KR20120052979A - 금속성 나노입자, 이의 제조 및 용도 - Google Patents

Abstract

본 출원은 표적세포, 조직 또는 기관을 방해, 변경 또는 파괴하기 위하여 건강 분야, 특히 인간의 건강 분야에 사용될 수 있는 활성가능 나노입자에 관한 것이다. 특히, 본 출원은 이온화 방사선에 노출될 때 유의적으로 효율적인 치료 효과를 나타낼 수 있는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명의 나노입자는 가장 큰 크기로서 약 80 내지 105 nm에 포함되는 크기를 갖는 금속성 나노입자이며, 상기 금속은 바람직하게는 원자번호(Z)가 25 이상이다. 또한, 본 발명은 전술한 나노입자 군을 포함하는 약학 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

금속성 나노입자, 이의 제조 및 용도{METALLIC NANOPARTICLES, PREPARATION AND USES THEREOF}

본 출원은 표적세포, 조직 또는 기관을 방해, 변경 또는 파괴하기 위하여 건강 분야, 특히 인간의 건강 분야에서 사용될 수 있는 활성가능 나노입자에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 출원은 X선, γ선, 방사성 동위원소 및/또는 전자빔과 같은 이온화 방사선에 노출될 때 놀랍게도 효율적인 치료 효과를 나타낼 수 있는 나노입자에 관한 것이다. 본 발명의 나노입자는 가장 큰 크기로서 약 80 내지 약 105 nm에 포함되는 크기를 갖는 금속성 나노입자이며, 상기 금속은 바람직하게는 원자번호(Z)가 25 이상이다. 또한, 본 발명은 상기 나노입자 군(population)을 포함하는 약학 조성물 및 그의 용도에 관한 것이다.

다양한 형태의 방사선, 예컨대 X선, 감마선, UV선, 레이저 광, 마이크로파, 전자빔 뿐만 아니라 예를 들어 중성자 및 양자의 입자빔이 암과 관련된 문제를 치료하기 위해 사용되어 왔다. 상기 방사선의 일부는 방사선 민감성 분자와 조합되어 상기 적용을 위해 사용되고 있다. 실제로 전자기 방사선 및 이온화 방사선은 특히 세포의 DNA 분자를 파괴하는 것이 가능하며, 이에 따라 상기 세포를 사멸시키거나 및/또는 상기 세포가 성장하고 분열하는 것을 방지할 수 있다. 이러한 효과는 특히 이온화 후에 방출되는 전자 및/또는 고에너지 광자에 의해 생성되는 간접적인 손상에 주로 기인하며, 이는 자유라디칼 생성의 원인이 될 것이다.

"이온화 방사선"이라는 용어는 원자 또는 분자를 이온화시킬 수 있는 고에너지성 입자 또는 파(wave)를 나타낸다. 이온화 능력은 개개의 입자 또는 파의 에너지에 의존하는 것이고, 그들의 수에 의존하는 것은 아니다. 만일 개개의 입자 또는 파가 충분하게 에너지를 갖지 않는다면, 입자 또는 파의 대량 흐름은 가장 흔한 상황에서 이온화를 발생시키지 않을 것이다. 통상적인 이온화 방사선은 에너지가 2 KeV보다 더 높은 방사선이다.

금 나노입자(GNP)에 의한 방사선민감(radiosensitization)은 방사선치료를 개선하기 위한 유망한 접근법으로서 인식되었다.

US 6,955,639(Hainfeld 등)에는 금속, 특히 금, 나노입자를 사용하여 X선 방사선 효과를 증가시키는 방법이 기재되어 있으며, 상기 금속 코어의 크기(직경)는 생체분배 이유 때문에 바람직하게는 0.8 내지 20 nm, 더 바람직하게는 0.8 내지 3 nm의 범위이다.

Herold 등의 문헌 [Int. J. Rad. Biol. 76 (2000) 1357]에는, 작은 크기(~ 2 nm)의 금 나노입자가 종양 덩어리(종양 mass)를 통해 더 균질적으로 확산되어야 한다고 개시되어 있다.

Chithrani 등의 문헌 [Nano Lett. 6 (2006) 662; Nano Lett. 7 (2007) 1542]에는, Hela 세포에서 50-nm 직경 GNP의 우선적인 침투 및 축적에 대해 개시되어 있다.

Chang 등의 문헌 [Cancer Sci. 99 (2008) 1479]에는, 흑색종 종양을 갖는 마우스 모델에서, 6 MeV 전자빔으로부터 25 Gy의 단일 투여량과 함께 13-nm 직경 GNP가 대조군에서보다 종양 부피의 더 현저한 감소를 야기하였다는 점이 나타나 있다.

Zhang 등의 문헌 [Biomed Microdevices (2009), 11:925-933]에는, 금 나노입자가 유효량의 방사선을 증대시킬 수 있다는 점을 확인하는 인실리코 데이터(몬테카를로 시뮬레이션 모델)가 제공되어 있지만, 상기 유효량 증대에 대한 나노입자 크기의 영향에 대해서는 연구되어 있지 않다. 상기 문헌은 방사선요법의 단락에서 Hainfeld의 1.9 nm 직경-나노입자에 대해 언급하고 있지만(제930페이지의 우측 칼럼 참조), 생물학 시스템, 특히 인간에서 유효량 증대 인자(dose enhancement factor)를 정확하게 정량화하는데 도움이 될 수 있는 결과에 대해서는 어떠한 것도 제공하고 있지 않다(Montenegro et al., J. Phys. Chem. A. 2009, 113, 12364-12369: "Monte Carlo Simulations and Atomic Calculations for Auger Processes in Biomedical Nanotheranostics" 참조).

본 발명자들은 놀랍게도, 선행기술에 개시되어 있는 나노입자에 비해, 이온화 방사선에 노출될 때 시험관내, 생체외 및 생체내에서 표적세포의 섭동(perturbation), 변형 또는 파괴를 더 효과적으로 달성할 수 있는 강력한 나노입자를 제공하며, 이는 본원에서 입증되었다.

유리하게는 본 발명의 나노입자는 가장 큰 크기로서 약 80 nm 내지 약 105 nm에 포함되는 크기를 갖는 금속성 나노입자이며, 상기 나노입자는 바람직하게는 원자번호(Z)가 25 이상인 금속으로 구성된 것이다. 본원에 기재되어 있는 나노입자의 유리한 성질들은, 본 발명과 반대로 유효량 증대 인자를 증가시키기 위한 작은 크기의 금 나노입자의 사용을 제안하는 선행기술로부터 추론될 수 없는 것이다[특히, 금 나노입자 농도의 영향을 밝혀낸 Brun 등(Colloids and Surfaces B: interfaces, 72 (2009) 128-134: "Parameters governing gold nanoparticle X-ray radiosensitization") 참조]. Brun 등의 도 4(B)에 도시된 결과들은 특히 주어진 금의 농도(인자 3에 따라 금 나노입자 반경이 변화하는 금의 함량)에 대해 금 나노입자의 크기가 감소될 때 유효량 증대 인자가 증가한다는 것을 나타낸다.

주어진 금속의 농도와 주어진 이온화 방사선 흡수력에 대해, 전형적인 금속성 나노입자의 크기가 바람직하게는 약 80 nm 내지 약 105 nm인 본원의 금속성 나노입자는, 더 작은 크기의 나노입자와 비교할 때, 특히 크기가 60 nm 이하인 나노입자와 비교할 때, 증가된 치료 효과(표적세포 손상을 발생시키는 능력)의 원인이 된다.

주어진 금속의 농도와 세포 수준에서 등가의 X선 감쇠에 대해, 본원의 금속성 나노입자는 세포를 사멸시키거나 및/또는 세포의 분할을 방지하는 능력을 더 강하게 나타낸다.

본원의 나노입자에 의해 나타나는 또다른 특징은 이온화 방사선에 노출될 때 표적세포와 접촉시 치료 효과를 발생시키는 능력이다. 즉, 방사선조사 하에서 관찰되는 치료 효능은 나노입자 세포 흡수를 필요로 하지 않는다. 이러한 성질은 본원에서 최초로 개시되는 것이다.

실제로, 선행기술에서 지금까지는 나노입자가 방사선조사 하에서 효과적인 세포 사멸 손상을 발생시킬 수 있기 위해서는 표적세포 흡수가 필요한 것으로 여겨졌다(예를 들어, Kong et al.(Small 4 (2008) 1537) 참조).

따라서, 본 발명은 의료적용의 측면에서 주로 생체적합성, 생체분포 및 세포 흡수의 이유 때문에 당업자로 하여금 직경이 약 1 내지 20 nm에서 최대 60 nm인 나노입자, 특히 관심이 오래 지속되어온 50-nm 나노입자를 사용하도록 하는 모든 선행기술들의 편견에 반대한다(예를 들어, Chithrani et al.(2006) 및 Chang et al.(2008) 참조).

또한, 본 발명의 나노입자는 유리하게는 대상체에 투여되는 금속의 양을 감소시킬 뿐만 아니라, 완전한 방사선요법 치료 프로토콜의 측면에서 나노입자 투여 단계의 수를 최소로 감소시킬 수 있도록 하며, 이에 따라 대상체에 의한 용인성이 증가된다.

본 발명의 요약

본 발명자들은, 바람직하게는 원자번호(Z)가 25 이상인 금속으로 구성되고 입자의 가장 큰 크기가 약 80 nm 내지 약 105 nm에 포함되는 나노입자를 사용할 때, 놀랍도록 증가된 효율로 신체의 표면에서 또는 내부에서, 표적세포, 조직 또는 기관, 특히 비정상 세포 또는 조직, 본원에서 정의된 양성 세포 또는 조직, 또는 병든 세포 또는 조직, 예컨대 전-악성 또는 악성 세포(암종 세포) 또는 조직(종양)을 방해, 변형 또는 파괴할 수 있다는 점을 발견하였다.

본 발명의 이점은, 그 자체로 유해하지 않지만, 적합한 조건하에서 동물, 바람직하게는 포유류, 더 바람직하게는 인간에게서 표적세포를 기능적으로 방해, 변형 또는 파괴시키기 위해 안전하게 이용될 수 있는, 나노입자를 제공하는 것이다. 나노입자의 원하는 치료 효과는 실제로 그의 이온화에 엄격하게 의존하며, 상기 이온화는 질적 및 양적 측면에서 그 자체로 유리하게 제어되고 당업자에 의해 표적화된, 즉 국부적인 방식으로 사용되는 이온화 방사선 원에 의해 발생된다.

본 발명은 실제로 상기 세포가 특히 X선, 감마선(γ선), 방사성 동위원소, 이온빔 및/또는 전자빔과 같은 이온화 방사선에 노출될 때 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 세포 방해, 변형 또는 파괴를 유도할 수 있는 나노입자에 대해 개시한다.

본원의 나노입자는 입사 방사선과 직접적으로 상호작용할 수 있으며, 나노입자가 표적세포에 의해 흡수될 필요 없이 놀라운 효과적인 치료 효과를 발생시킬 수 있다.

본 발명에 따른 나노입자는 하기에서 추가적으로 기재되는 바와 같이 생리적 유체에서 바람직하게는 나노입자의 안정성을 증가시키는 생체적합성 코팅으로 도포될 수 있다.

적합하고 바람직한 경우에는, 본 발명의 나노입자는 예를 들어 생물학적 조직 또는 세포의 특이적 표적화를 가능하게 하는 표면 성분을 사용하는 표적화 방식으로 이용될 수 있다. 그러나, 이는 표적으로 하는 분자를 표적세포 또는 조직으로 농축시키는 것을 요구하지 않는다.

증대된 침투 및 보유("EPR: Enhanced Permeation and Retention") 효과는 실제로 나노입자를 정맥내 경로(투여의 가능한 경로 중 하나임)로 주사하고나서 주어진 시간 이후에 종양 덩어리로 수동적으로 축적되는 원인이 된다. 실제로, 종양 혈관이 정상 모세혈관과 매우 구별된다는 점, 및 그의 혈관의 "누수(leakiness)"가 정상 조직에서 일반적이지 않은 나노입자의 선택적인 분출을 고무시킨다는 점이 관찰되었다. 효과적인 종양 림프의 배수의 결핍은 침투 나노입자의 제거를 방지하고 그의 축적을 촉진시킨다. 따라서, 본 발명의 나노입자는 정맥내 투여 이후에 원발성 종양 뿐만 아니라 전이성 종양을 성공적으로 표적화할 수 있다.

또한, 유리하게는 본 발명의 나노입자는 종양내 또는 동맥내 경로를 통해 투여될 수 있다.

따라서, 본 발명의 목적은 본 발명의 나노입자 또는 상기 나노입자의 군을 사용하여 표적세포, 조직 또는 기관을 변형 또는 파괴시키는 것이다.

본원에 개시된 특정 구현예는 표적 포유류 세포가 이온화 방사선에 노출될 때 상기 세포를 방해, 변형 또는 파괴하기 위한 약학 조성물의 제조에 있어서 금속성 나노입자 군의 용도 및 그에 상응하는 치료방법에 관한 것이며, 여기서 상기 나노입자는 원자번호(Z)가 25 이상인 금속으로 구성되고, 상기 군의 나노입자의 평균적인 가장 큰 크기는 약 80 nm 내지 약 105 nm이다.

암 치료에 사용하기 위한 본 발명의 생성물, 특히 나노입자 및 금속성 나노입자 군이 특히 본원에 개시되어 있다.

또다른 구현예는 포유류의 표적세포가 이온화 방사선에 노출될 때 상기 세포를 방해, 변형 또는 파괴하기 위한 약학 조성물, 특히 본원의 개시내용으로부터 명백해지는 약학 조성물에 기초하는 것이며, 상기 약학 조성물은 본원에서 정의되는 금속성 나노입자 군 및 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 포함하며, 여기서 상기 나노입자는 원자번호(Z)가 25 이상인 금속으로 구성되고, 상기 군의 나노입자의 평균적인 가장 큰 크기는 약 80 내지 105 nm이다.

또다른 구현예는 동물이 방사선, 특히 본원에 기재된 것과 같은 이온화 방사선에 노출될 때, 상기 동물의 암을 치료 또는 예방하거나 암의 증상을 완화시키기 위한, 본 발명에 따른 나노입자, 금속성 나노입자 군 또는 조성물의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 개시내용에는 특히 금속성 나노입자, 금속성 나노입자의 군 또는 본 발명에 따른 상기 나노입자의 군을 포함하는 조성물을 대상체에 투여하고, 상기 대상체를 방사선, 특히 이온화 방사선에 노출시킴으로써, 대상체의 암을 치료 또는 예방하거나 암의 증상을 완화시키기 위한 방법이 포함되며, 여기서 상기 대상체는 동물, 특히 포유류, 바람직하게는 인간이다.

또다른 측면에서, 본 발명의 개시내용은 임의의 하나 이상의 본원의 생성물, 즉 나노입자 및 조성물과 함께 상기 생성물(들)을 사용하기 위한 지시를 제공하는 표시 안내문(labeling notice)을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명의 상세한 설명

본 발명자들은 놀랍게도, 금속, 바람직하게는 원자번호(Z)가 25 이상인 금속으로 구성되고 입자의 가장 큰 크기가 약 80 내지 약 105 nm에 포함되는 나노입자가 동물의 비정상 세포, 조직 또는 기관을 방해, 변형 또는 파괴하기 위한 국부 조사(local irradiation)의 치료 효과를 실질적으로 증대시킬 수 있다는 점을 발견하였다.

방사선치료 효능의 강한 증대는 본 발명에 따른 금속성 나노입자를 사용함으로써 처음으로 관찰될 수 있다(예를 들어, 도 4a, 4b, 5a 및 5b 참조).

본 발명에서, "나노입자"는 나노미터 범위의 크기를 갖는 생성물, 특히 합성물을 나타낸다.

본 발명의 맥락에서, 크기라는 용어는 나노입자의 금속 코어의 가장 큰 치수를 나타낸다. 통상적으로, 가장 큰 치수는 둥근 형태 또는 구형의 나노입자의 직경, 또는 타원형 또는 계란형의 나노입자의 가장 긴 길이이다.

나노입자의 형태는 예를 들어 둥근 형태, 평평한 형태, 신장된 형태, 구형, 타원형 또는 계란형 등일 수 있다. 그 형태는 제조방법에 의해 결정되거나 조절될 수 있고 원하는 적용 분야에 따라 당업자에 의해 조정될 수 있다.

입자의 형태는 입자의 "생체적합성(biocompatibility)"에 영향을 미칠 수 있으며, 매우 균일한 형태를 갖는 입자가 바람직하다. 따라서, 약동학적 이유로, 본질적으로 구형, 둥근 형태 또는 타원형의 나노입자가 바람직하다. 구형 또는 둥근 형태가 특히 바람직하다.

유리하게는, 본 발명에 따른 나노입자의 가장 큰 크기는 본원의 실시예에서 입증된 바와 같이 약 70 nm 내지 약 130 nm, 유리하게는 약 75 또는 80 nm 내지 약 105 nm, 바람직하게는 약 75 nm 내지 약 95 nm 또는 약 80 nm 내지 약 90 또는 95 nm에 포함된다.

본 발명자들은 놀랍게도, 본 발명에서 표적세포, 예를 들어 종양 세포를 방해, 파괴 또는 변형하기 위해 상기 세포에 나노입자가 침투될 필요가 없다는 점을 처음으로 입증하였다. 실제로, 나노입자가 표적세포에 의해 혼입되는 조건 또는 나노입자가 표적세포와 접촉, 특히 외부 접촉하는 조건 모두에서 표적세포에 대한 등가의 효과가 본 발명자들에 의해 관찰되었다.

본 발명자들은, 이온화 방사선에 표적 포유류 세포가 노출될 때 상기 세포를 섭동, 방해, 변형 또는 파괴하기 위한 약학 조성물의 제조에 있어서 본 발명의 금속성 나노입자 또는 상기 금속성 나노입자의 군의 용도에 대해 개시한다. 상기 군에서, 나노입자는 바람직하게는 원자번호(Z)가 25 이상인 금속으로 이루어진다. 유리하게는, 상기 군의 나노입자의 가장 큰 크기의 평균은 약 70 nm 내지 약 130 nm, 유리하게는 약 75 또는 80 nm 내지 약 105 nm, 바람직하게는 약 75 nm 내지 약 95 nm 또는 약 80 nm 내지 약 90 또는 95 nm이다.

전술한 바와 같이 선행기술의 방법에 따라 수득된 나노입자에 의해 구성되는 나노입자의 전형적인 군에 있어서(이에 대해 하기에서 추가로 기재됨), 상기 군의 나노입자의 가장 큰 크기의 평균은 약 80 nm 내지 약 105 nm이며, 상기 군의 나노입자의 가장 큰 크기는 약 60 nm 내지 155 nm, 일반적으로 60, 65, 70, 75 또는 80 내지 105, 110, 130, 140, 150 또는 155 nm에 포함된다.

즉, 상기 군의 95%(2s)는 가장 큰 크기가 약 60 nm 내지 약 155 nm인 나노입자로 구성되거나, 또는 상기 군의 68%(1s)는 가장 큰 크기가 약 70 nm 내지 약 130 nm인 나노입자로 구성된다.

본 발명에 따른 금속성 나노입자는 금속으로 구성되며, 상기 금속은 바람직하게는 원자번호가 25 이상, 유리하게는 40 또는 50 이상, 더 바람직하게는 60 또는 70 이상이다.

상기 금속은 금(Au - Z = 79), 은(Ag - Z = 47), 백금(Pt - Z = 78), 팔라듐(Pd - Z = 46), 주석(Sn - Z = 50), 탄탈륨(Ta - Z = 73), 이테르븀(Yb - Z = 70), 지르코늄(Zr - Z = 40), 하프늄(Hf - Z = 72), 테르븀(Tb - Z = 65), 툴륨(Tm - Z = 69), 세륨(Ce - Z = 58), 디스프로슘(Dy - Z = 66), 에르븀(Er - Z = 68), 유로퓸(Eu - Z = 63), 홀뮴(Ho - Z = 67), 철(Fe - Z = 26), 란타늄(La - Z = 57), 네오디뮴(Nd - Z = 60), 프라세오디뮴(Pr - Z = 59), 및 이의 혼합물로부터 선택될 수 있다.

상기 금속은 바람직하게는 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 주석(Sn), 지르코늄(Zr) 및 철(Fe)로부터 선택된다.

원자번호(이는 양성자수라고도 알려짐)는 원자의 핵에서 발견되는 양성자의 수이다. 이는 통상적으로 기호 Z로 나타낸다. 원자번호에 의해 화학원소가 특이적으로 식별된다. 중성 전하의 원자에서, 원자번호는 전자의 수와 같다.

Z는 나노입자의 입사 방사선 흡수 능력에 관여한다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 금속성 나노입자는 금으로 구성된다.

본 발명에 따르면, 전술한 금속들의 혼합물이 특정 나노입자, 또는 특정 나노입자의 군에서 또한 가능하다.

비표면적(SSA)이 작은 나노입자가 주변환경과 그의 상호작용을 제한하기 위하여 또한 바람직하다.

비표면적(SSA)은 질량의 단위 당 전체 표면적(m²/g)을 측정하는 고체의 물질적 성질이다. SSA는 나노입자 생물학적 시스템 인터페이스에 영향을 미치는 중요한 인자로서 여겨진다; 동일한 질량-용량을 기준으로, 초미립자가 동물에게 투여될 때 염증과 같은 부작용을 미립자보다 더 야기한다는 것이 보고되었다(예를 들어, Nel et Al.(Nature Materials 8 (2009) 543 참조).

가장 큰 크기가 약 80 내지 105 nm인 금속성 나노입자가 하기에서 설명되는 바와 같이 SSA와 관련하여 특히 유리하다.

본 발명의 목적을 위해, 나노입자의 비표면적은 예를 들어 약 1 m²/g 내지 50 m²/g에 포함된다. 상기 비표면적은 바람직하게는 2 m²/g 내지 20 m²/g에 포함된다.

구형 나노입자의 비표면적은 식 (SSA = 3000 / (d×r))을 사용하여 산출될 수 있으며, 여기서 d는 금속성 나노입자의 밀도이고 r은 나노입자의 반경이다.

따라서, 입자 크기가 15, 30, 60, 80 및 100 nm인 구형 금 나노입자는 19.32의 금 나노입자 밀도에 대해 비표면적이 각각 20.7, 10.3, 5.2, 3.9 및 3.1 m²/g이 될 것이다.

입자 크기가 15, 30, 60, 80 및 100 nm인 구형 철 나노입자는 7.87의 철 나노입자 밀도에 대해 비표면적이 각각 50.8, 25.4, 12.7, 9.5 및 7.6 m²/g이 될 것이다.

본 발명자들은 본 발명에 따른 나노입자의 놀라운 효능이 주로 그의 크기에 기인한다는 점을 개시한다. 크기가 80 nm 이상인 나노입자가 이온화 방사선에 노출될 때, 이러한 나노입자는 실제로 더 작은 크기의 나노입자, 특히 60 nm 이하의 나노입자에 비해 표적세포에게 더 큰 손상을 발생시킬 수 있다. 따라서, 본 발명자들은 이온화 방사선하에서 세포 방해에 대해 근본적이고 직접적으로 영향을 미치는 나노입자의 크기를 강조하고 있으며, 본원에 기재되어 있는 크기들은 80 nm 역치값에 도달할 때, 바람직하게는 80 nm 역치값을 초과할 때, 포유류에서 치료적 적용을 향상시킨다(본원의 실시예 참조). 본원에서 확인된 크기의 범위 내에서 나노입자 크기가 가장 클수록, 세포 손상을 발생시키는 능력이 더 효과적이다.

이러한 메카니즘의 가능한 설명은 더 좋거나 다른 방식에서 포획된 에너지(이온화 방사선)를 전달하는 나노입자의 능력에 기인한 것일 수 있다.

실시예 2 및 3에서, 방사선조사할 때 나노입자에 의해 유도되는 치료 효과에 대해 미치는 금 농도의 영향으로부터 금 나노입자 크기의 영향을 구별하기 위하여, 본 발명자들은 특정의 가변 파라미터로서 금 나노입자의 크기를 사용함으로써 모든 시험관내 분석들을 수행하였다. 본 발명자들이 얻은 실험결과들은, 치료 효능(세포를 사멸시키거나 및/또는 세포의 분열을 방지하는 능력)의 증폭에 대한 나노입자 크기의 놀라운 영향(일정한 금속 농도에서)을 보여주었다.

이온화 방사선 하에서 효율적인 치료 효과를 발생시키기 위하여, 나노입자 크기가 80 nm 이상인 금속성 나노입자의 사용은 표적세포 당 금속의 농도가 약 2 내지 7배, 특히 4 내지 7배 또는 2 내지 5배일 것이 요구되며, 이는 나노입자 크기가 약 60 nm 이하인 금속성 나노입자를 사용할 때 요구되는 표적세포 당 금속의 농도보다 더 낮다(GNP와 관련하여 실시예 2 및 3 참조).

치료 효능이 유사하게 나타나면서 환자에게 투여되는 금속 양의 유의적이고 유리한 감소는 유해한 부작용들의 감소와 연관되며, 이는 본 발명에 의해 가능해진다.

또한, 본 발명은 방사선요법 치료에 있어서, 특히 이제까지 병원에서 통상적으로 수행되었던 방사선조사의 다중분할 프로토콜의 과정에 있어서, 투여 단계 횟수의 유의적인 감소를 가져온다. 실제로, 본 출원에 기재되어 있는 나노입자는 충분히 크기 때문에, 종양 조직에서 그의 보유를 향상시킬 수 있다. 더 큰 금속성 나노입자 크기의 표적 조직 클리어런스(clearance)의 실질적인 감소는 문헌 [CHANG et al. Cancer Sci. 99 (2008) 1479; Hainfeld et al., Phys. Med. Biol 49 (2004) N309]에서 관찰되었다.

이온화 방사선의 필요한 투여량은 시험관내에서 수행되는 적용에 대해 바람직하게는 약 0.05 Gray 내지 약 16 Gray, 바람직하게는 약 0.05 Gray 내지 약 6 Gray에 포함되는 양이다.

투여량은 특히 국부적, 생체외 또는 생체내에서 수행되는 적용에 대해 약 0.05 Gray 초과 내지 약 16 또는 30 Gray 미만에 포함된다.

전체 이온화 방사선의 범위는 현재 실무에 따라 인간에 있어서 약 1.5 Gray 내지 약 85 Gray이다. 또한, 약 40 Gray의 부가적인 조사 증가가 현재 실무에 따라 인간에게 제공될 수 있다.

전달되는 방사선의 총량은 단일 용량, 분할 용량, 과분할 용량 등과 같은 다른 스케줄에 따라 제공될 수 있다.

본원에서 조사되는 나노입자는 실시예에서 입증된 바와 같이 더 작은 크기의 조사된 나노입자를 사용하여 수득된 효과에 비해 분명한 치료 효과의 개선을 나타낸다.

본 발명에 따른 나노입자는 유리하게는 생체적합성이며, 이는 즉 동물 유기체, 일반적으로 포유류, 특히 인간에게 안전하게 투여되어 치료 효과를 제공할 수 있다는 것을 의미한다. 상기 생체적합성은 예를 들어 입자를 구성하는 금속(들)의 성질에 의해 및/또는 선택적인 코팅에 의해 보장될 수 있다.

본 발명에 따른 바람직한 나노입자는 투여 경로와 무관하게 생체적합성 코팅으로 도포된다. 본 발명의 나노입자가 정맥내(IV) 경로를 통해 대상체에 투여될 때, 상기 생체적합성 코팅은 전술한 EPR 효과 측면에서 나노입자의 생체분포를 최적화하는데 특히 유리하다. 나노입자의 전체 생체적합성 코팅은, 특히 IV 측면에서, 임의의 인식 성분(마크로파지, 옵소닌 등)과 입자 표면의 상호작용을 피하기 위해 바람직하다. "전체 코팅(full coating)"은 입자의 표면상에 적어도 완전한 단층을 생성할 수 있는 매우 높은 밀도의 생체적합성 분자의 존재를 나타낸다. 상기 코팅은 나노입자의 소위 "스텔스(stealth) 효과"의 원인이 된다.

생체적합성 코팅은, 생체적합성 현탁액, 예컨대 생리적 유체(혈액, 혈장, 혈청 등), 임의의 등장성 매질 또는 생리적 매질, 예를 들어 약학적 투여를 위해 요구되는 글루코스(5%) 및/또는 NaCl(0.9%)을 포함하는 매질에서, 특히 나노입자에게 안정성을 부여하거나 향상시킨다(나노입자를 구성하는 선택된 금속에 의존함).

상기 생체적합성 코팅은 나노입자를 표면처리제로 처리함으로써 획득된다.

안정성은 0.22μm 필터 여과 이전 및/또는 이후에 생체적합성 현탁액에서 금속성 나노입자의 금속 원소의 ICP-MS 정량화에 의해 확인하거나, 또는 생체적합성 현탁액에서 금속성 나노입자의 동적광산란법에 의해 확인할 수 있다.

유리하게는, 상기 코팅은 생체 내에서 입자의 완전성을 보존하고, 그의 생체적합성을 보장하거나 향상시키며, (예를 들어, 스페이서(spacer) 분자, 생체적합성 중합체, 표적화제, 단백질 등으로) 그의 선택적인 관능화를 용이하게 한다. 실제로, 본 발명에 따른 특정 나노입자는 생물학적 조직 또는 세포의 특이적 표적화를 가능하게 하는 표면 성분을 또한 포함한다. 상기 표면 성분은 바람직하게는 표적세포에 존재하는 인식 성분과 나노입자의 상호작용을 가능하게 하는 표적화제(targeting agent)이다. 상기 표적화제는 나노입자가 종양에 축적되면 작용할 수 있다. 표적화제의 형태가 표적과의 상호작용을 유발할 것이기 때문에, 상기 표적화제의 밀도는 주의깊게 조절된다. 실제로, 표적화제의 높은 밀도는 표적화제의 형태를 섭동시킬 수 있으며, 그 결과 표적세포에 의한 그의 인식을 섭동시킬 수 있다(예를 들어, J A Reddy et Al. Gene therapy 9 (2002) 1542; Ketan B. Ghaghada et Al. Journal of Controlled Release 104 (2005) 113 참조). 또한, 표적화제의 높은 밀도는 맥관구조에서 순환하는 동안 세망내피계(RES: Reticulo Endothelial System)에 의해 나노입자의 클리어런스를 향상시킬 수 있다.

생체적합성 코팅은 임의의 비결정 구조 또는 결정 구조로 구성될 수 있다.

일반적으로, 코팅은 생분해성일 수도 있으며 생분해성이지 않을 수도 있다. 상기 두 개의 옵션은 본 발명의 목적에 따라 사용될 수 있다.

생분해성이 없는 코팅의 예로는, 실리카, 알루미나, 당류(예를 들어, 아가로스), 포스페이트, 실란, 티올, 양쪽성 이온 화합물, 지질, 망상 조직이거나 그렇지 않은, 변형되거나 그렇지 않은, 포화 탄소 중합체(예를 들어, 폴리에틸렌 산화물) 및 무기 중합체(예를 들어, 폴리메타크릴레이트 또는 폴리스티렌), 및 이의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질 또는 표면처리제가 있다.

생분해성이 있는 코팅의 예로는, 예를 들어 변형되거나 그렇지 않은, 자연적 형태이거나 그렇지 않은, 생물학적 분자, 및 변형되거나 그렇지 않은, 자연적 형태이거나 그렇지 않은, 생물학적 분자 중합체로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 물질 또는 표면처리제가 있다, 상기 생물학적 중합체는 인지질, 단당류, 올리고당류 또는 다당류, 예를 들어 폴리설페이트되거나 그렇지 않은 덱스트란일 수 있다.

전술한 물질, 화합물 또는 표면처리제는 단독으로 또는 조합되어, 혼합물로 또는 집합물로, 합성되거나 그렇지 않거나, 공유결합되거나 그렇지 않거나, 선택적으로는 다른 화합물과 조합되어 사용될 수 있다. 또한, 자연적으로 수용성 또는 지용성이거나, 인위적으로 수용성 또는 지용성이 되도록 변형된 전술한 물질 중 임의의 것이 사용될 수도 있다.

생체적합성 코팅은 바람직하게는 무기 제제, 유기 제제, 및 이의 혼합물 또는 조합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함하거나, 또는 이러한 화합물로 이루어진다.

적합한 무기 제제는 산화물, 수산화물 및 옥시수산화물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 무기 제제는 예를 들어 규소, 알루미늄, 칼슘 및/또는 마그네슘을 포함할 수 있다.

이러한 제제는 생물학적 매질과 나노입자의 상호작용을 조절하기 위해 상기 나노입자에 양전하 또는 음전하를 부여하는데 사용될 수 있다.

예를 들어 마그네슘 및 칼슘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 무기 제제는 pH 7에서 나노입자의 표면에 양전하를 가져올 것이다.

예를 들어, 규소는 pH 7에서 나노입자의 표면에 음전하를 가져오기 위해 사용될 수 있다.

적합한 유기 제제는 본 발명에 따른 나노입자와 상호작용할 수 있는 관능기 및 상기 나노입자에 생체적합성을 부여하는 관능기를 포함하는 임의의 제제일 수 있다.

나노입자와 상호작용할 수 있는 관능기를 포함하는 제제는 예를 들어 카르복실레이트(R-COO^-), 실란(R-Si(OR)₃), 포스폰산 관능기(R-PO(OH)₂), 인산 관능기(R-O-PO(OH)₂) 또는 티올 관능기(R-SH)일 수 있다.

본 발명에 따른 나노입자에 생체적합성을 부여할 수 있는 관능기를 포함하는 제제는 스테릭(steric) 관능 및/또는 정전기 관능을 가질 수 있다. 상기 스테릭 관능을 가지는 제제는 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리에틸렌 산화물, 폴리비닐알코올, 폴리아크릴레이트, 폴리아크릴아미드(폴리(N-이소프로필아크릴아미드)), 폴리카바미드, 생체고분자 또는 다당류, 예컨대 덱스트란, 크실란, 셀룰로스, 콜라겐, 및 양쪽성 이온 화합물, 예컨대 폴리설포베타인 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

양의 정전기 관능을 가지는 제제는 아민, 예컨대 아미노프로필트리에톡시실란, 폴리리신 또는 2-아미노에탄티올일 수 있다.

음의 정전기 관능을 가지는 제제는 포스페이트(예를 들어, 폴리포스페이트, 메타포스페이트, 피로포스페이트 등), 카르복실레이트(예를 들어, 시트르산 또는 디카르복실산, 특히 숙신산) 및 티올(예를 들어, 메르캅토숙신산과 같은 카르복시 말단 티올)로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

또한, 상기 코팅은 관심대상인 임의의 분자가 입자의 표면에 결합할 수 있게 하는 다른 관능기(또는 링커(linker) 부분), 예컨대 생물학적 조직 또는 세포의 특이적 표적화를 가능하게 하는 표면 성분을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 나노입자의 일반적인 예는 금으로 이루어진 나노입자이다. 상기 금 나노입자는 또한 생체적합성 코팅으로서 티올 화합물, 예컨대 폴리에틸렌글리콜-티올(PEG-SH), 티오글루코스, 또는 카르복실레이트 화합물, 예컨대 시트레이트로 이루어진 코팅을 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 나노입자의 또다른 예는, 생체적합성 코팅으로서 폴리에틸렌, 아민 또는 카르복실로부터 선택된 하나 이상의 관능기를 갖는 티올 제제로 이루어진 코팅, 또는 시트레이트로 이루어진 코팅을 포함하는, 금으로 구성된 나노입자이다.

본 발명의 나노입자는 제조하기가 용이하다는 이점을 제공한다. 금속성 나노입자의 제조방법은 실제로 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Brian L. Cushing et Al. (Chem. Rev. 104 (2004) 3893 참조). 일반적으로, 금속성 나노입자는 수성 또는 비수성 용액에서 금속 원소를 침전시킴으로써 획득되며, 상기 침전은 금속 양이온의 화학적 환원을 수반한다. 금속성 나노입자를 제조하는 또다른 가능한 방법은 방사선-보조 환원을 통한 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 정의된 금속성 나노입자 또는 금속성 나노입자의 군의 제조방법에 관한 것이며, 이는 하기를 포함한다:

- 본원에 기재된 금속성 원소, 바람직하게는 원자번호(Z)가 25이거나 더 큰 금속성 원소를 제공하는 단계,

- 환원제의 존재하에 매질에서 상기 금속성 원소를 침전시켜, 상기 금속성 원소로부터 금속성 나노입자를 제조하는 단계, 및 선택적으로

- 상기 매질에 착화제를 첨가하는 단계(상기 착화제는 환원제를 첨가하기 전, 첨가하는 동안 또는 첨가한 후에 첨가됨), 여기서 상기 환원제 및 착화제는 선택적으로 동일한 화합물임, 및 선택적으로

- 전술한 표면처리제를 사용하여 나노입자를 코팅하는 단계.

본 발명에서 일반적으로 사용되는 매질(medium)은 수성 용액, 알코올성 용액 등으로부터 선택될 수 있다.

일반적으로 사용되는 환원제는 시트레이트, 아스코르브산, 2-메르캅토숙신산으로부터 선택될 수 있다.

일반적으로 사용되는 착화제는 시트레이트, 티올, 예컨대 2-메르캅토숙신산 등으로부터 선택될 수 있다.

상기 코팅 단계는 유리하게는 나노입자를 전술한 표면처리제와 접촉시키는 단계로 이루어진다.

특정 구현예에서, 나노입자의 군의 제조방법은 하기 단계를, 바람직하게는 순서대로, 포함한다:

a) 전구체로서, 본원에 기재된 금속성 원소, 바람직하게는 원자번호(Z)가 25이거나 더 큰 금속성 원소를 제공하는 단계,

b) 환원 화합물의 존재하에 전술한 극성 매질에서 상기 a) 단계의 전구체를, 바람직하게는 전구체 및/또는 환원 화합물의 농도 및/또는 온도를 조정함으로써, 침전시키는 단계,

c) 선택적으로, 상기 b) 단계의 침전 이전, 침전 동안 또는 침전 이후에 극성 매질에 착화제를 첨가하는 단계, 여기서 상기 착화제 및 환원제는 선택적으로 동일한 화합물임,

d) 선택적으로, 상기 b) 단계 또는 c) 단계의 말기에 수득된 현탁액을 세척하여, 임의의 불순물, 환원제 및/또는 착화제를 제거하는 단계,

e) 선택적으로, 상기 d) 단계의 말기에 수득된 현탁액을 농축시키는 단계, 및

f) 선택적으로, 나노입자를 코팅하는 단계.

전술한 군은 대상체에 투여되기 전에 추가적으로 제형화 단계에 제공될 수 있다.

특정 구현예에서, 본 발명에 따른 나노입자의 제조방법은 하기 단계를 바람직하게는 순서대로 포함하며, 상기 나노입자는 금속으로 이루어진 것이다:

a) 환원제(예컨대, 시트레이트)의 존재하에 수성 용액에서 염화금(gold chloride) 전구체(예컨대, 특히 HAuCl₄ 또는 KAuCl₄)의 용액을 침전시키는 단계, 여기서 상기 매질의 온도는 50℃ 내지 100℃에 포함됨,

b) 선택적으로, 상기 수득된 금속성 나노입자 현탁액을 세척하여, 임의의 불순물을 제거하는 단계,

c) 선택적으로, 상기 수득된 금속성 나노입자 현탁액을 농축시키는 단계,

d) 선택적으로, 상기 금속성 나노입자를 전술한 표면처리제와 접촉시켜, 상기 입자를 코팅시키는 단계.

본 발명의 또다른 목적은, 상기 정의된 나노입자 및/또는 본원에 기재된 방법에 따라 획득할 수 있는 나노입자를 포함하는 임의의 조성물에 기초한다. 의무적이지는 않지만, 본 발명의 조성물에서 입자는 전술한 바와 같이 매우 균일한 형태를 갖는 것이 유리하다.

고농도(예를 들어, 300g/L)의 금속 원소를 포함하는 생체적합성 현탁액은 본원의 방법에 따라 수득될 수 있다.

본 발명의 특정 목적은 상기 정의된 나노입자, 및 선택적으로는 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 조성물은 고체, 액체(현탁액 내 입자), 에어로졸, 겔, 페이스트 등의 형태일 수 있다. 바람직한 조성물은 주사가능 제형, 바람직하게는 액체 형태이다.

사용되는 부형제 또는 담체는 예를 들어 염류용액, 등장액, 멸균액, 완충액 등과 같이 이러한 형태의 적용을 위한 임의의 통상적인 지지체일 수 있다. 이는 또한 안정화제, 감미료, 계면활성제 등을 포함할 수도 있다. 이는 약학적 제형의 공지된 기술을 사용함으로써 예를 들어 앰플, 에어로졸, 병, 정제, 캡슐로 제형화될 수 있다.

유리하게는, 표적세포 당 투여되는 금속의 농도는 약 10^-7nmole(세포:[금속]=1:10^-7(nmole)) 내지 약 5x10^-1nmole(세포:[금속]=1:5x10^-1(nmole))이다. 더 바람직하게는, 표적세포 당 금속의 농도는 약 10^-6nmole(세포:[금속]=1:10^-6(nmole)) 내지 약 2x10^-1nmole(세포:[금속]=1:2x10^-1(nmole))이다.

더욱더 바람직하게는, 표적세포 당 금속의 농도는 약 10^-6nmole(세포:[금속]=1:10^-6(nmole)) 내지 약 10^-3nmole(세포:[금속]=1:10^-3(nmole))이거나, 또는 약 10^-6nmole(세포:[금속]=1:10^-6(nmole)) 내지 약 10^-4nmole(세포:[금속]=1:10^-4(nmole))이다.

본원에 기재된 조성물에서, 금속의 적합하거나 바람직한 농도는, 표적 포유류 세포, 특히 종양 포유류 세포의 그램 당 약 1 mg 내지 약 100 mg의 금속에 포함되며, 일반적으로 표적 포유류 세포의 그램 당 약 1 mg 또는 5 mg 내지 50 mg의 금속이다.

일반적으로, 액체 형태의 조성물은 0.01 g/L 내지 300 g/L의 금속을 포함하며, 바람직하게는 1 g/L 이상, 5 g/L 이상, 10 g/L 이상, 20 g/L 이상, 40 g/L 이상, 60 g/L 이상, 80 g/L 이상, 100 g/L 이상, 150 g/L 이상, 200 g/L 이상 또는 250 g/L 이상의 금속을 포함한다.

금속의 정량화는 바람직하게는 ICP-MS에 의해 수행된다.

전술한 금속의 농도는 환자 대상체, 선택된 투여 경로, 표적세포의 성질 등에 의존하여 달라지며, 이는 당업자에 의해 용이하게 조절될 수 있다.

본 발명의 나노입자, 나노입자의 군 및 조성물은 다수의 분야에서, 특히 인간 또는 가축 의약에 사용될 수 있는 생성물이다.

본 발명의 목적은 표적 세포, 조직 또는 기관을 변형 또는 파괴하기 위하여 전술한 생성물을 사용하는 것이다.

이온화 방사선의 에너지에 의해, 상기 입자들은 세포 및/또는 조직의 섭동 또는 파괴를 가능하게 할 수 있다.

따라서, 본 발명의 특정 목적은, 동물의 표적세포가 방사선, 특히 이온화 방사선에 노출될 때, 상기 표적세포를 변형 또는 파괴하기 위한 약학 조성물을 제조하기 위해 본 발명에 따른 금속성 나노입자 또는 나노입자 군을 사용하는 것에 기초하며, 또한 이에 대응하는 치료방법에 기초한다.

또한, 상기 약학 조성물은 암을 치료하기 위한 목적으로 본원의 나노입자 또는 나노입자 군과 구별되는 부가적인 치료적 화합물을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 또다른 특정 목적은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 표적세포의 섭동, 용해, 세포자멸 또는 파괴를 유도하거나 야기하기 위한 방법에 기초한 것으로서, 상기 방법은 세포, 특히 표적 세포와 전술한 나노입자가 상호작용하기에 충분한 시간 동안 상기 세포와 하나 이상의 나노입자를 접촉시키는 단계, 및 상기 세포를 방사선에 노출시키는 단계를 포함하며, 여기서 적합한 방사선은 특히 이온화 방사선, 바람직하게는 X선, γ-선, 방사성 동위원소 및/또는 전자빔이며, 상기 노출은 상기 표적세포의 섭동, 용해, 세포자멸 또는 파괴를 유도하거나 야기한다.

표적세포는 임의의 병리학적 세포, 즉 다시 말하면 병리학적 메카니즘에 관련된 세포일 수 있으며, 예를 들어 종양 세포, 협착 세포(섬유아/민무늬근 세포) 또는 면역계 세포(병리학적 세포 클론)와 같은 증식 세포이다. 바람직한 적용 분야는 악성 세포 또는 조직의 치료(예를 들어, 파괴 또는 기능적 변형)에 기초한다.

이러한 점에서, 본 발명의 특정 목적은 특히 암을 치료하기 위한 약학 조성물을 제조하기 위해 전술한 이온화 방사선과 조합하여 사용할 때 전술한 나노입자 또는 상기 나노입자의 군을 사용하는 것에 기초한다.

또한, 본 발명의 개시내용에는, 동물의 암 세포가 방사선, 특히 전술한 이온화 방사선에 노출될 때, 동물의 암을 치료 또는 예방하거나 암의 징후를 완화시키기 위해 전술한 조성물, 나노입자 또는 나노입자 군을 사용하는 것이 포함된다.

본 발명의 또다른 특정 목적은 시험관내, 생체외 또는 생체내에서 표적세포, 특히 암 세포의 섭동, 용해 또는 파괴를 유도하거나 야기하기 위한 방법에 기초한 것으로서, 상기 방법은 전술한 나노입자가 표적세포와 상호작용하기에 충분한 시간 동안 상기 하나 이상의 입자를 상기 세포와 접촉시키는 단계, 및 상기 세포를 방사선, 특히 전술한 이온화 방사선에 노출시키는 단계를 포함하며, 이러한 노출은 상기 세포의 섭동, 용해 또는 파괴를 유도하거나 야기한다.

본 발명의 또다른 목적은 대상체 또는 환자의 질환, 특히 암을 치료 또는 예방하거나 상기 질환의 증상을 완화시키기 위한 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 나노입자가 비정상 세포, 특히 암 세포와 (접촉하여) 상호작용하게 할 수 있는 조건하에서 상기 질환을 앓고 있는 환자에게 전술한 나노입자, 나노입자의 군 또는 조성물을 투여하는 단계, 및 그 후 상기 대상체를 조사와 같은 이온화 방사선에 노출시켜 대상체를 처치함으로써 환자의 비정상 세포의 변형, 방해 또는 기능적인 파괴를 유발하여 암을 치료 또는 예방하는 단계를 포함한다.

전통적인 암의 처치는 체계적으로 동시 복합 치료(예를 들어, 방사선요법 및 화학요법의 조합)의 동시적용을 나타낸다.

방사선요법의 측면에서, 이온화 방사선에 노출되는 본 발명의 나노입자는 다양한 암의 치료 프로토콜과 연관되어 사용될 수 있다. 상기 프로토콜은 수술, 방사선외과수술, 화학요법, 세포증식억제제(들), 세포독성(들)의 투여를 포함하는 치료법, 표적화 요법, 백신, 및 다른 임의의 암 치료용 생물학적 산물 또는 무기물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

놀랍게도, 본원의 나노입자는 또한 방사선요법 단독의 측면에서 사용될 수 있으며, 이 때 효과의 증가가 관찰된다.

본 발명은 임의 유형의 악성 종양, 예컨대 혈액학적 종양 또는 악성암종, 및 고형 종양, 특히 상피성, 신경외배엽 또는 간엽을 기원으로 하는 종양을 치료하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 나노입자는 방사선 요법이 전통적으로 사용되거나 및/또는 권고되는 전-악성 병변 또는 특이적 양성 질환을 치료하기 위해 사용될 수 있다.

본 발명은 치료적 측면에서 일차 종양, 또는 이차 침습, 국부적 또는 멀리 떨어져 있는 전이에 적용될 수 있으며, 예방적 측면에서 흑색종, 폐암, 신장암, 유방암 등으로부터 관찰되는 침습(전이)과 같은 이차 악성 중추신경계의 관여를 피하기 위해 적용될 수 있다.

나노입자는 항암 치료 기간 동안 언제든지 사용될 수 있다. 나노입자는 예를 들어 네오아주반트로서(암 절제 수술의 개입 전에) 투여되거나, 또는 아주반트로서(수술 후) 투여될 수 있다.

나노입자는 또한 수술에 의해 제거될 수 없는 후기 종양에 대해서도 사용될 수 있다.

본원에서 설명된 바와 같이, 조사는 현재 이용가능한 임의의 방사선요법 시스템을 사용함으로써 입자를 투여한 후 언제든지 하나 이상의 경우에 적용될 수 있다.

본원에 기재된 나노입자는 특히 전통적 치료법으로서 방사선요법이 이용되는 암을 치료하는데 사용하기 위한 것이다. 상기 암은 특히 흑색종, AIDS 관련 악성 신생물을 포함하는 피부암; 뇌, 뇌간, 소뇌, 뇌하수체, 척추관, 안구 및 안와를 포함하는 중추신경계 종양; 두경부 종양; 폐암; 유방암; 위장 종양, 예컨대 간 및 간담즙관 암, 결장, 직장 및 항문 암, 위, 췌장, 식도 암; 수컷 비뇨생식기 종양, 예컨대 전립선, 고환, 음경 및 요도 암; 부인과 종양, 예컨대 자궁경, 자궁내막, 난소, 난관, 질 및 외음부 암; 부신 및 복막후 종양; 위치와 무관한 골 및 연 조직의 육종; 림프종; 골수종; 백혈병; 및 소아과 종양, 예컨대 빌름스 종양, 신경아세포종, 중추신경계 종양, 유잉 육종 등으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

상기 입자는 조사의 전체 양의 넓은 범위 내에서 활성화될 수 있다.

양 및 스케줄(단일 용량으로, 또는 분할되거나 과분할된 프로토콜 측면에서 조사의 전달 및 계획 등)은 임의의 질환/해부학적 부위/질환 단계, 환자 설정/환자 연령(유아, 성인, 노인 환자)에 대해 한정되며, 임의의 특이적 상황에 대한 처치의 표준을 구성한다.

상기 조사는 현재 이용가능한 임의의 방사선요법 시스템을 사용함으로써 나노입자를 투여한 후 언제든지 하나 이상의 경우에 적용될 수 있다. 상기 나노입자는 국부(특히, 종양내(IT)), 피하, 정맥내(IV), 피내, 동맥내, 기도(흡입), 복강내, 근육내 및 구강 경로(경구)와 같은 다양한 경로들에 의해 투여될 수 있다. 상기 나노입자는 또한 종양 절제 이후에 종양 베드(bed)의 가상 공동(virtual cavity)과 같은 강내로 투여될 수 있다.

반복된 주사 또는 투여가 적합한다면 이에 따라 수행될 수 있다.

"치료"라는 용어는 비정상 기능의 교정, 질환의 예방, 병리학적 징후의 개선, 예컨대 특히 비정상 조직, 특히 종양의 크기 또는 성장의 감소, 상기 크기 또는 성장의 조절, 비정상 세포 또는 조직의 억제 또는 파괴, 질환 진행의 지연, 암 진행의 지연과 함께 질환의 안정화, 전이 형성의 감소, 질환의 퇴보 또는 완전 관해(예를 들어, 암의 측면) 등을 위해 수행되는 임의의 작용을 의미한다.

전술한 바와 같이, 적합한 방사선 또는 이온화 원(source)은 바람직하게는 이온화 방사선이며, 유리하게는 X선, 감마선, 전자빔, 이온빔 및 방사성 동위원소 또는 방사성 동위원소 방출로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. X선이 이온화 원으로서 특히 바람직하다.

이온화 방사선은 통상적으로 약 2 KeV 내지 약 25000 KeV, 특히 약 2 KeV 내지 약 6000 KeV(LINAC 원), 또는 약 2 KeV 내지 약 1500 KeV(예컨대, 코발트 60 원)이다. X선 원을 사용할 때, 특히 바람직한 이온화 방사선은 일반적으로 약 50 KeV 내지 약 12000 KeV, 예를 들어 약 50 KeV 내지 약 6000 KeV이다.

일반적이면서 비제한적인 방식으로, 하기의 X선이 나노입자를 활성화시키기 위하여 다양한 경우에 적용될 수 있다:

- 특히 표면상의 표적 조직에 대해 효과적인 50 내지 150 keV의 X선;

- 6㎝ 두께의 조직을 침투할 수 있는, 200 내지 500 keV의 X선(오르토(ortho) 전압);

- 1000 keV 내지 25,000 keV의 X선(메가(mega) 전압). 예를 들어, 전립선 암의 치료를 위한 나노입자의 이온화는 15,000 keV의 에너지를 갖는 5 포커싱된(five focused) X선을 통해 수행될 수 있다.

선택적으로, 방사성 동위원소는 이온화 방사선 원으로서 사용될 수 있다(이는 큐리요법(curietherapy) 또는 근접치료로서 지칭됨). 특히, 요오드 I¹²⁵(t½ = 60.1일), 팔라듐 Pd¹⁰³(t½ = 17일), 세슘 Cs¹³⁷ 및 이리듐 Ir¹⁹²이 사용되는 것이 유리할 수 있다.

또한, 면역방사성핵종(또는 면역방사성표지된 리간드)이 방사성면역요법의 측면에서 이온화 방사선 원으로서 사용될 수 있다. 방사성면역요법에 대해 적합한 방사성핵종은 예를 들어 ¹³¹I, ¹⁸⁶Re, ¹⁷⁷Lu 또는 ⁹⁰Y로부터 선택될 수 있다.

양성자와 같은 하전된 입자 빔, 탄소, 특히 고에너지 이온빔과 같은 이온 빔이 또한 이온화 방사선 원 및/또는 중성자 빔으로서 사용될 수 있다.

전자빔은 또한 4 MeV 내지 25 Mev에 포함되는 에너지를 갖는 이온화 방사선 원으로서 사용될 수 있다.

금속성 나노입자의 원자(들)의 원하는 X선 흡수단에 가깝거나 그에 대응하는 에너지를 갖는 X선을 선택적으로 발생시키기 위하여, 특이적 단색 조사 원이 사용될 수 있다.

바람직하게는, 이온화 방사선의 원은 선형가속기(LINAC), 코발트 60 및 근접치료(brachytherapy) 원으로부터 선택될 수 있다.

"조합"이라는 용어는 본 발명의 나노입자와 접촉하면서 관심대상인 세포, 조직 또는 기관이 한정된 원에 의해 활성화될 때 요구되는 효과가 달성된다는 것을 나타낸다. 그러나, 입자와 광선이 동시에 투여될 필요도 없고, 동일한 프로토콜에 따를 필요도 없다.

또한, 본 발명의 개시내용은 본원에 기재된 임의의 하나 이상의 나노입자 또는 조성물을 포함하는 키트를 제공한다. 통상적으로, 상기 키트는 본 발명에 따른 하나 이상의 나노입자 또는 나노입자의 군을 포함한다. 일반적으로, 상기 키트는 또한 본 발명의 약학 조성물의 하나 이상의 성분으로 채워진 하나 이상의 용기를 포함한다. 상기 용기(들)에 연관되어, 제품을 사용하기 위한 지시를 제공하는 표지 안내문이 본 발명의 방법에 따라 나노입자, 나노입자의 군 또는 조성물을 사용하기 위해 제공될 수 있다.

본 발명의 다른 측면들과 이점들은 하기의 실시예에서 명확해질 것이며, 이는 본 발명을 제한하려는 것이 아니라 설명을 목적으로 제공되는 것이다.

도 1a 및 1b:
도 1a는 표 1에 기재되어 있는 금 나노입자들의 투과전자현미경(TEM) 이미지를 나타낸다(실시예 1 참조).
도 1b는 표 1에 기재되어 있는 금 나노입자(GNP)의 크기분포를 나타낸다.
도 2a 및 2b: 제조된 금 나노입자의 결정 구조는 전자 회절에 의해 확인된다.
도 2a는 참조 나노입자(투과전자현미경의 카메라 정수(camera constant)(Lλ)를 정하기 위해 입방면심(Cubic Face Center) 구조의 금 나노입자가 참조로서 사용됨)의 전자 회절 패턴과 실시예 1의 금 나노입자(GNP)의 전자 회절 패턴을 나타낸다.
도 2b는 금 나노입자(실시예 1)의 지수(indexation)를 나타내며, 전자 회절 패턴은 금 나노입자의 입방면심(CFC: Cubic Face Center) 구조를 보여준다.
전자 회절 패턴의 지수화는 하기 단계로 이루어진다:
1) 참조 나노입자의 전자 회절 패턴의 카메라 정수를 정하는 단계,
2) 실시예 1의 금 나노입자의 전자 회절 패턴의 링(ring) 직경(D1, D2, ..., Dn)을 측정하는 단계,
3) 식 d_hkl = L*λ / (Dn/2)을 사용하여 d_hkl을 산출하는 단계,
4) 현존하는 구조 데이터베이스를 사용하여 각 링을 지수화하는 단계,
도 3a 및 3b:
도 3a는, 입자 크기가 15 nm인 금 나노입자(실시예 1의 금-15)에 대해 세포 수준에서 12μM, 20μM 및 130μM의 금의 존재하에서 또는 부재하에서(음성 대조군), 200 KVp X선 에너지 빔으로 조사된 HT29 결장암 세포를 사용하여 클론형성 생존 분석을 보여준다. 조사량은 0 Gy(조사되지 않음) 내지 4 Gy에서 달라진다.
HT29에 대한 음성 대조군: 사각형 점
HT29에 대한 금-15 나노입자 12μM: x형 점
HT29에 대한 금-15 나노입자 20μM: 삼각형 점
HT29에 대한 금-15 나노입자 130μM: 원형 점
도 3b는, 입자 크기가 80 nm인 금 나노입자(실시예 1의 금-80)에 대해 세포 수준에서 17μM, 52μM 및 119μM의 금의 존재하에서 또는 부재하에서(음성 대조군), 200 KVp X선 에너지 빔으로 조사된 HT29 결장암 세포를 사용하여 클론형성 생존 분석을 보여준다. 조사량은 0 Gy(조사되지 않음) 내지 4 Gy에서 달라진다.
HT29에 대한 음성 대조군: 사각형 점
HT29에 대한 금-80 나노입자 17 μM: x형 점
HT29에 대한 금-80 나노입자 52 μM: 삼각형 점
HT29에 대한 금-80 나노입자 119 μM: 원형 점
도 4a 및 4b: 본원에서 표적세포 당 금의 농도로 표현되기도 하는, 세포 수준에서 유사한 금의 농도에 대해 유효량 증대 인자(DEF: Dose Enhancement Factor)에 대한 금 나노입자 크기의 영향.
도 4a
세포 수준에서 금(Au)의 농도는 μM로 표현된다.
20 μM 미만의 금의 농도([Au] < 20 μM): x형 점
20 μM 내지 83 μM의 금의 농도(20 μM ≤ [Au] ≤ 83 μM): 다이아몬드형 점
95 μM 내지 148 μM의 금의 농도(95 μM ≤ [Au] ≤ 148 μM): 사각형 점
400 μM의 금의 농도([Au] = 400 μM): 삼각형 점
도 4b
표적세포 당 금(Au)의 농도는 다음과 같이 표현된다:
세포:Au = 1:X (X는 nmole로 표현됨)
세포:Au ≤ 1:15×10^-5: x형 점
1:20×10^-5 ≤ 세포:Au ≤ 1:45×10^-5: 다이아몬드형 점
1:60×10^-5 ≤ 세포:Au ≤ 1:110×10^-5: 사각형 점
세포:Au = 1:182×10^-5: 삼각형 점
도 5a 및 5b:
도 5a는 금 나노입자 크기 ≥ 80 nm에 대한 역치 효과를 보여준다. 세포 수준에서 금의 농도는 20μM 내지 83μM이다.
이에 상응하는 표적세포 당 금의 농도는 20×10^-5nmole 내지 45×10^-5nmole이다.
각각의 기울기 값 사이에 유의적인 차이를 나타내면서, 2개의 직선의 성향을 갖는 커브들이 만들어진다: 크기가 15 nm 내지 60 nm인 금 나노입자는 기울기가 0.0033인 선형 커브를 나타내며, 크기가 80 nm 내지 105 nm인 금 나노입자는 기울기가 0.0384인 선형 커브를 나타낸다. 상기 2개의 커브에 의해 나타나는 기울기 비(slope ratio)는 약 10이다. DEF를 고려할 때 관찰되는 역치 효과는 크기가 약 80 nm이거나 더 큰 금속성 나노입자에 의해 유도된다.
도 5b는 금 나노입자 크기 ≥ 80 nm에 대한 역치 효과를 보여준다. 세포 수준에서 금의 농도는 95μM 내지 148μM이다.
이에 상응하는 표적세포 당 금의 농도는 60×10^-5nmole 내지 110×10^-5nmole이다.
각각의 기울기 값 사이에 유의적인 차이를 나타내면서, 2개의 직선의 성향을 갖는 커브들이 만들어진다: 크기가 15 nm 내지 60 nm인 금 나노입자는 기울기가 0.0025인 선형 커브를 나타내며, 크기가 80 nm 내지 105 nm인 금 나노입자는 기울기가 0.0865인 선형 커브를 나타낸다. 상기 2개의 커브에 의해 나타나는 기울기 비(slope ratio)는 약 30이다. DEF를 고려할 때 관찰되는 역치 효과는 크기가 약 80 nm이거나 더 큰 금속성 나노입자에 의해 유도된다.

도 6a 및 6b:
도 6a는 실시예 1의 표 1에 기재되어 있는 각각의 금 나노입자에 대해 금 농도의 함수로서 X선 감쇠를 나타낸다.
금-15에 대해 [Au](g/L)의 함수로서 HU 값: 다이아몬드형 점
금-30에 대해 [Au](g/L)의 함수로서 HU 값: 사각형 점
금-60에 대해 [Au](g/L)의 함수로서 HU 값: 삼각형 점
금-80에 대해 [Au](g/L)의 함수로서 HU 값: x형 점
금-105에 대해 [Au](g/L)의 함수로서 HU 값: +형 점
도 6b는 X선 감쇠에 대한 금 나노입자 크기의 영향을 보여준다. 각각의 크기의 금 나노입자에 대한 기울기는 도 6a로부터 획득되며, 이는 금 나노입자 크기의 함수로서 기재된다.
도 7a 및 7b:
도 7a는 5분 미만 동안 금 나노입자(실시예 1의 금-60)와 인큐베이션된 HT29 세포의 4 Gy 조사하에서의 생존 분획(SF4)을 보여준다.
도 7b는 약 12 시간 동안 금 나노입자(실시예 1의 금-60)와 인큐베이션된 HT29 세포의 4 Gy 조사하에서의 생존 분획(SF4)을 보여준다.

실시예 1: 다양한 크기의 금 나노입자의 합성 및 물리화학적 특징화

금 나노입자가 수성 용액에서 시트르산나트륨에 의해 염화금이 환원됨으로써 수득된다. 프로토콜은 [G. Frens Nature Physical Science 241 (1973) 21]에서 조정되었다.

전형적인 실험에서, HAuCl₄ 용액이 끓을 때까지 가열된다. 그 후, 시트르산나트륨 용액이 첨가된다. 생성된 용액은 추가 5분 동안 끓이면서 유지된다.

나노입자의 크기는 시트르산 대 금 전구체의 비율을 주의깊게 변화시킴으로써 15 내지 105 nm로 조절된다(표 1 참조).

제조된 금 나노입자 현탁액은 그 후 30 kDa 셀룰로스 막을 갖는 한외여과 장치(Millipore사의 Amicon 교반 세포 모델 8400)를 사용하여 농축된다.

생성된 현탁액은 결국 라미나 후드에서 0.22μM 컷오프 막 필터(Millipore사의 PES 막)를 통해 여과되고, 4℃에서 저장된다.

금의 함량은 ICP-MS에 의해 결정되며, 이는 [Au] g/L로서 표현된다.

입자의 크기는 200개 이상의 입자들을 카운팅하여 투과전자현미경(TEM)에 의해 결정되며(도 1a), 여기서 크기를 측정하기 위해 가장 긴 나노입자의 치수를 고려한다. 히스토그램이 만들어졌으며, 평균과 표준편차가 기록되었다(도 1b).

샘플	입자 크기(nm)	합성	구조	[Au] g/L
		시트르산염 HAuCl4
금-15	15±2(1σ)	20 mL 30 mM 500 mL 0.25 mM	CFC	17.86
금-30	32±10(1σ)	7.5 mL 40 mM 500 mL 0.25 mM	CFC	16.90
금-60	60±10(1σ)	2 mL 85 mM 500 mL 0.25 mM	CFC	4.98
금-80	80±10(1σ)	1.2 mL 43 mM 200 mL 0.30 mM	CFC	10.67
금-105	105±25(1σ)	1.2 mL 39 mM 200 mL 0.33 mM	CFC	5.06

결론

표 1에 기재되어 있는 금 나노입자는 동일한 표면 성질들을 보장하기 위하여 모두 동일한 합성 과정에 따라 제조된다.

TEM 이미지는, 상기 합성된 금 나노입자의 형태가 모두 구형 및/또는 타원형이라는 점을 보여준다.

TEM 전자 회절 패턴은 합성된 모든 금 나노입자들이 CFC 구조를 나타낸다는 점을 보여준다.

따라서, 선행기술에 따라 잘 특징화된 평균 입자 크기 및 크기 다분산성(polydispersity)과 함께, 금 나노입자의 크기만 변화된다.

실시예 2 : 금의 농도가 세포 수준에서 일정할 때, 시험관내 효능에 대한 금 나노입자 크기의 영향(클론형성 생존 분석)

프로토콜

세포로 내재화되거나 또는 세포에 결합되는 금 나노입자(GNP)의 방사선 반응의 상승을 조사하기 위하여(하기에서 세포 수준에서 금의 농도로 표현됨), 본 발명자들은 하기에 기재된 특이적 클론형성 생존 분석을 사용하였다:

HT29 세포들이 20000 세포/cm²의 밀도로 플레이팅되었다. GNP는 μM 범위의 다양한 금의 농도로 매질에 첨가되었다. 1시간 내지 24시간의 인큐베이션 이후에, 세포 상청액이 제거되었다. 그 후, 상기 세포들을 PBS로 간단하게 세척하여, 세포에 접착되지 않거나 내재화되지 않은 모든 GNP들을 제거하였다. 다음으로, 본 발명자들은 세포 트립신화를 수행하였으며, Haemocytometer를 사용하여 세포수를 카운팅하였다.

각 조건에 대해, 본 발명자들은 100000 세포/mL 내지 220000 세포/mL의 샘플을 채취하였으며, ICP-MS에 의해 금의 농도를 또한 분석하였다.

세포 수준에서 금(Au)의 농도(부피 당 금 원자의 수)는 μM로 표현된다.

이러한 파라미터는 하기 식에 따라:

세포 = 1

X(nmole로 표현됨) =

하기와 같이 표적세포 당 금(Au)의 농도로 또한 표현될 수 있다:

세포:Au = 1:X (여기서, X는 nmole로 표현됨).

(처리 조건에 따라 300 내지 1000 세포/웰의 밀도로) 다른 세포들을 플레이팅하여, 클론형성 분석을 수행하였다. 세포들이 플레이트에 부착되면, 조사하지 않거나(샴 대조군(sham control)), 또는 200 kVp X선 장치를 사용하여 2 Gy 및 4 Gy의 양으로 조사하였다. 상기 세포들이 성장하게 놔두어, 12일까지 콜로니가 형성된다. 그 후, 상기 콜로니들은 고정되고 크리스탈 바이올렛으로 염색되었으며, 하기 식을 사용하여 클론형성 생존 분획(SF: survival fraction)을 추산하기 위해 카운팅되었다(도 3a 및 3b 참조):

콜로니형성률(PE: plating efficiency)은, 조사 없이 형성된 콜로니의 수 대 파종된 세포의 수의 비율이다:

PE = 형성된 콜로니의 수 x 100 / 파종된 세포의 수

생존 분획(SF: surviving fraction)은 조사 이후의 생존 세포의 수준을 나타내며, 이는 대조군의 PE로 정규화(normalize)된다:

SF = 처리 이후에 형성된 콜로니의 수 / (파종된 세포의 수 * PE)

유효량 증대 인자(DEF: Dose Enhancement Factor)는, SF(방사선의 양 단독) / SF(동일한 양의 방사선에 의해 활성화된 금 나노입자)의 비율로서 산정된다.

금 샘플	세포 수준에서 금(Au)의 농도(μM) 표적세포 당 금(Au)의 농도 세포:Au = 1:X (X는 nmole로 표현됨)
	[Au] μM	mL 당 세포수	세포:Au = 1:X(nmole)
금-15
금-30
금-60
금-80
금-105	6	1.6×105	3.6×10-5
금 샘플	세포 수준에서 금(Au)의 농도(μM) 표적세포 당 금(Au)의 농도 세포:Au = 1:X (X는 nmole로 표현됨)
	[Au] μM	mL 당 세포수	세포:Au = 1:X(nmole)
금-15	12	1.3×105	9.5×10-5
금-30	17	1.3×105	13.1×10-5
금-60	16	2.2×105	7.3×10-5
금-80	17	2.0×105	8.5×10-5
금-105	17	1.3×105	13.6×10-5
금 샘플	세포 수준에서 금(Au)의 농도(μM) 표적세포 당 금(Au)의 농도 세포:Au = 1:X (X는 nmole로 표현됨)
	[Au] μM	mL 당 세포수	세포:Au = 1:X(nmole)
금-15	20	9.7×104	20.7×10-5
금-30	40	1.8×105	22.6×10-5
금-60	83	2.2×105	37.7×10-5
금-80	52	2.1×105	24.9×10-5
금-105	59	1.4×105	43.4×10-5
금 샘플	세포 수준에서 금(Au)의 농도(μM) 표적세포 당 금(Au)의 농도 세포:Au = 1:X (X는 nmole로 표현됨)
	[Au] μM	mL 당 세포수	세포:Au = 1:X(nmole)
금-15	130	1.4×105	92.0×10-5
금-30	148	1.4×105	108.3×10-5
금-60	95	1.5×105	61.9×10-5
금-80	119	1.8×105	65.4×10-5
금 샘플	세포 수준에서 금(Au)의 농도(μM) 표적세포 당 금(Au)의 농도 세포:Au = 1:X (X는 nmole로 표현됨)
	[Au] μM	mL 당 세포수	세포:Au = 1:X(nmole)
금-15
금-30
금-60	400	2.2×105	181.8×10-5
금-80
금-105

표 2는 실시예 1의 표 1에서 합성된 각각의 금 나노입자에 대해 HT29 암 세포와 인큐베이션된 다양한 금(Au)의 농도에 대해, 세포 수준에서 금의 농도(μM)[또는 표적세포 당 금의 농도(세포:Au = 1:X (X는 nmole로 표현됨)]를 나타낸다.

상기 표 3a에는, 세포 수준에서 금의 농도가 20μM 미만일 때[또는 이에 상응하는 표적세포 당 금의 농도가 15*10^-5nmole 미만일 때(세포:Au ≤ 1:15*10^-5nmole)], 실시예 1의 금 나노입자의 4 Gy 조사량에 대해 얻어진 DEF 값이 기재되어 있다.

상기 표 3b에는, 세포 수준에서 금의 농도가 20μM 내지 83μM일 때[또는 이에 상응하는 표적세포 당 금의 농도가 20×10^-5nmole 내지 45×10^-5nmole일 때(1:20×10^-5nmole ≤ 세포:Au ≤ 1:45×10^-5nmole)], 실시예 1의 금 나노입자의 4 Gy 조사량에 대해 얻어진 DEF 값이 기재되어 있다.

상기 표 3c에는, 세포 수준에서 금의 농도가 95μM 내지 148μM일 때[또는 이에 상응하는 표적세포 당 금의 농도가 60×10^-5nmole 내지 110×10^-5nmole일 때(1:60×10^-5nmole ≤ 세포:Au ≤ 1:110×10^-5nmole)], 실시예 1의 금 나노입자의 4 Gy 조사량에 대해 얻어진 DEF 값이 기재되어 있다.

결론

놀랍게도, DEF 값의 역치는 입자 크기 ≥ 80 nm의 금 나노입자에 대해 관찰된다(도 5a 및 5b 참조).

실시예 3: 시험된 각각의 금 나노입자의 X선 감쇠용량(attenuation capacity)이 세포 수준에서 일정할 때, 시험관내 효능에 대한 금 나노입자 크기의 영향

프로토콜: X선 감쇠 측정

금의 농도([Au] g/L로 표현됨)가 다른 금 나노입자들이 200μL 튜브에서 제조되었으며, 주문설계된 폴리스티렌 홀더에 놓여졌다.

μCT는 애노드 전압 및 전류가 각각 50 KV 및 450 μA인 General Electric Locus μCT 시스템을 사용하여 수행되었다.

스캐닝은 90 μM 등방성 해상도 모드(isotropic resolution mode)를 사용하여 수행되었다.

관심대상인 원통형의 작은 영역을 각각의 튜브의 중심에 대해 3D 이미지에 주의깊게 놓아두었으며, 금 나노입자 분산액을 포함하는 유체-충진 튜브의 감쇠 값을 측정하였다.

결론

15 nm 내지 105 nm에 포함되는 크기에 대해 금 나노입자의 크기가 얼마인지에 관계없이, 유사한 X선 감쇠 값이 관찰된다(도 6a 및 6b 참조). 이러한 결과는 80 nm 이상인 나노입자 크기에 대해 관찰되는 효능에 대한 역치 효과를 확인시켜준다. 상기 나노입자는 주어진 흡수 X선 에너지에 대해 세포 수준의 손상을 더 많이 발생시킬 수 있다(도 4a 및 4b 참조).

실시예 4: 시험관내 효능에 대한, 세포 수준에서 금 나노입자 편재화(localization)의 효과(종양 세포막과의 물리적 상호작용 및/또는 세포 흡수)

HT29 세포들이 적절한 세포수로 플레이팅되어, 처리에 따라 50 내지 200개의 콜로니들이 형성된다. 세포들이 부착되면, 50μM, 100μM 또는 400μM의 금이 5분 미만의 인큐베이션 시간(인큐베이션되지 않음) 또는 12시간의 인큐베이션 시간과 함께 첨가된다. 입자 크기가 60 nm인 금 나노입자(실시예 1의 금-60)가 시험되었다. 세포들은 조사되지 않거나(샴 대조군(sham control)), 또는 200 kVp X선 장치를 사용하여 2 Gy 및 4 Gy의 양으로 조사되었다. 조사 이후에, 세포들은 37℃에서 10 내지 12일 동안 인큐베이션되었다. 클론들은 고정되고 크리스탈 바이올렛으로 염색되었으며, 클론형성 생존 분획을 산출하기 위해 카운팅되었다.

도 7a는 5분 미만 동안 금 나노입자(실시예 1의 금-60)와 인큐베이션된 HT29 세포의 4 Gy에서의 생존 분획(SF4)을 보여주며, 도 7b는 약 12 시간 동안 금 나노입자(실시예 1의 금-60)와 인큐베이션된 HT29 세포의 4 Gy에서의 생존 분획(SF4)을 보여준다.

DEF 금-60	50 μM	100 μM	400 μM
4 Gy, 5분 미만의 인큐베이션 시간	0.96	1.25	1.8
4 Gy, 12시간의 인큐베이션 시간	0.88	1	1.5

표 4는 5분 미만 또는 12시간의 인큐베이션 시간 동안 4 Gy에서 금의 농도 50μM, 100μM 및 400μM에 대한 금 나노입자(금-60)의 DEF를 나타낸다.

결론

상기 데이터는, 400 μM의 금 농도에 대해, 조사 이전에 세포와 5분 미만 동안 인큐베이션된 금 나노입자와 12 시간 동안 인큐베이션된 금 나노입자가 유사한 유의적인 DEF 값을 보여준다.

이러한 결과들은, 금 나노입자(GNP)가 GNP가 세포에 의해 내재화될 필요 없이 표적세포의 방사선 반응(radiation response)을 증대시킨다는 점을 입증한다. 실제로, 당업자에게 알려진 바와 같이, 생물학적 매질에 존재하는 나노입자의 약 50%의 세포 흡수를 허용하기 위해서는 2시간이 필요하다(예를 들어, Chitrani et al., 2006 참조).

금 나노입자가 암 세포와 접촉할 때, 유리하게는 방사선조사 하에서 암세포의 손상을 유도할 수 있다.

상기 실시예 1 내지 4의 실험결과들은, 만일 적절한 금속의 농도(이는 당업자에게 명백한 바와 같이 종양의 중량에 비례함)가 종양 부위상(금속성 나노입자의 세포 흡수는 앞서 입증된 바와 같이 필요하지 않음)에 존재한다면, 생체내에 투여될 때 치료효과의 증대를 유도하는 금속성 나노입자의 능력을 강조한다.

금속성 나노입자가 이온화 방사선에 노출될 때(예를 들어, 방사선요법을 통함) 효율적인 치료효과를 발생시키기 위하여, 입자의 크기가 약 60 nm인 금속성 나노입자를 사용할 때 요구되는 금속의 양에 비해, 입자의 크기가 80 nm 이상인 금속성 나노입자를 사용할 때에는 표적세포 당 유의적으로 더 작은 양의 금속이 요구된다.

이온화 방사선 하에서 효율적인 치료 효과를 발생시키기 위하여, 나노입자의 크기가 80 nm 이상인 금속성 나노입자의 사용은 표적세포 당 금속의 농도가 약 2 내지 7배, 특히 4 내지 7배 또는 2 내지 5배일 것이 요구되며, 이는 나노입자의 크기가 약 60 nm 이하인 금속성 나노입자를 사용할 때 요구되는 표적세포 당 금속의 농도보다 더 낮다.

이러한 금속성 나노입자는 생체내 사용에 있어서 유리한 것으로 나타난다.

나노입자의 가장 큰 크기의 평균이 80 내지 105 nm인 금속성 나노입자의 군은 특히 상기 나노입자들이 이온화 방사선에 노출될 때 치료법에서 유리하다. 실제로, 상기 나노입자는 특히 유효량 증대 인자(DEF: Dose Enhancement Factor)가 증대될 수 있도록 한다. 역치 효과(threshold effect)는, 가장 큰 크기가 바람직하게는 80 nm 이상, 더욱더 바람직하게는 약 80 nm 내지 105 nm인 본원의 나노입자에 대해 시험관내에서 관찰된다. 상기 나노입자는 감소된 표면적을 나타내고, 이는 생체적합성을 개선시켜주며, 결국 독성이 감소된다.

또한, 본원의 금속성 나노입자의 군은 종양의 클리어런스의 감소를 가져온다. 본 발명에 따른 조성물의 단일 주사는, 병원에서 현재 적용되는 다중 분할 조사 프로토콜의 측면에서 요구되는 치료 효과를 허용시켜준다.

참조문헌

Claims (12)

1. 양성 세포, 전-악성 세포 및 악성 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 포유류의 표적세포가 이온화 방사선에 노출될 때 상기 세포를 방해, 변형 또는 파괴하는 약학 조성물을 제조하기 위한 금속성 나노입자 군의 용도로서,
   상기 나노입자는 원자번호(Z)가 25 이상인 금속으로 구성되며, 상기 군의 나노입자의 가장 큰 크기의 평균은 약 80 내지 105 nm이며, 상기 금속성 나노입자는 생체적합성 코팅으로 도포된 것을 특징으로 하는 용도.
2. 제1항에 있어서,
   상기 금속이 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 주석(Sn), 지르코늄(Zr) 또는 철(Fe)로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
3. 제2항에 있어서,
   상기 조성물이 표적세포 당 약 10^-6nmole 내지 10^-3nmole의 금속을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 금속성 나노입자가 생물학적 조직 또는 세포의 특이적 표적화를 할 수 있는 표면 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 금속성 나노입자가 본질적으로 구형 또는 타원형인 것을 특징으로 하는 용도.
6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 이온화 방사선이 X선, γ선, 전자빔 및 방사성 동위원소 방출로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
7. 제6항에 있어서,
   상기 이온화 방사선이 약 50 KeV 내지 약 12000 KeV인 것을 특징으로 하는 용도.
8. 제6항에 있어서,
   상기 X선 방사선이 약 50 KeV 내지 6000 KeV인 것을 특징으로 하는 용도.
9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
   상기 악성 세포가 고형 종양의 세포인 것을 특징으로 하는 용도.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 약학 조성물이 금속성 나노입자의 군과 구별되는 암 치료용 부가적 치료 화합물을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 포유류의 세포가 인간 세포인 것을 특징으로 하는 용도.
12. 포유류의 표적세포가 이온화 방사선에 노출될 때 상기 세포를 변형 또는 파괴하는 약학 조성물로서,
    상기 약학 조성물은 금속성 나노입자 군 및 약학적으로 허용가능한 부형제를 포함하며, 상기 나노입자는 원자번호(Z)가 25 이상인 금속으로 구성되며, 상기 군의 나노입자의 가장 큰 크기의 평균은 약 80 내지 105 nm인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.

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