KR20120134501A

KR20120134501A - 키조개로부터 유래된 신규한 항균 펩타이드 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20120134501A
Application number: KR1020110053429A
Authority: KR
Inventors: 박윤경; 박성철; 박진순
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2011-06-02
Filing date: 2011-06-02
Publication date: 2012-12-12
Anticipated expiration: 2031-06-02
Also published as: KR101263452B1

Abstract

본 발명은 키조개(Korean pen shell, Atrina pectinata)에서 추출한 신규한 열 안정성 펩타이드에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명의 키조개에서 추출한 신규한 열 안정성 펩타이드는 그람 음성균에 대한 강력한 항균 활성을 나타내고 독성이 없으므로 본 발명의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균제, 화장품 보존제, 의약품 보존제 및 생물 농약으로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

키조개로부터 유래된 신규한 항균 펩타이드 및 이의 용도{Novel antibiotic peptide isolated from Atrina pectinata and use therof}

본 발명은 키조개(Korean pen shell, Atrina pectinata)로부터 분리한 항균 활성을 가진 신규한 열 안정성 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물에 관한 것이다.

식물이나 동물들은 항균제 기능의 펩타이드를 자연적으로 생산하는 것으로 알려져 있다[Bevins et al., Ann . Rev . Biochem., 1990, 59, 395-414]. 이러한 펩타이드의 항균작용은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로[Boman, H. G., Cell, 65, 205, 1991; Boman, H. G., Annu. Rev. Microbiol., 13, 61, 1995], 이러한 항균기능의 펩타이드들은 아미노산 서열에 따라 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-쉬트(sheet) 펩타이드, α-회전형(helical) 양친화성 분자, 및 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드로 분류된다[Mayasaki et al., Int . J. Antimicrob. Agents, 1998, 9, 269-280]. 이 중에서 가장 많이 존재하는 구조는 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 분자이며, 곤충에서 발견된 세크로핀(cecropin)이 대표적인 항균 펩타이드 구조이다.

또한, 생체 내에서 생산되는 상기 펩타이드 이외에 박테리오신(bacteriocin)이란 단백질 역시 주변의 동종 또는 이종의 세균들과 경쟁하기 위해 분비되어 유해 세균을 죽이는 항생물질로서의 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 이러한 박테리오신은 구조에 따라, 란티바이오틱스(lantibiotics), 비란티바이오틱스(nonlantibiotics) 및 신호 펩타이드(signal peptide)의 세 부류로 분류된다[Cintas et al., J. Bad ., 1998, 180, 1988-1994]. 이러한 생체 내에서 생성되면서 항생 기능을 수행하는 펩타이드 또는 박테리오신은 기존의 항생제가 화학물질로 이루어져 유발되는 항생물질로 인한 항생제 내성, 항생제 쇼크 등의 문제점을 해소할 수 있다.

따라서, 기존의 항균제를 천연 항균제 개발로 대체하려는 노력이 꾸준히 진행 되어 오고 있다. 여기서, 천연 항균제라 함은 천연소재 또는 미생물로부터 선택되어 생화학적 또는 생리학적 차이를 극대화하여, 바이러스, 세균, 효모, 곰팡이 등을 선택적으로 제어하고, 인체에 무해하거나 독성을 최소한으로 낮춘 항균제를 말한다. 현재 보고된 천연 항균제로는 편백나무에서 희노키티올, 목련에서 메그노놀, 자몽 종자 추출물인 DF-100등이 있으나, 현재 사용되는 규모는 매우 미미하다.

최근, 천연 허브추출물이 세포 증식 기작을 억제하여 미생물에 대한 살균 효과가 크고, 식물성 천연 살균 소독제로서 독성이 없고, 부식성이 없어 인체에 무해한 안전한 천연 항균제로 보고된 바 있으나, 재배 규모가 작거나, 다수가 외래종으로서 국내에서 재배하기에 까다로운 문제점 등으로 인하여 천연 항균제로서 활용하는 데에는 한계가 있다.

키조개(Korean pen shell, Atrina pectinata)는 사새목 키조개과의 연체동물로 주로 우리나라 동해 및 남해와 일본에 분포되어 있고, 내해나 내만의 조간대의 수심 5 내지 50 m의 진흙에 살며, 전체적으로 삼각형의 형태를 하고 있는 대형 패류이다. 키조개는 단백질과 글리코겐이 풍부하고 지질과 수분함량이 낮아 쇠고기에 비하여 성인병을 유발할 가능성이 작고, 베타인(betaine)류 특히, 베타-알리민베타인(β-alaminebetaine)이 풍부하게 포함되어 있는 것으로 알려져 있어, 오히려 성인병이나 대사질환의 예방효과가 있는 것으로 보고되어 있다.

이에, 본 발명자들은 생물소재인 키조개(Korean pen shell, Atrina pectinata)를 출발물질로 하고, 특히 키조개로부터 추출, 가열, 분리 및 정제하여 신규한 열 안정성 펩타이드를 획득하고, 상기 열 안정성 펩타이드가 그람 음성균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내고 사람의 적혈구에서 용혈 활성을 측정한 결과, 세포독성이 없는 것을 확인하여 천연 항균제로서의 기능을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 키조개(Korean pen shell, Atrina pectinata)로부터 분리한 열에 안정한 신규한 항균 펩타이드를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균 펩타이드를 이용한 항균용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 키조개(Korean pen shell, Atrina pectinata)로부터 분리한 신규한 항균 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 건강식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 생물 농약을 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 의약품, 화장품, 식품 또는 사료 보존용 방부제를 제공한다.

본 발명의 키조개(Korean pen shell, Atrina pectinata)로부터 분리한 신규한 펩타이드는 그람 음성균에 대한 우수한 항균 활성을 나타내며, 사람의 적혈구에서 용혈 활성을 측정을 통한 세포독성이 전혀 없는 것을 확인하였으므로, 이를 이용한 약학적 조성물, 화장료 조성물, 건강식품, 농약, 식품방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있다.

도 1a는 50% 메탄올을 이용하여 추출한 키조개의 전체 단백질을 트리신(Tricine) SDS-PAGE 전기영동 분석 결과로 앞쪽의 밴드는 사이즈 마커(size marker), 뒤쪽의 밴드는 추출한 단백질(10 ㎍)을 나타내는 도이다.
도 1b는 본 발명의 추출 단백질을 대장균(Escherichia coli)에 대하여 항균 활성을 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 70℃에서 20분간 가열한 상기 추출 단백질을 크기별로 분획한 뒤 트리신 SDS-PAGE를 통해 확인한 결과로 기호 M은 사이즈 마커(size marker), 기호 1은 열 안정성 단백질, 기호 2는 10 kDa 이상의 분획물 및 기호 3은 10 kDa 이하의 분획물을 나타낸 도이다.
도 2b는 열 안정성 단백질과 분획한 단백질을 pH이 다른 조건에서 항균 활성을 확인한 것으로 1번은 대조군(무 처리), 2번은 추출한 분획물(50 ㎍), 3번은 열 안정성 분획물(25 ㎍), 4번은 10 kDa 이상의 분획물(25 ㎍) 및 5번은 10 kDa 이하의 분획물(25 ㎍)을 나타낸 도이다.
도 3은 열 안정성 펩타이드를 RP(Revers Phase)-HPLC를 이용해 확인하고 이를 분리해 트리신 SDS-PAGE를 이용하여 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 MALDI-TOF/MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)를 이용하여 분자량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5는 네 개의 균에 펩타이드를 무 처리(1번), 1 ㎍(2번), 2 ㎍(3번) 및 4 ㎍(4번) 처리하여 항균 활성능력을 투명환을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 키조개 유래 신규한 열 안정성 펩타이드가 사람의 적혈구 세포에 대한 세포 파괴정도(Hemolytic)를 측정한 결과를 나타낸 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 키조개(Atrina pectinata )로부터 분리한 항균 펩타이드를 제공한다.

상기 키조개는 재배한 것, 시판되는 것 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 펩타이드는 열 안정성을 가지는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

본 발명의 한가지 측면에서, 키조개로부터 펩타이드를 깨끗하게 분리하기 위하여 HPLC를 이용하였고, 분리된 펩타이드는 트린신(Tricine) SDS-PAGE 법에 의해 확인하였다(도 3 참조).

본 발명의 한가지 측면에서, 상기 키조개 유래 펩타이드 분리 과정에 있어서, 가열 전 및 후의 분획의 대략적인 크기 및 항균 활성을 확인하기 위하여, 한천배지 도말법 및 트린신 SDS-PAGE 법에 의한 분자량을 비교한 결과, 가열 전에도 항균 활성을 나타내었고(도 1 참조), 10 kDa 이하의 분획물이 10 kDa 이상의 분획물보다 pH 5.4에서 활성이 좋음을 확인하였다(도 2 참조).

본 발명의 한가지 측면에서, 본 발명의 신규한 펩타이드의 분자량을 확인하기 위하여 MALDI-TOF/MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)를 이용하여 분자량을 확인한 결과, 본 발명의 키조개 유래 펩타이드는 약 4.6 kDa 분자량을 가지는 것을 확인하였다(도 4 참조).

본 발명의 한가지 측면에서, 본 발명의 펩타이드의 다양한 균에서 항균 활성을 확인하기 위하여, 다양한 균에 본 발명의 펩타이드를 처리한 후, 항균 활성을 확인한 결과, 대장균에서 가장 활성이 좋고, 다음으로 대장균 O157, 슈도모나스에서 활성이 좋았으며, 농도가 높을수록 활성이 좋음을 확인하였다(도 5 참조).

본 발명의 한가지 측면에서, 본 발명의 신규한 펩타이드의 세포독성을 확인하기 위하여, 적혈구 용혈 활성을 측정한 결과, 적혈구 세포들이 전혀 파괴되지 않는 결과를 확인함으로써, 세포독성이 없음을 확인하였다(도 6 참조).

따라서, 본 발명의 신규한 펩타이드는 항균활성을 나타내고, 세포독성이 없으므로 인체에 안전한 항균제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 펩타이드는 하기의 분리 방법에 의해 분리되는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

1) 키조개를 동결건조한 후 분말로 분쇄하는 단계;

2) 단계 1)의 분말을 유기용매로 추출하여 추출물을 제조하는 단계;

3) 단계 2)의 추출물을 원심분리하여 추출물의 상층액 분획을 회수하는 단계;

4) 단계 3)의 상층액 분획을 가열한 후 원심분리하여 열에 안정한 상층액 분획을 회수하는 단계; 및

5) 단계 4)의 분획을 크로마토그래피 및 투석을 이용하여 분리 및 정제하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 키조개는 재배한 것, 시판되는 것 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 동결건조는 액체 질소를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 2)의 유기용매는 30% 내지 80%(v/v) 메탄올수용액인 것 바람직하고, 50%(v/v) 메탄올수용액인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 4)의 가열은 60℃ 내지 80℃로 가열하는 것이 바람직하고, 70℃인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

상기 단계 4)의 가열 후 추출물의 상층액 분획에서 활성분획을 분리하는 방법으로 C-₁₈HPLC를 사용하는 것이 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 상기 키조개로부터 분리한 신규한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 약학적 조성물은 대장균, 대장균 O157, E.사카자키(Enterobacter sakazakill), P.에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 S.티피무리움(Salmonella typhimurium)에 대하여 항균활성을 갖는 것이 바람직하고, 대장균인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

따라서, 본 발명의 신규한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 항균활성을 나타내고, 세포독성이 없으므로 인체에 안전한 항균제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 신규한 펩타이드는 임상투여시 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 신규한 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명의 신규한 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 텍스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 신규한 펩타이드의 유효용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 신규 펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single does)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple does)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

또한, 본 발명은 본 발명의 신규한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물을 제공한다.

따라서, 본 발명의 신규한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물은 항균활성을 나타내고, 세포독성이 없으므로 인체에 안전한 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 화장료 조성물은 유효성분으로 상기 신규한 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들이 포함되며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파리핀, 전분, 트라킨트, 셀롤로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리켈이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소리비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 신규한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 건강식품을 제공한다.

상기 건강식품은 대장균, 대장균 O157, E.사카자키(Enterobacter sakazakill), P.에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 S.티피무리움(Salmonella typhimurium)에 대하여 항균활성을 갖는 것이 바람직하고, 대장균인 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

따라서, 본 발명의 신규한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 건강식품은 항균활성을 나타내고, 세포독성이 없으므로 인체에 안전한 건강식품으로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 본 발명의 신규한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 생물 농약을 제공한다.

상기 생물 농약은 그람 양성균에 대하여 항균 활성을 갖는 것이 바람직하고, 대장균, 대장균 O157, E.사카자키(Enterobacter sakazakill), P.에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 S.티피무리움(Salmonella typhimurium)에 대하여 항균활성을 갖는 것이 보다 바람직하고, 대장균인 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.

또한, 본 발명은 본 발명의 신규한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 의약품, 화장품, 식품 또는 사료보존용 방부제를 제공한다.

식품의 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 식품이나 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 식품의 방부제 및 화장품, 의약품 보존제의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다. 농작물의 병충해를 박멸하기 위한 농약 역시 해로운 미생물의 증식을 억제하고 인체에 무해하여야 사람이 농약을 살포한 농작물을 안전하게 섭취할 수 있다.

따라서, 본 발명의 신규한 펩타이드는 강력한 항균 활성을 나타내고 독성이 없으므로 생물 농약, 식품의 방부제, 화장품 및 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예를 통하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 키조개( Korean pen shell , Atrina pectinata )로부터 단백질 추출

키조개(Korean pen shell, Atrina pectinata)(장흥 키조개 정보화 마을) 200g을 액체 질소(Liquid nitrogen)를 통해 얼린 뒤 분쇄기로 분쇄한 후, 상기 분말을 4℃에서 3시간 동안 50% 메탄올 수용액(400 ml)에 첨가하여 잘 혼합하였다. 이후 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 추출물의 상층액 분획을 회수하였다. 이 상층액을 70℃에서 가열하고 다시 12,000 rpm에서 20분 동안 원심분리하여 열에 안정한 상층액 분획을 회수한 다음, 10 kDa 크기의 물질이 통과 가능한 막을 통해 크기별로 분리하여 2.21 mg를 최종 수득하였다.

< 실시예 2> 펩타이드의 분리

상기 <실시예 1>에서 수득한 추출액은 트리신(Tricine) SDS-PAGE(Tricine Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)을 수행하였다. 이때, 상기 추출액 및 표준단백질은 16.5% 트리신 아크릴아마이드 젤(Tricine Acrylamide gel)에 로딩하였다. 전기영동 후, 젤을 5% 글루타르알데히드(glutaraldehyde)로 고정시키고, 쿠마시 브릴러언트 블루(coomassie brilliant blue) G-250으로 염색하고, 탈색 버퍼(destaining buffer)(10% 아세트산)로 탈색하여 단백질의 밴드를 확인하였다.

그 결과, 키조개에서 추출한 최초 분획물에 대한 트리신 SDS-PAGE 전기영동 분석결과, 도 1a와 같이 나타내어 졌고, 최초 분획물을 가열 후 크기별로 분리하여 트린신 SDS-PAGE 전기영동 분석결과, 도 2a와 같이 나타내어졌다(도 1a 및 도 2a).

< 실시예 3> 펩타이드의 정제

상기 <실시예 2>로부터 수득한 키조개 유래 펩타이드를 C₁₈ column(5 μm, 300 Å, 4.6 x 250 mm, Vydac, 미국) 역상 HPLC(Reverse Phase HPLC)(Shimadzu, 일본)를 이용하여 정제하였다. 이때, 도 3에 나타낸 바와 같이, 완충용액(0.1% TFA가 포함된 아세토아니트릴 B)의 기울기(linear gradient, 10-60%, 1 ml/min, 50 min)에 의해 용출하였다(도 3).

또한, 상기 단계로부터 수득한 키조개 유래 펩타이드를 MALDI-TOF/MS(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry)를 이용하여 분자량을 측정하였다.

그 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 상기 키조개 유래 펩타이드는 약 4.6 kDa 의 분자량을 가지는 것을 확인하였다.

< 실시예 4> 펩타이드의 항균 활성 측정

상기 단계로부터 수득한 키조개에서 유래한 펩타이드의 항균 활성을 측정하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.

구체적으로 다양한 균에 대한 항균 활성을 측정하기 위하여, 균수는 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 각 웰당 5 x 10⁵ 셀이 되도록 희석하여 균을 포함한 인산나트륨 배지 50 ㎕를 펩타이드가 포함된 플레이트에 분주한 후, 음성 대조군에는 펩타이드 대신 배지만을 분주하고 37℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양하였다. 이후, 항균 활성을 확인하기 위하여 600 nm에서 흡광도를 측정하였고(Molecular Devices Emax, 미국) 강력한 항균 활성을 가진다고 알려진 멜라틴(melittin)과 비교한 결과를 하기 <표 1>에 나타내었다.

pH 5.2 와 7.2에서 다양한 균에 대한 항균활성측정
박테리아	생육 최소저해농도 (㎍/ml)
	키조개유래 펩타이드		멜라틴(Melittin)
	pH 5.2	pH 7.2	pH 5.2	pH 7.2
그림 음성균
대장균	20	160	6	6
대장균 O157	20	160	6	6
E. 사카자키	40	160	6	6
P. 에루기노사	40	>160	12	6
S. 티피무리움	80	>160	12	12
그람 양성균
S. 아우레우스	>160	>160	6	6
L. 모노사이토젠스	>160	>160	12	12

또한, 한천배지 도말법을 사용하여 항균활성을 확인하였다.

구체적으로 0.03% 배지가 포함된 1% 아가로스 배지에 5 x 10⁵ 대장균을 넣고 페트리디시에 붓고 굳힌 다음, 구멍을 낸 곳에 8 μl의 키조개 유래 펩타이드를 넣고 37℃ 배양기에서 3 시간 동안 배양하였다. 이후 6% 배지와 1% 아가로스가 포함된 젤을 위에 부어준 후 37℃ 배양기에서 24 시간 동안 배양하고, 상기방법과 동일한 방법으로 대장균만 분주된 음성 대조군과 비교하였다.

그 결과, 도 1b에 나타낸 바와 같이 대장균만 분주한 음성 대조군과 대장균에 항균 펩타이드를 처리한 실험군과의 생육 정도를 확인한 결과, 키조개 유래 펩타이드의 항균활성을 확인하였다(도 1b).

또한, 열 안정성 단백질과 분획한 단백질을 pH 7.2, pH 5.2의 조건에서 대장균에 항균활성을 확인한 것으로, 1번은 대조군(무 처리군), 2번은 추출한 분획물(50 μg), 3번은 열 안정성 분획물(25 μg), 4번은 10 kDa 이상의 분획물(25 μg) 및 5번은 10 kDa 이하의 분획물(25 μg)이고, 상기 한천배지 도말법의 방법과 동일하게 수행하였다.

그 결과, 도 2b에 나타낸 바와 같이, 10 kDa 이하에서, pH 5.2 조건에서 가장 활성이 좋음을 확인하였다(도 2b).

아울러, 10 kDa의 펩타이드를 4개의 균(대장균, 대장균 O157, 슈도모나스, 황색포도상구균)에서 활성을 상기 한천배지 도말법과 동일한 방법으로 수행한 후, 각각의 배지에 펩타이드를 무처리(1번), 1 μg(2번), 2 μg(3번) 및 4 μg(4번) 처리하여 항균활성 능력을 투명환을 통해 확인하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 10 kDa의 펩타이드를 4 개의 균에서 활성을 측정한 결과, 대장균에서 가장 활성이 좋고, 다음으로 대장균 O157, 슈도모나스에서 활성이 좋았으며, 농도가 높을수록 활성이 좋음을 확인하였다(도 5).

< 실시예 5> 적혈구 용혈 활성의 측정

상기 키조개 유래 펩타이드에 대하여, 사람의 적혈구 용혈 활성을 통하여 세포독성 여부를 판별하기 위하여 하기와 같이 실시하였다.

구체적으로 사람의 적혈구(human erythrocytes)를 PBS(phosphate-buffered saline: 35 mM 포스페이트 완충용액/0.15 M NaCl의 혼합용액, pH 7.0) 완충용액으로 3회 세척하고, PBS 완충용액으로 희석한 8.0% 적혈구 용액을 96-웰 마이크로적정 플레이트(microtiter plate)에 100㎕씩 로딩한 후, 상기에 상기 단계로부터 얻은 키조개 유래 열 안정성 펩타이드 용액을 100㎕씩 섞어 준 후, 37℃에서 1 시간 동안 배양한 후, 414 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 또한, 대조군으로서, 펩타이드인 멜리틴(melittin)에 동일하게 실시하였다. 이때, 0.1% 트리톤 X-100로 처리하였을 경우의 값을 100% 용혈도로 계산하고, 펩타이드의 용혈율, 즉 세포 파괴정도(hemolysis)는 하기 [수학식 1]에 의하여 산출하였다.

상기 식에서, 흡광도 A는 414 nm 파장에서 펩타이드 용액 처리시의 흡광도;

흡광도 B는 414 nm 파장에서 PBS 처리시의 흡광도; 및

흡광도 C는 414 nm 파장에서 1% 트리톤 X-100 처리시의 흡광도.

그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 키조개 유래 펩타이드가 사람의 적혈구 세포에 대한 세포 파괴정도(Hemolytic)를 측정한 결과, 비교 펩타이드인 멜리틴의 경우, 펩타이드 농도 4 μM에도 세포의 용혈율이 18%를 나타내며, 펩타이드 농도 15μM의 조건에서는 적혈구 세포들이 100% 파괴되었다. 반면에, 본 발명의 키조개 유래 펩타이드는 동일 농도 조건에서 실시한 결과, 적혈구 세포들이 전혀 파괴되지 않은 결과를 보임으로써, 세포독성이 전혀 없음을 확인하였다(도 6).

Claims

키조개(Atrina pectinata )로부터 분리한 항균 펩타이드.
제 1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 열 안정성을 가지는 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1항에 있어서, 상기 항균 펩타이드는 하기의 제조방법으로 제조되는 것을 특징으로 하는 펩타이드:
1) 키조개를 동결건조한 후 분말로 분쇄하는 단계;
2) 단계 1)의 분말을 유기용매로 추출하여 추출물을 제조하는 단계;
3) 단계 2)의 추출물을 원심분리하여 추출물의 상층액 분획을 회수하는 단계;
4) 단계 3)의 상층액 분획을 가열한 후 원심분리하여 열에 안정한 상층액 분획을 회수하는 단계; 및
5) 단계 4)의 분획을 크로마토그래피 및 투석을 이용하여 분리 및 정제하는 단계.
제 3항에 있어서, 상기 단계 2)의 유기용매는 50%(v/v) 메탄올수용액인 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 그람 음성균에 대하여 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균용 약학적 조성물.
제 6항에 있어서, 상기 그람 음성균은 대장균, 대장균 O157, E.사카자키(Enterobacter sakazakill), P.에루기노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 S.티피무리움(Salmonella typhimurium)으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 항균용 약학적 조성물.
제 1항에 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 화장료 조성물.
제 8항에 있어서, 상기 항균용 화장료 조성물은 그람 음성균에 대하여 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균용 화장료 조성물.
제 1항에 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 건강식품.
제 10항에 있어서, 상기 건강식품은 그람 음성균에 대하여 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는 항균용 건강식품.
제 1항에 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 생물 농약.
제 1항에 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 의약품, 화장품, 식품 또는 사료 보존용 방부제.