KR20130108763A - 호기적 및 혐기적 탈질세균인 슈도모나스속 엘오씨제이엔파이브 및 슈도모나스속 엘오씨제이엔파이브를 이용한 하수나 폐수의 질산염 제거 - Google Patents

호기적 및 혐기적 탈질세균인 슈도모나스속 엘오씨제이엔파이브 및 슈도모나스속 엘오씨제이엔파이브를 이용한 하수나 폐수의 질산염 제거 Download PDF

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Abstract

본 발명은 무산소 및 호기성 조건에서 도시생활하수의 탈질반응에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 질소, 인 및 유기물을 제거하는 연속반응기에서 분리된 종속영양 탈질세균인 슈도모나스속(Pseudomonas sp.) LOCJN5(기탁번호 KCTC 12098BP) 및 슈도모나스속 LOCJN5를 이용한 생활하수의 탈질화에 관한 것이다.
본 발명의 균주는 ssurRNA유전자 염기서열 상동성 비교에서 슈도모나스에어로지노사(Pseudomonas aeruginosa)LMG 1242T와 99.92%의 유사성을 가지고, 슈도모나스속의 다른 표준균주들과 근연관계를 가지는 신규한 세균인 슈도모나스속 LOCJN5로 동정되었다.
본 발명의 슈도모나스속 LOCJN5는 catalase와 oxidase 활성을 가지는 그람 음성 간균으로 esterase(C4), esterase lipase(C8), lipase(C14), leucinearylamidase, trypsin 및 acid phosphatase의 활성을 가지고 있고, D-glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-glucosamine, potassium gluconate, capric acid, adipic acid, malic acid 및 trisodium citrate를 탄소원으로 이용하며, 암모니아, 질산염, 아질산염을 질소원으로 이용할 수 있고, 질산염을 질소로 환원할 수 있다.
본 발명의 슈도모나스속 LOCJN5는 암모니아성 질소, 질산성 질소 혹은 아질산성 질소가 유일한 질소원으로 포함된 배지에서 생육하며 질소를 제거할 수 있고, 슈도모나스속 LOCJN5는 인공슬러지에 포함된 500 mg/L의 질산성 질소를 무산소 조건에서는 0 mg/L으로 감소시키고, 호기성 조건에서는 88 mg/L로 감소시켰다.

Description

호기적 및 혐기적 탈질세균인 슈도모나스속 엘오씨제이엔파이브 및 슈도모나스속 엘오씨제이엔파이브를 이용한 하수나 폐수의 질산염 제거{ A novel aerobic and anaerobic denitrifying bacterium, Pseudomonas sp. LOCJN5, and biological denitrification of synthetic wastewater using Pseudomonas sp. LOCJN5.}
본 발명은 무산소 및 호기성 조건에서 도시생활하수의 탈질반응에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 질소, 인 및 유기물을 제거하는 연속반응기에서 분리된 종속영양 탈질세균인 슈도모나스속 LOCJN5(기탁번호 KCTC 12098BP) 및 슈도모나스속 LOCJN5를 이용한 생활하수의 탈질화에 관한 것이다.
하천의 부영양화를 일으키는 주요 원인 중의 하나는 도시생활하수이다. 도시생활하수에 포함된 질소와 인은 물고기 폐사를 유발하는 하천 녹조형성의 직접적인 원인물질로서 자연수계로 방류되기 전에 제거되어야 한다.
생활하수에 포함된 질소화합물 중 암모니아는 호기적 환경에서 독립영양세균에 의한 질산화 반응으로 제거되고, 질산성 질소는 무산소 환경에서 종속영양세균에 의해 주로 제거된다. 질산성 질소의 제거는 무산소 상태에서만 일어난다고 생각되어왔으나, 호기적 상태에서도 탈질반응이 일어나는 것으로 보고되고 있다 [Robertson et al., 1988].
탈질과정에서 탈질 미생물은 질산성 질소를 아질산성 질소로 환원시킨 후 최종적으로 질소가스를 만든다. 탈질과정에 관여하는 미생물로는 Bacillus sp., Pseudomonas sp., Spirillum sp., Hyphomicrobium sp., Agrobacterium sp., Acinetobacter sp., Propionobacterium sp.,Rhizobium sp.,Cornebacterium sp., Cytophata sp., Thiobacillus sp., Alcaligenes sp., Stenotrophomonas sp., Oceanimonas sp.가 보고 되었으며, 최근에는 Acidovorax sp.도 탈질균으로 보고되었다[Heylen et al., 2008].
이와 같은 탈질반응의 중요성에 의하여 신규한 탈질 미생물의 연구가 계속되고 있으며, 특히 무산소 조건 뿐만 아니라 호기성 조건에서도 탈질반응을 유발하는 미생물의 개발이 요구되고 있다.
또한, 탈질 미생물은 염분(NaCl)의 농도에 의해 생육이 영향을 받게 되는데, 염분이 다량 함유된 하수나 폐수에서도 탈질이 일어나는 미생물의 개발이 요구되고 있다.
본 발명은 상기한 요구에 부응하기 위하여 안출된 것으로, 본 발명의 목적은 생물학적으로 탈질반응을 진행하는 신규한 세균을 제공하여 도시생활하수의 질산염 제거를 촉진하는 한편, 탈질 미생물의 감소 시 개발된 미생물의 즉각적인 투여로 생활하수처리 반응기 내의 탈질을 원활하게 함에 있다.
본 발명의 다른 목적은 산소의 유무에 관계없이 질산성 질소를 질소로 환원시킬수 있는 신규한 탈질 미생물을 제공하여 이를 도시생활하수의 탈질반응에 이용함에 있다.
본 발명의 또다른 목적은 고온환경의 생활하수 및 염도가 높은 하수나 폐수의 질산성 질소를 질소가스로 변환시키는 탈질반응에 특화된 탈질 미생물을 제공함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 질산환원능을 가지고 있는 균주 슈도모나스속 LOCJN5를 분리동정하고, 분리동정한 슈도모나스속 LOCJN5의 질산환원 효과를 확인함으로써 완성되었다.
본 발명의 일견지에 의하면 본 발명은 질산염을 아질산으로 환원하고 아질산염을 질소로 환원할 수 있는 질산환원능을 가지는 슈도모나스속 LOCJN5 균주를 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 슈도모나스속 LOCJN5는 암모니아성 질소, 질산성 질소 혹은 아질산성 질소가 유일한 질소원으로 포함된 배지에서 생육하며 질소를 제거할 수 있고, 슈도모나스속 LOCJN5는 인공슬러지에 포함된 500 mg/L의 질산성 질소를 무산소 조건에서는 0 mg/L으로 감소시키고, 호기성 조건에서는 88 mg/L로 감소시키는 것이 하기 실시예를 통하여 규명되었다(도 3 참조).
이 때 본 발명에서 분리된 균주의 그람 염색 후 촬영한 광학현미경 사진은 도 1과 같고, 한천 평판배지에서의 생육은 도 2와 같으며, ssurRNA 유전자 염기서열을 비교하여 작성한 계통분석도는 도 3과 같다.
또한 본 발명의 분리균주는 catalase와 oxidase 활성을 가지는 그람 음성 간균으로 esterase(C4), esterase lipase(C8), lipase(C14), leucinearylamidase, trypsin 및 acid phosphatase의 활성을 가지고 있고, D-glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N-acetyl-glucosamine, potassium gluconate, capric acid, adipic acid, malic acid 및 trisodium citrate를 탄소원으로 이용하며, 암모니아, 질산염, 아질산염을 질소원으로 이용할 수 있고, 질산염을 질소로 환원할 수 있다.
또한 본 발명의 분리균주를 인공 슬러지인 BTB 배지에서 생육을 측정한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이 45 ℃의 고온에서도 생육하고, 도 5에 나타낸 바와 같이 5%(w/v)NaCl이 포함된 환경에서도 생육하였다.
또한 본 발명의 균주는 ssurRNA유전자 염기서열 상동성 비교에서 슈도모나스에어로지노사(Pseudomonas aeruginosa)LMG 1242T와 99.92%의 유사성을 가지고(표 3 참조) 슈도모나스속의 다른 표준균주들과 근연관계를 가지는 신규한 세균인 슈도모나스속 LOCJN5로 동정되었으며, 2011년 12월 9일 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 생명자원센터에 기탁번호 KCTC12098BP로 기탁되었다.
이상 설명한 바와 같이 본 발명의 슈도모나스속 LOCJN5는 고온에서도 질산염의 제거가 가능하고, 높은 염분이 포함된 생육환경에서도 질산염의 제거가 가능하며, 무산소 상태 뿐만 아니라 호기적인 환경에서도 질산염의 제거가 가능하여, 슈도모나스속 LOCJN5는 무산소 및 유산소 상태의 염분농도가 높은 생활하수의 질소 제거에 적합한 탈질 미생물로 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 슈도모나스속 LOCJN5의 광학현미경사진이다.
도 2는 한천 평판배지에서 생육한 슈도모나스속 LOCJN5의 사진이다.
도3은 슈도모나스속 LOCJN5의 ssurRNA 유전자 계통도이다.
도4는 슈도모나스속 LOCJN5의 생육 온도를 나타내는 그래프이다.
도5는 다양한 NaCl 농도에서 슈도모나스속 LOCJN5의 생육을 나타내는 그래프이다.
도6은 슈도모나스속 LOCJN5의 분리에 사용한 연속반응기의 사진이다.
이하 실시예를 들어 본 발명을 구체적으로 설명하지만 본 발명의 권리범위가 기술된 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<본 발명의 신규한 질산염 환원세균의 분리>
도시생활하수의 처리를 목적으로 하는 A2O형의 연속식 회분반응기를 만들고 HRT를 12시간으로 조절하여 8주동안 운전함으로써 질소제거 반응을 유도하였다 (도 6 참조). 8주 운전 후 탈질반응이 진행되는 무산소조의 시료를 취하여 미생물을 분리하였다. A2O 반응조의 운전에는 합성폐수를 사용하였다.
1 L의 합성폐수에는 384.4 mg의 CH3COONa (COD 기준으로 300 mg/L), 49.4 mg의 KH2PO4 (PO4 3--P 기준으로 11 mg/L), 140 mg의 (NH4)2SO4 (NH4-N 기준으로 30 mg/L), 14 mg의 CaCl2·2H2O, 90 mg의 MgSO4·7H2O 및 0.3 mL의 영양용액이 포함된다.
영양용액 1 L에는 1.5 g의 FeCl3·6H2O, 0.15 g의 H3BO3, 0.03 g의 CuSO4·5H2O, 0.18 g의 KI, 0.12 g의 MnCl2·4H2O, 0.06 g의 Na2MoO4·2H2O, 0.12 g의 ZnSO4·7H2O, 0.15 g의 CoCl2·6H2O 및 10 g의 EDTA가 포함되었다[Tsuneda et al., 2006].
질산염 환원균의 분리에는 1.0 g의 L-asparagine, 1.0 g의 KNO3, 1.0 g의 KH2PO4, 0.06 g의 FeSO4·7H2O, 0.2 g의 CaCl2·2H2O, 1.0 g의 MgSO4·7H2O, 8.5 g의 sodium succinate 및 1 ml의 1% BTB가 1 L의 증류수에 포함된 분리배지를 사용하였다[Takaya et al., 2003].
분리균주의 질산성 질소 혹은 아질산성 질소의 제거는 BTB를 제외하고, KNO3의 농도를 0.815 g/L로 변경한 분리배지를 사용하여 무산소 및 호기적 배양 조건에서 확인하였다.
무산소 조건 배양을 위해서는 혈청병에 배지를 넣은 후 아르곤 가스로 퍼징하여 배지에 용해되어 있는 산소를 모두 제거한 후, 고무마개와 알루미늄 덮개로 밀봉한 상태의 배지를 만들고, 이러한 무산소 배지에 미생물의 접종 및 시료채취는 주사기를 이용하였다.
<분리된 질산염 환원세균의 질산환원능 검사>
분리된 세균을 KNO3가 질소원으로 포함된 BTB 배지에서 무산소 및 호기상태에서 배양하면서 질산성 질소의 감소를 Merck사의 nitrate test strip을 이용하여 확인한 결과, 아래의 표 1에서 알 수 있는 바와 같이 분리된 세균은 인공슬러지에 포함된 500 mg/L의 질산성 질소를 무산소 조건하에서는 0 mg/L로 감소시키고, 호기성 조건하에서는 88 mg/L로 감소시켜, 분리된 세균이 질산환원능을 가지고 있음을 확인할 수 있었다.
<표 1. 호기 및 무산소 상태에서 슈도모나스속 LOCJN5에 의한 합성폐수의 질산성 질소의 제거>

균주
호기
무산소
처리 전 처리 후 처리 전 처리 후
Pseudomonassp. LOCJN5 500 (mg/L) 88 (mg/L) 500 (mg/L) 0 (mg/L)
<분리된 세균의 ssurRNA 유전자 염기서열 분석 및 관련 미생물 균주 간의 ssurRNA 유전자 상동성 비교>
분류학적 동정를 위하여 균주 LOCJN5의 ssurRNA 유전자 서열을 분석하고, 분석한 서열과 근연균주와의 상동성을 조사하였다. ssurRNA 유전자의 증폭을 위해, 균주 LOCJN5의 게놈 DNA를 추출하였다.
추출한 게놈 DNA를 주형으로 세균ssurRNA 유전자 증폭용 프라이머인 27F 와 1492R (Lane, 1991)로 균주 LOCJN5의 ssurRNA 유전자를 증폭한 후, 증폭된 DNA 단편의 염기서열은 ㈜마크로젠에서 Sanger sequencing 방법으로 분석하였다.
염기서열 분석으로 얻은 1395 base의 ssurRNA 유전자 염기서열은 아래의 표 2와 같으며, 표 2의 ssurRNA 유전자 염기서열을 EzTaxon program (Chun et al., 2007)을 이용하여 분석한 결과는 아래의 표 3과 같다.
균주 LOCJN5는 표 3에서 알 수 있는 바와 같이 기존에 보고된 표준 미생물과 ssurRNA 유전자 염기서열이 같지 않은 신규한 미생물이다.
<표 2. 슈도모나스속 LOCJN5의 ssurRNA 유전자 염기서열>
>ssurRNA gene sequence of Pseudomonas sp. LOCJN5
TAAGTCCCGTAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTACCAGCACCTCGGGTGGGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCCAAGCCGCGAGGTGGAGCTAATCCCATAAAACCGATCGTAGTCCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGTGAATCAGAATGTCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTGCTCCAGAAGTAGCTAGTCTAACCGCAAGGGGGAC
<표 3. 슈도모나스속 LOCJN5 ssurRNA 유전자 서열의 EzTaxon 서버분석>
연번 학명 균주 GenBank No. 상동성
1 Pseudomonas aeruginosa LMG 1242T Z76651 99.928
2 Pseudomonas otitidis MCC10330T AY953147 98.566
3 Pseudomonas alcaligenes LMG 1224T Z76653 97.563
4 Pseudomonas indoloxydans IPL-1T DQ916277 97.133
5 Pseudomonas anguilliseptica NCIMB 1949T X99540 97.061
6 Pseudomonas stutzeri ATCC 17588T CP002881 97.061
7 Pseudomonas oleovorans subsp. lubricantis RS1T DQ842018 96.703
8 Pseudomonas citronellolis DSM 50332T Z76659 96.7
9 Pseudomonas mendocina LMG 1223T Z76664 96.688
10 Pseudomonas resinovorans LMG 2274T Z76668 96.611
11 Pseudomonas alcaliphila AL15-21T AB030583 96.559
12 Pseudomonas nitroreducens DSM 14399T AM088474 96.557
13 Pseudomonas panipatensis Esp-1T EF424401 96.549
14 Pseudomonas toyotomiensis HT-3T AB453701 96.487
15 Pseudomonas knackmussii B13T AF039489 96.344
16 Azotobacterchroococcum IAM 12666T AB175653 96.334
17 Pseudomonas benzenivorans DSM 8628T FM208263 96.272
18 Pseudomonas segetis FR1439T AY770691 96.201
19 Pseudomonas oleovorans DSM 1045T Z76665 96.193
20 Pseudomonas delhiensis RLD-1T DQ339153 96.129
21 Pseudomonas composti C2T FN429930 96.129
22 Pseudomonas peli R-20805T AM114534 96.129
23 Pseudomonas marincola KMM 3042T AB301071 96.057
24 Pseudomonas monteilii CIP 104883T AF064458 95.986
25 Pseudomonas plecoglossicid FPC951T AB009457 95.914
<분리된 세균의 ssurRNA 유전자 서열을 이용한 계통도>
균주 LOCJN5의 ssurRNA 유전자 서열을 이용하여 계통도를 작성하였다. 계통도 작성을 위해 근연균주들 중 표준균주의 ssurRNA 유전자 서열과 균주 LOCJN5의 ssurRNA 유전자 서열을 CLUSTAL_X 프로그램으로 정렬(alignment)하였다.
계통도는 neighbor-joining 방법을 이용하여 Mega 5(V5.05) 프로그램으로 만들었다. 계통도 상의 계통학적 거리는 Kimura’s two-parameter 방법으로 계산하였고, 계통도의 topology는 1000번의 재분석에 의거한 bootstrap 분석으로 평가하고, 백분율로 환산하여 50% 이상인 경우 각 노드에 표시하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이 균주 LOCJN5는 기존에 보고된 표준균주들과 상이한 것으로 나타났다.
ssurRNA 유전자의 상동성 비교와 계통분석 결과 균주 LOCJN5는 슈도모나스속 LOCJN5 (=Pseudomonassp. LOCJN5)로 동정되었다.
<분리균주의 생리적 특성에 대한 조사방법>
분리균주의 그람형은 BD사의 그람염색키트로 염색한 후 판별하였다. 미생물의 형태는 광학현미경으로 판별하였다.
분리균주의 Oxidase의 활성은 bioMerieux사의 시험시약을 이용하여 활성의 유무를 발색으로 판별하였고, Catalase의 활성은 미생물의 군락에 과산화수소수를 투여한 후 기포가 발생하면 양성으로 판별하였다.
분리균주의 최적 생육온도는 LB 혹은 BTB 배지에 접종된 미생물을 5, 10, 15, 20, 25, 30, 37, 40, 45 ℃에서 배양한 후 생육을 판단하였다.
분리균주의 탄수화물의 산화적 이용은 API 50CH와 CHB medium을 사용하여 측정하였고, 효소반응은 API ZYM으로 확인하였으며, 기타 특징은 API 20NE를 사용하여 측정하였다.
분리균주의 생육에 영향을 주는 NaCl의 농도는 0~5% (w/v)의 NaCl이 함유된 액체배지에서 균주를 접종한 후 미생물 생육을 600 nm 파장에서 흡광도로 판별하였다.
슈도모나스속 LOCJN5는 catalase 와 oxidase 활성을 가지는 그람 음성 단간균으로 관찰되었다(도 1 참조).
슈도모나스속 LOCJN5는 D-glucose, L-arabinose, D-mannose, D-mannitol, N- acetyl-glucosamine, potassium gluconate, capric acid, adipic acid, malic acid 및 trisodium citrate를 탄소원으로 이용하고, arginine dihydrolase, urease, protease의 활성이 있으며, 질산염을 아질산염으로 환원하고, 아질산염을 질소로 환원할 수 있다.
슈도모나스속 LOCJN5의 API 20NE, API 50CH 및 API ZYM 분석결과는 아래의 표 4, 표 5 및 표 6과 같다.
<표 4. 슈도모나스속 LOCJN5의 API 20NE 분석>
특징 활성
reduction of nitrates to nitrites, NO3->NO2 +
reduction of nitrates to nitrogen, NO3->N2 +
indole production -
glucose fermentation +
arginine dihydrolase +
urease +
hydrolysis Esculin (β-glucosidase) +
hydrolysis gelatin (protease) +
p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside -
D-glucose assimilation +
L-arabinose assimilation +
D-mannose assimilation +
D-mannitol assimilation +
N-acetyl-glucosamine assimilation +
D-maltose assimilation -
potassium gluconate assimilation +
capric acid assimilation +
adipic acid assimilation +
malic acid assimilation +
trisodium citrate assimilation +
phenylacetic acid assimilation -
cytochrome oxidase +
<표 5. 슈도모나스속 LOCJN5의 API 50CHB 분석>
No. 특징 활성 No. 특징 활성
0 Control - 25 aesculin -
1 glycerol w 26 salicin -
2 erythritol - 27 D-cellobiose -
3 D-arabinose w 28 D-maltose -
4 L-arabinose + 29 D-lactose -
5 D-ribose + 30 D-melibiose -
6 D-xylose + 31 Sucrose -
7 L-xylose w 32 D-trehalose -
8 D-adonitol - 33 inulin -
9 methyl-β-D-xylopyranside - 34 D-melezitose -
10 D-galactose + 35 D-raffinose -
11 D-glucose + 36 starch -
12 D-fructose w 37 glycogen -
13 D-mannose + 38 xylitol -
14 L-sorbose - 39 gentiobiose -
15 L-rhamnose - 40 D-turanose -
16 dulcitol - 41 D-lyxose -
17 inositol - 42 D-tagatose -
18 D-mannitol - 43 D-fucose +
19 D-sorbitol - 44 L-fucose -
20 methyl-α,D-mannopyranoside - 45 D-arabitol -
21 methyl-α,D-glucopyranoside - 46 L-arabitol -
22 N-acetylglucosamine - 47 potassium gluconate -
23 amygdalin - 48 potassium 2-keto-gluconate -
24 arbutin - 49 potassium 5-keto-gluconate -
<표 6. 슈도모나스속 LOCJN5의 API ZYM 분석>
특징 활성
Control -
Alkaline phosphatase -/w
Esterase(C4) +
Esterase Lipase(C8) +
Lipase(C14) w
Leucinearylamidase +
Valinearylamidase -
Crystinearylamidase -
Trypsin +
α-chymotrypsin -
Acid phosphatase +
Naphthol-AS-BI-phosphohydrolase -
α-galactosidase -
β-galactosidase -
β-glucuronidase -
α-glucosidase -
β-glucosidase -
N-acetyl-β-glucosaminidase -
α-mannosidase -
α-fucosidase -
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Claims (3)

  1. 신규한 질산염 환원 세균인 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)LOCJN5 (KCTC12098BP)균주.
  2. 제 1항 기재의 균주를 이용하여 암모니아성 질소, 질산성 질소 및 유기물을 제거하는 방법.
  3. 제 1항 기재의 균주를 이용하여 유산소 상태에서 하수 및 폐수의 질산염을 제거하는 방법.



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