KR20130103468A - Ｇｐｃｒ19 경로의 활성화에 의한 골수 유래 면역 조절 세포 및 면역 조절 ｂ 림프구의 체내외 증폭 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 GPCR19-연관 질환의 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 GPCR19 아고니스트의 효능 분석 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성되고 Gr-1+CD11b+ 표면 형질형을 가지며 항염증 활성을 갖는 MDSC(Myeloid-derived suppressor cell)를 제공한다. 또한 본 발명은 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성되거나 또는 H-MDSC 처리에 의해 형성되며 B220+ 표면 형질형을 가지며 항염증 활성을 갖는 면역조절 B 세포(Regulatory B cell)를 제공한다. 또한 본 발명은 H-MDSC 또는 BHM 세포를 유효성분으로 포함하는 항염증 약제학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 H-MDSC, 48H BH 또는 BHM 세포를 유효성분으로 포함하는 항암 약제학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 H-MDSC 또는 48H BH 세포를 생체내 증폭시킬 목적으로 조성된 GPCR19 아고니스트를 포함하는 항염증 약제학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 따르면 리포폴리사카라이드(LPS)의 투여로 인해 염증이 유도된 마우스에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(HY-2191)의 투여에 의하여 H-MDSC 세포의 수가 증가하고, 증가된 H-MDSC는 현저한 패혈증 치료 효과를 보인다. 본 발명에 따르면 리포폴리사카라이드(LPS)의 투여로 인해 염증이 유도된 마우스에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(HY2191)의 투여에 의하여 면역조절 B 세포(48h BH 세포)의 수가 증가하고, 증가된 48h BH세포는 현저한 패혈증 치료 효과를 보인다. 본 발명에 따르면 리포폴리사카라이드(LPS)의 투여로 염증이 유도된 마우스에서 H-MDSC의 투여에 의하여 BHM 세포의 수가 증가하고, 증가된 BHM 세포는 현저한 패혈증 치료 효과를 보인다.
Description
본 발명은 GPCR19 아고니스트를 생체 내외에서 세포에 처리하여 골수유래 면역조절 세포 (Myeloid-derived suppressor cell, MDSC) 또는 면역조절 B 세포수를 증가시키고 이 세포들의 항염증 표현형을 증대시키는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 GPCR19 수용체를 경유하는 신호전달체계의 활성화가 질환의 진행 및 발생의 조절에 중대한 영향을 미치는 질환 (이하 GPCR19-연관 질환)들의 치료를 목적으로 GPCR19 아고니스트를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 또한 본 발명은 GPCR19-연관 질환 치료제로 GPCR19 아고니스트의 효능 분석 방법에 관한 것이다.
패혈증은 미생물 감염 후 보체계, 혈액응고계, 선천 면역 세포계 등의 동시 다발적 활성화에 기인한 전신성 염증 반응 증후군(systemic inflammatory response syndrome; SIRS)을 시작으로 점차 환자가 쇼크에 이르러 30~50%의 환자가 사망하는 질환이다. 따라서 이러한 패혈증은 한 두 가지 염증 유발 경로 (TLR4 pathway, complement and coagulation pathway) 차단을 통하여 억제되지 않을 것이라는 것은 쉽게 추정 가능하며, 대부분의 환자에서 치료가 시작되는 시기는 이미 염증 유발 경로가 모두 활성화 된 후일 경우(established sepsis)가 많다. 지금까지 염증 유발 경로 1개의 차단을 목표로 개발된 치료제가 임상시험에서 효과가 없는 것은 상기의 이유 때문으로 추정된다. 전세계적으로 유일하게 FDA허가를 받아 시판되고 있는 Lilly사의 Xygris 또한 28일 생존율이 6% 환자에서만 증가되는 저조한 유효성은 혈액응고기전을 조절하는 APC(activated protein C)가 주성분이기 때문이다.
마우스 충수돌기의 대장과 연결 부위를 결찰 한 후 충수 돌기 부분을 천공 하면(CLP, cecal ligation and puncture) 패혈증이 유도되며, 이로 인하여 비장과 골수에서 CD11b+Gr-1+ 골수유래 면역 억제세포 (Myeloid-derived suppressor cell,MDSC)의 수가 현저히 증가된다. 이 세포들은 CD4+ T 세포의 활성화를 억제하고, CD8+ T세포의 IFNγ 분비를 억제한다[Delano MJ,et al.,(2007)J Exp Med 204(6):1463-1474]. 이러한 보고는 패혈증 환자에서도 MDSC가 면역 억제 상태 유도에 중요한 역할을 함으로써 2차 감염을 용이하게 하여 환자의 사망률을 높일것이라는 예측을 뒷바침하고 있다(Delano MJ,et al.,(2007)J Exp Med 204(6):1463-1474]. 그러나 이러한 예상과는 반대로 5 × 106개의 MDSC를 CLP 유도 1시간 전과 유도 24시간후에 정맥주사로 양자이입(adoptive transfer)하면 패혈증에 의한 전신 염증을 억제함으로써 오히려 사망률을 감소시킨다는 보고도 있다[Sander, L.E., et al.,(2010) J Exp Med 207(7):1453-64]. 따라서 MDSC가 패혈증환자에서 면역억제에 의한 2차감염 빈도를 높여 사망률을 높일지, 아니면 전신염증 반응을 억제하여 오히려 환자의 생존율을 높일지에 대하여는 논란의 여지가 있는 상황이다.
MDSC는 패혈증뿐만 아니라 여러 자가 면역 질환 마우스 모델에서도 수적 증가가 보고 되고 있지만, 질환의 진행을 악화시키는지 아니면 억제하는 지에 대한 확실한 결론이 나지 않고 있다. 전신성 홍반성 낭창증의 경우, 증상이 활발한 상태의 MRL-faslpr마우스의 신장과 혈액에서 MDSC가 증가되어 있으며 ex vivo 실험을 통하여 CD4+ T 세포의 증식을 억제함이 확인되었다[Cripps, J.G. and J.D. Gorham, (2011) Int Immunopharmacol; Iwata Y., et al.,(2010) Clin Exp Nephrol 14:411417].
B 세포(B cell)는 전통적으로 항체를 생성하여 체액성 면역반응(humoral immune response)에 관여한다고 알려져 왔다. 최근에 세포성 면역 반응과 염증 반응을 조절하는 기능을 가진 B10 면역조절 B 세포, CD5+B1a 세포, CD1d+ 변연부(marginal zone) B 세포 및 T2-MZP(Transitional-2-marginal zone precursor) B 세포 등의 면역조절 B 세포 (Regulatory B cell, Breg)들이 보고되고 있다. 아직 면역조절 B 세포 특이적인 표면 분자 및 세포질 내 표적 분자가 확인 되지 않아서 상기 세포들의 명확한 특성이 규명 되어 있지 않다. 그러나 면역조절 B 세포는 대부분 B2 B 세포에서 유래되며(CD5+B1a cell은 예외) IL-10을 분비하는 공통점을 가지고 있다. 면역조절 B 세포 중 ex vivo와 in vivo 실험을 통하여 면역 억제 기능이 확인된 면역조절 B 세포는 B10 면역조절 B 세포와 T2-MZP 면역조절 B 세포이다[Mauri, C. and P.A. Blair, (2010) Nat Rev Rheumatol,6(11):636-43].
T2-MZP 면역조절 B 세포(CD19+, CD21high ,CD23+, CD24 high, CD93+, CD1d+, IL-10+)는 만성 대장염(chronic colitis)의 마우스 모델(TCRα-/-)의 장간막림프절(MLN, Mesenteric lymph node)에서 발현됨이 보고되었고, 비장에서 분리한 이 세포를 정맥주사로 양자이입(adoptive transfer)하였을 때 대장염이 억제되는 것이 보고되었다[Mizoguchi, A.,et al., Immunity 16,219-230,(2002)]. T2-MZP 면역조절 B 세포는 류마티스 관절염의 마우스 모델(CIA, collagen induced arthritis)의 비장, 특히 증상이 호전된 마우스의 비장에서 증가되어 있음이 확인되었고, 양자이입 방법으로 관절염 억제 기능이 증명되었다. IFN-γ 분비 TH 1 세포 증식을 억제하여 염증을 억제하는데 IL-10 및 CD1d 발현 증가가 중요한 역할을 함이 IL-10 및 CD1d knockout 마우스 실험을 통하여 증명되었다[Evans, J. G.et al., J Immunol 178,7868-7878,(2007)].
B10 면역조절 B 세포(CD5+,CD1d+,IL-10+, B220+)는 여러 염증 질환과 자가 면역 질환의 마우스 모델의 비장과 림프절에 생성됨이 보고되었다[DiLillo, D.J., T. Matsushita, and T.F. Tedder, (2010) Ann N Y Acad Sci,1183: 38-57.]. B10 면역조절 B 세포의 염증 억제 효과는 ex vivo에서 생성된 B10 면역조절 B 세포를 류마티스 관절염 마우스 모델인chronic collagen-induced arthritis (CCIA)에 양자이입(adoptive transfer)하여 증명 되었다. B10 면역조절 B 세포의 양자이입으로 관절염 지수(arthritis index)가 50%이상 감소하였고 질병 중증도(disease severity)는 90%이상 감소되었다[Mauri, C., et al., (2003) J Exp Med, 197 (4): 489-501].
그러나 이상과 같이 MDSC와 면역조절 B 세포의 항염증 효과에 대한 지속적인 보고에도 불구하고 이들 세포군을 생체 내외에서 약물을 사용하여 인위적으로 증폭하는 기술은 보고되어 있지 못하다. 본 발명은 이들 MDSC와 면역조절 B 세포를 생체 내외에서 인위적으로 증폭시키기 위하여 GPCR19 아고니스트를 사용하는 방법에 관한 것이며, 또한 GPCR19 아고니스트의 스크리닝 및 그 약물의 효능 측정 방법에 관한 것이며, 소듐 타우로데옥시콜레이트(HY2191, Sodiumtaurodeoxycholate) 및 그 유도체를 이용하여 생체 내외에서 유전자 발현 및 단백 발현의 표현형이 기존에 알려진 것과는 다른 항염증 표현형이 증대된 MDSC 및 면역조절 B 림프구의 숫적 증폭 기술에 관한 것이다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 특허문헌 및 논문이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 특허문헌 및 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 생체내외에서 항염증 효과가 증대된 MDSC 및 면역 조절 B세포를 인위적으로 증폭하는 기술을 개발 하고자 노력하였다. 또한 본 발명자들은 GPCR19-연관 질환 치료제와 그의 스크리닝 방법과 GPCR19-연관 질환 치료제로써 GPCR19 아고니스트의 효능 분석 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 포유동물 또는 골수 유래 세포집단에 GPCR19 아고니스트를 투여 또는 처리하여 MDSC(Myeloid-derived suppressor cell) 및 면역조절 B 세포를 증폭시키는 기술을 개발하였고, GPCR19 아고니스트를 유효성분으로 포함하는 조성물이 MDSC(Myeloid-derived suppressor cell) 및 면역조절 B 세포를 매개하여 생체 내에서 항염증 활성을 갖는 것을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명의 목적은 GPCR19 아고니스트 및 그 유도체를 생체 내에 투여하여 염증 억제 효과가 향상된 새로운 표현형의 MDSC 또는 면역조절 B 세포를 숫적으로 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 GPCR19 아고니스트를 시험관내에서 골수세포 또는 말초혈액에 처리하여 염증 억제 효과가 향상된 새로운 표현형의 MDSC 또는 면역조절 B 세포 수를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적은 GPCR19-연관 질환 치료제의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 GPCR19 아고니스트의 효능 분석 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 항염증 활성을 갖는 MDSC에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항염증 활성을 갖는 면역조절 B 세포에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 MDSC 또는 면역조절 B 세포를 유효성분으로 포함하는 항염증 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 소듐 타우로데옥시콜레이트(HY2191, Sodiumtaurodeoxycholate) 및 그 유도체를 생체 내 투여하거나 골수세포에 처리하여 염증 억제 효과가 향상된 새로운 표현형의 MDSC 또는 면역조절 B 세포의 수를 증가시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명 다음 단계를 포함하는 GPCR19-연관 질환 치료제의 생체내 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 생체 내 생리적 활성 조절 물질을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계;
(b) 상기 포유동물에 GPCR19(G-protein coupled receptor 19) 아고니스트 시험물질을 투여하는 단계; 및
(c) 상기 포유동물에서 (i) Gr-1+CD11b+ MDSC(Myeloid-derived suppressor cell), (ii) Prok2, Osm, Ltf, Klra17, Slc40a1, Fcer2a, Hspa1a, Il8rb, Lyz2, Pi16, Dfna5h, Mtus1, 4732429D16Rik, Myadm, P2ry6, Fosb, Cd177, Sort1, Gcnt2, Chac1, Reck, Lyzs, Plekhg3, Csf3r, Aatk, Dgkg, Tacstd2 또는 Xcl1 유전자를 고발현하거나 또는 Il1a, Edn1, Cxcl10, Adora2b, Cxcl9, Serpina3f, Cxcl1, Ptx3, Ifng, Slc7a11, Batf2, Gbp5, Cfl1, Mefv, Bcl2l11, Gbp2, Sphk1, Cd274, Icam1, Il10, Ahnak, Gbp3, Cirbp, Gpr84, Bcl2a1c, Tgtp, Cd86, Hif1a, Smpdl3b, B930041F14Rik, D330014H01Rik, Tnfaip2, Pex11a, Arrdc4, St6galnac4, Irgm1, Pde4d, Marcksl1, Tgm2, Ccl3, Il12a, Tap1, Mt1, Rbak, Rundc3b, Sdc4, Clec4e, Klhl15, Dnase1l3 또는 Mx1 유전자를 저발현하는 MDSC, (iii) CD23hi 면역조절 B 세포(CD23hi Regulatory B cell 혹은 CD23hi BH cell) 또는 (iv) Fcer2a, Grm6, AU019823, Marcksl1, Bcl2a1c, Bcl2a1d, Afg3l1, Cdk5r1, Cd40, Rrp1b, Slamf1, Luc7l, Igsf9, Gypc, C1qbp, Id3, Il4i1, Gbp1, Cd83, Mybl2, Ift140, Snx11, Swap70, Ccbp2, Sc4mol, Cyp51, Sqle, LOC100040592, B3gnt8, 1300014I06Rik, Fdps, Ctsa, Dmwd, Sfrs7, Hbb-bh1, Hspa1a, Srpk3, Hhex, Insig1, Cbfa2t3h, Taf15, Ddx17, Cnn2, Brwd1, Cr2, Arhgap4, Pira3, Flna, Cdk5rap1, Cugbp1, Ankrd37, Cd44, Mrps7, Mapk11, Pycard, Cap1, Lta, Rbm4, Cd180, Cfp, Cmah, LOC100046855, Srebf1, Ciita, Ryr1, E2f2, Dap3, Wdr9, Ccr6, Pcbd2, Lmnb1, Pira4, Blvrb 또는 Actb 유전자를 고발현하거나 또는 1190002H23Rik, Bhlhb8, Mist1, Fkbp11, Cacna1h, Rsph1, Rbm47, Slpi, Ly6c1, Hist1h1c, Tg, Klra7, Creb3l2, Prg2, Creld2, Nkg7, Anxa2, Txndc5, Tmem66, Amigo2, Klra4, LOC100038894, Speer3, Derl3, Ppapdc1b, Ckb, Thy1, Pqlc3, Klrd1, Xbp1, Klre1, Lgals1, 2010001M09Rik, Ctsw, Cd160, Ccl5, Sel1l, Dusp4, Socs2, Ccl4, Cd9, Mcoln2, Trp53inp1, Ssr2, Reln, Tubb2b, Akp2, F2r, H13, Cd8b1, Ifit3, Rsad2, LOC667370, Irf7, Ifit2, Slfn1, Cxcl10, Ctla4, Rgs1, Oasl2, Il7r, Usp18, Mx1, LOC100048346, Mx2, Tyki, Hba-a1, Lgals3bp, Ifitm3, Cfl1, Oas2, Serpina3f, Emb, P2ry14, Cirbp, Dhx58, Fcer1g, Ifng, AA467197, Gpr114, Trafd1, Cd3d, Igtp, Rilpl1, Apoe, Lat, Sh2d2a, Cd6, Slc15a2, Gbp2, Oasl1, Spo11, Ctse, Klf9, Pex11a, D14Ertd668e, Mlkl, Itk, Serpinb6b 또는 Cd69 유전자를 저발현하는 면역조절 B 세포의 생성 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질을 주입하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질을 주입한 포유동물에서 상기 (i) 내지 (iv)의 세포의 생성 정도가 증가하면 상기 시험물질은 GPCR19-연관 질환 치료제로 판정한다.
본 발명자들은 GPCR19-연관 질환의 치료제와 그의 스크리닝 방법과 GPCR19-연관 질환의 치료제로 GPCR19 아고니스트의 효능 분석 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 본 발명자들은 포유동물 또는 골수 유래 세포집단에 GPCR19 아고니스트를 투여 또는 처리하여 형성된 MDSC(Myeloid-derived suppressor cell) 및 면역조절 B 세포를 개발하였고, 이를 유효성분으로 포함하는 조성물이 항염증 활성을 갖는 것을 규명하였다.
본 발명은 GPCR19-연관 질환의 치료제의 스크리닝 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물로 예방 또는 치료가 가능한 질환은 GPC19-연관 질환으로 바람직하게는 패혈증, 자가면역질환, 염증성 질환, 류마티스 관절염, 아토피성 피부염, 알쯔하이머 병, 궤양성 대장염, 제1형 당뇨병, 크론병, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척수염, 다발성 경화증, 캐슬만씨 병, 자가면역성 간염, 자가 면역성 포도막염, 중증 근무력증, 원형 탈모증 및 전신성 홍반성 낭창으로 구성된 군으로부터 선택되나 이에 한정지 않고, 가장 바람직하게는 패혈증이다.
본 발명의 GPCR19-연관 질환 치료제의 생체내 스크리닝 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 생체 내 생리적 활성 조절 물질의 투여
본 발명의 방법에 있어서, GPCR19-연관 질환의 치료제를 스크리닝하기 위하여 먼저 생체 내 생리적 활성 조절 물질을 인간을 제외한 포유동물에 투여하여 생체 내에서 생리적 반응을 유발한다.
본 발명에 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질은 생체 내에서 생리적 반응을 유발하는 물질을 의미한다. 예컨대, 상기 생체 내 생리적 활성 조절 물질은 세포의 리셉터(Receptor)[예컨대, TLR(toll-like receptor)]에 결합하여 신호전달 반응을 조절하거나 일반적인 면역계의 다양한 성분(예컨대, 혈관내피세포, 수지상 세포, T세포 및 B세포)의 리셉터와 상호작용하여 신호전달 반응을 조절하는 물질을 포함한다.
바람직하게는, 생체 내 생리적 활성 조절 물질은 면역계의 다양한 체액성 인자 또는 세포와 상호작용하여 특이적인 사이토카인 또는 케모카인을 을 분비하게 하거나, 생체 세포의 표면 분자 발현을 증가시키거나, 항체를 형성하게 하거나 특이적인 림포사이트 집단을 생성 또는 증가하게 하는 분자이며, 보다 바람직하게는 합성 유기 화학물질, 단백질, 지질단백질, 당단백질, 펩타이드, RNA, DNA 또는 다당류로 구성된 개개의 분자, 또는 세포 구조체(세균 또는 진균류) 또는 바이러스의 일부로 이루어진 군에서 선택되나 이에 한정되지 않는다.
본 발명에 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질은 다양한 종류에서 유래된 물질로 바람직하게는, 박테리아 유래 물질, 진균 유래 물질, 바이러스 유래 물질, 자가 유래 물질, 또는 알러젠(allergen)이고, 보다 바람직하게는 박테리아 유래 물질 또는 진균 유래 물질이고, 보다 더 바람직하게는 박테리아 유래 분자이며, 가장 바람직하게는 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 펩티도글리칸이다.
본 발명의 방법에 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질로서 박테리아 유래 물질은 포유동물에 감염되어 여러가지 질병을 일으키는 박테리아 군으로부터 선택이 가능하며, 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엠반다카(Salmonella mbandaka), 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis), 스트렙토코커스 뉴모니아(Streptococcus pneumoniae), 스타필로코쿠스 오레우스 (Staphylococcus aureus), 타플릴로코쿠스 에피더미디스(Staphlylococcus epidermidis), 네이세리아 메닌기티디스(Neisseria meningitidis), 네이세리아 고노르헤에(Neisseria gonorrheae), 헤모필루스 인플루엔제(Haemophilus influenzae), 대장균(Esherichia coli), 클레브시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 리스테리아 모노시토겐스(Listeria monocytogenes), 비브리오 콜레레(Vibrio cholerae), 클로스트리디움 퍼프린젠스(Clostridium perfringens), 클로스트리디움 보툴리늄(Clostridium botulinum), 수도모나스 에라션스(Pseudomonas aerations), 보렐리아 부르그도르테리(Borrelia burgdorferi), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 시겔라 보이디(Shigella boydii), 시겔라 디센트리게(Shigella dysentriae), 알로이오코쿠스 오티티디스(Alloiococcus otitidis) 및 그룹 B 스트렙토코시(streptococci)이고, 가장 바람직하게는 살모넬라 티피뮤리움(Salmonella typhimurium), 살모넬라 엠반다카(Salmonella mbandaka) 및 살모넬라 엔테라이티디스(Salmonella enteritidis)으로 이루어진 군에서 선택되나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질로서 진균 유래 물질은 포유동물에 감염되어 여러 가지 질병을 일으키는 진균에서 유래하는 물질로, 예컨대 포유동물의 피부, 구강에 표재성 진균증(superficial mycosis)을 일으키고, 내장, 뇌 등에 전신성 진균증을 일으키는 진균에서 유래한 물질이다. 진균 유래 물질은 다양한 진균 군으로부터 선택이 가능하며, 바람직하게는 칸디다(Candida), 아스페르길루스(Aspergillus), 크립토코커스(Cryptococcus), 무코르 (Mucor), 리조푸스 (Rhizopus), 압시디아(Absidia), 노카르디아(Nocardia), 히스토플라스마(Histoplasma), 블라스토마이세스(Blastomyces), 콕시디오이데스 (Coccidioides), 트리코피톤(Trichophyton), 미크로스포륨(Microsporum), 에피더모피톤(Epidermophyton), 스포로트릭스(Sporothrix), 흑색진균(Dematiaceous fungi), 말라세치아(Malassezia), 뉴모사이스티스(Pneumocystis), 페니실륨(Penicillium), 알타나리아(Alternaria), 클라도스포륨(Cladosporium), 보트리티스(Botrytis), 어에로바시듐(Aureobasidium), 프자륨(Fusarium), 트리코데르마(Trichoderma), 헬민쏘스포륨(Helminthosporium), 뉴로스포라(Neurospora), 월레미아(Wallemia) 및 로도토룰라(Rhodotorula)으로 이루어지는 군에서 선택되나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질로서 바이러스 유래 물질은 포유동물에 감염되어 다양한 질병을 일으키는 바이러스 군으로부터 선택이 가능하며, 바람직하게는, 아데노바이러스, 알파바이러스, 칼리시 바이러스, 코로나바이러스, CMV, 디스템퍼 바이러스, 에볼라 바이러스, 엔테로바이러스, EBV, 플라비바이러스(예컨대, Hep C) 헤파드나바이러스(예컨대, Hep B, 간염 델타 물질, Hep E 또는 F바이러스), A형 간염 바이러스(예컨대, VP1), GBV-C, 허피스바이러스(예컨대, 허피스 심플렉스 바이러스 단백질[예컨대, 타입 I 당단백질 G, gpD, CP27, 수두 대상포진 바이러스 당단백질(예컨대, IE62, gp1 또는 외피 단백질)], 면역결핍 바이러스, 예컨대, HIV(예컨대, 외피 또는 단백질분해효소), 감염성 복막염 바이러스, 인플루엔자 바이러스(예컨대, 인플루엔자 A 헤마글루티닌, 뉴라미니다제 또는 핵단백질), LCMV, 백혈병 바이러스, 마버그 바이러스, 오르토믹소바이러스, 파필로마 바이러스[예컨대, HPV(예컨대, HPV 캡시드 단백질), 파라인플루엔자 바이러스(예컨대, 헤마글루티닌/뉴라미니다제)], 파라믹소바이러스[예컨대, RSV(예컨대, F 또는 G 단백질)], 파보바이러스, 페스티바이러스, 피코나바이러스[예컨대, 폴리오바이러스 캡시드 폴리펩티드(예컨대, VP1, VP2 또는 VP3, 또는 Hep A 항원)], 폭스 바이러스(예컨대, 백시니아 바이러스 폴리펩티드, 예컨대, 외피 단백질), 공수병 바이러스(예컨대, 공수병 바이러스 당단백질 G), 레오바이러스, 레트로바이러스, 리노바이러스(예컨대, 인간 리노바이러스 캡시드), 루벨라 바이러스(예컨대, 캡시드 단백질) 및 로타바이러스로 이루어지는 군에서 선택되나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질로서 자가 유래 물질은 생체의 정상 구성 성분[예컨대, 단백질(사이토카인, 호르몬, 인터루킨 또는 이들의 혼합물), 핵산, 이들의 혼합물 또는 이들의 조각]에 있어서 동일 개체에 다양한 신호전달 반응을 일으키어 자가면역반응을 야기하여 자가 항체를 형성하도록 자극함으로써 자가면역질환을 일으키는 물질이다. 자가면역반응을 일으키는 자가 유래 물질은 자연발생적인 자가 유래 물질의 구성과는 상이한 구성으로 배열되어 있다. 자가면역반응을 일으키는 자가 유래 물질로, 바람직하게는 인슐린, 미예린 염기성 단백질, rh 인자, 아세틸콜린 수용체, 갑상성 세포 수용체(기초막 단백질, 갑상선 단백질 PM-1 또는 글루탐산 디카복실라제(64K)) 및 카복시펩티다제 H로 구성되는 군으로부터 선택되나 이에 한정되지 않는다. 자가 유래 물질이 야기하는 자가면역질환은 바람직하게는, 류머티스성 관절염 (RA), 다발성 경화증 (MS), 전신 홍반 루푸스(SLE), 루푸스 신장염, 피부 홍반 루푸스 (CLE), 자가면역성 간염, 연소성 류머티스성 관절염, 전염성 간염, 원발성 담즙성 간경화, 건선, 피부염, 아토피성 피부염, 전신성 피부경화증, 전신성 경화증, 크론병, 궤양성 대장염, 호흡 곤란 증후군, 성인성 호흡 곤란 증후군, ARDS, 수막염, 뇌염, 포도막염, 사구체신염, 천포창, 대식세포 활성화 증후군, 습진, 천식, 죽상동맥경화증, 백혈구 부착 결핍증, 진성 당뇨병, 제I형 진성 당뇨병, 인슐린 의존성 진성 당뇨병, 알러지성 비염, 장기 이식과 관련된 자가면역 반응, 레이노 증후군, 자가면역성 갑상선염, 하시모토 갑상선염, 알러지성 뇌척수염, 쇼그렌 증후군, 유년 발병형 당뇨병, 사이토카인 및 T-림프구에 의해 매개되는 급성 및 지연형 과민증과 관련되는 면역 응답, 결핵, 사르코이드증, 다발근육염, 육아종증, 혈관염, 악성 빈혈(애디슨병), 백혈구 누출을 수반하는 질환, 중추 신경계(CNS) 염증성 장애, 다발성 장기 손상 증후군, 용혈 빈혈, 한랭글로빈혈증, 쿰즈(Coombs) 양성 빈혈, 중증 근육무력증, 항원-항체 복합체 매개 질환, 항-사구체 기저막 질환, 항-인지질 증후군, 알러지성 신경염, 그레이브스병, 램버트-이튼 근무력 증후군, 수포성 유사천포창, 천포창, 자가면역성 다중내분비병증, 라이터 질환, 근육강직 증후군, 베쳇병, 거대세포성 동맥염, 면역 복합체 신장염, IgA 신장병증, IgM 다발신경병증, 면역성 혈소판감소성 자반 (ITP) 및 자가면역성 혈소판감소증으로 이루어지는 군에서 선택되나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질로서 알러젠(allergen)은 당업계에 공지된 알레르기, 즉, 개체에 반복적으로 노출시 IgE 매개 반응을 유발하는 것으로 알려져 있는 모든 자연 발생적 물질 또는 이들 물질의 혼합물을 포함한다. 자연 발생적 알레르기 유발 물질로, 바람직하게는 꽃가루 알레르기 유발 물질(예컨대, 수목, 잡초, 초본 또는 잔디의 꽃가루 알레르기 유발 물질), 진드기 알레르기 유발 물질(예컨대, 집 먼지진드기 또는 저장 진드기 유래 물질), 곤충 알레르기 유발 물질(예컨대, 흡입성, 타액 및 독액 유래 알레르기 유발 물질), 개, 고양이, 랫트 및 마우스의 타액, 털 및 비듬에서 유래하는 동물 알레르기 유발 물질, 진균 알레르기 유발 물질 및 음식물 알레르기 유발 물질로 이루어진 군에서 선택되나 이에 한정되지 않고 이들의 혼합물을 포함한다. 이들 알러젠의 형태로는 알러젠 추출물, 정제된 알러젠, 변형된 알러젠, 재조합 알러젠, 재조합 변이체 알러젠, 30 아미노산 이상의 알러젠 단편 또는 이들의 조합 형태물로 이루어지는 군에서 선택되나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 방법에 있어서, 상기 생체 내 생리적 활성 조절 물질은 인간을 제외한 포유동물에게 투여가 가능하며 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 반려 동물(예컨대, 개, 고양이), 농장용 동물(예컨대, 소, 양, 돼지 또는 말) 또는 실험실용 동물(예컨대, 랫트, 마우스 또는 기니피그)이고, 보다 더 바람직하게는 마우스, 랫트, 개, 원숭이, 염소, 양, 토끼이고 가장 바람직하게는 마우스이다.
상기 포유동물에 생체 내 생리적 활성 조절 물질의 투여는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시할 수 있으며, 바람직하게는 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있고, 보다 바람직하게는 구강내, 비강내, 위장관내, 외이도내, 질내, 직장내, 정맥내 또는 복강내 주입, 피부 또는 안구에 투여할 수 있고, 가장 바람직하게는 복강내 투여한다.
한편, 생체 내 생리적 활성 조절 물질의 투여량은 실험실에서 통상적(routinely)으로 정할 수 있으며, 예를 들어 생체 내 생리적 활성 조절 물질로서 마우스에 리포폴리사카라이드(LPS)가 이용되는 경우, 투여량은 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg이고, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg이고, 가장 바람직하게는 20 mg/kg을 사용한다.
단계 (b): GPCR19 아고니스트 시험물질의 투여
본 발명의 방법에 사용되는 GPCR19 아고니스트 시험물질은 GPCR19 수용체와 상호작용하여 효능을 일으키는, 바람직하게는 그 물질이 갖는 작용과 같은(또는 유사한) 작용을 하는 물질 또는 약제, 혹은 수용부위의 활성을 높이는 분자를 의미한다. 본 발명의 GPCR19 아고니스트는 GPCR19 수용체의 효능제 또는 부분적 효능제로서 작용한다. 본 명세서의 용어 "효능제"는 일반적으로 다른 분자 또는 수용체 부위의 활성을 강화하는 화합물을 의미한다. 고전적인 정의에서, 효능제는 오르토스테릭 효능제, 알로스테릭 효능제, 역 효능제 또는 공동-효능제의 여부와 관계없이, 수용체에 결합하여 그것의 수용체 상태를 변경시킴으로써 생물학적 작용을 일으키는 특성을 갖는다. 결론적으로, 효능작용은 생물학적 작용을 생성하는 효능제 또는 리간드의 특성으로 정의된다. 보다 구체적으로, GPCR19 아고니스트는 GPCR19에 결합하여 수용체를 발현하는 세포에서 사이클릭 아데노신 모노포스페이트(cAMP)의 농도를 3 ％ 이상 증가시키는 수용체 리간드 또는 화합물이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에 사용되는 GPCR19 아고니스트는 하기 화학식 1의 화합물, 그의 염 또는 수화물을 포함하고, 보다 바람직하게는 소듐 타우로데옥시콜레이트(HY2191)이다.
소듐 타우로데옥시콜레이트의 투여량으로 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg이고, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg이고, 가장 바람직하게는 0.5 ~ 8 mg/kg을 사용한다.
화학식 1
상기 화학식에서 R1은 수소, 하이드록시, 치환 또는 비치환 알킬 또는 할로겐; R2는 수소 또는 α-하이드록시; R3은 하이드록시, NH(CH2)mSO3H(m은 정수 0, 1, 2, 3, 4 또는 5) 또는 NH(CH2)nCO2H(n은 정수 0, 1, 2, 3, 4 또는 5); R4는 수소, 알킬 또는 할로겐; R5는 수소, 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴이고; R6은 수소 또는 R5 및 R6가 부착된 탄소와 함께 3, 4, 5 또는 6개 원자 크기로 형성된 고리이고; R7은 수소, 하이드록시, 치환 또는 비치환 알킬; R8은 수소 또는 치환 또는 비치환 알킬; R9은 수소 또는 치환 또는 비치환 알킬; R10은 수소 또는 치환 또는 비치환 알킬; R11은 수소 또는 치환 또는 비치환 알킬이다.
본 발명의 방법에 사용되는 GPCR19 아고니스트 시험물질의 투여 대상인 인간을 제외한 포유동물과 투여하는 방법은 단계 (a)에서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 명세서의 용어 "알킬"에는 포화 지방족 기, 예컨대 직쇄 알킬 기(예컨대, 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 펜틸, 헥실, 헵틸, 옥틸, 노닐, 데실), 분지쇄 알킬 기(예컨대, 이소프로필, tert-부틸, 이소부틸), 시클로알킬(예컨대, 지환족) 기(예컨대, 시클로프로필, 시클로펜틸, 시클로헥실, 시클로헵틸, 시클로옥틸), 알킬 치환 시클로알킬 기 및 시클로알킬 치환 알킬 기가 포함된다. 특정 실시예에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 골격 내에 6개 이하의 탄소 원자를 갖는다[예컨대, C1-C6 (직쇄), C3-C6 (분지쇄)]. 일부 예에서, 직쇄 또는 분지쇄 알킬은 골격 내에 4개 이하의 탄소 원자를 갖는다. 또한, 시클로알킬은 고리 구조 내에 3 내지 8개의 탄소 원자를 갖는다.
본 명세서의 용어 "치환 알킬"은, 탄화수소 골격의 1개 이상의 탄소 상의 1개 이상의 수소 원자가 치환기로 대체된 알킬 잔기를 나타낸다. 이러한 치환기에는, 예컨대 알킬, 알케닐, 알키닐, 할로겐, 히드록실, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 디알킬아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 알콕실, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노(알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기가 포함될 수 있다.
본 명세서의 용어 "아릴"에는 방향족성을 가진 기, 예컨대 0 내지 4개의 헤테로원자를 포함할 수 있는 5 및 6원의 "비접합" 또는 단일-고리 방향족 기, 및 1개 이상의 방향족 고리를 갖는 "접합" 또는 멀티시클릭 계가 포함된다. 아릴 기의 예로는 벤젠, 페닐, 피롤, 푸란, 티오펜, 티아졸, 이소티아졸, 이미다졸, 트리아졸, 테트라졸, 피라졸, 옥사졸, 이속사졸, 피리딘, 피라진, 피리다진 및 피리미딘 등이 포함된다. 또한, 본 명세서의 용어 "아릴"에는 멀티시클릭 아릴기, 예컨대 트리시클릭, 비시클릭, 예컨대 나프탈렌, 벤즈옥사졸, 벤조디옥사졸, 벤조티아졸, 벤조이미다졸, 벤조티오펜, 메틸렌디옥시페닐, 퀴놀린, 이소퀴놀린, 나프티리딘, 인돌, 벤조푸란, 퓨린, 벤조푸란, 데아자퓨린 또는 인돌리진이 포함된다. 고리 구조 내에 헤테로원자를 갖는 아릴 기는 "아릴 헤테로사이클", "헤테로사이클", "헤테로아릴" 또는 "헤테로방향족"으로도 지칭될 수 있다. 방향족 고리는 하나 이상의 고리 위치에서 상기 기재된 바와 같은 치환기, 예컨대 할로겐, 히드록실, 알콕시, 알킬카르보닐옥시, 아릴카르보닐옥시, 알콕시카르보닐옥시, 아릴옥시카르보닐옥시, 카르복실레이트, 알킬카르보닐, 알킬아미노카르보닐, 아르알킬아미노카르보닐, 알케닐아미노카르보닐, 알킬카르보닐, 아릴카르보닐, 아르알킬카르보닐, 알케닐카르보닐, 알콕시카르보닐, 아미노카르보닐, 알킬티오카르보닐, 포스페이트, 포스포네이토, 포스피네이토, 시아노, 아미노(알킬아미노, 디알킬아미노, 아릴아미노, 디아릴아미노 및 알킬아릴아미노 포함), 아실아미노(알킬카르보닐아미노, 아릴카르보닐아미노, 카르바모일 및 우레이도 포함), 아미디노, 이미노, 술프히드릴, 알킬티오, 아릴티오, 티오카르복실레이트, 술페이트, 알킬술피닐, 술포네이토, 술파모일, 술폰아미도, 니트로, 트리플루오로메틸, 시아노, 아지도, 헤테로시클릴, 알킬아릴, 또는 방향족 또는 헤테로방향족 잔기로 치환될 수 있다. 또한, 아릴 기는 지환족 또는 헤테로시클릭 고리와 융합 또는 가교될 수 있고, 이들은 방향족이 아니므로 멀티시클릭 계(예컨대, 테트랄린 또는 메틸렌디옥시페닐)를 형성한다. 탄소의 개수가 달리 특정되어 있지 않다면, "저급 알킬"에는 골격 구조 내에 1 내지 10개, 예컨대 1 내지 6 개의 탄소 원자를 갖는, 상기 정의된 바와 같은 알킬기가 포함된다.
본 명세서의 용어 "히드록시" 또는 "히드록실" 에는 -OH 또는 -O- 를 갖는 기가 포함된다.
본 명세서의 용어 "할로겐"에는 불소, 브롬, 염소 또는 요오드가 포함된다.
단계 (c): GPCR19 -연관 질환 치료제로서의 GPCR19 아고니스트 시험물질의 생체내 유효성 판정
본 발명의 방법에 있어서, GPCR19 아고니스트 시험물질을 인간을 제외한 포유동물에 투여한 후 포유동물에서 상기 (i) 내지 (iv)의 세포의 생성 정도가 증가하면 GPCR19 아고니스트 시험물질은 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다.
(i) Gr-1+CD11b+ MDSC(Myeloid-derived suppressor cell) 세포
패혈증 유도 마우스에 표면형질 마커 Gr-1+ 및 CD11b+ 의 발현이 증가된 MDSC(Gr-1+CD11b+ MDSC) 세포의 양자이입 결과는 패혈증 유도 마우스에서 사망률을 감소시킨 보고가 있다.
이에 본 발명자들은 패혈증 유도 마우스에 GPCR19 아고니스트 시험물질 투여하여 비장에서의 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포의 증가를 확인하였고, 이들 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포는 기존에 알려진 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포와는 유전자 발현 양상이 다른 표현형을 가지는 세포들이었으며, 양자이입에 의하여 패혈증 치료능이 있었다. 본 발명자들은 MDSC 세포의 증가를 조절하는 상위 신호 전달 경로에 GPCR19가 관련되어 있음을 규명하였고, 이에 GPCR19 아고니스트를 처리하여 GPCR19 활성화를 유도하고, Gr-1+CD11b+ MDSC 세포를 증가시킴으로 하위 다양한 신호전달 경로를 통하여 염증을 제어할 수 있음을 제시하였다.
따라서 시험물질의 투여 결과 시험물질을 주입하지 않은 대조군과 비교하여 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포의 증가가 나타나면, 이는 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다. 보다 구체적으로, 시험물질의 투여 결과 시험물질을 주입하지 않은 대조군과 비교하여 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포의 수가 2% 이상, 바람직하게는 1% 이상, 보다 바람직하게는 0.5% 이상 증가하면 시험물질은 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다. 예를 들어, Gr-1+CD11b+ MDSC 세포의 수는 FACS로 분석할 수 있다.
(ii) GPCR19 아고니스트 시험물질의 유효성 분석은 상기 (ii)에 기재된 특정 유전자를 고발현 또는 저발현하는 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포수를 측정함으로써 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, MDSC 세포에서 상기 (ii)에 기재된 특정 유전자의 고발현 또는 저발현은 대조군(시험물질을 처리하지 않은 군)과 비교하여 각각 1.5 배 이상 및 1.5 배 이하 발현 되는 것을 의미한다.
유전자의 발현정도는 당업계에서 통상적으로 이용되는 유전자발현 분석 방법, 예컨대 실시간 RT-PCR 방법 또는 마이크로어레이 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 실시할 수 있다.
상술한 유전자들의 고발현 또는 저발현되는 MDSC 세포는 GPCR19 아고니스트로 투여로 인해 형질전환 및 생체내 증폭되고, 형질전환 및 생체내 증폭된 MDSC 세포를 패혈증 마우스에 투여한 결과 패혈증 치료효과를 확인하였고 이는 실시예 1에서 보다 상세하게 제시되고 있다. GPCR19 아고니스트 시험물질로 바람직하게는, 소듐 타우로데옥시콜레이트(HY-2191)를 사용하였고, 상기 시험물질의 투여로 인해 생성된 MDSC 세포는 “H-MDSC” 세포로 명명하였다. 패혈증 마우스에 GPCR19-연관 질환 치료제로써 판정을 위해 사용된 H-MDSC 세포의 패혈증 치료효과는 다른 대조군에 비해서 현저하게 높은 80%의 생존율을 보였다. 이와 같은 결과는, GPCR19 아고니스트 시험물질의 투여 결과로 생성된 H-MDSC 세포를 패혈증의 치료제 또는 GPCR19-연관 질환 치료제로 사용 될 수 있음을 제시한다.
따라서 시험물질의 투여 결과 시험물질을 주입하지 않은 대조군과 비교하여 상기 (ii)에서 상술한 유전자들의 고발현 또는 저발현을 보이는 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포의 증가가 나타나면, 이는 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다. 보다 구체적으로, 시험물질의 투여 결과 시험물질을 주입하지 않은 대조군과 비교하여 상기 (ii)에서 상술한 유전자들의 고발현 또는 저발현을 보이는 MDSC 세포의 수가 2% 이상, 바람직하게는 1% 이상, 보다 바람직하게는 0.5% 이상 증가하면 시험물질은 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다. 예를 들어, MDSC 세포의 수는 FACS로 분석할 수 있다.
상기 (ii)에서 고발현 또는 저발현된 유전자의 리스트는 앞서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
(iii) CD23 hi 면역조절 B 세포(CD23hi Regulatory B cell)
B 세포는 면역 반응에 있어서 전통적으로 항체를 생성하여 체액성 면역반응(humoral immune response)에 관여하는 세포로 알려져 있다. 이중 일부 면역조절 B 세포는 염증 반응을 조절하는 것으로 알려져 있다.
이에 본 발명자들은 패혈증 유도 마우스에 GPCR19 아고니스트 시험물질 투여하여 비장에서의 CD23hi면역조절 B 세포의 증가를 확인하였고, 상기 CD23hi 면역조절 B 세포의 패혈증 치료 효과도 확인 하였다. 본 발명자들은 CD23hi 면역조절 B 세포의 증가를 조절하는 상위 신호 전달 경로에 GPCR19가 관련되어 있음을 규명하였고, 이에 GPCR19 아고니스트를 처리하여 GPCR19 활성화를 유도하고, CD23hi 면역조절 B 세포를 증가시킴으로 하위 다양한 신호전달 경로를 통하여 염증을 제어할 수 있음을 제시하였다.
따라서 시험물질의 투여 결과 시험물질을 주입하지 않은 대조군과 비교하여 CD23hi 면역조절 B 세포의 증가가 나타나면, 이는 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다. 보다 구체적으로, 시험물질의 투여 결과 시험물질을 주입하지 않은 대조군과 비교하여 CD23hi 면역조절 B 세포의 수가 2% 이상, 바람직하게는 1% 이상, 보다 바람직하게는 0.5% 이상 증가하면 시험물질은 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다. 예를 들어, CD23hi 면역조절 B 세포의 수는 FACS로 분석할 수 있다.
(iv) GPCR19 아고니스트 시험물질의 분석은 상기 (iv)에 기재된 특정 유전자를 고발현 또는 저발현하는 CD23hi 면역조절 B 세포를 측정함으로써 실시할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, CD23hi 면역조절 B 세포에서 상기 (iv)에 기재된 특정 유전자의 고발현 또는 저발현은 대조군(시험물질을 처리하지 않은 군)과 비교하여 각각 1.5 배 이상 및 1.5 배 이하 저발현 되는 것을 의미한다.
유전자의 발현정도는 당업계에서 통상적으로 이용되는 유전자발현 분석 방법, 예컨대 실시간 RT-PCR 방법 또는 마이크로어레이 방법(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001))에 따라 실시할 수 있다.
상술한 유전자들의 고발현 또는 저발현되는 CD23hi 면역조절 B 세포는 GPCR19 아고니스트의 투여로 인해 형질전환 및 생체내 증폭 되고, 형질전환 및 생체내 증폭된 CD23hi 면역조절 B 세포를 패혈증 마우스에 투여한 결과 패혈증 치료효과를 확인하였고 이는 실시예 15에서 보다 상세하게 제시되고 있다. CD23hi 면역조절 B 세포의 형질 전환 및 생체내 증폭을 위하여 GPCR19 아고니스트 시험물질에 의하여, 바람직하게는 (i) 또는 (ii)에서 생성된 H-MDSC 세포 또는 GPCR19 아고니스트 시험물질인 소듐 타우로데옥시콜레이트(HY2191)를 사용하였다. H-MDSC 세포를 투여한 결과 생성된 세포는 “BHM” 세포로 명명 하였고, 소듐 타우로데옥시콜레이트를 투여한 후 48시간 뒤에 생체내에서 생성된 세포는 “48h BH” 세포로 명명하였다. 패혈증 마우스에 GPCR19-연관 질환 치료제로써 판정을 위해 사용된 BHM 세포의 패혈증 치료효과는 다른 대조군에 비해서 현저하게 높은 100%의 생존율을 보였고(실시예 13), 48h BH 세포의 치료효과 역시 80%의 생존율을 보였다(실시예 14 ). 이와 같은 결과는, GPCR19 아고니스트 시험물질에 의하여, 바람직하게는 (i) 또는 (ii)에서 생성된 H-MDSC 세포를 투여하여 생성된 BHM 세포 또는 소듐 타우로데옥시콜레이트를 투여한후 48시간 뒤에 생성된 B 세포(48h BH)로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 패혈증의 치료제 또는 GPCR19-연관 질환 치료제로 사용 될 수 있음을 제시한다.
따라서 시험물질의 투여 결과 시험물질을 주입하지 않은 대조군과 비교하여 상기 (iv)에서 상술한 유전자들의 고발현 또는 저발현을 보이는 면역조절 B 세포의 증가가 나타나면, 이는 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다. 보다 구체적으로, 시험물질의 투여 결과 시험물질을 주입하지 않은 대조군과 비교하여 상기 (iv)에서 상술한 유전자들의 고발현 또는 저발현을 보이는 면역조절 B 세포의 수가 2% 이상, 바람직하게는 1% 이상, 보다 바람직하게는 0.5% 이상 증가하면 시험물질은 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다. 예를 들어, 면역조절 B 세포의 수는 FACS로 분석할 수 있다.
상기 (iv)의 MDSC 또는 면역조절 B 세포에서 고발현 또는 저발현되는 유전자 리스트는 앞서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
결과적으로 본 발명의 방법에 있어서, 단계 (c)에서 상술한 내용과 같이 GPCR19 아고니스트 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 GPCR19 아고니스트 시험물질을 투여한 군에서 상기 (i) 내지 (iv)의 세포의 생성 정도가 2% 이상, 바람직하게는 1% 이상, 보다 바람직하게는 0.5% 이상 증가하면 시험물질은 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 GPCR19-연관 질환의 치료제의 시험관내 스크리닝 방법을 제공한다:
(a) 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 시험물질을 골수세포 집단(bone marrow cell population)에 처리하는 단계; 및
(b) 상기 골수세포 집단에서 (i) Gr-1+CD11b+ MDSC(Myeloid-derived suppressor cell), (ii) Prok2, Osm, Ltf, Klra17, Slc40a1, Fcer2a, Hspa1a, Il8rb, Lyz2, Pi16, Dfna5h, Mtus1, 4732429D16Rik, Myadm, P2ry6, Fosb, Cd177, Sort1, Gcnt2, Chac1, Reck, Lyzs, Plekhg3, Csf3r, Aatk, Dgkg, Tacstd2 또는 Xcl1 유전자를 고발현하거나 또는 Il1a, Edn1, Cxcl10, Adora2b, Cxcl9, Serpina3f, Cxcl1, Ptx3, Ifng, Slc7a11, Batf2, Gbp5, Cfl1, Mefv, Bcl2l11, Gbp2, Sphk1, Cd274, Icam1, Il10, Ahnak, Gbp3, Cirbp, Gpr84, Bcl2a1c, Tgtp, Cd86, Hif1a, Smpdl3b, B930041F14Rik, D330014H01Rik, Tnfaip2, Pex11a, Arrdc4, St6galnac4, Irgm1, Pde4d, Marcksl1, Tgm2, Ccl3, Il12a, Tap1, Mt1, Rbak, Rundc3b, Sdc4, Clec4e, Klhl15, Dnase1l3 또는 Mx1 유전자를 저발현하는 MDSC, (iii) CD23hi 면역조절 B 세포 또는 (iv) Fcer2a, Grm6, AU019823, Marcksl1, Bcl2a1c, Bcl2a1d, Afg3l1, Cdk5r1, Cd40, Rrp1b, Slamf1, Luc7l, Igsf9, Gypc, C1qbp, Id3, Il4i1, Gbp1, Cd83, Mybl2, Ift140, Snx11, Swap70, Ccbp2, Sc4mol, Cyp51, Sqle, LOC100040592, B3gnt8, 1300014I06Rik, Fdps, Ctsa, Dmwd, Sfrs7, Hbb-bh1, Hspa1a, Srpk3, Hhex, Insig1, Cbfa2t3h, Taf15, Ddx17, Cnn2, Brwd1, Cr2, Arhgap4, Pira3, Flna, Cdk5rap1, Cugbp1, Ankrd37, Cd44, Mrps7, Mapk11, Pycard, Cap1, Lta, Rbm4, Cd180, Cfp, Cmah, LOC100046855, Srebf1, Ciita, Ryr1, E2f2, Dap3, Wdr9, Ccr6, Pcbd2, Lmnb1, Pira4, Blvrb 또는 Actb 유전자를 고발현하거나 또는 1190002H23Rik, Bhlhb8, Mist1, Fkbp11, Cacna1h, Rsph1, Rbm47, Slpi, Ly6c1, Hist1h1c, Tg, Klra7, Creb3l2, Prg2, Creld2, Nkg7, Anxa2, Txndc5, Tmem66, Amigo2, Klra4, LOC100038894, Speer3, Derl3, Ppapdc1b, Ckb, Thy1, Pqlc3, Klrd1, Xbp1, Klre1, Lgals1, 2010001M09Rik, Ctsw, Cd160, Ccl5, Sel1l, Dusp4, Socs2, Ccl4, Cd9, Mcoln2, Trp53inp1, Ssr2, Reln, Tubb2b, Akp2, F2r, H13, Cd8b1, Ifit3, Rsad2, LOC667370, Irf7, Ifit2, Slfn1, Cxcl10, Ctla4, Rgs1, Oasl2, Il7r, Usp18, Mx1, LOC100048346, Mx2, Tyki, Hba-a1, Lgals3bp, Ifitm3, Cfl1, Oas2, Serpina3f, Emb, P2ry14, Cirbp, Dhx58, Fcer1g, Ifng, AA467197, Gpr114, Trafd1, Cd3d, Igtp, Rilpl1, Apoe, Lat, Sh2d2a, Cd6, Slc15a2, Gbp2, Oasl1, Spo11, Ctse, Klf9, Pex11a, D14Ertd668e, Mlkl, Itk, Serpinb6b 또는 Cd69 유전자를 저발현하는 면역조절 B 세포의 생성 여부를 분석하는 단계; 상기 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 시험물질을 처리한 골수세포 집단에서 상기 (i) 내지 (iv)의 세포의 생성 정도가 대조군과 비교하여 증가하면 상기 시험물질은 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다.
단계 (a): 세포 생리 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 시험물질의 시험관내 골수세포에 처리
본 발명의 방법에 있어서, 단계 (a)에서 세포 생리 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 시험물질을 골수세포 집단에 처리한다.
본 발명의 방법에 사용되는 세포 생리 활성 조절 물질은 상기 생체내 생리 활성 조질물질과 동일하고, GPCR19 아고니스트 시험물질 역시 상술한 내용과 동일하기 때문에 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
상기 세포 생리 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 시험물질이 처리된 골수세포 집단(bone marrow cell population)은 대퇴골 및 경골의 골수에서 유래된 세포 집단으로, 바람직하게는 조혈성세포(hematopoietic) 또는 골수성세포(myeloid cells)를 형성할 수 있는 세포이고, 보다 바람직하게는 B 세포, T 세포, NK 세포, 림프구 수지상 세포, 골수형 수지상 세포, 과립구, 마크로파지, 거핵세포 또는 적혈구 세포를 포함하는 조혈기관 계통의 모든 세포 유형으로 분화할 수 있는 클론원성 및 자가증식형 조혈성 세포, myeloid derived suppressor cell(MDSC)로 분화할 수 있는 공통 골수계 전구세포(CMP, common myeloid precursor) 또는 공통 림프계 전구세포(CLP, common lymphoid precursor)이고, 가장 바람직하게는 CD23hi 표면형질 마커를 발현하는 B 세포를 형성할 수 있는 세포 또는 Gr+CD11b+ 표면형질 마커를 발현하는 MDSC 세포를 형성할 수 있는 세포이다.
본 발명의 방법에 있어서, 생체 내 생리적 활성 조절 물질을 골수세포 집단에 처리하는 것은 배양되는 골수세포의 배양액에 처리할 수 있으며, 생체 내 생리적 활성 조절 물질의 하나로 사용되는 리포폴리사카라이드(LPS)의 농도로 바람직하게는 0.0001 mg/㎖ 내지 10 mg/㎖이고, 보다 바람직하게는 0.0005 mg/㎖ 내지 1 mg/㎖이고, 보다 더 바람직하게는 0.001 mg/㎖ 내지 0.1 mg/㎖이고 가장 바람직하게는 0.001 mg/㎖를 처리할 수 있다. 또한 GPCR19 아고니스트 시험물질을 골수세포 집단에 처리하는 것은 배양되는 골수세포의 배양액에 처리할 수 있으며, GPCR19 아고니스트 시험물질의 하나로 사용되는 소듐 타우로데옥시콜레이드(HY2191)의 농도로 바람직하게는 0.0001 mg/㎖ 내지 100 mg/㎖ 이고, 보다 바람직하게는 0.001 mg/㎖ 내지 10 mg/㎖ 이고, 보다 더 바람직하게는 0.01 mg/㎖ 내지 1 mg/㎖ 이고, 가장 바람직하게는 0.05 mg/㎖을 배양액에 처리한다.
단계 (b): GPCR19 -연관 질환 치료제로서의 GPCR19 아고니스트 시험물질 판정
GPCR19 아고니스트 시험물질 처리 결과, 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 시험물질을 처리한 골수세포 집단에서 상기 (i) 내지 (iv)의 세포의 생성 정도가 2% 이상, 바람직하게는 1% 이상, 보다 바람직하게는 0.5% 이상 증가하면 시험물질은 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다.
생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 시험물질 처리로 인해 생성되는 상기 (i) 내지 (iv)의 MDSC 및 면역조절 B 세포에서 고발현 또는 저발현되는 유전자 리스트 및 시험물질의 처리 방법은 앞서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 GPCR19 아고니스트의 생체내 효능 분석 방법을 제공한다:
(a) 생체 내 생리적 활성 조절 물질을 인간을 제외한 포유동물에 투여하는 단계;
(b) 상기 포유동물에 GPCR19 아고니스트를 투여하는 단계; 및
(c) 상기 포유동물에서 (i) Gr-1+CD11b+ MDSC(Myeloid-derived suppressor cell), (ii) Prok2, Osm, Ltf, Klra17, Slc40a1, Fcer2a, Hspa1a, Il8rb, Lyz2, Pi16, Dfna5h, Mtus1, 4732429D16Rik, Myadm, P2ry6, Fosb, Cd177, Sort1, Gcnt2, Chac1, Reck, Lyzs, Plekhg3, Csf3r, Aatk, Dgkg, Tacstd2 또는 Xcl1 유전자를 고발현하거나 또는 Il1a, Edn1, Cxcl10, Adora2b, Cxcl9, Serpina3f, Cxcl1, Ptx3, Ifng, Slc7a11, Batf2, Gbp5, Cfl1, Mefv, Bcl2l11, Gbp2, Sphk1, Cd274, Icam1, Il10, Ahnak, Gbp3, Cirbp, Gpr84, Bcl2a1c, Tgtp, Cd86, Hif1a, Smpdl3b, B930041F14Rik, D330014H01Rik, Tnfaip2, Pex11a, Arrdc4, St6galnac4, Irgm1, Pde4d, Marcksl1, Tgm2, Ccl3, Il12a, Tap1, Mt1, Rbak, Rundc3b, Sdc4, Clec4e, Klhl15, Dnase1l3 또는 Mx1 유전자를 저발현하는 MDSC, (iii) CD23hi 면역조절 B 세포 또는 (iv) Fcer2a, Grm6, AU019823, Marcksl1, Bcl2a1c, Bcl2a1d, Afg3l1, Cdk5r1, Cd40, Rrp1b, Slamf1, Luc7l, Igsf9, Gypc, C1qbp, Id3, Il4i1, Gbp1, Cd83, Mybl2, Ift140, Snx11, Swap70, Ccbp2, Sc4mol, Cyp51, Sqle, LOC100040592, B3gnt8, 1300014I06Rik, Fdps, Ctsa, Dmwd, Sfrs7, Hbb-bh1, Hspa1a, Srpk3, Hhex, Insig1, Cbfa2t3h, Taf15, Ddx17, Cnn2, Brwd1, Cr2, Arhgap4, Pira3, Flna, Cdk5rap1, Cugbp1, Ankrd37, Cd44, Mrps7, Mapk11, Pycard, Cap1, Lta, Rbm4, Cd180, Cfp, Cmah, LOC100046855, Srebf1, Ciita, Ryr1, E2f2, Dap3, Wdr9, Ccr6, Pcbd2, Lmnb1, Pira4, Blvrb 또는 Actb 유전자를 고발현하거나 또는 1190002H23Rik, Bhlhb8, Mist1, Fkbp11, Cacna1h, Rsph1, Rbm47, Slpi, Ly6c1, Hist1h1c, Tg, Klra7, Creb3l2, Prg2, Creld2, Nkg7, Anxa2, Txndc5, Tmem66, Amigo2, Klra4, LOC100038894, Speer3, Derl3, Ppapdc1b, Ckb, Thy1, Pqlc3, Klrd1, Xbp1, Klre1, Lgals1, 2010001M09Rik, Ctsw, Cd160, Ccl5, Sel1l, Dusp4, Socs2, Ccl4, Cd9, Mcoln2, Trp53inp1, Ssr2, Reln, Tubb2b, Akp2, F2r, H13, Cd8b1, Ifit3, Rsad2, LOC667370, Irf7, Ifit2, Slfn1, Cxcl10, Ctla4, Rgs1, Oasl2, Il7r, Usp18, Mx1, LOC100048346, Mx2, Tyki, Hba-a1, Lgals3bp, Ifitm3, Cfl1, Oas2, Serpina3f, Emb, P2ry14, Cirbp, Dhx58, Fcer1g, Ifng, AA467197, Gpr114, Trafd1, Cd3d, Igtp, Rilpl1, Apoe, Lat, Sh2d2a, Cd6, Slc15a2, Gbp2, Oasl1, Spo11, Ctse, Klf9, Pex11a, D14Ertd668e, Mlkl, Itk, Serpinb6b 또는 Cd69 유전자를 저발현하는 면역조절 B 세포의 생성 여부를 분석하는 단계; 상기 GPCR19 아고니스트를 주입하지 않은 대조군과 비교하여 상기 GPCR19 아고니스트를 주입한 포유동물에서 상기 (i) 내지 (iv)의 세포의 생성 정도가 대조군과 비교하여 증가하면 상기 GPCR19 아고니스트는 효능이 있는 것으로 판정한다.
본 발명의 방법에 사용되는 GPCR19 아고니스트의 생체내 효능 분석하는 방법을 각각의 단계 별로 상세하게 설명하면 다음과 같다:
단계 (a): 생체 내 생리적 활성 조절 물질의 투여
본 발명의 방법에 있어서, GPCR19 아고니스트의 효능 분석을 위하여 먼저 생체 내 생리적 활성 조절 물질을 인간을 제외한 포유동물에 투여하여 생체 내에 생리적 반응을 유발한다. 단계 (a)에서 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질, 그의 투여하는 방법 및 포유동물은 앞에서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
단계 (b):
GPCR19
아고니스트의
투여
본 발명의 방법에 있어서, 단계 (b)의 방법으로 생체 내 생리적 활성 조절 물질을 투여된 상기 포유동물에 GPCR19 아고니스트를 투여한다. 단계 (b)에서 GPCR19 아고니스트, 그의 투여하는 방법 및 포유동물은 앞에서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
단계 (c):
GPCR19
아고니스트의
생체내
효능 판정
GPCR19 아고니스트 투여 결과, GPCR19 아고니스트를 투여하지 않은 대조군과 비교하여 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트를 투여한 포유동물에서 상기 (i) 내지 (iv)의 세포의 생성 정도가 2% 이상, 바람직하게는 1% 이상, 보다 바람직하게는 0.5% 이상 증가하면 GPCR19 아고니스트는 효능이 있는 것으로 판정한다.
생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 투여로 인해 생성되는 상기 (i) 내지 (iv)의 MDSC 및 면역조절 B 세포에서 고발현 또는 저발현되는 유전자 리스트 및 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트의 투여 방법은 앞서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 GPCR19 아고니스트의 시험관내 효능 분석 방법을 제공한다:
(a) 세포 생리 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트를 골수세포 집단(bone marrow cell population)에 처리하는 단계; 및
(b) 상기 골수세포 집단에서 (i) Gr-1+CD11b+ MDSC(Myeloid-derived suppressor cell), (ii) Prok2, Osm, Ltf, Klra17, Slc40a1, Fcer2a, Hspa1a, Il8rb, Lyz2, Pi16, Dfna5h, Mtus1, 4732429D16Rik, Myadm, P2ry6, Fosb, Cd177, Sort1, Gcnt2, Chac1, Reck, Lyzs, Plekhg3, Csf3r, Aatk, Dgkg, Tacstd2 또는 Xcl1 유전자를 고발현하거나 또는 Il1a, Edn1, Cxcl10, Adora2b, Cxcl9, Serpina3f, Cxcl1, Ptx3, Ifng, Slc7a11, Batf2, Gbp5, Cfl1, Mefv, Bcl2l11, Gbp2, Sphk1, Cd274, Icam1, Il10, Ahnak, Gbp3, Cirbp, Gpr84, Bcl2a1c, Tgtp, Cd86, Hif1a, Smpdl3b, B930041F14Rik, D330014H01Rik, Tnfaip2, Pex11a, Arrdc4, St6galnac4, Irgm1, Pde4d, Marcksl1, Tgm2, Ccl3, Il12a, Tap1, Mt1, Rbak, Rundc3b, Sdc4, Clec4e, Klhl15, Dnase1l3 또는 Mx1 유전자를 저발현하는 MDSC, (iii) CD23hi 면역조절 B 세포 또는 (iv) Fcer2a, Grm6, AU019823, Marcksl1, Bcl2a1c, Bcl2a1d, Afg3l1, Cdk5r1, Cd40, Rrp1b, Slamf1, Luc7l, Igsf9, Gypc, C1qbp, Id3, Il4i1, Gbp1, Cd83, Mybl2, Ift140, Snx11, Swap70, Ccbp2, Sc4mol, Cyp51, Sqle, LOC100040592, B3gnt8, 1300014I06Rik, Fdps, Ctsa, Dmwd, Sfrs7, Hbb-bh1, Hspa1a, Srpk3, Hhex, Insig1, Cbfa2t3h, Taf15, Ddx17, Cnn2, Brwd1, Cr2, Arhgap4, Pira3, Flna, Cdk5rap1, Cugbp1, Ankrd37, Cd44, Mrps7, Mapk11, Pycard, Cap1, Lta, Rbm4, Cd180, Cfp, Cmah, LOC100046855, Srebf1, Ciita, Ryr1, E2f2, Dap3, Wdr9, Ccr6, Pcbd2, Lmnb1, Pira4, Blvrb 또는 Actb 유전자를 고발현하거나 또는 1190002H23Rik, Bhlhb8, Mist1, Fkbp11, Cacna1h, Rsph1, Rbm47, Slpi, Ly6c1, Hist1h1c, Tg, Klra7, Creb3l2, Prg2, Creld2, Nkg7, Anxa2, Txndc5, Tmem66, Amigo2, Klra4, LOC100038894, Speer3, Derl3, Ppapdc1b, Ckb, Thy1, Pqlc3, Klrd1, Xbp1, Klre1, Lgals1, 2010001M09Rik, Ctsw, Cd160, Ccl5, Sel1l, Dusp4, Socs2, Ccl4, Cd9, Mcoln2, Trp53inp1, Ssr2, Reln, Tubb2b, Akp2, F2r, H13, Cd8b1, Ifit3, Rsad2, LOC667370, Irf7, Ifit2, Slfn1, Cxcl10, Ctla4, Rgs1, Oasl2, Il7r, Usp18, Mx1, LOC100048346, Mx2, Tyki, Hba-a1, Lgals3bp, Ifitm3, Cfl1, Oas2, Serpina3f, Emb, P2ry14, Cirbp, Dhx58, Fcer1g, Ifng, AA467197, Gpr114, Trafd1, Cd3d, Igtp, Rilpl1, Apoe, Lat, Sh2d2a, Cd6, Slc15a2, Gbp2, Oasl1, Spo11, Ctse, Klf9, Pex11a, D14Ertd668e, Mlkl, Itk, Serpinb6b 또는 Cd69 유전자를 저발현하는 면역조절 B 세포의 생성 여부를 분석하는 단계; 상기 GPCR19 아고니스트를 처리하지 않은 대조군과 비교하여 상기 GPCR19 아고니스트를 처리한 골수세포 집단에서 상기 (i) 내지 (iv)의 세포의 생성 정도가 대조군과 비교하여 증가하면 상기 GPCR19 아고니스트는 효능이 있는 것으로 판정한다.
단계 (a): 세포 생리 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트의 처리
본 발명의 방법에 있어서, GPCR19 아고니스트의 효능을 분석하기 위하여 먼저 생체 내 생리적 활성 조절 물질을 골수세포 집단(bone marrow cell population)에 처리하여 골수세포의 생리적 변화를 유도한다. 단계 (a)에서 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트, 그의 처리하는 방법 및 골수세포 집단은 앞에서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
단계 (b): GPCR19 아고니스트의 시험관내 효능 판정
GPCR19 아고니스트 시험물질 처리 결과, 시험물질을 처리하지 않은 대조군과 비교하여 세포 생리 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 시험물질을 처리한 골수세포 집단에서 상기 (i) 내지 (iv)의 세포의 생성 정도가 2% 이상, 바람직하게는 1% 이상, 보다 바람직하게는 0.5% 이상 증가하면 GPCR19 아고니스트는 효능이 있는 것으로 판정한다. 시험물질은 GPCR19-연관 질환의 치료제로 판정한다.
세포 생리 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 시험물질 처리로 인해 생성되는 상기 (i) 내지 (iv)의 MDSC 및 면역조절 B 세포에서 고발현 또는 저발현되는 유전자 리스트 및 시험물질의 처리 방법은 앞서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 상기 포유동물은 마우스, 랫트, 개, 원숭이, 염소, 양 또는 토끼인 것을 특징으로 하는 방법이다. 본 발명의 방법에 사용이 가능한 포유동물은 인간을 제외한 포유동물에게 투여가 가능하며 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 반려 동물(예를 들어, 개, 고양이 또는 새), 농장용 동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말 또는 닭) 또는 실험실용 동물(예를 들어, 랫트, 마우스, 기니피그 또는 새)이고, 보다 더 바람직하게는 마우스, 랫트, 개, 원숭이, 염소, 양, 토끼이고 가장 바람직하게는 마우스이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법에 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질 또는 세포 생리 활성 조절 물질은 박테리아 유래 물질 진균 유래 물질, 바이러스 유래 물질, 자가 유래 물질, 또는 알러젠(allergen)인 것을 특징으로 하는 방법이다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 생체 내 생리적 활성 조절 물질 또는 세포 생리 활성 조절 물질은 박테리아 유래 물질로서 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 펩티도글리칸이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법에 사용되는 상기 생체 내 생리적 활성 조절 물질 또는 세포 생리 활성 조절 물질은 GPCR19를 제외한 세포의 수용체에 작용하여 표적 세포의 염증 향진 작용을 촉진하는 물질이다. 이들은 앞서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 사용되는 GPCR19 아고니스트는 하기 화학식 1의 화합물, 그의 염 또는 수화물이다:
상기 화학식에서 R1은 수소, 하이드록시, 치환 또는 비치환 알킬 또는 할로겐; R2는 수소 또는 α-하이드록시; R3은 하이드록시, NH(CH2)mSO3H(m은 정수 0, 1, 2, 3, 4 또는 5) 또는 NH(CH2)nCO2H(n은 정수 0, 1, 2, 3, 4 또는 5); R4는 수소, 알킬 또는 할로겐; R5는 수소, 치환 또는 비치환 알킬 또는 아릴이고; R6은 수소 또는 R5 및 R6가 부착된 탄소와 함께 3, 4, 5 또는 6개 원자 크기로 형성된 고리이고; R7은 수소, 하이드록시, 치환 또는 비치환 알킬; R8은 수소 또는 치환 또는 비치환 알킬; R9은 수소 또는 치환 또는 비치환 알킬; R10은 수소 또는 치환 또는 비치환 알킬; R11은 수소 또는 치환 또는 비치환 알킬이다.
화학식 1의 화합물은 앞서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 방법에 사용되는 GPCR19 아고니스트 시험물질, 생체 내 생리적 활성 조절 물질, 세포 생리 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트의 투여 또는 처리로 인해 생성된 MDSC에서 고발현 또는 저발현 되는 유전자는 앞서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법에 사용되는 GPCR19 아고니스트 시험물질, 생체 내 생리적 활성 조절 물질, 세포 생리 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트의 투여 또는 처리로 인해 생성된 면역조절 B 세포에서 고발현 또는 저발현 되는 유전자는 앞서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생체 내 생리적 활성 조절 물질 또는 세포 생리 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성되고 Gr-1+CD11b+ 표면 형질형을 가지며 항염증 활성을 갖는 세포인 MDSC(Myeloid-derived suppressor cell)를 제공한다.
본 발명에서 사용된 생체 내 생리적 활성 조절 물질 또는 세포 생리 활성 조절 물질의 처리는 앞서 상술한 방법과 동일하고, 생체 내 생리적 활성 조절 물질 또는 세포 생리 활성 조절 물질로 예컨대, 리포폴리사카라이드(LPS)를 인간을 제외한 포유동물에게 투여할 경우 투여량으로 바람직하게는 0.001 mg/kg 내지 100 mg/kg이고, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 50 mg/kg이고, 가장 바람직하게는 20 mg/kg를 투여한다.
상기 리포폴리사카라이드(LPS)를 골수세포 집단에 처리하는 경우 그 농도로 바람직하게는 0.0001 mg/㎖ 내지 10 mg/㎖이고, 보다 바람직하게는 0.0005 mg/㎖ 내지 1 mg/㎖이고, 보다 더 바람직하게는 0.001 mg/㎖ 내지 0.1 mg/㎖이고 가장 바람직하게는 0.001 mg/㎖을 배양액에 처리한다.
한편, GPCR19 아고니스트 또는 그 시험물질로서, 예컨대 소듐 타우로데옥시콜레이트를 인간을 제외한 포유동물에게 투여하는 경우에는 바람직하게는 0.01 mg/kg 내지 100 mg/kg이고, 보다 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 10 mg/kg이고, 가장 바람직하게는 0.5 ~ 8 mg/kg을 투여한다. 상기 소듐 타우로데옥시콜레이트를 골수세포 집단에 처리하는 경우에는 바람직하게는 0.0001 mg/㎖ 내지 100 mg/㎖ 이고, 보다 바람직하게는 0.001 mg/㎖ 내지 10 mg/㎖ 이고, 보다 더 바람직하게는 0.01 mg/㎖ 내지 1 mg/㎖ 이고, 가장 바람직하게는 0.05 mg/㎖을 배양액에 처리한다.
생체 내 생리적 활성 조절 물질로 예컨대, 리포폴리사카라이드(LPS)를 처리하는 시간은 바람직하게는 6시간 내지 48시간이고, 가장 바람직하게는 18시간 처리한다. 한편, GPCR19 아고니스트로서 소듐 타우로데옥시콜레이트를 처리하는 시간은 바람직하게는 6시간 내지 96시간이고, 보다 바람직하게는 12시간 또는 72시간이며, 가장 바람직하게는 48시간이다.
생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트의 처리 후에 MDSC(Myeloid-derived suppressor cell)는 Gr-1+CD11b+ 표면 형질형을 나타내는 세포로 분화한다. 분화된 MDSC 세포는 대식 세포 계열의 골수 세포 마커 CD11b 및 과립구에 대한 마커 Gr1을 발현한다. Gr1+CD11b+은 Gr1+ 또는 CD11b+에 대한 항체를 이용하여 면역반응을 유도하고, 유세포분석기를 사용하여 선별할 수 있다. Gr-1+CD11b+ 표면 형질을 갖는 MDSC 세포를 패혈증 마우스에 투여한 결과 대조군과 비교하여 현저하게 높은 생존율을 보였고, 이는 상기 MDSC 세포가 항염증 활성을 나타낸다는 것을 제시한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, Gr1+CD11b+ 표면 형질형을 갖는 MDSC는 Prok2, Osm, Ltf, Klra17, Slc40a1, Fcer2a, Hspa1a, Il8rb, Lyz2, Pi16, Dfna5h, Mtus1, 4732429D16Rik, Myadm, P2ry6, Fosb, Cd177, Sort1, Gcnt2, Chac1, Reck, Lyzs, Plekhg3, Csf3r, Aatk, Dgkg, Tacstd2 또는 Xcl1 유전자를 고발현하거나 또는 Il1a, Edn1, Cxcl10, Adora2b, Cxcl9, Serpina3f, Cxcl1, Ptx3, Ifng, Slc7a11, Batf2, Gbp5, Cfl1, Mefv, Bcl2l11, Gbp2, Sphk1, Cd274, Icam1, Il10, Ahnak, Gbp3, Cirbp, Gpr84, Bcl2a1c, Tgtp, Cd86, Hif1a, Smpdl3b, B930041F14Rik, D330014H01Rik, Tnfaip2, Pex11a, Arrdc4, St6galnac4, Irgm1, Pde4d, Marcksl1, Tgm2, Ccl3, Il12a, Tap1, Mt1, Rbak, Rundc3b, Sdc4, Clec4e, Klhl15, Dnase1l3 또는 Mx1 유전자를 저발현 한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질은 박테리아 유래 물질, 진균 유래 물질, 바이러스 유래 물질, 자가 유래 물질, 알러젠(allergen) 또는 암 세포 유래 물질인 것을 특징으로 하여 생성되는 MDSC를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 생체 내 생리적 활성 조절 물질은 박테리아 유래 물질로서 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 펩티도글리칸이다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 생체 내 생리적 활성 조절 물질은 항원이다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법에서 상기 MDSC를 만들기 위하여 사용되는 GPCR19 아고니스트는 화학식 1의 화합물, 그의 염 또는 수화물이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성되거나 또는 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성된 MDSC 처리에 의해 형성되며 CD23hi 표면 형질형을 가지며 항염증 활성을 갖는 면역조절 B 세포(Regulatory B cell)를 제공한다.
생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리하는 방법은 앞서 상술한 내용과 동일하기 때문에, 이 둘 사이에 공통된 내용은 반복 기재에 따른 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성된 MDSC를(H-MDSC) 포유동물에 투여할 경우, 투여하는 세포수로 바람직하게는 1 × 103 내지 1 × 108 세포수 이고, 보다 바람직하게는 1 × 105 내지 1 × 107 세포수 이고, 가장 바람직하게는 1 × 106 세포수 이다. 상기 H-MDSC 투여로 인하여 CD23hi 표면형질 마커를 발현하는 면역조절 B세포가 생성되고(예컨대, BHM 세포), 이 세포를 패혈증에 걸린 마우스에 투여한 결과 대조군과 비교하여 현저하게 높은 생존율을 보였고, 이는 상기 면역조절 B 세포(예컨대, BHM 세포)가 항염증 활성을 나타낸다는 것을 제시한다.
생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트를 골수세포집단에 처리하는 경우는 앞서 상술한 내용과 동일하고, 이를 투여한 결과 CD23hi 표면형질 마커를 발현하는 면역조절 B 세포가 생성된다(예컨대, 48H BH 세포). 생성된 48H BH 세포를 패혈증 마우스에 투여한 결과 대조군과 비교하여 현저하게 높은 생존율을 보였고, 이는 상기 면역조절 B 세포(예컨대, 48H BH 세포)가 항염증 활성을 나타낸다는 것을 제시한다.
GPCR19 아고니스트 또는 그 시험물질, 예컨대 소듐 타우로데옥시콜레이트를 골수세포 집단에 처리하는 것은 배양되는 골수세포의 배양액에 처리할 수 있으며, 바람직하게는 0.0001 mg/㎖ 내지 100 mg/㎖ 이고, 보다 바람직하게는 0.001 mg/㎖ 내지 10 mg/㎖ 이고, 보다 더 바람직하게는 0.01 mg/㎖ 내지 1 mg/㎖ 이고, 가장 바람직하게는 0.05 mg/㎖을 배양액에 처리한다.
GPCR19 아고니스트 또는 그 시험물질의 처리 결과 생성되는 면역조절 B 세포에서 발현하는 표현형질 마커인 CD23hi은 면역조절 B 세포 계통의 초기 마커인 전구체(precursor) B 세포 표면에 성숙하는 기간 동안 나타나서 면역조절 B 세포가 살아있는 동안 남아있는 마커이다. CD23hi 면역조절 B 세포는 CD23+ 항체를 이용하여 염색한 후에, 유세포분석기를 사용하여 선별할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, CD23hi 표면형질 마커를 발현하는 면역조절 B세포는 Fcer2a, Grm6, AU019823, Marcksl1, Bcl2a1c, Bcl2a1d, Afg3l1, Cdk5r1, Cd40, Rrp1b, Slamf1, Luc7l, Igsf9, Gypc, C1qbp, Id3, Il4i1, Gbp1, Cd83, Mybl2, Ift140, Snx11, Swap70, Ccbp2, Sc4mol, Cyp51, Sqle, LOC100040592, B3gnt8, 1300014I06Rik, Fdps, Ctsa, Dmwd, Sfrs7, Hbb-bh1, Hspa1a, Srpk3, Hhex, Insig1, Cbfa2t3h, Taf15, Ddx17, Cnn2, Brwd1, Cr2, Arhgap4, Pira3, Flna, Cdk5rap1, Cugbp1, Ankrd37, Cd44, Mrps7, Mapk11, Pycard, Cap1, Lta, Rbm4, Cd180, Cfp, Cmah, LOC100046855, Srebf1, Ciita, Ryr1, E2f2, Dap3, Wdr9, Ccr6, Pcbd2, Lmnb1, Pira4, Blvrb 또는 Actb 유전자를 고발현하거나 또는 1190002H23Rik, Bhlhb8, Mist1, Fkbp11, Cacna1h, Rsph1, Rbm47, Slpi, Ly6c1, Hist1h1c, Tg, Klra7, Creb3l2, Prg2, Creld2, Nkg7, Anxa2, Txndc5, Tmem66, Amigo2, Klra4, LOC100038894, Speer3, Derl3, Ppapdc1b, Ckb, Thy1, Pqlc3, Klrd1, Xbp1, Klre1, Lgals1, 2010001M09Rik, Ctsw, Cd160, Ccl5, Sel1l, Dusp4, Socs2, Ccl4, Cd9, Mcoln2, Trp53inp1, Ssr2, Reln, Tubb2b, Akp2, F2r, H13, Cd8b1, Ifit3, Rsad2, LOC667370, Irf7, Ifit2, Slfn1, Cxcl10, Ctla4, Rgs1, Oasl2, Il7r, Usp18, Mx1, LOC100048346, Mx2, Tyki, Hba-a1, Lgals3bp, Ifitm3, Cfl1, Oas2, Serpina3f, Emb, P2ry14, Cirbp, Dhx58, Fcer1g, Ifng, AA467197, Gpr114, Trafd1, Cd3d, Igtp, Rilpl1, Apoe, Lat, Sh2d2a, Cd6, Slc15a2, Gbp2, Oasl1, Spo11, Ctse, Klf9, Pex11a, D14Ertd668e, Mlkl, Itk, Serpinb6b 또는 Cd69 유전자를 저발현 한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, CD23hi 표면형질 마커를 발현하는 면역조절 B 세포는 CD21 및 CD23을 발현한다.
상기 면역조절 B 세포에서 발현하는 CD23(FCεRII)는 림프구 추적 수용체(MEL-14) 및 내피 백혈구 부착 분자-1(ELAM-1) 등을 포함하는 C-렉틴 군의 II형 분자이다. CD23(FCεRII)은 IgE에 대하여 친화력이 낮은 수용체이다. 포유동물의 수지상세포, B 세포, T 세포 및 거식세포를 포함하는 다양한 혈액 구성 세포타입들이 CD23을 세포 표면에 발현하고 있다. 또한 CD23 분자들은 생체액에 용해된 형태로 발견되기도 한다. 용해성 CD23(sCD23) 분자는 세포막 투과성 수용체의 단백질 절단에 의해 생성된다. 한편, CD21은 B 세포에서 발현하는 마커로써, CD19 및 TAPA-1과 복합체를 형성하고 보체성분 3Cd와 결합하여 B 세포의 활성화 및 증식의 부자극 성분이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에 사용되는 생체 내 생리적 활성 조절 물질 또는 세포활성 조절물질은 박테리아 유래 물질, 진균 유래 물질, 바이러스 유래 물질, 자가 유래 물질, 또는 알러젠(allergen)인 것을 특징으로 하여 생성되는 면역조절 B 세포를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 생체 내 생리적 활성 조절 물질 또는 세포활성 조절 물질은 박테리아 유래 물질로서 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 펩티도글리칸이다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법에서 상기 MDSC 또는 면역조절 B 세포(48H BH 세포) 또는 보다 구체적으로는 CD21+CD23+ B 세포를 만들기 위하여 사용되는 GPCR19 아고니스트는 화학식 1의 화합물, 그의 염 또는 수화물이다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성된 Gr-1+CD11b+MDSC(H-MDSC), 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성된 Gr-1+CD11b+MDSC 처리에 의해 형성된 면역조절 B 세포(BHM 세포), 보다 구체적으로는 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성된 Gr-1+CD11b+MDSC 처리에 의해 형성된 CD21+CD23+ B 세포, 또는 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성된 면역조절 B 세포(48H BH 세포) 또는 보다 구체적으로는 생체 내 생리적 활성 조절 물질 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형성된 CD21+CD23+ B 세포,를 유효성분으로 포함하는 항염증 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물의 유효성분으로 바람직하게는 Gr-1+CD11b+MDSC 또는 CD23hi 면역조절 B 세포(48H BH 세포 또는 BHM 세포) 또는 B220+ CD21+CD23+ B 세포를 함유하는 항염증 약제학적 조성물이다.
본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 방법으로 생성된 항염증 약제학적 조성물로 예방 또는 치료가 가능한 질환은 바람직하게는 패혈증, 자가면역질환, 염증성 질환, 류마티스 관절염, 아토피성 피부염, 알쯔하이머 병, 궤양성 대장염, 제1형 당뇨병, 크론병, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척수염, 다발성 경화증, 캐슬만씨 병, 자가면역성 간염, 자가 면역성 포도막염, 중증 근무력증, 원형 탈모증 및 전신성 홍반성 낭창으로 구성된 군으로부터 선택되나 이에 한정되지 않고, 가장 바람직하게는 패혈증이다.
본 발명의 조성물이 항염증 약제학적 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체를 포함한다. 본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed. 1995)에 상세히 기재되어 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 관절내 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 예시적인 투여량은 0.001-1000 ㎎/㎏이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명 따르면 리포폴리사카라이드(LPS)의 투여로 인해 염증이 유도된 마우스에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(HY2191)의 투여에 의하여 H-MDSC 세포의 수가 증가하고, 증가된 H-MDSC는 현저한 패혈증 치료 효과를 보인다.
(b) 본 발명에 따르면 리포폴리사카라이드(LPS)의 투여로 인해 염증이 유도된 마우스에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(HY2191)의 투여에 의하여 면역조절 B 세포(48h BH 세포)의 수가 증가하고, 증가된 48h BH 세포 세포는 현저한 패혈증 치료 효과를 보인다.
(c) 본 발명에 따르면 리포폴리사카라이드(LPS)의 투여로 인해 염증이 유도된 마우스에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(HY2191)의 투여에 의하여 B220+CD21+CD23+ B 세포의 수가 증가하고, 증가된 B220+CD21+CD23+ B 세포는 현저한 패혈증 치료 효과를 보인다.
(d) 본 발명에 따르면 리포폴리사카라이드(LPS)의 투여로 염증이 유도된 마우스에서 H-MDSC의 투여에 의하여 BHM 세포의 수가 증가하고, 증가된 BHM 세포는 현저한 패혈증 치료 효과를 보인다.
(e) 본 발명에 따르면 리포폴리사카라이드(LPS)의 투여로 염증이 유도된 마우스에서 H-MDSC의 투여에 의하여 B220+CD21+CD23+B 세포의 수가 증가하고, 증가된 B220+CD21+CD23+B 세포는 현저한 패혈증 치료 효과를 보인다.
(f) 본 발명의 방법은 GPCR19-연관 질환의 치료제의 스크리닝 방법 또는 GPCR19 아고니스트의 효능 분석 방법을 제공하여, 항염증 약제학적 조성물을 제공한다.
도 1A-1C는 소듐 타우로데옥시콜레이트 (HY2191)의 패혈증 치료효과를 보기위해 다양한 종류의 패혈증 유도 마우스에 소듐 타우로데옥시콜레이트 (HY2191)을 주입한 후 그 생존율을 도식화한 그래프이다. 실험방법을 도식화한 이미지를 그래프 상부에 첨부하였다. 도 1A는 HY2191을 LPS 유도 패혈증 마우스에 LPS처리 30분 및 24시간 후에 주입하였을 때 생존율을 나타내는 그래프이다. 도 1B는 HY2191을 CLP 유도 패혈증 마우스에 CLP 유도 2시간 후에 주입하였을 때 생존율을 도시하는 그래프이다. 도 1C는 HY2191가 B 세포 및 T 세포가 결핍된 마우스 (Rag2 KO)에서는 패혈증 치료효과를 나타내지 못함을 도시하는 그래프이다.
도 2A-2B는 HY2191에 의한 생체내 염증사이토카인 생성 억제를 도시하는 그래프이다. 도 2A는 HY2191가 LPS에 의해 유도된 혈중 염증사이토카인 농도를 감소시킴을 도시하는 그래프이다. 도 2B는 HY2191가 CLP에 의해 유도된 혈중 염증사이토카인 농도를 감소시킴을 도시하는 그래프이다.
도 3A-3B는 HY2191처리후 패혈증에의한 저혈압증의 완화를 도시하는 그래프이다. 도 3A는 LPS에 의해 유도된 혈압 저하가 HY2191에 의해 정상화됨을 평균 혈압 (mmHg) 상승으로 나타낸 그래프이다. 도 3B는 LPS에 의해 유도된 신부전과 간기능 장애가 HY2191에 의해 완화됨을 각각 혈중 BUN과 AST 감소로 도시하는 그래프이다.
도 4는 LPS 유도 패혈증 마우스의 비장세포 특히 CD11b+세포 및 B220+ B 세포의 절대수를 도시한 그래프이다.
도 5는 LPS 유도 패혈증 마우스의 비장 CD4+Foxp3+ T cell (regulatory T cell, Treg)의 절대수를 도시한 그래프이다.
도 6는 LPS에 의한 비장 세포의 활성화가 HY2191에 의해 억제됨을 도시하는 그래프들이다. 도 6A에서 비장 CD11C+세포의 활성화를 CD86 활성화 마커의 평균 형광강도(Mean fluoresense intensity, MFI)로 표시하였다. 도 6B에서 비장 B220+B 세포의 활성화를 CD86 활성화 마커의 평균 형광강도(Mean fluoresense intensity, MFI)로 표시하였다. 도 6C는 비장 B220+ B 세포중 세포 활성화마커인 CD86을 과발현하는 B220+CD86+ B 세포의 상대적 비율(%)로 나타내는 FACS 플롯이다.
도 7은 HY2191를 처리한 LPS 유도 패혈증 마우스 생체 내에서 Gr-1+CD11b+ 세포 (H-MDSC)가 증가하고 이들이 패혈증 치료 효과를 보임을 도시하는 그래프들이다. 도 7A는 LPS 유도 패혈증 마우스의 비장에서의 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포수가 HY2191 처리 군에서 24시간 및 48시간 후에 의미 있게 증가함을 도시한 그래프이다. 또한 HY2191가 B 세포 및 T 세포가 결핍된 마우스 (Rag2 KO)에서는 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포수에 변화를 주지 않음을 도시하는 그래프이다. 도 7B는 H-MDSC의 비장 세포내 상대적 비율 (%)을 도시한 FACS 플롯이다. 도 7C위는 H-MDSC의 미성숙도를 골수양세포 미성숙 마커인 CD31+ 세포의 비율 (%)로 나타낸 FACS 히스토그램이다. 도 7C아래는 H-MDSC가 Ly6G+Ly6CinterF4/80low 임을 보여주는 FACS 플롯이다. 도 7D는 H-MDSC와 L-MDSC의 발현 유전자를 비교하는 Heat-map이다. 붉은 색은 L-MDSC (HY2191을 처리하지 않은 LPS 유도 패혈증 마우스에서 수확한 Gr-1+CD11b+ MDSC)에 비하여 H-MDSC에서 과발현하는 유전자를, 초록색은 저발현하는 유전자를 각각 표시한다.
도 8은 H-MDSC의 패혈증 치료효과를 보기위해 패혈증 유도 마우스에 여러 종류의 세포를 양자이입(adoptive transfer)한 후 그 생존율을 도식화한 그래프이다. LPS 유도 패혈증 마우스에서 H-MDSC 수확 및 투여 후 그 치료효과를 분석하기 위한 전반적인 실험방법을 도식화한 이미지를 그래프 상위에 첨부하였다.
도 9는 LPS 패혈증 유도 마우스에 양자 이입된 H-MDSC가 유도하는 생체 내 면역 세포들의 변화를 절대수 및 상대적 비율 (%)로 도시화한 그래프들이다. 도 9A는 H-MDSC 양자 이입 24시간 후에 비장 B 세포의 상대적 및 절대수의 증가를 도시하는 FACS 플롯 이미지 (위)와 반복실험의 그래프(아래)이다. 도 9B는 H-MDSC 양자 이입 24시간 후에 비장 및 골수 CD11B+ Gr-1+ F4/80- 세포의 상대적 및 절대수의 증가를 도시하는 FACS 플롯 이미지 (위)와 반복실험의 그래프(아래)이다. 도 9C는 H-MDSC 양자 이입 24시간 후에 비장 T 세포 (CD4+ 및 CD8+ T 세포)들의 상대적 및 절대수가 변화하지 않음을 도시하는 FACS 플롯 이미지 (위)와 그래프 (아래)이다. 도 9D는 H-MDSC 양자 이입 24시간 후에 비장 CD11C+ 수지상 세포 절대수의 의미 있는 변화가 없음을 도시하는 그래프이다.
도 10은 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에 양자 이입한 H-MDSC에 의해 증식된 비장 B 세포 (BHM 세포)의 패혈증 치료효과를 보기위해 패혈증 유도 마우스에 여러 종류의 B 세포를 양자이입(adoptive transfer)한 후 그 생존율을 도식화한 그래프이다.
도 11은 양자 이입된 BHM 세포가 B 세포 및 T 세포가 결핍된 마우스 (Rag2 KO)에서H-MDSC 존재하에 패혈증 치료효과를 나타냄을 도시하는 그래프이다.
도 12A-C 는 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에 양자 이입한 48h BH 세포가 유도하는 생체 내 비장 면역 세포들의 변화를 도시화한 그래프들이다. 도 12A는 48h BH 세포가 양자 이입 24시간 후에 LPS에 의한 비장 B 세포의 활성화를 도시화한 FACS 플롯 이미지이다. 도 12B는 48h BH 세포가 양자 이입 24시간 후에 LPS에 의한 비장 T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포)의 활성화를 도시화한 FACS 플롯 이미지이다. 도 12C는 48h BH 세포를 양자 이입 24시간 후에 비장에서 증가된 CD11b+ Ly6G+ Ly6C inter세포의 상대적 비율 (%)을 도시화한 FACS 플롯 이미지이다.
도 13은 48h BH 세포의 표현형이 기존에 알려진 면역조적 B 세포와 차이가 있슴을 나타내는 FACS 플롯이다. 도 13A는 48h BH 세포가 B1a B 세포 특징적인 마커인 CD1d 및 CD5를 발현을 도식화한 FACS 플롯이다. 도 13B는 48h BH 세포가 면역 조절 T2-MZP B 세포 특징적 마커인 CD93 발현을 도식화한 FACS 플롯이다. 도 13C는 LPS로 패혈증을 유도한 마우스 체내에서 관찰되는 B 세포에 비하여 48h BH 세포가 성숙 B 세포의 특징적 마커인 IgM 발현을 도식화한 FACS 플롯이다.
도 14A 는 L-MDSC (HY2191을 처리하지 않은 LPS 유도 패혈증 마우스에서 수확한 Gr-1+CD11b+ MDSC) 또는 H-MDSC (HY2191을 처리한 LPS 유도 패혈증 마우스에서 수확한 Gr-1+CD11b+ MDSC)를 양자 이입 24시간 후 증가된 비장 B220+CD23hiCD21int세포의 표현형 및 상대적 비율 (%)을 도식화한 FACS플롯이다. 도 14B는 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에서 L-MDSC 또는 H-MDSC 양자 이입 24시간 후에 비장의 B220+CD23+세포 수 증가를 절대수로 도식화한 그래프이다.
도 15A는 B220+CD23hiCD21hi세포 (CD23hi BH Cell)가 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에서 HY2191 주입 48시간 후에 CD23 발현을 나타내는 FACS 플롯이다. 도 15B는 B220+CD23hiCD21int세포 (CD23hi BH Cell)의 패혈증 치료효과를 보기위해 패혈증 유도 마우스에 양자이입(adoptive transfer)한 후 마우스의 생존율을 도식화한 그래프이다. LPS로 패혈증을 유도한 마우스로 부터 CD23hi BH 세포를 수확한 시기와 투여 후 그 치료효과를 분석하기 위한 전반적인 실험방법을 그래프 상위에 도식화하였다.
도 16은 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에 양자 이입 (adoptive transfer)한 CD23hi BH 세포가 마우스의 생체 내에서 B 세포 및 CD11b+ 세포 증식을 유도함을 도식화한 그래프이다. CD23hi BH 세포를 마우스에 양자 이입한 후 24시간 및 48시간 후의 비장의 B220+ B세포와 CD11b+ Gr-1+ 절대수를 대조군(PBS) 및 CD23lo BH 세포와 비교하였다.
도 17A는 마우스 골수세포에 LPS (1mg/ml)과 HY2191 (50 mg/ml)을 24h 동안 시험관내 처리한 후 Gr-1+CD11b+ 세포의 절대수가 증가함을 도식화한 그래프이다. LexMDSC (시험관내의 마우스 골수세포에 HY2191을 처리하지 않고 LPS만 단독으로 처리한 후 생성된 Gr-1+CD11b+ 세포) 또는 HexMDSC (시험관내의 마우스 골수세포에HY2191와 LPS를 동시에 처리한 후 생성된 Gr-1+CD11b+ 세포)의 절대수를 도식화하였다. 도 17B는 도 17A의 HexMDSC, LexMDSC, 배지 (cellgro, 음성대조군)의 패혈증 치료효과를 보기위하여 양자 이입후 생존한 LPS로 패혈증을 유도한 마우스의 생존율을 도식화한 그래프이다.
도 2A-2B는 HY2191에 의한 생체내 염증사이토카인 생성 억제를 도시하는 그래프이다. 도 2A는 HY2191가 LPS에 의해 유도된 혈중 염증사이토카인 농도를 감소시킴을 도시하는 그래프이다. 도 2B는 HY2191가 CLP에 의해 유도된 혈중 염증사이토카인 농도를 감소시킴을 도시하는 그래프이다.
도 3A-3B는 HY2191처리후 패혈증에의한 저혈압증의 완화를 도시하는 그래프이다. 도 3A는 LPS에 의해 유도된 혈압 저하가 HY2191에 의해 정상화됨을 평균 혈압 (mmHg) 상승으로 나타낸 그래프이다. 도 3B는 LPS에 의해 유도된 신부전과 간기능 장애가 HY2191에 의해 완화됨을 각각 혈중 BUN과 AST 감소로 도시하는 그래프이다.
도 4는 LPS 유도 패혈증 마우스의 비장세포 특히 CD11b+세포 및 B220+ B 세포의 절대수를 도시한 그래프이다.
도 5는 LPS 유도 패혈증 마우스의 비장 CD4+Foxp3+ T cell (regulatory T cell, Treg)의 절대수를 도시한 그래프이다.
도 6는 LPS에 의한 비장 세포의 활성화가 HY2191에 의해 억제됨을 도시하는 그래프들이다. 도 6A에서 비장 CD11C+세포의 활성화를 CD86 활성화 마커의 평균 형광강도(Mean fluoresense intensity, MFI)로 표시하였다. 도 6B에서 비장 B220+B 세포의 활성화를 CD86 활성화 마커의 평균 형광강도(Mean fluoresense intensity, MFI)로 표시하였다. 도 6C는 비장 B220+ B 세포중 세포 활성화마커인 CD86을 과발현하는 B220+CD86+ B 세포의 상대적 비율(%)로 나타내는 FACS 플롯이다.
도 7은 HY2191를 처리한 LPS 유도 패혈증 마우스 생체 내에서 Gr-1+CD11b+ 세포 (H-MDSC)가 증가하고 이들이 패혈증 치료 효과를 보임을 도시하는 그래프들이다. 도 7A는 LPS 유도 패혈증 마우스의 비장에서의 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포수가 HY2191 처리 군에서 24시간 및 48시간 후에 의미 있게 증가함을 도시한 그래프이다. 또한 HY2191가 B 세포 및 T 세포가 결핍된 마우스 (Rag2 KO)에서는 Gr-1+CD11b+ MDSC 세포수에 변화를 주지 않음을 도시하는 그래프이다. 도 7B는 H-MDSC의 비장 세포내 상대적 비율 (%)을 도시한 FACS 플롯이다. 도 7C위는 H-MDSC의 미성숙도를 골수양세포 미성숙 마커인 CD31+ 세포의 비율 (%)로 나타낸 FACS 히스토그램이다. 도 7C아래는 H-MDSC가 Ly6G+Ly6CinterF4/80low 임을 보여주는 FACS 플롯이다. 도 7D는 H-MDSC와 L-MDSC의 발현 유전자를 비교하는 Heat-map이다. 붉은 색은 L-MDSC (HY2191을 처리하지 않은 LPS 유도 패혈증 마우스에서 수확한 Gr-1+CD11b+ MDSC)에 비하여 H-MDSC에서 과발현하는 유전자를, 초록색은 저발현하는 유전자를 각각 표시한다.
도 8은 H-MDSC의 패혈증 치료효과를 보기위해 패혈증 유도 마우스에 여러 종류의 세포를 양자이입(adoptive transfer)한 후 그 생존율을 도식화한 그래프이다. LPS 유도 패혈증 마우스에서 H-MDSC 수확 및 투여 후 그 치료효과를 분석하기 위한 전반적인 실험방법을 도식화한 이미지를 그래프 상위에 첨부하였다.
도 9는 LPS 패혈증 유도 마우스에 양자 이입된 H-MDSC가 유도하는 생체 내 면역 세포들의 변화를 절대수 및 상대적 비율 (%)로 도시화한 그래프들이다. 도 9A는 H-MDSC 양자 이입 24시간 후에 비장 B 세포의 상대적 및 절대수의 증가를 도시하는 FACS 플롯 이미지 (위)와 반복실험의 그래프(아래)이다. 도 9B는 H-MDSC 양자 이입 24시간 후에 비장 및 골수 CD11B+ Gr-1+ F4/80- 세포의 상대적 및 절대수의 증가를 도시하는 FACS 플롯 이미지 (위)와 반복실험의 그래프(아래)이다. 도 9C는 H-MDSC 양자 이입 24시간 후에 비장 T 세포 (CD4+ 및 CD8+ T 세포)들의 상대적 및 절대수가 변화하지 않음을 도시하는 FACS 플롯 이미지 (위)와 그래프 (아래)이다. 도 9D는 H-MDSC 양자 이입 24시간 후에 비장 CD11C+ 수지상 세포 절대수의 의미 있는 변화가 없음을 도시하는 그래프이다.
도 10은 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에 양자 이입한 H-MDSC에 의해 증식된 비장 B 세포 (BHM 세포)의 패혈증 치료효과를 보기위해 패혈증 유도 마우스에 여러 종류의 B 세포를 양자이입(adoptive transfer)한 후 그 생존율을 도식화한 그래프이다.
도 11은 양자 이입된 BHM 세포가 B 세포 및 T 세포가 결핍된 마우스 (Rag2 KO)에서H-MDSC 존재하에 패혈증 치료효과를 나타냄을 도시하는 그래프이다.
도 12A-C 는 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에 양자 이입한 48h BH 세포가 유도하는 생체 내 비장 면역 세포들의 변화를 도시화한 그래프들이다. 도 12A는 48h BH 세포가 양자 이입 24시간 후에 LPS에 의한 비장 B 세포의 활성화를 도시화한 FACS 플롯 이미지이다. 도 12B는 48h BH 세포가 양자 이입 24시간 후에 LPS에 의한 비장 T 세포(CD4+ 및 CD8+ T 세포)의 활성화를 도시화한 FACS 플롯 이미지이다. 도 12C는 48h BH 세포를 양자 이입 24시간 후에 비장에서 증가된 CD11b+ Ly6G+ Ly6C inter세포의 상대적 비율 (%)을 도시화한 FACS 플롯 이미지이다.
도 13은 48h BH 세포의 표현형이 기존에 알려진 면역조적 B 세포와 차이가 있슴을 나타내는 FACS 플롯이다. 도 13A는 48h BH 세포가 B1a B 세포 특징적인 마커인 CD1d 및 CD5를 발현을 도식화한 FACS 플롯이다. 도 13B는 48h BH 세포가 면역 조절 T2-MZP B 세포 특징적 마커인 CD93 발현을 도식화한 FACS 플롯이다. 도 13C는 LPS로 패혈증을 유도한 마우스 체내에서 관찰되는 B 세포에 비하여 48h BH 세포가 성숙 B 세포의 특징적 마커인 IgM 발현을 도식화한 FACS 플롯이다.
도 14A 는 L-MDSC (HY2191을 처리하지 않은 LPS 유도 패혈증 마우스에서 수확한 Gr-1+CD11b+ MDSC) 또는 H-MDSC (HY2191을 처리한 LPS 유도 패혈증 마우스에서 수확한 Gr-1+CD11b+ MDSC)를 양자 이입 24시간 후 증가된 비장 B220+CD23hiCD21int세포의 표현형 및 상대적 비율 (%)을 도식화한 FACS플롯이다. 도 14B는 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에서 L-MDSC 또는 H-MDSC 양자 이입 24시간 후에 비장의 B220+CD23+세포 수 증가를 절대수로 도식화한 그래프이다.
도 15A는 B220+CD23hiCD21hi세포 (CD23hi BH Cell)가 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에서 HY2191 주입 48시간 후에 CD23 발현을 나타내는 FACS 플롯이다. 도 15B는 B220+CD23hiCD21int세포 (CD23hi BH Cell)의 패혈증 치료효과를 보기위해 패혈증 유도 마우스에 양자이입(adoptive transfer)한 후 마우스의 생존율을 도식화한 그래프이다. LPS로 패혈증을 유도한 마우스로 부터 CD23hi BH 세포를 수확한 시기와 투여 후 그 치료효과를 분석하기 위한 전반적인 실험방법을 그래프 상위에 도식화하였다.
도 16은 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에 양자 이입 (adoptive transfer)한 CD23hi BH 세포가 마우스의 생체 내에서 B 세포 및 CD11b+ 세포 증식을 유도함을 도식화한 그래프이다. CD23hi BH 세포를 마우스에 양자 이입한 후 24시간 및 48시간 후의 비장의 B220+ B세포와 CD11b+ Gr-1+ 절대수를 대조군(PBS) 및 CD23lo BH 세포와 비교하였다.
도 17A는 마우스 골수세포에 LPS (1mg/ml)과 HY2191 (50 mg/ml)을 24h 동안 시험관내 처리한 후 Gr-1+CD11b+ 세포의 절대수가 증가함을 도식화한 그래프이다. LexMDSC (시험관내의 마우스 골수세포에 HY2191을 처리하지 않고 LPS만 단독으로 처리한 후 생성된 Gr-1+CD11b+ 세포) 또는 HexMDSC (시험관내의 마우스 골수세포에HY2191와 LPS를 동시에 처리한 후 생성된 Gr-1+CD11b+ 세포)의 절대수를 도식화하였다. 도 17B는 도 17A의 HexMDSC, LexMDSC, 배지 (cellgro, 음성대조군)의 패혈증 치료효과를 보기위하여 양자 이입후 생존한 LPS로 패혈증을 유도한 마우스의 생존율을 도식화한 그래프이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예
1.
LPS
로 유도한 패혈증 모델에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
, sodium
taurodeoxycholate
;
HY2191
)의 효과
LPS(sigma, 미국)에 유도되는 패혈증 모델 설정을 위해 모든 실험에 8-12 주령의 C57BL/6 마우스(SLC, 일본)를 사용하였다. 살모넬라 LPS(sigma, 미국) 20mg/kg (12,000 EU/g)를 마우스의 복강 내 투여한 지 30분 및 24시간 후에 꼬리정맥으로 대조 물질(PBS, WelGENE, 한국) 또는 소듐 타우로데옥시콜레이트[HY2191, sodium taurodeoxycholate; HY2191(New Zealand Pharmaceuticals Ltd, 뉴질랜드)]를 Medfusion2001(medex, 미국)을 사용하여 15분간 점적 주사하였다 (Medfusion2001, medex, 미국). 시간이 경과함에 따른 실험군 및 대조군의 생존율을 조사하였고 그 결과는 도 1A에 도시하였다. 도 1A에서 알 수 있듯이, 소듐 타우로데옥시콜레이트를 투여한 실험군의 마우스들은 대조군의 마우스들에 비하여 생존율이 30분후 투여한 경우에 4배, 24시간 후 투여한 경우에는 5배 높았다.
실시예
2.
Cecal
-
ligation
and
Puncture
(
CLP
) 패혈증 모델에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate
;
HY2191
)의 효과
마우스를 인위적으로 맹장을 결찰 및 천공하여 복막염을 유발한후 시간 경과에 따라 패혈증이 유발되는 CLP 모델을 이용하여 소듐 타우로데옥시콜레이트의 약리 효과를 시험하였다. 20마리의 C57BL/6 마우스(SLC, 일본)를 애버틴(2,2,2-Tribromoethanol 25g + 2-Methyl-2-butanol 15.5ml로 제조된 stock용액을 PBS로 8배 희석하여 사용)으로 마취시킨 후, 복부 오른쪽 부위를 0.5 cm 길이로 절개하고 맹장을 노출시킨 다음 회맹부 관 (ileocecal valve) 아래부위 0.9 cm 하단부위를 결찰한 후 맹장에 23 게이지 바늘로 3개의 구멍을 내고, 복부를 다시 봉합하여 패혈증을 유발하였다. 봉합한지 2시간 후에 각 10마리의 C57BL/6 마우스에는 소듐 타우로데옥시콜레이트[HY2191, sodium taurodeoxycholate; HY2191(New Zealand Pharmaceuticals Ltd, 뉴질랜드)]를 꼬리정맥으로 20분간 점적 투여하고(실험군) 나머지 10마리의 C57BL/6 마우스에게는 PBS만을 동일한 방법으로 투여하였다(대조군). 음성 대조군으로써 복부 피부와 복막만 인위적으로 절개한후 CLP 조치 없이 다시 수술로 복부 피부와 복막을 봉합하여 패혈증을 유도하지 않은 마우스를 샴(sham)수술군으로 사용하였다. 시간이 경과함에 따른 실험군 및 대조군의 C57BL/6 마우스의 생존율을 조사하였다. 그 결과는 도 1B와 같으며, HY2191을 CLP 유도 패혈증 마우스에 2시간 후 주입 시 대조군에 비해 생존율이 7배 증가하는 치료 효과를 보여주었다.
실시예
3.
LPS
로 유도한 패혈증 모델에서 B세포 및 T 세포의 중요성 분석
실시예 1에서와 동일한 LPS를 사용하여 패혈증을 유발하였으며, B세포 및 T 세포가 결핍된 마우스(Rag2 KO)를 이용하여 소듐 타우로데옥시콜레이트[HY2191, sodium taurodeoxycholate; HY2191(New Zealand Pharmaceuticals Ltd, 뉴질랜드)]의 효과를 실시예 1과 동일한 방법으로 시험하였다. 도 1C에서 보이는 바와 같이, 48시간 이내에 모든 개체가 폐사하여 실험군과 대조군에서 생존율의 변화가 없음을 확인하였다. 이는 HY2191가 패혈증 치료효과를 보이기 위하여 T 세포 또는 B세포를 필요로 함을 시사하는 소견이다.
실시예
4.
LPS
로 패혈증을 유도한 마우스 모델에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate;
HY2191
)의 염증유발 사이토카인 생성억제 효과
실시예 1에서와 같이 C57BL/6 마우스에 LPS 20 mg/kg를 복강내 주사한 지 30분 후에 꼬리정맥으로 대조 물질(PBS, WelGENE, 한국) 또는 소듐 타우로데옥시콜레이트[HY2191, sodium taurodeoxycholate; HY2191(New Zealand Pharmaceuticals Ltd, 뉴질랜드)]를 점적 투여하였다. LPS 투여 후 6시간에 마우스 꼬리에서 채혈한 다음, 원심분리(2000× g, 20분)하여 혈청만 얻어 CBA(cytometric bead array) kit (BD, 미국)를 사용하여 사이토카인 발현의 변화를 확인하였다.
TNF-a 및 IFN-g, MCP-1, IL-6 는 LPS 유발 6시간 경과 후 HY2191 투여에 의한 의미 있는 감소를 보였다 (도 2A).
실시예
5.
CLP
패혈증 모델에서 염증유발 사이토카인 변화에서의 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate
;
HY2191
)의 효과
실시예 2에서와 같이 CLP 유도 시 나타나는 염증 사이토카인의 변화를 실시예 4의 방법과 동일한 방법으로 확인하였다. CLP 후 4, 24 및 48시간에 혈액을 채취하여 혈청을 분리한 다음 CBA(cytometric bead array) kit를 사용하여 사이토카인 발현의 변화를 확인하였다.
TNF-a 및 IL-1b, MCP-1는 CLP 유도 후 24h에서 HY2191 투여에 의한 현저한 감소를 보였다 (도 2B).
실시예
6. 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate
;
HY2191
)를 사용한 패혈증
치료후
혈압 저하 정상화 효과
실시예 1과 동일한 방법으로 처치한 C57BL/6 마우스들의 꼬리에서 LPS 유도 후 1, 2, 4 및 6시간에 비침습적 혈압측정기(non-invasive blood pressure, NIBP, CODA, 미국)를 사용하여 혈압을 측정하였다. LPS 투여 1시간 후부터 평균 혈압이 두 군 모두에서 감소하기 시작하였으며, HY2191을 처리한 군의 평균 혈압이 LPS 유도 후 4시간부터 PBS를 처리한 대조군의 혈압과 비교하여 유의하게 상승하였다 (도 3A).
실시예
7. 패혈증 모델에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate;
HY2191
)에 의한 신장 및 간기능 보호 효과
LPS로 패혈증 유도 시 나타나는 신장 및 간 기능 손상을 관찰하고 HY2191 투여에 따른 장기 손상 정도 변화를 혈액 내 요소 질소(blood urea nitrogen, BUN) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼레이즈(aspartate aminotransferase, AST) 농도를 측정하여 확인하였다 (도 3B). LPS 유발 30분 후 HY2191 또는 PBS를 꼬리에 점적 투여하고 24시간 및 48시간에 혈액을 채취하여 혈청을 분리하였다. 분리한 혈청에서 BUN을 측정하여 신기능의 손상 정도를 관찰하였고 AST를 측정하여 간기능의 손상 정도를 관찰하였다. HY2191은 LPS 유도 48시간에 신장의 손상을 나타내는 BUN의 상승을 현저히 감소시킴을 확인하였다 (도 3B 왼쪽). 또한 HY2191은 24시간, 48시간 동안 관찰한 모두에서 패혈증으로 인한 AST 농도의 상승을 현저히 억제하였다. 이는 HY2191이 패혈증에 의한 간 손상을 치료하는 효과가 있슴을 나타내는 소견이다. (도 3B 오른쪽).
실시예
8.
LPS
로 유도한 패혈증 모델에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate
; HY2191)에 의해
증가되는
비장세포
확인
실시예 1과 같이, LPS로 패혈증을 유도한 마우스 모델에서 HY2191 및 PBS 대조군을 처치한 후 6시간, 24시간 및 48시간에 비장세포의 변화를 확인하였다. 전체 비장세포의 수는 LPS 유도 48시간 후에 PBS 대조군에서 감소를 보이는 것과 달리 HY2191 투여 군에서 의미 있게 증가함을 보였다. 유세포 분석기를 이용하여, CD11b+ 세포와 B220+ 세포의 절대수가 전체 비장세포 중에서 현저히 증가한 것임을 확인하였다 (도 4).
실시예
9.
LPS
로 유도한 패혈증 모델에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate
; HY2191)에 의해
증가되는
T 조절세포 확인
실시예 8과 동일한 방법으로 실험하여, 비장세포 중에서 T 조절세포인 CD4+Foxp3+ T 세포의 절대수가 HY2191에 의해 LPS 유도 48시간 후에 유의하게 증가함을 확인하였다 (도 5).
실시예
10.
LPS
로 유도한 패혈증 모델에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate
; HY2191)에 의한
수지상세포
활성화 억제 효과
실시예 8과 동일한 방법으로 실험하여, LPS 유도 후 비장세포 중에서도 CD11c+ 수지상세포의 활성도 (CD86 발현)를 확인하였다. 도 6A에 나타난 바와 같이, 살아있는 수지상세포만을 분석하기 위해 CD11c(+)/7AAD(-) 세포만을 선별한 후, 수지상세포 공자극분자 중에서 CD86 발현능을 분석하였다. 평균 형광강도 (Mean fluoresence intensity, MFI)로 CD86 발현능을 표시하였으며 LPS 유도 후 24시간이후 부터 HY2191에 의해 유의하게 발현이 억제됨을 확인하였다.
실시예
11.
LPS
로 패혈증을 유도한 마우스 모델에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate;
HY2191
)에 의한 B 세포 활성화 억제 효과
실시예 8과 동일한 방법으로 실험하여, LPS 유도 후 비장세포 중에서 B220+인 B 세포의 활성도 (CD86 발현)를 확인하였다. 살아있는 B 세포만을 분석하기 위해 B220(+)/7AAD(-) 세포만을 선별한 후, B 세포 공자극분자 중에서 CD86 발현을 분석하였다. 평균 형광강도 (Mean fluoresence intensity, MFI)로 CD86 발현을 표시하였으며 LPS 유도 후 6시간과 24시간에 HY2191에 의해 유의하게 억제됨을 확인하였다 (도 6B, 도 6C).
실시예
12.
LPS
로 유도한 패혈증 모델에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate
; HY2191)에 의하여
증가되는
H-
MDSC
의 패혈증 치료 효과
실시예 1과 같이 LPS로 패혈증을 유도한 마우스에 소듐 타우로데옥시콜레이트를 투여한 지 24시간이 지난 뒤 각각의 마우스들을 희생시켜 비장을 적출하여 비장세포에서 CD11b가 발현되면서 동시에 Gr-1이 높게 발현되는 세포들(골수유래억제세포, MDSC)을 분석하였다(도 7A, 도7B). 소듐 타우로데옥시콜레이트를 투여하지 않고 LPS만을 투여한 마우스들을 희생시켜 비장을 적출하여 비장세포에서 CD11b가 발현되면서 동시에 Gr-1이 높게 발현되는 세포들 (이하 L-MDSC)에 비하여 패혈증 마우스에 소듐 타우로데옥시콜레이트를 투여한 지 24시간이 지난 뒤에 각각의 마우스들을 희생시켜 확보한 비장세포에서 CD11b가 발현되면서 동시에 Gr-1이 높게 발현되는 세포들 (이하 H-MDSC)의 수가 의미 있게 증가하였다 (도7A, 도 7B). L-MDSC 및 H-MDSC 세포들의 미성숙도를 골수양세포 미성숙 마커인 CD31을 이용하여 확인하였다(도 7C 위). 두 가지 세포에서의 CD31+ 발현 세포의 비율은 의미있는 차이를 관찰할 수 없었다. L-MDSC 및 H-MDSC는 F4/80loGr-1+ 이면서 Ly6g+ Ly6c+ 표현형을 나타내었다 (도 7C 아래). 이러한 표현형을 가지는 MDSC는 소듐 타우로데옥시콜레이트를 투여한 패혈증 마우스에서 의미 있는 증가를 보였다.
QIAGEN RNeasy Mini KIT(Qiagen, 미국)를 이용해 MDSC 에서 total RNA를 추출하였다. 패혈증을 유도한 마우스에 HY2191을 처리하지 않고 분리선별한 Gr1+CD11b+ MDSC (L-MDSC)와 비교하여 패혈증을 유도한 마우스에 HY2191을 처리하고 분리선별한 Gr1+CD11b+ MDSC (H-MDSC)에서 특이적으로 발현이 증가되는 유전자들과 발현이 감소되는 유전자를 관찰하였다(도 8B, 표1, 표2). 유전자들의 발현 차이를 Illumina Sentrix MouseRef-8(v1.1) BeadChip arrays(Illumina, 미국)로 비교하였고, p-value가 0.05 미만이며 fold change가 2 이상 또는 -2 이하인 유전자를 선별하였고, 목록은 다음 표 1 내지 표 2와 같다:
| 참조 서열 ID | 기호 | H-MDSC/ L-MDSC 비율 |
| NM_015768.1 | Prok2 | 3.74 |
| NM_001013365.1 | Osm | 3.33 |
| NM_015768.1 | Prok2 | 3.15 |
| NM_008522.3 | Ltf | 3.02 |
| NM_133203.1 | Klra17 | 3.01 |
| NM_016917.2 | Slc40a1 | 2.96 |
| NM_008522.2 | Ltf | 2.91 |
| NM_013517.1 | Fcer2a | 2.83 |
| NM_010479.2 | Hspa1a | 2.81 |
| NM_009909.3 | Il8rb | 2.63 |
| NM_017372.3 | Lyz2 | 2.60 |
| NM_023734.3 | Pi16 | 2.41 |
| NM_018769.3 | Dfna5h | 2.39 |
| NM_001005864.2 | Mtus1 | 2.38 |
| NM_145437.2 | 4732429D16Rik | 2.29 |
| NM_016969.1 | Myadm | 2.29 |
| NM_183168.1 | P2ry6 | 2.24 |
| Osm | 2.22 | |
| NM_001005865.2 | Mtus1 | 2.21 |
| NM_008036.2 | Fosb | 2.17 |
| NM_026862.3 | Cd177 | 2.16 |
| NM_019972.2 | Sort1 | 2.12 |
| NM_133219.1 | Gcnt2 | 2.12 |
| NM_026929.3 | Chac1 | 2.12 |
| NM_016678.1 | Reck | 2.11 |
| NM_019972.2 | Sort1 | 2.11 |
| NM_026862.3 | Cd177 | 2.11 |
| NM_017372.2 | Lyzs | 2.10 |
| NM_153804.3 | Plekhg3 | 2.06 |
| NM_007782.1 | Csf3r | 2.05 |
| NM_007377.3 | Aatk | 2.05 |
| NM_138650.1 | Dgkg | 2.03 |
| NM_020047.3 | Tacstd2 | 2.03 |
| NM_008510.1 | Xcl1 | 2.02 |
| NM_007782.1 | Csf3r | 2.02 |
| 참조 서열 ID | 기호 | H-MDSC/ L-MDSC 비율 |
| Il1a | -3.05 | |
| NM_010104.2 | Edn1 | -2.86 |
| NM_021274.1 | Cxcl10 | -2.56 |
| NM_007413.4 | Adora2b | -2.35 |
| NM_008599.3 | Cxcl9 | -2.23 |
| NM_001033335.2 | Serpina3f | -2.21 |
| NM_008176.1 | Cxcl1 | -2.19 |
| NM_008987.2 | Ptx3 | -2.03 |
| NM_008337.3 | Ifng | -2.00 |
| NM_011990.2 | Slc7a11 | -2.00 |
| NM_028967.1 | Batf2 | -1.89 |
| NM_153564.2 | Gbp5 | -1.88 |
| NM_007687.2 | Cfl1 | -1.86 |
| NM_008337.1 | Ifng | -1.83 |
| NM_019453.1 | Mefv | -1.77 |
| NM_207680.2 | Bcl2l11 | -1.76 |
| NM_010260.1 | Gbp2 | -1.74 |
| NM_011451.2 | Sphk1 | -1.71 |
| NM_021893.2 | Cd274 | -1.71 |
| NM_010493.2 | Icam1 | -1.71 |
| NM_010548.1 | Il10 | -1.71 |
| NM_001039959.1 | Ahnak | -1.70 |
| NM_018734.2 | Gbp3 | -1.69 |
| NM_007705.2 | Cirbp | -1.67 |
| NM_030720.1 | Gpr84 | -1.67 |
| NM_007535.2 | Bcl2a1c | -1.67 |
| NM_011579.2 | Tgtp | -1.66 |
| NM_019388.2 | Cd86 | -1.65 |
| NM_010431.1 | Hif1a | -1.65 |
| NM_133888.2 | Smpdl3b | -1.65 |
| NM_030720.1 | Gpr84 | -1.65 |
| NM_178699.3 | B930041F14Rik | -1.64 |
| NM_177617.2 | D330014H01Rik | -1.63 |
| NM_018734.3 | Gbp3 | -1.63 |
| NM_019388.2 | Cd86 | -1.63 |
| NM_009396.1 | Tnfaip2 | -1.63 |
| NM_011068.1 | Pex11a | -1.62 |
| NM_001042592.2 | Arrdc4 | -1.62 |
| NM_011373.2 | St6galnac4 | -1.62 |
| NM_008326.1 | Irgm1 | -1.62 |
| NM_011056.2 | Pde4d | -1.61 |
| NM_010807.3 | Marcksl1 | -1.61 |
| NM_009373.3 | Tgm2 | -1.60 |
| NM_011337.2 | Ccl3 | -1.60 |
| NM_008351.1 | Il12a | -1.58 |
| NM_013683.1 | Tap1 | -1.58 |
| NM_013602.2 | Mt1 | -1.58 |
| NM_021326.2 | Rbak | -1.58 |
| NM_198620.1 | Rundc3b | -1.58 |
| NM_011521.2 | Sdc4 | -1.58 |
| NM_011068.1 | Pex11a | -1.57 |
| NM_019948.2 | Clec4e | -1.57 |
| NM_153165.2 | Klhl15 | -1.57 |
| NM_007870.2 | Dnase1l3 | -1.56 |
| NM_010846.1 | Mx1 | -1.55 |
| NM_146004.1 | BC024997 | -1.55 |
| NM_016674.2 | Cldn1 | -1.55 |
| NM_008330.1 | Ifi47 | -1.54 |
| NM_145209.3 | Oasl1 | -1.54 |
| NM_019948.1 | Clecsf9 | -1.53 |
| NM_001013370.1 | Sesn1 | -1.53 |
| NM_008793.1 | Pcsk4 | -1.53 |
| NM_013928.2 | Schip1 | -1.53 |
| NM_008332.2 | Ifit2 | -1.52 |
| NM_010501.2 | Ifit3 | -1.52 |
| NM_009396.1 | Tnfaip2 | -1.52 |
| NM_130447.2 | Dusp16 | -1.52 |
| NM_027261.1 | Josd3 | -1.52 |
| NM_009251.1 | Serpina3g | -1.52 |
| NM_009754.2 | Bcl2l11 | -1.51 |
| NM_025745.2 | 4933407N01Rik | -1.51 |
| NM_007707.2 | Socs3 | -1.51 |
| NM_010474.1 | Hs3st1 | -1.51 |
| NM_009895.3 | Cish | -1.51 |
| NM_019758.2 | Mtch2 | -1.50 |
| NM_175352.4 | Unc119b | -1.50 |
| NM_008607.1 | Mmp13 | -1.50 |
| NM_018738.3 | Igtp | -1.50 |
| NM_010260.1 | Gbp2 | -1.50 |
| NM_175687.1 | A230050P20Rik | -1.50 |
CD11b 및 Gr-1의 발현 정도에 따라 세포를 크게 세군으로 나누고 이를 FACS sorter로 분리 선별하였다 (도 8). 분리한 세포들의 세포 수를 헤모사이토미터로 측정하여 살아있는 세포수가 1 × 105 이 되게 PBS에 동량으로 섞어 패혈증이 유도된 마우스에 꼬리정맥으로 주입하였다 (도8 위). 이 때 세포를 주사하기 24시간 전에 마우스들은 LPS를 치사량(20mg/kg, 12,000 EU/g)으로 복강 내 투여하였다. PBS 그룹 및 L-MDSC, H-MDSC 그룹에서 각각 마우스를 5마리씩 사용하였으며, Gr-1int 세포를 주사한 군에서는 3마리, Gr-1-세포를 주사한 군에서는 4마리를 사용하였다. H-MDSC를 투여한 마우스들에서 L-MDSC(40% 생존) 및 다른 표면 표현형의 세포들에 비해 현저히 증가된 생존율(80% 생존)을 보였다. H-MDSC에 의한 치료효과의 작용기전을 확인하기 위하여 세포가 주사된 마우스의 비장 세포 변화를 관찰 하였다 (도 9). LPS 투여한 지 24시간이 지난 마우스에 H-MDSC 및 L-MDSC를 양자 이입하였다. 세포 양자 이입후 24시간이 지난 마우스의 비장세포를 수확하였다. 도 9A (위: 대표적 FACS 플롯, 아래: 반복실험 그래프)와 같이 H-MDSC를 양자 이입한 경우에 B220+ 세포가 유의하게 증가함을 확인하였다. 또한, 도 9B (위: 대표적 FACS 플롯, 아래: 반복실험 그래프)에서 보여주는 바와같이 H-MDSC를 양자이입한 경우에 L-MDSC에서 보다 골수 및 비장에서 CD11b+Gr-1+세포가 증가함을 확인하였다. 그러나 도 9C 및 9D에서 확인할 수 있듯이, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포 및 CD11c+ DC 수의 변화는 없었다.
실시예
13.
LPS
로 유도된 패혈증 모델에서 소듐
타우로데옥시콜레이트에
의하여
증가되는
48h
B
H
세포의 패혈증 치료 효과
실시예 1과 동일한 C57BL/6 마우스를 사용하였다. PBS 그룹, 정상 마우스 B 세포 투여군, 48h BL 세포 투여군, 24h BH 세포 투여군, 48h BH 세포 투여군 및 BHM 세포 투여군에서 각각 5마리씩 사용하였다. BHM 세포를 확보하기 위하여 LPS와 소듐 타우로데옥시콜레이트를 투여한 지 24시간이 지난 뒤에 마우스를 희생시켜 비장을 적출하였으며, 이 비장세포에서 CD11b와 Gr-1 분자를 높게 발현하는 MDSC 들을 FACS sorter로 분리 선별하였다(도 10 위 왼쪽). 살아있는 (7AAD-) CD11b+ Gr-1+ 세포 1 × 105 개를 PBS에 부유하여 24시간 전에 패혈증이 유도된 B6마우스에 꼬리정맥으로 주사하였다. 이 마우스로부터 BHM 세포를 확보하기 위하여 CD11b+ Gr-1+ 세포를 투여하고 나서 24시간이 지난 뒤에 마우스를 희생시켜 비장을 적출하였으며, 이 비장세포에서 B220분자를 높게 발현하는 B 세포들을 FACS sorter로 분리 선별하였다(BHM 세포, 도 10 위 왼쪽). 24h 또는 48h BH 세포를 확보하기 위하여 LPS와 소듐 타우로데옥시콜레이트를 투여한 지 24 시간 또는 48시간이 지난 뒤에 마우스를 희생시켜 비장을 적출하였으며, 이 비장세포에서 B220분자를 높게 발현하는 B 세포들을 FACS sorter로 분리 선별하였다(24h BH 세포 또는 48h BH 세포, 도 10 위 가운데). 48h BL 세포를 확보하기 위하여 LPS를 투여한 지 48시간이 지난 뒤에 마우스를 희생시켜 비장을 적출하였으며, 이 비장세포에서 B220분자를 높게 발현하는 B 세포들을 FACS sorter로 분리 선별하였다(48h BL 세포, 도 10 위 오른쪽). 살아있는 (7AAD-) 세포 1 × 106 개를 PBS에 부유하여 패혈증이 유도된 B6마우스의 꼬리정맥에 이 세포들을 주사하였다. 이 때 세포를 양자 입양 받은 마우스들은 B 세포를 주사하기 24시간 전에 LPS(20mg/kg, 12,000 EU/g)를 복강 내 투여하여 패혈증을 유도하였다. 정상 마우스의 B 세포를 주사한 군(0% 생존) 및 24h BH 세포 주사군 (20% 생존), 48h BL 세포 (40% 생존)에 비해 48h BH 세포를 투여한 마우스들에서 현저히 증가된 생존율(80% 생존)을 보였다. BHM 세포를 투여한 마우스들에서 가장 좋은 생존율(100% 생존)을 보였다.
실시예
14.
LPS
로 유도된 패혈증 모델에서 소듐
타우로데옥시콜레이트에
의하여
증가되는
48h
B
H
세포 및 H-MDSC의 중요성 확인
실시예 12와 13에서 처럼, C57BL/6 마우스에서 만들어진 H-MDSC와 BHM 세포를 B 세포와 T 세포가 없는 Rag2KO 마우스에 LPS 유도 24시간 후에 양자이입하여 패혈증 모델에서의 효과를 확인하였다. PBS군, BHM 세포 (1 × 106, 5 × 106)개 및 BHM 세포 (1 × 106, 5 × 106)와 48h H-MDSC (1 × 105)군에서 2마리씩 사용하였다. 실시예 3에서처럼 Rag2KO 마우스에 LPS(20mg/kg, 12,000 EU/g)를 복강 내 투여하였을 시 24시간 후에 PBS 또는 BHM 세포 1 × 106 개를 꼬리 정맥으로 양자 이입한 경우에 48시간 이내에 모든 개체가 폐사하여 실험군과 대조군에서 생존율의 변화가 없음을 확인하였다. BHM 세포 1 × 106 개와 48h H-MDSC를 양자이입한 경우에 72시간 이내에 모든 개체가 폐사하였고, BHM 세포 5 × 106 개를 양자이입한 경우에 96시간 이내에 모든 개체가 폐사하였다. 다른 군들과는 달리 BHM 세포 5 × 106 개와 48h H-MDSC 1 × 105 개를 함께 양자이입한 군에서만 120시간이상 지속적으로 생존함을 확인하였다. BHM 세포를 양자이입한 경우에는 세포 수에 관계없이 PBS군에 비해서 생존기간이 연장됨을 확인할 수 있어 효과를 보였다.
실시예
15.
LPS
로 유도한 패혈증 모델에서 소듐 타우로데옥시콜레이트(
HY2191
,
sodium
taurodeoxycholate
; HY2191)에 의하여
증가되는
B
H
세포 양자 이입 후
비장세포에서의
변화 확인
실시예 13과 동일한 방법으로 48h BH 세포를 제조하여, LPS 유도 후 24시간 째 48h BH 세포 1 × 106개를 양자이입한 후 24시간 지난 마우스를 희생시켜 비장세포 중에서 B220+인 B 세포의 활성도 (CD86 발현)를 확인하였다. 살아있는 B 세포만을 분석하기 위해 B220(+)/7AAD(-) 세포만을 선별한 후, B 세포 공자극분자 중에서 CD86 발현을 분석하였다. 24시간째 대조물질인 PBS만 투여한 군과 비교 시 BH 세포를 양자이입한 경우에 CD86 발현이 감소됨을 보였다(도 12A). 도 12B에서는 비장세포 중에서도 CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포에서 LPS 투여시의 CD69hiCD62Llo T 세포의가 감소됨을 확인하였다. 도 12C는 48h BH 세포를 양자 이입 24시간 후에 비장에서 증가된 CD11b+ Ly6G+ Ly6C inter세포의 상대적 비율 (%)을 도시화한 FACS 플롯 이미지로 CD11b+ 세포만을 gating한 후 분석하였다. PBS군과 비교시 48h BH 세포를 양자 이입한 경우에 CD11b+ Ly6G+ Ly6C inter세포의 상대적 비율이 58%에서 82%로 증가함을 확인하였다.
실시예
16.
B
HM
세포,
B
L
및
B
H
세포 표현형 분석
BHM 세포와 유사한 특징을 가지며, BHM 세포의 제조 방법보다 수월하고 효율적으로 제조할 수 있는 48h BH 세포를 제조하여 두 세포를 비교 분석하였다. 8주에서 12주 사이의 정상 C57BL/6 마우스 비장을 2장의 프로스티드 슬라이드(frosted slide)로 갈아서 단일 세포 부양액으로 만든 후 염색여백부위 차단용 완충액[blocking buffer, purified 2.4 G2(rat IgG2b against FcγRII, eBioscience, 미국)]과 불활성화시킨 10%의 마우스, 랫트 및 염소 혈청을 함유한 인산완충용액(PBS)을 혼합하여 4℃에서 30분간 배양하였다. 비장 세포들은 항-마우스 CD11b(M1/70), 항-마우스 B220(RA3-6B2), 항-마우스 Gr-1(RB6-8C5), 항-마우스 F4/80(CI:A3-1), 항-마우스 CD23(B3B4), 항-마우스 CD21(7G6) 및 항-마우스 CD93(AA4.1), 기타 모든 항체를 이용하여 15분간 염색하였다. 세척 조건 염색을 마친 세포들은 살아있는 세포만을 확인할 수 있게 7-아미노 액티노마이신 D(7AAD, 7-amino actinomycin D)를 10분간 염색한 다음, FACS Canto II(BD, 미국)를 이용하여 측정하였다. 자료들은 Flowjo software(Tree Star, Inc., 미국)를 이용하여 분석하였다. BHM 세포와 48h BH 세포는 기존의 T2-MZP 조절 B 세포와 유사하게 CD21, CD23 은 높게 발현 하지만(도 14, 도 15A), CD5, CD1d 및 AA4(CD93)는 발현하지 않았다 (도 13A-B). IgM의 발현이 48h BL 세포에 비하여 48h BH 세포가 고르게 높았으며 이는 성숙 B 세포의 특징을 지니고 있음을 보여주었다(도13C).
실시예
17.
LPS
로 유도된 패혈증 모델에서 소듐
타우로데옥시콜레이트
처치후
증가되는
CD23
hi
B
H
세포의 패혈증 치료 효과
LPS와 소듐 타우로데옥시콜레이트를 투여한 지 48시간이 지난 뒤에 마우스를 희생시켜 비장을 적출하였다. 비장세포에서 B220+CD23hiCD21hi Gr-1-CD11b-의 표현형을 나타내는 CD23hi BH 세포들을 FACS sorter로 분리 선별하였다. 동시에 B220+CD23loCD21hiGr-1-CD11b- 표현형을 나타내는 CD23lo BH 세포들도 같은 방법으로 선별하여 대조군으로 사용하였다. 살아있는 (7AAD-) 세포 1 × 105 및 0.5 × 105 개를 PBS에 부유한 후 마우스의 꼬리정맥으로 주입하였다. 이 때 마우스들은 세포를 주사하기 24시간 전에 LPS를 치사량 (20mg/kg, 12,000 EU/g)으로 복강 내 투여하였다. 1 × 105 및 0.5 × 105 의 CD23hi BH 세포를 투여한 패혈증 마우스들(100% 및 75% 생존)에서 CD23lo BH 세포를 투여한 패혈증 마우스 (각각 75% 및 25% 생존)에 비해 현저히 증가된 생존율을 보였다. PBS만 주입한 마우스는 0%의 생존율을 보였다. (도 15B). PBS 투여군 3마리, CD23lo BH 세포 투여군 및 CD23hi BH 세포 투여군에서 두 가지 용량 군 별로 (1 × 105 및 0.5 × 105) 각각 4마리씩 사용하였다. QIAGEN RNeasy Mini KIT(Qiagen, 미국)를 이용해 B 세포에서 total RNA를 추출하였다. 패혈증을 유도한 마우스에 HY2191을 처리하지 않고 48시간 후에 분리선별한 B220+ B 세포 (48h BL cell) 또는 패혈증 마우스에서 HY2191 처리 48시간 후에 분리선별한CD23loCD21+B220+ B세포 (CD23lo BH cell)와 비교하여 패혈증 마우스에서 HY2191 처리 48시간 후 분리선별한 B220+ B 세포 (48h BH cell) 또는 CD23hiCD21+B220+ B세포 (CD23hi BH cell)에서 특이적으로 발현이 증가 또는 감소되는 유전자들의 발현 차이를 Illumina Sentrix MouseRef-8(v1.1) BeadChip arrays(Illumina, 미국)로 비교하였고, p-value가 0.05 미만이며 fold change가 2 이상 또는 -2 이하인 유전자를 선별하였고, 목록은 다음 표 3 내지 표 8과 같다.
| 참조 서열 ID | 기호 | 48h BH/ 24h BH비율 |
| NM_001082545.1 | Stfa2 | 34.73 |
| NM_013650.2 | S100a8 | 26.68 |
| NM_181596.3 | Retnlg | 21.78 |
| NM_009114.1 | S100a9 | 21.15 |
| NM_008491.1 | Lcn2 | 17.54 |
| NM_001082547.1 | EG433016 | 15.16 |
| Il1b | 11.76 | |
| NM_029796.2 | Lrg1 | 10.60 |
| NM_017370.1 | Hp | 9.96 |
| NM_008039.2 | Fpr2 | 8.65 |
| NM_007695.2 | Chi3l1 | 8.18 |
| NM_013590.2 | Lyz | 8.16 |
| NM_008522.3 | Ltf | 7.98 |
| NM_007585.3 | Anxa2 | 7.54 |
| NM_008230.4 | Hdc | 7.15 |
| NM_010185.2 | Fcer1g | 7.12 |
| NM_001082543.1 | Stfa1 | 6.06 |
| NM_133198.1 | Pygl | 5.91 |
| NM_011313.2 | S100a6 | 5.70 |
| NM_009369.1 | Tgfbi | 5.63 |
| Chi3l3 | 5.30 | |
| NM_011315.3 | Saa3 | 5.10 |
| NM_026862.3 | Cd177 | 5.00 |
| NM_009663.1 | Alox5ap | 4.84 |
| NM_009841.3 | Cd14 | 4.83 |
| NM_009477.1 | Upp1 | 4.77 |
| NM_013517.1 | Fcer2a | 4.65 |
| NM_026414.2 | Asprv1 | 4.64 |
| NM_010058.1 | Dmwd | 4.61 |
| NM_016917.2 | Slc40a1 | 4.56 |
| NM_133219.1 | Gcnt2 | 4.51 |
| NM_015768.1 | Prok2 | 4.34 |
| NM_021609.3 | Ccbp2 | 4.17 |
| NM_030694.1 | Ifitm2 | 4.14 |
| NM_009402.1 | Pglyrp1 | 4.02 |
| NM_011414.2 | Slpi | 4.00 |
| NM_172453.1 | Pif1 | 3.88 |
| NM_008694.1 | Ngp | 3.86 |
| NM_145158.2 | Emilin2 | 3.75 |
| NM_007515.2 | Slc7a3 | 3.73 |
| NM_017372.3 | Lyz2 | 3.64 |
| NM_010705.2 | Lgals3 | 3.51 |
| NM_013612.1 | Slc11a1 | 3.45 |
| NM_173372.1 | Grm6 | 3.39 |
| NM_009645.2 | Aicda | 3.35 |
| NM_010176.2 | Fah | 3.29 |
| NM_013599.2 | Mmp9 | 3.28 |
| NM_017370.1 | Hp | 3.18 |
| NM_024253.4 | Nkg7 | 3.10 |
| NM_007547.2 | Sirpa | 3.10 |
| NM_144559.1 | Fcgr4 | 3.10 |
| NM_021273.3 | Ckb | 2.98 |
| NM_172449.1 | Bzrap1 | 2.89 |
| NM_009689.2 | Birc5 | 2.85 |
| NM_172723.4 | Adap1 | 2.84 |
| NM_011121.3 | Plk1 | 2.83 |
| NM_009778.1 | C3 | 2.83 |
| NM_014194.1 | Klra7 | 2.81 |
| NM_013652.2 | Ccl4 | 2.80 |
| XM_001475189.1 | LOC100040592 | 2.76 |
| NM_009910.2 | Cxcr3 | 2.75 |
| NM_017370.1 | Hp | 2.72 |
| NM_009645.1 | Aicda | 2.72 |
| NM_010615.1 | Kif11 | 2.72 |
| NM_009689.1 | Birc5 | 2.71 |
| NM_008823.3 | Cfp | 2.71 |
| NM_009689.2 | Birc5 | 2.70 |
| NM_023223.1 | Cdc20 | 2.70 |
| NM_023223.1 | Cdc20 | 2.70 |
| NM_008685.2 | Nfe2 | 2.69 |
| NM_013538.3 | Cdca3 | 2.67 |
| NM_024245.3 | Kif23 | 2.64 |
| NM_134469.3 | Fdps | 2.63 |
| NM_013538.4 | Cdca3 | 2.63 |
| NM_134471.3 | Kif2c | 2.62 |
| NM_007681.2 | Cenpa | 2.61 |
| NM_023716.2 | Tubb2b | 2.61 |
| NM_153101.1 | Mrgpra2 | 2.59 |
| NM_021386.3 | Cldn10 | 2.59 |
| NM_025831.3 | 1300014I06Rik | 2.57 |
| NM_009270.3 | Sqle | 2.57 |
| NM_012055.3 | Asns | 2.56 |
| NM_020010.2 | Cyp51 | 2.56 |
| NM_008446.1 | Kif4 | 2.53 |
| NM_145150.1 | Prc1 | 2.53 |
| NM_053214.1 | Myo1f | 2.50 |
| NM_025436.1 | Sc4mol | 2.50 |
| NM_010620.1 | Kif15 | 2.49 |
| NM_009382.3 | Thy1 | 2.48 |
| NM_172301.3 | Ccnb1 | 2.47 |
| NM_017407.1 | Spag5 | 2.46 |
| NM_010129.1 | Emp3 | 2.46 |
| NM_015768.1 | Prok2 | 2.46 |
| NM_021407.1 | Trem3 | 2.44 |
| NM_145588.1 | Kif22 | 2.44 |
| NM_175384.3 | Cdca2 | 2.43 |
| NM_197959.1 | 3000004C01Rik | 2.42 |
| NM_012055.1 | Asns | 2.40 |
| NM_028390.2 | Anln | 2.37 |
| NM_009140.2 | Cxcl2 | 2.37 |
| NM_139206.1 | Centd3 | 2.36 |
| NM_011701.3 | Vim | 2.36 |
| NM_023223.1 | Cdc20 | 2.33 |
| XM_001471776.1 | LOC100038894 | 2.33 |
| NM_178683.4 | Depdc1b | 2.32 |
| NM_011497.3 | Aurka | 2.32 |
| XM_359281.1 | Lst1 | 2.31 |
| NM_008519.1 | Ltb4r1 | 2.31 |
| NM_013517.3 | Fcer2a | 2.30 |
| XM_980391.1 | D230007K08Rik | 2.29 |
| NM_013658.2 | Sema4a | 2.28 |
| NM_023878.2 | Cldn10 | 2.28 |
| NM_008252.2 | Hmgb2 | 2.28 |
| NM_013612.1 | Slc11a1 | 2.27 |
| NM_007532.2 | Bcat1 | 2.27 |
| NM_021293.2 | Cd33 | 2.27 |
| NM_001033484.1 | Iqgap3 | 2.26 |
| NM_010555.4 | Il1r2 | 2.26 |
| NM_009270.3 | Sqle | 2.25 |
| NM_172659.2 | Slc2a6 | 2.23 |
| NM_009477.1 | Upp1 | 2.22 |
| NM_010436.2 | H2afx | 2.22 |
| NM_133662.2 | Ier3 | 2.21 |
| NM_007671.2 | Cdkn2c | 2.20 |
| NM_008247.2 | Ppap2a | 2.20 |
| NM_008505.3 | Lmo2 | 2.19 |
| NM_007471.1 | App | 2.19 |
| NM_011340.3 | Serpinf1 | 2.19 |
| NM_018767.2 | Cd160 | 2.19 |
| NM_009773.1 | Bub1b | 2.19 |
| NM_010858.4 | Myl4 | 2.18 |
| NM_197959.1 | 3000004C01Rik | 2.17 |
| NM_133198.1 | Pygl | 2.15 |
| NM_008446.1 | Kif4 | 2.15 |
| NM_013517.1 | Fcer2a | 2.15 |
| NM_009860.2 | Cdc25c | 2.15 |
| NM_009835.2 | Ccr6 | 2.14 |
| NM_021530.2 | Slc4a8 | 2.13 |
| NM_028232.1 | Sgol1 | 2.10 |
| NM_194069.1 | D12Ertd647e | 2.09 |
| NM_025654.2 | Rdm1 | 2.08 |
| NM_146171.1 | Ncapd2 | 2.08 |
| NM_008288.2 | Hsd11b1 | 2.08 |
| NM_016692.1 | Incenp | 2.08 |
| NM_144512.2 | Slc6a13 | 2.08 |
| NM_016745.2 | Atp2a3 | 2.08 |
| NM_178911.4 | Pld4 | 2.08 |
| NM_016662.4 | Mxd3 | 2.08 |
| NM_009174.3 | Siah2 | 2.07 |
| NM_025377.1 | 1110001A07Rik | 2.07 |
| NM_019972.2 | Sort1 | 2.06 |
| NM_011662.2 | Tyrobp | 2.06 |
| NM_008021.4 | Foxm1 | 2.05 |
| NM_026515.2 | 2810417H13Rik | 2.05 |
| NM_146094.1 | Fads1 | 2.05 |
| NM_194068.1 | D12Ertd647e | 2.04 |
| NM_010058.1 | Dmwd | 2.04 |
| NM_009477.1 | Upp1 | 2.04 |
| NM_009955.2 | Dpysl2 | 2.03 |
| NM_001042652.1 | Nusap1 | 2.03 |
| NM_013870.2 | Smtn | 2.02 |
| NM_009128.1 | Scd2 | 2.02 |
| NM_009860.1 | Cdc25c | 2.02 |
| NM_198411.2 | 2610204M08Rik | 2.01 |
| NM_001081403.1 | Klhl14 | 2.01 |
| NM_016745.2 | Atp2a3 | 2.00 |
| NM_011090.1 | Pira3 | 2.00 |
| NM_009985.3 | Ctsw | 2.00 |
| 참조 서열 ID | 기호 | 48h BH/ 24h BH비율 |
| NM_010501.1 | Ifit3 | -26.50 |
| NM_016850.2 | Irf7 | -13.14 |
| NM_021384.3 | Rsad2 | -9.76 |
| NM_008332.2 | Ifit2 | -8.45 |
| XM_001480051.1 | LOC100048346 | -7.46 |
| NM_011909.1 | Usp18 | -7.07 |
| NM_021274.1 | Cxcl10 | -6.74 |
| NM_011909.1 | Usp18 | -6.51 |
| NM_145227.1 | Oas2 | -5.75 |
| NM_020557.3 | Tyki | -5.15 |
| Mx2 | -5.12 | |
| NM_011854.1 | Oasl2 | -4.95 |
| NM_025378.2 | Ifitm3 | -4.60 |
| NM_001033335.2 | Serpina3f | -4.56 |
| NM_001039160.2 | Gvin1 | -4.24 |
| NM_010479.2 | Hspa1a | -4.09 |
| NM_011520.3 | Sdc3 | -4.00 |
| NM_011150.2 | Lgals3bp | -3.95 |
| NM_009696.2 | Apoe | -3.85 |
| NM_021430.2 | Rilpl1 | -3.82 |
| NM_018738.3 | Igtp | -3.82 |
| NM_010741.2 | Ly6c1 | -3.77 |
| NM_008332.2 | Ifit2 | -3.68 |
| NM_198034.2 | Sidt1 | -3.50 |
| NM_019440.2 | Iigp2 | -3.44 |
| NM_011854.2 | Oasl2 | -3.28 |
| NM_008733.3 | Nrap | -3.22 |
| NM_030150.2 | Dhx58 | -3.21 |
| NM_008326.1 | Irgm1 | -3.18 |
| NM_011407.1 | Slfn1 | -3.15 |
| NM_001024721.1 | BC094916 | -3.06 |
| NM_145226.2 | Oas3 | -3.04 |
| NM_145209.3 | Oasl1 | -3.02 |
| NM_146142.1 | Tdrd7 | -3.02 |
| XM_001471686.1 | LOC100038882 | -2.95 |
| NM_010846.1 | Mx1 | -2.89 |
| NM_198095.2 | Bst2 | -2.86 |
| NM_008330.1 | Ifi47 | -2.86 |
| NM_172275.1 | Trafd1 | -2.85 |
| NM_011852.2 | Oas1g | -2.85 |
| NM_199146.1 | AI451617 | -2.83 |
| NM_020583.4 | Isg20 | -2.80 |
| NM_145973.2 | Ell3 | -2.79 |
| NM_199015.1 | D14Ertd668e | -2.78 |
| NM_145209.3 | Oasl1 | -2.76 |
| NM_011163.3 | Eif2ak2 | -2.74 |
| NM_145209.2 | Oasl1 | -2.65 |
| NM_008372.3 | Il7r | -2.62 |
| NM_172603.1 | Phf11 | -2.57 |
| NM_172603.2 | Phf11 | -2.55 |
| NM_133362.2 | Erdr1 | -2.50 |
| NM_001039530.1 | Parp14 | -2.48 |
| XM_001479238.1 | LOC100047963 | -2.45 |
| NM_023386.3 | Rtp4 | -2.43 |
| NM_133200.3 | P2ry14 | -2.42 |
| NM_172275.1 | Trafd1 | -2.42 |
| NM_178283.3 | Asb13 | -2.42 |
| NM_027320.4 | Ifi35 | -2.42 |
| NM_011852.2 | Oas1g | -2.41 |
| NM_133211.3 | Tlr7 | -2.40 |
| NM_009099.2 | Trim30 | -2.39 |
| NM_011068.1 | Pex11a | -2.39 |
| NM_001033122.3 | Cd69 | -2.36 |
| NM_009911.2 | Cxcr4 | -2.36 |
| NM_021415.3 | Cacna1h | -2.34 |
| NM_026004.2 | Nt5c3 | -2.34 |
| NM_007829.3 | Daxx | -2.34 |
| NM_018851.2 | Samhd1 | -2.30 |
| NM_008326.1 | Irgm1 | -2.28 |
| NM_172275.1 | Trafd1 | -2.25 |
| NM_007707.2 | Socs3 | -2.23 |
| NM_010708.1 | Lgals9 | -2.19 |
| NM_007602.3 | Capn5 | -2.18 |
| NM_007870.2 | Dnase1l3 | -2.15 |
| NM_001038587.1 | Adar | -2.12 |
| Tor3a | -2.10 | |
| NM_174992.2 | BC004728 | -2.10 |
| NM_010362.2 | Gsto1 | -2.09 |
| NM_133200.3 | P2ry14 | -2.08 |
| NM_029803.1 | Ifi27 | -2.08 |
| NM_172608.1 | Tmem184b | -2.07 |
| NM_027919.3 | Tha1 | -2.03 |
| NM_029005.1 | Mlkl | -2.03 |
| NM_145391.1 | Tapbpl | -2.02 |
| NM_174992.3 | BC004728 | -2.01 |
| NM_019949.1 | Ube2l6 | -2.01 |
| 참조 서열 ID | 기호 | 48h BH/ 48h BL비율 |
| NM_021609.3 | Ccbp2 | 2.57 |
| NM_025436.1 | Sc4mol | 2.14 |
| NM_020010.2 | Cyp51 | 2.00 |
| NM_009270.3 | Sqle | 1.99 |
| XM_001475189.1 | LOC100040592 | 1.88 |
| NM_146184.4 | B3gnt8 | 1.85 |
| NM_025831.3 | 1300014I06Rik | 1.85 |
| NM_134469.3 | Fdps | 1.83 |
| NM_001038492.1 | Ctsa | 1.80 |
| NM_010058.1 | Dmwd | 1.80 |
| NM_146083.1 | Sfrs7 | 1.72 |
| NM_013517.1 | Fcer2a | 1.71 |
| NM_008219.3 | Hbb-bh1 | 1.71 |
| NM_010479.2 | Hspa1a | 1.70 |
| NM_019684.1 | Srpk3 | 1.69 |
| NM_008245.3 | Hhex | 1.68 |
| NM_153526.2 | Insig1 | 1.68 |
| NM_009824.1 | Cbfa2t3h | 1.67 |
| NM_027427.1 | Taf15 | 1.67 |
| NM_199080.2 | Ddx17 | 1.66 |
| NM_007725.2 | Cnn2 | 1.66 |
| NM_145125.2 | Brwd1 | 1.66 |
| NM_007758.2 | Cr2 | 1.66 |
| NM_138630.1 | Arhgap4 | 1.64 |
| NM_023716.2 | Tubb2b | 1.64 |
| NM_011090.1 | Pira3 | 1.63 |
| NM_013730.4 | Slamf1 | 1.63 |
| NM_010227.2 | Flna | 1.63 |
| NM_025876.2 | Cdk5rap1 | 1.63 |
| NM_198683.1 | Cugbp1 | 1.62 |
| NM_009270.3 | Sqle | 1.62 |
| NM_001039562.1 | Ankrd37 | 1.60 |
| NM_001039150.1 | Cd44 | 1.60 |
| NM_025305.1 | Mrps7 | 1.60 |
| NM_011161.4 | Mapk11 | 1.60 |
| NM_023258.3 | Pycard | 1.59 |
| NM_007598.2 | Cap1 | 1.59 |
| NM_010735.1 | Lta | 1.59 |
| NM_009032.2 | Rbm4 | 1.59 |
| NM_008533.2 | Cd180 | 1.59 |
| NM_008823.3 | Cfp | 1.59 |
| NM_007717.1 | Cmah | 1.58 |
| XM_001476916.1 | LOC100046855 | 1.58 |
| NM_011480.1 | Srebf1 | 1.57 |
| NM_007575.2 | Ciita | 1.57 |
| NM_198683.1 | Cugbp1 | 1.57 |
| NM_009109.2 | Ryr1 | 1.56 |
| NM_177733.2 | E2f2 | 1.56 |
| NM_022994.2 | Dap3 | 1.55 |
| Wdr9 | 1.55 | |
| NM_009835.3 | Ccr6 | 1.55 |
| NM_028281.1 | Pcbd2 | 1.55 |
| NM_010721.1 | Lmnb1 | 1.54 |
| NM_011091.1 | Pira4 | 1.54 |
| NM_144923.2 | Blvrb | 1.54 |
| NM_007393.1 | Actb | 1.54 |
| NM_183222.2 | Fcrl5 | 1.54 |
| NM_016745.2 | Atp2a3 | 1.53 |
| NM_010497.2 | Idh1 | 1.53 |
| NM_007573.2 | C1qbp | 1.53 |
| NM_011203.2 | Ptpn12 | 1.53 |
| NM_013710.3 | Fgd2 | 1.53 |
| NM_133774.4 | Stard4 | 1.53 |
| NM_153424.2 | Nphp4 | 1.52 |
| XM_131538.1 | Dhcr24 | 1.52 |
| NM_011701.3 | Vim | 1.52 |
| NM_001036740.2 | B3gnt8 | 1.52 |
| Abi3 | 1.52 | |
| NM_008235.2 | Hes1 | 1.51 |
| NM_009970.1 | Csf2ra | 1.51 |
| NM_145619.2 | Parp3 | 1.51 |
| NM_010193.3 | Fem1b | 1.51 |
| NM_199035.1 | Alg8 | 1.50 |
| NM_027959.3 | Pdia6 | 1.50 |
| NM_013538.3 | Cdca3 | 1.50 |
| NM_028817.2 | Acsl3 | 1.50 |
| NM_178781.2 | 9330186A19Rik | 1.50 |
| 참조 서열 ID | 기호 | 48h BH/ 48h BL비율 |
| NM_010501.1 | Ifit3 | -14.00 |
| NM_021384.3 | Rsad2 | -8.07 |
| NM_010501.2 | Ifit3 | -6.81 |
| XM_001480084.1 | LOC667370 | -6.79 |
| NM_016850.2 | Irf7 | -6.59 |
| NM_008332.2 | Ifit2 | -5.48 |
| NM_011407.1 | Slfn1 | -5.18 |
| NM_021274.1 | Cxcl10 | -5.17 |
| NM_008332.2 | Ifit2 | -5.03 |
| NM_009843.3 | Ctla4 | -4.42 |
| NM_015811.1 | Rgs1 | -4.22 |
| NM_011854.1 | Oasl2 | -4.20 |
| NM_008372.3 | Il7r | -4.13 |
| NM_011909.1 | Usp18 | -4.11 |
| NM_010846.1 | Mx1 | -4.00 |
| XM_001480051.1 | LOC100048346 | -3.99 |
| Mx2 | -3.82 | |
| NM_020557.3 | Tyki | -3.79 |
| NM_008218.2 | Hba-a1 | -3.27 |
| NM_011150.2 | Lgals3bp | -3.21 |
| NM_025378.2 | Ifitm3 | -3.15 |
| NM_011909.1 | Usp18 | -3.15 |
| NM_007687.2 | Cfl1 | -3.08 |
| NM_145227.1 | Oas2 | -3.03 |
| NM_001033335.2 | Serpina3f | -2.92 |
| NM_015811.1 | Rgs1 | -2.88 |
| NM_010330.3 | Emb | -2.88 |
| NM_133200.3 | P2ry14 | -2.85 |
| NM_007705.2 | Cirbp | -2.75 |
| NM_030150.2 | Dhx58 | -2.75 |
| NM_010185.2 | Fcer1g | -2.72 |
| NM_008337.1 | Ifng | -2.63 |
| XM_001471776.1 | LOC100038894 | -2.58 |
| NM_015811.1 | Rgs1 | -2.53 |
| NM_001004174.1 | AA467197 | -2.50 |
| NM_010649.2 | Klra4 | -2.49 |
| NM_001033468.1 | Gpr114 | -2.44 |
| NM_024253.4 | Nkg7 | -2.42 |
| NM_172275.1 | Trafd1 | -2.41 |
| NM_013487.1 | Cd3d | -2.39 |
| NM_018738.3 | Igtp | -2.35 |
| NM_021430.2 | Rilpl1 | -2.30 |
| NM_010654.2 | Klrd1 | -2.29 |
| NM_009696.2 | Apoe | -2.29 |
| NM_010169.3 | F2r | -2.28 |
| NM_010689.2 | Lat | -2.25 |
| NM_001025571.1 | Sh2d2a | -2.23 |
| NM_009852.3 | Cd6 | -2.19 |
| NM_009852.3 | Cd6 | -2.18 |
| NM_021301.1 | Slc15a2 | -2.18 |
| NM_010260.1 | Gbp2 | -2.17 |
| NM_145209.2 | Oasl1 | -2.15 |
| NM_012046.2 | Spo11 | -2.14 |
| NM_009858.2 | Cd8b1 | -2.14 |
| NM_007799.2 | Ctse | -2.13 |
| NM_010638.4 | Klf9 | -2.13 |
| NM_011068.1 | Pex11a | -2.12 |
| NM_145209.3 | Oasl1 | -2.09 |
| NM_199015.2 | D14Ertd668e | -2.09 |
| NM_029005.1 | Mlkl | -2.09 |
| NM_010583.2 | Itk | -2.09 |
| NM_011454.1 | Serpinb6b | -2.08 |
| NM_001033122.3 | Cd69 | -2.08 |
| NM_011815.1 | Fyb | -2.07 |
| NM_008326.1 | Irgm1 | -2.07 |
| NM_010071.2 | Dok2 | -2.06 |
| XM_001479238.1 | LOC100047963 | -2.06 |
| NM_019440.2 | Iigp2 | -2.05 |
| NM_133888.2 | Smpdl3b | -2.04 |
| NM_008365.1 | Il18r1 | -2.04 |
| NM_009985.3 | Ctsw | -2.03 |
| NM_001008548.2 | Pde2a | -2.03 |
| NM_007498.2 | Atf3 | -2.02 |
| NM_009382.3 | Thy1 | -2.01 |
| NM_178404.2 | Zc3h6 | -2.01 |
| NM_001039160.2 | Gvin1 | -2.01 |
| NM_178149.4 | Pik3ip1 | -2.01 |
| NM_177155.3 | Klri2 | -2.00 |
| 참조 서열 ID | 기호 | 48h CD23hi BH/ 48h CD23lo BH비율 |
| NM_013517.1 | Fcer2a | 4.99 |
| NM_013517.3 | Fcer2a | 3.43 |
| NM_013517.1 | Fcer2a | 2.76 |
| NM_173372.1 | Grm6 | 2.75 |
| NM_212449.1 | AU019823 | 2.34 |
| NM_010807.3 | Marcksl1 | 2.34 |
| NM_007535.2 | Bcl2a1c | 2.28 |
| NM_007536.2 | Bcl2a1d | 2.17 |
| NM_054070.1 | Afg3l1 | 2.09 |
| NM_009871.2 | Cdk5r1 | 2.01 |
| NM_170702.2 | Cd40 | 1.94 |
| NM_028244.1 | Rrp1b | 1.93 |
| NM_054070.2 | Afg3l1 | 1.91 |
| NM_013730.4 | Slamf1 | 1.86 |
| NM_028190.2 | Luc7l | 1.80 |
| NM_170702.2 | Cd40 | 1.74 |
| NM_033608.2 | Igsf9 | 1.73 |
| NM_001048207.1 | Gypc | 1.73 |
| NM_007573.2 | C1qbp | 1.72 |
| NM_008321.1 | Id3 | 1.72 |
| NM_010215.2 | Il4i1 | 1.71 |
| NM_010259.2 | Gbp1 | 1.69 |
| NM_009856.1 | Cd83 | 1.67 |
| NM_008652.2 | Mybl2 | 1.67 |
| NM_170702.2 | Cd40 | 1.65 |
| NM_134126.2 | Ift140 | 1.64 |
| NM_028965.3 | Snx11 | 1.58 |
| NM_009302.2 | Swap70 | 1.53 |
| 참조 서열 ID | 기호 | 48h CD23hi BH/ 48h CD23lo BH비율 |
| NM_025427.2 | 1190002H23Rik | -7.99 |
| NM_010800.3 | Bhlhb8 | -7.72 |
| NM_010800.2 | Mist1 | -7.60 |
| NM_024169.3 | Fkbp11 | -7.26 |
| NM_021415.3 | Cacna1h | -6.14 |
| NM_025290.3 | Rsph1 | -5.82 |
| NM_178446.2 | Rbm47 | -5.28 |
| NM_011414.2 | Slpi | -5.19 |
| NM_010800.3 | Bhlhb8 | -4.84 |
| NM_010741.2 | Ly6c1 | -4.81 |
| NM_015786.1 | Hist1h1c | -4.79 |
| NM_009375.2 | Tg | -4.74 |
| NM_014194.1 | Klra7 | -4.71 |
| NM_178661.2 | Creb3l2 | -4.64 |
| NM_008920.4 | Prg2 | -4.48 |
| NM_029720.1 | Creld2 | -4.33 |
| NM_024253.4 | Nkg7 | -4.21 |
| NM_007585.3 | Anxa2 | -4.07 |
| NM_029720.2 | Creld2 | -3.94 |
| NM_145367.3 | Txndc5 | -3.84 |
| NM_026432.2 | Tmem66 | -3.83 |
| NM_178114.3 | Amigo2 | -3.67 |
| NM_010649.2 | Klra4 | -3.65 |
| XM_001471776.1 | LOC100038894 | -3.61 |
| NM_027650.1 | Speer3 | -3.58 |
| NM_024440.2 | Derl3 | -3.46 |
| NM_028000.1 | Ppapdc1b | -3.43 |
| NM_021273.3 | Ckb | -3.42 |
| NM_009382.3 | Thy1 | -3.37 |
| NM_172574.1 | Pqlc3 | -3.33 |
| NM_010654.2 | Klrd1 | -3.28 |
| NM_013842.2 | Xbp1 | -3.24 |
| NM_153590.3 | Klre1 | -3.22 |
| NM_008495.1 | Lgals1 | -3.12 |
| NM_027222.2 | 2010001M09Rik | -3.11 |
| NM_009985.3 | Ctsw | -3.11 |
| NM_018767.2 | Cd160 | -3.05 |
| NM_013653.2 | Ccl5 | -2.98 |
| NM_001039089.1 | Sel1l | -2.86 |
| NM_176933.4 | Dusp4 | -2.85 |
| NM_007706.3 | Socs2 | -2.81 |
| NM_013652.2 | Ccl4 | -2.78 |
| NM_007657.2 | Cd9 | -2.71 |
| NM_001005846.2 | Mcoln2 | -2.64 |
| NM_021897.1 | Trp53inp1 | -2.54 |
| NM_025448.2 | Ssr2 | -2.53 |
| NM_011261.2 | Reln | -2.52 |
| NM_023716.2 | Tubb2b | -2.51 |
| NM_007431.1 | Akp2 | -2.48 |
| NM_010169.3 | F2r | -2.41 |
| NM_010376.3 | H13 | -2.41 |
| NM_009858.2 | Cd8b1 | -2.39 |
| NM_133626.2 | Rrbp1 | -2.38 |
| NM_172574.1 | Pqlc3 | -2.37 |
| NM_009151.2 | Selplg | -2.36 |
| NM_010376.3 | H13 | -2.36 |
| NM_145537.1 | Edem2 | -2.32 |
| NM_013863.4 | Bag3 | -2.24 |
| NM_001081212.1 | Irs2 | -2.23 |
| NM_027881.1 | Osbpl3 | -2.21 |
| NM_001033126.2 | Cd27 | -2.19 |
| NM_024444.1 | Cyp4f18 | -2.16 |
| NM_009696.2 | Apoe | -2.16 |
| NM_144525.2 | 1110039B18Rik | -2.16 |
| NM_010173.3 | Faah | -2.16 |
| XM_001472253.1 | LOC100044439 | -2.10 |
| NM_007421.1 | Adssl1 | -2.08 |
| NM_016969.1 | Myadm | -2.04 |
실시예
18.
LPS
로 유도된 패혈증 모델에서 소듐
타우로데옥시콜레이트
처치후
증가되는
CD23
hi
B
H
세포를 양자
이입 하였을
때 늘어나는 세포 아형 분석
실시예 17에서, CD23hi 면역조절 BH 세포를 양자이입한 경우 CD11b+ Gr-1+ 세포 및 면역조절 B 세포의 증가를 확인할 수 있었다(도 16). 위 실시 예에서 사용한 수용 마우스 수는 PBS 그룹 3마리, CD23lo 면역조절 BH 세포 그룹 및 CD23hi 면역조절 BH 세포 그룹에서 1 × 105 개씩 양자이입한 3마리씩 사용하였다. LPS 투여 후 24시간과 48시간에 각각 마우스들을 희생시켜 B세포와 CD11b+ Gr-1+세포에서 CD23hi BH 세포를 양자이입한 경우에 CD23lo BH 세포를 양자이입한 경우에 의미있는 세포 수의 증가를 보였다.
실시예
19.
LPS
로 유도된 패혈증 모델에서 소듐
타우로데옥시콜레이트
처치후
증가되는
H-
MDSC
세포를 양자
이입 하였을
때 늘어나는 B세포 아형 분석
실시예 12에서와 같이 만들어진 L-MDSC 및 H-MDSC를 양자이입한 경우 도 14A에서 볼 수 있듯이 H-MDSC를 양자이입한 후 24시간째에 B세포에서 CD23 high 부분이 확연히 증가됨을 FACS 플롯 이미지로 확인하였다. 도 14B는 H-MDSC를 양자이입한 경우에 B 세포에서 CD23 high 부분이 L-MDSC의 경우에서 보다 유의한 증가를 보임을 확인하였다.
실시예
20.
LPS
와 소듐
타우로데옥시콜레이트를
이용하여
시험관에서의
H-
MDSC
제조 및 이들 세포의 패혈증 치료효과 분석
8주에서 12주 사이의 정상 C57BL/6 마우스를 희생시켜 대퇴골 및 경골의 골수에서 세포를 채취한 후 셀그로(Cellgro) 배지(CellGenix, 독일)에 세포 (1 × 106 /ml)를 부유하였다. 1 × 106 /well의 세포에 1 mg/㎖ 의 LPS와 50 mg/㎖의 HY2191 을 혼합하여 24시간 배양하였다.
골수세포에 LPS만을 시험관내 처리하여 수확한 MDSC (LexMDSC)과 LPS와 HY2191를 동시에 시험관내에서 골수세포에 처리한 후 수확한 MDSC (HexMDSC) 사이에 CD11b+Gr-1+ MDSC 분화 정도를 비교하였다. 24시간 배양 시, 대조군에 비하여 HY2191 처리군에서 CD11b+Gr-1+세포의 절대수가 각각 36% 및 34% 증가한 것을 유세포 분석법(FASC)으로 확인하였다(도 17A). 24시간 배양을 완료한 LexMDSC및 HexMDSC를 LPS 10 mg/kg을 24시간전에 주사한 C57BL/6 마우스에 정맥으로 양자이입였다. 그 중 HexMDSC를 주사한 마우스만이 생존하였고, PBS만 처리한 군, LexMDSC 투여군 및 Media 투여한 군 모두 폐사하였다(도 17B).
Claims (7)
- TLR(toll-like recetor) 신호전달 유도 인자 및 GPCR19 아고니스트 처리되어 형질전환 또는 증폭되거나 또는 상기 제13항의 MDSC 처리에 의해 형질전환 또는 증폭되어 CD23hi 표면 형질형을 가지며 항염증 활성을 갖는 면역조절 B 세포(Regulatory B cell).
- 제 1 항에 있어서, 상기 면역조절 B 세포는 Fcer2a, Grm6, AU019823, Marcksl1, Bcl2a1c, Bcl2a1d, Afg3l1, Cdk5r1, Cd40, Rrp1b, Slamf1, Luc7l, Igsf9, Gypc, C1qbp, Id3, Il4i1, Gbp1, Cd83, Mybl2, Ift140, Snx11, Swap70, Ccbp2, Sc4mol, Cyp51, Sqle, LOC100040592, B3gnt8, 1300014I06Rik, Fdps, Ctsa, Dmwd, Sfrs7, Hbb-bh1, Hspa1a, Srpk3, Hhex, Insig1, Cbfa2t3h, Taf15, Ddx17, Cnn2, Brwd1, Cr2, Arhgap4, Pira3, Flna, Cdk5rap1, Cugbp1, Ankrd37, Cd44, Mrps7, Mapk11, Pycard, Cap1, Lta, Rbm4, Cd180, Cfp, Cmah, LOC100046855, Srebf1, Ciita, Ryr1, E2f2, Dap3, Wdr9, Ccr6, Pcbd2, Lmnb1, Pira4, Blvrb 또는 Actb 유전자를 고발현하거나 또는 1190002H23Rik, Bhlhb8, Mist1, Fkbp11, Cacna1h, Rsph1, Rbm47, Slpi, Ly6c1, Hist1h1c, Tg, Klra7, Creb3l2, Prg2, Creld2, Nkg7, Anxa2, Txndc5, Tmem66, Amigo2, Klra4, LOC100038894, Speer3, Derl3, Ppapdc1b, Ckb, Thy1, Pqlc3, Klrd1, Xbp1, Klre1, Lgals1, 2010001M09Rik, Ctsw, Cd160, Ccl5, S el1l, Dusp4, Socs2, Ccl4, Cd9, Mcoln2, Trp53inp1, Ssr2, Reln, Tubb2b, Akp2, F2r, H13, Cd8b1, Ifit3, Rsad2, LOC667370, Irf7, Ifit2, Slfn1, Cxcl10, Ctla4, Rgs1, Oasl2, Il7r, Usp18, Mx1, LOC100048346, Mx2, Tyki, Hba-a1, Lgals3bp, Ifitm3, Cfl1, Oas2, Serpina3f, Emb, P2ry14, Cirbp, Dhx58, Fcer1g, Ifng, AA467197, Gpr114, Trafd1, Cd3d, Igtp, Rilpl1, Apoe, Lat, Sh2d2a, Cd6, Slc15a2, Gbp2, Oasl1, Spo11, Ctse, Klf9, Pex11a, D14Ertd668e, Mlkl, Itk, Serpinb6b 또는 Cd69 유전자를 저발현하는 것을 특징으로 하는 면역조절 B 세포.
- 제 1 항에 있어서, 상기 면역조절 B 세포는 CD21 및 CD23을 발현하는 것을 특징으로 하는 면역조절 B 세포.
- 제 1 항에 있어서, 상기 TLR 신호전달 유도 인자는 박테리아 유래 인자, 진균 유래 인자, 바이러스 유래 인자, 자가 유래 인자, 알러젠(allergen) 또는 암 세포 유래 인자인 것을 특징으로 하여 생성되는 면역조절 B 세포.
- 제 4 항에 있어서, 상기 TLR 신호전달 유도 인자는 박테리아 유래 인자로서 리포폴리사카라이드(LPS) 또는 펩티도글리칸인 것을 특징으로 하여 생성되는 면역조절 B 세포.
- 제 1 항에 있어서, 상기 GPCR19 아고니스트는 하기 화학식 1의 화합 물, 그의 염 또는 수화물인 것을 특징으로 하는 면역조절 B 세포:
화학식 1
상기 화학식에서 R1은 수소, 하이드록시, C1-5 직쇄 또는 가지쇄 알킬 또는 할로겐; R2는 수소 또는 α-하이드록시; R3은 하이드록시, NH(CH2)mSO3H(m은 정수 0, 1, 2, 3, 4 또는 5) 또는 NH(CH2)nCO2H(n은 정수 0, 1, 2, 3, 4 또는 5); R4 및 R5는 수소; R6은 수소 또는 R5 및 R6가 부착된 탄소와 함께 3, 4, 5 또는 6개 원자 크기로 형성된 고리이고; R7은 수소 또는 하이드록시; R8, R9 및 R10은 C1-3 직쇄 또는 가지쇄 알킬; R11은 수소이다.
- 상기 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항의 면역조절 B 세포를 유효성분으로 포함하는 패혈증, 자가면역질환, 염증성 질환, 류마티스 관절염, 아토피성 피부염, 알쯔하이머 병, 궤양성 대장염, 제1형 당뇨병, 크론병, 건선, 건선성 관절염, 강직성 척수염, 다발성 경화증, 캐슬만씨 병, 자가면역성 간염, 자가 면역성 포도막염, 중증 근무력증, 원형 탈모증 및 전신성 홍반성 낭창으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나의 염증 질환 예방 또는 치료용 약제학적 조성물.
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-
2013
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