KR20130000369A

KR20130000369A - 단백질 어레이 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20130000369A
Application number: KR1020127010435A
Authority: KR
Inventors: 웨이-우 히; 동휘 마; 유민 슈; 자이렌 선
Original assignee: 오리진 테크놀로지스 인코포레이티드
Priority date: 2009-09-25
Filing date: 2010-09-23
Publication date: 2013-01-02
Also published as: AU2010298238A1; US20120231969A1; EP2480892A1; WO2011038138A1; CA2774615A1; US20110105712A1; US9255929B2; CN102803969A; IL218753A0; BR112012006678A2; JP2013506138A

Abstract

본 명세서에 개시된 예시적 실시양태는 특히, 단백질 어레이, 상기 어레이의 제조 방법 및 상기 어레이의 사용 방법에 관한 것이다. 일부 실시양태에서, 인간 게놈 내의 좌위의 50% 이상을 대표하는 공지된 단백질들이 지지체 상의 공지된 위치에 정렬된다. 일부 실시양태에서, 어레이는 상기 지지체에의 친화성 결합에 의해 세포 용해물로부터 정제된 단백질로 제조된다. 일부 실시양태에서, 단백질 어레이는 항체의 결합 특이성을 해독하는 데에 사용된다. 일부 실시양태에서, 단백질 어레이는 자가면역 질환을 진단하는 데에 사용된다. 많은 다른 실시양태들 및 일반적인 특징이 본 명세서에 개시된다.

Description

단백질 어레이 및 이의 용도{PROTEIN ARRAYS AND USES THEREOF}

관련 출원의 상호참조

본원은 온전히 그대로 본 명세서에 참고로 도입되는, 2009년 9월 25일자로 출원된 미국 가출원 제61/245,852호의 우선권의 이익을 주장한다.

분야

본 명세서에 개시된 실시양태는 단백질 어레이(array), 단백질 어레이의 제조 방법, 및 특히 연구 및 질환의 진단을 위한 상기 어레이의 용도의 분야에 관한 것이다.

I

단백질 어레이는 많은 단백질-기재 분석이 병렬로 수행될 수 있게 한다. 이것은 개개의 분석에 비해 크게 증가된 처리량을 제공한다. 이것은 전형적으로 분석 당 보다 적은 시약을 사용하고 또한 분석 당 보다 적은 시간을 요구한다. 그 결과, 어레이의 제작 비용이 고려되는 경우조차도 어레이는 일반적으로 분석 당 크게 감소된 비용을 제공한다. 또한, 어레이에서 다수의 분석의 동시적인 수행은 개개의 분석의 중복 및 다수의 방식으로 동일한 파라미터를 분석하는 능력을 제공함으로써 개개의 분석에 비해 결과의 정밀성 및 정확성을 개선시킨다. 또한, 전체 게놈 단백질 어레이는 프로테옴(proteome) 광범위 단백질-분자 상호작용을 검출할 가능성을 제공한다. 이러한 게놈 광범위 조사는 몇몇 두드러진 용도를 제시하자면 단백질-단백질 상호작용을 이해하고 항체 결합 특이성 및 교차반응을 해독하고 진단 및 환자 계층분류를 위한 생체마커를 확인하기 위한 강력한 수단일 것이다.

단백질 어레이의 여러 주요 형식이 기재되어 있다. 전상(forward phase) 단백질 마이크로어레이에서, 특정한 표적에 대한 잘 정의된 특이성을 갖는 포획 단백질은 어레이에서 정의된 위치에 고정화되고, 표적 화합물은 샘플과 어레이의 결합 위치 및 결합 강도에 의해 확인되고 정량된다. 전상 어레이의 1차 용도는 개개의 샘플을 조사하여 다수의 상이한 성분들의 존재 및 양을 동시에 결정하는 것이다. 한 전형적인 유형의 전상 어레이에서, 상기 어레이는 특정한 항원들에 대해 특이적인 일군의 항체로 제조되고, 상기 어레이는 샘플 중 이들 항체의 존재 및 양을 측정하는 데에 사용된다.

역상(reverse phase) 어레이에서, 일군의 샘플이 정렬된 후 확인 시약, 전형적으로 단일특이적 시약, 예컨대, 특정한 항원에 대해 특이적인 항체로 프로빙된다. 역상 어레이의 1차 용도는 한 성분(또는 기껏해야 몇몇 성분)의 존재 및 양에 대해 다수의 샘플을 특징규명하는 것이다. 역상 어레이의 예시적인 용도는 상이한 세포 유형들의 집합물에 대한 일련의 단일특이적 시약, 예컨대, 특정한 항원에 대해 특이적인 항체를 스크리닝하는 것이다.

현행 단백질 어레이 기술의 유형, 용도, 이점 및 단점을 기술하는 문헌[Joos and Bachmann (2009); "Protein microarrays: potentials and limitations," Frontiers in Biosciences 14: 4376-4385]; 문헌[Chan et al., (2004); "Protein microarrays for multiplex analysis of signal transduction pathways," Nature Medicine 10(12): 1390-396]; 문헌[Hartmann et al., (2009); "Protein microarrays for diagnostic assays," Anal. Bioanal. Chem. 393: 1407-1416]; 및 문헌[Caron et al., (2007); "Cancer Immunomics Using Autoantibody Signature for Biomarker Discovery," Molecular & Cellular Proteomocis 6.7: 1115-1122]을 포함하는 단백질 어레이에 대한 다수의 평론이 공개되어 있다. 추가 참고문헌들은 하기 단락 VII에 제공되어 있다.

종래 단백질 어레이는 전형적으로 비교적 적은 수의 정제된 단백질들을 포함하거나, 또는 다수의 이미 정렬된 DNA를 숙주 세포 내로 역 형질감염시키고 성장 및 형질감염된 DNA의 발현 후 상기 숙주 세포를 제자리(in situ)에서 용해시킴으로써 제조되었다. 전자 카테고리 내의 어레이들은 실제로 수득될 수 있는 단백질의 수, 즉 상기 어레이에서 각각의 단백질에 대해 극복되어야 하는 단백질 정제의 어려움에 의해 한정된다. 후자 카테고리 내의 어레이들은 형질감염 및 발현 결과의 불균일성, 및 제자리에서 표면 상에서 용해된 전면성장(confluent) 세포로부터 수득될 수 있는 한정된 단백질 밀도에 의해 한정된다. 이러한 이유 및 다양한 다른 이유로, 현재 사용가능한 단백질 어레이들은 다양한 한계점 및 단점을 갖고 있으므로, 개선된 단백질 어레이 및 현행 기술로 사용될 수 없는 기능성을 제공하는 어레이가 필요하다.

II

하기 번호 매겨진 단락들은 예시로서 제공되고 본 명세서에 개시된 본 발명의 많은 양태 및 실시양태 중 일부를 기술한다. 많은 다른 양태 및 실시양태들이 본 명세서에 기재되고 당업자에게 용이하게 자명할 것이다. 번호 매겨진 단락에서 어구 "상기 또는 하기"의 사용은 번호 매겨진 단락에 기재된 다양한 요소들이 임의의 방식으로 조합될 수 있음을 의미하고 임의의 이러한 조합에 대한 명백한 뒷받침을 제공하는 데에 사용된다. 본 출원인은 이처럼 약술된 조합물들 중 임의의 하나 이상을 본원에서 또는 임의의 후속 또는 관련 출원에서 보정에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 명확히 제시하고/하거나 주장할 권리를 유보한다.

1.01. 상응하는 복수의 단백질을 포함하는 복수의 세포 용해물을 지지체 상의 상응하는 복수의 위치에 도포하는 단계를 포함하는 단백질 어레이의 제조 방법으로서, 상기 복수의 단백질이 상응하는 복수의 외인성 DNA를 통해 상기 상응하는 복수의 세포 내에서 발현되는 것인 단백질 어레이의 제조 방법.

1.02. 단백질 P₁ 내지 P_n을 포함하는 용해물 L₁ 내지 L_n을 지지체 상의 위치 S₁ 내지 S_n에 도포하는 단계를 포함하는 단백질 어레이의 제조 방법으로서, 이때 각각의 용해물 L_x가 외인성 DNA D_x를 통해 그 내부에서 발현된 단백질 P_x를 포함하는 세포 C_x의 용해물이고 위치 S_x에 도포되고, P₁ 내지 P_n이 모두 서로 상이하고, S₁ 내지 S_n이 모두 서로 상이하고, n이 1 초과의 정수이고, x가 1 내지 n의 정수인 단백질 어레이의 제조 방법.

실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같이, x는 특히 본 명세서의 임의의 부분에 기재된 바와 같이 유전자, 좌위(loci) 또는 게놈 내의 단백질 코딩 영역의 분획(fraction)이다. 실시양태에서, 하기 본 명세서에 기재된 바와 같이, x는 유기체의 유전자, 좌위 또는 단백질 코딩 유전자의 세트 번호이다.

1.03. 단백질 P₁ 내지 P_n을 지지체 상의 위치 S₁ 내지 S_n에 도포하는 단계를 포함하는 단백질 어레이의 제조 방법으로서, 이때 각각의 단백질 P_x가 외인성 DNA D_x를 통해 세포 C_x 내에서 발현되고 위치 S_x에 도포되고, P₁ 내지 P_n이 모두 서로 상이하고, S₁ 내지 S_n이 모두 서로 상이하고, n이 1 초과의 정수이고, x가 1 내지 n의 정수인 단백질 어레이의 제조 방법.

1.04. 상응하는 복수의 단백질을 포함하는 복수의 용해물을 지지체 상의 상응하는 복수의 위치에 도포하여 상기 복수의 단백질의 어레이를 생성하는 단계를 포함하는 단백질 어레이의 제조 방법으로서, 이때 상기 용해물이 상응하는 복수의 세포 콜로니 또는 배양물 중의 복수의 단백질을 상기 콜로니 또는 배양물의 세포 내에서 상응하는 복수의 외인성 DNA를 통해 발현하는는 단계, 및 상기 복수의 세포 콜로니 또는 배양물 각각을 용해시켜 상기 상응하는 복수의 단백질을 포함하는 상응하는 복수의 용해물을 생성하는 단계를 포함하는 방법에 의해 생성되는 것인 단백질 어레이의 제조 방법.

1.05. 상응하는 복수의 세포 콜로니 또는 배양물 중의 복수의 2개 이상의 단백질을 상기 콜로니 또는 배양물의 세포 내에서 상응하는 복수의 외인성 DNA를 통해 발현하는 단계;

상기 복수의 세포 콜로니 또는 배양물 각각을 용해시켜 상기 상응하는 복수의 단백질을 포함하는 상응하는 복수의 용해물을 생성하는 단계; 및

상기 상응하는 복수의 단백질을 포함하는 상기 복수의 용해물을 지지체 상의 상응하는 복수의 위치에 도포하여 상기 복수의 단백질의 어레이를 생성하는 단계

를 포함하는 단백질 어레이의 제조 방법.

2.01. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 단백질이 상기 세포 내에서 상기 DNA를 통해 과다발현되는 것인 방법.

2.02. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 단백질이 상기 용해물 중에 고농도로 존재하는 것인 방법.

2.03. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 대조군 이외에 상기 단백질의 50, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 이상이 상기 세포 내의 총 단백질의 0.01, 0.025, 0.05, 0.10, 0.15, 0.25, 0.35, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00, 2.25, 2.50, 2.75, 3.00, 3.50, 4.00, 4.50, 5.00, 5.50, 6.00, 7.50, 10.0, 15.0 또는 20% 이상인 방법.

2.04. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 대조군 이외에 상기 단백질의 50, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 이상이 상기 세포 내에서의 상기 단백질의 임의의 내인성 발현보다 실질적으로 더 많은 양으로 상기 외인성 DNA를 통해 상기 세포 내에서 발현되는 것인 방법.

2.05. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 대조군 이외에 상기 단백질의 50, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 이상이 상기 세포 내에서의 상기 단백질의 임의의 내인성 발현보다 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0, 5.0, 7.5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1,000 또는 1,500배 이상인 양으로 상기 세포 내에서 상기 DNA를 통해 발현되는 것인 방법.

2.06. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 대조군 이외에 상기 단백질의 50, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 이상이 상기 용해물 중의 총 단백질의 0.01, 0.025, 0.05, 0.10, 0.15, 0.25, 0.35, 0.50, 0.75, 1.00, 1.25, 1.50, 1.75, 2.00, 2.25, 2.50, 2.75, 3.00, 3.50, 4.00, 4.50, 5.00, 5.50, 6.00, 7.50, 10.0, 15.0 또는 20% 이상인 방법.

2.07. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 대조군 이외에 상기 용해물의 50, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 이상에서 각각의 용해물 중의 각각의 단백질의 농도가 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 35, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 또는 900 ㎍/㎖ 이상이거나 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 35, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 또는 900 mg/㎖이상인 방법.

3.01. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 유기체의 게놈에 의해 코딩된 단백질의 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 98% 이상을 총체적으로 포함하는 것인 방법. 실시양태에서, 상기 유기체는 포유동물이다. 실시양태에서, 상기 유기체는 마우스, 래트, 양, 염소, 개 및 영장류 중 임의의 하나이다.

3.02. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 인간 게놈에 의해 코딩된 단백질의 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 98% 이상을 총체적으로 포함하는 것인 방법.

3.03. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 어레이가 유기체의 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000 또는 30,000개 이상의 상이한 좌위의 단백질을 포함하는 것인 방법.

3.04. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 어레이가 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000 또는 30,000개 이상의 상이한 단백질을 포함하는 것인 방법.

3.05. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 어레이가, 상기 단백질이 도포되는 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000 또는 30,000개 이상의 위치를 포함하는 것인 방법.

3.06. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 위치가 ㎠ 당 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,500, 10,000, 15,000 또는 20,000개 이상 존재하는 것인 방법.

3.07. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 도포된 용해물이 ㎠ 당 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,500, 10,000, 15,000 또는 20,000개 이상 존재하는 것인 방법.

3.08. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 도포된 상기 단백질이 ㎠ 당 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,500, 10,000, 15,000 또는 20,000개 이상 존재하는 것인 방법.

3.09. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, ㎠ 당 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,500, 10,000, 15,000 또는 20,000개 이상의 위치가 존재하고 상기 단백질이 상기 위치 중 50, 60, 70, 80, 90 또는 95% 이상에 도포되는 것인 방법.

3.10. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 반점(spot)의 직경이 10 내지 50 ㎛, 25 내지 75 ㎛, 50 내지 100 ㎛, 75 내지 150 ㎛, 100 내지 200 ㎛, 150 내지 250 ㎛, 200 내지 300 ㎛, 250 내지 350 ㎛, 300 내지 400 ㎛, 400 내지 500 ㎛, 500 내지 750 ㎛, 400 내지 800 ㎛ 또는 750 내지 1,000 ㎛인 방법.

3.11. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 특징부의 면적이 10 내지 50 ㎛², 25 내지 75 ㎛², 50 내지 100 ㎛², 75 내지 150 ㎛², 100 내지 200 ㎛², 150 내지 250 ㎛², 200 내지 300 ㎛², 250 내지 350 ㎛², 300 내지 400 ㎛², 400 내지 500 ㎛², 500 내지 750 ㎛², 400 내지 800 ㎛², 750 내지 1,250 ㎛², 1,000 내지 2,000 ㎛², 1,500 내지 3,000 ㎛² 또는 2,500 내지 5,000 ㎛²인 방법.

3.12. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 특징부(반점)의 중심 대 중심 간격이 5 내지 15 ㎛, 10 내지 20 ㎛, 15 내지 25 ㎛, 20 내지 40 ㎛, 25 내지 50 ㎛, 25 내지 75 ㎛, 50 내지 100 ㎛, 75 내지 150 ㎛, 100 내지 150 ㎛, 125 내지 175 ㎛, 150 내지 225 ㎛, 200 내지 250 ㎛, 225 내지 275 ㎛, 250 내지 350 ㎛, 300 내지 400 ㎛ 또는 400 내지 500 ㎛인 방법.

4.01. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 각각의 용해물 중의 단백질의 농도가 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 35, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 또는 900 ㎍/㎖ 이상 또는 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 35, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 또는 900 mg/㎖ 이상인 방법.

4.02. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 대조군 이외에 상기 용해물의 50, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 이상에 대해 용해물 단백질의 양이 상기 용해물의 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,500, 2,000 또는 2,500개 이상의 세포 내의 총 단백질의 양인 방법.

4.03. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 대조군 이외에 상기 단백질의 50, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 이상에 대해 외인성 DNA를 통해 발현된 상기 단백질의 양이, 상기 단백질이 발현된 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,500, 2,000 또는 2,500개의 세포 내에서 상기 외인성 DNA를 통해 발현된 상기 단백질의 양 중 임의의 양 이상인 방법.

5.01. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 세포가 진핵세포인 방법.

5.02. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 세포가 원핵세포인 방법.

5.03. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 세포가 HEK293, COS, CV1, BHK, CHO, HeLa, LTK 및 NIH 3T3 세포 중 임의의 하나 이상인 방법.

5.04. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 세포가 HEK293T 세포인 방법.

6.01. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 외인성 DNA 중 하나 이상이 상기 단백질 중 하나를 각각 코딩하는 것인 방법.

6.02. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 외인성 DNA 중 하나 이상이 상기 단백질 중 하나를 각각 코딩하고, 각각의 이러한 외인성 DNA에서 각각의 상기 단백질이 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA에 의해 코딩되는 것인 방법.

6.03. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 외인성 DNA 중 하나 이상이 상기 단백질 중 하나를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된, 상기 세포 내에서의 전사에 효과적인 시스(cis) 작용 요소를 포함하는 발현 구축물인 방법. 실시양태에서, 상기 시스 작용 요소는 프로모터를 포함한다.

6.04. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 외인성 DNA 중 하나 이상이 상기 단백질 중 하나를 코딩하는 DNA에 작동가능하게 연결된, 상기 세포 내에서의 전사에 효과적인 프로모터 (및 임의적으로 다른 시스 작용 유전 요소)를 포함하는 발현 구축물이고, 상기 하나 이상의 외인성 DNA 각각에서 상기 단백질을 코딩하는 상기 DNA가 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA인 방법.

6.05. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 프로모터가 CMV, SV40 또는 MMTV 프로모터 중 임의의 하나 이상인 방법.

6.06. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 외인성 DNA 중 하나 이상이 부착, 고정화, 포획, 정제, 검출 및/또는 정량 중 임의의 하나 이상에 효과적인 태그(tag) 서열에 정확한 판독 프레임(reading frame)으로 융합된, 상기 어레이용 단백질의 아미노산 서열을 실질적으로 포함하는 키메라 단백질을 코딩하는 것인 방법.

6.07. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 태그가 GST, HA, V5, HIS, DDK(또는 FLAG) 또는 myc 태그 중 임의의 하나 이상인 방법.

6.08. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 태그가 myc/FLAG 태그인 방법.

6.09. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 발현 구축물이 pCMV6-도입 발현 벡터인 방법.

6.10. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 외인성 DNA가 상기 단백질 어레이용 단백질을 코딩하는 내인성 유전자의 발현의 비상동성 재조합 활성화를 위한 구축물을 포함하는 것인 방법.

6.11. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 상기 외인성 DNA가 상기 어레이용 단백질을 코딩하는 내인성 유전자의 발현의 상동성 재조합 활성화를 위한 구축물을 포함하는 것인 방법.

7.01. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 지지체가 본 명세서의 임의의 부분에 기재되거나 나열된 임의의 지지체인 방법.

7.02. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 지지체가 니트로셀룰로스를 포함하는 것인 방법.

7.03. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 지지체가 니트로셀룰로스로 코팅된 유리 슬라이드를 포함하는 것인 방법.

8.01. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 지지체에의 도포 전에 용해물로부터 정제되는 것인 방법.

8.02. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 지지체에의 도포 전에 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 또는 99% 이상의 순도로 정제되는 것인 방법.

8.03. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 지지체에의 도포 전에 상기 지지체에 도포된 총 단백질의 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 또는 99% 이상이 되도록 정제되는 것인 방법.

8.04. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 지지체에의 도포 전에 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되는 것인 방법.

8.05. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 친화성 태그를 포함하고 지지체에의 도포 전에 상기 친화성 태그에 대해 특이적인 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되는 것인 방법.

8.06. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 펩티드 친화성 태그를 포함하고 지지체에의 도포 전에 상기 펩티드 친화성 태그에 대해 특이적인 친화성 크로마토그래피에 의해 정제되는 것인 방법.

8.07. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 DDK 친화성 태그를 포함하고 지지체에의 도포 전에 상기 DDK 태그에 대해 특이적인 항체를 사용하는 면역친화성 크로마토그래피에 의해 정제되는 것인 방법.

9.01. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 지지체에의 도포 후에 용해물로부터 정제되는 것인 방법.

9.02. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 지지체에의 도포 후에 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 또는 99% 이상의 균질한 순도로 정제되는 것인 방법.

9.03. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 지지체에의 도포 후에 지지체 상에 고정화된 총 단백질의 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98 또는 99% 이상이 되도록 정제되는 것인 방법.

9.04. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 지지체에의 도포 후에 외인성 DNA를 통해 발현된 단백질에 대해 특이적인 상기 지지체 상의 친화성 잔기(moiety)에 결합시키고 비결합된 물질을 제거함으로써 정제되는 것인 방법.

9.05. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 친화성 태그를 포함하고 지지체에의 도포 후에 상기 태그에 대해 특이적인 상기 지지체 상의 친화성 잔기에 결합시키고 비결합된 물질을 제거함으로써 정제되는 것인 방법.

9.06. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 펩티드 친화성 태그를 포함하고 지지체에의 도포 후에 상기 펩티드 태그에 대해 특이적인 친화성 잔기에 결합시키고 비결합된 물질을 제거함으로써 정제되는 것인 방법.

9.07. 상기 또는 하기에 따른 방법에 있어서, 단백질이 DDK 친화성 태그를 포함하고 지지체에의 도포 후에 상기 DDK 친화성 태그에 대해 특이적인 친화성 잔기에 결합시키고 비결합된 물질을 제거함으로써 정제되는 것인 방법.

10.01. 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이에 있어서, 상기 방법들 중 임의의 한 방법에 의해 제조된 단백질 어레이.

10.02. 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이에 있어서, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000 또는 30,000개 이상의 상이한 단백질을 포함하는 단백질 어레이.

10.03. 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이에 있어서, 유기체의 게놈의 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 21,000, 22,000, 23,000, 24,000, 25,000, 26,000, 27,000, 28,000, 29,000 또는 30,000개 이상의 상이한 좌위를 포함하는 단백질 어레이.

10.04. 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이에 있어서, 유기체의 게놈에 의해 코딩된 단백질의 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 98% 이상을 포함하는 단백질 어레이.

10.05. 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이에 있어서, 도포된 용해물이 ㎠ 당 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,500, 10,000, 15,000 또는 20,000개 이상 존재하는 것인 단백질 어레이.

10.06. 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이에 있어서, 상기 외인성 DNA를 통해 발현된 상기 단백질이 ㎠ 당 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,500, 10,000, 15,000 또는 20,000개 이상 존재하는 것인 단백질 어레이.

10.07. 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이에 있어서, 상기 단백질이 도포되는 위치의 25, 50, 60, 75, 80, 85, 90, 95, 99 또는 100% 이상에서 상기 외인성 DNA를 통해 발현된 상기 단백질의 양이, 상기 각각의 단백질이 발현된 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1,000, 1,500, 2,000 또는 2,500개의 세포 내에서 상기 외인성 DNA를 통해 발현된 상기 단백질의 양 중 임의의 양 이상인 방법.

10.08. 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이에 있어서, 정렬 마커를 포함하는 단백질 어레이.

11.01. 항체를 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이와 접촉시키는 단계 및 상기 항체와 상기 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 단백질에 대한 하나 이상의 항체의 항체 특이성 및/또는 교차반응을 측정하는 방법. 실시양태에서, 상기 단백질 어레이는 상기 또는 하기에 따른 게놈에 의해 코딩된 모든 단백질의 실질적인 분획을 포함한다.

11.02. 항체 제제를 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이와 접촉시키는 단계 및 상기 제제 중 항체와 상기 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 항체 제제의 하나 이상의 특이성 및/또는 하나 이상의 교차반응성을 측정하는 방법. 실시양태에서, 상기 항체 제제는 전체 세포 항혈청이다. 실시양태에서, 상기 단백질 어레이는 상기 또는 하기에 따른 게놈에 의해 코딩된 단백질의 실질적인 분획을 포함한다.

11.03. 항체 또는 항체 제제를 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계 및 이로써 측정된 상기 어레이와의 결합으로부터 상기 항체 또는 항체 제제에 특이적으로 결합된 단백질을 확인하는 단계를 포함하는, 항체 또는 항체 제제의 결합 특이성을 측정하는 방법. 실시양태에서, 상기 단백질 어레이는 상기 또는 하기에 따른 게놈에 의해 코딩된 단백질의 실질적인 분획을 포함한다.

11.04. 하나 이상의 건강한 개체로부터의 샘플 및 질환을 앓는 하나 이상의 병든 개체로부터의 샘플과 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계, 및 상기 건강한 개체로부터의 샘플의 결합과 상기 병든 개체로부터의 샘플의 결합에서의 차이로부터 상기 질환의 단백질 생체마커를 결정하는 단계를 포함하는, 질환의 단백질 생체마커를 결정하는 방법. 실시양태에서, 상기 단백질 어레이는 상기 또는 하기에 따른 게놈에 의해 코딩된 단백질의 실질적인 분획을 포함한다.

11.05. 하나 이상의 건강한 대상체로부터의 항체 함유 샘플 및 자가면역 질환을 앓는 하나 이상의 대상체로부터의 샘플과 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계 및 상기 건강한 대상체로부터의 샘플 중의 항체의 결합과 상기 자가면역 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플 중의 항체의 결합에서의 차이로부터 상기 자가면역 질환의 단백질 생체마커를 결정하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환의 생체마커를 결정하는 방법. 실시양태에서, 상기 단백질 어레이는 상기 또는 하기에 따른 게놈에 의해 코딩된 단백질의 실질적인 분획을 포함한다.

11.06. 하나 이상의 건강한 대상체로부터의 샘플 및 건강한 대상체에 존재하지 않는 항체의 존재를 특징으로 하는 질환을 앓는 하나 이상의 대상체로부터의 샘플과 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계, 및 상기 건강한 대상체로부터의 샘플 중의 항체의 결합과 상기 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플 중의 항체의 결합의 차이로부터 상기 질환의 단백질 생체마커를 결정하는 단계를 포함하는, 건강한 개체에 존재하지 않는 항체의 존재를 특징으로 하는 질환의 생체마커를 결정하는 방법. 실시양태에서, 상기 단백질 어레이는 상기 또는 하기에 따른 게놈에 의해 코딩된 단백질의 실질적인 분획을 포함한다.

11.07. 건강한 개체에 존재하지 않는 항체의 존재를 특징으로 하는 질환을 앓을 가능성이 있는 대상체로부터의 항체 함유 샘플과 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계 및 상기 샘플 중의 항체와 상기 어레이의 결합으로부터 상기 질환의 부재 또는 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 건강한 개체에 존재하지 않는 항체의 존재를 특징으로 하는 질환의 진단 방법. 실시양태에서, 상기 단백질 어레이는 상기 또는 하기에 따른 게놈에 의해 코딩된 단백질의 실질적인 분획을 포함한다.

11.08. 신호 전달 경로 단백질을 포함하는 샘플과 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 신호 전달 경로의 모니터링 방법으로서, 이때 상기 결합이 상기 단백질의 부재, 존재 및/또는 양을 표시하는 것인 방법. 실시양태에서, 상기 샘플은 전체 세포 용해물이다. 실시예에서, 상기 샘플은 외인성 DNA를 통한 단백질 발현이 상기 신호 전달 경로의 단백질을 변경시킬 수 있는 세포를 포함한다. 실시양태에서, 상기 단백질의 존재도, 번역 후 변형 및 안정성 중 임의의 하나 이상에서의 변화가 모니터링된다. 실시양태에서, 상기 단백질의 결합은 하나 이상의 단백질 특이적 항체를 사용하여 검출한다. 실시양태에서, 상기 단백질 어레이에의 결합은 외인성 DNA를 통해 발현된 단백질과 하나 이상의 신호 전달 경로의 내인성 단백질 사이의 기능적 연결을 해독하는 데에 사용된다. 실시양태에서, 여러 측정이 연속적으로 수행되고, 하나 이상의 신호 전달 경로에서 단백질 상태에서의 변화가 모니터링된다.

11.09. 소분자를 포함하는 샘플과 상기 또는 하기에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 상기 소분자와 단백질 사이의 상호작용을 측정하는 방법. 실시양태에서, 상기 소분자는 유기 소분자, 지방, 지방산, 지방산 에스테르, 지질, 당, 글리칸, 핵산, 폴리뉴클레오티드, 아미노산, 펩티드 또는 폴리펩티드 및 임의의 다른 소분자 중 임의의 하나 이상이다. 실시양태에서, 상기 소분자는 검출 표지로 검출가능하게 표지된다. 실시양태에서, 상기 소분자의 결합은 상기 어레이에 결합된 소분자에 결합하는 2차 작용제(agent)를 사용하여 검출한다.

III

단어, 용어 및 어구는 본 명세서에서 달리 정의될 수 있는 경우를 제외하고 당업자에게 이해되는 그들의 통상적인 의미에 따라 본 명세서에서 사용된다. 명료함을 위해, 일부 용어 및 어구의 예시적 설명이 이하에 기재된다. 이 예시적 설명은 본 명세서에 기재된 본 발명의 이해를 돕기 위해 배타적으로 기재되지만 본 발명을 한정하지 않고 어떠한 방식으로든 본 발명을 과도하게 한정하는 것으로 이해되어서는 안 된다.

용해물 L₁ 내지 L_n은 1부터 n까지 연속적으로 번호 매겨진 복수의 n개의 용해물을 표시하고, 이때 n은 2 이상이다. 용해물 중 일부는 동일할 수 있거나, 또는 용해물 모두가 상이할 수 있다.

세포 (일반적으로 세포의 집단) C₁ 내지 C_n은 1부터 n까지 연속적으로 번호 매겨진 복수의 n개의 세포(일반적으로 n개의 세포 집단)를 표시하고, 이때 n은 2 이상이다. 세포들 중 일부는 동일할 수 있거나, 또는 세포들 모두가 상이할 수 있다.

단백질 P₁ 내지 P_n은 1부터 n까지 연속적으로 번호 매겨진 복수의 n개의 단백질을 표시하고, 이때 n은 2 이상이다. 단백질들 중 일부는 동일할 수 있거나, 또는 단백질들 모두가 상이할 수 있다.

위치 S₁ 내지 S_n은 1부터 n까지 연속적으로 번호 매겨진 (일반적으로 어레이 내의) 복수의 n개의 위치를 표시하고, 이때 n은 2 이상이다. 단백질들 중 일부는 동일할 수 있거나, 또는 단백질들 모두가 상이할 수 있다. 단백질들 중 일부 또는 전부의 정체(identity)가 공지되어 있을 수 있거나 비공지되어 있을 수 있다.

DNA D₁ 내지 D_n은 1부터 n까지 연속적으로 번호 매겨진 복수의 n개의 DNA를 표시하고, 이때 n은 2 이상이다. DNA들 중 일부 또는 전부의 정체가 공지되어 있을 수 있거나 비공지되어 있을 수 있다.

이 표시들과 함께 사용되는 용어 "각각"(및 "상응하는")은 이들 사이의 상응성을 의미한다. 예를 들면, 위치 S₁ 내지 S_n에서 DNA D₁ 내지 D_n을 통해 단백질 P₁ 내지 P_n을 발현하는 세포 C₁ 내지 C_n의 용해물 L₁ 내지 L_n은 각각 위치 S₁에서 DNA D₁을 통해 단백질 P₁을 발현하는 세포 C₁의 용해물 L₁, 위치 S₂에서 DNA D₂를 통해 단백질 P₂를 발현하는 세포 C₂의 용해물 L₂ 등 내지 위치 S_n에서 DNA D_n을 통해 단백질 P_n을 발현하는 세포 C_n의 용해물 L_n을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 항체는 하기 단편을 포함하는 F(ab)₂ 및 F(ab) 단편을 포함하나 이들로 한정되지 않는 다중클론 및 단일클론 항체 및 이들의 유도체를 포함한다: 예를 들면, 문헌[Winter et al., (1991) Nature 349:293-299] 및 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같은 하이브리드(키메라) 항체 분자; 예를 들면, 문헌[Inbar et al., (1972) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 69:2659-2662] 및 문헌[Ehrlich et al., (1980) Biochem 19:4091-4096]에 기재된 바와 같은 Fv 분자(비공유 이종이량체); 예를 들면, 문헌[Huston et al., (1988) Proc Natl Acad Sci U.S.A. 85:5879-5883]에 기재된 바와 같은 단일쇄 Fv 분자(sFv); 이량체성 및 삼량체성 항체 단편 구축물; 예를 들면, 문헌[Pack et al., (1992) Biochem 31:1579-1584] 및 문헌[Cumber et al., (1992) J. Immunology 149B:120-126]에 기재된 바와 같은 미니바디(minibody); 예를 들면, 문헌[Riechmann et al., (1988) Nature 332:323-327], 문헌[Verhoeyan et al., (1988) Science 239:1534-1536] 및 1994년 9월 21일 공개된 영국 특허공보 제2,276,169호에 기재된 바와 같은 인간화된 항체 분자; 및 이러한 분자들로부터 수득된 임의의 기능성 단편, 예컨대, 항원 결합 성질을 보유하는 단편.

항원은 전형적으로 항체 T-세포 수용체 또는 다른 항원 결합 항체, T-세포 수용체 또는 다른 항원 결합 면역 시스템 분자에 결합함으로써 체내에서 면역반응을 유발하는 임의의 작용제를 의미하기 위해 본 명세서에서 광범위하게 사용된다. 항원은 전형적으로 하나 이상의 에피토프를 갖는다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 어레이는 일반적으로 분산된 위치들의 정돈된 정렬을 지칭한다. 단백질 어레이는 전형적으로 분산된 위치들에서의 단백질의 정돈된 정렬이다. 종종 단백질 어레이는 하나 이상의 위치에 배치된 단백질을 갖는 표면 상의 분산된 위치들의 한 세트를 포함한다. 전형적으로, 상기 위치들, 특히 단백질이 배치된 위치들은 상기 어레이에서 공지된 장소에 존재하고, 상기 위치들은 전형적으로 공간적 주소, 예컨대, 2 차원적 데카르트 좌표 시스템에서 x,y 좌표와 유사한 2 차원적 명칭을 갖는다. 명백하게는, 어레이는 임의의 원하는 기하구조로 만들어질 수 있고, 어레이에서 위치 및/또는 단백질의 유일한(unique) 장소를 나타내기 위해 다른 주소부여 방법이 사용될 수 있다. 실시양태에서, 어레이 내의 단백질의 일부 또는 전부는 공지된 단백질이다.

DNA는 천연 발생 DNA의 변형된 형태, 예컨대, 비일반적인 염기를 갖는 DNA 또는 혼입 표지를 갖는 DNA 또는 화학적으로 변형된 DNA를 포함하는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 본 명세서에서 많은 실시예 및 예시가 DNA의 관점에서 기재되어 있지만, 다른 폴리뉴클레오티드, 예컨대, RNA가 매우 동일한 방식으로 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, RNA가 숙주 세포 내로 도입되는 경우, 전형적으로 상기 RNA는 DNA로 전환되므로, 어구 "외인성 DNA를 통해 발현된"은 RNA의 도입으로부터 비롯된 발현을 포함한다.

DDK는 FLAG로서 상업적으로 공지된 펩티드 태그를 나타내기 위해 본 명세서에서 사용된다. 용어 DDK 및 FLAG는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.

에피토프는 항체에 의해 인식된(결합된) 항원의 개개의 특정한 특징부(예컨대, 구조적 특징부)이다. 항원은 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 상이한 항체들은 주어진 한 항원 상의 동일한 또는 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 단백질 항원 상의 에피토프는 아미노산 서열의 연속적 또는 불연속적 부분에 의해 정의될 수 있다.

재조합 단백질은 분자 클로닝 기법을 사용하여 제조한 단백질, 예컨대, 외인성 폴리뉴클레오티드, 예컨대, 외인성 DNA를 통해 발현된 단백질을 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 본 명세서의 임의의 부분에서 보다 더 상세히 논의되어 있는 바와 같이, 외인성 폴리뉴클레오티드를 통한 단백질의 발현은 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하거나, 또는 예컨대, 프로모터 활성화 또는 다른 방법으로 내인성 유전자의 증가된 발현을 일으키는 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입함으로써 일으킬 수 있다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 특이적 결합 파트너는 표적에 특이적으로 결합하는 작용제를 의미한다. 특이적 결합은 상기 작용제가 표적, 예컨대, 항원, 또는 항원 내의 에피토프를 다른 비표적 물질로부터 구별할 수 있음을 의미한다. 항원에 대해 특이적인 항체 및 상기 항원은 특이적 결합 파트너의 일례이다. 특이적 결합 파트너는 이 파트너가 전형적으로 비특이적 결합의 함수인 배경 노이즈(background noise)보다 높은 표적을 검출하는 데에 사용될 수 있다는 의미에서 특이적이다. 예를 들면, 단백질의 특이적 결합 파트너는 상기 단백질의 특정한 특징부, 예컨대, 서열 또는 위상적 구조를 검출할 수 있다. 특정한 특징부는 예를 들면, 아미노산의 정의된 순서 또는 정의된 화학적 잔기일 수 있다. 예를 들면, 단백질에 특이적으로 결합하는 항체는 단백질의 짧은 아미노산 서열에 대해 특이적일 수 있거나, 특정한 아미노산 변형, 예컨대, 티로신의 인산화(포스포티로신)에 대해 특이적일 수 있거나, 또는 특히 상기 단백질 내의 특정한 탄수화물 배열(글리칸 구조)에 대해 특이적일 수 있다.

지지체는 단백질이 도포되어 어레이를 형성할 수 있는 표면 제공 구조체를 의미하기 위해 본 명세서에서 광범위하게 사용된다. 전형적으로, 지지체는 고체이고 어레이를 제조하고 사용하기 위해 요구되는 조작에 대해 구조적으로 안정하다. 지지체는 하나 이상의 성분, 예컨대, 고체성을 위한 유리 슬라이드 및 단백질을 어레이 내에 고정화시키기 위한 니트로셀룰로스 "패드"를 가질 수 있다.

IV
도면 및 표의 간단한 설명
표 1은 본 명세서에 기재된 본 발명의 다양한 실시양태에 따라 어레이를 제조하는 일반적인 방법을 보여주는 개략적인 도면이다.
도 1은 중복 샘플 및 대조군의 배치도를 예시하는 서브어레이의 확대도와 함께 모듈 어레이 배치도를 보여주는 개략적인 도면이다.
도 2는 쇼트(Schott) 니트로셀룰로스로 코팅된 유리 지지체 슬라이드 상에서 중복적으로 반점화된 3720개의 용해물(모두 7500개의 반점)의 단백질 어레이를 보여준다. 도 2a는 총 단백질을 가시화하기 위해 콜로이드성 금으로 염색한 후 어레이를 보여준다. 도 2b는 각각의 용해물에서 외인성 DNA를 통해 발현된 단백질을 가시화하기 위해 항-FLAG 항체로 면역염색한 후 어레이를 보여준다.
도 3은 외인성 DNA를 통해 세포 내에서 단백질을 발현하기 위한 pCMV6-도입 발현 벡터의 개략적인 도면이다. 이 도면은 진핵세포 내에서의 강한 전사를 위한 CMV 프로모터, 진핵세포 내에서의 복제를 위한 SV40 기점, DDK-myc 태그 코딩 영역, 클로닝을 위한 다수의 제한 부위를 갖는 영역, 각각 진핵세포 및 원핵세포에서 항생제 내성을 부여하기 위한 가나마이신/네오마이신 내성 유전자, 진핵세포 내에서의 전사체 폴리아데닐화를 위한 폴리아데닐화 신호 및 진핵세포 내에서의 DNA 복제를 위한 fi 박테리아 복제 기점을 포함하는 벡터의 주요 작용기를 보여준다.
도 4는 쇼트 니트로셀룰로스로 코팅된 유리 지지체 슬라이드 상에서 중복적으로 반점화된 3720개의 용해물의 단백질 어레이와 특징규명된 항-p53 항체의 결합의 특이성을 보여준다. 도 4a는 각각의 용해물에서 외인성 DNA를 통해 결합된 단백질을 가시화하기 위해 항-FLAG 항체로 면역염색한 후 어레이를 보여준다. 도 4b는 항-p53 항체로 면역염색한 후 어레이를 보여준다. 화살표에 의해 강조된 1개의 양성 용해물이 존재한다. 교차반응은 전혀 검출되지 않았다. 도 4c는 p53 항체에 결합하는 반점을 함유하는 어레이의 구획의 확대된 이미지를 보여준다. 도 4c에서 상부 패널은 대조군 단백질의 희석 연속물을 포함하는 확대된 영역에서의 항-FLAG 면역염색을 보여준다. 도 4c의 하부 패널은 p53 항체에 결합하는 중복 반점(화살표로 강조되어 있음)의 반응을 보여준다.
도 5는 전체 세포 면역화에 의해 발생된 단일클론 항체를 해독하기 위한 단백질 어레이의 사용을 예시한다. 도 5a는 상기 단일클론 항체를 사용한 상기 어레이의 면역염색을 보여준다. 양성 신호는 점선 상자 및 화살표로 표시되어 있다. 삽입도는 화살표로 강조된 중복 E-캐드헤드린(Cadhedrin) I 양성 신호를 갖는 양성 영역을 고배율로 보여준다. 도 5b는 E-캐드헤드린 I에 대한 단일클론 항체의 특이성을 확인시켜주는 웨스턴 블롯 분석의 결과를 보여준다.
도 6은 단백질 용해물 어레이를 사용하여 유방암 생체마커를 확인하는 것을 예시한다.
좌측 패널은 유방암 환자로부터의 혈청을 사용하여 상기 어레이를 면역염색한 결과를 보여준다. 양성적으로 반응하는 영역들은 점선 상자로 표시되어 있고, 화살표로 강조되어 있으며 확대된 영역 A, B 및 C에서 확대되어 도시되어 있다.
우측 패널은 정상 대조군 혈청을 사용한 대조군 면역염색을 보여준다. 확대된 영역 A, B 및 C는 좌측 패널에서 도시된 확대된 영역 A, B 및 C에 상응한다. 대조군 혈청은 유방암 환자로부터의 혈청에 의해 면역염색된 위치를 면역염색하지 못하지만, 대조군 혈청 중 자가항체의 반응은 상기 어레이의 상이한 위치들에서 영역 C에서 관찰될 수 있다.
표 2는 용해물로부터 정제된 단백질을 사용하여 어레이를 제조하는 한 실시양태의 개략적인 도면이다. 실시양태에서, 단백질은 DDK 에피토프를 태그로서 포함하고 항-DDK 항체를 사용한 면역친화에 의해 정제된다.
도 7은 항-DDK 항체를 사용한 고처리 면역친화성 정제에 의해 10개의 무작위적으로 선택된 전체 세포 용해물로부터 정제된 10개의 myc-FLAG(DDK) 태그 포함 단백질의 SDS-PAGE에 의한 균질성을 보여준다.
표 3은 지지체 상에서의 단백질의 제자리 정제를 사용하여 어레이를 제조하는 한 실시양태의 개략적인 도면이다.
도 8은 지지체 상에서의 정제 단계를 사용하여 어레이를 제조하는 실시양태의 개략적인 도면이고, 이때 FLAG 태그 포함 단백질은 항-FLAG로 코팅된 지지체 상에 고정화되고 다른 단백질은 세척됨으로써 정제된 단백질의 어레이가 생성된다.
도 9는 항-FLAG 항체로 코팅된 니트로셀룰로스 지지체 상의 용해물로부터 FLAG 태그 포함 단백질을 지지체 상에서 면역친화성 정제로 정제하는 것을 보여준다. 도 9a는 항-FLAG 항체로 코팅된 지지체 상에서 제조된 어레이의 작은 영역을 보여준다. 도 9b는 항-FLAG 항체 코팅을 사용하지 않고 제조된 부합하는 어레이의 작은 영역을 보여준다. 도 9a 및 9b 둘 다에서 상부 삽입도는 상기 어레이의 이 부분에서 반점화된 myc를 가시화하기 위해 항-myc 항체를 사용한 면역염색을 보여주고, 하부 삽입도는 FLAG 태그를 포함하지 않는 단백질의 (비특이적) 결합을 표시하는 항-베타 액틴 항체를 사용한 면역염색을 보여준다.
[표 1]

[표 2]

[표 3]

V

본 명세서에 기재된 본 발명의 실시양태는 특히, 단백질 어레이, 단백질 어레이의 제조 방법, 단백질 어레이의 사용 방법 및 단백질 어레이를 혼입하는 장치를 제공한다. 일부 실시양태는 특히, 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 방법, 항체 특이성을 검증하고 교차반응하는 종을 확인하는 방법, 항체 특이성을 해독하여 생체마커를 확인하는 방법, 질환을 진단하는 방법 및 환자 집단을 계층분류하는 방법을 제공한다.

본 명세서에서 추가로 예시되는 바와 같이, 실시양태에서, 어레이 내의 단백질은 세포 용해물에 포함된다. 실시양태에서, 상기 용해물은 단백질이 외인성 DNA를 통해 발현되는 세포로부터 제조된다. 실시양태에서, 상기 용해물은 외인성 DNA를 통해 단백질을 과다발현하는 세포로부터 제조된다. 실시양태에서, 상이한 과다발현된 단백질을 포함하는 용해물은 상기 단백질들의 정체가 어레이 내의 그들의 위치에 의해 공지되도록 상기 어레이 내의 특정한 위치에 도포된다. 다양한 실시양태에서, 과다발현된 단백질들의 구조 및/또는 기능은 공지되어 있을 수 있거나 비공지되어 있을 수 있다. 실시양태에서, 외인성 DNA는 내인성 유전자의 과다발현을 활성화시킨다. 실시양태에서, 외인성 DNA는 단백질을 코딩한다. 실시양태에서, 외인성 DNA는 cDNA를 포함하고 상기 cDNA가 코딩하는 단백질의 과다생성을 일으킨다. 실시양태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 실시양태에서, 상기 세포는 인간 세포이다. 실시양태에서, 상기 단백질은 포유동물 단백질이다. 실시양태에서, 상기 단백질은 인간 단백질이다. 실시양태에서, 어레이는 정의된 수의 유전자를 포함한다. 실시양태에서, 어레이는 게놈, 예컨대, 인간 게놈에 의해 코딩된 단백질의 정의된 분획을 포함한다.

실시양태에서, 단백질은 고정화 전에 상기 용해물로부터 정제된다. 실시양태에서, 상기 단백질은 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질이고 면역친화성 정제에 의해 정제된 후 상기 어레이 내에 고정화된다. 실시양태에서, 상기 단백질은 FLAG 친화성 태그를 포함하고 항-FLAG 항체를 사용하는 면역친화성 정제에 의해 정제된다.

실시양태에서, 단백질은 친화성 시약으로 코팅된 지지체에의 결합에 의해 도포 후 제자리에서 용해물로부터 정제된다. 실시양태에서, 단백질은 친화성 시약에 결합하는 친화성 태그를 포함하는 융합 단백질이고, 상기 단백질은 상기 친화성 태그와 상기 친화성 시약 사이의 상호작용에 의해 상기 친화성 시약으로 코팅된 지지체에 특이적으로 결합되고, 용해물 중의 비결합된 단백질은 상기 지지체로부터 제거된다. 실시양태에서, 상기 친화성 태그는 FLAG 태그이고, 상기 친화성 시약은 항-FLAG 항체이다.

실시양태에서, 단백질 어레이는 단백질-단백질 상호작용을 측정하는 데에 사용된다. 실시양태에서, 어레이는 단백질이 특이적으로 결합하고/하거나 교차반응하는 단백질을 확인하고/하거나 결정하고/하거나 정량하는 데에 사용된다.

실시양태에서, 단백질 어레이는 특히, 다중클론 및 단일클론 항체 및 항체 유도체를 포함하는 항체의 특이성 및/또는 교차반응성을 측정하는 데에 사용된다. 실시양태에서, 어레이는 항체를 해독하기 위해, 즉 예컨대, 특히 항체가 결합하는 단백질이 공지되어 있지 않은 경우 항체가 결합하는 단백질을 확인하는 데에 사용된다.

실시양태에서, 단백질 어레이는 자가면역 혈청 중의 항체가 결합하는 단백질을 결정하는 데에 사용된다. 실시양태에서, 자가면역 질환은 임의의 하나 이상의 루푸스(Lupus), RA 또는 MS이다.

실시양태에서, 단백질 어레이는 건강 및/또는 질환의 자가면역 마커를 확인하는 데에 사용된다. 실시양태에서, 단백질 어레이는 건강 및/또는 질환의 자가면역 마커를 결정하는 데에 사용된다. 실시양태에서, 상기 자가면역 마커는 자가면역 질환 또는 암을 위한 마커이다. 실시양태에서, 상기 자가면역 질환은 임의의 하나 이상의 루푸스, RA 또는 MS이다.

실시양태에서, 단백질 어레이는 비단백질 물질과 단백질의 결합을 측정하는 데에 사용된다. 실시양태에서, 단백질 어레이는 비단백질 물질의 단백질 결합 파트너를 확인하는 데에 사용된다.

어레이 제조 방법

실시양태에서, 어레이는 단백질 집단의 각각의 단백질에 대해 상기 단백질을 포함하는 세포 용해물을 제조하고 상기 용해물을 지지체 상의 한 위치에 도포함으로써 형성되는데, 이때 각각의 단백질에 대한 용해물은 상이한 위치에 도포되고, 상기 용해물의 도포는 상기 지지체 상의 단백질의 어레이를 형성하고, 상기 단백질은 상기 용해물이 제조되는 세포 내에서 외인성 DNA를 통해 발현된다. 도 1은 본 발명의 실시양태에 따라 세포 용해물로부터 어레이를 제조하는 일반적인 방법을 보여준다. 도 1은 표 1에 기재된 실시양태의 일반적인 방법에 따라 제조된 2 차원적 단백질 어레이를 보여준다. 표 2는 단백질이 어레이를 형성하기 전에 용해물로부터 정제되는 실시양태에 따라 어레이를 제조하는 방법을 보여준다. 표 3은 단백질이 어레이를 형성한 후 제자리 친화성 정제 방법에 의해 정제되는 실시양태에 따라 어레이를 제조하는 방법을 보여준다.

본 명세서에 기재된 본 발명의 양태에서, 실시양태는 유기체의 게놈 내의 유전자에 의해 발현된 단백질의 실질적인 분획을 포함하는 어레이에 관한 것이다. 나아가, 일부 실시양태는 단백질이 지지체에의 도포 전에 숙주 세포 내에서 외인성 DNA를 통해 과다발현되는 어레이에 관한 것이다. 일부 추가 실시양태는 어레이 내의 단백질의 농도가 상기 단백질이 발현되는 숙주 세포 내의 상기 단백질의 농도보다 더 높은 어레이에 관한 것이고, 일부 실시양태는 어레이 내의 단백질의 농도가 상기 단백질을 외인성 DNA를 통해 발현하는 숙주 세포 내의 상기 단백질의 농도보다 더 높은 어레이에 관한 것이다.

본 명세서에 예시된 바와 같이, 실시양태에서 어레이의 제조 방법은 세포 내에서 외인성 DNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)를 통해 단백질을 발현하고 상기 세포를 용해시키고 용해물(또는 이로부터 정제된 단백질)을 지지체에 도포하여 어레이를 형성하는 임의의 적합한 방법을 사용할 수 있다. 다양한 예시적 실시양태에 따라 단백질을 발현하고 용해물을 제조하고 상기 용해물(또는 정제된 단백질)을 지지체에 도포하여 어레이를 형성하는 방법은 이하에 보다 상세히 기재되어 있고 실시예에 추가로 예시되어 있다.

어레이용 단백질

본 명세서에 기재된 본 발명의 실시양태에서 어레이용 단백질은 숙주 세포 내에서 외인성 폴리뉴클레오티드, 종종 DNA를 통해 수득된다. 실시양태에서, 상기 숙주 세포는 진핵세포이다. 실시양태에서, 상기 세포는 포유동물 세포이다. 실시양태에서, 상기 세포는 본 명세서의 임의의 부분에 추가로 논의되어 있는 바와 같이 인간 세포이다. 실시양태에서, 상기 숙주 세포 내에서 단백질을 발현하기 위한 폴리뉴클레오티드, 예컨대, DNA는 라이브러리의 구성원이다. 이와 관련하여, 용어 라이브러리는 폴리뉴클레오티드, 예컨대, DNA의 수집물 또는 세트를 의미한다. 실시양태에서, 라이브러리는 정의된 수의 유일한 좌위, 유전자, 단백질 코딩 유전자 또는 영역, 게놈, 예컨대, 포유동물 게놈, 예컨대, 마우스, 래트, 염소, 양, 돼지, 소, 말, 원숭이, 고릴라 또는 인간 게놈의 개방 판독 프레임(open reading frame) 등을 포함할 수 있다.

이와 관련하여, "좌위" 또는 "유전자 좌위"는 염색체 상의 구분되는 위치를 지칭한다. 유전자 좌위는 함께 스플라이싱될 수 있는 모든 가능한 엑손을 포함하는 게놈 내의 정의된 염색체 영역에 대한 뉴클레오티드 서열에 의해 정밀하게 맵핑된다. 대체 엑손 사용 및/또는 차등 스플라이싱으로 인해 단일 게놈 좌위로부터 1개 초과의 전사체가 유도될 수 있다. 따라서, 각각의 유일한 유전자 좌위는 동일한 유일한 유전자 좌위로부터 유도된 상이한 전사체에 대한 폴리뉴클레오티드를 각각 함유하는 다수의 발현 클론에 의해 나타내어질 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같이 단백질 포함 좌위라 함은 상기 단백질이 이를 코딩하는 좌위에 상응함을 의미한다.

인간 게놈에서 유전자, 단백질 코딩 유전자, 유일한 좌위 등의 총수는 진행되고 있는 연구의 대상이다. 예를 들면, 인간 유전자의 수를 기술하는 문헌[Nature 431, 931-945 (2004년 10월 21일)] 및 다른 논문들을 참조한다. NCBI는 본 명세서에서 기준 서열 수집물("RefSeq")로서 지칭되는 인간 게놈으로부터의 뉴클레오티드 서열의 포괄적이고 통합된 비중복된 세트를 유지한다. 꼼꼼하게 정리되고 연속적으로 갱신된 수집물은 예를 들면, 문헌[Pruitt KD, Katz KS, Sicotte H, Maglott DR, Trends Genet. 2000 Jan;16(1):44-47]; 문헌[Pruitt KD, Maglott DR, Nucleic Acids Res 2001 Jan 1;29(1):137-140]; 및 문헌[The NCBl handbook[인터넷]. Bethesda (MD): National Library of Medicine (US), National Center for Biotechnology Information, 2002 Oct. Chapter 17, The Reference Sequence (RefSeq) Project](웹사이트(http://ncbi.nlm.nih.gov/entrez)에서 사용가능함)에 기재되어 있다. 단백질을 발현하기 위한 폴리뉴클레오티드의 서열뿐만 아니라 좌위 및 유전자의 수도 RefSeq 및 다른 데이터베이스, 예컨대, 진뱅크(GenBank), 스위스프롯(SwissProt), 진시크(GenSeq), EMBL, 유니프롯(UniProt), ASD, IMGT, IPD 또는 IPI에 존재할 수 있다.

실시양태에서, 이러한 라이브러리는 게놈 내의 유일한 좌위의 실질적인 부분, 예컨대, 게놈, 예컨대, 인간 게놈 내의 유일한 좌위의 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 또는 99%(및 이들 사이의 값) 이상을 포함한다. 실시양태에서, 이러한 라이브러리는 게놈 내의 유전자의 실질적인 부분, 예컨대, 게놈, 예컨대, 인간 게놈 내의 유전자의 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 또는 99%(및 이들 사이의 값) 이상을 포함할 수 있다. 실시양태에서, 이러한 라이브러리는 게놈 내의 유전자의 실질적인 부분, 예컨대, 게놈, 예컨대, 인간 게놈 내의 단백질 코딩 유전자의 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97 또는 99%(및 이들 사이의 값) 이상을 포함할 수 있다.

실시양태에서, 이러한 라이브러리는 특정된 수의 유일한 좌위, 유전자, 단백질 코딩 유전자, 개방 판독 프레임 등, 예컨대, 5,000, 6,000, 7,000, 8,000, 9,000, 10,000, 11,000, 12,000, 13,000, 14,000, 15,000, 16,000, 17,000, 18,000, 19,000, 20,000, 21,000, 22,000, 24,000, 26,000, 28,000, 30,000, 35,000 또는 40,000개 이상의 좌위, 유전자, 단백질 코딩 유전자, 개방 판독 프레임 등에 대한 폴리뉴클레오티드, 예컨대, DNA를 포함한다.

서브어레이

실시양태에서, 단백질 어레이는 단백질이 세포 주기 동안 또는 발생 동안 발현되는 경우, 단백질이 유기체 내에서 발현되는 경우, 또는 단백질이 세포 내에 위치하는 경우 특정한 일반적인 단백질 특징, 예컨대, 기능적 또는 구조적 특징, 주어진 대사 경로에서의 단백질의 관여, 단백질과 질환의 관계 등에 기초하여 서브어레이로 분류된다. 실시양태에서, 어레이 및/또는 서브어레이는 특정한 질환에서의 관여에 의해 관련되는 단백질을 분류할 수 있다. 실시양태에서, 어레이 및/또는 서브어레이는 단백질, 예컨대, 경막(혈장 막); G-단백질 커플링된 수용체; G-단백질 커플링된 비후각 수용체; G-단백질 커플링된 후각 수용체; 호르몬 수용체; 스테로이드 호르몬 수용체; 신경전달제 수용체; 효소; 인산화효소(kinase); 세포질; 소기관 핵; 핵막; 소포체(endoplasmic reticulum); 미토콘드리아; 리소좀; 세포골격; 면역 시스템; 조직 유형(예를 들면, 유방, 전립선, 뇌, 심장 등); 이온 채널; 핵 호르몬 수용체, 사이토크롬 P450; 인산분해효소(phosphatase); 단백질분해효소(protease); 포스포디에스터라제(phosphodiesterase); 단백질 수송(trafficking); ATP-결합 카세트(ANC); 사이토킨; 호메오박스(homeobox) 및 HOX 유전자; 인테그린(integrin); 전달자(transporter); DexH/D 단백질 족(RNA 대사) 등을 분류할 수 있다.

외인성 DNA를 통한 단백질 생성

실시양태에서, 단백질은 용해물이 제조되는 세포 내에서 외인성 DNA를 통해 발현된다. 즉, 세포 내의 상기 단백질의 양(및 이에 따라 용해물 중의 상기 단백질의 양)은 실질적으로 외인성 DNA에 의해 발생된다. 실시양태에서, 단백질은 세포 내에서 외인성 DNA를 통해 과다발현되는데, 이것은 세포가 외래 DNA의 존재 및 작용 하에서 존재하지 않을 경우 상기 세포가 생성할 양을 초과하여 상기 단백질이 상기 세포 내에서 생성됨을 의미한다. 실시양태에서, 단백질은 세포 내에서 내인적으로 생성되나, 외인성 DNA를 통해 세포 내에서 구별가능하게 더 높은 수준으로 생성된다. 실시양태에서, 단백질은 외인성 DNA의 부재 하에서 생성된 양을 실질적으로 초과하는 양으로 외인성 DNA를 통해 과다생성된다. 실시양태에서, 단백질은 외인성 DNA 없이 세포 내에서 생성된 양보다 1.2, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0, 9.0, 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 5,000, 7,500 또는 10,000배 이상 많은 양으로 생성된다.

단백질을 발현하기 위한 외인성 DNA

외인성 DNA라 함은 게놈 내의 그의 천연 환경에서 존재하는 천연 발생 DNA가 아닌 DNA, 즉 그의 비변경된 내인성 환경에서 존재하는 비변경된 내인성 유전자가 아닌 DNA를 의미한다. 전형적으로, 외인성 DNA는 잘 공지된 재조합 DNA 기법을 통해 세포 내로 도입된 DNA이다. 종종 외인성 DNA는 그의 천연 형태로, 뮤테인(mutein)으로서 및/또는 융합 단백질로서 발현될 단백질을 코딩한다. 이와 관련하여 실시양태에서, 외인성 DNA는 이하에 보다 상세히 논의되어 있는 바와 같이 발현 벡터 또는 구축물의 형태로 세포 내로 도입된다. 또한, 외인성 DNA는 발현될 단백질을 코딩하지 않는 활성화제 DNA, 예컨대, 비상동성 재조합에 의해 작용하는 RAGE 구축물일 수 있다. 외인성 DNA는 발현될 단백질에 대한 유전자의 일부만을 포함하는 활성화제 DNA, 예컨대, 상동성 재조합에 의한 유전자 활성화를 위한 구축물일 수 있다. 외인성 DNA는 단백질을 코딩하는 구축물, 예컨대, 발현 구축물일 수 있고, 이 경우 코딩 영역은 비단절될 수 있거나 단절될 수 있다. 외인성 DNA는 세포 내에서 어레이를 위한 원하는 양의 하나 이상의 단백질을 생성하는 다른 외인성 DNA일 수 있다.

발현 벡터

실시양태에서, 어레이용 단백질은 이 단백질을 코딩하는 발현 벡터(발현 구축물로도 지칭됨)인 외인성 DNA를 통해 세포 내에서 발현되고, 이때 상기 단백질에 대한 코딩 서열은 숙주 세포 내에서 원하는 전사 및 궁극적으로 단백질의 생성을 제공하는 발현 조절 서열(시스 작용 조절 서열로도 지칭됨)에 작동가능하게 연결되어 있다. 실시양태에서, 발현 벡터는 세포 내에서 에피솜(episome) 요소로서 지속되는 발현 벡터와 같이 자발적으로 복제된다. 실시양태에서, 발현 벡터는 숙주 세포 DNA와 함께 복제되는 발현 벡터와 같이 숙주 세포 DNA 내로 혼입된다. 임의의 적합한 발현 조절 서열이 세포 내에서 단백질을 생성하는 데에 사용될 수 있다. 이러한 발현 조절 서열은 프로모터, 인핸서, 리보솜 상호작용 부위, 예컨대, 리보솜 결합 부위, 폴리아데닐화 부위, 전사 스플라이스 서열, 전사 종결 서열, mRNA를 안정화시키는 서열, 및 숙주 세포 내에서 외인성 DNA를 통한 단백질의 생성에 대한 원하는 효과를 일으키고/키거나 조절하고/하거나 촉진하고/하거나 증가시키고/시키거나 달성하는 다른 서열들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 이러한 조절 서열은 숙주 상용성, 유도적 발현, 높은 mRNA 카피수, 및 다른 원하는 효과를 위해 선택될 수 있다. 실시양태에서, 이와 관련하여 유용한 프로모터는 박테리아 숙주를 위한 trp, lac, tac 또는 T7 프로모터; 효모를 위한 알파 인자, 알코올 산화효소 또는 PGH 프로모터; 및 진핵세포, 예컨대, 포유동물 세포를 위한 MMTV, SV40, CMV 및 RSV "프로모터"를 포함한다.

본 발명의 일부 실시양태에서 유용한 한 예시적 발현 벡터인 pCMV6-도입 벡터가 도 3에 개략적으로 도시되어 있다.

세포 내로의 외인성 DNA의 도입

임의의 적합한 시스템 또는 방법이 DNA 또는 다른 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입함으로써 본 발명의 실시양태에서 어레이를 제조하기 위한 단백질을 발현하는 데에 사용될 수 있다. 이와 관련하여 사용될 수 있는 DNA 및 다른 폴리뉴클레오티드를 도입하기 위한 많은 잘 공지된 방법들, 예컨대, 이하에 추가로 나열된 참고문헌들에 기재된 방법들이 존재한다. 이들 참고문헌 및 임의의 부분에 기재된 적합한 방법들 중에서 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시양태에서 사용될 수 있는 적합한 방법은 인산칼슘 침전, 전기천공, 주입, DEAE-덱스트란 매개된 형질감염, 리포솜(liposome)과의 융합, 세포 내로의 섭취를 향상시키는 작용제와의 결합, 및 바이러스 형질도입이다. DNA 및 다른 폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하고 세포 내로의 도입 후 상기 세포 내에서 상기 DNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)가 염색체 외에서 지속되거나 숙주 세포의 염색체(들) 내로 통합되는 방법이 사용될 수 있다. 상기 DNA 또는 다른 폴리뉴클레오티드는 잘 공지된 방법에 따라 일시적으로, 구성적으로 및/또는 유도적으로 발현될 수 있다. 세포 내로 도입된 폴리뉴클레오티드가 DNA가 아닌 경우, 이것은 종종 상기 폴리뉴클레오티드가 DNA로 복제되고 이 DNA가 궁극적으로 관심 있는 단백질의 발현을 위한 주형인 경우일 것이다.

세포

전술한 바와 같이, 관심 있는 단백질을 발현하는 세포는 외인성 DNA(또는 다른 폴리뉴클레오티드)를 숙주 세포 내로 도입하고, 상기 DNA를 섭취한 세포를 선별하고, 상기 세포를 클론적으로 증식시키고, 상기 세포가 관심 있는 단백질을 발현하는 것을 확인한 후, 원하는 어레이를 제조하기에 충분한 용해물을 제조하기에 충분한 세포 집단을 생성하도록 상기 세포를 저장하고/하거나 추가로 증폭시킴으로써 제조될 수 있다. 적합한 방법들, 예를 들면, 이하에 추가로 나열된 분자 클로닝에 대한 참고문헌들에 기재된 방법들이 당업계에 잘 공지되어 있고 당업계에서 관용적으로 사용되고 있다.

실시양태에서, 어레이의 제조를 위한 단백질은 임의의 적합한 세포 유형, 예컨대, 박테리아, 식물 또는 동물 세포, 효모 또는 포유동물 세포, 및 인간 세포, 예컨대, COS, CV1, BHK, CHO, HeLa, LTK, NIH 3T3, 293 및 HEK293 세포, 예컨대, HEK293T 세포를 포함하는 원핵세포 또는 진핵세포(이들로 제한되지 않음)에서 제조될 수 있다.

용해물

용해물은 임의의 적합한 방법을 사용하여 세포로부터 제조할 수 있다. 실시양태에서, 용해물 방법은 단백질의 원하는 구조적 및/또는 기능적 특징을 보존한다. 많은 이러한 방법들이 당업자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들면, 용해물은 세제 무함유 완충제 및 세제 함유 완충제(예컨대, RIPA 완충제를 포함함), SDS 함유 용해 완충제, 저장성 용해 완충제 등을 사용하여 제조할 수 있다. 세포를 용해시키는 방법은 당업계에 잘 공지되어 있고 세제 용해, 초음파 용해 및 압력(프렌치 압력) 하의 용해 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

실시양태에서, 어레이 내의 용해물의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100% 이상에서 각각의 용해물 중의 단백질의 농도는 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 35, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 또는 900 ㎍/㎖, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 35, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 또는 900 mg/㎖, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5 gm/㎖ 이상이다.

실시양태에서, 어레이 내의 용해물의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100% 이상에서 재조합 DNA를 통해 발현된 단백질의 농도는 용해물 중의 총 단백질의 0.01, 0.05, 0.10, 0.20, 0.50, 0.75, 1.00, 2.00, 3.00, 4.00, 5.00, 10.0, 15.0 또는 20.0% 이상이다.

실시양태에서, 용해물 농도는 0.2 내지 4 mg/㎖이고, 외인성 DNA를 통해 발현된 단백질은 총 단백질의 0.1 내지 2%이다.

재조합 단백질이 어레이에의 도포 전에 정제되는 실시양태에서, 어레이에 도포된 단백질의 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95 또는 100% 이상에 대한 도포 완충제 중의 재조합 단백질의 농도는 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 35, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 또는 900 ㎍/㎖, 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 25, 35, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 800 또는 900 mg/㎖, 또는 1, 2, 3, 4 또는 5 gm/㎖ 이상이다.

지지체

어레이는 한 부분에서든 아니면 여러 부분에서든 임의의 적합한 지지체 상에서 제조될 수 있다. 실시양태에서, 고체 지지체는 불용성 매트릭스이고 강성 또는 반강성 표면을 가질 수 있는 임의의 물질일 수 있다. 실시양태에서, 지지체는 단백질을 도포하여 어레이를 제조하기 위한 지지체로서 작용하기에 적합한 다른 막 물질들 중에서 막, 예컨대, 니트로셀룰로스, 나일론 등이다. 이러한 막 지지체는 자유롭게 서있을 수 있거나 스스로 지지될 수 있고, 예로는 유리 슬라이드 상의 니트로셀룰로스 막 물질이 있다. 실시양태에서, 지지체는 유리, 예컨대, 유리 슬라이드; 통합 회로 및 MEM 장치 내의 요소의 표면을 포함하는 실리콘; 및 플라스틱 플레이트, 예컨대, 마이크로타이터 플레이트(예를 들면, 96-웰 마이크로타이터 플레이트, 384-웰 마이크로타이터 플레이트 및 다른 용량의 마이크로타이터 플레이트를 포함함)를 포함하는 플라스틱일 수 있다.

예시적 고체 지지체는 기재(substrate), 예컨대, 니트로셀룰로스(예를 들면, 유리 슬라이드 상의 막 또는 마이크로타이터 웰 형태); 폴리비닐클로라이드(예를 들면, 시트(sheet), 유리 상 또는 마이크로타이터 웰 내); 폴리스티렌 라텍스(예를 들면, 비드, 유리 상 또는 마이크로타이터 플레이트 내); 불화폴리비닐리딘; 디아조화된 종이; 나일론 막; 활성화된 비드; 자기적 반응성 비드 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 구체적인 지지체는 플레이트, 펠렛, 디스크, 모세관, 중공형 섬유, 바늘, 핀, 고체 섬유, 셀룰로스 비드, 공극 유리 비드, 실리카 겔, 임의적으로 디비닐벤젠과 가교결합된 폴리스티렌 비드, 이식된 코폴리 비드, 폴리아크릴아미드 비드, 라텍스 비드, 임의적으로 N-N'-비스-아크릴오일에틸렌디아민과 가교결합된 디메틸아크릴아미드 비드, 및 소수성 중합체로 코팅된 유리 입자를 포함한다.

실시양태에서, 단백질은 공유결합 및/또는 비공유 결합을 통해 지지체에 부착된다. 실시양태에서, 단백질은 비변형된 형태로 부착될 수 있거나 부착 또는 부착 후 제거 또는 이들 둘 다를 촉진하도록 변형될 수 있다. 실시양태에서, 단백질은 유리, 폴리라이신, 폴리스티렌, 폴리아크릴레이트, 폴리이미드, 폴리아크릴아미드, 폴리에틸렌, 폴리비닐, 폴리디아세틸렌, 폴리페닐렌-비닐렌, 폴리펩티드, 폴리사카라이드, 폴리설폰, 폴리피롤, 폴리이미다졸, 폴리티오펜, 폴리에테르, 에폭시, 실리카 유리, 실리카 겔, 실록산, 폴리포스페이트, 하이드로겔, 아가로스, 셀룰로스, 및/또는 다른 지지체, 코팅물 또는 필름에의 부착을 촉진하거나 가능하게 하도록 변형될 수 있다.

이들 중에서 니트로셀룰로스, 예컨대, 쇼트 넥스테리온(Nexterion) 니트로셀룰로스 슬라이드로 코팅된 유리 슬라이드이다.

지지체에의 용해물의 도포

단백질, 예컨대, 외인성 유전자를 통해 발현된 용해물 중의 단백질은 다양한 방식으로 어레이에 도포될 수 있다. 실시양태에서, 상기 단백질을 마이크로어레이 프린터를 사용하여 도포한다. 마이크로어레이 프린터는 그의 프린팅 팁 구조 및 샘플 반점화를 위한 기작에 의해 3개의 군으로 분류될 수 있다: 퀼 핀(quill pin)(스플릿 핀), 압전(잉크 젯) 반점화기(spotter) 및 고체 핀(Barbulovic-Nad et al., 2006). 아우숀(Aushon)에 의해 개발된 고체 핀 어레이어(arrayer)는 복합 혼합물, 예컨대, 세포 용해물의 프린팅을 위해 특별히 고안되었고 점성 단백질 용액을 사용할 때 잘 작동하여 슬라이드 상의 균일한 반점을 생성한다(Spurrier et al., 2008). 콜로이드성 금으로 염색된 어레이를 보여주는 도 2a에 예시된 바와 같이 이 반점화기(spotter)를 사용한 경우 균일성은 매우 우수하다. 반점 중의 총 단백질은 어레이 전체에 걸쳐 균일하고, 각각의 서브어레이에서 농도 연속물은 적절한 스케일링(scaling)을 보여주고, 이것도 마찬가지로 어레이 전체에 걸쳐 균일하다.

어레이 기하구조 및 반점 밀도

어레이는 매우 다양한 형식, 크기 및 모듈성을 갖도록 제조될 수 있고, 특히 매우 다양한 위치, 단백질, 특징부, 특징부 크기, 특징부 간격, 특징부 점유도, 대조군, 정렬 마커 및 기준물을 갖도록 제조될 수 있다.

실시양태에서, 어레이에서 위치가 ㎠ 당 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,500, 10,000, 15,000 또는 20,000개 이상 존재한다.

실시양태에서, 어레이 상의 상이한 위치들에 도포된 용해물이 ㎠ 당 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,500, 10,000, 15,000 또는 20,000개 이상 존재한다. 실시양태에서, 어레이 상의 상이한 위치들에 도포된, 외인성 DNA를 통해 발현된 단백질이 ㎠ 당 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,500, 10,000, 15,000 또는 20,000개 이상 존재한다.

실시양태에서, 상기 단백질을 갖는 어레이 상의 위치가 ㎠ 당 10, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 350, 500, 750, 1,000, 2,000, 3,000, 4,000, 5,000, 6,000, 7,500, 10,000, 15,000 또는 20,000개 이상 존재하고, 이때 상기 단백질이 상기 위치의 50, 60, 70, 80, 90 또는 95% 이상에 도포된다.

실시양태에서, 용해물 및/또는 단백질은 직경이 10 내지 50, 25 내지 75, 50 내지 100, 75 내지 150, 100 내지 200, 150 내지 250, 200 내지 300, 250 내지 350, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 750, 400 내지 800 또는 750 내지 1,000 ㎛인 반점(특징부)에 도포된다.

실시양태에서, 어레이에서 용해물 또는 단백질을 포함하는 특징부의 면적은 10 내지 50, 25 내지 75, 50 내지 100, 75 내지 150 100 내지 200, 150 내지 250, 200 내지 300, 250 내지 350, 300 내지 400, 400 내지 500, 500 내지 750, 400 내지 800, 750 내지 1,250, 1,000 내지 2,000, 1,500 내지 3,000 또는 2,500 내지 5,000 ㎛²이다.

실시양태에서, 어레이에서 특징부(반점)의 중심 대 중심 간격은 5 내지 15, 10 내지 20, 15 내지 25, 20 내지 40, 25 내지 50, 25 내지 75, 50 내지 100, 75 내지 150, 100 내지 150, 125 내지 175, 150 내지 225, 200 내지 250, 225 내지 275, 250 내지 350, 300 내지 400 또는 400 내지 500 ㎛이다.

실시양태에서, 단백질 반점 크기는 110 내지 300 ㎛ 직경이다. 실시양태에서, 어레이 상의 위치 및/또는 단백질의 중심 대 중심 간격은 150 내지 250 ㎛이다.

결합을 검출하기 위한 어레이의 사용

임의의 적합한 방법이 단백질 어레이에서 작용제와 단백질의 결합을 검출하고/하거나 측정하는 데에 사용될 수 있다. 실시양태에서, 고체상 분석이 사용된다. 실시양태에서, 샌드위치 분석이 사용된다. 실시양태에서, 방사성측정, 색측정, 화학발광측정 및/또는 형광측정 기재 분석이 사용된다. 항체 결합 분석에 관한 일부 실시양태에서, 예를 들면, RIA(방사성 면역분석), ELISA(효소 결합된 면역흡착 분석), EIA(효소 면역분석), 면역형광 분석 및 면역침전 분석 등을 포함하는 임의의 적합한 면역분석이 사용될 수 있다. 실시양태에서, 작용제가 직접적으로 표지되고 어레이 내의 단백질과의 결합이 직접적으로 결합된 표지의 검출 및/또는 측정에 의해 측정되는 직접적 표지 방법이 사용된다. 실시양태에서, 작용제의 결합이 상기 작용제의 일부가 아니고 어레이 상의 단백질의 일부도 아닌 검출 잔기와의 상호작용에 의해 검출되는 간접적 표지 방법이 사용된다. 예를 들면, 간접적 ELISA에서, 어레이 내의 항체와 단백질의 결합은 1차 항체에 결합하는 표지된 2차 항체에 의해 검출된다. 실시양태에서 유용한 색측정, 방사성측정 및 형광측정 검출 마커는 로다민(rhodamine) 또는 로다민 유도체, 비오틴, 아비딘, 스트렙타비딘, 형광 화합물, 예컨대, Cy3, Cy5, 알렉사(Alexa)-555, 알렉사-647, 딜라이트(Dylight)-549 또는 딜라이트-649a, 화학발광 화합물, 예컨대, 디메틸 아크리디늄 에스테르 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는다.

실시양태에서, 효소 면역분석이 검출을 위해 사용될 수 있다. 단백질 어레이에 용이하게 적용될 수 있는 다양한 이러한 분석, 예컨대, 문헌[Voller, A., "The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (EL1SA)," 1978, Diagnostic Horizons 2, 1-7, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, Md.]; 문헌[Voller, A. et al., 1978, J. Clin. Pathol. 31, 507-520]; 문헌[Butler, J. E., 1981, Meth. Enzymol. 73, 482-523]; 및 문헌[Maggio, E. (ed.), 1980, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, Fla.]에 기재된 분석이 당업계에 잘 공지되어 있고 관용적으로 사용된다.

ELISA는 효소 반응을 사용하여 발색 또는 형광발생 기질로부터 착색된(흡수된) 또는 형광 생성물을 생성하거나 화학발광 기질로부터 발광을 생성한다. 하나 이상의 효소를 사용할 수 있다. 단순한 실행으로, 발색 기질에 작용하는 효소를 항체에 접합시킨다. 접합체를 예를 들면, 마이크로타이터 접시 웰 내에 고정화된 단백질과 함께 항온처리한다. 항온처리 후, 어레이에서 단백질에 결합되지 않은 접합체를 세척하여 제거한다. 신호 발생제, 예컨대, 발색 기질을 일정한 시간 동안 상기 웰 내에 첨가하여 항온처리함으로써 상기 마이크로타이터 플레이트 웰 내에서 단백질에 결합된 임의의 효소 접합체가 착색된 생성물을 발생시키게 한다. 선형 방식의 반응에서, 생성된 색채의 양은 결합된 접합체의 양에 비례한다. 단백질 어레이의 경우, 반응의 생성물은 일반적으로 표면 상에 침전되거나 결합될 것이므로, 항체가 결합된 장소로부터 확산되지 않는다. 효소 반응의 사용은 각각의 결합 사건으로부터의 신호를 크게 증폭시킨다. ELISA는 추가 증폭을 위해 2개 이상의 효소를 사용할 수 있다. 매우 다양한 ELISA가 당업계에 공지되어 있고 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 어레이와 함께 사용되도록 용이하게 개조될 수 있다.

하기 효소들을 포함하나 이들로 한정되지 않는 많은 효소들이 실시양태에서 사용될 수 있는 ELISA에서 성공적으로 사용되고 있다: 말레이트 탈수소효소, 스타필로코커스 핵산분해효소(nuclease), 델타-5-스테로이드 이성화효소(isomerase), 효모 알코올 탈수소효소, 알파-글리세로포스페이트 탈수소효소, 트리오스 포스페이트 이성화효소, 호스라디쉬 과산화효소, 알칼리성 인산분해효소, 아스파라긴분해효소(asparaginase), 글루코스 산화효소, 베타-갈락토시다제(galactosidase), 리보핵산분해효소(ribonuclease), 요소분해효소(urease), 과산화수소분해효소(catalase), 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소, 글루코아밀라제(glucoamylase) 및 아세틸콜린분해효소(acetylcholinesterase).

이 효소들(및 다른 효소들)을 위한 임의의 적합한 기질 및 표지, 예컨대, (전술된 바와 같이) 각각 착색된 생성물, 형광 생성물 및 화학발광 생성물을 생성시키는 발색, 형광발생, 생체발광 및 화학발광 기질들(그러나 이들로 한정되지 않음)이 ELISA에서 사용될 수 있다. 방사성표지도 사용될 수 있다. 실시양태에서 유용한 형광 표지는 하기 형광 표지들을 포함하나 이들로 한정되지 않는다: 플루오레세인(fluorescein) 이소티오시아네이트, 로다민, 파이코에리쓰린(phycoerythrin), 파이코시아닌(phycocyanin), 알로파이코시아닌(allophycocyanin), o-프탈알데히드 및 플루오레스카민(fluorescamine). 실시양태에서 유용한 화학발광 표지는 루미놀(luminol), 이소루미놀(isoluminol), 써로매틱 아크리디늄(theromatic acridinium) 에스테르, 이미다졸, 아크리디늄 염 및 옥살레이트 에스테르를 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 실시양태에서 유용한 생체발광 표지는 루시페린(luciferin), 루시퍼라제(luciferase) 및 애큐오린(aequorin)을 포함하나 이들로 한정되지 않는다. 임의의 적합한 표지가 사용될 수 있고, 전술된 것들은 ELISA 및 이와 관련하여 효과적일 수 있는 다른 결합 분석에서 개발되고 사용된 보다 잘 공지되고 보다 효과적인 표지들의 단지 일부이다.

결합 파트너를 스크리닝하기 위한 단백질 어레이의 사용

어레이에서 폴리펩티드(단백질)와 반응하거나 결합하는 임의의 유형의 샘플 또는 물질(본 명세서에서 "작용제"로서 지칭됨)의 상호작용은 확인될 수 있다. 실시양태에서, 어레이를 사용하여 어레이 내의 단백질에의 결합, 예컨대, 샘플(및 이의 성분들) 또는 작용제, 예컨대, 후보 결합 화합물 또는 항체의 결합을 검출한다. 이와 관련하여 예시적인 사용이 이하에 기재된다.

실시양태에서, 작용제는 어레이 내의 단백질의 특이적 결합 파트너, 예컨대, 항체, 수용체 리간드, 앱타머(aptamer), 폴리펩티드 및 다른 결합 분자이다. 작용제는 효소, 또는 폴리펩티드를 변형시키는 다른 물질, 예컨대, (단백질을 인산화시키는) 인산화효소일 수 있다. 작용제는 단백질(폴리펩티드)에 결합할 수 있는 임의의 물질 또는 잔기(화합물; 생체분자, 예컨대, 폴리펩티드(아미노산), 지질, 핵산(뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드) 및 탄수화물; 무기 분자; 유기 분자 등을 포함하나 이들로 한정되지 않음)를 단독으로 또는 조합된 형태로 포함할 수 있다.

항체가 결합하는 단백질을 확인하기 위한 단백질 어레이의 사용

실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 어레이는 항체가 결합하는 단백질을 스크리닝하고 확인하는 데에 사용될 수 있다. 항체는 그의 특이성 때문에 진단 및 치료 목적을 위해 광범위하게 사용된다. 현행 분석 방법에서의 한계점 때문에, 이들 항체와 상호작용하는 항원은 전체적으로 공지되어 있지 않다.

항원에 대한 항체가 발생되는 경우, 생성된 항체는 일반적으로 그 항원에 대해 특이적임을 특징으로 한다. 단백질 항원의 경우, 단백질은 전형적으로 개개의 항체가 특이적으로 결합하는 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 단백질 내의 에피토프는 단백질의 연속적인 부분들에 의해 형성될 수 있을 뿐만 아니라 단백질의 3 차원적 구조에서 인접하도록 폴딩되는 단백질의 불연속적 영역들에 의해서도 형성될 수 있다. 항체, 예컨대, 단백질에 대한 항체의 결합 특이성은 동일한 또는 유사한 에피토프를 함유하는 다른 단백질과의 교차반응에 의해 복합해질 수 있다. 교차반응성은 항체가 분석 및 치료 목적을 위해 사용되는 경우 상당한 문제점이 될 수 있다.

종종 이러한 교차반응은 하나의 에피토프를 정의하는 하나의 아미노산 서열이 상이한 단백질들에서 발생하기 때문에 일어난다. 이것은 동일한 1차 전사체의 차등적으로 스플라이싱된 변이체에서 일어날 수 있거나, 또는 단순히 서열이 2개의 단백질에서 독립적으로 발생하기 때문에 일어날 수 있다. 교차반응하는 단백질은 동일한 세포 및 조직 유형, 및 상이한 유형에서 발생할 수 있고, 예컨대, 스플라이스 변이가 조직 특이적 방식으로 일어나는 경우 발생한다.

일반적으로, 검출 분석, 예컨대, 진단 분석 또는 치료에서의 사용을 위해 항체의 특이성을 이해하는 것이 중요하다. 많은 목적의 경우, 항체와 그의 특이적 표적의 상호작용 및 항체의 교차반응성을 특징규명하는 것이 중요하다. 항체 교차반응성의 전반적인 이해는 항체와 프로테옴의 상호작용을 전체적으로 측정하는 임의의 방식이 존재하지 않기 때문에 현행 기술을 사용하여 용이하게 수득할 수 없다. 단백질 파트너에 결합하는 다른 단백질(및 비단백질 작용제)의 상호작용의 경우도 마찬가지이다.

본 명세서에 기재된 실시양태에서, 단백질 어레이는 1차 항원 이외의 단백질에의 교차반응에 대해 항체를 스크리닝하고, 특히 주어진 게놈 내에 코딩된 단백질의 실질적인 분획과의 상호작용의 이해를 획득하는 데에 사용될 수 있다. 이와 관련하여 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 게놈 광범위 어레이가 특히 유용하다. 단백질에 결합하는 다른 유형의 작용제의 경우도 마찬가지이다.

질환의 생체마커를 확인하기 위한 단백질 어레이의 사용

일부 실시양태에서, 본 명세서에 기재된 단백질 어레이는 자가면역 질환 및 다른 질환, 예컨대, 암에 의해 생성된 항체를 검출하는 데에 사용될 수 있다. 자가면역 질환에서, 대상체는 자가항원에 대한 면역반응을 발생시키고, 이들 항체는 종종 질환 진단 및 예후에 유용한 마커이다. 종종, 이러한 자가항체에 대한 동족 항원이 공지되어 있지 않은데, 이 경우 실시양태에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 어레이는 이러한 단백질 결합 자가항체가 결합하는 단백질을 결정하는 데에 사용될 수 있다. 다른 경우, 동족 항원이 적어도 부분적으로 공지되어 있고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 어레이는 자가항체를 결정하고/하거나, 특징규명하고/하거나, 또는 측정하는 데에 사용될 수 있다.

공지된 또는 비공지된 단백질에 결합하는 항체의 경우, 실시양태에서 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 어레이는 이러한 자가항체의 부재, 존재 및/또는 양을 결정하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들면, 이와 관련하여 본 발명의 일부 실시양태에 따르면, 대상체, 예컨대, 자가면역 질환에 대한 위험을 갖거나 자가면역 질환을 실제로 앓고 있는 대상체로부터의 (몇몇을 제시하자면) 항혈청, 혈액 성분, 체액 및/또는 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 어레이에 도포하여 이들이 결합하는 표적 항원(단백질)을 결정하고/하거나, 상기 어레이 내의 특정한 단백질에 결합하는 샘플 중의 자가항체의 부재, 존재 및/또는 양을 결정함으로써, 상기 샘플 중 자가 면역 항체를 특징규명하여 상기 대상체에서 건강, 위험 또는 실제 질환 등을 진단할 수 있다.

유사하게, 이와 관련하여 본 발명의 일부 실시양태에 따르면, 대상체, 예컨대, 질환의 부재 하에서 일반적으로 발견되지 않는 항체의 생성을 일으키는 질환에 대한 위험을 갖거나 상기 질환을 실제로 앓고 있는 대상체로부터의 (몇몇을 제시하자면) 항혈청, 혈액 성분, 체액 및/또는 세포를 본 명세서에 기재된 바와 같은 단백질 어레이에 도포하여 이들이 결합하는 표적 항원(단백질)을 결정하고/하거나 상기 어레이 내의 특정한 단백질에 결합하는 샘플 중의 자가항체의 부재, 존재 및/또는 양을 결정함으로써, 상기 샘플 중의 항체를 특징규명하여 상기 대상체에서 건강, 위험 또는 실제 질환 등을 진단할 수 있다.

상기 설명 및 하기 실시예는 본 명세서에 개시된 본 발명의 다양한 실시양태를 예시한다. 매우 다양한 추가 양태들, 특징들 및 실시양태들이 본 개시내용을 읽은 당업자에게 자명할 것이고, 이들 모두가 본 명세서에 개시된 본 발명의 범위 내에 있음이 인식될 것이다.

V

하기 실시예는 본 명세서에 기재된 본 발명의 다양한 양태에 따른 단백질 마이크로어레이의 예시적 실시양태들 및 이들의 몇몇 예시적 적용을 기술한다. 이 실시예들은 본 명세서에 기재된 본 발명을 어떠한 방식으로든 한정하지 않는다.

실시예 1: 인간 단백질 유전자의 약 50% 적용범위를 갖는 단백질 마이크로어레이

본 발명의 실시양태는 게놈 내의 모든 단백질 코딩 유전자의 실질적인 분획을 갖는 어레이를 제공한다. 국제 인간 게놈 서열분석 협회는 인간 게놈 내에 약 20,000 내지 25,000개의 단백질 코딩 유전자들이 존재한다고 추정한다(Stein, 2004). 하기 실시예는 약 3,500 내지 10,000개의 개개의 인간 유전자들을 함유하는 약 10,000 내지 20,000개의 반점을 갖는 단백질 어레이의 제조 및 용도를 예시한다. 상기 어레이는 이하에 기재된 바와 같이 포유동물 발현 벡터 pCMV6-도입 내로 클로닝된 검증된 인간 cDNA의 라이브러리(오리진 인코포레이티드(OriGene, Inc.))를 사용하여 제조하였다.

실시예 2: 인간 단백질을 발현하기 위한 pCMV -도입 벡터

어레이용 단백질은 도 3에 개략적으로 도시된 바와 같은 pCMV-도입 발현 벡터를 통해 발현되었다. 상기 벡터는 이 벡터를, 포유동물 숙주 세포 내에서 포유동물 단백질을 과다발현하여 단백질 어레이를 제조하기에 특히 효과적인 벡터로 만드는 여러 특징을 갖는다. 상기 벡터는 진핵세포 내에서의 효율적인 에피솜 복제에 효과적인 복제 기점(SV40 Ori) 및 박테리아 내에서의 복제를 위한 기점을 포함한다. 상기 벡터는 CMV 프로모터, 다중클로닝 영역 및 폴리아데닐화 신호를 포함하는, 포유동물 세포 내에서의 편리한 클로닝 및 효율적인 발현을 위한 발현 카세트를 포함한다. 또한, 상기 발현 카세트는 C-말단 myc-DDK 태그 포함 단백질을 발현하기 위해 폴리아데닐화 신호의 바로 상류에서 myc 및 DDK 에피토프를 포함한다. 상기 태그는 재조합적으로 발현된 단백질을 검출하고 정제하는 데에 효과적이고 편리한 잔기이다. 상기 벡터는 박테리아 숙주(및 시험관) 내에서의 효율적인 전사를 위해 다중클로닝 영역의 상부에서 T7 프로모터를 포함한다. 상기 벡터는 포유동물 숙주 세포 및 박테리아 숙주 세포에서의 선별을 위한 약물 내성 마커(각각 가나마이신 내성 유전자 및 네오마이신 내성 유전자)를 발현하기 위한 제2 발현 카세트를 포함한다. 또한, 상기 벡터는 태그 포함 융합 단백질의 CMV 발현의 3' 영역에서 C-말단 myc 및 DDK 태그 서열을 포함한다. 상기 벡터는 박테리아 세포 내에서의 증식을 위한 복제 기점도 포함한다. (FLAG는 DDK에 대한 특허등록 명칭이다.)

실시예 3: 과다발현 용해물

pCMV-도입 벡터 내로 클로닝되고 HEK293T 세포 내에서 과다발현된 인간 cDNA를 사용하여 12,000개 초과의 과다발현 용해물을 제조하고, 이들을 항-FLAG 면역블롯 분석으로 검증하였다. 또한, 발현 프로파일 분석은 적절한 번역 후 변형이 이 발현 시스템에서 일어남을 보여주었다. 모든 용해물에 대한 발현 프로파일을 개별적으로 조사하고 해석하였다. 도 2는 8개의 무작위적으로 선택된 용해물에 대한 발현 프로파일을 보여준다.

대다수의 재조합 단백질에 대한 발현 수준은 도 2에 나타낸 바와 같이 그의 내인성 반대-파트너보다 100배 이상 더 높다. 이 수준의 과다발현은 숙주 세포 자체로부터의 배경에 비해 극도로 높은 신호 대 노이즈 비(signal to noise ratio)를 제공한다.

항-FLAG 면역블롯에 대한 전체 성공률은 약 95%이다.

실시예 4: 니트로셀룰로스 슬라이드 상에의 과다발현 용해물의 프린팅

과다발현 용해물을 쇼트 니트로셀룰로스 슬라이드 상에 프린팅하였다. 도 1은 전체적인 배치 및 서브어레이 세부사항을 보여준다. 상기 도면에 나타낸 바와 같이, 각각의 슬라이드는 서브어레이로, 전형적으로 슬라이드 당 40개의 서브어레이로 분리된다. 상기 도면에서 확대된 영역은 각각의 서브어레이의 배치를 보여준다. 상기 도면에 표시된 바와 같이, 각각의 서브어레이는 하기 대조군 및 마커를 함유하였다: 정제된 BSA-cy3 및 BSA-cy5 배향 마커; 정제된 마우스 및 토끼 IgG(양성 대조군); 빈 pCMV-도입 벡터 DNA로 형질감염된 HEK293T 세포의 용해물(음성 대조군); 및 (서브어레이 용해물에서 외인성 재조합 단백질 발현을 정량하기 위한 기준 농도 곡선을 확립하기 위한) 정제된 GST-myc-FLAG 융합 단백질의 기준 희석 연속물. GST-myc-FLAG 농도 연속물로부터의 신호는 myc-FLAG 태그 포함 단백질 발현을 측정하기 위한 신호 강도 대 농도의 표준 곡선을 확립하는 데에 사용되었다.

핀 반점화기, 구체적으로 오우숀 2470 어레이 반점화기를 사용하여 쇼트 니트로셀룰로스 표준 마이크로어레이 슬라이드 상에서 어레이를 제조하였다. 110 ㎛ 핀을 사용하여 9,000개의 반점(특징부)(각각 200 내지 300 피코리터)을 표준 슬라이드 상의 21 mm x 51 mm 니트로셀룰로스 패드 상에 프린팅하였다. 85 ㎛ 핀을 사용하여 16,000개의 반점을 프린팅하였다. 다소 더 큰 니트로셀룰로스 패드(21 mm x 60 mm) 상에서 85 ㎛ 핀을 사용하여 22,000개 만큼 많은 150 내지 200 피코리터 반점을 상기 슬라이드 상에 프린팅하였다. 주위 분석물 이론과 일치하여, 반점 크기가 감소함에 따라 검출 민감성이 증가하였다(Ekins, 1989). 신호의 균일성은 110 ㎛ 반점보다 85 ㎛ 반점의 경우 더 높았지만, 신호 강도는 거의 동일하였다. 어레이 제작의 세부사항은 이하에 기재되어 있다.

슬라이드 유형: 쇼트 NC 슬라이드

오우숀 어레이어 핀 크기: 85 ㎛

슬라이드 NC 패드 치수: 21 mm x 60 mm

총 서브어레이: 48(4칸 x 12줄)

서브어레이 크기: 4200 ㎛ x 4400 ㎛

서브어레이 치수: 21칸(수평) x 22줄(수직)

중간 반점 직경: 약 150 ㎛

반점 중심 대 중심 간격: 200 ㎛

서브어레이 사이의 거리: 200 ㎛

샘플 당 복제물: 2

이들 세부사항에 따라 만들어진 슬라이드는 22,176개의 특징부(반점), 예컨대, 10,464개의 유일한 단백질 반점(예컨대, 용해물)의 중복체 및 1,248개의 대조군 특징부를 포함할 수 있다.

고체 핀 반점화기를 사용하여 1% NP-40을 함유하는 RIPA 완충제 중의 용해물을 니트로셀룰로스 슬라이드 상에 반점화하였다. 다른 용액들, 예컨대, 다른 세제 또는 무질서화 시약, 예컨대, 문헌[Chan et al., 2004 and Nishizuka et al., 2003]에 기재된 것들을 함유하는 용액들이 프린팅을 위해 사용될 수 있다. 용해물을 공급원 플레이트로부터 직접 반점화하고, 샘플 농도에 대한 증발 효과를 최소화하기 위해 모든 반점화를 70% 상대습도에서 조절된 환경 하에서 수행하였다. 이것은 약 9,000개의 반점의 어레이를 프린팅함에 있어서 잘 작동하였다.

보다 큰 어레이의 경우, 한번에, 연속적으로 또는 병렬로 반점화하는 대신에 여러 공급원 플레이트로부터 반점화함으로써 제작 시간을 동일하게 유지할 수 있다. 어레이 제작 동안 농도에 대한 증발 효과를 추가로 최소화하기 위해, 용해물을 여러 공급원 플레이트 내로 분배하고 병렬로 반점화함음으로써 샘플들 중 어떠한 샘플도 불리하게 영향받을 정도로 길게 노출되지 않게 할 수 있다. 대안적으로 또는 추가로, 4% 글리세롤(또는 다른 안정화제 및 항증발제)이 반점화 완충제에 첨가될 수 있다.

실시예 5: 칩 질의 평가

단백질 어레이의 질은 콜로이드성 금으로 염색하여 총 단백질을 평가하고 항-FLAG 면역염색을 수행하여 재조합 단백질을 평가함으로써 평가되었다. 콜로이드성 금 염색은 도 3a에 나타낸 바와 같이 상기 어레이 전체에 걸쳐 총 단백질에 대한 반점 형태의 높은 균일성을 보여준다. 항-FLAG 항체를 사용한 면역염색은 도 3b 및 도 5a에 나타낸 바와 같이 상기 어레이 전체에 걸쳐 FLAG-myc 융합 단백질의 결합을 보여주었다. 항-FLAG 결합의 양에서의 변동성은 숙주 세포 내에서의 융합 단백질 발현의 차이 및 그로 인한 용해물 중의 농도의 차이를 반영한다. 정제된 GST-myc-FLAG 융합 단백질은 용해물 중의 융합 단백질의 농도를 측정하기 위한 기준 표준물로서 작용하기 위해 상기 어레이에 직접 도포된다. 희석 연속물은 도 1에서 상기 어레이의 확대된 영역 내에서 도식적으로 예시되어 있고, 희석 연속물의 균일성은 도 4c에서 상부 우측 패널에서 관찰될 수 있다.

실시예 6: 용해물 어레이를 사용한 항체 특이성의 확인

항체 특이성은 종종 분자생물학 연구 및 치료 항체 개발을 위해 중요할 뿐만 아니라 항체의 진단 및 치료 용도를 위한 중요한 특징이다. 교차반응은 생물학적 연구에 대한 거짓 양성, 및 예를 들면, 문헌[Tabrizi et al., (2009)]에 기재된 바와 같은 치료 항체 치료에 대한 부작용을 초래할 수 있다. 본 명세서에 개시된 본 발명의 실시양태는 항체의 1차 특이성 및 교차반응성의 확인 및/또는 특징규명을 포함하는, 항체 특이성의 확인 및 검증을 위한 과다발현 용해물 마이크로어레이의 용도를 포함한다. 나아가, 상기 어레이는 다른 단백질뿐만 아니라 다른 유형의 분자의 결합 특이성 및 교차-반응성을 조사하고 확인하고 검증하는 데에 사용될 수 있다.

이와 관련하여 예를 들면, p53에 대한 이미 특징규명된 다중클론 항체는 3700개의 상이한 myc-FLAG 인간 융합 단백질들을 포함하는 3700개 이상의 과다발현 용해물을 포함하는 용해물 어레이에 대해 스크리닝되었다. p53 항체는 p53 발현 용해물 및 HEK293T 숙주 세포의 내인성 p53 둘 다와 반응하였다. 상기 과다발현 용해물로부터의 신호는 배경 HEK293T 발현으로부터의 신호보다 10배 이상 더 높았다.

또한, 상기 항체는 배경 수준보다 현저히 높으나 p53 용해물에의 결합보다 낮은 수준에서 여러 다른 용해물에 결합하였다. 추가 조사는 이들 용해물 중 여러 용해물에서의 높은 p53 신호가 외인성 단백질과 항-p53 항체의 교차반응성보다는 외인성 단백질에 의한 p53 발현의 자극으로 인한 것임을 보여주었다. 유사한 결과를, 마우스 단일클론 항-p53 항체를 사용하여 수득하였다.

도 4에 예시된 결과는 과다발현 용해물 어레이가 단백질 상호작용 특이성 및 교차반응성을 연구하고 다른 단백질, 특히 예를 들면, 내인성 단백질의 발현에 대한 다수의 단백질(개별적으로 및/또는 서로 조화하여)의 과다발현의 효과를 측정하는 데에 사용될 수 있음을 보여준다.

실시예 7: 전체 세포 면역화에 의해 발생된 단일클론 항체의 해독

전체 세포 면역화는 단일클론 항체, 예컨대, 생체마커 분석 및 암 요법을 위한 매우 특이적인 단일클론 항체를 발생시키는 데에 사용될 수 있다. 그러나, 전체 세포 면역화 기법의 보다 넓은 사용은 초기에 수득되는 단일클론 항체의 표적을 결정하기 어렵다는 점에 의해 방해된다. 종종 이 작업은 매우 비싸고 실시를 위해 수년이 소요된다.

실시양태에서, 과다발현 용해물 마이크로어레이 칩은 단백질 결합 작용제의 단백질 결합 표적, 예컨대, 전체 세포 면역화 기법에 의해 발생된 단일클론 항체의 세포 단백질 결합 특이성을 신속하게 측정하는 데에 사용될 수 있다. 결합 파트너, 예컨대, 항체의 결합 특이성 또는 특이성들을 측정하는 것은 본 명세서에서 해독으로서 지칭된다.

이와 관련하여 실시양태는 마우스를 MCF-7 유선 암종 세포로 면역화시켜 초기에 수득한 상업적으로 입수가능한 항-E-캐드헤린 항체의 표적의 확인에 의해 예시된다(Shimoyama et al., 1989). 면역염색 데이터는 표적이 3700개 이상의 상이한 유전자들로부터 명확히 구별됨을 보여준다(도 5a). 결론은 웨스턴 블롯 분석에 의해 추가로 뒷받침된다(도 5b).

실시예 8: 종양 생체마커 발견

다양한 단백질이 질환 표시자로서 작용하고 치료법을 개발하기 위한 종결점을 대신한다. 암을 가진 환자에 의해 생성된 종양에 대한 자가항체는 질환의 귀중한 진단 및 예후 표시자로서 입증될 수 있는 한 부류의 단백질을 대표한다. 이러한 단백질이 대표될 가능성은 부분적으로 인간 혈청 중의 자가항체를 특징규명하기 어렵다는 점 때문에 실현되지 않았다.

이러한 어려움을 극복한다는 희망으로 다양한 방법, 예컨대, SEREX(재조합 발현 클로닝에 의한 항원의 혈청학적 확인) 및 SERPA(혈청학적 프로테옴 분석)이 개발되었으나(Gunawardana and Diamandis, 2007), 이들은 모두 실질적인 단점을 갖는다.

SEREX는 각각의 클론에 대한 명확한 해석과 함께 보다 넓은 적용범위를 제공할 수 있으나, 원핵세포 cDNA 발현 라이브러리 스크리닝에 기초한 것이다. 그 결과, 스크리닝을 위해 사용되는 재조합 단백질이 임의의 번역 후 변형을 갖지 않는다. 뿐만 아니라, 상기 기술은 발견 단계에서 다수의 환자 혈청 샘플을 연구하는 것을 어렵게 만든다.

SERPA는 면역블롯팅 및 MS로 자가항체 표적을 확인한다. 본질적으로, 자가항체를 함유하는 혈청은 2-D IEF/SDS PAGE로 처리된 인간 조직 용해물 중의 동족 항원을 검출하기 위한 프로브로서 사용된다. 그 다음, 혈청 중의 자가항체에 결합하는 겔 내의 단백질 항원이 질량 분광법에 의해 확인된다. 상기 기법은 단백질을 강한 변성 조건으로 처리하고 검출 비민감성 및 재현불가능성이라는 문제점을 갖는다. 또한, 상기 기법이 제공하는 제한된 데이터(IEP, 크기 및 질량 스펙트럼)로부터 전형적으로 웨스턴 블롯 및 검출 단계의 수행에 관여된 다른 단백질에 의해 오염된 항원을 확인하는 것은 어려울 수 있다.

본 명세서에 기재된 실시양태는 자가항체의 단백질 항원을 확인하고 특징규명하기 위해 방법들, 예컨대, SEREX 및 SERPA의 한계점을 극복한다. 실시양태에서, 단백질 어레이는 각각의 유전자에 대한 명확한 해석을 가짐으로써, 단백질이 어레이 내의 각각의 장소에서 공지된다. 더욱이, 실시양태에서, 어레이 내의 단백질은 HEK293T 발현 시스템 내에서 생성되고 번역 후에 잘 가공된다.

이러한 실시양태는 유방암 환자에서 자가항체의 확인에 의해 예시된다. 마이크로어레이 슬라이드를 유방암 환자로부터의 혈청 또는 동일한 연령의 건강한 환자로부터의 혈청과 함께 항온처리한 후 면역염색하여 환자 혈청 중의 자가항체가 상기 마이크로어레이 내의 단백질에 결합된 장소를 가시화하였다. 결과는 도 6에 예시된 바와 같이 상이한 인간 혈청에 대한 상이한 자가항체 면역반응 패턴을 보여준다.

실시예 9: 정제된 단백질 어레이 - 1 단계 면역정제

종래 연구는 항-FLAG 면역친화성 정제 기술이 천연 조건 하에서 과다발현 용해물로부터 FLAG 태그 포함 다중 서브유니트 단백질 복합체를 단리하는 데에 사용될 수 있음을 보여주었다(Chiang et al., 1993; Gloeckner et al., 2009). 본 발명자들은 이 방법을 적용하여, HEK2093T 세포에서 pCMV6-도입 벡터를 사용하여 발현한 FLAG-myc 태그 포함 단백질을 단리하였다. 일반적인 방법이 표 2 및 3에 개략적으로 도시되어 있고, 10개의 무작위적으로 선택된 용해물에 대한 결과가 도 7에 도시되어 있다. 상기 방법은 His, myc, FLAG, V5, GST, T7, HSV, VSV-g, Glu-Glu, HA, E-태그 등을 포함하나 이들로 한정되지 않는 임의의 에피토프 태그와 함께 사용될 수 있다.

실시예 10: 칩 상에서의 정제

칩 상에서의 정제는 본 명세서에 기재된 바와 같은 마이크로어레이를 생성하는 데에 사용될 수 있다. 칩 상에서의 정제를 사용하여 단백질 어레이를 제조하기 위한 일반적인 방법이 표 3 및 도 8에 도시되어 있다.

본 실시예는 DDK 에피토프 및 항-DDK 항체(FLAG 에피토프 및 항-FLAG 항체)를 사용하여 10,464개의 정제된 인간 재조합 단백질들을 갖는 단백질 어레이를 생성하는 것을 기술한다. FLAG는 높은 면역원성 펩티드이다. FLAG 에피토프 태그와 항-FLAG 항체 사이의 상호작용은 예외적으로 강하고 특이적이다(Chiang and Roeder, 1993). 고품질의 항-FLAG 항체가 마우스, 토끼, 염소 및 심지어 닭을 포함하는 상이한 종들에서 생성되었다. 이러한 항체는 예컨대, 면역침전 분석을 위해 종종 사용되는 고품질의 항-FLAG 마우스 단일클론 항체 및 토끼 다중클론 항체를 제공하는 오리진 인코포레이티드로부터 상업적으로 입수가능하다.

칩 상에서의 정제의 효능은 도 9에 도시되어 있다. pCMV6-도입 벡터를 통해 HEK293T 세포에서 발현된 FLAG-myc 태그 포함 단백질을 포함하는 HEK293T 세포 용해물 또는 빈 pCMV6-도입 벡터로 형질전환된 세포의 용해물(음성 대조군)을 비코팅된 니트로셀룰로스 슬라이드(음성 대조군) 및 항-FLAG 항체로 코팅된 니트로셀룰로스 슬라이드 상에 반점화하였다. 그 다음, 슬라이드를 항-myc 항체로 프로빙하여 고정화된 FLAG-myc 태그 포함 단백질을 가시화하거나 항-베타 액틴 항체로 프로빙하여 태그 불포함 세포 단백질을 대표하는 액틴을 가시화하였다.

도 9에 예시된 바와 같이, 항-myc 항체 결합은 myc-FLAG 태그 포함 단백질이 단단하고 비교적 균일하고 조밀하게 염색되는 반점으로 항-FLAG로 코팅된 니트로셀룰로스 슬라이드에 결합하는 반면, 상기 단백질이 보다 넓고 보다 확산되고 보다 덜 조밀한 반점으로 비코팅된 슬라이드에 결합함을 보여주었다. 어느 한 유형의 슬라이드 상에서도 항-myc 항체에 의한 음성 대조군의 염색은 없었다. 항-FLAG로 코팅된 슬라이드 상에서 반점의 항-베타 액틴 면역염색은 없었는데, 이는 차단 단계가 비특이적 결합을 방해하는 데에 효과적이었고 용해물이 슬라이드 상에 반점화된 후 거대한 세포 단백질이 효율적으로 세척되어 제거되었음을 보여준다. 비코팅된 슬라이드에의 항-myc 항체 결합은 어두운 환형을 갖는 확산된 반점으로 거대한 세포 단백질의 결합을 보여주었다.

칩 상에서의 1 단계 면역친화성 정제는 임의의 태그 포함 단백질과 함께 사용될 수 있으므로 태그 포함 융합 단백질을 발현하는 벡터를 사용하여 외인성 DNA를 통해 생성된 단백질에 광범위하게 적용될 수 있다. 다양한 태그들이 이 목적을 위해 DDK(FLAG)와 동일한 방식으로 사용될 수 있다.

VII

하기 참고문헌들 및 이들 내의 임의의 부분에서 인용된 참고문헌들은 특히, 본 명세서에서 그들이 참조된 특정한 주제에 대하여 온전히 그대로 본 명세서에 명시적으로 도입된다.

본 발명의 실시양태를 실시함에 있어서 유용할 수 있는 폴리뉴클레오티드, 외인성 유전자의 발현, 발현 벡터, 및 형질전환된 세포 내에서의 단백질 생성에 대한 정보는 상기 실시양태들이 속하는 분야에서 잘 공지되어 있고 널리 입수가능하다. 이러한 정보는 예를 들면, 하기 참고문헌들에서 발견될 수 있다:

문헌[Hames et al., Polynucleotide Hybridization, IRL Press, 1985];

문헌[Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology, Elsevir Sciences Publishing, Inc., New York, 1986];

문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning, 3^rd Ed. CSH Press, 2001];

문헌[Howe, Gene Cloning and Manipulation, Cambridge University Press, 1995]; 및

문헌[Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., 1994 to the present].

여기서 인용된 참조문헌들에서 언급된 추가 정보는 하기 참고문헌들에서 발견될 수 있다:

문헌[Barbulovic-Nad, I., Lucente, M., Sun, Y., Zhang, M., Wheeler, A. R., and Bussmann, M. (2006) Bio-microarray fabrication techniques--a review. Crit Rev Biotechnol 26, 237-259];

문헌[Chan, S. M., Ermann, J., Su, L., Fathman, C. G., and Utz, P. J. (2004) Protein microarrays for multiplex analysis of signal transduction pathways. Nat Med 10, 1390-1396];

문헌[Cheadle, C., Vawter, M. P., Freed, W. J., and Becker, K. G. (2003) Analysis of microarray data using Z score transformation. J Mol Diagn 5, 73-81];

문헌[Chiang, C. M., Ge, H., Wang, Z., Hoffmann, A., and Roeder, R. G. (1993) Unique TATA-binding protein-containing complexes and cofactors involved in transcription by RNA polymerases II and III. Embo J 12, 2749-2762];

문헌[Chiang, C. M., and Roeder, R. G. (1993) Expression and purification of general transcription factors by FLAG epitope-tagging and peptide elution. Pept Res 6, 62-64];

문헌[Ekins, R. P. (1989) Multi-analyte immunoassay. J Pharm Biomed Anal 7, 155-168];

문헌[Gloeckner, C. J., Boldt, K., Schumacher, A., and Ueffing, M. (2009) Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Mammalian Cells by the Strep/FLAG (SF)-TAP Tag. Methods Mol Biol 564, 359-372];

문헌[Goshima, N., Kawamura, Y., Fukumoto, A., Miura, A., Honma, R., Satoh, R., Wakamatsu, A., Yamamoto, J., Kimura, K., Nishikawa, T., et al., (2008) Human protein factory for converting the transcriptome into an in vitro-expressed proteome. Nat Methods 5, 1011-1017];

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Claims

단백질 P₁ 내지 P_n을 포함하는 용해물 L₁ 내지 L_n을 지지체 상의 위치 S₁ 내지 S_n에 도포하는 단계를 포함하는, 단백질 어레이(array)를 제조하는 방법으로서,
각각의 용해물 L_x는 외인성 DNA D_x를 통해 그 내부에서 발현된 단백질 P_x를 포함하는 세포 C_x의 용해물이고 위치 S_x에 도포되며,
P₁ 내지 P_n은 모두 서로 상이하며,
S₁ 내지 S_n은 모두 서로 상이하며,
n은 1 초과의 정수이며,
x는 1 내지 n의 정수인 것인 방법.
단백질 P₁ 내지 P_n을 지지체 상의 위치 S₁ 내지 S_n에 도포하는 단계를 포함하는, 단백질 어레이를 제조하는 방법으로서,
각각의 단백질 P_x는 외인성 DNA D_x를 통해 세포 C_x 내에서 발현되고 위치 S_x에 도포되며,
P₁ 내지 P_n은 모두 서로 상이하며,
S₁ 내지 S_n은 모두 서로 상이하며,
n은 1 초과의 정수이며,
x는 1 내지 n의 정수인 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 단백질이 유기체의 1,000개 이상의 상이한 좌위를 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 유기체의 게놈에 의해 코딩된 단백질의 20% 이상을 총체적으로 포함하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈이 인간 게놈인 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용해물의 50% 이상에 대해 어레이 내의 각각의 위치에 도포된 용해물 단백질의 양이 상기 용해물의 100개 이상의 세포 내의 총 단백질의 양인 것인 방법.
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 또는 용해물이 유리 슬라이드 상의 니트로셀룰로스에 도포되는 것인 방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 지지체가 친화성 태그(tag)에 대해 특이적인 포획 시약으로 코팅되고, 단백질이 상기 태그를 포함하고 상기 포획 시약에의 결합에 의해 정제되는 것인 방법.
지지체 상의 위치 S₁ 내지 S_n에서 단백질 P₁ 내지 P_n을 포함하는 용해물 L₁ 내지 L_n을 포함하는 단백질 어레이로서,
각각의 용해물 L_x는 외인성 DNA D_x를 통해 그 내부에서 발현된 단백질 P_x를 포함하는 세포 C_x의 용해물이고 위치 S_x에 도포되며,
P₁ 내지 P_n은 모두 서로 상이하며,
S₁ 내지 S_n은 모두 서로 상이하며,
n은 1 초과의 정수이며,
x는 1 내지 n의 정수인 것인 단백질 어레이.
지지체 상의 위치 S₁ 내지 S_n에서 단백질 P₁ 내지 P_n을 포함하는 단백질 어레이로서,
각각의 단백질 P_x는 외인성 DNA D_x를 통해 세포 C_x 내에서 발현되고 위치 S_x에 도포되며,
P₁ 내지 P_n은 모두 서로 상이하며,
S₁ 내지 S_n은 모두 서로 상이하며,
n은 1 초과의 정수이며,
x는 1 내지 n의 정수인 것인 단백질 어레이.
제9항 또는 제10항에 있어서, 단백질이 유기체의 1,000개 이상의 상이한 좌위를 포함하는 것인 단백질 어레이.
제9항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 유기체의 게놈에 의해 코딩된 단백질의 20% 이상을 총체적으로 포함하는 것인 단백질 어레이.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 게놈이 인간 게놈인 것인 단백질 어레이.
제9항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 용해물의 50% 이상에 대해 어레이 내의 각각의 위치에 도포된 용해물 단백질의 양이 상기 용해물의 100개 이상의 세포 내의 총 단백질의 양인 것인 단백질 어레이.
제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질 또는 용해물이 유리 슬라이드 상의 니트로셀룰로스에 도포되는 것인 단백질 어레이.
제9항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 단백질이 친화성 태그를 포함하고 그 내부에 고정화된 친화성 태그에 대해 특이적인 포획 시약에 의해 지지체에 결합되는 것인 단백질 어레이.
항체 또는 항체 제제와 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계, 및 상기 측정으로부터 상기 어레이 내의 단백질에 대한 상기 항체 또는 항체 제제의 결합 특이성을 확인하는 단계를 포함하는, 항체 또는 항체 제제의 결합 특이성을 측정하는 방법.
하나 이상의 건강한 개체로부터의 샘플 및 질환을 앓는 하나 이상의 병든 개체로부터의 샘플과 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계, 및 상기 건강한 개체로부터의 샘플의 결합과 상기 병든 개체로부터의 샘플의 결합에서의 차이로부터 상기 질환의 단백질 생체마커를 결정하는 단계를 포함하는, 질환의 단백질 생체마커를 결정하는 방법.
하나 이상의 건강한 대상체로부터의 항체 함유 샘플 및 자가면역 질환을 앓는 하나 이상의 대상체로부터의 항체 함유 샘플과 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계, 및 상기 건강한 대상체로부터의 샘플 중의 항체의 결합과 상기 자가면역 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플 중의 항체의 결합에서의 차이로부터 상기 자가면역 질환의 단백질 생체마커를 결정하는 단계를 포함하는, 자가면역 질환의 생체마커를 결정하는 방법.
하나 이상의 건강한 대상체로부터의 샘플 및 건강한 개체에 존재하지 않는 항체의 존재를 특징으로 하는 질환을 앓는 하나 이상의 대상체로부터의 샘플과 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계, 및 상기 건강한 대상체로부터의 샘플 중의 항체의 결합과 상기 질환을 앓는 대상체로부터의 샘플 중의 항체의 결합에서의 차이로부터 상기 질환의 단백질 생체마커를 결정하는 단계를 포함하는, 건강한 개체에 존재하지 않는 항체의 존재를 특징으로 하는 질환의 생체마커를 결정하는 방법.
건강한 개체에 존재하지 않는 항체의 존재를 특징으로 하는 질환을 앓을 가능성이 있는 대상체로부터의 항체 함유 샘플과 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계, 및 상기 샘플 중의 항체와 상기 어레이의 결합으로부터 상기 질환의 부재 또는 존재를 결정하는 단계를 포함하는, 건강한 개체에 존재하지 않는 항체의 존재를 특징으로 하는 질환을 진단하는 방법.
신호 전달 경로 단백질을 포함하는 샘플과 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계를 포함하는 신호 전달 경로를 모니터링하는 방법으로서, 이때 상기 어레이 내의 단백질에의 결합이 상기 신호 전달 경로 단백질의 부재, 존재 및/또는 양을 표시하는 것인 방법.
소분자를 포함하는 샘플과 제9항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 단백질 어레이의 결합을 측정하는 단계를 포함하는, 소분자와 단백질 사이의 상호작용을 측정하는 방법.