KR20120046737A - 이미노 지질을 포함하는 양쪽성 리포좀 - Google Patents

이미노 지질을 포함하는 양쪽성 리포좀 Download PDF

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Abstract

본 발명은 음이온성 및 양이온성 잔기의 혼합물을 포함하는 외부 표면을 가지며, 상기 양이온성 잔기의 적어도 일부가 생리적 조건하에서 본질적으로 하전되는 이미노 잔기인 지질 어셈블리, 리포좀, 및 세포의 혈청 저항성 형질감염을 위한 그의 용도에 관한 것이다.

Description

이미노 지질을 포함하는 양쪽성 리포좀 {AMPHOTERIC LIPOSOMES COMPRISING IMINO LIPIDS}
본 발명은 지단백질 매개 흡수 차단을 극복할 수 있는 지질 어셈블리 또는 리포좀에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 각각의 극성 영역에서, 카르복실 또는 포스페이트 헤드 기를 갖는 음으로 하전된 지질, 및 이미노 또는 구아니도 잔기를 갖는 양으로 하전된 지질 또는 그의 유도체를 둘 다 포함하는 리포좀의 개선에 관한 것이다.
리포좀은 활성 성분을 위한 담체로서의 광범위한 용도를 갖는다. 중성 또는 음으로 하전된 리포좀은 종종 소분자 약물의 전달을 위해 사용되는 한편, 양으로 하전된 (양이온성) 또는 양쪽성 리포좀의 최근 발표된 계열은 주로 핵산, 예컨대 플라스미드 또는 올리고뉴클레오티드의 전달을 위해 주로 사용된다. 핵산 수송물의 전달을 위해 사용되는 양이온성 리포좀의 중요한 예에는, 비제한적으로 문헌 [Semple et al., Nat. Biotech. (2010) 28:172-176; Akinc et al., Nat. Biotech. (2008) 26:561-569]; 문헌 [Chien et al., Cancer Gene Ther. (2005) 12:321-328]; 문헌 [de Fougerolles, Nat. Rev. Drug Discov. (2007) 6:443-453]; 문헌 [Kim et al., Mol. Ther. (2006) 14:343-350]; 문헌 [Morrissey, Nat. Biotech. (2005) 23: 1002-1007]; 문헌 [Peer, Science (2008) 319: 627-630] 및 문헌 [Santel, Gene Ther. (2006) 13: 1222-1234]가 포함된다. 핵산의 전달을 위한 양쪽성 리포좀의 적용은 문헌 [Andreakos et al., Arthritis Rheum. (2009) 60:994-1005]에서 입증되었다.
양쪽성 리포좀은 pH-감성 리포좀의 보다 큰 족에 속하며, 이에는 또한 pH-감성 음이온성 또는 양이온성 리포좀이 포함되며, 이의 기본형은 문헌 [Lai et al., Biochemistry (1985) 24:1654-1661] 및 문헌 [Budker et al., Nat. Biotech. (1996) 14:760-764]에 제시되어 있다. pH-감성 음이온성 또는 양이온성 리포좀과는 달리, 양쪽성 리포좀은 복잡한 구조이고, 상보적인 전하를 갖는 적어도 한 쌍의 지질을 포함한다. 제WO 02/066012호에는 낮은 pH 및 중성 pH 둘 다에서 안정한 상을 갖는 양쪽성 리포좀의 주요 특징부가 기재되어 있다. 제WO 02/066012호 및 제WO 07/107304호에는 낮은 pH에서 출발하여 핵산을 이러한 입자에 적재하는 방법이 기재되어 있다.
문헌 [Hafez, et al. (Biophys. J. 2000, 79(3), 1438-1446)] 및 제WO 02/066012호에는 진정한 양쪽성을 갖는 지질 혼합물을 어떻게 선택하는지, 보다 구체적으로 그의 등전점 및 융합 개시점을 어떻게 결정하는지에 대한 약간의 안내가 제공되어 있다. 중성 지질은 양쪽성 리포좀의 부가적 구성성분일 수 있다. 하나 이상의 이러한 중성 지질의 포함은 혼합물의 복잡성을 현저히 부가시키는데, 이는 특히 모든 구성요소의 개별적인 양이 달라질 수 있기 때문이다. 지질의 매우 다양한 가능한 조합은 양쪽성 리포좀의 보다 빠른 최적화의 현실적인 장애를 의미한다.
이와 관련하여, 제WO 08/043575호는 양쪽성 리포좀의 안정성, 융합유도성 (fusogenicity) 및 세포 형질감염의 최적화 전략, 특히 어떠한 지질의 혼합물이 높은 pH 및 낮은 pH에서 만족스럽게 안정한 라멜라 상을 형성하면서, 중간 pH에서는 융합유도성 6각형 상을 형성하는지 예측하는 방법을 밝히고 있다.
상기 참고 문헌에 따른 양쪽성 리포좀은 세포의 강력한 형질감염체 (transfectant)이다. 그러나, 이러한 리포좀의 일부의 기능은 특정 혈청의 첨가에 의해 차단되어, 생체내에서 특정 세포의 표적화를 위한 이러한 리포좀의 활성을 잠재적으로 제한할 수 있음이 관찰되었다. 이는 본원에 제시되는 실시예, 예를 들어 실시예 3에서 추가로 예시된다.
여러 혈청 중에서 관찰되는 양쪽성 리포좀의 흡수 저해는, 문헌 [Akinc et al., Mol. Ther. (2010) electronic publication on May11th, ahead of print. DOI: 10.1038/mt.2010.85]에서 입증된 바와 같은 최근 발표된 지단백질 (이 경우 ApoE)과의 복합체 형성을 통한 양이온성 담체의 활성화와는 명백히 반대된다.
보다 자세한 연구를 통해 이러한 저해 효과의 매개자가 지단백질임이 밝혔졌다. 본원의 실시예 4에 나타나는 바와 같이, 장애 세포로의 siRNA의 기능적 전달에 의해 지시되듯 인간 혈청의 지단백질 결핍은 리포좀의 흡수를 더 이상 저해할 수 없다. 본 발명의 발명자들은 이제 놀랍게도 그리고 예기치 않게, 극성 헤드 기에 카르복실 또는 포스페이트 잔기를 갖는 음이온성 지질과 조합된 양이온성 이미노 지질의 특정 종이, 혈청의 존재하에서 형질감염 활성을 유지하는데 특히 유리함을 확인하였다. 빈번히, 상기 지질 혼합물로부터 생성된 지질 어셈블리 또는 리포좀을 본원 및 제WO 08/043575호에 기재된 방법에 따라 제형화했을 때 특별한 장점이 관찰되었다.
발명의 목적
따라서, 본 발명의 목적은 다양한 혈청의 존재하에서 세포에 형질감염될 수 있는 지질 어셈블리 또는 리포좀을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 약물, 예컨대 핵산 약물, 예를 들어 올리고뉴클레오티드 및 플라스미드를 비롯한 활성 제제 또는 성분의 세포 또는 조직안으로의 전달을 위한 담체로서 이러한 리포좀을 포함하는 제약 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 개요
본 발명은 지질 어셈블리, 리포좀 및 세포의 형질감염을 위한 그의 용도를 제공하며, 상기 지질 어셈블리는 음이온성 및 양이온성 양친매성물질을 포함하며, 양이온성 양친매성물질의 적어도 일부는 pH 7.5에서 실질적으로 하전되는 이미노 지질이며, 음이온성 양친매성물질은 카르복실 또는 포스페이트 지질이고, 추가로 양이온성 및 음이온성 양친매성물질 사이의 전하비는 1.5 이하이다.
본 발명의 다양한 실시양태에서, 음이온성 및 양이온성 양친매성물질을 포함하는 지질 어셈블리가 제공되며, 상기 양이온성 양친매성물질의 적어도 일부가 생리적 조건하에서 실질적으로 하전되는 이미노 지질이며, 추가로 음이온성 양친매성물질의 적어도 일부가 카르복실 지질이며, 양이온성 및 음이온성 양친매성물질 사이의 비율은 1.5 이하이다.
본 발명의 보다 구체적인 측면에서, 지질의 조합을 포함하는 지질 어셈블리가 제공되며, 상기 조합의 양이온성 지질은 구아니도 잔기를 포함하고, 상기 조합의 음이온성 지질은 카르복실기를 포함하고, 추가로 구아니도 잔기와 카르복실기 사이의 비율은 1.5 이하인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 음이온성 및 양이온성 양친매성물질을 포함하는 지질 어셈블리가 제공되며, 상기 양이온성 양친매성물질의 적어도 일부는 생리적 조건하에서 실질적으로 하전되는 이미노 지질이고, 추가로 음이온성 양친매성물질의 적어도 일부는 포스페이트 지질이고, 양이온성 및 음이온성 양친매성물질 사이의 비율은 1.5 이하이다. 이러한 실시양태의 보다 바람직한 측면에서, 이미노 지질은 구아니도 지질이다.
본 발명의 양이온성 양친매성물질의 하전된 이미노기의 pK는 7.5 초과이고, 이민, 아미딘, 피리딘, 2-아미노피리딘, 헤테로시클릭 질소 염기, 구아니도 잔기, 이소우레아 또는 티오이소우레아로부터 선택된다. 바람직한 실시양태에서, 양이온성 지질은 PONA, CHOLGUA, GUADACA, MPDACA 또는 SAINT-18의 군으로부터 선택된다.
바람직한 실시양태에서, 음이온성 지질은 CHEMS, DMGS, DOGS, DOPA 또는 POPA의 군으로부터 선택된다.
다수의 실시양태에서, 본 발명의 지질 어셈블리는 리포좀이다.
추가의 실시양태에서, 지질 어셈블리는 또한 중성 지질, 예컨대 콜레스테롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민 또는 스핑고미엘린 또는 그의 혼합물을 포함한다.
바람직한 실시양태에서, 중성 지질은 콜레스테롤이고, 지질 혼합물 중 콜레스테롤의 몰 분율은 10 내지 50 mol%이다.
일부 실시양태에서, 지질 어셈블리는 또한 PEG화 지질을 포함하고, 이러한 실시양태의 바람직한 측면에서 리포좀은 (i) 활성 성분의 존재하에서 리포좀의 형성 및 봉입 단계 및 (ii) 상기 단계 (i) 이후 PEG-지질의 별도 첨가 단계를 포함하는 방법에 의해 제조된다.
혈청 저항성 형질감염이 음이온성 및 양이온성 잔기의 혼합물을 포함하는 외부 표면을 갖는 지질 어셈블리 또는 리포좀을 이용하여 달성할 수 있음을 예기치 않게 확인하였으며; 여기서 양이온성 잔기의 적어도 일부는 생리적 조건하에서 실질적으로 하전되는 이미노 잔기이다. 여러 실시양태에서, 본 발명의 지질 어셈블리 및 리포좀은 제WO 08/043575호에 기재되는 방법 및 또한 본원에 보다 상세하게 기재되는 방법을 사용하여 제형화된다.
발명의 상세한 설명
지질의 화학적 성질
"하전가능한"은 양친매성물질의 pK가 pH 4 내지 8 범위임을 의미한다. 따라서 하전가능한 양친매성물질은 약 산 또는 약 염기일 수 있다. 하전된 양친매성물질과 관련하여 "안정한"은 pH 4 내지 pH 8 범위에서 실질적으로 안정한 전하를 야기하는, pK가 상기 범위 밖인 강산 또는 강 염기를 의미한다.
본원에서 "양쪽성"은 음이온성 및 양이온성의 하전된 기의 특질부 둘 다를 포함하는 물질, 물질의 혼합물 또는 초분자 복합체 (예를 들어, 리포좀)를 의미하며; 여기서
1) 양이온성 및 음이온성 양친매성물질 중 적어도 하나 이상, 임의로 둘 다, pK가 4 내지 8인 하나 이상의 하전된 기를 가져 하전가능하고,
2) 양이온성 전하가 pH 4에서 우세하고,
3) 음이온성 전하가 pH 8에서 우세하다.
그 결과, 물질 또는 물질의 혼합물은 pH 4 내지 pH 8에서 중성 순전하의 등전점을 가진다. 쯔비터이온은 상기한 범위 내에서 pK를 갖지 않으므로, 양쪽성 특질부는 이러한 정의에 따라 쯔비터이온성 특질부와는 다르다. 결과적으로, 쯔비터이온은 상기 pH 값의 범위에 걸쳐 본질적으로 중성으로 하전되며, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜에탄올아민은 쯔비터이온성 특질부를 갖는 중성 지질이다.
본원에서 "전하비" 또는 "C/A"는 양이온성 및 음이온성 양친매성물질 각각에 보통 배정되는 명목 전하의 절대값 또는 그 사이의 비율의 계수를 의미한다. 카르복실기의 명목 전하는 "-1"이고, 포스페이트 잔기의 명목 전하는 "-2"이고, 이미노 화합물의 명목 전하는 "+1"이다. 그 후, 주어진 양친매성물질의 혼합물 또는 지질 어셈블리에서의 "전하비"를 이러한 명목 전하와 고려되는 화합물의 해당 몰 분율의 곱으로부터 계산하며, 중성 화합물, 예컨대 콜레스테롤 또는 쯔비터이온성 양친매성물질, 예컨대 POPC 또는 DOPE는 고려하지 않는다.
Figure pct00001
상기 식에서, xc1 ...n은 주어진 양이온성 화합물의 몰 분율을 나타내고, xa1 ...n은 음이온성 화합물의 몰 분율을 나타내고, zc1 ...n은 주어진 양이온성 화합물의 명목 전하를 나타내고, za1 ...n은 음이온성 화합물의 명목 전하를 나타낸다.
예로써, 42 mol%의 카르복실 지질, 38%의 이미노 지질 및 20 mol%의 중성 지질을 포함하는 혼합물의 전하비 또는 C/A는 38/42=0.91이다. 27%의 포스페이트 지질, 43 mol%의 이미노 지질 및 30 mol%의 중성 지질을 포함하는 또 다른 혼합물의 전하비 또는 C/A는 포스페이트기의 이중 명목 전하로 인하여, 43/54=0.8이다.
정의 및 예시로부터, 지질 사이의 몰 비 또는 간단하게 비율과 전화비는 단일-하전된 종에 있어서는 동일한 의미를 가지고, 이러한 용어가 그 군 안에서는 상호 교환가능함이 명백할 것이다. 이는 이미노 및 카르복시 지질의 조합의 경우의 예이다. 이와는 대조적으로, 포스페이트 지질에 있어서 몰 비는 전하비와 상이한데, 이는, 예를 들어 포스페이트기가 DOPA에서와 같이 1차 포스페이트 에스테르로서 존재하는 경우, 이러한 화합물이 이중 전하를 지닐 수 있기 때문이다. 상기 계산 예에서 볼 수 있듯이, 이 때 몰 비 또는 지질 비율은 전하비의 두 배이다. 오로지 명확하게 나타내기 위하여, 본 개시내용에 걸쳐 용어 "전하비"가 사용되는 것이 선호된다.
본원에서 "생리적 pH" 또는 "생리적 조건"은 약 7.5의 pH를 의미한다.
극성 헤드 기에 카르복실 잔기를 포함하는 음이온성 지질은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 극성 헤드 기에 카르복실 잔기를 포함하는 음이온성 지질의 예는 하기 구조 (1)-(4)로부터 선택할 수 있다.
Figure pct00002
상기 식에서, n 또는 m은 0 내지 29의 정수이고, R1 및 R2는 서로 독립적으로 8 내지 24개의 탄소 원자 및 0, 1 또는 2개의 불포화 결합을 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 잔기이다. A, B 또는 D는 서로 독립적으로 없거나, -CH2-, -CH=, =CH-, -O-, -NH-, -C(O)-O-, -O-C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -O-C(O)-NH-, -NH-C(O)-O-, 인산 또는 아인산 디에스테르이고, "스테롤"은 그의 C3 원자를 통해 부착된 콜레스테롤일 수 있다.
하기 리스트는 카르복실기를 갖는 지질의 추가적인 구체적 예를 제공한다.
CHEMS 콜레스테롤헤미숙시네이트
Chol-COOH 또는 Chol-C1 콜레스테릴-3-카르복실산
Chol-C2 콜레스테롤헤미옥살레이트
Chol-C3 콜레스테롤헤미말로네이트
Chol-C3N N-(콜레스테릴-옥시카르보닐)글리신
Chol-C5 콜레스테롤헤미글루타레이트
Chol-C6 콜레스테롤헤미아디페이트
Chol-C7 콜레스테롤헤미피멜레이트
Chol-C8 콜레스테롤헤미수베레이트
Chol-C12 콜레스테롤헤미도데칸 디카르복실산
Chol-C13N 12-콜레스테릴옥시카르보닐아미노도데칸산
Chol-C16 콜레스테롤헤미헥사데칸 디카르복실산
하기 일반식의 콜레스테롤헤미디카르복실산 및 콜레스테릴옥시카르보닐아미노카르복실산:
Figure pct00003
상기 식에서, Z는 C 또는 -NH-이고, n은 O 및 29의 임의의 수이다.
DGS 또는 DG-Succ 디아실글리세롤헤미숙시네이트 (비특이적 막 앵커)
DOGS 또는 DOG-Succ 디올레오일글리세롤헤미숙시네이트
DMGS 또는 DMG-Succ 디미리스토일글리세롤헤미숙시네이트
DPGS 또는 DPG-Succ 디팔미토일글리세롤헤미숙시네이트
DSGS 또는 DSG-Succ 디스테아로일글리세롤헤미숙시네이트
POGS 또는 POG-Succ 1-팔미토일-2-올레오일글리세롤-헤미숙시네이트
DOGM 디올레오일글리세롤헤미말로네이트
DOGG 디올레오일글리세롤헤미글루타레이트
DOGA 디올레오일글리세롤헤미아디페이트
DMGM 디미리스토일글리세롤헤미말로네이트
DMGG 디미리스토일글리세롤헤미글루타레이트
DMGA 디미리스토일글리세롤헤미아디페이트
DOAS 4-{(2,3-디올레오일-프로필)아미노}-4-옥소부탄산
DOAM 3-{(2,3-디올레오일-프로필)아미노}-3-옥소프로판산
DOAG 5-{(2,3-디올레오일-프로필)아미노}-5-옥소펜탄산
DOAA 6-{(2,3-디올레오일-프로필)아미노}-6-옥소헥산산
DMAS 4-{(2,3-디미리스토일-프로필)아미노}-4-옥소부탄산
DMAM 3-{(2,3-디미리스토일-프로필)아미노}-3-옥소프로판산
DMAG 5-{(2,3-디미리스토일-프로필)아미노}-5-옥소펜탄산
DMAA 6-{(2,3-디미리스토일-프로필)아미노}-6-옥소헥산산
DOP 2,3-디올레오일-프로판산
DOB 3,4-디올레오일-부탄산
DOS 5,6-디올레오일-헥산산
DOM 4,5-디올레오일-펜탄산
DOG 6,7-디올레오일-헵탄산
DOA 7,8-디올레오일-옥탄산
DMP 2,3-디미리스토일-프로판산
DMB 3,4-디미리스토일-부탄산
DMS 5,6-디미리스토일-헥산산
DMM 4,5-디미리스토일-펜탄산
DMG 6,7-디미리스토일-헵탄산
DMA 7,8-디미리스토일-옥탄산
DOG-GluA 디올레오일글리세롤-글루코론산 (1- 또는 4-연결됨)
DMG-GluA 디미리스토일글리세롤-글루코론산 (1- 또는 4-연결됨)
DO-cHA 디올레오일글리세롤헤미시클로헥산-1,4-디카르복실산
DM-cHA 디미리스토일글리세롤헤미시클로헥산-1,4-디카르복실산
PS 포스파티딜세린 (비특이적 막 앵커)
DOPS 디올레오일포스파티딜세린
DPPS 디팔미토일포스파티딜세린
MA 미리스트산
PA 팔미트산
OA 올레산
LA 리놀레산
SA 스테아르산
NA 네르본산
BA 베헨산
POGA 팔미토일-올레오일-글루탐산
DPAA 디팔미토일아스파르트산
상기 열거된 디아실기를 포함하는 음이온성 지질의 임의의 디알킬 유도체 또한 본 발명의 범주 내에 있다.
카르복실기를 갖는 바람직한 음이온성 지질은 Chol-C1 내지 Chol-C16의 군 (그의 모든 동족체 포함)으로부터 선택할 수 있으며, 특히 CHEMS이다. 또한 음이온성 지질 DMGS, DPGS, DSGS, DOGS, POGS가 바람직하다.
극성 헤드 기에 포스페이트 잔기를 포함하는 음이온성 지질은 당업자에게 널리 공지되어 있다. 포스페이트 지질의 예는 하기 구조 (P1)-(P4)로부터 선택할 수 있다.
Figure pct00004
상기 식에서, n 또는 m은 O 내지 29의 정수이고, R1 및 R2는 서로 독립적으로 8 내지 24개의 탄소 원자 및 0, 1 또는 2개의 불포화 결합을 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 잔기이고, A, B 또는 D는 서로 독립적으로 없거나, -CH2-, -CH=, =CH-, -O-, -NH-, -C(O)-O-, -O-C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -O-C(O)-NH- 또는 -NH-C(O)-O-이고, "스테롤"은 C3 원자를 통해 부착된 콜레스테롤일 수 있다.
하기 리스트는 포스파티드산 기를 갖는 지질의 추가적인 구체적 예를 제공한다.
Chol-P 콜레스테롤-3-포스페이트
DOPA 디올레오일-포스파티드산
POPA 팔미토일-올레오일-포스파티드산
DPPA 디팔미토일-포스파티드산
DMPA 디미리스토일포스파티드산.
R1이 16 내지 24개의 탄소 원자를 갖는 세틸포스페이트 또는 인산 에스테르 동족체.
본 발명에서 사용할 수 있는 양이온성 지질은 그의 극성 헤드 기에 이미노 잔기를 포함하는 양친매성 분자이고, 이러한 이미노 잔기는 생리적 조건하에서 실질적으로 하전된다. 따라서, 바람직한 실시양태에서 이러한 관능기의 pK 값은 7.5 이상이고, 보다 바람직한 형태에서 이미노기의 pK 값은 8.5 이상이다. 이러한 특징을 갖는 이미노 잔기는 이민 자체이거나 보다 큰 관능기, 예컨대 아미딘, 피리딘, 2-아미노피리딘, 헤테로시클릭 질소 염기, 구아니도 관능기, 이소우레아, 이소티오우레아 등의 일부일 수 있다.
하기 구조 (I1)... (I113)는 이러한 이미노 잔기의 일부 구체적인 예를 나타낸다.
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
상기 식에서, L은 양친매성 지질 분자의 비극성 영역 및 임의로 링커 및 스페이서 잔기를 나타낸다. L의 예는 추가로 하기 일반적 구조 (11) 내지 (15)로부터 선택할 수 있다.
Figure pct00008
상기 식에서, n 또는 m은 0 내지 29의 정수를 나타내고, R1 및 R2는 서로 독립적으로 8 내지 24개의 탄소 원자 및 0, 1 또는 2개의 불포화 결합을 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 잔기이고, A, B 또는 D는 서로 독립적으로 없거나, -CH2-, -CH=, =CH-, -O-, -NH-, -C(O)-O-, -O-C(O)-, -C(O)-NH-, -NH-C(O)-, -O-C(O)-NH- 또는 -NH-C(O)-O-이고, "스테롤"은 그의 C3 원자를 통해 부착되는 콜레스테롤일 수 있다.
하기 표 1에는 잔기 (I1) 내지 (I113)를 함유하는 이미노의 pK에 대한 계산된 값 또는 데이터베이스 값이 제공된다. 4차화 이미노 잔기에 있어서, 이러한 사실을 단지 강조하기 위해서 99의 가정 값을 도입하였다.
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
상기 제시된 데이터로부터, 구조 I1-I113 중 대부분이 7.5 초과 또는 심지어 8.5 초과인 pK를 갖는 바람직한 이미노 잔기를 포함함이 명백하다.
pK 값은 공공 데이터베이스로부터 취할 수 있다. 대안적으로, 이러한 값을 계산하거나, 예측하거나 외삽할 수 있는 전문가 소프트웨어가 공공 도메인에서 이용가능하며, 예를 들어 ACD/Labs v7 (어드밴스드 케미스트리 디벨롭먼트 (Advanced Chemistry Development), 캐나다 온타리오주 소재) 등이 있다.
상기 분석된 이미노 잔기는, 본 발명을 특정 예로 제한하지 않으면서 본 발명의 교시내용을 예시한다. 치환체의 위치를 변화시키는 것은 당연히 가능하며, 특히 고리계, 예컨대 피롤 또는 피리딘이 본 발명의 실시에 사용되는 경우에 가능하다. I1-I113에 걸쳐 사용되는 지방족 라디칼을 방향족 잔기 또는 아릴 잔기로 교체하는 것 또한 가능하다. 하기 화합물 (A1) 내지 (A21)의 리스트는 이러한 변형체를 추가로 예시하는 다수의 예를 제공하며, 여기서 L은 상기 정의와 같다.
Figure pct00012
하기 표 2는 잔기 (A1) 내지 (A21)를 함유하는 이미노의 pK에 대한 계산된 값 또는 데이터베이스 값을 제공한다. 4차화 이미노 잔기에 있어서, 이러한 사실을 단지 강조하기 위해서 99의 가정 값을 도입하였다.
Figure pct00013
다시 기재하자면, 상기 표 2에 제시된 구조 중 다수는 pK가 7.5 초과 또는 심지어 8.5 초과인 바람직한 이미노 잔기를 포함한다.
상기한 바와 같이, 하전된 이미노 잔기는 지질 앵커 또는 소수성 부분과 조합되어 그들 자체로 지질 2중층을 형성할 수 있는 지질 또는 양친매성물질이 되거나 다른 지질 또는 양친매성물질로부터 형성되는 지질 막에 통합될 수 있다. 일부 실시양태에서, 특정 지질 또는 양친매성물질은 하기 제시되는 예 L1 내지 L17로부터 선택할 수 있다.
Figure pct00014
Figure pct00015
Figure pct00016
상기 식에서, R1 및 R2는 서로 독립적으로 8 내지 24개의 탄소 원자 및 0, 1 또는 2개의 불포화 결합을 갖는 알킬, 알케닐 또는 알키닐 잔기이다.
이러한 지질 중 일부는 앞서 문헌에 제시되었는데, 예를 들어 제WO91/16024호, 제WO97/43363호, 제WO98/05678호, 제WO 01/55098호, 제WO 2008/137758호 (아미노산 지질), 제EP 0685234호 (디아실글리세롤 기재), 제US 5965434호 (또한 디아실글리세롤 기재)에서 구아니도 지질, 또는 제US 6726894호에서 피리디늄 화합물이 제시되어 있다. 또한, 제WO 29086558호에 입증되어 있는 바와 같이 또는 구조 (15)에서 예시된 바와 같이, 예를 들어 디옥솔란 링커 세그먼트를 포함하는 동시에 해당 헤드기의 관능성을 유지하는 대안적 지질 골격을 사용하는 것 또한 가능하다.
지질 혼합물 및 임의적 다른 지질
본 발명은 음이온성 및 양이온성 양친매성물질을 포함하는 지질 혼합물을 개시하며, 상기 양이온성 양친매성물질의 적어도 일부는 생리적 조건하에서 실질적으로 하전되는 이미노 지질이고, 추가로 음이온성 양친매성물질의 적어도 일부는 카르복실 지질 또는 포스페이트 지질이다.
극성 헤드 기에 하전된 이미노 잔기를 포함하는 양이온성 지질, 및 극성 헤드 기에 카르복실 또는 포스페이트 관능기를 포함하는 음이온성 지질 둘 다의 공존이 본 발명의 중심 특징부이다. 즉, 이러한 요소 중 하나가 실질적으로 부재하는 리포좀 또는 지질 어셈블리는 본 발명의 실시에서 고려하지 않는다. 양이온성 이미노 지질 및 음이온성 지질은 상이한 비율로 존재할 수 있으며, 상기 비율은 본원에서 본 개시내용에 걸쳐 "전하비" (양이온:음이온 비율, C/A, 정의 참고)를 특징으로 한다. 다수의 실시양태에서, C/A 비율은 0.33 초과이고, 바람직한 실시양태에서 이러한 비율은 0.5 초과이고, 일부 실시양태에서 비율은 0.66 이상이다. 상기 실시양태의 바람직한 측면에서 C/A는 3 이하이고, 추가로 바람직한 측면에서 비율은 2 이하이고, 특히 바람직한 측면에서 비율은 1.5 이하이다.
상기 실시양태의 여러 측면에서, 생성되는 지질 혼합물은 양쪽성 특질부를 갖는다. 7.5 초과의 pK를 갖는 이미노 지질, 심지어 8.5 이상의 pK를 갖는 바람직한 이미노 지질은 생리적 조건하에서 본질적으로 하전되고, 그의 실제 전하는 그의 명목 전하에 가까워지고, 결국에는 동일하게 된다. 카르복실 지질의 통상적 pK는 4.5 내지 6이고, 또한 이러한 지질은 따라서 생리적 pH에서 하전 된다. 따라서 이미노 및 카르복실 지질 둘의 혼합물은 생리적 pH에서 C/A가 1 미만일 때 순 음전하를 갖게 되고, C/A=1에서 순전하는 0이 되고, C/A>1에서는 양전하를 갖게 된다.
낮은 pH에서, 음이온성 전하는 카르복실 지질의 pK 부근에서 없어져, C/A<1를 갖는 지질 혼합물을 먼저 중성, 그 후 양으로 하전 되도록 한다. 전하 역전은 C/A<1의 특징이고, 양쪽성 특질부를 정의한다. C/A=1 또는 C/A>1를 갖는 지질 혼합물 또한 낮은 pH에서 음전하가 감소하나, 전하 역전은 일어나지 않는다. 그러나, C/A와 생성된 지질 어셈블리의 양쪽성 특질부 사이의 관계는 주어진 2중충을 가로질러 하전된 잔기의 통계, 본질적으로 동일한 분포를 의미함을 인지해야 한다. 이는 이러한 계산의 완전한 유효성을 유지하기 위하여, 막의 내부 및 외부 리플렛 (leaflet)이 동일한 조성의 하전된 지질을 가져야 함을 의미한다. 이는 실시예 9에서 입증되는 바와 같이 항상 그러한 것은 아닐 수 있으며, 양쪽성 특질부를 갖는 리포좀은 C/A>1를 갖는 지질 혼합물로도 형성할 수 있다. 여전히, 본원에 개시된 막 조성과 양쪽성 특질부 사이의 상관관계는 지질 혼합물의 선택에 우수한 안내를 제공한다.
지질 혼합물은 부가적 양이온성, 음이온성, 중성/쯔비터이온성 또는 관능화 지질을 추가로 포함할 수 있다. 부가적 양이온성 지질은 공지된 구성요소, 예컨대 DOTAP, DODAP, DC-Chol 등일 수 있다. 부가적 음이온성 지질은 음으로 하전된 인지질, 예컨대 포스파티딜글리세롤, 포스파티드산, 디세틸인산, 카르디올리핀 등으로부터 선택할 수 있다. 중성 또는 쯔비터이온성 지질은 콜레스테롤, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜콜린, 스핑고미엘린 등이다.
바람직한 실시양태에서, 중성 지질은 콜레스테롤이다. 추가로 바람직한 것은 지질 혼합물이 10 mol% 내지 50 mol%의 콜레스테롤을 포함하는 변형체이고, 더욱 바람직한 것은 약 20 mol% 내지 40 mol%의 콜레스테롤을 포함하는 변형체이다.
관능화 지질의 중요한 군은 중합체 연장, 예컨대 폴리에틸렌글리콜 (PEG-지질)을 포함하는 것이다. 여러 PEG화 지질이 최신 기술에서 공지되어 있는데, 본질적 차이는 (i) PEG-쇄의 분지의 크기 및 정도, (ii) PEG와 분자의 막-삽입부 사이의 링커 기의 유형, 및 (iii) PEG화 지질의 소수성, 막 삽입 도메인의 크기에서 찾을 수 있다. PEG화의 추가적 측면은 (iv) 지질 어셈블리에서 개질물의 밀도, 및 (v) 그러한 지질 어셈블리 내에서의 개질물의 배향이다.
측면 (i)의 다수의 실시양태에서, PEG 단편의 분자량은 500Da 내지 5,000Da이고, 더욱 바람직한 실시양태에서, 이러한 단편의 분자량은 약 700Da 내지 2,500Da이고, 더욱 바람직한 것은 약 2,000Da의 PEG 단편이다. 이러한 다수의 실시양태에서, PEG 잔기는 단일 쇄, 비분지형 PEG이다.
측면 (ii)의 통상적 실시양태는 포스포에탄올아민 잔기, 디아실글리세롤 잔기 또는 세라마이드의 극성 헤드 기이다.
측면 (iii)에서의 특징인 소수성, 막 삽입 도메인의 크기는, 2중층 내 PEG 지질의 막 체류 시간을 결정하므로 이러한 분자의 추가로 중요한 특징부이다. 예로써, 짧은 소수성 도메인을 갖는 PEG화 지질, 예컨대 DMPE-PEG2000 (디미리스토일포스파티딜에탄올아민-PEG 컨쥬게이트, 여기서 PEG 쇄의 분자량은 2000Da임)은 수 초안에 주어진 막으로부터 확산되는 반면, DSPE-PEG2000 동족체는 수 시간 또는 수 일 동안 2중층에 체류한다 (문헌 [Silvius, J. R. and Zuckermann, M.J. (1993) Biochemistry 32, 3153-3161] 또는 문헌 [Webb, M.S. et al. (1998) in Biochim Biophys Acta 1372: 272-282] 또는 문헌 [Wheeler et al. (1999) in Gene Ther 6: 271-281] 참고).
이와 동시에 PEG화는 리포좀에, 특히 제US 6,287,591호에 예시되는 바와 같이 양이온성 리포좀과 음이온성 핵산 수송물의 조합에 콜로이드 안정성을 제공하지만, 또한 리포좀의 세포 흡수 및/또는 엔도좀 흡수를 손상시킨다 (문헌 [Shi, F. et al. (2002) in Biochem. J. 366:333-341] 참고). 현재 일시적 PEG화가 최신 기술이며, 콜로이드 안정성 및 입자의 활성 둘 다의 요구사항을 만족시킨다.
PEG화의 추가적 측면 (iv)은 이러한 개질물의 밀도이며, 이는 지질 혼합물의 0.5 내지 10 mol%이어야 하며, 바람직한 실시양태에서 PEG화 정도는 약 1 내지 4 mol%이어야 한다.
주어진 2중층의 PEG화가 지질 어셈블리의 라멜라 상을 안정화시키고, 6각형 상의 형성과 연관된 지질 융합을 손상시키므로, 2중층 중의 잔류 PEG 잔기의 양은 최소량이어야한다. 이는 PEG지질의 요구량의 적정에 의해 달성할 수 있다. 측면 (v)의 일부 실시양태에서 리포좀은 따라서 양쪽 막 리플렛에서 PEG화되며, PEG의 양은 최소화된다. 또 다른 변형체에서, PEG 제거는 되도록 완벽하게 한다. 이는 외부 2중층과 연합된 PEG 지질에 있어서는 달성하기 쉽지만, 지질 구조의 내부에 부착된 PEG 지질에 있어서는 확산이 본질적으로 불가능하다. 따라서, 본 발명의 측면 (v)의 바람직한 실시양태는, 하전된 이미노 및 카르복실 또는 포스페이트 지질과 외부 표면 상에 본질적으로 자리한 PEG화 지질을 추가로 포함하는 리포좀을 제공하는 것이다.
이러한 리포좀은, 리포좀이 제1 단계에서 형성되고 이 단계에 또한 수송물 분자의 캡슐화가 포함되는, 그의 제조 방법을 특징으로 할 수 있다. 그 후 제2 단계에서, 앞서-제작된 리포좀의 외부 2중층 안으로 PEG-지질이, 예를 들어 리포좀 현탁액에 PEG화 지질의 교질입자 용액을 첨가함으로써 삽입된다. 이러한 방법의 특정 실시양태에서, 핵산을 격리하는 리포좀은 핵산의 수성 용액과 지질의 알코올성 용액을 혼합함으로써 형성된다. 핵산을 트래핑하는 리포좀이 자발적으로 형성되고 PEG화 지질을 후속 단계에서 첨가한다.
이러한 방법은 양쪽성 리포좀을 이용하여 특별히 유리하게 실시할 수 있는데, 이는 이러한 리포좀이 이미 콜로이드 안정성을 제공하여 리포좀 형성과 PEG화 사이의 시간 요소가 덜 결정적이기 때문이다. 핵산을 캡슐화하는 양쪽성 리포좀의 제조는 제WO 02/066012호, 그의 계속 출원 제US2007/0252295호 또는 추가로 제WO 07/107304호에 개시되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 이미노 및 카르복실 또는 포스페이트 지질을 포함하는 양쪽성 리포좀은, 중성화 완충제와 함께 요구되는 양의 PEG 지질을 제공함으로써 그의 외부에서 PEG화 된다. 이를 위하여, PEG 지질을 중성화 완충제 중에 용해시킬 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 상기 리포좀을 형성하고 중성화시키고 PEG 지질을 0.1초 내지 수 일의 휴지 기간 후 별도로 첨가한다. 또 다른 실시양태에서, 리포좀을 형성하고 중성화시키고 리포좀 현탁액을 추가로 농축시키고 재료의 농축 후에 PEG 지질을 첨가한다. 또 다른 실시양태에서, 리포좀을 형성하고 중성화시키고 농축시키고 비-캡슐화 핵산을 제거하고, 임의로 리포좀 현탁액을 위한 완충제를 교체한 후, PEG 지질을 첨가한다. 요약하면, PEG 지질은 리포좀의 형성 및 폐쇄 후 언제나 첨가할 수 있다.
다른 실시양태에서, 이미노 및 카르복실 또는 포스페이트 지질을 포함하는 리포좀은 pH-감성 양이온성 특질부를 갖고, 상기 간략히 기재한 단계를 따라 상기 리포좀의 형성 및 폐쇄시 요구되는 양의 PEG 지질을 제공함으로써 그의 외부 표면 상에서 PEG화 된다. pH-감성 리포좀은 핵산의 존재하에서 응집물을 형성하는 경향이 더욱 크기 때문에, 빠른 PEG화가 바람직하여 PEG 지질을 리포좀의 폐쇄 직후, 예를 들어 그의 제조 0.1초 내지 1분 후에 첨가한다.
외부 표면 상에서 본질적으로 PEG화 되는 생성물 리포좀을 수득하는 상기 방법과는 대조적으로, 리포좀의 실제 형성 동안 (즉, 초기의 구조 폐쇄 전)의 PEG화 지질의 존재는 상이한 생성물을 야기한다. 구조적 데이터는 아직 수득하지 않았지만, 이러한 경우 상당량의 PEG 잔기가 또한 막의 내부 리플렛 내에 체류할 것임을 당업자는 예상할 것이다. 이는 또한 초기의 리포좀의 양쪽 리플렛에 접근할 수 있는 핵산 수송물의 경우에도 유사하며, 이 중 상당 부분은 리포좀이 폐쇄된 후 리포좀의 내부에서 검출될 수 있다.
지질 어셈블리
본원에 언급된 구성요소는 당업자에게 공지된 다양한 구조로 어셈블될 수 있다. 이는 하나 또는 다수의 개별적인 2중층을 포함하는 리포좀, 다른 초분자 지질 어셈블리 또는 수성 상을 제공하는 꽤 큰 내부 부피를 갖는 소포일 수 있다. 이는 또한 에멀젼 액적 또는 리포플렉스 어셈블리 형태의 구조일 수 있으며, 후자는 다수의 실시양태에서 지질과 핵산 사이의 정전기적 복합체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 구조는 리포좀 또는 소포이다. 다수의 실시양태에서, 리포좀 또는 소포는 꽤 큰 수성 내부를 갖는다. 본 발명의 다수의 측면에서, 활성 제약 성분은 복합체화, 캡슐화, 격리되거나 또는 다르게 지질 어셈블리와 연합된다.
다수의 유용한 이미노 및 카르복실 또는 포스페이트 및 부가적 지질을 고려했을 때, 매우 많은 잠재적으로 유용한 조합이 존재하여, 다수의 변형체 중에서의 선택 및 최적화가 추가로 요구된다. 제WO 08/043575호에는 구체적인 안내가 제공되고, 본원에서 추가로 상세하게 논의되는 바와 같이, 복합체 지질 어셈블리, 특히 지질 2중층의 최적화 방법이 제공된다. 요약하면, 제WO 08/043575호의 교시내용은 산성 및 중성 pH 조건하 모두에서 양쪽성 지질 혼합물이 안정한 2중층을 형성함을 입증하지만, 이러한 지질 혼합물로부터 형성되는 2중층은 그의 등전점 (통상적으로 약 산성 조건)에서 상 전이되고 융합될 수 있다. 제WO 08/043575호에는 하전된 지질 구성요소를 위한 중간 크기 또는 작은 크기의 지질 헤드 기의 용도가 개시되어 있다. 제WO 08/043575호에는 또한 적재 절차 동안 낮은 pH에서 라멜라 상을 안정화시키기 위한 큰 또는 벌키한 완충제 이온의 용도, 및 또한 저장 동안 중성 pH에서 라멜라 상을 안정화시키기 위한 큰 또는 벌키한 완충제 이온의 용도가 교시된다. 특히, 제WO 08/043575호의 44-57쪽을 참고하며, 이는 상기 인용한 본질적인 요소를 특징부로 한다. 참고 문헌에는 융합 활성을 최대화하기 위해 작은 헤드 기를 갖는 중성 지질의 용도가 추가로 개시되어 있다. 개선된 융합을 위한 통상적 중성 지질은 콜레스테롤 또는 DOPE이다. 중성 지질에 대한 구체적인 고려사항 및 최적화 규칙은 제WO 09/047006호, 특히 63-70쪽에 추가로 제시되어 있다.
통틀어, 모두 본원에서 "참고 문헌"으로 지칭되는 제WO 08/043575호 또는 제WO 09/047006호는 지질 어셈블리의 최적화를 위한 합리적인 안내를 제공한다. 참고 문헌은 양쪽성 리포좀에 한정되지는 않으며, 지질 어셈블리의 구조-활성 관계에 대한 포괄적 모델을 제공한다.
본 발명은, 세포 결합, 상호작용 또는 지단백질 또는 다른 혈청 구성요소와의 경쟁을 우회할 수 있는 리포좀을 제형화하는 최적화된 방법을 제공하기 때문에, 진전된 기술을 제시한다. 참고 문헌에서 교시되는 방법이 지질 어셈블리의 필수 융합유도성에 대한 정보를 제공하는 한편, 참고 문헌에는 리포좀의 세포 결합의 예측에 관해서는 언급되지 않는다.
따라서, 본 발명의 목적은, 참고 문헌에 개시된 방법으로 제형화되고, 카르복실 또는 포스페이트, 즉 음으로 하전된 잔기를 갖는 음이온성 지질과 조합으로 생리적 조건하에서 실질적으로 하전되는 이미노 지질을 사용했을 때 관찰되는 예상치 못한 특성이 조합된, 지질 어셈블리, 지질 혼합물 및 리포좀을 제공하는 것이다. 어떠한 이론에 얽매이지 않길 바라면서, 본원에서 제형화되는 신규 조성물은, 당업계에 공지되지 않은 특징부인 지단백질-유사 세포 결합 및 흡수를 더욱 잘 촉진시킬 수 있다.
본원에 기재된 지질 혼합물은 양쪽성 또는 pH-감성 양이온성을 지닐 수 있으며, 둘 다 일반적으로 지질 어셈블리 또는 리포좀 쪽으로 이를 형성하는 지질에 의해 전달된다. 전하 특성은 제WO 02/066012호에 지질 막 또는 2중층의 양쪽 리플렛을 향한 지질의 대칭적 분포에 대해 기재된 대로 쉽게 예측할 수 있다. 그러나, 일부 경우 최외곽 리플렛의 지질 분포는 어셈블리의 다른 부분과 상이할 수 있다. 거시적으로, C/A가 1을 약간 초과하는 카르복실 또는 포스페이트 지질과 조합된 하전된 이미노 지질을 포함하는 지질 혼합물은 따라서 실시예 9 및 도 1에서 입증되는 바와 같이 여전히 양쪽성 특질부를 갖는 리포좀을 형성할 수 있다.
인 실리코 (in silico) 최적화 및 예측의 목적으로, C/A<1를 갖는 본 발명의 지질 혼합물이 양쪽성으로 고려되고, 참고 문헌의 분류에 따라 "앰포터 (amphoter) I" 혼합물로 범주화되는 지질 어셈블리를 형성할 수 있다. 다른 실시양태에서, C/A=1 또는 C/A>1를 갖는 지질 혼합물이 사용되고; 이들은 pH-감성 양이온성 지질 혼합물인데, 즉 그의 전하가 생리적 pH에서 중성 또는 양이온성이고, pH가 감소함에 따라 더욱 양이온성이 된다. 상기 실시양태의 pH-감성 양이온성 혼합물은 그의 양쪽성 짝의 경우에서와 같은 등전점을 더 이상 갖지 않는다. 그러나, 참고 문헌에 제공된 구조-활성 관계는 적용가능한데, 이는 그의 전하와는 상관없이 용질 및 이온과 관련하여 지질 어셈블리의 상 거동의 보편적인 이해를 제공하기 때문이다.
명확히 기재하자면, 본 발명의 지질 혼합물은 생리적 pH에서 실질적으로 하전되는 이미노기를 갖는 하나 이상의 양이온성 지질을 포함하고, 카르복실 또는 포스페이트기를 갖는 하나 이상의 음이온성 지질을 추가로 포함하고, 임의로 중성 지질을 추가로 포함한다.
리포좀의 양쪽성 특질부는 추가적 장점을 지닌다. 이러한 리포좀 또는 지질 어셈블리의 표면 음전하는 현탁액 중에서의 리포좀의 콜로이드 안정성을 크게 개선시킨다. 이는 양이온성 리포좀과 응집물을 쉽게 만드는 다중음이온성 수송물, 예컨대 핵산과 관련하여 특히 중요하다.
양쪽성 지질 어셈블리 또는 리포좀의 음성 내지 중성의 표면 전하는 또한, 생체내에 리포좀을 투여할 때 유리한데, 이는 양이온성 리포좀에서 관찰되는 바와 같은 상피 상의 비특이적 흡착 또는 혈청 구성요소와의 응집물 형성을 방지한다 (문헌 [Santel et al., (2006) in Gene Therapy 13: 1222-1234 for endothelial adsorption of cationic liposomes or Andreakos et al., (2009) in Arthritis and Rheumatism, 60:994-1005 for the prevention of aggregate formation with amphoteric liposomes] 참고).
따라서, 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 리포좀은 양쪽성 특질부를 지닌다. 이러한 군에서, 다중음이온성 수송물, 예를 들어 핵산의 입자에의 효과적인 적재를 유지하기 위하여 매우 낮은 백분율의 양이온성 구성요소를 회피하는 것이 유리하다. 추가로 바람직한 실시양태에서, C/A는 0.5 초과이다.
전신적으로, 즉, 혈류 안으로 적용하는 경우, 리포좀은 체내에서 특정하게 분포된다. 통상적 표적 부위는 간 및 비장이나, 또한 순환 식균 세포도 포함된다. 리포좀은 또한 혈관을 둘러싼 상피와 접촉하고 이러한 세포에 형질감염될 수 있다. 감염 부위 및 종양에의 리포좀의 축적은 특별한 치료적 관련성을 지닌다.
당업자는 한 부위 또는 다른 부위로의 입자의 분포를 인도하는 방법을 알 것이다. 약 150nm 이하의 작은 직경을 갖는 리포좀은 간 상피에 침투할 수 있어서, 간세포 및 간 실질의 다른 세포에 대한 접근성을 획득한다는 것이 널리 공지되어 있다. 간 세포의 표적화가 치료적 관심사인 측면에서, 본 발명의 리포좀의 직경은 150nm 이하일 수 있고, 바람직한 실시양태에서, 리포좀의 직경은 120nm 미만일 수 있다.
직경이 100nm 이상인 입자가 식균 세포에 의해 잘 인식된다는 것이 또한 널리 공지되어 있다. 따라서, 대식세포 또는 수지상 세포가 관심 표적을 구성하는 실시양태에서, 본 발명의 리포좀은 120nm 이상이다. 일부 실시양태에서, 이러한 리포좀은 150nm 이상이다. 다른 실시양태에서, 이러한 리포좀의 크기는 250nm 정도, 또는 400nm까지 클 수 있다.
또한, 표면 전하가 순환 시간에 영향을 주고, 그에 따라 리포좀의 바이오분포에 영향을 줄 수 있음이 설명되어 있고, PEG화가 표면 전하를 감소시켜 리포좀의 연장된 순환을 초래함이 잘 확립되어 있다. 연장된 순환은 일반적으로 종양으로의 분포를 최대화하는 것으로 인식된다. 따라서, 종양이 관심 표적을 구성하는 측면에서, 본 발명의 리포좀은 낮은 순 표면 전하를 가지고, 0.67 내지 1.5의 C/A를 특징으로 한다. 이러한 적용의 바람직한 실시양태에서, 상기 리포좀을 형성하는 지질 혼합물은 0.8 내지 1.25의 C/A를 갖는다. 또한, 종양을 표적화하는 리포좀은 크기가 작다. 바람직한 실시양태에서, 이러한 리포좀은 150nm 미만, 추가로 바람직한 실시양태에서, 리포좀은 120nm 미만이다. 일부 실시양태에서, 리포좀은 PEG 지질을 추가로 포함한다.
본 발명의 리포좀에 있어서의 수송물
본 발명의 리포좀 또는 지질 어셈블리는 하나 이상의 활성제를 격리 또는 캡슐화시킬 수 있다. 상기 활성제는 약물을 포함할 수 있다. 일부 실시양태에서, 상기 활성제는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 활성 성분은 핵산으로 이루어진다.
이러한 용도에 한정되지 않으면서, 본 발명에 기재되는 리포좀 또는 지질 어셈블리는 핵산-기재 약물, 예컨대 올리고뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 및 DNA 플라스미드를 위한 담체로서 사용하기에 매우 적합하다. 이러한 약물은 단백질, 폴리펩티드 또는 RNA에 대한 하나 이상의 특정 서열을 코딩하는 핵산으로, 및 특히 스플라이싱 및 인위적 절단에 의한 방해를 통해 단백질 발현 수준을 특이적으로 조절할 수 있거나 단백질 구조에 영향을 줄 수 있는 올리고뉴클레오티드로 분류된다.
따라서, 본 발명의 일부 실시양태에서, 핵산-기재 치료제는 하나 이상의 RNA로 척추 동물 세포 내에서 전사될 수 있는 핵산을 포함할 수 있으며, 상기 RNA는 mRNA, shRNA, miRNA 또는 리보자임일 수 있고, 이러한 mRNA는 하나 이상의 단백질 또는 폴리펩티드를 코딩한다. 이러한 핵산 치료제는 원형 DNA 플라스미드, 선형 DNA 구조물, 예컨대 제WO 98/21322호 또는 제DE 19753182호에 기재된 바와 같은 MIDGE (미니멀리스틱 면역학적으로 정의된 유전자 발현; Minimalistic Immunogenically Defined Gene Expression) 벡터 또는 번역 준비가 된 mRNA일 수 있다 (예를 들어, 제EP 1392341호).
본 발명의 다른 실시양태에서, 존재하는 세포내 핵산 또는 단백질을 표적화할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드가 전사를 감쇠 또는 조절하거나, 전사의 과정을 변경시키거나, 달리 단백질의 발현을 방해하는데 적합화되도록, 상기 핵산은 특정 유전자를 코딩할 수 있다. 용어 "표적 핵산"은 특정 유전자를 코딩하는 DNA, 및 또한 이러한 DNA로부터 유도되는 모든 RNA, 즉 전-mRNA 또는 mRNA를 포함한다. 표적 핵산과 이러한 서열로 인도하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 사이의 특정 혼성화는 단백질 발현의 저해 또는 조절을 야기할 수 있다. 이러한 특정 표적화를 달성하기 위하여, 올리고뉴클레오티드는 표적 핵산의 서열에 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드의 연속적 스트레치 (stretch)를 적합하게 포함해야 한다.
상기 언급한 기준을 만족하는 올리고뉴클레오티드는 여러 다양한 화학적 성질 및 위상기하를 가지도록 제작할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는, 비제한적으로, 포스페이트 또는 포스포티오에이트 형태의 DNA, RNA, 잠금 (locked) 핵산 (LNA), 비잠금 (unlocked) 핵산 (UNA), 2'0-메틸 RNA (2'Ome), 2'O-메톡시에틸 RNA (2'MOE)를 포함하는 자연 발생 또는 변형된 뉴클레오시드 또는 모르폴리노 또는 펩티드 핵산 (PNA)을 포함할 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 단일 가닥 또는 이중 가닥일 수 있다.
올리고뉴클레오티드는 8-60 전하를 갖는 다중음이온성 구조이다. 대부분의 경우, 이러한 구조는 뉴클레오티드를 포함하는 중합체이다. 본 발명은 올리고뉴클레오티드의 작용의 특정 기작에 제한되지 않고, 기작의 이해는 본 발명의 실시에서 필수가 아니다. 올리고뉴클레오티드의 작용의 기작은 다양할 수 있고, 특히, 스플라이싱, 전사, 핵-세포질 전달 및 번역에 대한 효과를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 실시양태에서, 단일 가닥 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있으며, 이에는, 비제한적으로, DNA-기재 올리고뉴클레오티드, 잠금 핵산, 2'-개질 올리고뉴클레오티드 등 (통상적으로 안티센스 올리고뉴클레오티드으로 공지됨)이 포함된다. 골격 또는 염기 또는 당 개질물에는, 비제한적으로, 포스포티오에이트 DNA (PTO), 2'O-메틸 RNA (2'Ome), 2'플루오로 RNA (2'F), 2'O-메톡시에틸-RNA (2'MOE), 펩티드 핵산 (PNA), N3'-P5' 포스포아미데이트 (NP), 2'플루오로아라비노 핵산 (FANA), 잠금 핵산 (LNA), 비잠금 핵산 (UNA), 모르폴린 포스포아미데이트 (모르폴리노), 시클로헥센 핵산 (CeNA), 트리시클로-DNA (tcDNA) 등이 포함될 수 있다. 또한, 하나 이상의 단일 뉴클레오티드 종으로부터 공중합체, 블록-공중합체 또는 갭머 (gapmer) 또는 다른 배열로서 제작된 혼합된 화학물질이 당업계에 공지되어 있다.
상기 언급된 올리고뉴클레오티드에 부가적으로, 단백질 발현은 또한, 상보적 서열 모티프를 포함하는 이중 가닥 RNA 분자를 사용하여 저해할 수 있다. 이러한 RNA 분자는 당업계에서 siRNA 분자로 공지되어 있다 (예를 들어, 제WO 99/32619호 또는 제WO 02/055693호). 다른 siRNA는 단일 가닥 siRNA 또는 하나의 비연속적 가닥을 갖는 이중 가닥 siRNA를 포함한다. 다시 기재하자면, 다양한 화학물질이 이러한 계열의 올리고뉴클레오티드에 적합화되었다. 또한, DNA/RNA 하이브리드 시스템이 당업계에 공지되어 있다. 다른 종류의 siRNA에는, 보다 작은 두 가닥이 보통의 긴 가닥에 혼성화되는 3-가닥 구조물, 소위 메로듀플렉스 (meroduplex) 또는 그의 구조 안에 빠진 곳 및 틈을 갖는 sisiRNA가 포함된다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 디코이 (decoy) 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 이러한 이중 가닥 DNA 분자 및 이의 화학적 개질물은 표적 핵산이 아닌 전사 인자를 표적으로 한다. 이는 디코이 올리고뉴클레오티드가 서열-특이적 DNA-결합 단백질과 결합하고 전사를 방해함을 의미한다 (예를 들어, 문헌 [Cho-Chung, et al., in Curr. Opin. Mol. Ther., 1999]).
본 발명의 추가적 실시양태에서, 생리적 조건하에서 유전자의 프로모터 영역에 혼성화되어 전사에 영향을 줄 수 있는 올리고뉴클레오티드를 사용할 수 있다. 다시 기재하자면, 다양한 화학물질이 이러한 계열의 올리고뉴클레오티드에 적합화될 수 있다.
본 발명의 또 다른 대안에서, DNA자임을 사용할 수 있다. DNA자임은 단일-가닥 올리고뉴클레오티드 및 효소 활성을 갖는 그의 화학적 개질물이다. "10-23" 모델로 공지된 통상적 DNA자임은 생리적 조건하에서 단일-가닥 RNA를 특이적 부위에서 절단할 수 있다. DNA자임의 10-23 모델은 RNA 상의 표적 서열에 대해 상보적인 2 기질-인식 도메인이 측면에 배치된 (flanked), 15개의 고도로 보존된 데옥시리보뉴클레오티드의 촉매적 도메인을 갖는다. 표적 mRNA의 절단은 그의 파괴 및 DNA자임 재순환을 초래할 수 있고, 다중 기질을 절단할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시양태에서, 리보자임을 사용할 수 있다. 리보자임은 단일-가닥 올리고리보뉴클레오티드 및 효소 활성을 갖는 그의 화학적 개질물이다. 이는 작용적으로, 촉매적 코어를 형성하는 보존된 스템-루프 구조 및 주어진 RNA 전사물에서 표적 부위를 둘러싸는 서열에 역 상보적인 측면에 배치된 서열의 두 구성요소로 나눌 수 있다. 측면에 배치된 서열은 특이성을 부여할 수 있고, 일반적으로 총 14-16 nt로 구성되고, 선택된 표적 부위의 양쪽 상에서 연장된다.
본 발명의 다른 실시양태에서, 압타머 (aptamer)를 사용하여 단백질을 표적화할 수 있다. 압타머는 핵산, 예컨대 RNA 또는 DNA 및 특이적 분자 표적에 강하게 결합하고 통상적으로 길이가 15-60 nt인 그의 화학적 개질물로 이루어진다. 뉴클레오티드의 사슬은 분자를 복잡한 3차원 모양으로 접는 분자간 상호작용을 형성할 수 있다. 압타머의 모양은, 비제한적으로 산성 단백질, 염기성 단백질, 막 단백질, 전사 인자 및 효소를 비롯한 그의 표적 분자의 표면에 강하게 결합할 수 있도록 한다. 압타머 분자의 결합은 표적 분자의 기능에 영향을 줄 수 있다.
상기 언급된 올리고뉴클레오티드 모두 그 길이는, 가닥 당 뉴클레오티드의 개수가 5 또는 10개 정도로 적은 것에서부터 (바람직하게는 15개, 더 바람직하게는 18개), 50 또는 60개 정도로 많은 것 (바람직하게는 30개, 더 바람직하게는 25개) 사이에서 다양할 수 있다. 보다 구체적으로, 올리고뉴클레오티드는 그의 표적 서열의 RNA분해효소H 매개된 분해를 촉매하거나 번역을 저지하거나 스플라이싱을 재인도하거나 안타고미르로서 작용하는 8 내지 50개의 뉴클레오티드 길이의 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있으며; 이는 15 내지 30개의 염기쌍 길이의 siRNA일 수 있거나; 이는 또한 15 내지 30개의 염기쌍 길이의 디코이 올리고뉴클레오티드를 나타낼 수 있다. 대안적으로, 이는 15 내지 30개의 뉴클레오티드 길이의 게놈 DNA의 전사에 영향을 주는 상보적 올리고뉴클레오티드일 수 있거나; 이는 또한 25 내지 50개의 뉴클레오티드 길이의 DNA자임 또는 25 내지 50개의 뉴클레오티드 길이의 리보자임 또는 15 내지 60개의 뉴클레오티드 길이의 압타머를 나타낼 수 있다. 이러한 올리고뉴클레오티드의 하부계열은 종종 기능적으로 정의되고, 본 발명의 교시내용을 실질적으로 해치지 않으면서 그의 화학적 성질 또는 구조의 특징부를 일부 (전체는 아님) 공유하거나 동일하거나 상이할 수 있다. 올리고뉴클레오티드와 표적 서열 사이의 합치성은, 염기쌍을 형성하는 올리고뉴클레오티드의 각각의 염기와 상기 언급된 개수의 올리고뉴클레오티드의 연속된 스트레치에 걸쳐 표적 핵산 상의 그의 상보적 염기가 완벽한 것이 바람직하다. 덜 바람직하지만, 서열의 쌍은 상기 염기쌍의 연속적 스트레치 내에 하나 이상의 잘못된 쌍을 포함할 수 있다. 일반적으로, 이러한 핵산의 유형 및 화학적 조성은, 생체내 또는 시험관내에서 비히클로서의 본 발명의 리포좀의 성능에 큰 영향을 주지 않으며, 당업자는 본 발명의 양쪽성 리포좀과의 조합으로 적합한 다른 유형의 올리고뉴클레오티드 또는 핵산을 찾을 수 있을 것이다.
특정 측면에서 그리고 본원에서 입증되는 바와 같이, 본 발명에 따른 리포좀은 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 세포를 형질감염시키는데 유용하다.
특정 실시양태
콜레스테롤 기재 지질
본 발명의 교시내용을 예시하기 위하여, 구아니도 잔기 (하전된 이미노기, CHOL-GUA), 이미다졸 잔기 (비-하전된 이미노기, CHIM) 또는 디메틸아미노 또는 트리메틸 암모늄 잔기 (비-이미노, 그러나 하전된 기, DC-CHOL 또는 TC-CHOL)를 포함하는 콜레스테롤의 양이온성 유도체를 체계적으로 여러 음이온성 지질과 조합하였다.
Figure pct00017
사용된 음이온성 지질은 CHEMS (소수성 부분으로서 콜레스테롤, 카르복실산 전하 기), DMGS 또는 DOGS (디아실글리세롤 소수성 부분, 카르복실산 전하 기) 또는 DOPA (소수성 부분으로서 디아실 글리세롤, 포스페이트 에스테르 전하 기)이었다. 대부분의 양이온/음이온 조합에 있어서, C/A 비율이 0.33 내지 2인 8개의 일련의 2원 혼합물을 제조했고, 양이온성 지질과 DOPA의 조합을 0.75 내지 1의 C/A에서 시험하였다. 콜레스테롤을 지시된 바와 같이 모든 지질 혼합물에 20 내지 40 mol%를 구성하도록 첨가하였다.
모든 리포좀에 세포 주기 키나아제 PLK-1의 생성을 저해할 수 있는 올리고뉴클레오티드인 PLK-1 siRNA를 적재했고, 시험 세포의 세포 생존력을 저해하여 성공적인 형질감염이 측정되었다 (또한 문헌 [Haupenthal et al., int. J. Cancer (2007), 121 :206-210] 참고). 세포 생존력의 비특이적 저해, 즉, 세포독성 효과를, 동일한 일반적 조성을 갖는 비-표적화 siRNA를 동일한 양으로 포함하는 대조군 제제를 통해 모니터링하였다.
통상의 세포 배양 배지 내에서 또는 다수의 양쪽성 리포좀의 세포 흡수의 강력한 저해제인 10% 마우스 혈청의 부가적 존재하에서, 세포의 형질감염을 이어 수행하였다. 형질감염의 효력은, 세포 생존력의 50% 저해를 달성하는데 필요한 농도인 IC50으로 표현된다.
통상의 배지 내에서의 IC50과 마우스 혈청 첨가시의 IC50 사이의 비율을 마우스 혈청에 의한 세포 흡수의 저해에 대한 측량 수단으로 사용한다. 이러한 비율은 특이적 표적화 특성을 갖지 않는 리포좀에 있어서 5 이상이다. 본 발명의 리포좀 (즉, 하전된 이미노기와 음으로 하전된 지질의 조합을 포함하는 리포좀)에 있어서는 5 이하이다.
실시예 14에 추가로 입증되는 바와 같이, HeLa 세포의 최량의 혈청-저항성 형질감염은 CHOLGUA와 카르복실 지질 DOGS의 조합으로 달성할 수 있다. 특히 우수한 결과는 40% 미만의 콜레스테롤의 존재하 및 0.5 내지 1.5의 C/A를 갖는 혼합물에서 수득되었다. 만약 모든 다른 구성요소, 예컨대 DOGS 또는 콜레스테롤을 일정하게 하고, DC-CHOL에서와 같이 GUA 헤드 기를 디메틸아민으로 교체한다면, 리포좀은 마우스 혈청이 부재할 때는 여전히 활성이나, 마우스 혈청의 존재하에서는 더 이상 활성이 아니다. 이는 CHIM과 DMGS의 조합에서도 관찰될 수 있다.
콜레스테롤-기재 양이온성 지질과 포스페이트 지질 DOPA의 조합은, 이미노 지질 CHOLGUA에서 최량의 활성이 관찰되었으므로 이러한 연구 결과와 유사하다. 또한, CHOLGUA:DOPA 리포좀의 혈청-저항성 형질감염을 관찰할 수 있었으나, 혈청의 부재와 비교했을 때 상당한 저해가 있었다. DOPA와 CHIM 또는 DC-CHOL의 조합에서는 혈청의 존재하에서 어떠한 형질감염도 이뤄지지 않았다.
DACA-기재 지질
헤드 기 화학적 성질과 혈청 저항성 형질감염의 상관 관계를 추가로 연구하기 위해, 소수성 도메인으로서 통상적 디알킬-카르복실산 (DACA) 앵커을 사용하여 하기 지질을 합성하였다:
Figure pct00018
ADACA (아미노-DACA)
Figure pct00019
GUADACA (구아니디노-DACA)
Figure pct00020
PDACA (피리디일-DACA)
Figure pct00021
MPDACA (메틸피리디일-DACA)
Figure pct00022
BADACA {벤자민딘-DACA)
여기서, DACA 잔기는 실시예 10에 기재된 바와 같이 올레일요오다이드를 올레산에 첨가하여 수득했고, 생성되는 화합물은 다음과 같다:
Figure pct00023
양이온성 지질 중에서, GUADACA, MPDACA 또는 BADACA는 그의 극성 헤드 기에 하전된 이미노 잔기를 갖는다. PDACA의 헤드 기는 피리딘 잔기의 낮은 pK (계산된 pK는 5.9임)로 인하여 본질적으로 비하전되는 반면, 메틸화 변형체는 끊임없이 하전된 피리디늄 화합물 MPDACA의 형성을 초래한다. ADACA는 약 9의 충분히 높은 pK를 가지나, 이미노 구성요소는 갖지 않는다. 그러나, 아미노기가 아미드에 대해 □-위치에 있어 이민 형태의 메소화합물 (mesomeric) 안정화를 가능하게 하므로 상기 구성요소로부터 소량의 해당 에나민이 형성될 수 있다.
음이온성 지질 CHEMS, DMGS, DOGS 및 DOPA와의 조합은 콜레스테롤 기재 지질에 대해 상기한 바와 같이 제조했고, 0.33 내지 2 (또는 포스페이트 지질에 있어서는 0.75 내지 1)의 다양한 C/A 비율을 갖는 유사한 일련의 여러 리포좀을 제조하였다.
또한, 리포좀에 PLK-1 표적화 siRNA 또는 관계없는 서열을 적재하고, 형질감염 특성을 마우스 혈청의 존재 또는 부재하에서 HeLa 세포 상에서 시험하였다.
실시예 14 및 15에서 추가로 입증되는 바와 같이, HeLa 세포의 혈청-저항성 형질감염은 GUADACA 또는 MPDACA와 카르복실 지질 또는 포스페이트 지질의 조합에 의해 달성할 수 있다. 부가적으로, 이러한 지질은 또한 혈청의 부재하에서도 매우 효율적인 PLK-1 siRNA의 형질감염을 제공한다. 이는 최근 디메틸아미노 헤드 기를 갖는 리포좀 (문헌 [Akinc et al., Mol. Ther. (2010) electronic publication on May11th, ahead of print. DOI: 10.1038/mt.2010.85])에 있어서 기재된 바와 같이 혈청 구성요소로 리포좀의 활성화가 이루어지지 않음을 의미한다. 카르복실 지질과의 조합에 있어서 0.5 내지 1.5의 C/A 비율 및 포스페이트 지질에 있어서 0.75 또는 1의 C/A에서 또한 매우 높은 수준의 담체 활성이 관찰된다. 이러한 다수의 경우, 제형은 양쪽성 전하 특성을 갖는다.
피리디늄 화합물 MPDACA의 메틸화가 되지 않으면 관련 PDACA를 제공한다. 이민 관능기는 여전히 지니지만, 이러한 관능기는 더 이상 MPDACA에서와 같이 하전되지 않으며; PDACA는 또한 형질감염 목적으로 양이온성 지질로서 활성이 아니다. 또 다른 변형체에서, 헤드 기의 방향족 고리는 유지했으나, 하전된 이민은 고리-밖 아미니드기의 일부로서 제시되었다. 이러한 화합물은, 예를 들어 CHEMS 또는 DMGS와의 조합으로 형질감염을 위한 지질로서 활성인 것으로 확인되었으며, 이는 또한 혈청-저항성 형질감염을 초래하였다.
디알킬카르복실산 기재의 부가적 지질.
제US 6726894호 (구조 31)에 기재된 바와 같이 피리디늄 지질 SAINT-18을 사용하여 유사한 연구 결과를 확인하였다.
Figure pct00024
SAINT-18을 다양한 지질 음이온, 예컨대 CHEMS, DMGS 또는 DOGS와 조합하였다. 양이온성 및 음이온성 지질의 비율은 체계적인 방식으로 달리했고, 생성된 2원 혼합물에 추가로 20 또는 40 mol%의 콜레스테롤을 공급하였다. 개별적인 지질 혼합물을 리포좀으로 변형시키고, 작용군 및 대조군 siRNA의 캡슐화에 사용하였다. 정상 세포 배양 배지의 존재하에서 HeLa 세포 상에 시험했을 때, 실시예 8에서 입증되는 바와 같이 세포 생존력의 효율적이고 특이적인 저해가 시험 제형의 다수에서 관찰되었다. 그러나, C/A≥1를 갖는 리포좀은 어느 것도 마우스 혈청의 존재하에서 세포의 형질감염을 제공하지 않았다. 완전히 대조적으로, 양쪽성 제형의 대다수는 혈청에 의한 방해에 저항성이고, 세포에 효과적으로 형질감염되었다. 또한, 효과는 PLK-1 siRNA에 특이적이었고, 세포 증식을 비특이적으로 저해하기 위해서는 관계없는 siRNA (SCR)가 적재된 훨씬 높은 비율의 리포좀이 필요하였다. SAINT18과 DMGS의 조합을 사용했을 때 최량의 결과가 수득되었다. 따라서, SAINT-18 및 DMGS를 포함하고 추가로 C/A<1를 특징으로 하는 리포좀은 본 발명의 범주 안에 있다.
아미노산 기재 지질
본 발명의 교시내용을 추가로 예시하기 위하여, 양이온성 구아니도 지질 PONA (팔미토일-올레오일-노르-아르기닌, 구조 21)를 다양한 지질 음이온, 예컨대 CHEMS 또는 DMGS와 조합하였다. 양이온성 및 음이온성 지질의 비율을 체계적인 방식으로 달리했고, 생성된 2원 혼합물에 추가로 20 mol%의 콜레스테롤을 공급하였다. 개별적인 지질 혼합물을 리포좀으로 변형시키고, 작용군 및 대조군 siRNA의 캡슐화에 사용하였다. HeLa 세포 상에 시험했을 때, 실시예 5에서 입증되는 바와 같이 세포 생존력의 효율적이고 특이적인 저해가 시험 제형의 대부분에서 관찰되었다. 활성은 인간 또는 마우스 혈청의 존재에 의해 영향을 받지 않거나 매우 약간 영향을 받았다.
실시예 6에서, 음이온성 지질 CHEMS를 PONA의 유도체와 조합했는데, 여기서 하기 구조 (21) 및 (23)에 나타난 바와 같이 구아니도 잔기를 아미노기 (PON아민) 또는 4차화 암모늄기 (PON암모늄)으로 치환하였다.
Figure pct00025
다시 기재하자면, 음이온성 및 양이온성 지질 구성요소 사이의 비율을 체계적으로 달리했고, 20%의 콜레스테롤이 모든 지질 혼합물에 존재하였다. 재료를 리포좀으로 제형화시키고, 작용군 및 대조군 siRNA의 캡슐화에 사용하였다. HeLa 세포 상에 시험했을 때, 세포 생존력의 효율적이고 특이적인 저해가 몰 과량의 양이온성 지질을 포함하는 모든 제형에서 관찰되었다. 보다 높은 몰 량의 음이온성 지질 CHEMS를 포함하는 혼합물에 있어서, 최량의 활성이 PONA와의 조합에서 관찰되었으나, PON아민:CHEMS 조합은 일부 경우에서만 효과적이었다. PON암모늄:CHEMS 조합은 과량의 음이온성 지질을 사용했을 때 효과적이지 않았다.
또한, 과량의 음이온성 지질 CHEMS를 포함하는 혼합물 중에서, PONA:CHEMS 조합의 형질감염 활성은 인간 또는 마우스 혈청의 존재에 의해 단지 약간 영향을 받았으나, PON아민:CHEMS 조합의 활성은 마우스 혈청의 존재하에서 완전히 억제되었다. PON암모늄 제형은 혈청의 존재하에서 불활성으로 남아있었다.
PONA, PON아민 또는 PON암모늄과 포스페이트 지질 DOPA의 조합을 또한 실시예 15에 추가로 기재된 바와 같이 시험하였다. PONA 및 PON아민 둘 다 HeLa 세포의 혈청-저항성 형질감염을 초래했으나, PON암모늄은 그렇지 않았다.
조합된 데이터는 구아니도 지질과 음으로 하전된, 예를 들어 카르복실 또는 포스페이트 지질의 조합을 포함하는 지질 조합의 바람직한 흡수를 지지한다. 이는 하기 기재되는 역학적 고려사항과 연관된 것일 수 있다. 과량의 양이온성 지질 구성요소를 갖는 제형의 일정하고 높은 활성은 이러한 입자와 세포 표면 사이의 정전기적 상호작용에 기인한 것일 수 있으나, 이는 비특이적이다. 이러한 관점과 연관된 것은, 양이온성 제형의 활성이 음이온성 또는 양이온성 지질의 성질에 좌우되지 않았다는 사실이다.
추가적인 실험에서, 구아니도 지질 PONA를 CHEMS, DMGS 또는 DOGS와 조합하였다. 다시 기재하자면, 해당 2원 혼합물 중 음이온성 및 양이온성 지질 화합물 둘 다의 비율을 체계적으로 변화시키고 제형에 추가로 0, 20 또는 40 mol%의 콜레스테롤을 공급하였다. 상기한 바와 같이 시험했을 때, 제형의 대부분은 IC50이 6nM 미만으로 HeLa 세포의 세포 증식을 저해하는데 활성이었다 (실시예 7 참고). 그러나, 활성 및 불활성 siRNA의 효력에 요구되는 농도의 비교로, 제형 사이에 상당한 차이가 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 비교의 척도는 두 siRNA의 IC50 값 사이의 비율이며, 본원에서 SCR/PLK 비율로 표현된다. 선택된 제형만이 5보다 훨씬 높은 값에 도달하였다. 훨씬 더 바람직한 제형은 SCR/PLK≥10을 가졌다. 이러한 바람직한 제형 모두는 1 미만인 양이온성 및 음이온성 지질 구성요소 사이의 그의 비율을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 다른 저해성 혈청의 존재하에서 특정 세포로의 흡수에 있어서 특정 지질 헤드 기 화학적 성질이 결정적임을 확인한다. 바람직하게는, 카르복실기를 포함하는 음이온성 지질 및 하전된 이미노 잔기를 포함하는 양이온성 지질의 양쪽성 조합이 목적하는 특성을 초래한다. 대조적으로, 동일한 지질을 포함하는 양이온성 제형은 특정 헤드 기 화학적 성질에 좌우되지 않으며 세포에 의해 덜 허용된다.
지단백질 결합
리포좀의 형질감염과 경쟁하는 지단백질은 그의 밀도에 따라 여러 구조를 포함한다. 이러한 것은 킬로미크론 (chylomicron), VLDL, LDL, IDL 또는 HDL 입자로 공지되어 있다. 내인성 경로에서, 킬로미크론은 소장의 상피 라이닝에서 합성되고, ApoB 유전자 생성물의 짧은 변형체인 ApoB-48을 사용하여 어셈블리된다. 지단백질이 HDL 입자로 추가로 교환되면, ApoC-II 및 ApoE의 킬로미크론 입자로의 전달이 야기되는데, 먼저 입자로부터 지질의 방출에 필요한 효소인 지단백질 리파아제의 활성화를 매개한다. 소위 잔여물 (remnant)인 가수분해된 킬로미크론 형태는 그의 ApoE 부분의 인식을 통해 간에서 주로 흡수된다. VLDL 입자의 합성, 성숙, 사용 및 재순환은 매우 동일한 경로를 따르나, 간에서 출발하고 그의 구조 형성 단위로서 ApoB-100 단백질을 사용한다. 다시 기재하자면, ApoE는 VLDL-잔여물, 소위 IDL 입자의 최종 흡수 및 재순환을 매개한다 (또한 http://en.wikipedia.org/wiki/Lipoprotein 참고).
ApoE와 아포지단백질 A 및 C는 모두 11개의 아미노산이 반복되는 양친매성 직렬을 포함하므로 구조적 상동성을 공유한다. 결정학 데이터로 ApoA-I 및 ApoE 단편에 있어서 연장된 양친매성 나선형 구조의 존재가 확인되고, 또한 이러한 나선의 극성 면 상의 혼합된 전하 구성이 밝혀진다. 이러한 데이터는 RCSB 단백질 데이터 은행 (www.rcsb.org/pdb/home/home.do에서 입수가능함)에서 공적으로 입수가능하며, 1AV1.pdb를 기재하면 ApoA-I의 단백질 구조가 제공된다. 1lpe.pdb의 아미노산 129 내지 166은 ApoE의 LDL-수용체 결합 단편를 나타낸다. 그의 전체적 유사성과는 대조적으로, 세 가지 아포지단백질은 그의 아미노산 조성물을 분석하면 특정한 차이가 나타난다. ApoE에서는, 아르기닌이 직렬 반복에서 주를 이루는 양이온성 아미노산이다. 대조적으로, ApoA는 동일한 양의 리신 및 아르기닌을 갖는 한편, ApoC는 과량의 리신 잔기를 갖는다.
Figure pct00026
요약하면, 천연 지단백질의 극성 표면은 아포지단백질로 덮혀있고, 이 중 ApoE는 이러한 입자의 세포 흡수를 위한 통상적인 결합 모티프이다. ApoE의 물에 노출된 부분은 음이온성 및 양이온성 전하의 모자이크로 나타나며, 여기서 음이온성 전하는 아스파르트산 및 글루탐산 잔기의 자유 카르복실 말단으로부터 생성된다. 양이온성 전하는 아미노 및 구아니도기의 혼합물을 포함하며, 매우 소수의 이미다졸이 존재한다.
리포좀의 표면 상의 ApoE 결합 카세트의 인식 패턴을 모방하기 위하여, 여러 대안을 따를 수 있다. ApoE 펩티드 단편을 합성하고, 이러한 펩티드를 리포좀의 표면 상에 그래프팅하는 것이 가능하다. 이는 문헌 [Mims et al., J Biol. Chem. 269, 20539 (1994)]; 문헌 [Rensen et al., mol Pharmacol. 52, 445 (1997)]; 문헌 [Rensen et al., J. Lipid Res. 38, 1070 (1997)]; 문헌 [Sauer et al., Biochemistry 44, 2021 (2005)] 또는 문헌 [Versluis et al., J Pharmacol. Exp. Ther 289, 1 (1999)]에서 입증되었다. 그러나, 펩티드 합성 및 유도체화에 드는 높은 비용으로 인해 대안적 접근법이 요구된다.
여러 하전된 지질의, 잠재적으로 중성 지질을 추가로 포함하는 혼합물을 사용하는 요구되는 하전된 잔기의 직접적 제시는, 훨씬 더 간단한 구조를 제공하고, 값비싼 펩티드 생성 및 유도체화의 필요성을 제거할 것이다. 이러한 접근법의 중대한 난제는 지질 2중층 내에서의 하전된 기의 평면적 확산이고, 이제까지는 이러한 덜 구조화된 어셈블리의 친화성이 원래의 지단백질에 의해 제공되는 친화성과 효과적으로 경쟁할 것인지 명확하지 않았다. 또한, 반대로 하전된 지질의 헤드 기가 서로 염 가교를 형성할 수 있는 한편, 관능기들 사이의 오직 소수의 수소 결합이 지단백질, 예를 들어 ApoE의 결합 카세트에서 탐지되었다. 이는 이미노:포스페이트 지질 조합, 예컨대 GUADACA:DOPA 또는 MPDACA:DOPA의 활성을 설명할 수 있다. DOPA가 생리적 조건하에서 두 음전하를 제공하지만, 입체 장애가 한 DOPA와 두 GUADACA 지질 사이의 염의 형성을 불가능하게 한다. 그러므로, 이러한 막 내에서 DOPA와 GUADACA 사이의 음으로 하전된 염은 자유 GUADACA 분자와 공존해야 하고, 따라서 통상적 지질 어셈블리 내에서 분리된 음이온성 및 양이온성 요소의 자발적 존재를 촉진하다.
상기 이론은 본 발명의 발견사항을 제한하지 않으면서 언급되는 것이다. 이러한 특정 이론에 얽매이지 않길 바라면서, 하전된 이미노 지질과 음으로 하전된 카르복실 또는 포스페이트 지질의 조합이 ApoE로 덮힌 지단백질의 표면 특성을 모방하는 것으로 추측할 수 있다. 당연히 이러한 지식 없이 입자를 사용하고, 개발하고, 최적화할 수 있다. 그러나, 이론적 배경은 본 발명의 다양한 실시양태에서 기재된 벡터의 원리 또는 응용가능성의 안내를 이해하는데 유용할 수 있다.
예를 들어, 지단백질 수용체는 다양한 세포 유형 내에서 상이한 발현 프로파일을 가지며, 이러한 지식을 사용하여 본 발명의 리포좀을 위한 표적 세포의 수를 평가할 수 있다.
LDL-수용체는 종양 및 폐의 기관지상피 세포 상에 고도로 발현되어 있다 (문헌 [Su Al, Wiltshire T, Batalov S, et al. (2004). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (16): 6062-7] 참고, 또한 http://en.wikipedia.org/wiki/File:PBB_GE_LDLR_202068_s_at_tn.png에 발표되어 있음).
본 발명의 리포좀은 따라서 종양학 분야에서의 적용, 또한 특정 폐 세포의 형질감염에 특히 적합하다. 종양은 EPR-효과 (높은 투과 보유성 효과)를 통해 전신적 순환으로부터, 즉, 허술한 종양의 맥관 구조를 통해 접근가능하지만 기관지상피 세포는 또한 기도로부터 표적화할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 하전된 이미노 및 카르복실 또는 포스페이트 지질을 포함하는 리포좀으로부터의 에어로졸이 따라서, 폐 세포, 특히 기관지상피 세포의 표적화를 위해 흡입 복용 형태로 사용된다.
도 1 내지 6은 실시예 14에 기재된 스크리닝 실험의 결과를 나타낸다. 양이온성 지질의 성질은 보다 작은 도면으로 나타내어져 있고, 다른 설명 및 축은 모든 표시된 항목에 있어서 동일하며 아래 별도의 작은 도면에 주어진다. 이중 막대는 각각 20%의 콜레스테롤 (왼쪽 막대) 및 40%의 콜레스테롤 (오른쪽 막대)을 포함하는 리포좀을 나타낸다.
막대는 각각의 도면에 있어서 실험 조건, 즉 마우스 혈청의 존재 또는 부재하에서의 해당 리포좀/siRNA 조합에 대한 IC50 값을 나타낸다. 이러한 IC50 값은 세포 성장의 1/2-최대 저해에 필요한 농도를 나타내며 nM으로 주어진다. 시험 항목의 최대 농도는 마우스 혈청의 부재 또는 존재하에 각각 40nM 및 36nM이었다.
시험 항목의 순서는 다음과 같다:
도 1 음이온성 지질은 CHEMS - 마우스 혈청을 첨가하지 않음
도 2 음이온성 지질은 CHEMS + 마우스 혈청을 첨가함
도 3 음이온성 지질은 DMGS - 마우스 혈청을 첨가하지 않음
도 4 음이온성 지질은 DMGS + 마우스 혈청을 첨가함
도 5 음이온성 지질은 DOGS - 마우스 혈청을 첨가하지 않음
도 6 음이온성 지질은 DOGS + 마우스 혈청을 첨가함
실시예
본 발명의 교시내용은 하기 실시예를 고려했을 때 더 잘 이해될 수 있다. 그러나, 이러한 실시예는 본 발명의 교시내용을 어떠한 방식으로도 제한하지 않아야 한다.
실시예 1 - 리포좀 제조, 특징규명 및 siRNA 의 캡슐화
리포좀을 제WO 07/107304호에 개시된 바와 같은 방법으로 제조하였다. 보다 구체적으로, 지질을 이소프로판올 중에 용해하고, NaAc 20mM, 수크로스 300mM 중 pH 4.0 (pH는 HAc로 조정함)의 siRNA 용액을 최종 알콜 농도가 30%이도록 알콜성 지질 혼합물에 첨가하여 리포좀을 제조하였다. 형성된 리포좀의 현탁액을 두 배 부피의 Na3HPO4 136mM, NaCl 100mM (pH 9)를 사용하여 pH 7.5으로 이동시켜 최종 지질 농도 3mM 및 최종 이소프로판올 농도 10%로 만들었다.
동적 광 산란 (MALVERN 3000HSA)을 이용하여 리포좀을 그의 입자 크기로 특징규명하였다.
작용군 siRNA: 문헌 [Haupenthal et al., int. J. Cancer (2007), 121 :206-210]에서와 같은 21량체 블런트 (blunt) 말단 표적화 마우스 및 인간 PLK-1.
대조군 siRNA (SCR): 동일한 공급원으로부터의 21량체.
실시예 2 - 일반적 세포 배양 및 증식 어세이
HeLa 세포를 DSMZ (독일 미생물 및 세포배양 수집물)로부터 수득하고 DMEM (깁코-인비트로젠; Gibco-lnvitrogen) 중에서 유지하고, 10% FCS로 보충하였다. 세포를 2.5x104 세포/ml의 밀도로 플레이팅하고, 5% CO2하 37℃에서 100㎕ 배지 중에서 배양하였다. 16시간 후, siRNA를 함유하는 리포좀을 희석하고 10㎕를 세포에 첨가하여 최종 농도를 0.4 내지 100nM Plk1 또는 스크램블 (scrambled) siRNA로 만들고; 10㎕ 희석 완충제를 또한 미처리 세포에 첨가하고, 세포가 없는 웰에 첨가하였다. 세포 배양 디쉬를 5% CO2하 37℃에서 72시간 동안 인큐베이션하였다.
세포 증식/생존력을, 공급자의 지시에 따라 셀타이터-블루 세포 생존력 어세이 (CellTiter-Blue Cell Viability assay) (미국 소재의 프로메가 (Promega))를 사용하여 측정하였다.
실시예 3 - 혈청에 의한 형질감염 의 저해
DODAP:DMGS:콜레스테롤 (24:36:40 mol%)으로부터의 리포좀에 상기한 바와 같은 작용군 및 대조군 siRNA를 적재하고, 25㎕의 리포좀을 여러 종으로부터의 75㎕ 혈청 (시그마-알드리치; SIGMA-Aldrich)과 함께 30분 동안 인큐베이션하였다. 후속하여, 리포좀을 세포에 첨가하고, 72시간 동안 인큐베이션을 계속하고 세포 생존력을 상기한 바와 같이 측정하였다.
혈청 없이 인큐베이션한 경우, 작용군 siRNA의 투여는 세포 증식의 강한 저해를 초래하였다. 하기 표 7에서 입증되는 바와 같이, 이러한 과정은 혈청의 첨가에 의해 저해되었다.
Figure pct00027
실시예 4 - 저해는 지단백질 에 좌우됨
실시예 3에서와 같은 리포좀을 특정 보체 인자 또는 지단백질이 부재한 인간 혈청 (시그마-알드리치)과 함께 상기한 바와 같이 인큐베이션했고, HeLa 세포 상에서 RNAi 효과를 매개하는 그의 능력을 분석하였다.
하기 표 8에서 입증되는 바와 같이, 형질감염의 효력은 지단백질의 고갈을 통해 복원할 수 있었다. 보체 인자의 제거는 효과적이지 않았다.
Figure pct00028
실시예 5 - 구아니도 지질을 사용한 혈청 저항성 형질감염
일련의 리포좀을 PONA:음이온성 지질:콜레스테롤 (x:y:20 mol%)으로부터 제작하고, 실시예 1에서와 같이 작용군 및 대조군 siRNA를 적재하였다. 이러한 일련의 리포좀 중에서, 양이온성 구성요소 PONA와 음이온성 지질 CHEMS 또는 DMGS 사이의 비율을 표에 지시된 바와 같이 0.33 내지 2로 체계적으로 변화시켰다. 양이온성:음이온성 지질의 비율이 1 이상인 리포좀에 2 mol%의 DMPE-PEG2000 (니뽄 오일즈 앤 패츠; Nippon Oils and Fats)을 추가로 공급하여 입자의 응집을 방지하였다. 이러한 개질물은 표에서 "+"로 나타냈다. C/A<1을 갖는 입자와의 대조군 반응은 PEG 지질의 존재 또는 부재하에서의 형질감염 특성의 변화를 나타내지 않았다.
실시예 2에서와 같이 HeLa 세포를 성장시키고 유지시키고, 인간 또는 마우스 유래의 혈청 (시그마-알드리치)을 120분 동안 세포에 직접 첨가하였다. 후속하여, 리포좀을 50pM 내지 50nM의 농도로 세포에 첨가하고, 인큐베이션을 72시간 동안 계속하고, 세포 생존력을 상기한 바와 같이 측정하였다. 여기서 형질감염의 효력은, 세포 증식을 50% 저해하는데 필요한 농도인 IC50으로 표현하였다. 따라서 낮은 IC50 값은 고도로 효과적인 형질감염을 나타낸다.
표 9의 결과로부터, 혈청의 첨가가 실시예의 리포좀에 의해 매개되는 siRNA의 형질감염에 단지 약간의 영향을 준다는 것이 명백해진다. 적은 양의 음이온성 지질을 포함하는 PONA:CHEMS로부터의 리포좀에 있어서 여전히 일부 저해가 관찰되었다 (비율 0.33 내지 0.5, 마우스 혈청 이용시 특히 강한 저해).
Figure pct00029
실시예 6 - 구아니도 헤드 기의 임계성
양이온성 및 음이온성 지질 구성요소 사이의 비율을 체계적으로 변화시킨 일련의 리포좀을 실시예 5에서와 같이 제조하고 siRNA를 적재하였다. 양이온성 지질 구성요소는 PONA, PON아민 및 PON암모늄이었고, 음이온성 지질은 CHEMS이었고, 콜레스테롤 함량은 20 mol%로 고정하였다. 양이온성:음이온성 지질의 비율이 1 이상인 리포좀에 2 mol%의 DMPE-PEG2000 (니뽄 오일즈 앤 패츠)을 추가로 공급하여 입자의 응집을 방지하였다. 이러한 개질물은 표에서 "+"로 나타냈다.
실시예 2에서와 같이 HeLa 세포를 성장시키고 유지시키고, 인간 또는 마우스 유래의 혈청 (시그마-알드리치)을 120분 동안 세포에 직접 첨가하였다. 후속하여, 리포좀을 50pM 내지 50nM의 농도로 세포에 첨가하고, 인큐베이션을 72시간 동안 계속하고, 세포 생존력을 상기한 바와 같이 측정하였다. 형질감염의 효력은 실시예 5에서와 같이 IC50으로 표현하였다.
표 10의 데이터로부터, 혈청의 존재하에서 PONA 만이 HeLa 세포의 형질감염을 매개하며, PON아민은 매개하지 못하며 PON암모늄은 더욱 덜 매개한다는 것이 명백해진다. 이는, 형질감염을 더욱 공격적으로 저해하는 마우스 혈청의 경우 더욱 두드러진다. 과량의 양이온성 지질 구성요소는 어느 정도 혈청에 의해 매개되는 활성의 손실을 보충하나, 세포에 대한 이러한 리포좀의 비특이적 정전기적 흡착으로 인한 것일 수 있다.
Figure pct00030
실시예 7 - 리포좀 조성물의 최적화
양이온성 및 음이온성 지질 구성요소 사이의 비율을 체계적으로 변화시킨 일련의 리포좀을 실시예 5에서와 같이 제조하고 siRNA를 적재하였다. 양이온성 지질 구성요소는 PONA이었고, 음이온성 지질은 CHEMS, DMGS 또는 DOGS이었고, 콜레스테롤 함량은 0 내지 40 mol%로 변화시켰다. 양이온성:음이온성 지질의 비율이 1 이상인 리포좀 및 또한 일부의 다른 리포좀에 2 mol%의 DMPE-PEG2000 (니뽄 오일즈 앤 패츠)을 추가로 공급하여 입자의 응집을 방지하였다. 이러한 개질물은 표에서 "+"로 나타냈다.
실시예 2에서와 같이 HeLa 세포를 성장시키고 유지시키고, 리포좀을 6nM 내지 200nM의 농도로 세포에 첨가하고, 인큐베이션을 72시간 동안 계속하고, 세포 생존력을 상기한 바와 같이 측정하였다. 여기서 형질감염의 효력은 상기 실시예에서와 같이 IC50으로 표현하였다. 부가적으로, 불활성 siRNA (SCR)가 적재된 리포좀에 대해 IC50을 측정했고, IC50 (SCR)과 IC50 (PLK1) 사이의 비율을 계산하였다. 이러한 파라미터에서 높은 값은 일반적으로 PLK1 siRNA에 의한 세포 생존력의 매우 특이적 저해, 담체가 기여하는 낮은 비특이적 효과 및 낮은 수준의 세포독성을 나타낸다.
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
실시예 8 - 피리디늄 지질을 포함하는 리포좀
SAINT-18을 양이온성 지질로서 사용하고, 그의 메틸화 피리디늄 구조가 하전된 이미노 잔기를 제공하였다. CHEM, DMGS 및 DOGS를 카르복실 관능기를 제공하는 음이온성 지질로서 개별적으로 사용하였다. 양이온성 및 음이온성 지질 구성요소 사이의 비율을 체계적으로 변화시킨 일련의 리포좀을 실시예 5에서와 같이 제조하고 siRNA를 적재하였다. 지질 혼합물에 20 또는 40 mol%의 콜레스테롤을 추가로 공급하였다. 양이온성:음이온성 지질의 비율이 1 이상인 리포좀에 2 mol%의 DMPE-PEG2000 (니뽄 오일즈 앤 패츠)을 추가로 공급하여 입자의 응집을 방지하였다. 이러한 개질물은 표에서 "+"로 나타냈다.
실시예 2에서와 같이 HeLa 세포를 성장시키고 유지시키고, 리포좀을 50pM 내지 50nM의 농도로 세포에 첨가하고, 인큐베이션을 72시간 동안 계속하고, 세포 생존력을 상기한 바와 같이 측정하였다. 여기서 형질감염의 효력은 상기 실시예에서와 같이 IC50으로 표현하였다. 부가적으로, 불활성 siRNA (SCR)가 적재된 리포좀에 대해 IC50을 측정했고, IC50 (SCR)과 IC50 (PLK1) 사이의 비율을 계산하였다. 이러한 파라미터에서 높은 값은 일반적으로 PLK1 siRNA에 의한 세포 생존력의 매우 특이적 저해, 담체가 기여하는 낮은 비특이적 효과 및 낮은 수준의 세포독성을 나타낸다.
Figure pct00034
Figure pct00035
Figure pct00036
표 14 내지 16의 데이터로부터 명확히 나타나는 바와 같이, 다수의 양쪽성 리포좀은 심지어 마우스 혈청의 존재하에서도 세포의 형질감염을 촉진시켰다. SAINT-18과 디아실글리세롤 DMGS 및 DOGS의 조합을 포함하는 리포좀이 특히 유용한 한편, CHEMS와의 조합은 단지 C/A=0.67에서만 효과적이었다. PONA 조합을 사용했을 때는, 양쪽성 구조물이 고도로 특이적으로 세포에 형질감염 되는 한편, C/A>1을 갖는 조성물은 SCR/PLK1가 2 미만으로 나타내어지는 바와 같이 고도로 특이적인 형질감염을 제공하지 않았다.
본 발명의 다른 실시양태 및 용도는 본원에 개시된 본 발명의 상세한 설명 및 실시를 고려했을 때, 당업자가 명백히 알 것이다. 상세한 설명 및 실시예는, 하기 청구범위에서 지시되는 본 발명의 진정한 범주 및 주제에 대한 예시로서만 고려해야 한다.
실시예 9 - 제타 전위 측정
9.1 PONA : CHEMS : CHOL으로부 터 형성된 리포좀에 있어서의 제타 전위의 분석
x mol%의 PONA, y mol%의 CHEMS 및 20 mol%의 콜레스테롤을 포함하는 100㎕의 지질혼합물 (20mM 총 지질 농도, 용매: 이소프로판올)을, 10mM 아세트산 및 10mM 인산 pH4을 포함하는 900㎕의 완충제에 주입하였다. PONA 및 CHEMS에 대한 몰 백분율인 X 및 Y를 조정하여 표 17의 C/A 비율을 제공하였다. 현탁액을 즉시 보텍싱하고, 3mL의 pH 조절 완충제를 첨가하였다. 완충제는 50mM 아세트산 및 50mM 인산의 군으로부터 선택하고, NaOH 또는 50mM Na2HPO4/50mM 아세트산나트륨 pH9.4를 사용하여 pH 4, 5, 6.5 또는 7.5로 조정하였다. 혼합 pH를 기록하고, 제타사이저 (Zetasizer) HSA3000를 사용하여 모니터링한 생성된 지질 입자의 제타 전위와 함께 하기 표 17에 기재하였다.
Figure pct00037
명확히 말하면, 입자는 심지어 1.22, 즉 1 초과의 C/A를 갖는 혼합물에 대해서도 양쪽성 특질부를 나타낸다. 0.67, 0.82 또는 1의 C/A를 갖는 입자가 또한 pH7.4에서 제조됐고, 후속하여 보다 낮은 pH에 노출시켰다. 표 17에 나타내어지는 바와 같이 제타 전위에 명백한 변화는 없었다.
9.2 DOPA 가 음이온성 지질인 조합에 있어서의 제타 전위 측정
또한 지질 헤드 기의 이미노/포스페이트 조합인 GUADACA 및 DOPA의 2원 혼합물로부터 지질 입자를 제조하였다. 9.1에 기재된 것과 동일한 방식으로 입자를 제조하고, 여러 C/A 비율을 갖는 혼합물에 대해 표 18의 제타 전위를 기록하였다.
Figure pct00038
9.1에서 수득된 입자에서와 같이, 양쪽성 특질부를 갖는 C/A>1의 입자를 또한 수득하였다. 여전히 등전점은 예상한 대로 이동한다.
9.3 DOTAP : CHEMS : CHOL 에 있어서의 제타 전위 측정
비교를 위해, PONA를 DOTAP로 치환한 지질 혼합물로 동일한 측정을 수행하였다. 결과는 표 19에 나타내었다. PONA:CHEMS와는 대조적으로 DOTAP:CHEMS로부터의 양쪽성 입자는 오직 C/A<1에서만 확인되었다.
Figure pct00039
실시예 10 - CHOLGUA 의 합성
25g 콜레스테롤클로로포르미에이트 및 50 당량 (eq.) 에틸렌디아민을 디클로로메탄 중에 용해시키고, 6시간 동안 20℃에서 반응시켰다. 아미노에틸카르바모일-콜레스테롤을 크로마토그래피 및 결정화로 단리시켰다. 수율은 28.7g이고, 순도는 90%이었다.
CHOLGUA를 앞서 단리한 아미노에틸카르바모일-콜레스테롤으로부터 합성하였다. 30g의 물질을 디클로로메탄/에탄올 중 1.5 당량의 1H-피라졸-1-카르복스아미디늄 히드로클로라이드 및 4 당량의 N,N-디이소프로필에틸아민과 함께 16시간 동안 20℃에서 인큐베이션한 후, 생성물을 크로마토그래피로 단리하였다. 순도는 95%이고, 수율은 16.5g이었다.
실시예 11 - DACA , PDACA 및 MPDACA 의 합성
42.4g의 올레일 알콜, 2.5 당량의 디이소프로필아조디카르복실레이트, 2.5 당량의 트리페닐포스핀 및 5 당량의 LiI를 테트라히드로푸란 (THF) 중 20℃에서 24시간 동안 반응시켰다. 올레일요오다이드를 크로마토그래피로 단리했고, 순도는 90%이고, 수율은 13.4g이었다.
두 번째 단계에서, 10g 올레산을 2.2 당량의 리튬디이소프로필아미드와 THF 중 20℃에서 0.5시간 동안 혼합한 후, 1 당량의 올레일요오다이드를 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 20℃에서 인큐베이션하고, 크로마토그래피를 사용하여 반응 혼합물로부터 DACA를 정제하였다. 순도는 95%이고, 수율은 14.96g이었다.
PDACA의 합성을 위하여, 2g의 DACA, 1.2 당량의 4-피콜릴아민, 1.4 당량의 O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 테트라플루오로보레이트 및 4 당량의 N-메틸모르폴린을 THF 중 20℃에서 24시간 동안 혼합하였다. 반응 혼합물을 크로마토그래피를 포함하여 정제하였다. PDACA의 순도는 95%이고, 수율은 1.72g이었다.
MPDACA의 합성을 위하여, 2g의 PDACA를 THF 중에 2 당량의 디메틸술페이트와 함께 용해시키고, 혼합물을 16시간 동안 20℃에서 인큐베이션한 후, MPDACA를 크로마토그래피로 정제하였다. MPDACA의 순도는 95%이고, 수율은 1.71g이었다.
실시예 12 - GUADACA 의 합성
첫 번째 단계에서, 3.5g의 DACA 및 1.5 당량의 1,1'-카르보닐디이미다졸을 디클로로메탄 중에 용해시키고, 16시간 동안 20℃에서 인큐베이션 한 후, 30 당량의 에틸렌디아민을 첨가하였다. 반응 혼합물을 4시간 동안 20℃에서 인큐베이션한 후, 아미노에틸-DACA를 크로마토그래피를 포함하여 정제하였다. 순도는 90%이고, 수율은 3.2g이었다.
GUADACA를 아미노에틸-DACA로부터 합성하였는데, 이를 위해 3.2g의 아미노에틸-DACA, 2.5 당량의 1H-피라졸-1-카르복스아미딘 히드로클로라이드 및 12 당량의N,N-디이소프로필에틸아민을 3시간 동안 20℃에서 인큐베이션한 후, GUADACA를 단리하였다. 순도는 95%이고, 수율은 2.24g이었다.
실시예 13 - BADACA 의 합성
BADACA를 하기 절차에 따라 DACA로부터 합성하였다: 4,15g의 DACA, 1.2 당량의 p-아미노벤즈아미딘, 1.2 당량의 N,N'-디시클로헥실카르보디이미드 및 3 당량의 4-디메틸아미노피리딘을 건조 디메틸포름아미드 중에서 혼합하고, 16시간 동안 70℃에서 인큐베이션하였다. 크로마토그래피를 사용하여 BADACA를 반응으로부터 단리하였다. 순도는 95%이고, 수율은 1.62g이었다.
실시예 14 - 카르복실 지질과의 조합에서 DAC A 또는 콜레스테롤 기재 양이온성 지질의 혈청 저항성 형질감염
양이온성 및 음이온성 지질 구성요소 사이의 비율을 체계적으로 변화시킨 일련의 리포좀을 실시예 5에서와 같이 제조하고 siRNA를 적재하였다. 양이온성 지질 구성요소는 CHOLGUA, CHIM, DC-CHOL, TC-CHOL, GUADACA, MPDACA, BADACA 및 PDACA이었다. 음이온성 지질은 CHEMS, DMGS 또는 DOGS이었고, 콜레스테롤 함량은 20 또는 40 mol%이었고, 모든 지질 혼합물은 데이터 표에서 확인된다. 양이온성:음이온성 지질의 비율이 1 이상인 리포좀에 1.5 mol%의 DMPE-PEG2000 (니뽄 오일즈 앤 패츠)을 추가로 공급하였다.
실시예 2에서와 같이 HeLa 세포를 성장시키고 유지시키고, 마우스 혈청 (시그마-알드리치)을 120분 동안 세포에 직접 첨가하였다. 후속하여, 리포좀을 세포에 첨가하고, 인큐베이션을 72시간 동안 계속하고, 세포 생존력을 상기한 바와 같이 측정하였다. 리포좀의 최고 농도는 마우스 혈청의 부재 또는 존재하에서의 실험에 있어서 각각 40nM 및 36nM이었다. 형질감염의 효력은 실시예 5에서와 같이 IC50 (nM siRNA로)으로 표현하였다. 이러한 스크리닝 실험으로부터의 모든 결과는 도 1 내지 6에 나타내었다.
형질감염되는 혼합물 중 다수는, 매우 낮은 IC50 값으로 지시되는 바와 같이 siRNA의 HeLa 세포로의 매우 강력한 형질감염을 초래하였다. 심지어 마우스 혈청의 존재하에서도, 이미노 지질, 예컨대 CHOLGUA를 포함하는 지질의 조합은, MPDACA, GUADACA 또는 PONA를 포함하는 지질의 조합은 더욱, 강력한 형질감염체로 유지되었다.
실시예 15 - 포스페이트 지질과의 조합에서 여러 양이온성 지질의 혈청 저항성 형질감염
0.75 또는 1의 C/A 비율을 갖는 일련의 리포좀을 실시예 5에서와 같이 제조하고 siRNA를 적재하였다. 양이온성 지질 구성요소는 CHOLGUA, CHIM, DC-CHOL, GUADACA, MPDACA, BADACA, PONA, DOTAP 또는 DODAP이었다. 음이온성 지질은 DOPA이었고, 콜레스테롤 함량은 40 mol%이었고, 모든 지질 혼합물은 표 20에서 확인된다. 리포좀에 1.5 mol%의 DMPE-PEG2000 (니뽄 오일즈 앤 패츠)을 추가로 공급하였다.
실시예 2에서와 같이 HeLa 세포를 성장시키고 유지시키고, 마우스 혈청 (시그마-알드리치)을 120분 동안 세포에 직접 첨가하였다. 후속하여, 리포좀을 세포에 첨가하고, 인큐베이션을 72시간 동안 계속하고, 세포 생존력을 상기한 바와 같이 측정하였다. 여기서 형질감염의 효력은 실시예 5에서와 같이 IC50 (nM siRNA로)으로 표현하였다.
형질감염되는 혼합물 중 다수는, 매우 낮은 IC50 값으로 지시되는 바와 같이 siRNA의 HeLa 세포로의 매우 강력한 형질감염을 초래하였다. 심지어 마우스 혈청의 존재하에서도, 이미노 지질, 예컨대 CHOLGUA를 포함하는 지질의 조합은, MPDACA, GUADACA 또는 PONA를 포함하는 지질의 조합은 더욱, 강력한 형질감염체로 유지되었다.
Figure pct00040
실시예 16 - 음으로 하전된 지질의 부재하에서는 혈청 저항성 형질감염 이 잘 이루어지지 않음
양이온성 지질 및 중성 지질로서 콜레스테롤으로부터 일련의 리포좀을 제조하였다. 이러한 제조에서 음이온성 지질은 사용하지 않았다. 양이온성 지질 구성요소는 CHOLGUA, CHIM, DC-CHOL, ADACA, GUADACA, MPDACA, BADACA, PONA, DOTAP 및 DODAP이었고, 리포좀은 실시예 5에 기재된 절차에 따라 제조하였다.
콜레스테롤 함량은 40 mol%이었고, 리포좀에 1.5 mol%의 DMPE-PEG2000 (니뽄 오일즈 앤 패츠)을 추가로 공급하여 siRNA의 존재하에서 응집물의 형성을 방지하였다.
실시예 2에서와 같이 HeLa 세포를 성장시키고 유지시키고, 마우스 혈청 (시그마-알드리치)을 120분 동안 세포에 직접 첨가하였다. 후속하여, 리포좀을 세포에 첨가하고, 인큐베이션을 72시간 동안 계속하고, 세포 생존력을 상기한 바와 같이 측정하였다. 여기서 형질감염의 효력은 실시예 5에서와 같이 IC50 (nM siRNA로)으로 표현하였다.
수득된 결과를 하기 표 21에 나타내었다. 모든 경우에서, 형질감염 효력은 음이온성 지질을 추가로 포함하는 혼합물보다 상당히 낮았다. 마우스 혈청의 존재하에서 활성이 검출되지 않은 GUADACA 또는 PONA의 경우는 제외한다.
Figure pct00041

Claims (21)

  1. 음이온성 및 양이온성 양친매성물질을 포함하며, 상기 양이온성 양친매성물질의 적어도 일부가 생리적 조건하에서 실질적으로 하전되는 이미노 지질이며, 음이온성 양친매성물질이 카르복실 또는 포스페이트 지질이며, 추가로 양이온성 및 음이온성 양친매성물질 사이의 전하비가 1.5 이하인 지질 어셈블리.
  2. 제1항에 있어서, 음이온성 및 양이온성 양친매성물질을 포함하며, 상기 양이온성 양친매성물질의 적어도 일부가 생리적 조건하에서 실질적으로 하전되는 이미노 지질이며, 추가로 음이온성 양친매성물질의 적어도 일부가 카르복실 지질이며, 양이온성 및 음이온성 양친매성물질 사이의 비율이 1.5 이하인 지질 어셈블리.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 지질의 조합을 포함하며, 상기 조합의 양이온성 지질이 구아니도 잔기를 포함하고, 상기 조합의 음이온성 지질이 카르복실기를 포함하고, 구아니도 잔기와 카르복실기 사이의 비율이 1.5 이하인 것을 추가로 특징으로 하는 지질 어셈블리.
  4. 제1항에 있어서, 음이온성 및 양이온성 양친매성물질을 포함하며, 상기 양이온성 양친매성물질의 적어도 일부가 생리적 조건하에서 실질적으로 하전되는 이미노 지질이며, 추가로 음이온성 양친매성물질의 적어도 일부가 포스페이트 지질이며, 추가로 양이온성 및 음이온성 양친매성물질 사이의 전하비가 1.5 이하인 지질 어셈블리.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 양친매성물질의 하전된 이미노기의 pK가 7.5 초과이고, 이민, 아미딘, 피리딘, 2-아미노피리딘, 헤테로시클릭 질소 염기, 구아니도 잔기, 이소우레아 또는 티오이소우레아로부터 선택되는 것을 추가로 특징으로 하는 지질 어셈블리.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 양친매성물질이 구조 I1 내지 I113, 구조 A1 내지 A21 또는 구조 L1 내지 L17을 포함하는 군으로부터 선택되고, 상기 군의 구성원이 7.5 초과의 pK에 따라 추가로 선택되는 것인 지질 어셈블리.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 지질이 PONA, CHOLGUA, GUADACA, MPDACA 또는 SAINT-18의 군으로부터 선택되는 것을 추가로 특징으로 하는 지질 어셈블리.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 음이온성 지질이 CHEMS, DMGS, DOGS, DOPA 또는 POPA의 군으로부터 선택되는 것을 추가로 특징으로 하는 지질 어셈블리.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 양이온성 및 음이온성 지질의 전하비가 0.5 내지 1.5인 것을 추가로 특징으로 하는 지질 어셈블리.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 리포좀인 것을 추가로 특징으로 하는 지질 어셈블리.
  11. 제10항에 있어서, 콜레스테롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고미엘린 또는 그의 혼합물로부터 선택되는 중성 또는 쯔비터이온성 지질을 추가로 포함하는 리포좀.
  12. 제11항에 있어서, 중성 지질이 콜레스테롤이고, 지질 혼합물 중 콜레스테롤의 몰 분율이 10 내지 50 mol%인 것을 추가로 특징으로 하는 리포좀.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, PEG 지질을 추가로 포함하는 리포좀.
  14. 제13항에 있어서, PEG 지질이 최외곽 막 리플렛 (leaflet)에 위치하는 것을 추가로 특징으로 하는 리포좀.
  15. 제10항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 제약 성분을 추가로 포함하는 리포좀.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제약 성분이 올리고뉴클레오티드인 리포좀.
  17. 제16항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 디코이 올리고뉴클레오티드, 및 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA, 전사 영향 작용제, 리보자임, DNA자임 또는 압타머 (aptamer)인 리포좀.
  18. 제17항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 개질된 뉴클레오시드, 예컨대 DNA, RNA, LNA, PNA, 2'0Me RNA, 2' MOE RNA, 2'F RNA를 그의 포스포디에스테르 또는 포스포티오에이트 형태로 포함하는 것인 리포좀.
  19. 제14항에 있어서, (i) 활성 성분의 존재하에서 리포좀의 형성 및 봉입 단계 및 (ii) 상기 단계 (i) 이후 PEG-지질의 별도 첨가 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 리포좀.
  20. 세포의 생체내, 시험관내 또는 생체외 형질감염을 위한 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 리포좀의 용도.
  21. 폐 세포의 형질감염을 위한 제10항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 리포좀을 포함하는 에어로졸의 용도.
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