KR20130094875A

KR20130094875A - 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체를 포함하는 조영제, 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20130094875A
Application number: KR1020120016107A
Authority: KR
Inventors: 이강호; 장용민; 김태정
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2012-02-17
Filing date: 2012-02-17
Publication date: 2013-08-27
Anticipated expiration: 2032-02-17
Also published as: KR101661552B1

Abstract

본 발명은 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체를 포함하는 조영제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체는 사이즈가 매우 작아서, 신장을 통해 소변으로 배출되기 용이하다. 따라서, 모든 기관에서 발생되는 질병의 진단을 위한 조영제로 사용될 수 있으며, 특히, 간과 신장에서 보다 효율적인 질병진단용 조영제로 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 나노입자체를 제조하기 위한 조건이 고온 또는 고압을 사용하지 않는 간단한 제조방법으로서, 제조 비용이 낮다는 장점이 있어서, 의학 진단 분야에 사용할 수 있는 조영제를 효과적으로 제조 및 사용할 수 있는 장점이 있다.

Description

산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체를 포함하는 조영제, 및 이의 제조방법 {CONTRAST AGENTS COMPRISED COUPLING DYSPROSIUM OXIDE NANOPARTICLES BY BIOCOMPATIBLE LIGAND, AND SYNTHESIZING METHOD THEREOF}

본 발명은 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체를 포함하는 조영제, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

생체내에서 발생하는 질병은 조기 진단하는 것이 질환 치료에 있어서 매우 중요한 요소로 알려져 있다. 질환 검사방법에는 대표적으로 혈액검사, 생체검사, 분자영상법 등이 있다. 혈액 검사는 혈액 속에 특정 성분의 농도가 변경되는 것을 살펴보는 것인데, 예컨데, 간 질환의 경우, 빌리루빈(bilirubin), 아미노전이효소(Aminotransferases), 알칼라인 인산 분해효소(ALP,Alkaline phosphatase), 알부민(albumin), 글로부린(globulin)등의 혈청 암모니아(ammonia), 약물 청소율(drug clearance) 등을 측정하여 간 질환을 진단하는 방법이 있다. 그러나, 위와 같이 혈액을 통한 질병 진단방법은 직접적으로 측정할 수 있는 방법이 아니기에 질환 초기에는 질환 표지물질이 검출되지 않는 문제가 있다. 다음으로 생체검사는 직접 조직을 떼어내어 현미경 등으로 직접 관찰하는 방법으로 정확한 진단을 위해 필수적인 단계이긴 하지만 검사가 용이하지 않는 문제가 있다.

분자영상법은 세포 내에서 일어나는 여러 분자수준의 변화, 즉 유전자의 발현, 생화학적 변화, 생물학적 변화를 영상으로 분석 평가하는 기법으로, 분자생물학과 첨단 영상기술이 접목하여 가능하게 되었으며 의학, 유전학, 분자생물학, 세포학, 화학, 약학, 물리학, 전산학, 의공학, 영상의학, 핵의학의 기술들이 집약되어 있는 기술이다.

최근 들어 분자영상 기술의 빠른 발전으로 질병의 진단 및 병변의 검출이 가능해지고 있다. 특히, 핵의학 영상과 자기공명영상 기술은 질환의 진단에 매우 유용한 검사 시스템으로 주목받고 있다.

상기 자기공명영상(MRI, Magnetic Resonance Imaging) 기술은 자기장 안에서 수소 원자의 스핀이 이완되는 현상을 이용해 신체의 해부학적, 생리학적, 생화학적 정보 영상을 얻는 방법으로서, 인간이나 동물의 신체기관을 비침습적이며 실시간 영상화할 수 있는 뛰어난 영상 진단 장비중의 하나이다.

생명과학이나 의학 분야에서 MRI를 다양하고 정밀하게 활용하기 위해서 외부에서 물질을 주입하여 영상 대조도를 증가하는 방법을 사용하는데, 이러한 물질을 조영제라고 한다. MRI 이미지 상에서 조직들 사이의 대조도(contrast)는 조직 내의 물분자 핵스핀(nuclear spin)이 평형상태로 돌아가는 이완작용(relaxation)이 조직별로 다르기 때문에 생기는 현상인데, 조영제는 이러한 이완작용에 영향을 끼쳐 조직간 이완도의 차이를 벌리고 MRI 시그널의 변화를 유발하여 조직간의 대조를 보다 선명하게 하는 역할을 한다.

영상 대조도를 증가시키는 조영제는 특징과 기능, 주입하는 대상에 따라 활용도와 정밀도의 차이가 생긴다. 조영제를 이용하여 증강된 대조는 특정 생체기관과 조직들의 주변과 영상신호를 높이거나 낮추어서 보다 선명하게 영상화하게 해 준다. MRI 영상을 얻기를 원하는 신체부위의 영상신호를 주위보다 상대적으로 높게 만드는 조영제를 양성(positive) 조영제라고 하며, 이와 반대로 주위보다 상대적으로 낮게 만드는 조영제를 음성(negative) 조영제라고 한다.

음성 조영제로는 현재 산화철나노입자 한가지밖에 없는데, 산화철나노입자 조영제는 나노입자 사이즈가 너무 커서 간조영제로만 사용된다. 그러나, 다양한 질환의 진단을 위해서는 조영제로 사용할 물질의 입자 크기가 나노 사이즈로 매우 작아야, 생체 내 모든 기관에 적용이 가능하다

또한, 조영제는 자성을 띄는 상자성이 있어야 하는데, 조영제의 제조에 사용되는 상자성 나노입자로는 Mn, Fe, Co, Ni, Gd 등이 있으며, 이들 상자성 나노입자는 비수용성 및 독성 등과 같은 문제을 가지고 있어서, 이를 해결하기 위하여 상자성 나노입자 표면을 다양한 물질로 코팅하려는 시도가 있다.

종래에 조영제의 기능을 높이기 위한 대한민국 등록특허 제1072666호 “산화가돌리늄 나노입자에 생체적합성 리간드가 코팅된 나노입자체 및 이의 제조방법”에는 산화가돌리늄 표면을 생체적합성 리간드인 폴리에틸렌 글리콜, 락토바이오닉산 또는 D-글루쿠로닉산으로 코팅하여 제조되는 나노입자체가 기재되어 있다.

그러나, 상기 등록특허 제1072666호의 나노입자체는 뇌질환 진단을 위해 사용하는 조영제로서, 생체내에서 다양한 형태로 발병할 수 있는 질병 진단용 조영제로 사용하기에는 한계가 있다.

상술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 본 발명의 목적은 산화디스프로슘 나노입자를 제조하고, 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체를 포함하는 조영제, 및 이의 제조방법을 제공하고자 한다.

위와 같은 과제를 달성하기 위하여, 본 발명은 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합되어 이루어지는 산화디스프로슘 나노입자체를 포함하는 MRI 조영제를 제공한다.

상기 생체적합성 리간드에 항체 또는 단백질이 결합될 수 있다.

상기 생체적합성 리간드는 폴리에틸렌 글리콜, 락토바이오닉산, D-글루쿠로닉산 등을 이용할 수 있으며, D-글루쿠로닉산인 것이 바람직하다.

상기 생체적합성 리간드가 결합된 산화디스프로슘 나노입자체의 직경은 1 ~ 5 ㎚인 것이 바람직하다.

상기 산화디스프로슘 나노입자체는 생체적합성 리간드가 나노입자체 전체중량에 대해서 50~60 중량%로 하여 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 1) 글리콜에 디스프로슘 전구체를 첨가하여 용해시키고, 염기성 용액을 첨가하고 70~90 ℃로 반응시켜 반응물 1을 제조하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 반응물 1에 과산화수소를 첨가하고, 반응시켜 반응물 2를 제조하는 단계; 및 3) 상기 반응물 2에 생체적합성 리간드를 첨가하고, 반응시키는 단계; 를 포함하여 이루어지는 산화디스프로슘 나노입자체 제조방법을 제공한다.

상기 단계 1)의 글리콜은 트리에틸렌 글리콜 또는 트리프로필렌 글리콜을 사용할 수 있다.

상기 단계 2)의 반응물 2에는 산화된 디스프로슘을 포함할 수 있다.

상기 단계 3)의 생체적합성 리간드는 폴리에틸렌 글리콜, 락토바이오닉산, D-글루쿠로닉산 등을 사용할 수 있다.

상기 단계 3)의 생체적합성 리간드에 항체 또는 단백질이 결합되어 있는 것을 사용할 수 있다.

상기 제조방법으로 생성되는 산화디스프로슘 나노입자체의 직경은 1 ~ 5 ㎚일 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 산화디스프로슘 나노입자체 제조방법으로 통해서 제조된 산화디스프로슘 나노입자체를 포함하는 MRI 조영제를 것을 제공한다.

상기 MRI 조영제는 간 또는 신장 질병 진단을 위하여 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조영제를 주입하는 단계를 포함하는 질병의 진단방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조영제를 이용한 MRI 영상 획득방법을 제공한다.

본 발명에 따른 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체는 사이즈가 매우 작아서, 신장을 통해 소변으로 배출되기 용이하다. 따라서, 모든 기관에서 발생되는 질병의 진단을 위한 조영제로 사용될 수 있으며, 특히, 간과 신장에서 보다 효율적인 질병진단용 조영제로 사용될 수 있다.

또한 본 발명의 나노입자체를 제조하기 위한 조건이 고온 또는 고압을 사용하지 않는 간단한 제조방법으로서, 제조 비용이 낮다는 장점이 있어서, 의학 진단 분야에 사용할 수 있는 조영제를 효과적으로 제조 및 사용할 수 있는 장점이 있다.

도 1은 본 발명의 제조방법에 따라 생성된 희토류 원소가 포함되는 나노입자체의 전자현미경 사진이다((a)는 비교예 1, (b)는 비교예 2, (c)는 실시예 1, (d)는 비교예 3, (e)는 비교예 4).
도 2는 희토류 원소가 포함된 나노입자체의 X-선 회절분석 실험 결과이다((a)는 비교예 1, (b)는 비교예 2, (c)는 실시예 1, (d)는 비교예 3, (e)는 비교예 4).
도 3은 희토류 원소가 포함된 나노입자체의 FT-IR 측정 결과이다((a)는 비교예 1, (b)는 비교예 2, (c)는 실시예 1, (d)는 비교예 3, (e)는 비교예 4).
도 4는 희토류 원소가 포함된 나노입자체의 TGA 측정 결과이다((a)는 비교예 1, (b)는 비교예 2, (c)는 실시예 1, (d)는 비교예 3, (e)는 비교예 4).
도 5는 희토류 원소가 포함된 나노입자체의 이완성을 측정한 결과이다((a)는 비교예 1, (b)는 비교예 2, (c)는 실시예 1, (d)는 비교예 3, (e)는 비교예 4).
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 산화디스프로슘 나노입자체의 농도에 따른 이완성을 측정한 결과이다.
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 산화디스프로슘 나노입자체의 세포독성 실험결과이다.
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 산화디스프로슘 나노입자체의 in vivo 실험 결과이다.
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 산화디스프로슘 나노입자체를 생체내 주입 90분 후, 나노입자체의 조직분포를 나타낸 것이다.

본 발명은 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합되어 이루어지는 산화디스프로슘 나노입자체를 포함하는 MRI 조영제를 제공한다.

상기 산화디스프로슘은 디스프로슘이 산화된 것인데, 디스프로슘은 비교적 단단하고 반응성이 매우 큰 금속으로, 공기와 물에 의해 산화된다. 녹는점이 매우 높고, 중성자를 흡수할 수 있으므로 원자로 내에서 제어봉으로 사용된다. 정유산업에서 촉매로, 전자장치의 부품으로, 인광물질의 활성제로 쓰인다. 실온에서 디스프로슘 금속의 결정구조는 육방최밀격자이며, －168 ℃ 이하에서 강자성을 띠는 특성이 있다.

화학적으로 디스프로슘은 3가의 원자가를 갖는 희토류 금속으로 행동하며, 연한 황색의 화합물을 만든다. Dy³ ⁺이온은 강한 상자성을 나타낸다. 따라서, 본 발명은 나노입자체에 디스프로슘 나노입자를 사용하되, 강한 상자성을 띌 수 있도록 산화된 형태로 한다.

상기 생체적합성 리간드는 세포특이적 결합을 위하여 항체를 결합시킬 수 있으며, 특정 질환의 치료 목적 또는 결합을 위하여 세포 특이 단백질이 결합될 수 있다.

이때, 상기 생체적합성 리간드는 폴리에틸렌 글리콜, 락토바이오닉산, D-글루쿠로닉산 등을 사용할 수 있으며, D-글루쿠로닉산인 것이 바람직하다.

D-글루쿠로닉산은 포도당 6자리의 알코올잔기를 카르복시기로 치환한 형태인데, 소변에서 페놀류, 스테로이드류의 배당체(D-글루쿠로니드)형으로 발견하는 것 외에, 동물에서는 글리코사미노글리칸의 구성당, 식물에서는 아라비아고무, 헤미셀룰로오스, 사포닌 등의 구성당, 세균이 분비하는 협막다당에서도 발견된다. 본 발명에서 D-글루쿠로닉산은 상기 산화디스프로슘이 생체내 독성을 나타내지 않게 하기 위하여 사용되는데, 산화디스프로슘 나노입자에 결합되어 산화디스프로슘 나노입자체가 된다.

상기 생체적합성 리간드가 결합된 산화디스프로슘 나노입자체의 직경은 1 ~ 5 ㎚이다. 상기 산화디스프로슘 나노입자체의 직경범위는 작은 직경으로 인해서 생체내 모든기관에 적용이 가능하게 할 수 있는 범위이다.

상기 산화디스프로슘 나노입자체는 생체적합성 리간드가 산화디스프로슘 나노입자체 전체중량에 대해서 50~60 중량%로 하여 이루어질 수 있다. 상기 생체적합성 리간드가 나노입자체 전체중량에 대해서, 50 중량% 미만일 경우에는 산화디스프로슘 표면에 충분히 결합되기 어렵고, 60 중량%를 초과할 경우에는 초과량에 비하여 더욱 효과가 상승하지 않아 경제성이 떨어진다

본 발명의 산화디스프로슘 나노입자체의 제조방법은,

1) 글리콜에 디스프로슘 전구체를 첨가하여 용해시키고, 염기성 용액을 첨가하고 70~90 ℃로 반응시켜 반응물 1을 제조하는 단계;

2) 상기 단계 1)의 반응물 1에 과산화수소를 첨가하고, 반응시켜 반응물 2를 제조하는 단계; 및

3) 상기 반응물 2에 생체적합성 리간드를 첨가하고, 반응시키는 단계;

를 포함하여 이루어진다.

상기 단계 1)은 글리콜에 디스프로슘 전구체를 첨가하여 용해시키고, 염기성 용액을 첨가하고 70~90 ℃로 반응시켜 반응물 1을 제조하는 단계이다.

상기 글리콜은 디스프로슘을 반응시키기 위한 용매로 사용되는 것으로서, 이때, 상기 글리콜은 트리에틸렌 글리콜 또는 트리프로필렌 글리콜 등을 사용할 수 있다.

또한, 상기 디스프로슘 전구체는 디스프로슘 원소를 포함하고 있는 물질로서, 글리콜에 용해되는 경우, Dy³ ⁺로 해리될 수 있으며, 디스프로슘의 물질 특성에 의해, 상자성을 띄게 될 수 있다. 이때, 상기 디스프로슘 전구체는 DyCl₃, Dy(NO₃)₃ 등을 선택하여 사용할 수 있다.

글리콜 20~40 ㎖에 디스프로슘 전구체 3~7 mmol로 하여 첨가하여 용해시킨다. 이때, 수산화물 나노입자를 형성시키기 위하여 NaOH 또는 KOH 등의 염기성 용액을 첨가하고, 반응이 효율적으로 이루어지게 하기 위하여, 70~90 ℃로 온도를 유지하여 반응시킨다. 이때, 상기 반응온도 범위는 전구체와 염기의 반응이 효율적으로 이루어지게 하기 위한 온도범위이다.

상기 단계 2)는 반응물 1에 과산화수소를 첨가하고, 반응시켜 반응물 2를 제조하는 단계이다.

상기 반응물 1에 포함된 Dy(OH)₃ 포함되어 있는데, 여기에 과산화수소를 첨가함하고 반응시킴으로서, 반응물 2가 제조될 수 있다. 상기 반응을 통해서 반응물 2에는 산화디스프로슘이 생성될 수 있다.

상기 단계 3)은 상기 반응물 2에 생체적합성 리간드를 첨가하고, 반응시키는 단계이다.

상기 반응물 2에는 산화디스프로슘이 있으며, 상기 산화디스프로슘이 생체내 독성을 나타내지 않으면서도, 입자끼리 뭉치지 않도록 하기 위하여, 생체적합성 리간드를 첨가하여 산화디스프로슘에 생체적합성 리간드가 결합될 수 있다. 이때, 상기 생체적합성 리간드는 폴리에틸렌 글리콜, 락토바이오닉산, D-글루쿠로닉산 등을 사용할 수 있다. 본 제조방법을 통해서 제조되는 산화디스프로슘 나노입자체의 세포특이적 특성을 부여하기 위해 상기 생체적합성 리간드에 항체 또는 단백질이 결합될 수 있다.

본 발명의 제조방법으로 생성되는 산화디스프로슘 나노입자체의 직경은 1 ~ 5 ㎚일 수 있다.

상기 산화디스프로슘 나노입자체는 생체적합성 리간드가 산화디스프로슘 나노입자체 전체중량에 대해서 50~60 중량%로 하여 이루어질 수 있다. 상기 생체적합성 리간드가 나노입자체 전체중량에 대해서, 50 중량% 미만일 경우에는 산화디스프로슘에 충분히 결합되기 어렵고, 60 중량%를 초과할 경우에는 초과량에 비하여 더욱 효과가 높아지지 않는다는 문제점이 있다.

이상에서 설명한 본 발명의 제조방법에 따른 산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체가 간단하게 제조된다. 즉, 상기 언급된 바와 같이, 상기 반응을 수반하는 합성 단계에 의해, 디스프로슘 전구체가 나노 크기 입자인 산화된 디스프로슘이 되고, 상기 산화디스프로슘의 입자 표면에는 생체적합성 리간드가 결합된다. 또한, 본 발명에 따른 최종산물은 초미세 크기로 제조되어 인체 흡수가 빠르며, 제조비용이 저렴하다는 장점이 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 산화디스프로슘 나노입자체 제조방법으로 통해서 제조된 산화디스프로슘 나노입자체를 포함하는 MRI 조영제를 제공한다.

본 발명의 산화디스프로슘 나노입자체를 유효성분으로 포함하는 MRI 조영제는 유효성분 안정성을 높이기 위하여 보조 성분을 추가할 수 있다. 바람직한 보조성분으로는 산도가 pH = 7인 소듐시트레이트(sodiumcitrate) 완충용액 등을 혼합하여 본 발명에 따른 산화디스프로슘 나노입자체의 안정성을 높이고, 이를 통해 인체내 사용하기 적절한 조영제로 사용할 수 있다.

본 발명의 조영제는 인체내 주입된 후, 일정시간 후에 MRI 장치를 이용하여, 생체내 영상이미지를 얻을 수 있는데, 이때 영상이미지는 주입된 조영제에 포함된 나노입자가 생체내 각 기관의 모세혈관 또는 조직들 사이에 분포되고, 이를 MRI 장비를 이용하여 조직내의 물분자 핵스핀이 평형상태로 돌아가는 이완작용을 유발시킨다. MRI 장치는 조직간의 다른 이완도에 의해 생성되는 대조도 차이를 벌리고, 자기적 시그널의 변화를 측정하여 조직내 이상 조직을 발견함으로서 질병을 진단할 수 있다.

본 발명의 조영제 및/또는 제약 조성물의 투여에 사용되는 투여량 및 처방은 질환의 진단 또는 치료에 있어 숙련된 자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 조영제의 투여량은 수혜자의 연령, 성별, 건강 및 체중, 수반되는 치료의 종류, 만약 있다면 치료 횟수, 및 목적하는 효과의 특성에 따라 달라질 것으로 이해된다. 임의의 투여 방식에 있어, 전달되는 조영제의 실제량 뿐만 아니라 본원에 기재된 유리한 효과를 달성하는데 필요한 투여 계획은 또한 부분적으로는 조영제의 생체이용가능성, 치료 또는 진단되는 장애, 목적하는 치료 또는 진단 투여량 및 당업자에게 명백할 것인 다른 요인과 같은 요인에 따라 달라질 것이다. 본 발명에 있어서 동물, 특히 인간에게 투여되는 투여량은 동물에서 적당한 기간에 걸쳐 목적하는 치료 또는 진단 반응을 나타내기에 충분해야 한다.

투여에 적절한 나노입자체를 포함하는 조영제의 양은 빠르게 제거되는 조영제가 덜 빠르게 제거되는 것 보다 높은 투여량이 투여될 필요가 있을 수 있다는 점에서 선택된 조영제의 분배 프로파일에 따라 달라진다. 생체내 분배 및 국지화는 투여 후의 적절한 시점, 비-표적 조직에서의 제거 속도에 대한 표적 부위에서의 축적 속도에 따라 통상적으로는 30 분과 180 분 사이에 표준 MRI 영상 기술에 따라 추적할 수 있다.

이하, 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며, 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> D- 글루쿠로닉산이 결합된 산화디스프로슘 나노입자체의 제조

트리에틸렌 글리콜 30 ㎖에 디스프로슘(dysprosium) 전구체 5 mmol을 첨가하고, 이를 50 ℃에서 산화디스프로슘이 용해될 때까지 교반하여 혼합액을 제조하였다. 상기 혼합액에 15 mmol NaOH를 첨가하고, 80 ℃를 유지하며 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 여기에 과산화수소액 7.5 ㎖을 주사기를 이용하여 천천히 첨가하였다. 반응 혼합액은 추가적으로 2시간 동안 반응시켜, 산화디스프로슘 나노입자를 제조하였다.

상기 산화디스프로슘 나노입자가 생성된 용액에 5 mmol D-글루쿠로닉산을 첨가하고, 6 시간동안 추가반응을 실시하였다. 반응이 완료된 용액을 상온으로 냉각하고, 냉각된 용액을 1L 비이커에 넣고, 3차 증류수 500 ㎖을 추가로 첨가하고, 1시간 동안 교반하였다. 이를 1주일간 방치하여, 침전물을 형성시키고, 상층액을 제거한 후, 3차 증류수로 재세척을 실시하였다. 이를 3회 실시하여 D-글루쿠로닉산이 결합된 산화디스프로슘 나노입자체(밝은 노란색)를 제조하였다.

< 비교예 1> D- 글루쿠로닉산이 결합된 산화가돌리늄 나노입자체의 제조

디스프로슘 전구체 대신에 가돌리늄(gadolinium) 전구체를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 D-글루쿠로닉산이 결합된 산화가돌리늄 나노입자체(밝은 노란색)를 제조하였다.

< 비교예 2> D- 글루쿠로닉산이 결합된 산화디스프로슘 나노입자체의 제조

디스프로슘 전구체 대신에 유로퓸(europium) 전구체를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 D-글루쿠로닉산이 결합된 산화유로퓸 나노입자체(노란색)를 제조하였다.

< 비교예 3> D- 글루쿠로닉산이 결합된 산화홀뮴 나노입자체의 제조

디스프로슘 전구체 대신에 홀뮴(holmium) 전구체를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 D-글루쿠로닉산이 결합된 산화홀뮴 나노입자체(짙은 노란색)를 제조하였다.

< 비교예 4> D- 글루쿠로닉산이 결합된 산화에르븀 나노입자체의 제조

디스프로슘 전구체 대신에 에르븀(erbium) 전구체를 사용하는 것을 제외하고는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 하여 D-글루쿠로닉산이 결합된 산화에르븀 나노입자체(짙은 노란색)를 제조하였다.

< 실험예 1> 나노입자체 크기 측정

상기 실시예 1 및 비교예 1~4에서 제조된 나노입자체를 전자현미경으로 측정하기 위하여, 상기 나노입자체를 메탄올에 분산처리를 한 후, 시편을 제작하였다. 이를 고해상도 전자현미경(제작사: JEOL, 모델: JEM-ARM 1300S, 1.2 MeV)으로 측정하였다. 그 결과를 하기 표 1 및 도 1에 나타내었다.

샘플	나노입자	나노입자체 크기(㎚)
실시예 1	Dy₂O₃	2.9
비교예 1	Gd₂O₃	2.4
비교예 2	Eu₂O₃	2.0
비교예 3	Ho₂O₃	2.4
비교예 4	Er₂O₃	2.9

상기 표 1에서 보는 바와 같이, 본 발명에 따른 생체적합성 리간드가 결합된 나노입자체들은 균일하고, 2.0 ~ 2.9 ㎚ 입자 크기를 보였다. 이는 본 발명에 따른 나노입자체가 인체 흡수가 용이하게 이루어질 수 있음을 간접적으로 나타내었다.

형태상 특징은 도 1을 통해서 더욱 상세히 볼 수 있다.

< 실험예 2> X- 레이 회절분석

나노입자의 결정구조를 확인하기 위하여 나노입자체를 분말형태로 공기중에서 말려서 이를 X-회절기 (제작사: Philips, 모델: X'PERT PRO MRD)을 사용해 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 제조방법을 통하여 제조된 나노입자의 결정구조는 입방구조에 해당하는 결정구조를 가짐을 알 수 있었다. 또한, 이들을 열분석기 (TGA)로 700 ℃로 가열한 다음 얻은 파우더를 다시 결정구조를 측정해 보니 벌크에서 관찰되는 입방구조를 관찰하였다.

< 실험예 3> 나노입자체의 생체고분자 결합 상태 측정

본 실시예 물질의 구조분석 및 D-글루쿠로닉산의 결합된 양을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1 및 비교예 1~4의 FT-IR 적외선분광광도계(Fourier Transform Infrared Spectrophotometer, 제작사: Mattson Instruments Ins., 모델: Galaxy 7020A)에 투입하고 측정하였다.

또한, 열중량분석기(thermogravimetric analyzer, TA Instruments, SDT-Q 600)를 이용하여 나노입자 표면에 결합된 글루쿠로닉산의 양을 측정하였다. 사용되는 실시예 1 및 비교예 1~4는 건조된 것을 사용하였으며, 상온에서 700 ℃에서 측정하였다.

그 결과를 하기 표 2, 도 3 (a) ~ (e), 도 4(a) ~ (e)에 나타내었다.

샘플	나노입자	D-글루쿠로닉산 그라프트 밀도 (㎚^-1)	전체질량 대비 D-글루쿠로닉산 함량(중량%)
실시예 1	Dy₂O₃	12.74	52.11
비교예 1	Gd₂O₃	11.46	56.64
비교예 2	Eu₂O₃	9.43	55.21
비교예 3	Ho₂O₃	12.35	54.20
비교예 4	Er₂O₃	19.74	60.38

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 실시예 1 및 비교예 1~4의 나노입자체에서 나노입자에 결합된 D-글루쿠로닉산 그라프트 밀도는 최소 9.43에서 최대 19.74로 나타났으며, 나노입자체에서 D-글루쿠로닉산의 함량은 전체중량에 대해서 최소 55.21 중량%에서 최대 60.38 중량%으로 D-글루쿠로닉산이 결합되어 있음을 알 수 있었다.

도 3에서 나타난 바와 같이, 2920-2950, 1600-1620 및 1070-1080 cm^-1 각각은 C-H, C=O 및 C-O 진동을 나타내며, 이는 D-글루쿠로닉산이 나노입자에 결합되어 있음을 알 수 있었다.

도 4에서 나타난 바와 같이, D-글루쿠로닉산이 나노입자에 결합된 양을 보여준다. 실시예 1의 나노입자체에는 D-글루쿠로닉산이 52.11% 됨을 알 수 있었다.

< 실험예 4> 농도에 따른 나노입자체 이완성 측정

실시예 1 및 비교예 1~4에서 제조된 나노입자체를 증류수로 현탁하여 0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 mM 농도로 하여 시료를 제조하였다. 이를 1.5 T MRI 장치(Signa Advantage, GE medical system, 연결 부속장치는 knee coil (EXTREM))로 측정하였다.

r1 및 r2는 1/T1 및 1/T2의 기울기 값으로부터 계산되었다.

그 결과를 하기 표 3, 도 5 및 도 6에 나타내었다.

샘플	나노입자	r1 (s^-1 mM^-1)	r2 (s^-1 mM^-1)
실시예 1	Dy₂O₃	0.16	40.28
비교예 1	Gd₂O₃	4.25	27.11
비교예 2	Eu₂O₃	0.006	3.82
비교예 3	Ho₂O₃	0.13	31.24
비교예 4	Er₂O₃	0.06	14.74

도 5의 그래프를 통해서 r1 및 r2 기울기 값을 구하고, 그 결과를 표 3과 같이 나타내었다., 각 나노입자체는 r1과 r2을 나타내었으며, 본 실시예 1 및 비교예 1~4의 나노입자체는 모두 r2 기울기 값을 나타내었으나, r1은 비교예 1만이 뚜렷한 값의 변화를 보였다. 특히, 실시예 1의 산화디스프로슘은 r2 기울기 값이 높게 나타내었는데, 이는 산화디스프로슘 나노입자는 T2 조영제로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 본 발명의 실시예 1의 나노입자체는 도 6을 통해서도 확인할 수 있듯이 첨가량에 따른 뚜렷한 이완성을 보였다.

따라서, 실시예 1은 T2 조영제로 적절한 물질임을 알 수 있었다.

< 실험예 5> in vitro 세포독성 실험

본 발명의 실시예 1의 산화디스프로슘 나노입자체 세포독성을 측정하기 위하여 하기와 같은 실험을 진행하였다.

세포독성에 사용된 세포주는 인간 전립선 암세포(DU 145)와 간세포주(NCTC 1469)를 사용하였다. 위 세포주를 24-웰 세포 배양 플레이트에 씨드(5X10⁴ 세포주 밀도, 500 ㎕/웰, 5% CO2, 37 ℃)시키고, 24시간 동안 배양하였다. 여기에 실시예 1의 나노입자체를 인산 완충액으로 희석하여 5, 10, 50, 100 uM로 제조하고 이를 처리하고, 48시간 동안 세포주를 배양하였다.

CellTiter-Glo 발광 세포성 분석키트(promega, WI, USA)를 이용하였고, 발광분석기(Victor 3, Perkin-Elmer)를 이용하여 세포내 ATP 측정을 통한 세포 활성을 측정하였다.

그 결과를 하기 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 1의 산화디스프로슘 나노입자체는 2가지의 세포주에 농도를 달리하여 처리함에도 세포 생장율이 전혀 감소되지 않았다. 이로 미루어보아, 본 실시예 1의 나노입자체는 세포독성이 없음을 알 수 있었다.

< 실험예 5> 본 발명에 따른 조영제의 생체 내 조영효과

T2 MR 이미지는 3T MRI 스캐너(GE 3T, Signa HD)를 이용하였다.

수컷 ICR 마우스(6.5주, 116g)를 1.5% 이소플루란이 혼합된 산소 가스로 마취를 시켰다. MRI 조영제를 주입하기 전 상태를 측정하고, 마우스 꼬리를 통해 실시예 1의 나노입자체가 포함된 MRI 조영제 0.05 mmol Dy/kg으로 주입하고, 다시 측정하였다.

측정하는 동안, 마우스는 따뜻한 물담요로 37 ℃로 유지하였다. 측정 실험이 끝나 마우스는 다시 케이지에 넣어 관리하였다. 측정 파라미터는 표 4와 같다.

측정된 결과를 하기 도 8 및 9에 나타내었다.

파라미터	값
H =	3 T
the temperature	37 ℃
NEX	4
FOV	6 - 9 cm
phase FOV	0.7
matrix size	256 X 256
slice thickness	1 - 2 mm
spacing gap	0.5 ~ 1.0 mm
pixel bandwidth	31.25
TR	3000 ms
TE	50 ms

도면 8(a)에 나타난 바와 같이, 간에서 강한 네거티브 조영 증대는 실시예 1의 나노입자체가 포함된 조영제는 주입 후, 30분이 지나, T2 MR이미지에서 명백히 보였다. 간보다는 약하지만, 신장도 30분 후, 네거티브 조영 증대가 나타났다(도 8(b)). 간에서 보여진 강한 시그널 강도는 나노입자체가 간의 세망내피계 시스템에 흡수되어 나타난 것으로 보여진다. 더욱이, 신장에서의 네거티브 조영 증대는 나노입자체가 신장에서 제거됨을 나타내는데, 이는 임상적 적용을 위해서는 중요한 점이다.

도 8의 이미지 결과는 도 9의 그래프에서 보다 명확히 알 수 있는데, 본 실시예 1의 나노입자체를 포함하는 조영제를 주입하고 90분 후에는 조영 신호 강도의 변화가 간에서 높게 나타나고, 그 다음으로 신장에서도 높게 나타남을 볼 수 있었다.

따라서, 실시예 1의 나노입자체를 이용한 MRI 조영제는 간 및 신장에서 조영 효과가 우수함을 알 수 있었다.

상기에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 설명하였지만, 본 발명은 이에 한정되는 것이 아니고 본 발명의 기술 사상 범위 내에서 여러 가지로 변형하여 실시하는 것이 가능하고, 이 또한 첨부된 특허 청구 범위에 속하는 것은 당연하다.

Claims

산화디스프로슘 나노입자에 생체적합성 리간드가 결합되어 이루어지는 산화디스프로슘 나노입자체를 포함하는 MRI 조영제.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 리간드에 항체 또는 단백질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 MRI 조영제.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 리간드는 폴리에틸렌 글리콜, 락토바이오닉산 및 D-글루쿠로닉산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 MRI 조영제.
제3항에 있어서, 상기 생체적합성 리간드는 D-글루쿠로닉산인 것을 특징으로 하는 MRI 조영제.
제1항에 있어서, 상기 생체적합성 리간드가 결합된 산화디스프로슘 나노입자체의 직경은 1 ~ 5 ㎚인 것을 특징으로 하는 MRI 조영제.
제1항에 있어서, 상기 산화디스프로슘 나노입자체는 생체적합성 리간드가 나노입자체 전체중량에 대해서 50~60 중량%로 하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 MRI 조영제.
제1항에 있어서, 상기 조영제는 간 또는 신장 질병 진단을 특징으로 하는 MRI 조영제.
1) 글리콜에 디스프로슘 전구체를 첨가하여 용해시키고, 염기성 용액을 첨가하고 70~90 ℃로 반응시켜 반응물 1을 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 반응물 1에 과산화수소를 첨가하고, 반응시켜 반응물 2를 제조하는 단계; 및
3) 상기 반응물 2에 생체적합성 리간드를 첨가하고, 반응시키는 단계;
를 포함하여 이루어지는 산화디스프로슘 나노입자체의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 1)의 글리콜은 트리에틸렌 글리콜 및 트리프로필렌 글리콜으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노입자체의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 2)의 반응물 2에는 산화된 디스프로슘을 포함하고 있는 것을 특징으로 하는 나노입자체의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 3)의 생체적합성 리간드에 항체 또는 단백질이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 나노입자체의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 단계 3)의 생체적합성 리간드는 폴리에틸렌 글리콜, 락토바이오닉산 및 D-글루쿠로닉산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 나노입자체의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 제조방법으로 생성되는 산화디스프로슘 나노입자체의 직경은 1 ~ 5 ㎚인 것을 특징으로 하는 나노입자체의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 산화디스프로슘 나노입자체는 생체적합성 리간드가 나노입자체 전체중량에 대해서 50~60 중량%로 하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 나노입자체의 제조방법.
제8항의 나노입자체 제조방법으로 통해서 제조된 산화디스프로슘 나노입자체를 포함하는 MRI 조영제.
제15항에 있어서, 상기 조영제는 간 또는 신장 질병 진단을 특징으로 하는 MRI 조영제.
제1항 또는 제15항의 조영제를 주입하는 단계를 포함하는 질병의 진단방법.
제1항 또는 제15항의 조영제를 이용하는 MRI 영상 획득방법.