 180 tccaacgggc ccgtctggct ggagcagctg accaacgagt tcccgggcct gaccatagcc 240 aacgaggcgg aaggcggacc gaccgccgtg gcttacaaca agatctcctg gaatcccaag 300 tatcaggtca tcaacaacct ggactacgag gtcacccagt tcctgcaaaa agacagcttc 360 aagccggacg atctggtgat cctctgggtc ggcgccaacg actatctggc ctatggctgg 420 aacacagagc aggatgccaa gcgggtgcgc gacgccatca gcgatgcggc caaccgcatg 480 gtgctgaacg gcgccaagga gatactgctg ttcaacctgc cggatctggg ccagaacccc 540 tcggcccgca gccagaaggt ggtcgaggcg gccagccatg tctccgccta ccacaaccag 600 ctgctgctga acctggcacg ccagctggct cccaccggca tggtgaagct gttcgagatc 660 gacaagcagt ttgccgagat gctgcgtgat ccgcagaact tcggcctgag cgaccagagg 720 aacgcctgct acggtggcag ctatgtatgg aagccgtttg cctcccgcag cgccagcacc 780 gacagccagc tctccgcctt caacccgcag gagcgcctcg ccatcgccgg caacccgctg 840 ctggcccagg ccgtcgccag ccccatggct gcccgcagcg ccagcaccct 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acaggcacgg cacctccttc 480 gacgacgaga tcgaggccaa cacgtacccc gcgctcaagg aggcgctgct cggcgtccgc 540 gccagggctc cccacgccag ggtggcggct ctcggctacc cgtggatcac cccggccacc 600 gccgacccgt cctgcttcct gaagctcccc ctcgccgccg gtgacgtgcc ctacctgcgg 660 gccatccagg cacacctcaa cgacgcggtc cggcgggccg ccgaggagac cggagccacc 720 tacgtggact tctccggggt gtccgacggc cacgacgcct gcgaggcccc cggcacccgc 780 tggatcgaac cgctgctctt cgggcacagc ctcgttcccg tccaccccaa cgccctgggc 840 gagcggcgca tggccgagca cacgatggac gtcctcggcc tggactga 888 <210> 53 <211> 888 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 53 tcagtccagg ccgaggacgt ccatcgtgtg ctcggccatg cgccgctcgc ccagggcgtt 60 ggggtggacg ggaacgaggc tgtgcccgaa gagcagcggt tcgatccagc gggtgccggg 120 ggcctcgcag gcgtcgtggc cgtcggacac cccggagaag tccacgtagg tggctccggt 180 ctcctcggcg gcccgccgga ccgcgtcgtt gaggtgtgcc tggatggccc gcaggtaggg 240 cacgtcaccg gcggcgaggg ggagcttcag gaagcaggac gggtcggcgg tggccggggt 300 gatccacggg tagccgagag ccgccaccct ggcgtgggga gccctggcgc ggacgccgag 360 cagcgcctcc ttgagcgcgg ggtacgtgtt ggcctcgatc tcgtcgtcga aggaggtgcc 420 gtgcctgtcc ttgcaggggc tgcccttgcc gccgctgagg acacccgccg tgccgcaggc 480 cgtgatggcg ttgatgaagg tgctgttgtc gttgccgccg atggtgagcg tgaccaggtc 540 cgtgccggtg ccgagcgcgt ccaactgggg tgcgacgccc gggtactggg cccgcgtgaa 600 gtcggcggtc tgcgcggcgc cgcaggtgac gtccgtgagg cgggcgcccg tcgtgtccgc 660 gatgacgtgg gggtagttgg ccgtcgagcg cagacagagc aggttggcgg ggtcgacggg 720 caggacgccg gagccggcgc tgtagctgtc gccgagggcg acgtagtcca gggtcggagt 780 ggcctgggcg ggcgcggcgt gggcggtggc gtcggtgagg ccgagggcga gcgtgccgac 840 ggcggcgact gtcgcggtca tgacacggcg aagggcaggc ttcggcat 888 <210> 54 <211> 717 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 54 atggattacg agaagtttct gttatttggg gattccatta ctgaatttgc ttttaatact 60 aggcccattg aagatggcaa agatcagtat gctcttggag ccgcattagt caacgaatat 120 acgagaaaaa tggatattct tcaaagaggg ttcaaagggt acacttctag atgggcgttg 180 aaaatacttc ctgagatttt aaagcatgaa tccaatattg tcatggccac aatatttttg 240 ggtgccaacg atgcatgctc agcaggtccc caaagtgtcc 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ggccacaacg gcggcgcggg ggcgctgacc tacccggttc agcagcagct cgccaacttc 420 tacgcggcca gcaacaacac attcaacggc aataacgatg tcgtcttcgt gctggccggc 480 agcaacgaca ttttcttctg gaccactgcg gcggccacca gcggctccgg cgtgacgccc 540 gccattgcca cggcccaggt gcagcaggcc gcgacggacc tggtcggcta tgtcaaggac 600 atgatcgcca agggtgcgac gcaggtctac gtgttcaacc tgcccgacag cagcctgacg 660 ccggacggcg tggcaagcgg cacgaccggc caggcgctgc tgcacgcgct ggtgggcacg 720 ttcaacacga cgctgcaaag cgggctggcc ggcacctcgg cgcgcatcat cgacttcaac 780 gcacaactga ccgcggcgat ccagaatggc gcctcgttcg gcttcgccaa caccagcgcc 840 cgggcctgcg acgccaccaa gatcaatgcc ctggtgccga gcgccggcgg cagctcgctg 900 ttctgctcgg ccaacacgct ggtggcttcc ggtgcggacc agagctacct gttcgccgac 960 ggcgtgcacc cgaccacggc cggccatcgc ctgatcgcca gcaacgtgct ggcgcgcctg 1020 ctggcggata acgtcgcgca ctga 1044 <210> 56 <211> 786 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 56 gtgatcgggt cgtacgtggc ggtgggggac agcttcaccg agggcgtcgg cgaccccggc 60 cccgacgggg cgttcgtcgg ctgggccgac cggctcgccg tactgctcgc 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120 atggcggccc gctcccccgg cttccggtac gccaacctgg cggtgcgcgg gaagctgatc 180 ggacagatcg tcgacgagca ggtggacgtg gccgccgcca tgggagccga cgtgatcacg 240 ctggtcggcg ggctcaacga cacgctgcgg cccaagtgcg acatggcccg ggtgcgggac 300 ctgctgaccc aggccgtgga acggctcgcc ccgcactgcg agcagctggt gctgatgcgc 360 agtcccggtc gccagggtcc ggtgctggag cgcttccggc cccgcatgga ggccctgttc 420 gccgtgatcg acgacctggc cgggcggcac ggcgccgtgg tcgtcgacct gtacggggcc 480 cagtcgctgg ccgaccctcg gatgtgggac gtggaccggc tgcacctgac cgccgagggc 540 caccgccggg tcgcggaggc ggtgtggcag tcgctcggcc acgagcccga ggaccccgag 600 tggcacgcgc cgatcccggc gacgccgccg ccggggtggg tgacgcgcag gaccgcggac 660 gtccggttcg cccggcagca cctgctgccc tggataggcc gcaggctgac cgggcgctcg 720 tccggggacg gcctgccggc caagcgcccg gacctgctgc cctacgagga ccccgcacgg 780 tga 783 <210> 58 <211> 1365 <212> DNA <213> Streptomyces coelicolor <400> 58 atgacccggg gtcgtgacgg gggtgcgggg gcgcccccca ccaagcaccg tgccctgctc 60 gcggcgatcg tcaccctgat agtggcgatc tccgcggcca tatacgccgg agcgtccgcg 120 gacgacggca 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cgcctgggac 180 accagcccgg cgtccgtcgc cgccgtgggc gactccatca cgcgcggctt cgacgcctgt 240 gcggtgctgt cggactgccc ggaggtgtcg tgggcgaccg gcagcagcgc gaaggtcgac 300 tcgctggccg tacggctgct ggggaaggcg gacgcggccg agcacagctg gaactacgcg 360 gtcaccgggg cccggatggc ggacctgacc gctcaggtga cgcgggcggc gcagcgcgag 420 ccggagctgg tggcggtgat ggccggggcg aacgacgcgt gccggtccac gacctcggcg 480 atgacgccgg tggcggactt ccgggcgcag ttcgaggagg cgatggccac cctgcgcaag 540 aagctcccca aggcgcaggt gtacgtgtcg agcatcccgg acctcaagcg gctctggtcc 600 cagggccgca ccaacccgct gggcaagcag gtgtggaagc tcggcctgtg cccgtcgatg 660 ctgggcgacg cggactccct ggactcggcg gcgaccctgc ggcgcaacac ggtgcgcgac 720 cgggtggcgg actacaacga ggtgctgcgg gaggtctgcg cgaaggaccg gcggtgccgc 780 agcgacgacg gcgcggtgca cgagttccgg ttcggcacgg accagttgag ccactgggac 840 tggttccacc cgagtgtgga cggccaggcc cggctggcgg agatcgccta ccgcgcggtc 900 accgcgaaga atccctga 918 <210> 61 <211> 1068 <212> DNA <213> Streptomyces rimosus <400> 61 ttcatcacaa cgatgtcaca acaccggcca tccgggtcat ccctgatcgt gggaatgggt 60 gacaagcctt cccgtgacga aagggtcctg ctacatcaga aatgacagaa atcctgctca 120 gggaggttcc atgagactgt cccgacgcgc ggccacggcg tccgcgctcc tcctcacccc 180 ggcgctcgcg ctcttcggcg cgagcgccgc cgtgtccgcg ccgcgaatcc aggccaccga 240 ctacgtggcc ctcggcgact cctactcctc gggggtcggc gcgggcagct acgacagcag 300 cagtggctcc tgtaagcgca gcaccaagtc ctacccggcc ctgtgggccg cctcgcacac 360 cggtacgcgg ttcaacttca ccgcctgttc gggcgcccgc acaggagacg tgctggccaa 420 gcagctgacc ccggtcaact ccggcaccga cctggtcagc attaccatcg gcggcaacga 480 cgcgggcttc gccgacacca tgaccacctg caacctccag ggcgagagcg cgtgcctggc 540 gcggatcgcc aaggcgcgcg cctacatcca gcagacgctg cccgcccagc tggaccaggt 600 ctacgacgcc atcgacagcc gggcccccgc agcccaggtc gtcgtcctgg gctacccgcg 660 cttctacaag ctgggcggca gctgcgccgt cggtctctcg gagaagtccc gcgcggccat 720 caacgccgcc gccgacgaca tcaacgccgt caccgccaag cgcgccgccg accacggctt 780 cgccttcggg gacgtcaaca cgaccttcgc cgggcacgag ctgtgctccg gcgccccctg 840 gctgcacagc gtcacccttc ccgtggagaa ctcctaccac cccacggcca acggacagtc 900 caagggctac ctgcccgtcc tgaactccgc cacctgatct cgcggctact ccgcccctga 960 cgaagtcccg cccccgggcg gggcttcgcc gtaggtgcgc gtaccgccgt cgcccgtcgc 1020 gccggtggcc ccgccgtacg tgccgccgcc cccggacgcg gtcggttc 1068 <210> 62 <211> 1008 <212> DNA <213> Aeromonas hydrophila <400> 62 atgaaaaaat ggtttgtgtg tttattggga ttggtcgcgc tgacagttca ggcagccgac 60 agtcgccccg ccttttcccg gatcgtgatg ttcggcgaca gcctctccga taccggcaaa 120 atgtacagca agatgcgcgg ttacctcccc tccagcccgc cctactatga gggccgtttc 180 tccaacggac ccgtctggct ggagcagctg accaaacagt tcccgggtct gaccatcgcc 240 aacgaagcgg aaggcggtgc cactgccgtg gcttacaaca agatctcctg gaatcccaag 300 tatcaggtca tcaacaacct ggactacgag gtcacccagt tcttgcagaa agacagcttc 360 aagccggacg atctggtgat cctctgggtc ggtgccaatg actatctggc ctatggctgg 420 aacacggagc aggatgccaa gcgggttcgc gatgccatca gcgatgcggc caaccgcatg 480 gtactgaacg gtgccaagca gatactgctg ttcaacctgc cggatctggg ccagaacccg 540 tcagctcgca gtcagaaggt ggtcgaggcg gtcagccatg tctccgccta tcacaaccag 600 ctgctgctga acctggcacg ccagctggcc cccaccggca tggtaaagct gttcgagatc 660 gacaagcaat ttgccgagat gctgcgtgat ccgcagaact tcggcctgag cgacgtcgag 720 aacccctgct acgacggcgg ctatgtgtgg aagccgtttg ccacccgcag cgtcagcacc 780 gaccgccagc tctccgcctt cagtccgcag gaacgcctcg ccatcgccgg caacccgctg 840 ctggcacagg ccgttgccag tcctatggcc cgccgcagcg ccagccccct caactgtgag 900 ggcaagatgt tctgggatca ggtacacccg accactgtcg tgcacgcagc cctgagcgag 960 cgcgccgcca ccttcatcgc gaaccagtac gagttcctcg cccactga 1008 <210> 63 <211> 1011 <212> DNA <213> Aeromonas salmonicida subsp. Salmonicida <400> 63 atgaaaaaat ggtttgtttg tttattgggg ttgatcgcgc tgacagttca ggcagccgac 60 actcgccccg ccttctcccg gatcgtgatg ttcggcgaca gcctctccga taccggcaaa 120 atgtacagca agatgcgcgg ttacctcccc tccagcccgc cctactatga gggccgtttc 180 tccaacggac ccgtctggct ggagcagctg accaagcagt tcccgggtct gaccatcgcc 240 aacgaagcgg aaggcggtgc cactgccgtg gcttacaaca agatctcctg gaatcccaag 300 tatcaggtca tcaacaacct ggactacgag gtcacccagt tcttgcagaa agacagcttc 360 aagccggacg atctggtgat cctctgggtc ggtgccaatg actatctggc atatggctgg 420 aatacggagc aggatgccaa gcgagttcgc gatgccatca gcgatgcggc caaccgcatg 480 gtactgaacg gtgccaagca gatactgctg ttcaacctgc cggatctggg ccagaacccg 540 tcagcccgca gtcagaaggt ggtcgaggcg gtcagccatg tctccgccta tcacaacaag 600 ctgctgctga acctggcacg ccagctggcc cccaccggca tggtaaagct gttcgagatc 660 gacaagcaat ttgccgagat gctgcgtgat ccgcagaact tcggcctgag cgacgtcgag 720 aacccctgct acgacggcgg ctatgtgtgg aagccgtttg ccacccgcag cgtcagcacc 780 gaccgccagc tctccgcctt cagtccgcag gaacgcctcg ccatcgccgg caacccgctg 840 ctggcacagg ccgttgccag tcctatggcc cgccgcagcg ccagccccct caactgtgag 900 ggcaagatgt tctgggatca ggtacacccg accactgtcg tgcacgcagc cctgagcgag 960 cgcgccgcca ccttcatcga gacccagtac gagttcctcg cccacggatg a 1011 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 64 Met Arg Arg Ser Arg Phe Leu Ala 1 5 <210> 65 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 65 Ala Leu Ile Leu Leu Thr Leu Ala 1 5 <210> 66 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 66 Ala Arg Ala Ala Pro 1 5 <210> 67 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 67 Tyr Val Ala Leu Gly Asp Ser Tyr Ser Ser Gly 1 5 10 <210> 68 <211> 280 <212> PRT <213> Aeromonas salmonicida <400> 68 Ala Asp Thr Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly Asp Ser 1 5 10 15 Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro Val Trp 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Val Val His Ala Ala Leu Ser Glu Arg Ala Ala Thr Phe Ile Glu Thr 260 265 270 Gln Tyr Glu Phe Leu Ala His Gly 275 280 <210> 69 <211> 954 <212> DNA <213> Aeromonas salmonicida <400> 69 gacactcgcc ccgccttctc ccggatcgtg atgttcggcg acagcctctc cgataccggc 60 aaaatgtaca gcaagatgcg cggttacctc ccctccagcc cgccctacta tgagggccgt 120 ttctccaacg gacccgtctg gctggagcag ctgaccaagc agttcccggg tctgaccatc 180 gccaacgaag cggaaggcgg tgccactgcc gtggcttaca acaagatctc ctgggacccc 240 aagtatcagg tcatcaacaa cctggactac gaggtcaccc agttcttgca gaaagacagc 300 ttcaagccgg acgatctggt gatcctctgg gtcggtgcca atgactatct ggcatatggc 360 tggaatacgg agcaggatgc caagcgagtt cgcgatgcca tcagcgatgc ggccaaccgc 420 atggtactga acggtgccaa gcagatactg ctgttcaacc tgccggatct gggccagaac 480 ccgtcagccc gcagtcagaa ggtggtcgag gcggtcagcc atgtctccgc ctatcacaac 540 aagctgctgc tgaacctggc acgccagctg gcccccaccg gcatggtaaa gctgttcgag 600 atcgacaagc aatttgccga gatgctgcgt gatccgcaga acttcggcct gagcgacgtc 660 gagaacccct gctacgacgg cggctatgtg tggaagccgt ttgccacccg cagcgtcagc 720 accgaccgcc agctctccgc cttcagtccg caggaacgcc tcgccatcgc cggcaacccg 780 ctgctggcac aggccgttgc cagtcctatg gcccgccgca gcgccagccc cctcaactgt 840 gagggcaaga tgttctggga tcaggtacac ccgaccactg tcgtgcacgc agccctgagc 900 gagcgcgccg ccaccttcat cgagacccag tacgagttcc tcgcccacgg atga 954 <210> 70 <211> 279 <212> PRT <213> Aeromonas salmonicida <400> 70 Ala Asp Thr Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly Asp Ser 1 5 10 15 Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr Leu Pro 20 25 30 Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro Val Trp 35 40 45 Leu Glu Gln Leu Thr Lys Gln Phe Pro Gly Leu Thr Ile Ala Asn Glu 50 55 60 Ala Glu Gly Gly Ala Thr Ala Val Ala Tyr Asn Lys Ile Ser Trp Asp 65 70 75 80 Pro Lys Tyr Gln Val Ile Asn Asn Leu Asp Tyr Glu Val Thr Gln Phe 85 90 95 Leu Gln Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp Asp Leu Val Ile Leu Trp Val 100 105 110 Gly Ala Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly Trp Asn Thr Glu Gln Asp Ala 115 120 125 Lys Arg Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp Ala 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Pro Arg 50 55 60 Trp Val Leu Val Glu Leu Gly Gly Asn Asp Gly Leu Arg Gly Phe Gln 65 70 75 80 Pro Gln Gln Thr Glu Gln Thr Leu Arg Gln Ile Leu Gln Asp Val Lys 85 90 95 Ala Ala Asn Ala Glu Pro Leu Leu Met Gln Ile Arg Leu Pro Ala Asn 100 105 110 Tyr Gly Arg Arg Tyr Asn Glu Ala Phe Ser Ala Ile Tyr Pro Lys Leu 115 120 125 Ala Lys Glu Phe Asp Val Pro Leu Leu Pro Phe Phe Met Glu Glu Val 130 135 140 Tyr Leu Lys Pro Gln Trp Met Gln Asp Asp Gly Ile His Pro Asn Arg 145 150 155 160 Asp Ala Gln Pro Phe Ile Ala Asp Trp Met Ala Lys Gln Leu Gln Pro 165 170 175 Leu Val Asn His Asp Ser Leu Glu 180 <210> 96 <211> 308 <212> PRT <213> Aeromonas hydrophila <400> 96 Ile Val Met Phe Gly Asp Ser Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser 1 5 10 15 Lys Met Arg Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg 20 25 30 Phe Ser Asn Gly Pro Val Trp Leu Glu Gln Leu Thr Asn Glu Phe Pro 35 40 45 Gly Leu Thr Ile Ala Asn Glu Ala Glu Gly Gly Pro Thr Ala Val Ala 50 55 60 Tyr Asn Lys Ile Ser Trp Asn Pro Lys Tyr Gln Val Ile Asn Asn Leu 65 70 75 80 Asp Tyr Glu Val Thr Gln Phe Leu Gln Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp 85 90 95 Asp Leu Val Ile Leu Trp Val Gly Ala Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly 100 105 110 Trp Asn Thr Glu Gln Asp Ala Lys Arg Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp 115 120 125 Ala Ala Asn Arg Met Val Leu Asn Gly Ala Lys Glu Ile Leu Leu Phe 130 135 140 Asn Leu Pro Asp Leu Gly Gln Asn Pro Ser Ala Arg Ser Gln Lys Val 145 150 155 160 Val Glu Ala Ala Ser His Val Ser Ala Tyr His Asn Gln Leu Leu Leu 165 170 175 Asn Leu Ala Arg Gln Leu Ala Pro Thr Gly Met Val Lys Leu Phe Glu 180 185 190 Ile Asp Lys Gln Phe Ala Glu Met Leu Arg Asp Pro Gln Asn Phe Gly 195 200 205 Leu Ser Asp Gln Arg Asn Ala Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Val Trp Lys 210 215 220 Pro Phe Ala Ser Arg Ser Ala Ser Thr Asp Ser Gln Leu Ser Ala Phe 225 230 235 240 Asn Pro Gln Glu Arg Leu Ala Ile Ala Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln 245 250 255 Ala Val Ala Ser Pro Met Ala Ala Arg Ser Ala Ser Thr Leu Asn Cys 260 265 270 Glu Gly Lys Met Phe Trp Asp Gln Val His Pro Thr Thr Val Val His 275 280 285 Ala Ala Leu Ser Glu Pro Ala Ala Thr Phe Ile Glu Ser Gln Tyr Glu 290 295 300 Phe Leu Ala His 305 <210> 97 <211> 232 <212> PRT <213> Aspergillus aculeatus <400> 97 Thr Thr Val Tyr Leu Ala Gly Asp Ser Thr Met Ala Lys Asn Gly Gly 1 5 10 15 Gly Ser Gly Thr Asn Gly Trp Gly Glu Tyr Leu Ala Ser Tyr Leu Ser 20 25 30 Ala Thr Val Val Asn Asp Ala Val Ala Gly Arg Ser Ala Arg Ser Tyr 35 40 45 Thr Arg Glu Gly Arg Phe Glu Asn Ile Ala Asp Val Val Thr Ala Gly 50 55 60 Asp Tyr Val Ile Val Glu Phe Gly His Asn Asp Gly Gly Ser Leu Ser 65 70 75 80 Thr Asp Asn Gly Arg Thr Asp Cys Ser Gly Thr Gly Ala Glu Val Cys 85 90 95 Tyr Ser Val Tyr Asp Gly Val Asn Glu Thr Ile Leu Thr Phe Pro Ala 100 105 110 Tyr Leu Glu Asn Ala Ala Lys Leu Phe Thr Ala Lys Gly Ala Lys Val 115 120 125 Ile Leu Ser Ser Gln Thr Pro Asn Asn Pro Trp Glu Thr Gly Thr Phe 130 135 140 Val Asn Ser Pro Thr Arg Phe Val Glu Tyr Ala Glu Leu Ala Ala Glu 145 150 155 160 Val Ala Gly Val Glu Tyr Val Asp His Trp Ser Tyr Val Asp Ser Ile 165 170 175 Tyr Glu Thr Leu Gly Asn Ala Thr Val Asn Ser Tyr Phe Pro Ile Asp 180 185 190 His Thr His Thr Ser Pro Ala Gly Ala Glu Val Val Ala Glu Ala Phe 195 200 205 Leu Lys Ala Val Val Cys Thr Gly Thr Ser Leu Lys Ser Val Leu Thr 210 215 220 Thr Thr Ser Phe Glu Gly Thr Cys 225 230 <210> 98 <211> 167 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 98 Leu Leu Ile Leu Gly Asp Ser Leu Ser Ala Gly Tyr Arg Met Ser Ala 1 5 10 15 Ser Ala Ala Trp Pro Ala Leu Leu Asn Asp Lys Trp Gln Ser Lys Thr 20 25 30 Ser Val Val Asn Ala Ser Ile Ser Gly Asp Thr Ser Gln Gln Gly Leu 35 40 45 Ala Arg Leu Pro Ala Leu Leu Lys Gln His Gln Pro Arg Trp Val Leu 50 55 60 Val Glu Leu Gly Gly Asn Asp Gly Leu Arg Gly Phe Gln Pro Gln Gln 65 70 75 80 Thr Glu Gln Thr Leu Arg Gln Ile Leu Gln Asp Val Lys Ala Ala Asn 85 90 95 Ala Glu Pro Leu Leu Met Gln Ile Arg Leu Pro Ala Asn Tyr Gly Arg 100 105 110 Arg Tyr Asn Glu Ala Phe Ser Ala Ile Tyr Pro Lys Leu Ala Lys Glu 115 120 125 Phe Asp Val Pro Leu Leu Pro Phe Phe Met Glu Glu Val Tyr Leu Lys 130 135 140 Pro Gln Trp Met Gln Asp Asp Gly Ile His Pro Asn Arg Asp Ala Gln 145 150 155 160 Pro Phe Ile Ala Asp Trp Met 165 <210> 99 <211> 295 <212> PRT <213> Aeromonas hydrophila <400> 99 Ile Val Met Phe Gly Asp Ser Leu Ser Asp Thr Gly Lys Met Tyr Ser 1 5 10 15 Lys Met Arg Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Pro Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg 20 25 30 Phe Ser Asn Gly Pro Val Trp Leu Glu Gln Leu Thr Asn Glu Phe Pro 35 40 45 Gly Leu Thr Ile Ala Asn Glu Ala Glu Gly Gly Pro Thr Ala Val Ala 50 55 60 Tyr Asn Lys Ile Ser Trp Asn Pro Lys Tyr Gln Val Ile Asn Asn Leu 65 70 75 80 Asp Tyr Glu Val Thr Gln Phe Leu Gln Lys Asp Ser Phe Lys Pro Asp 85 90 95 Asp Leu Val Ile Leu Trp Val Gly Ala Asn Asp Tyr Leu Ala Tyr Gly 100 105 110 Trp Asn Thr Glu Gln Asp Ala Lys Arg Val Arg Asp Ala Ile Ser Asp 115 120 125 Ala Ala Asn Arg Met Val Leu Asn Gly Ala Lys Glu Ile Leu Leu Phe 130 135 140 Asn Leu Pro Asp Leu Gly Gln Asn Pro Ser Ala Arg Ser Gln Lys Val 145 150 155 160 Val Glu Ala Ala Ser His Val Ser Ala Tyr His Asn Gln Leu Leu Leu 165 170 175 Asn Leu Ala Arg Gln Leu Ala Pro Thr Gly Met Val Lys Leu Phe Glu 180 185 190 Ile Asp Lys Gln Phe Ala Glu Met Leu Arg Asp Pro Gln Asn Phe Gly 195 200 205 Leu Ser Asp Gln Arg Asn Ala Cys Tyr Gly Gly Ser Tyr Val Trp Lys 210 215 220 Pro Phe Ala Ser Arg Ser Ala Ser Thr Asp Ser Gln Leu Ser Ala Phe 225 230 235 240 Asn Pro Gln Glu Arg Leu Ala Ile Ala Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln 245 250 255 Ala Val Ala Ser Pro Met Ala Ala Arg Ser Ala Ser Thr Leu Asn Cys 260 265 270 Glu Gly Lys Met Phe Trp Asp Gln Val His Pro Thr Thr Val Val His 275 280 285 Ala Ala Leu Ser Glu Pro Ala 290 295 <210> 100 <211> 50 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 100 Arg Pro Ala Phe Ser Arg Ile Val Met Phe Gly Asp Ser Leu Ser Asp 1 5 10 15 Thr Gly Lys Met Tyr Ser Lys Met Arg Gly Tyr Leu Pro Ser Ser Pro 20 25 30 Pro Tyr Tyr Glu Gly Arg Phe Ser Asn Gly Pro Val Trp Leu Glu Gln 35 40 45 Leu Thr 50 <210> 101 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 101 Phe Pro Gly Leu Thr Ile Ala Asn Glu Ala Glu Gly Gly 1 5 10 <210> 102 <211> 79 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 102 Thr Ala Val Ala Tyr Asn Lys Ile Ser Trp Asn Pro Lys Tyr Gln Val 1 5 10 15 Ile Asn Asn Leu Asp Tyr Glu Val Thr Gln Phe Leu Gln Lys Asp Ser 20 25 30 Phe Lys Pro Asp Asp Leu Val Ile Leu Trp Val Gly Ala Asn Asp Tyr 35 40 45 Leu Ala Tyr Gly Trp Asn Thr Glu Gln Asp Ala Lys Arg Val Arg Asp 50 55 60 Ala Ile Ser Asp Ala Ala Asn Arg Met Val Leu Asn Gly Ala Lys 65 70 75 <210> 103 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 103 Ile Leu Leu Phe Asn Leu Pro Asp Leu Gly Gln Asn Pro Ser Ala Arg 1 5 10 15 Ser Gln Lys Val Val Glu Ala 20 <210> 104 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 104 Ser His Val Ser Ala Tyr His Asn 1 5 <210> 105 <211> 38 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 105 Leu Leu Leu Asn Leu Ala Arg Gln Leu Ala Pro Thr Gly Met Val Lys 1 5 10 15 Leu Phe Glu Ile Asp Lys Gln Phe Ala Glu Met Leu Arg Asp Pro Gln 20 25 30 Asn Phe Gly Leu Ser Asp 35 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 106 Tyr Val Trp Lys Pro Phe Ala 1 5 <210> 107 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 107 Gln Leu Ser Ala Phe 1 5 <210> 108 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 108 Pro Gln Glu Arg Leu Ala Ile Ala Gly Asn Pro Leu Leu Ala Gln Ala 1 5 10 15 Val Ala Ser Pro Met Ala 20 <210> 109 <211> 4 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 109 Arg Ser Ala Ser 1 <210> 110 <211> 24 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 110 Leu Asn Cys Glu Gly Lys Met Phe Trp Asp Gln Val His Pro Thr Thr 1 5 10 15 Val Val His Ala Ala Leu Ser Glu 20 <210> 111 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 111 Ala Ala Thr Phe Ile 1 5 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Consensus sequence <400> 112 Gln Tyr Glu Phe Leu Ala His 1 5

Claims (25)

  1. a) 약 10% 내지 약 70%의 식물 인지질을 포함하는 인지질 조성물; 지질 아실트랜스퍼라제; 및 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀; 및 선택적으로 물을 혼합하여, 반응 조성물 내에 적어도 2 w/w%의 물을 포함하는 반응 조성물을 제조하는 단계; 및
    b) 적어도 하나의 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 분리하거나 정제하는 단계;
    로 이루어진 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르의 제조 방법
  2. 제 1항에 있어서, 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀은 반응 조성물 전체 함량에 대해 적어도 5% 함량으로 첨가함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 식품 또는 식품 성분과 혼합됨을 특징으로 하는 방법.

  4. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르는 약제학적 희석제, 담체 또는 첨가제 또는 화장품 희석제, 담체 또는 첨가제와 혼합됨을 특징으로 하는 방법.
  5. a) 적어도 약 10% 내지 약 70%의 식물 인지질을 포함하는 인지질 조성물, b) 적어도 약 2%의 물 및 c) 첨가된 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀을 포함하는 반응 조성물 내에서 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 생성하기 위한 지질 아실트랜스퍼라제의 용도.
  6. 제 5항에 있어서, 상기 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀은 반응 조성물의 적어도 5% 함량으로 첨가함을 특징으로 하는 용도.
  7. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 또는 제 6항의 용도에 있어서, 상기 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀은
    ⅰ) 3-베타 하이드록시 그룹 또는 3-알파 하이드록시 그룹; 및/또는
    ⅱ) 시스 위치 내의 A:B 고리, 트랜스 위치 내의 A:B 고리 또는 C5-C6가 불포화됨의 구조적 특성을 하나 또는 그 이상 지님을 특징으로 하는 방법.

  8. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항, 제 6항 또는 제 7항의 용도에 있어서, 상기 파이토스테롤은 알파-시토스테롤, 베타-시토스테롤, 스티그마스테롤, 에르고스테롤, 캄페스테롤, 5,6-디하이드로스테롤, 브라시카스테롤, 알파-스피나스테롤, 베타-스피나스테롤, 감마-스피나스테롤, 델타스피나스테롤, 후코스테롤, 디모스테롤, 아스코스테롤, 세레비스테롤, 에피스테롤, 아나스테롤, 하이포스테롤, 콘드릴라스테롤, 데스모스테롤, 찰리노스테롤, 포리퍼라스테롤, 클리오나스테롤, 스테롤글리코사이드 및 다른 천연 또는 합성 이성체 또는 유도체에서 선택된 하나 또는 그 이상임을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 또는 제 8항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 내지 제 8항 중 어느 한 항의 용도에 있어서, 라이소(lyso)-인지질이 생성됨을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 라이소-인지질은 정제되거나 분리됨을 특징으로 하는 방법.

  11. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 10항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 용도에 있어서, 지질 아실트랜스퍼라제는 GDSX 모티프 및/또는 GANDY 모티프를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 내지 제 11항 중 어느 한 항의 용도에 있어서, 지질 아실트랜스퍼라제는 아실 트랜스퍼라제 활성을 지니는 효소로 특정되고, GDSX 모티프의 아미노산 서열을 지니고 이때 X는 L, A, V, I, F, Y, H, Q, T, N, M 또는 S의 아미노산 잔기 중에 하나 또는 그 이상임을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 내지 제 12항 중 어느 한 항의 용도에 있어서, 아실 트랜스퍼라제 활성 퍼센트를 측정하기 위한 프로토콜을 사용하여 측정시 지질 아실트랜스퍼라제는 적어도 15%의 트랜스퍼라제 활성을 지님을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 내지 제 13항 중 어느 한 항의 용도에 있어서, 지질 아실트랜스퍼라제는 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis) 내의 뉴클레오타이드 서열의 발현을 통해 수득할 수 있는 폴리펩타이드임을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 용도에 있어서, 상기 인지질 조성물은 식용유 또는 조(crude) 식용유의 화학적 탈 검(degumming), 효소 탈 검, 총(total) 탈 검, 수퍼 탈 검, 물 탈 검 또는 이들의 둘 이상의 혼합 탈 검 방법에 의해 수득된 검 상(phase)임을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 내지 제 15항 중 어느 한 항의 용도에 있어서, 상기 인지질 조성물은 식용유 또는 조 식용유를 산 및/또는 수산화나트륨과 같은 알칼리로 처리하여 수득된 소프스톡(soapstock) 및 소프스톡 획분을 분리한 것임을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 15항 또는 제 16항에 있어서, 상기 검 상 또는 소프스톡은 지질 아실트랜스퍼라제, 파이토스테롤 및/또는 파이토스타놀 및 선택적으로 물과 혼합하기 전에 정제 또는 건조 또는 용매 분별화(fractionated) 또는 둘 이상의 방법 조합으로 처리됨을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 용도에 의해 수득되는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 포함하는 조성물.
  19. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 용도에 의해 수득되는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 포함하는 식품.
  20. 제 1항 내지 제 4항 또는 제 7항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 방법 또는 제 5항 내지 제 17항 중 어느 한 항의 용도에 의해 수득되는 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르와 선택적으로 화장품 희석제, 첨가제 또는 담체를 포함하는 예를 들면 화장품과 같은 개인 보호 조성물.
  21. 제 18항의 조성물을 식품 및/또는 식품 재료에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 포함하는 식품의 제조 방법.
  22. 제 18항의 조성물을 개인 보호 용품(화장품) 성분에 첨가하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 파이토스테롤 에스테르 및/또는 파이토스타놀 에스테르를 포함하는 개인 보호 용품(화장품)의 제조 방법.
  23. 실시예 및 도면에 관련하여 본 명세서 내에 실질적으로 기재된 방법.
  24. 실시예 및 도면에 관련하여 본 명세서 내에 실질적으로 기재된 용도.
  25. 실시예 및 도면에 관련하여 본 명세서 내에 실질적으로 기재된 조성물.
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