KR20130118941A - 면역치료법 - Google Patents

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파블로 우마나
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Abstract

본 발명은 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병을 치료하는데 사용하기 위한, (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 제공한다. 추가로, 조합물을 포함한 약학 조성물 및 이를 사용하는 방법이 제공된다.

Description

면역치료법{IMPROVED IMMUNOTHERAPY}
본 발명은 일반적으로 면역치료법에 관한 것이다. 더욱 특별히, 본 발명은 면역치료제로서의 조합된 사용을 위한 항원-표적화된 면역컨주게이트(immunoconjugate) 및 Fc-조작된 항체에 관련된다. 또한, 본 발명은 상기 면역컨주게이트 및 항체의 조합물을 포함하는 약학 조성물 및 질병 치료에 이를 사용하는 방법에 관한 것이다.
개별 세포 또는 특정 세포 유형의 선택적 파괴는 종종 다양한 임상 현장에서 요망될 수 있다. 예를 들면, 종양 세포를 특이적으로 파괴하면서도 건강한 세포 및 조직을 그대로 손상되지 않게 놔두는 것이 암 치료법의 우선적인 목표이다.
이를 달성하기 위한 하나의 바람직한 방식은 종양에 대해 면역 반응을 유도함으로써 면역 효과자(effector) 세포, 예컨대 천연 킬러(NK: natural killer) 세포 또는 세포독성 T 림프구(CTL: cytotoxic T lymphocyte)가 종양 세포를 공격하고 파괴하도록 만드는 것이다. 효과자 세포는, 면역 세포의 표면 상에서 수용체로의 결합을 통해 신호작용을 유도하는 다수의 사이토킨(cytokine)을 비롯한 다양한 자극원에 의해 활성화될 수 있다. 예를 들면, 무엇 보다도, 세포독성 T 세포 및 NK 세포의 증식 및 활성화를 자극하는 인터류킨(interleukin)-2(IL-2)은, 전이성 신장 세포 암종 및 악성 흑색종을 치료하는 것으로 입증되었다. 그러나, 신속한 혈액 소거 및 종양 특이성의 결여로 인해, 면역 반응을 활성화시키거나 항-종양 효과를 갖기에 충분히 높은 농도의 사이토킨을 종양 부위에서 달성하기 위해서는 높은 투약량의 사이토킨의 전신 투여가 요구된다. 사이토킨의 이러한 높은 전신 수준은 심각한 독성 및 부작용을 일으킬 수 있고, 또한 IL-2도 마찬가지이다. 따라서, 암 치료법에 사용하기 위해서, 종양 또는 종양 미세환경으로 사이토킨을 특이적으로 전달하는 것이 요망된다. 이는 사이토킨을 종양 항원에 특이적인 표적 구성부분(moiety), 예를 들어 항체 또는 항체 단편에 컨주게이트화함으로써 달성될 수 있다. 이러한 면역컨주게이트의 추가의 이점은, 컨주게이트되지 않은 사이토킨에 비하여 혈청 반감기가 증가한다는 것이다.
전신 부작용을 더 낮은 투약량에서 최소한으로 유지시키면서도 종양 부위에서 면역자극 활성을 최대화시키는 능력은 사이토킨 면역컨주게이트를 최적의 면역치료제로 만든다.
효과자 세포를 활성화시키는 또 다른 방법은 면역글로불린의 Fc 부분 또는 Fc 영역을 포함하는 재조합 융합 단백질에 의해 이들 세포의 표면 상에서 Fc 수용체를 활성화시킴에 의해서이다. Fc 영역에 의해 중재되는 항체의 소위 효과자 기능은 항체-기초 암 면역치료법에서 중요한 작용 기작이다. 항체-의존성 세포-중재된 세포독성, NK 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포(예를 들어 종양 세포)의 파괴는, 세포의 표면에 결합된 항체가 NK 세포 상에서 Fc 수용체와 상호작용할 때 개시된다. NK 세포는 IgG1 또는 IgG3 하위부류의 면역글로불린을 인식하는 FcγⅢa(CD16a)를 발현한다. 추가의 효과자 기능으로는 항체-의존성 세포-중재된 식세포 작용(ADCP: antibody-dependent cell-mediated phagocytosis) 및 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity)이 포함되고, 이는 항체의 부류 및 하위부류에 따라 다양한데, 그 이유는 상이한 면역 세포 유형이 면역글로불린 중쇄 불변성 도메인의 상이한 유형 및 하위유형을 인식하는 상이한 Fc 수용체 세트를 가지기 때문이다(예를 들어 α, δ, γ, ε, 또는 μ 중쇄 불변성 도메인은 IgA, IgD, IgE, IgG, 또는 IgM 부류 항체에 각각 상응함). 다양한 전략이 항체의 효과자 기능을 증가시키기 위해 사용되어 왔다. 예를 들면, 쉴즈(Shields) 등[J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001)]은, Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334에서의 아미노산 치환(잔기의 EU 번호매김)이 항체의 FcγⅢa 수용체로의 결합 및 ADCC를 개선시킴을 제안한다. Fc 영역에서 아미노산이 개질되고 개선된 Fc 수용체 결합 및 효과자 기능을 나타내는 추가의 항체 변형체는, 예를 들어 미국 특허 제6,737,056호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2004/063351호 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2004/099249호에 기재되어 있다. 다르게는, 증가된 Fc 수용체 결합 및 효과자 기능은 항체의 글리코실화를 변경시킴으로써 수득될 수 있다. 암 면역치료법에서 가장 흔히 사용되는 항체인 IgG1 유형 항체는 Fc 영역의 각각의 CH2 도메인중 Asn 297에서 보존된 N-연결된 글리코실화 부위를 갖는다. Asn 297에 결합된 2개의 복합 2촉각성(biantennary) 올리고당은 폴리펩타이드 CH2 도메인 사이에 매립되어 주쇄와 광범위한 접촉부를 형성하고, 이들의 존재는 항체가 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC)을 비롯한 효과자 기능을 중재하기 위해 중요하다(Lifely et al., Glycobiology 5, 813-822 (1995); Jefferis et al., Immunol Rev 163, 59-76 (1998); Wright and Morrison, Trends Biotechnol 15, 26-32 (1997)). 단백질 공학 연구로부터, FcγR이 IgG CH2 도메인의 더 낮은 힌지 영역과 상호작용함이 제시되었다(Lund et al., J Immunol 157, 4963-69 (1996)). 그러나, FcγR 결합은 또한 CH2 영역에서 올리고당의 존재를 필요로 하고(Lund et al., J Immunol 157, 4963-69 (1996); Wright and Morrison, Trends Biotech 15, 26-31 (1997)), 이는 올리고당 및 폴리펩타이드가 둘 다 상호작용 부위에 직접적으로 기여한다는 것 또는 올리고당이 활성 CH2 폴리펩타이드 입체배좌를 유지시키기 위해 필요하다는 것을 제시한다. 따라서 올리고당 구조의 개질이 IgG1 및 FcγR 사이의 상호작용의 친화도를 증가시키고, IgG1 항체의 ADCC 활성을 증가시키는 수단으로서 연구될 수 있다. 우마나(Umana) 등의 문헌[Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)] 및 미국 특허 제6,602,684호(국제 특허출원 공개공보 WO 제99/54342호; 이의 내용은 본원에 참고로 전체가 인용됨)는, 중국 햄스터 난소(CHO: Chinese hamster ovary) 세포에서 이등분된 올리고당의 형성을 촉매화하는 글리코실전이효소인 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 Ⅲ(GnTⅢ)의 과발현이 이들 세포에서 생산되는 항체의 시험관내 ADCC 활성을 상당히 증가시킴을 제시한다. 생산 세포주에서 GnTⅢ의 과발현은 이등분된 올리고당이 풍부한 항체를 유도하고, 이는 일반적으로 또한 푸코실화되지 않은 하이브리드 유형이다. GnTⅢ에 더하여, 만노시다아제 Ⅱ(ManⅡ)가 생산 세포주에서 과발현된다면, 착체 유형의 이등분된, 푸코실화되지 않은 올리고당이 풍부한 항체가 수득된다(Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)). 개질되지 않은 글리칸을 갖는 항체에 비하여, 두 유형의 항체는 매우 증가된 ADCC를 나타내지만, N-글리칸의 대부분이 착체 유형인 항체만이 상당한 보체-의존성 세포독성을 유도할 수 있다(Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)). ADCC 활성의 증가를 위한 중요 인자는 올리고당 코어의 가장 안쪽의 N-아세틸글루코사민 잔기로부터의 푸코스의 제거인 것으로 보이고, 이는 IgG Fc 도메인의 FcγⅢa로의 결합을 개선시킨다(Shinkawa et al., J Biol Chem 278, 3466-3473 (2003)). 푸코실화가 감소된 항체를 생산하기 위한 추가의 방법은, 예를 들어 α(1,6)-푸코실전이효소 결핍 숙주 세포에서의 발현을 포함한다(Yamane-Ohnuki et al., Biotech Bioeng 87, 614-622 (2004); Niwa et al., J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)).
자유 사이토킨, 면역컨주게이트 또는 조작된 항체의 사용에 의한 항암 면역치료법에서 달성된 성공에도 불구하고, 암 치료법에서 효과적이고 안전한 신규 치료에 대하여 지속적으로 요구되고 있다.
본 발명자들은 국소적 면역 세포 활성화를 위한 2가지 전략의 조합, 즉 사이토킨 면역컨주게이트 및 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체에 의한 효과자 세포의 동시적 자극이 항암 면역치료법의 효능을 크게 개선시킴을 밝혀내었다.
따라서, 본 발명은 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병을 치료하기 위한, (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 제공한다. 한 실시태양에서 효과자 구성부분은 사이토킨이다. 한 실시태양에서 사이토킨은 IL-2, GM-CSF, IFN-α, 및 IL-12로 구성된 군에서 선택된다. 하나의 특별한 실시태양에서, 효과자 구성부분은 IL-2이다. 또 다른 실시태양에서, 효과자 구성부분은 IL-12이다. 또 다른 특정 실시태양에서, IL-2 효과자 구성부분은, 돌연변이 되지 않은 IL-2 효과자 구성부분에 비하여, IL-2 수용체의 α-서브유닛으로의 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분의 친화도를 감소시키거나 폐기하지만 중간-친화도 IL-2 수용체로의 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분의 친화도를 보존하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 특히 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분은 인간 IL-2의 잔기 42, 45, 및 72에 상응하는 위치로부터 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 위치(들)에서 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분은 인간 IL-2의 잔기 42, 45 및 72에 상응하는 위치에서 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 더 구체적인 실시태양에서, 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분은 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G를 포함하는 인간 IL-2이다. 특정 실시태양에서 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분은 인간 IL-2의 위치 3에 상응하는 위치에서의 아미노산 돌연변이를 추가로 포함하고, 이는 IL-2의 O-글리코실화를 제거한다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분은 서열 번호 2의 아미노산 서열을 포함한다. 한 실시태양에서, 효과자 구성부분은 단일-쇄 효과자 구성부분이다.
한 실시태양에서, 항원-결합 구성부분은 항체 또는 항체 단편이다. 한 실시태양에서, 효과자 구성부분은 아미노- 또는 카복시-말단 펩타이드 결합을 항원-결합 구성부분과 공유한다. 한 실시태양에서 항원-결합 구성부분은 Fab 분자 및 scFv 분자로부터 선택된다. 한 실시태양에서 항원-결합 구성부분은 Fab 분자이다. 또 다른 실시태양에서, 항원-결합 구성부분은 scFv 분자이다. 한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 제1 및 제2 항원-결합 구성부분을 포함한다. 한 실시태양에서, 제1 및 제2 항원-결합 구성부분은 독립적으로 Fab 분자 및 scFv 분자로부터 선택된다. 한 실시태양에서, 각각의 제1 및 제2 항원-결합 구성부분은 Fab 분자이다. 또 다른 실시태양에서 제1 및 제2 항원-결합 구성부분은 각각 scFv 분자이다. 한 실시태양에서, 효과자 구성부분은 아미노- 또는 카복시-말단 펩타이드 결합을 제1 항원-결합 구성부분과 공유하고, 제2 항원-결합 구성부분은 아미노- 또는 카복시-말단 펩타이드 결합을 효과자 구성부분 또는 제1 항원-결합 구성부분과 공유한다. 한 실시태양에서, 효과자 구성부분은 아미노-말단 펩타이드 결합을 제1 항원-결합 구성부분과 공유하고 카복시-말단 펩타이드 결합을 제2 항원-결합 구성부분과 공유한다. 한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 본질적으로 효과자 구성부분, 및 하나 이상의 결합기 서열에 의해 연결된 제1 및 제2 항원-결합 구성부분으로 구성된다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분, 및 제1 및 제2 Fab 분자를 포함하고, 여기서 효과자 구성부분은 그의 아미노-말단 아미노산에서 제1 Fab 분자의 중쇄 또는 경쇄의 카복시-말단에 연결되고, 여기서 효과자 구성부분은 그의 카복시-말단 아미노산에서 제2 Fab 분자의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단에 연결된다.
특정 실시태양에서, 항원-결합 구성부분은 종양 세포 또는 종양 세포 환경 상에 존재하는 항원으로 유도된다. 하나의 구체적인 실시태양에서 항원-결합 구성부분은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP: Fibroblast Activation Protein), 테나신(Tenascin)-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 피브로넥틴(Fibronectin)의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암배아성 항원(CEA: Carcinoembryonic 항원) 및 흑색종-연관된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP: Melanoma-associated Chondroitin Sulphate)으로 구성된 군에서 선택된 항원으로 유도된다.
한 실시태양에서, 증가된 효과자 기능은 활성화 Fc 수용체로의 증가된 결합, 증가된 ADCC, 증가된 ADCP, 증가된 CDC, 및 증가된 사이토킨 분비로 구성된 군에서 선택된다. 한 실시태양에서, 증가된 효과자 기능은 활성화 Fc 수용체로의 증가된 결합이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 활성화 Fc 수용체는 FcγⅢa, FcγRI, 및 FcRyⅡa로 구성된 군에서 선택된다. 한 실시태양에서, 활성화 Fc 수용체는 FcγⅢa이다. 한 실시태양에서 증가된 효과자 기능은 증가된 ADCC이다. 한 실시태양에서, 증가된 효과자 기능은 활성화 Fc 수용체로의 증가된 결합 및 증가된 ADCC이다.
한 실시태양에서, 항체는 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 돌연변이의 도입에 의해 조작된다. 하나의 구체적인 실시태양에서 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 한 실시태양에서 항체는 Fc 영역에서의 글리코실화의 개질에 의해 조작된다. 하나의 구체적인 실시태양에서 Fc 영역에서의 글리코실화의 개질은 조작되지 않은 항체에 비하여 Fc 영역에서의 푸코실되지 않은 올리고당의 증가된 비율이다. 더욱 더 구체적인 실시태양에서 Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율은 Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 70% 이상이다. 또 다른 구체적인 실시태양에서 Fc 영역에서의 글리코실화의 개질은, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서의 이등분된 올리고당의 증가된 비율이다. 더욱 더 구체적인 실시태양에서 Fc 영역에서 이등분된 올리고당의 증가된 비율은 Fc 영역에서 이등분된 올리고당의 약 20% 이상, 바람직하게는 50% 이상, 가장 바람직하게는 70% 이상이다. 역시 또 다른 구체적인 실시태양에서 Fc 영역에서의 글리코실화의 개질은, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서의 이등분된, 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율이다. 바람직하게는 항체는 Fc 영역에서 이등분된, 푸코실화되지 않은 올리고당의 약 25% 이상, 약 35% 이상, 또는 약 50% 이상을 갖는다. 하나의 특별한 실시태양에서 항체는, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된다. 항체의 Fc 영역에서의 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율은 증가된 효과자 기능, 특히 증가된 ADCC를 갖는 항체를 생성한다. 하나의 특별한 실시태양에서 푸코실화되지 않은 올리고당은 이등분된, 푸코실화되지 않은 올리고당이다.
한 실시태양에서 항체는 전장 IgG 부류 항체, 특별히 IgG1 하위부류 항체이다. 특정 실시태양에서 항체는 종양 세포 상에 존재하는 항원으로 유도된다. 하나의 구체적인 실시태양에서 항체는 CD20, 상피 성장 인자 수용체(EGFR: Epidermal Growth Factor Receptor), HER2, HER3, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-1R: Insulin-like Growth Factor-1 Receptor), c-Met, CUB 도메인-함유 단백질-1(CDCP1), 암배아성 항원(CEA) 및 흑색종-연관된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)으로 구성된 군에서 선택된 항원으로 유도된다.
하나의 특별한 실시태양에서 항체는, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된 항-CD20 항체이다. 적합한 항-CD20 항체는 국제 특허출원 공개공보 WO 제2005/044859호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참고로 이의 전체가 인용된다. 또 다른 특정 실시태양에서 항체는 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된 항-EGFR 항체이다. 적합한 항-EGFR 항체는 국제 특허출원 공개공보 WO 제2006/082515호 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/017963호에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참고로 이의 전체가 인용된다. 추가의 특정 실시태양에서 항체는, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된 항-IGF-1R이다. 적합한 항-IGF-1R 항체는 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/077546호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참고로 이의 전체가 인용된다. 역시 또 다른 특정 실시태양에서 항체는, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된 항-CEA 항체이다. 적합한 항-CEA 항체는 PCT 공개 번호 WO 제2011/023787호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참고로 이의 전체가 인용된다. 역시 또 다른 특정 실시태양에서 항체는, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된 항-HER3이다. 적합한 항-HER3 항체는 PCT 공개 번호 WO 제2011/076683호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참고로 이의 전체가 인용된다. 역시 또 다른 특정 실시태양에서 항체는, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된 항-CDCP1 항체이다. 적합한 항-CDCP1 항체는 PCT 공개 번호 WO 제2011/023389호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참고로 이의 전체가 인용된다. 한 실시태양에서 항체는, 하나 이상의 글리코실전이효소의 변경된 활성을 갖는 숙주 세포에서 항체를 생산함으로써, 조작되지 않은 항체에 비하여 Fc 영역에서 개질된 글리코실화를 갖도록 조작된다.
한 실시태양에서 항체는, 증가된 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 Ⅲ(GnTⅢ) 활성을 갖는 숙주 세포에서 항체를 생산함으로써, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된다. 하나의 특별한 실시태양에서 숙주 세포는 또한 증가된 α-만노시다아제 Ⅱ(ManⅡ) 활성을 갖는다. 또 다른 실시태양에서 항체는, 감소된 α(1,6)-푸코실전이효소 활성을 갖는 숙주 세포에서 항체를 생산함으로써, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된다.
한 실시태양에서 질병은 효과자 세포 기능의 자극에 의해 치료가능한 질환이다. 한 실시태양에서 질병은 세포 증식 질환이다. 하나의 특별한 실시태양에서 질병은 암이다. 하나의 구체적인 실시태양에서 암은 폐암, 결장암, 신장암, 전립선암, 유방암, 두경부암, 난소암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 및 피부암으로 구성된 군에서 선택된다. 한 실시태양에서 개체는 포유동물이다. 하나의 특별한 실시태양에서 개체는 인간이다.
또 다른 양태에서 본 발명은 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체를 약학적으로 허용가능함 담체중에 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 개체에서 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 용도를 내포한다.
본 발명은 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 치료 효과량으로 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
또한 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 효과자 세포 기능을 자극하기에 효과적인 양으로 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 효과자 세포 기능을 자극하는 방법이 제공된다.
추가의 양태에서 본 발명은 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체, 및 (c) 임의적으로, 질환의 치료 방법으로서 조합된 치료의 사용을 지시하는 인쇄된 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 동일한 또는 별도의 용기에 포함하는, 질병의 치료용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 약학 조성물, 용도, 방법 및 키트에서 사용된 면역컨주게이트 및 항체는 본 발명을 위해 유용한 항체 및 면역컨주게이트에 관하여 앞선 문단에서 기재된 임의의 특징을 단독으로 또는 조합하여 혼입할 수 있음을 알아야 한다.
도 1. TNC A2-표적화된 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵(GlycoMab)을 SCID-인간 FcγRⅢ 형질감염 마우스에 정맥내로 주사된 인간 비-소 세포 폐암(NSCLC: non-small cell lung cancer) 세포주 A549에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 테나신 C의 A2 도메인에 대해 양성인 것으로 제시되었다. 데이터로부터, 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵의 조합물이 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵 단독에 비하여 증진된 중앙 생존율에 있어서 탁월한 효능을 중재하였음을 알 수 있다(실시예 1 참조).
도 2. TNC A2-표적화된 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵을 SCID 마우스에 비장내로 주사된 인간 결장 LS174T 세포주에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 테나신 C의 A2 도메인에 대해 양성인 것으로 제시되었다. 데이터로부터, 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵의 조합물이 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵 단독에 비하여 증진된 중앙 생존율 및 전체 생존율에 있어서 탁월한 효능을 중재하였음을 알 수 있다(실시예 2 참조).
도 3. FAP-표적화된 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵을 SCID 마우스에 신장내로 주사된 인간 신장 세포주 ACHN에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 FAP에 대해 양성인 것으로 제시되었다. 데이터로부터, 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵의 조합물이 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵 단독에 비하여 SCID 마우스에서 상승적으로 증진된 중앙 생존율 및 전체 생존율을 초래하였음을 알 수 있다(실시예 3 참조).
도 4. FAP-표적화된 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵을 SCID-인간 FcγRⅢ 형질감염 마우스에 신장내로 주사된 인간 신장 세포주 ACHN에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 FAP에 대해 양성인 것으로 제시되었다. 데이터로부터, 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵의 조합물이 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵 단독에 비하여 전체 생존율에 있어서 탁월한 효능을 중재하였음을 알 수 있다(실시예 4 참조).
도 5. TNC A2-표적화된 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-CD20 글리코맵을 SCID-인간 FcγRⅢ 형질감염 마우스에 정맥내로 주사된 인간 맨틀(mantle) 세포 림프종 세포주 Z138에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 TNC A2에 대해 양성인 것으로 제시되었다. 데이터로부터, 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-CD20-글리코맵의 조합물이 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-CD20-글리코맵 단독에 비하여 중앙 생존율 및 전체 생존율을 상승적으로 증진시켰음을 알 수 있다(실시예 5 참조).
도 6. CD25로의 결합이 결핍된 IL-2 4중 돌연변이체(qm: quadruple mutant)를 포함하는 FAP-표적화된 28H1 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트, 및 항-EGFR 글리코맵을 SCID-인간 FcγRⅢ 형질감염 마우스에 신장내로 주사된 인간 신장 세포주 ACHN에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 FAP에 대해 양성인 것으로 제시되었다. 데이터로부터, 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵의 조합물이 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵 단독에 비하여 증진된 중앙 생존율에 있어서 탁월한 효능을 중재하였음을 알 수 있다(실시예 6 참조).
도 7. 용액에 존재하거나(도 7a) 또는 세포 접시에 코팅된(도 7b), IL-2[프로류킨(Proleukin)], 28H1 Fab-IL2-Fab 또는 28H1 Fab-IL2 qm-Fab와 함께 48 시간 동안 예비처리된 PBMC(E:T = 10:1, 4 시간)에 의한 K562 종양 세포 사멸의 증가. 값은 처리되지 않은 PBMC에 비하여 증가된 사멸률(%)을 나타낸다(실시예 8 참조).
도 8. 상이한 농도의 항-EGFR 글리코맵의 존재하에, 57 nM FAP-표적화된 28H1 Fab-IL2-Fab 또는 28H1 Fab-IL2 qm-Fab와 함께 45 시간 동안 예비처리되거나 되지 않은 PBMC(E:T = 10:1, 4 시간)에 의한 전체 A549 종양 세포 사멸률(실시예 8 참조).
도 9. 항-EGFR 글리코맵(도 9a) 또는 에르비툭스(Erbitux)(도 9b) 단독 물질과 함께(5 또는 500 ng/㎖) 또는 상이한 농도의 IL-2(프로류킨), 28H1 Fab-IL2-Fab 또는 28H1 Fab-IL2 qm-Fab와 조합하여 항온처리된 후의, ADCC 동안의 PBMC에 의한 IFN-γ 방출. A549 세포가 표적 세포로 사용되었다(E:T = 5:1, 21 시간; 실시예 8 참조).
도 10. 상이한 농도의 IL-2(프로류킨), 28H1 Fab-IL2-Fab 또는 28H1 Fab-IL2 qm-Fab와 함께 항온처리된 후의, A549 종양 세포의 항체-독립적 사멸 동안의 PBMC에 의한 IFN-γ 방출(E:T = 5:1, 21 시간; 실시예 8 참조).
제1 양태에서, 본 발명은 본 발명은 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병을 치료하기 위한, (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 제공한다.
본 발명은 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 치료 효과량으로 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 질병을 치료하는 방법을 제공한다.
또한 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 효과자 세포 기능을 자극하기에 효과적인 양으로 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 효과자 세포 기능을 자극하는 방법이 제공된다.
정의
용어들은, 하기에서 달리 정의되지 않는 한, 당분야에 일반적으로 사용되는 바와 같이 본원에서 사용된다.
본원에 사용될 경우, 용어 "면역컨주게이트"는 하나 이상의 효과자 구성부분 및 하나 이상의 항원 결합 구성부분을 포함하는 폴리펩타이드 분자를 지칭한다. 특정 실시태양에서, 면역컨주게이트는 하나 이상의 효과자 구성부분, 및 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함한다. 본 발명에 따른 특정 면역컨주게이트는 본질적으로 하나 이상의 결합기 서열에 의해 연결된 하나의 효과자 구성부분 및 두개의 항원 결합 구성부분으로 구성된다. 항원 결합 구성부분은 본원에 기재된 바와 같은 다양한 배치형태로 다양한 상호작용에 의해서 효과자 구성부분에 연결될 수 있다.
본원에 사용될 경우, 용어 "항원 결합 구성부분"은 항원 결정자에 특이적으로 결합된 폴리펩타이드 분자를 지칭한다. 한 실시태양에서, 항원 결합 구성부분은 이것이 표적 부위에, 예를 들면 항원 결정자를 갖는 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 스트로마(stroma)에 부착되는 실체(entity)(예를 들어 효과자 구성부분 또는 제2 항원 결합 구성부분)로 유도될 수 있다. 항원 결합 구성부분으로는 본원에 추가로 정의된 바와 같은 항체 및 이의 단편이 포함된다. 특정 항원 결합 구성부분은 중쇄 가변성 영역 및 항체 경쇄 가변성 영역을 포함하는, 항체의 항원 결합 도메인을 포함한다. 특정 실시태양에서, 항원 결합 구성부분은 본원에 추가로 정의된 바와 같고 당분야에 공지된 항체 불변성 영역을 포함할 수 있다. 유용한 중쇄 불변성 영역은 임의의 5종의 이소형(isotype)을 포함한다: α, δ, ε, γ, 또는 μ. 유용한 경쇄 불변성 영역은 임의의 2종의 이소형을 포함한다: κ 및 λ.
본원에 사용될 경우, 용어 "대조 항원 결합 구성부분"은 다른 항원 결합 구성부분 및 효과자 구성부분 없이 존재할 경우의 항원 결합 구성부분을 지칭한다. 예를 들면, 본원에 정의된 바와 같은 Fab-IL2-Fab 면역컨주게이트를 대조 항원 결합 구성부분과 비교할 경우, 대조 항원 결합 구성부분은 자유 Fab이고, 여기서 Fab-IL2-Fab 면역컨주게이트 및 자유 Fab 분자는 둘 다 동일한 항원 결정자에 특이적으로 결합될 수 있다.
본원에 사용될 경우, 용어 "항원 결정자"는 "항원" 및 "에피토프(epitope)"와 동의어이고, 항원-결합 구성부분이 결합하여 항원-결합 구성부분-항원 착체를 형성하는 폴리펩타이드 거대 분자 상의 부위(예를 들어 아미노산의 인접 연신부 또는 비인접 아미노산의 상이한 영역으로 구성된 입체배좌 배치형태)를 지칭한다. 유용한 항원 결정자는, 예를 들면, 종양 세포의 표면 위, 바이러스-감염된 세포의 표면 위, 다른 질병에 걸린 세포의 표면 위에서 발견되고, 혈청 및/또는 세포외 기질(ECM: extracellular matrix)에서는 존재하지 않는다.
"특이적으로 결합하는"은 결합이 항원에 대해 선택적이고, 원치않거나 비특이적인 상호작용으로부터 구별될 수 있음을 의미한다. 항원-결합 구성부분이 특이적 항원 결정자에 결합하는 능력은 효소-연결된 면역흡수성 검정(ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay) 또는 당분야의 숙련가에게 친숙한 다른 기법, 예를 들어 표면 플라스몬(plasmon) 공명 기법[비아코어(BIAcore) 기기 상에서 분석됨](Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적인 결합 검정(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정될 수 있다.
용어 "항-[항원] 항체" 및 "[항원]에 결합하는 항체"는 항원을 표적화하는데 있어서 항체가 진단제 및/또는 치료제로서 유용하기에 충분한 친화도를 갖고 개개의 항원에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 한 실시태양에서, 항-[항원] 항체의 비관련된 단백질로의 결합 정도는, 예를 들어, 방사면역검정(RIA: radioimmunoassay)에 의해 측정될 경우 항원에 대한 항체의 결합의 약 10% 미만이다. 특정 실시태양에서, [항원]에 결합하는 항체는 ≤ 1μΜ, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들어 10-8 M 또는 미만, 예를 들어 10-8 M to 10-13 M, 예를 들어, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수(KD)를 갖는다. 상기 정의는 항원에 결합하는 항원-결합 구성부분에 또한 적용가능한 것으로 이해된다.
본원에 사용될 경우, 항원-결합 구성부분 등과 관련하여 용어 "제1" 및 "제2"는 각각의 유형의 구성부분이 하나 보다 많이 존재하는 경우 구별의 편리를 위해 사용된다. 이들 용어의 사용은, 명백히 그러하다고 언급되지 않는 한, 면역컨주게이트의 특정 순서 또는 배향을 제공하려는 것은 아니다.
본원에 사용될 경우, 용어 "효과자 구성부분"은, 예를 들면, 신호 변환 또는 다른 신호 경로를 통해 세포 활성에 영향을 주는 폴리펩타이드, 예를 들어, 단백질 또는 당단백질을 지칭한다. 따라서, 본 발명의 효과자 구성부분은 효과자 구성부분을 위해 하나 이상의 수용체를 갖는 세포에서 반응을 조절하기 위해 세포 막 밖으로 신호를 전달하는 수용체-중재된 신호작용과 연관될 수 있다. 한 실시태양에서, 효과자 구성부분은 효과자 구성부분을 위한 하나 이상의 수용체를 갖는 세포에서 세포독성 반응을 이끌어낼 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 효과자 구성부분은 효과자 구성부분을 위한 하나 이상의 수용체를 갖는 세포에서 증식 반응을 이끌어낼 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 효과자 구성부분은 효과자 구성부분을 위한 하나 이상의 수용체를 갖는 세포에서 분화를 이끌어낼 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 효과자 구성부분은 효과자 구성부분을 위한 하나 이상의 수용체를 갖는 세포에서 내생성 세포 단백질의 발현을 변경(즉, 상향조절 또는 하향조절)할 수 있다. 효과자 구성부분의 비제한적인 예로는 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 효소, 기질, 및 보조인자가 포함된다. 효과자 구성부분은 다양한 배치형태로 항원-결합 구성부분과 회합되어 면역컨주게이트를 형성할 수 있다.
본원에 사용될 경우, 용어 "사이토킨"은 생물학적 또는 세포 기능 또는 과정(예를 들어 면역, 염증, 및 조혈작용)을 중재 및/또는 조절하는 분자를 지칭한다. 용어 "사이토킨"은 본원에 사용될 경우 "림포카인(lymphokine)", "케모카인(chemokine)", "모노카인(monokine)", 및 "인터류킨"을 포함한다. 유용한 사이토킨의 예로는, 제한되지 않지만, GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1a, MIP-1β, TGF-β, TNF-α, 및 TNF-β가 포함된다. 특별한 사이토킨은 IL-2 및 IL-12이다. 용어 "사이토킨"은 본원에 사용될 경우 상응하는 야생형 사이토킨의 아미노산 서열에서 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 사이토킨 유사체, 예컨대 예를 들면 사우베(Sauve) 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 88, 4636-40 (1991)]; 후(Hu) 등의 문헌[Blood 101, 4853-4861 (2003)] 및 미국 특허출원 공개공보 제2003/0124678호; 샤나펠트(Shanafelt) 등의 문헌[Nature Biotechnol 18, 1197-1202 (2000)]; 헤아톤(Heaton) 등의 문헌[Cancer Res 53, 2597-602 (1993)] 및 미국 특허 제5,229,109호; 미국 특허출원 공개공보 제2007/0036752호; 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/0034473호; 국제 특허출원 공개공보 WO 제2009/061853호; 또는 상기 및 하기에 기재된 IL-2 유사체가 포함됨을 의미한다.
본원에 사용될 경우, 용어 "단일-쇄"는 펩타이드 결합에 의해 선형으로 연결된 아미노산 단량체를 포함하는 분자를 지칭한다. 한 실시태양에서, 효과자 구성부분은 단일-쇄 효과자 구성부분이다. 단일-쇄 효과자 구성부분의 비제한적 예로는 사이토킨, 성장 인자, 호르몬, 효소, 기질, 및 보조인자가 포함된다. 효과자 구성부분이 사이토킨이고, 흥미로운 사이토킨이 보통 자연에서 다량체로 발견되는 경우, 다량체 사이토킨의 각각의 서브유닛은 효과자 구성부분의 단일-쇄에 의해 순차적으로 코딩된다. 따라서, 유용한 단일-쇄 효과자 구성부분의 비제한적 예로는 GM-CSF, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12, IFN-α, IFN-β, IFN-γ, MIP-1α, MIP-1β, TGF-β, TNF-a, 및 TNF-β가 포함된다.
본원에 사용될 경우, 용어 "대조 효과자 구성부분"은 컨주게이트화되지 않은 효과자 구성부분을 지칭한다. 예를 들면, 본원에 기재된 바와 같은 IL-2 면역컨주게이트를 대조 효과자 구성부분과 비교할 경우, 대조 효과자 구성부분은 자유로운, 컨주게이트화되지 않은 IL-2이다. 마찬가지로, 예를 들어, IL-12 면역컨주게이트를 대조 효과자 구성부분과 비교할 경우, 대조 효과자 구성부분은 자유로운, 컨주게이트화되지 않은 IL-12이다(예를 들어 p40 및 p35 서브유닛이 단지 디설파이드 결합(들)만을 공유하는 이종이량체 단백질로서 존재함).
본원에 사용될 경우, 용어 "효과자 구성부분 수용체"는 효과자 구성부분에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드 분자를 지칭한다. 예를 들면, IL-2가 효과자 구성부분인 경우, IL-2 분자(예를 들어 IL-2를 포함하는 면역컨주게이트)에 결합하는 효과자 구성부분 수용체는 IL-2 수용체이다. 유사하게, 예를 들어, IL-12가 면역컨주게이트의 효과자 구성부분인 경우, 효과자 구성부분 수용체는 IL-12 수용체이다. 효과자 구성부분이 하나 보다 많은 수용체에 특이적으로 결합하는 경우, 효과자 구성부분에 특이적으로 결합하는 모든 수용체는 효과자 구성부분을 위한 "효과자 구성부분 수용체"이다.
용어 "항체"는 본원에서 가장 넓은 의미로 사용되고 다양한 항체 구조를 내포하며, 제한되지 않지만, 이들이 원하는 항원-결합 활성을 나타내고 Fc 영역 또는 면역글로불린의 Fc 영역에 대등한 영역을 포함하는 한, 단일클론성 항체, 다중클론성 항체, 다중특이적 항체(예를 들어 이특이적 항체), 및 항체 단편이 포함된다.
용어 "전장 항체", "고유의 항체", 및 "전체 항체"는 본원에서 상호교환적으로 사용되어 천연의 항체 구조에 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 본원에 정의된 바와 같은 Fc 영역을 함유하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭한다.
"천연의 항체"는 다양한 구조를 갖는 천연적으로 발생한 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 천연의 IgG 항체는 디설파이드-결합된 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성된 약 150,000 달톤의 이종사량체성 당단백질이다. N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 중쇄는 가변성 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변성 도메인으로도 지칭되는 가변성 영역(VH)을 갖고, 여기에 중쇄 불변성 영역으로도 지칭되는 3개의 불변성 도메인(CHI, CH2, 및 CH3)이 수반된다. 유사하게, N-말단으로부터 C-말단까지, 각각의 경쇄는 가변성 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변성 도메인으로도 지칭되는 가변성 영역(VL)을 갖고, 여기에 경쇄 불변성 영역으로도 지칭되는 불변성 경쇄(CL) 도메인이 수반된다. 항체의 경쇄는 그의 불변성 도메인의 아미노산 서열에 기초하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 지칭되는 2가지 유형중 하나로 할당될 수 있다.
"항체 단편"은 고유의 항체가 결합되는 항원에 결합하는 고유의 항체의 일부를 포함하는 고유의 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 예로는 제한되지 않지만 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, 디아바디(diabody), 선형 항체, 단일-쇄 항체 분자(예를 들어 scFv), 단일-도메인 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체가 포함된다. 특정 항체 단편에 대해 검토하기 위해, 허드슨(Hudson) 등의 문헌[Nat Med 9, 129-134 (2003)]을 참조한다. scFv 단편에 대해 검토하기 위해, 예를 들어 플릭천(Pliickthun)의 문헌[The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)]을 참조하고; 또한 국제 특허출원 공개공보 WO 제93/16185호; 및 미국 특허 제5,571,894호 및 제5,587,458호를 참조한다. 샐비지(salvage) 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 대한 논의를 위해, 미국 특허 제5,869,046호를 참조한다. 디아바디는 2가 또는 2특이적일 수 있는 2개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 예를 들면, EP 제404,097호; 국제 특허출원 공개공보 WO 제1993/01161호; 허드슨 등의 문헌[Nat Med 9, 129-134 (2003)]; 및 홀린거(Hollinger) 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993)]을 참조한다. 트라이바디(triabody) 및 테트라바디(tetrabody)는 또한 허드슨 등의 문헌[Nat Med 9, 129-134 (2003)]에 기재되어 있다. 단일-도메인 항체는 항체의 중쇄 가변성 도메인의 전부 또는 일부, 또는 경쇄 가변성 도메인의 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 특정 실시태양에서, 단일-도메인 항체는 인간 단일-도메인 항체이다[미국 매사추세츠주 왈탐 소재의 도만티스 인코포레이티드(Domantis, Inc.); 예를 들어 미국 특허 제6,248,516 B1호 참조]. 항체 단편은, 본원에 기재된 바와 같이, 제한되지 않지만 고유의 항체의 단백질분해적 분해, 뿐만 아니라 재조합 숙주 세포[예를 들어 이. 콜라이(E. coli) 또는 파아지]에 의한 생산을 비롯한 다양한 기법에 의해 제조될 수 있다.
용어 "항원 결합 도메인"은 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하고 이에 상보성인 영역을 포함하는 항체의 일부를 지칭한다. 항원 결합 도메인은, 예를 들면, 하나 이상의 항체 가변성 도메인(소위 항체 가변성 영역)에 의해 제공될 수 있다. 특별히, 항원 결합 도메인은 항체 경쇄 가변성 영역(VL) 및 항체 중쇄 가변성 영역(VH)을 포함한다.
용어 "가변성 영역" 또는 "가변성 도메인"은 항원으로의 항체의 결합에 관여되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 천연의 항체의 중쇄 및 경쇄(각각 VH 및 VL)의 가변성 도메인은 일반적으로 유사한 구조를 갖고, 각각의 도메인은 4개의 보존된 골격구조 영역(FR: framework region) 및 3개의 과가변성 영역(HVR)을 포함한다. 예를 들어, 킨드트(Kindt) 등의 문헌[Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)]을 참조한다. 단일 VH 또는 VL 도메인은 항원-결합 특이성을 부여하기에 충분할 수 있다.
용어 "과가변성 영역" 또는 "HVR"은, 본원에 사용될 경우, 서열에서 과가변성이고/이거나 구조적으로 한정된 루우프(loop)("과가변성 루우프")를 형성하는 항체 가변성 도메인의 각각의 영역을 지칭한다. 일반적으로, 천연의 4개 쇄의 항체는 6개의 HVR을 포함한다; 3개는 VH(H1, H2, H3)에 존재하고, 3개는 VL(LI, L2, L3)에 존재한다. HVR은 일반적으로 과가변성 루우프로부터 및/또는 상보성 결정 영역(CDR: complementarity determining region)으로부터의 아미노산 잔기를 포함하고, 후자는 가장 높은 서열 가변성을 갖고/갖거나 항원 인식에 관여된다. VH에서의 CDR1을 제외하고, CDR은 일반적으로 과가변성 루우프를 형성하는 아미노산 잔기를 포함한다. 과가변성 영역(HVR)은 또한 "상보성 결정 영역"(CDR)으로 지칭되고, 이들 용어는 본원에서 항원 결합 영역을 형성하는 가변성 영역의 일부에 관하여 상호교환적으로 사용된다. 이러한 특정 영역이 카밧(Kabat) 등[U.S. Dept. of Health and Human Services, Sequences of Proteins of Immunological Interest (1983)] 및 코티아(Chothia) 등[J Mol Biol 196:901-917 (1987)]에 의해 기재되어 있고, 여기서 정의는 서로에 대해 비교될 경우 아미노산 잔기의 중첩부 또는 부분집합을 포함한다. 그럼에도 불구하고, 항체 또는 이의 변형체의 CDR을 지칭하기 위한 정의의 적용은 본원에 정의되고 사용되는 바와 같은 범주내에 속하도록 의도된다. 상기 인용된 문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 내포하는 적절한 아미노산 잔기는 비교를 위해 하기 표 1에 제시되어 있다. 특정 CDR을 내포하는 정확한 잔기 수는 CDR의 서열 및 크기에 따라 달라질 것이다. 당분야의 숙련가라면 어느 잔기가 항체의 가변성 영역 아미노산 서열에 제공된 특정 CDR을 포함하는지를 관례대로 결정할 수 있다.
CDR 정의1
CDR 카밧 코티아 AbM 2
VH CDR1 31-35 26-32 26-35
VH CDR2 50-65 52-58 50-58
VH CDR3 95-102 95-102 95-102
VL CDR1 24-34 26-32 24-34
VL CDR2 50-56 50-52 50-56
VL CDR3 89-97 91-96 89-97
1표 1에서 모든 CDR 정의의 번호매김은 카밧 등에 의해 제시된 번호매김 관례에 따른다(이하 참조).
2표 1에서 사용될 경우 소문자 "b"를 갖는 "AbM"은 옥스포드 몰레큘러(Oxford Molecular)의 "AbM" 항체 모델링 소프트웨어에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 지칭한다.
카밧 등은 또한 임의의 항체에 적용가능한 가변성 영역 서열에 대해 번호매김 체계를 규정하였다. 당분야의 숙련가라면, 서열 자체 그 이상의 임의의 실험적 데이터에 의존하지 않고, "카밧 번호매김"의 이러한 체계를 임의의 가변성 영역 서열에 명확히 할당할 수 있다. 본원에 사용될 경우, "카밧 번호매김"은 카밧[U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983)]에 의해 제시된 번호매김 체계를 지칭한다. 별도로 특정화되지 않는 한, 항체 가변성 영역중의 특정 아미노산 잔기 위치의 번호매김에 대한 언급은 카밧 번호매김 체계를 따른다.
서열 목록의 폴리펩타이드 서열(즉, 서열 번호 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 등)은 카밧 번호매김 체계에 따라 번호가 붙혀지지 않는다. 그러나, 서열 목록의 서열의 번호매김을 카밧 번호매김으로 전환시키는 것은 당분야의 통상의 기술에 속한다.
"골격구조" 또는 "FR"은 과가변성 영역(HVR) 잔기 이외의 가변성 도메인 잔기를 지칭한다. 가변성 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3, 및 FR4로 구성된다. 따라서, HVR 및 FR 서열은 일반적으로 VH(또는 VL)로 하기 서열로 나타난다: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.
항체의 "부류"는 그의 중쇄에 의해 소유된 불변성 도메인 또는 불변성 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류인 IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM이 존재하고, 이들중 몇몇은 하위부류(이소형), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, 및 IgA2로 추가로 나눠진다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변성 도메인은 각각 α, δ, ε, γ, 및 μ으로 일컬어 진다.
용어 "Fc 영역"은 본원에서 불변성 영역의 적어도 일부를 포함하는 면역글로불린 중쇄의 C-말단 영역을 정의하기 위해 사용된다. 이 용어는 천연의 서열 Fc 영역 및 변형 Fc 영역을 포함한다. IgG 중쇄의 Fc 영역의 경계가 약간 다를수 있지만, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 대체적으로 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 중쇄의 카복실-말단으로 연장되는 것으로 규정된다. 그러나, Fc 영역의 C-말단 라이신(Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 본원에 달리 특정화되지 않는 한, Fc 영역 또는 불변성 영역에서의 아미노산 잔기의 번호매김은, 카밧 등의 문헌[Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991]에 기재된 바와 같은, EU 지표로도 일컬어 지는 EU 번호매김 체계에 따른다.
"면역글로불린의 Fc 영역에 대등한 영역"은 면역글로불린의 Fc 영역의 천연 발생 대립형질 변형체, 뿐만 아니라 치환, 부가 또는 결실을 생성하지만 효과자 기능(예컨대 항체-의존성 세포-중재된 세포독성)을 중재하는 면역글로불린의 능력을 실질적으로 감소시키지 않도록 변경된 변형체를 포함하고자 한다. 예를 들면, 하나 이상의 아미노산은, 생물학적 기능의 실질적인 손실없이, 면역글로불린의 Fc 영역의 N-말단 또는 C-말단으로부터 결실된다. 이러한 변형체는 활성에 최소한의 영향을 가질 수 있도록 당분야에 공지된 일반적인 규칙에 따라 선택될 수 있다(예를 들어, 보위(Bowie) 등의 문헌[Science 247, 1306-10 (1990)] 참조).
항체에 관하여 사용될 경우, 용어 "효과자 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인할 수 있는 생물학적 활성을 지칭하고, 이는 항체 이소형에 따라 달라진다. 항체 효과자 기능의 예로는: Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC), Fc 수용체 결합, 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC), 항체-의존성 세포 식세포 작용(ADCP), 사이토킨 분비, 항원 제공 세포에 의한 면역 착체-중재된 항원 수용, 세포 표면 수용체(예를 들어 B 세포 수용체)의 하향 조절, 및 B 세포 활성화가 포함된다.
본원에 사용될 경우, 용어 "효과자 세포"는 효과자 구성부분 수용체, 예를 들어 사이토킨 수용체, 및/또는 Fc 수용체를 이들의 표면 상에 나타내고(이를 통해 이들은 효과자 구성부분, 예를 들어 사이토킨, 및/또는 항체의 Fc 영역에 결합함) 표적 세포, 예를 들어 종양 세포의 파괴에 기여하는 림프구의 집단을 지칭한다. 효과자 세포는 예를 들면 세포독성 또는 식세포 효과를 중재할 수 있다. 효과자 세포로는, 제한되지 않지만, 효과자 T 세포, 예컨대 CD8+세포독성 T 세포, CD4+ 헬퍼(helper) T 세포, γδ T 세포, NK 세포, 림포카인-활성화된 킬러(LAK: lymphokine-activated killer) 세포 및 대식세포/단세포가 포함된다. 이들의 수용체 발현 패턴에 따라서, 효과자 세포의 다음과 같은 상이한 하위 집단이 존재한다: 즉 (a) 특정 효과자 구성부분을 위한 수용체를 발현하지만 Fc 수용체를 발현하지 않고, 본 발명의 항체가 아니라 면역컨주게이트에 의해 자극되는 세포(예를 들어 T 세포, IL-2 수용체를 발현함); (b) Fc 수용체를 발현하지만 특정 효과자 구성부분을 위한 수용체를 발현하지 않고, 본 발명의 면역컨주게이트가 아니라 항체에 의해 자극되는 세포; 및 (c) Fc 수용체 및 특정 효과자 구성부분을 위한 수용체 둘다를 발현하고, 항체 및 본 발명의 면역컨주게이트에 의해 동시적으로 자극되는 세포(예를 들어 NK 세포, FcγⅢ 수용체 및 IL-2 수용체를 발현함).
본원에 사용될 경우, 용어 "조작하다, 조작된, 조작"은, 펩타이드 주쇄의 임의의 조작처리, 또는 천연 발생 또는 재조합 폴리펩타이드 또는 이의 단편의 번역후 개질을 포함하는 것으로 고려된다. 조작으로는 아미노산 서열, 글리코실화 패턴, 또는 개별 아미노산의 측쇄 기의 개질, 뿐만 아니라 이러한 시도의 조합이 포함된다. 특별히 "글리코-"라는 접두어와 함께의 "조작"은, 뿐만 아니라 용어 "글리코실화 조작"은, 세포에서 발현되는 당백질의 변경된 글리코실화를 달성하기 위해 올리고당 합성 경로의 유전자적 조작처리를 비롯한, 세포의 글리코실화 절차의 대사적 조작을 포함한다. 게다가, 글리코실화 조작은 돌연변이 및 세포 환경이 글리코실화에 미치는 영향을 포함한다. 한 실시태양에서, 글리코실화 조작은 글리코실전이효소 활성에서의 변경이다. 하나의 특별한 실시태양에서, 조작에 의해 글루코사미닐전이효소 활성 및/또는 푸코실전이효소 활성이 변경된다. 글리코실화 조작은 "증가된 GnTⅢ 활성을 갖는 숙주 세포"(예를 들어 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 Ⅲ(GnTⅢ) 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 증가된 수준으로 발현하도록 조작처리된 숙주 세포), "증가된 ManⅡ 활성을 갖는 숙주 세포"(예를 들어 α-만노시다아제 Ⅱ (ManⅡ) 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 증가된 수준으로 발현하도록 조작처리된 숙주 세포), 또는 "감소된 α(1,6) 푸코실전이효소 활성을 갖는 숙주 세포"(예를 들어 α(1,6) 푸코실전이효소를 감소된 수준으로 발현하도록 조작처리된 숙주 세포)를 수득하기 위해 사용될 수 있다.
용어 "아미노산 돌연변이"는 본원에 사용될 경우 아미노산 치환, 결실, 삽입, 및 개질을 내포함을 의미한다. 치환, 결실, 삽입 및 개질의 임의의 조합이 최종 작성물에 나타나도록 이루어질 수 있지만, 단 최종 작성물은 원하는 특징, 예를 들어, Fc 수용체로의 감소된 결합을 소유해야 한다. 아미노산 서열 결실 및 삽입으로는 아미노산의 아미노- 및/또는 카복시-말단 결실 및 삽입이 포함된다. 특정 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 예를 들어 Fc 영역의 결합 특징을 변경할 목적으로, 비-보존적 아미노산 치환, 즉 하나의 아미노산이 상이한 구조 및/또는 화학적 특징을 갖는 또 다른 아미노산으로 대체됨이 특별히 바람직하다. 아미노산 치환은 20개의 표준 아미노산의 비천연 발생 아미노산 또는 천연 발생 아미노산 유도체에 의한 대체를 포함한다(예를 들어 4-하이드록시프롤린, 3-메틸히스티딘, 오르니틴, 호모세린, 5-하이드록시라이신). 아미노산 돌연변이는 당분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법에 의해 생성될 수 있다. 유전적 방법은 부위-지향성(site-directed) 돌연변이발생, PCR, 유전자 합성 등을 포함할 수 있다. 유전자 조작 이외의 방법, 예컨대 화학적 개질에 의한 아미노산의 측쇄 기를 변경시키는 방법이 또한 유용할 수 있는 것으로 고려된다.
기준 폴리펩타이드 서열과 관련된 "아미노산 서열 동일성 퍼센트(%)"는, 필요할 경우, 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하기 위해 서열을 정렬하고 갭(gap)을 도입한 후, 서열 동일성의 일부로서 임의의 보존적 치환을 고려하지 않고, 기준 폴리펩타이드 서열중의 아미노산 잔기와 동일한 후보 서열중의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다. 아미노산 서열 동일성 퍼센트를 결정하기 위한 정렬은 당분야의 기술에 속하는 다양한 방식으로, 예를 들어 공개적으로 입수가능한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 메그얼라인(Megalign)(DNASTAR) 소프트웨어를 사용하여 달성될 수 있다. 당분야의 숙련가라면, 비교되는 서열의 전장에 대하여 최대 정렬을 달성하기 위해 요구되는 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열 정렬을 위한 적절한 매개변수를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적을 위해, 아미노산 서열 동일성% 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 사용하여 생성된다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제네테크 인코포레이티드(Genentech, Inc.)에 의해 제조되고, 원시 코드(source code)는 사용자 기록문서와 함께 워싱턴 디씨 20559 소재의 미국 저작권 사무소(Copyright Office)에 보관되어 있고, 여기서 이는 미국 저작권 등록 번호 제TXU510087호하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 미국 캘리포니아주 사우쓰 샌 프란시스코 소재의 제네테크 인코포레이티드로부터 공개적으로 입수가능하거나, 또는 원시 코드로부터 컴파일링될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은, 디지털 UNIX V4.0D를 비롯하여, UNIX 작동 시스템 상에서 사용하기 위해 컴파일링되어야 한다. 모든 서열 비교 매개변수는 ALIGN-2 프로그램에 의해 설정되고, 달라지지 않는다. ALIGN-2가 아미노산 서열 비교를 위해 이용되는 상황에서, 소정의 아미노산 서열 B로의, B와의, 또는 B에 대한 소정의 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성%(이는 다르게는 소정의 아미노산 서열 B로의, B와의 또는 B에 대한 특정한 아미노산 서열 동일성%을 갖거나 포함한 소정의 아미노산 서열 A로서도 표현됨)은 다음과 같이 계산된다:
X/Y 분율×100
여기서, X는 A 및 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2와의 동일한 부합성으로서 획득된 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서의 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 동일하지 않은 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성%은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성과 동일하지 않을 것임을 이해할 것이다. 달리 특별히 언급되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 아미노산 서열 동일성% 값은 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 사용하여 바로 앞 문단에서 기재된 바와 같이 수득된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주", 및 "숙주 세포 배양액"은 상호교환적으로 사용되고, 외래성 핵산이 도입되는 세포를 지칭하고, 이러한 세포의 자손을 포함한다. 숙주 세포는 "형질변환체" 및 "형질변환된 세포"를 포함하고, 이는 1차 형질변환된 세포 및 계대배양 수와 무관하게 이로부터 유도된 자손을 포함한다. 자손은 모 세포와 핵산 함량 면에서 완전히 동일하지 않지만, 돌연변이를 포함할 수 있다. 고유적으로 형질변환된 세포에서 선별되거나 선택될 경우 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다. 숙주 세포는 본 발명을 위해 사용된 항체 및 면역컨주게이트를 생성하기 위해 사용될 수 있는 임의의 유형의 세포 시스템이다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 개질된 올리고당을 갖는 항체의 생산을 허용하도록 조작된다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 Ⅲ(GnTⅢ) 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 증가된 수준으로 발현하도록 조작처리되었다. 특정 실시태양에서 숙주 세포는 α-만노시다아제 Ⅱ (ManⅡ) 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩타이드를 증가된 수준으로 발현하도록 추가로 조작처리되었다. 숙주 세포로는 배양된 세포, 예로서 몇 개만 들자면, 포유동물 배양된 세포, 예컨대 CHO 세포, BHK 세포, NSO 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마(hybridoma) 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 및 식물 세포, 뿐만 아니라 형질감염 동물, 형질감염 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포가 포함된다.
본원에 사용될 경우, 용어 "GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩타이드"는 β-1,4 결합에서의 N-아세틸글루코사민(GlcNAc) 잔기가 N-연결된 올리고당의 트리만노실 코어의 β-연결된 만노사이드로 부가되는 것을 촉매화할 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이는, 투약량 의존성의 존재 또는 부재하에, 특정 생물학적 검정으로 측정될 경우, 생화학 및 분자 생물학의 국제 연맹 품목분류위원회(NC-IUBMB: Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology)에 따라, β-1,4-만노실-당단백질 4-베타-N-아세틸글루코사미닐-전이효소(EC 2.4.1.144)로도 공지된, β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 Ⅲ의 활성과 유사하지만 반드시 동일할 필요는 없는 효소 활성을 나타내는 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 투약량 의존성이 존재하는 경우에, 이는 GnTⅢ과 동일할 필요는 없고, GnTⅢ과 비교하여 소정의 활성에서의 투약량-의존성에 실질적으로 유사하다(즉, 후보 폴리펩타이드는 GnTⅢ에 비하여 더 큰 활성을 나타내거나, 또는 많아야 약 25배 미만, 바람직하게는, 많아야 약 10배 미만의 활성, 및 가장 바람직하게는, 많아야 약 3배 미만의 활성을 나타낸다). 특정 실시태양에서 GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩타이드는 GnTⅢ의 촉매 도메인 및 이종성 골지(Golgi) 거주 폴리펩타이드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 특별히, 골지 편재화 도메인은 만노시다아제 Ⅱ 또는 GnTI의 편재화 도메인, 가장 특별히 만노시다아제 Ⅱ의 편재화 도메인이다. 다르게는, 골지 편재화 도메인은 만노시다아제 I의 편재화 도메인, GnTⅡ의 편재화 도메인, 및 α1,6 코어 푸코실전이효소의 편재화 도메인으로 구성된 군에서 선택된다. 이러한 융합 폴리펩타이드를 생성하는 방법 및 증가된 효과자 기능을 갖는 항체를 제조하기 위해 이들을 사용하는 방법은 국제 특허출원 공개공보 제WO2004/065540호, 미국 가특허 출원 제60/495,142호 및 미국 특허 출원 공개공보 제2004/0241817호에 개시되어 있고, 이의 전체 내용은 명백히 본원에 참고로 인용된다.
본원에 사용될 경우, 용어 "골지 편재화 도메인"은 골지 착체내의 위치로 폴리펩타이드를 고정시키는데 책임이 있는 골지 거주 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 지칭한다. 일반적으로, 편재화 도메인은 효소의 아미노산 말단 "테일(tail)"을 포함한다.
본원에 사용될 경우, 용어 "ManⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드"는 N-연결된 올리고당의 분지화된 GlcNAcMan5GlcNAc2 만노스 중간체에서 말단 1,3- 및 1,6-연결된 α-D-만노스 잔기의 가수분해를 촉매화할 수 있는 폴리펩타이드를 지칭한다. 이는, 생화학 및 분자 생물학의 국제 연맹 품목분류위원회(NC-IUBMB)에 따라, 만노실 올리고당 1,3-1,6-α-만노시다아제 Ⅱ(EC 3.2.1.114)로서도 공지된 골지 α-만노시다아제 Ⅱ와 유사하지만 동일할 필요는 없는 효소 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 포함한다.
"활성화 Fc 수용체"는 항체의 Fc 영역과의 이후의 맞물림이 효과자 기능을 수행하기 위해 수용체-함유 세포를 자극하는 신호작용을 이끌어 내는 Fc 수용체이다. 활성화 Fc 수용체로는 FcγⅢa(CD16a), FcγRI(CD64), FcγRⅡa(CD32), 및 FcaRI(CD89)가 포함된다.
항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC)은 면역 효과자 세포에 의한 항체-코팅된 표적 세포의 용해를 유도하는 면역 기작이다. 표적 세포는 Fc 영역을 포함하는 항체 또는 이의 단편이, 일반적으로 Fc 영역에 N-말단인 단백질 부분을 통해 특이적으로 결합하는 세포이다. 본원에 사용될 경우, 용어 "증가된 ADCC"는 상기 정의된 ADCC의 기작에 의해, 소정의 시간에서 표적 세포를 둘러싸는 매질중에서 항체의 소정의 농도에서의 용해된 표적 세포 수의 증가, 및/또는 ADCC의 기작에 의해, 소정의 시간에서 표적 세포의 소정의 수의 용해를 달성하기 위해 필요한 표적 세포를 둘러싼 매질에서의 항체 농도의 감소로 정의된다. ADCC의 증가는, 동일한 표준 제조, 정제, 배합 및 저장 방법(이는 당분야의 숙련가에게 공지됨)을 사용하지만, 조작되지 않은, 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 중재된 ADCC에 관련된다. 예를 들면 본원에 기재된 방법에 의해 글리코실화의 변경된 패턴을 갖도록(예를 들어 글리코실전이효소, GnTⅢ, 또는 다른 글리코실전이효소를 발현하도록) 조작된 숙주 세포에 의해 생성된 항체에 의해 중재된 ADCC의 증가는 동일한 유형의 조작되지 않은 숙주 세포에 의해 생성된 동일한 항체에 의해 중재된 ADCC에 관련된다.
"증가된 항체 의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC)을 갖는 항체"는 당분야의 숙련가에게 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 결정될 경우 증가된 ADCC를 갖는 항체를 의미한다. 하나의 허용된 시험관내 ADCC 검정은 다음과 같다:
1) 검정은 항체의 항원-결합 영역에 의해 인식된 표적 항원을 발현하는 것으로 공지된 표적 세포를 사용한다;
2) 검정은, 효과자 세포로서, 무작위로 선택된 건강한 공여자의 혈액으로부터 단리된 인간 말초 혈액 단핵 세포(PBMC: peripheral blood mononuclear cell)를 사용한다;
3) 검정은 하기 프로토콜에 따라 수행된다:
i) 표준 밀도 원심분리 절차를 사용하여 PBMC를 단리하고 RPMI 세포 배양 배지중에 5×106 세포/㎖로 현탁시킨다;
ii) 표적 세포를 표준 조직 배양 방법에 의해 성장시키고, 90% 초과의 생존 능력을 갖는 지수 성장 상으로부터 수확하고, RPMI 세포 배양 배지에서 세척하고, 100 마이크로-큐리(micro-Curie)의 51Cr로 표지화하고, 세포 배양 배지로 2회 세척하고, 105 세포/㎖ 밀도로 세포 배양 배지에 현탁시킨다;
iii) 100 마이크로리터의 상기 최종 표적 세포 현탁액을 각각의 96-웰 미세적정 플레이트(96-well microtiter plate)의 각각의 웰에 옮긴다;
iv) 항체를 세포 배양 배지중 4000 ng/㎖에서 0.04 ng/㎖으로 연속적으로 희석하고, 50 마이크로리터의 생성된 항체 용액을 96-웰 미세적정 플레이트중의 표적 세포에 첨가하여, 상기 전체 농도 범위를 커버하는 다양한 항체 농도를 3중으로 시험한다;
v) 최대 방출(MR: maximum release) 대조군의 경우, 표지된 표적 세포가 함유된 플레이트중 3개의 추가의 웰은 항체 용액(상기 iv 지점) 대신에 비이온성 세정액의 50 마이크로리터의 2%(부피/부피) 수성 용액을 수용한다;
vi) 자발적 방출(SR: spontaneous release) 대조군의 경우, 표지된 표적 세포가 함유된 플레이트중 3개의 추가의 웰은 항체 용액(상기 iv 지점) 대신에 50 마이크로리터의 RPMI 세포 배양 배지를 수용한다;
vii) 이어서 96-웰 미세적정 플레이트를 50×g에서 1분 동안 원심분리하고 1 시간 동안 4℃에서 항온처리한다;
viii) 50 마이크로리터의 PBMC 현탁액(상기 i 지점)을 각각의 웰에 첨가하여 25:1의 효과자:표적 세포 비율을 수득하고, 플레이트를 5% C02 분위기 하에 37℃에서 인큐베이터 내에 4 시간 동안 넣어둔다;
ix) 각각의 웰로부터의 세포-부재 상청액을 수거하고, 실험적으로 방출된 방사능(ER)을 감마 계수기에 의해 정량화한다;
x) 특정 용해물의 백분율을 각각의 항체 농도에 대해 식 (ER-MR)/(MR-SR)×100에 따라 계산한다: 여기서 ER은 항체 농도에 대해 정량화된 평균 방사능(상기 ix 지점 참조)이고, MR은 MR 대조군(상기 v 지점 참조)에 대해 정량화된 평균 방사능(상기 ix 지점 참조)이고, SR은 SR 대조군(상기 vi 지점 참조)에 대해 정량화된 평균 방사능(상기 ix 지점 참조)이다;
4) "증가된 ADCC"는 상기 시험된 항체 농도 범위내에서 관찰된 특정 용해물의 최대 백분율의 증가, 및/또는 상기 시험된 항체 농도 범위 내에서 관찰된 특정 용해물의 최대 백분율의 반을 달성하는데 필요한 항체 농도의 감소로 정의된다. ADCC에서의 증가는, 상기 검정에 의해 측정되고, 동일한 항체에 의해 중재되며, 동일한 표준 생산, 정제, 배합 및 저장 방법(이는 당분야의 숙련가에게 공지됨)을 사용하지만 조작되지 않은 동일한 유형의 숙주 세포에 의해 생산되는 ADCC와 관련된다.
본원에 사용될 경우, "조합"(이의 문법적인 변형어, 예컨대 "조합하다" 또는 "조합하는")은 본 발명에 따른 면역컨주게이트 및 항체의 조합을 내포하고, 여기서 면역컨주게이트 및 항체는 동일하거나 상이한 용기에, 동일하거나 상이한 약학 제형에 존재하고, 함께 또는 별도로, 동시에 또는 연속적으로, 임의의 순서로 투여되고, 동일하거나 상이한 경로로 투여되지만, 단 면역컨주게이트 및 항체는 신체에서 이들의 생물학적 효과를 동시적으로 부여할 수 있어야, 즉 동시적으로 효과자 세포를 자극할 수 있어야 한다. 예를 들면 본 발명에 따른 면역컨주게이트 및 항체를 "조합함"은 특정 약학 제형중의 면역컨주게이트를 우선 투여하고, 이후 또 다른 약학 제형중의 항체를 투여하거나, 이와 반대임을 포함한다.
제제의 "효과량"은 이것이 투여되는 세포 또는 조직에서 생리학적 변화를 일으키는데 필요한 양을 지칭한다.
예를 들어 약학 조성물의 "치료 효과량"은 원하는 치료 또는 예방 결과를 달성하기 위해 필요한 시간 기간 동안 및 투여량에서의 효과적인 양을 지칭한다. 제제의 치료 효과량은, 예를 들면 질병의 나쁜 영향을 제거, 감소, 지연, 최소화 또는 예방한다. 몇몇 활성 구성성분들의 조합물의 치료 효과량은 각각의 활성 구성성분들의 치료 효과량일 수 있다. 다르게는, 치료에 의해 야기되는 부작용을 감소시키기 위해, 몇몇 활성 구성성분들의 조합물의 치료 효과량은 부가적, 또는 초부가적(superadditive) 또는 상승적 효과를 생성하기에 효과적이고, 조합물에서 치료 효과적이지만 활성 구성성분들이 단독으로 사용될 경우 이들중 하나 또는 몇몇의 치료 아래의 양일 수 있는 개별 활성 구성성분들의 양일 수 있다.
"개체" 또는 "피험체"는 포유동물이다. 포유동물로는, 제한되지 않지만, 가축(예를 들어 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류(예를 들어 인간 및 인간 이외의 영장류, 예컨대 원숭이), 토끼 및 설치류(예를 들어 마우스 및 래트)가 포함된다. 특별히, 개체 또는 피험체는 인간이다.
용어 "약학 조성물"은 포함된 활성 구성성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 형태이고, 제형이 투여되는 피험체에 허용되지 않도록 독성인 추가의 성분을 함유하지 않는 제조물을 지칭한다.
"약학적으로 허용가능함 담체"는 피험체에 무독성인 활성 구성성분 이외의 약학 제형중의 활성구성성분을 지칭한다. 약학적으로 허용가능함 담체로는, 제한되지 않지만, 완충액, 부형제, 안정화제 또는 보존제가 포함된다.
본원에 사용될 경우, "치료"(및 이의 문법적인 변형어, 예컨대 "치료하다" 또는 "치료하는")는 치료될 개체에서 질병의 자연적 과정을 변경시키는 시도에 있어서의 임상적 개입을 지칭하고, 임상적 병리 과정 동안 또는 예방을 위해 수행될 수 있다. 요망되는 치료 효과로는, 제한되지 않지만, 질병의 발생 또는 재발의 방지, 증후의 경감, 질병의 임의의 직접적 또는 간접적인 병리학적 결과의 감소, 전이의 방지, 질병 진행 속도의 감소, 질병 상태의 개선 또는 일시적 억제, 및 경감 또는 개선된 예후가 포함된다. 몇몇 실시태양에서, 발명의 조합물은 질병의 전개를 지연시키거나 질병의 진행을 둔화시키기 위해 사용된다.
용어 "패키지 삽입물"은, 이러한 치료 생성물의 사용에 관한 지시, 용법, 투여량, 투여법, 조합 치료, 금기 및/또는 경고에 대한 정보를 함유하는, 치료 생성물의 상업적 패키지에 관습적으로 포함된 지침서를 지칭하기 위해 사용된다.
면역컨주게이트
본 발명에서 유용한 면역컨주게이트는 하나 이상의 효과자 구성부분 및 하나 이상의 항원-결합 구성부분을 포함하는 폴리펩타이드 분자이다.
면역컨주게이트는, 효과자 구성부분을 항원-결합 구성부분에 화학적으로 컨주게이트화함으로써, 또는 효과자 구성부분 및 항원-결합 구성부분을 융합 단백질로서 발현시킴으로써 제조될 수 있다(예를 들어 나카무라(Nakamura) 및 쿠보(Kubo)의 문헌[Cancer 80, 2650-2655 (1997)]; 및 베커(Becker) 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 93, 7826-7831 (1996)] 참조). 본 발명에서 사용하기 위하여, 융합 단백질로서 발현된 면역컨주게이트가 일반적으로 바람직하다. 따라서, 특정 실시태양에서 효과자 구성부분은 아미노- 또는 카복시-말단 펩타이드 결합을 항원-결합 구성부분과 공유한다(즉, 면역컨주게이트는 융합 단백질이다). 이러한 면역컨주게이트에서, 효과자 구성부분은 예를 들면 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄에 융합될 수 있다. 항체 단편, 예컨대 Fab 또는 scFv 분자를 항원 결합 구성부분으로서 포함하는 면역컨주게이트가 본 발명에서 특별히 유용하다. 예시적인 항체 단편/사이토킨 면역컨주게이트는, 예를 들어 세비지(Savage) 등의 문헌[Br J Cancer 67, 304-310 (1993)]; 양(Yang) 등의 문헌[Mol. Immunol. 32, 873-881 (1995)]; PCT 국제 특허출원 공개공보 WO 제2001/062298 A2호; 미국 특허 제5,650,150호; PCT 국제 특허출원 공개공보 WO 제2006/119897 A2호; 및 PCT 국제 특허출원 공개공보 WO 제99/29732 A2호에 기재되어 있다.
한 실시태양에서, 효과자 구성부분은 단일-쇄 효과자 구성부분이다. 한 실시태양에서 효과자 구성부분은 사이토킨이다. 한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 둘 이상의 항원-결합 구성부분을 포함한다. 면역컨주게이트의 효과자 구성부분 및 항원-결합 구성부분은 상기 및 하기 본원에 상세히 기재된 것들을 포함한다. 면역컨주게이트의 항원-결합 구성부분은 다양한 표적 분자(예를 들어 종양 세포 또는 종양 스트로마 상에서 발현되는 단백질 분자 상의 항원 결정자)에 대해 유도될 수 있다. 항원 결합 구성부분의 비제한적 예가 본원에 기재된다. 본원에 기재된 바와 같은 특별히 유용한 면역컨주게이트는 전형적으로 하나 이상의 하기 특성을 나타낸다: 특별히, 동일한 항원 결정자를 표적화하고 동일한 효과자 구성부분을 갖는 상이한 배치형태의 면역컨주게이트에 비하여, 작용의 높은 특이성, 감소된 독성 및/또는 개선된 안정성. 본 발명에 사용하기 위한 특정 면역컨주게이트는 추가로 PCT 국제 특허출원 공개공보 WO 제2011/020783호에 기재되어 있고, 이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용된다.
면역컨주게이트 포맷
PCT 국제 특허출원 공개공보 WO 제2011/020783호에 기재된 면역컨주게이트는 둘 이상의 항원 결합 도메인을 포함한다. 이와 같이, 한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 적어도 제1 효과자 구성부분 및 적어도 제1 및 제2 항원 결합 구성부분을 포함한다. 한 실시태양에서, 제1 효과자 구성부분은 단일 쇄 효과자 구성부분이다. 한 실시태양에서, 제1 및 제2 항원 결합 구성부분은 독립적으로 scFv 분자 및 Fab 분자로 구성된 군에서 선택된다. 하나의 특별한 실시태양에서 각각의 제1 및 제2 항원-결합 구성부분은 Fab 분자이다. 또 다른 실시태양에서 각각의 제1 및 제2 항원-결합 구성부분은 scFv 분자이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 제1 효과자 구성부분은 아미노- 또는 카복시-말단 펩타이드 결합을 제1 항원 결합 구성부분과 공유하고, 제2 항원 결합 구성부분은 아미노- 또는 카복시-말단 펩타이드 결합을 i) 제1 효과자 구성부분 또는 ii) 제1 항원 결합 구성부분과 공유한다. 하나의 특별한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 본질적으로 제1 단일-쇄 효과자 구성부분, 및 제1 및 제2 항원 결합 구성부분으로 구성된다. 더욱 더 특별한 실시태양에서, 각각의 제1 및 제2 항원-결합 구성부분은 Fab 분자이다.
한 실시태양에서, 제1 효과자 구성부분은 카복시-말단 펩타이드 결합을 제1 항원 결합 구성부분과 공유하고, 추가로 아미노-말단 펩타이드 결합을 제2 항원 결합 구성부분과 공유한다. 또 다른 실시태양에서, 제1 항원 결합 구성부분은 카복시-말단 펩타이드 결합을 제1 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분과 공유하고, 추가로 아미노-말단 펩타이드 결합을 제2 항원 결합 구성부분과 공유한다. 또 다른 실시태양에서, 제1 항원 결합 구성부분은 아미노-말단 펩타이드 결합을 제1 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분과 공유하고, 추가로 카복시-말단 펩타이드를 제2 항원 결합 구성부분과 공유한다.
한 실시태양에서, 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분은 카복시-말단 펩타이드 결합을 제1 중쇄 가변성 영역과 공유하고, 추가로 아미노-말단 펩타이드 결합을 제2 중쇄 가변성 영역과 공유한다. 또 다른 실시태양에서, 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분은 카복시-말단 펩타이드 결합을 제1 경쇄 가변성 영역과 공유하고, 추가로 아미노-말단 펩타이드를 제2 경쇄 가변성 영역과 공유한다. 또 다른 실시태양에서, 제1 중쇄 또는 경쇄 가변성 영역은 카복시-말단 펩타이드 결합에 의해 제1 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분에 연결되고, 추가로 아미노-말단 펩타이드 결합에 의해 제2 중쇄 또는 경쇄 가변성 영역에 연결된다. 또 다른 실시태양에서, 제1 중쇄 또는 경쇄 가변성 영역은 아미노-말단 펩타이드 결합에 의해 제1 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분에 연결되고, 추가로 카복시-말단 펩타이드 결합에 의해 제2 중쇄 또는 경쇄 가변성 영역에 연결된다.
하나의 특별한 실시태양에서, 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분은 카복시-말단 펩타이드 결합을 제1 Fab 중쇄 또는 경쇄와 공유하고, 추가로 아미노-말단 펩타이드 결합을 제2 Fab 중쇄 또는 경쇄와 공유한다. 또 다른 실시태양에서, 제1 Fab 중쇄 또는 경쇄는 카복시-말단 펩타이드 결합을 제1 단일-쇄 효과자 구성부분과 공유하고, 추가로 아미노-말단 펩타이드 결합을 제2 Fab 중쇄 또는 경쇄와 공유한다. 다른 실시태양에서, 제1 Fab 중쇄 또는 경쇄는 아미노-말단 펩타이드 결합을 제1 단일-쇄 효과자 구성부분과 공유하고, 추가로 카복시-말단 펩타이드 결합을 제2 Fab 중쇄 또는 경쇄와 공유한다.
한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 아미노-말단 펩타이드 결합을 하나 이상의 scFv 분자와 공유하는 하나 이상의 제1 효과자 구성부분을 포함하고, 여기서 제1 효과자 구성부분은 추가로 카복시-말단 펩타이드 결합을 하나 이상의 scFv 분자와 공유한다. 하나의 특별한 실시태양에서, 효과자 구성부분은 단일 쇄 효과자 구성부분이다.
또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 하나 이상의 제1 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분, 및 제1 및 제2 항원 결합 구성부분을 포함하고, 여기서 각각의 항원 결합 구성부분은 그의 카복시-말단 아미노산에서 면역글로불린 불변성 도메인을 포함하는 불변성 영역에 연결되는 scFv 분자를 포함하고; 제1 항원 결합 구성부분은 그의 불변성 영역 카복시-말단 아미노산에서 제1 효과자 구성부분의 아미노-말단 아미노산에 연결되고; 제1 및 제2 항원 결합 구성부분은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 하나의 특별한 실시태양에서, 불변성 영역은 독립적으로 IgG CH1, IgG CH2, IgG CH3, IgG C카파, IgG C람다 및 IgE CH4 도메인으로 구성된 군에서 선택된다. 한 실시태양에서, 제1 항원 결합 구성부분의 면역글로불린 도메인은 제2 항원 결합 구성부분의 면역글로불린 도메인에 디설파이드 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 한 실시태양에서, 하나 이상의 디설파이드 결합은 제1 및 제2 항원 결합 구성부분의 면역글로불린 도메인의 카복시-말단에 위치된다. 또 다른 실시태양에서, 하나 이상의 디설파이드 결합은 제1 및 제2 항원 결합 구성부분의 면역글로불린 도메인의 아미노-말단에 위치된다. 또 다른 실시태양에서, 둘 이상의 디설파이드 결합은 제1 및 제2 항원 결합 구성부분의 면역글로불린 도메인의 아미노-말단에 위치된다.
하나의 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 제1 및 제2 항원 결합 구성부분을 포함하고, 각각은 그의 카복시-말단 아미노산에서 IgG CHI 도메인을 포함하는 불변성 영역에 연결된 scFv 분자를 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 구성부분은 그의 불변성 영역 카복시-말단 아미노산에서 제1 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분의 아미노-말단 아미노산에 연결되고, 제1 및 제2 항원 결합 구성부분은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 면역컨주게이트의 제2 항원 결합 구성부분은 추가로 그의 카복시-말단 아미노산에서 제2 효과자 구성부분의 아미노-말단 아미노산에 연결될 수 있다. 한 실시태양에서, 제2 효과자 구성부분은 단일 쇄 효과자 구성부분이다.
하나의 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 제1 및 제2 항원 결합 구성부분을 포함하고, 각각은 그의 카복시-말단 아미노산에서 IgG C카파 도메인을 포함하는 불변성 영역에 연결된 scFv 분자를 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 구성부분은 그의 불변성 영역 카복시-말단 아미노산에서 제1 효과자, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분의 아미노-말단 아미노산에 연결되고, 제1 및 제2 항원 결합 구성부분은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 면역컨주게이트의 제2 항원 결합 구성부분은 추가로 그의 카복시-말단 아미노산에 제2 효과자 구성부분의 아미노-말단 아미노산에 연결될 수 있다. 한 실시태양에서, 제2 효과자 구성부분은 단일 쇄 효과자 구성부분이다.
또 다른 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 제1 및 제2 항원 결합 구성부분을 포함하고, 각각은 카복시-말단 아미노산에서 IgE CH4 도메인을 포함하는 불변성 영역에 연결된 scFv 분자를 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 구성부분은 그의 불변성 영역 카복시-말단 아미노산에서 제1 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분의 아미노-말단 아미노산에 연결되고, 제1 및 제2 항원 결합 구성부분은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 면역컨주게이트의 제2 항원 결합 구성부분은 그의 카복시-말단 아미노산에서 제2 효과자 구성부분의 아미노-말단 아미노산에 연결될 수 있다. 한 실시태양에서, 제2 효과자 구성부분은 단일 쇄 효과자 구성부분이다.
또 다른 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 각각 제1 및 제2 항원 결합 구성부분을 포함하고, 각각은 그의 카복시-말단 아미노산에서 IgE CH3 도메인에 연결된 scFv 분자를 포함하고, 여기서 제1 항원 결합 구성부분은 그의 카복시-말단 아미노산에서 제1 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분의 아미노-말단 아미노산에 연결되고, 제1 및 제2 항원 결합 구성부분은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 면역컨주게이트의 제2 항원 결합 구성부분은 추가로 그의 카복시-말단 아미노산에서 제2 효과자 구성부분의 아미노-말단 아미노산에 연결될 수 있다. 한 실시태양에서, 제2 효과자 구성부분은 단일 쇄 효과자 구성부분이다.
또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 제1 및 제2 효과자 구성부분, 및 제1 및 제2 항원 결합 구성부분을 포함하고, 여기서 각각의 항원 결합 구성부분은 그의 중쇄 또는 경쇄 카복시-말단 아미노산에서 IgG1 CH3 도메인에 연결되는 Fab 분자를 포함하고, 각각의 IgG1 CH3 도메인은 그의 각각의 카복시-말단 아미노산에서 효과자 구성부분중 하나의 아미노-말단 아미노산에 연결되고, 제1 및 제2 항원 결합 구성부분은 하나 이상의 디설파이드 결합을 통해 공유적으로 연결된다. 하나의 특별한 실시태양에서, 제1 및/또는 제2 효과자 구성부분은 단일 쇄 효과자 구성부분이다. 추가의 실시태양에서, 항원 결합 구성부분의 IgG1 CH3 도메인은 디설파이드 결합에 의해 연결될 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 하나 이상의 디설파이드 결합은 제1 및 제2 항원 결합 구성부분의 IgG1 CH3 도메인의 카복시-말단에 위치된다. 또 다른 실시태양에서, 하나 이상의 디설파이드 결합은 제1 및 제2 항원 결합 구성부분의 IgG1 CH3 도메인의 아미노-말단에 위치된다. 또 다른 실시태양에서, 둘 이상의 디설파이드 결합은 제1 및 제2 항원 결합 구성부분의 IgG1 CH3 도메인의 아미노-말단에 위치된다.
몇몇 실시태양에서, 면역컨주게이트는 효과자 구성부분 및 항원 결합 구성부분 사이에 위치된 하나 이상의 단백질분해의 분해 부위를 포함한다. 면역컨주게이트의 성분(예를 들어, 항원 결합 구성부분 및/또는 효과자 구성부분)은 직접적으로, 또는 다양한 결합기, 특별히 하나 이상의 아미노산, 전형적으로 약 2 내지 20개의 아미노산을 포함하는 펩타이드 결합기를 통해 연결되고, 이는 본원에 기재되고 당분야에 공지되어 있다. 적합한, 비-면역성 결합기 펩타이드로는, 예를 들면, (G4S)n, (SG4)n 또는 G4(SG4)n 결합기 펩타이드를 포함하고, 여기서 n은 일반적으로 1 내지 10 사이의 수, 전형적으로 2 내지 4 사이의 수이다.
항원 결합 구성부분
본 발명의 면역컨주게이트의 항원-결합 구성부분은 일반적으로 특정 항원 결정자에 결합하고, 항원 결정자를 갖는 표적 부위, 예를 들면 특정 유형의 종양 세포 또는 종양 스트로마에 결합된 실체(예를 들어 효과자 구성부분 또는 제2 항원 결합 구성부분)로 유도될 수 있는 폴리펩타이드 분자이다. 면역컨주게이트는, 예를 들면, 종양 세포의 표면 위, 바이러스-감염된 세포의 표면 위, 다른 질병을 갖는 세포의 표면 위에서 발견되고, 혈청, 및/또는 세포외 기질(ECM)에서는 존재하지 않는 항원 결정자에 결합될 수 있다. 종양 항원의 비제한적인 예는 MAGE, MART-1/멜란(Melan)-A, gp1OO, 디펩티딜 펩티다아제 IV(DPPIV: Dipeptidyl peptidase IV), 아데노신 데아미나아제-결합 단백질(ADAbp: adenosine deaminase-binding protein), 사이클로필린(cyclophilin) b, 결장 회합된 항원(CRC-C017-1A/GA733, 암배아성 항원(CEA) 및 그의 면역성 에피토프 CAP-1 및 CAP-2, etv6, amll, 전립선 특이적 항원(PSA: Prostate Specific Antigen) 및 그의 면역성 에피토프 PSA-1, PSA-2, 및 PSA-3, 전립선-특이적 막 항원(PSMA: prostate-specific membrane antigen), T-세포 수용체/CD3-제타 쇄, 종양 항원의 MAGE-계열(예를 들어, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A5, MAGE-A6, MAGE-A7, MAGE-A8, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A11, MAGE-A12, MAGE-Xp2(MAGE-B2), MAGE-Xp3(MAGE-B3), MAGE-Xp4(MAGE-B4), MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-C4, MAGE-C5), 종양 항원의 GAGE-계열(예를 들어, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7, GAGE-8, GAGE-9), BAGE, RAGE, LAGE-1, NAG, GnT-V, MUM-1, CDK4, 티로시나아제(tyrosinase), p53, MUC 계열, HER2/neu, p21ras, RCAS1, α-페토단백질(fetoprotein), E-카드헤린(cadherin), α-카테닌, β-catenin 및 γ-카테닌, p120ctn, gp1OO Pmell17, PRAME, NY-ESO-1, cdc27, 아데노마투스 폴리포시스 콜라이 단백질(APC: adenomatous polyposis coli protein), 포드린(fodrin), 코넥신(Connexin) 37, Ig-이디오타입(idiotype), p15, gp75, GM2 및 GD2 강글리오시드, 바이러스성 생성물, 예컨대 인간 유두종 바이러스 단백질, 종양 항원의 Smad 계열, lmp-1, PIA, EBV-코딩된 핵 항원(EBNA: encoded nuclear antigen)-1, 뇌 글리코겐 포스포릴라아제(phosphorylase), SSX-1, SSX-2(HOM-MEL-40), SSX-1, SSX-4, SSX-5, SCP-1 및 CT-7, 및 c-erbB-2가 포함된다. 바이러스 항원의 비제한적 예로는 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌(hemagglutinin), 엡스타인-바르(Epstein-Barr) 바이러스 LMP-1, 간염 C 바이러스 E2 당단백질, HIV gp160, 및 HIV gp120이 포함된다. ECM 항원의 비제한적 예로는 신데칸(syndecan), 헤파라나아제(heparanase), 인테그린(integrin), 오스테오폰틴(osteopontin), 링크(link), 카드헤린, 라미닌(laminin), 라미닌 유형 EGF, 렉틴(lectin), 피브로넥틴, 노취(notch), 테나신, 및 매트릭신(matrixin)이 포함된다. 본 발명의 면역컨주게이트는 세포 표면 항원의 하기 구체적인 비제한적 예에 결합될 수 있다: FAP, Her2, EGFR, IGF-1R, CD2(T-세포 표면 항원), CD3(TCR과 회합된 이종다량체), CD22(B-세포 수용체), CD23(낮은 친화도 IgE 수용체), CD25(IL-2 수용체 α쇄), CD30(사이토킨 수용체), CD33(미엘로이드 세포 표면 항원), CD40(종양 괴사 인자 수용체), IL-6R(IL6 수용체), CD20, MCSP, c-Met, CUB 도메인-함유 단백질-1(CDCP1), 및 PDGFβR(β 혈소판-유도된 성장 인자 수용체).
특정 실시태양에서 항원-결합 구성부분은 종양 세포 위에 또는 종양 세포 환경에 존재하는 항원으로 유도된다. 하나의 구체적인 실시태양에서 항원-결합 구성부분은 섬유아세포 활성화 단백질(FAP), 테나신-C의 A1 도메인(TNC A1), 테나신-C의 A2 도메인(TNC A2), 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(EDB), 암배아성 항원(CEA) 및 흑색종-회합된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)으로 구성된 군에서 선택된 항원으로 유도된다.
한 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함하고, 각각의 이들 항원 결합 구성부분은 동일한 항원 결정자에 특이적으로 결합한다. 또 다른 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함하고, 여기서 각각의 이들 항원 결합 구성부분은 상이한 항원 결정자에 특이적으로 결합한다.
항원 결합 구성부분은 항원 결정자에 특이적 결합을 보유하는 임의의 유형의 항체 또는 이의 단편일 수 있다. 한 실시태양에서 항원-결합 구성부분은 항체 또는 항체 단편이다. 항체 단편으로는, 제한되지 않지만, VH 단편, VL 단편, Fab 단편, F(ab')2 단편, scFv 단편, Fv 단편, 미니바디(minibody), 디아바디, 트리아바디, 및 테트라바디가 포함된다(예를 들어 허드슨(Hudson) 및 수리아우(Souriau)의 문헌[Nature Med 9, 129-134 (2003)] 참조). 특별히 유용한 항체 단편은 Fab 단편 및 scFv 단편이다. 따라서, 한 실시태양에서 항원-결합 구성부분은 Fab 분자 및 scFv 분자로부터 선택된다. 한 실시태양에서 항원-결합 구성부분은 Fab 분자이다. 또 다른 실시태양에서 항원-결합 구성부분은 scFv 분자이다.
한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 피브로넥틴의 엑스트라 도메인 B(EDB)에 특이적인 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 EDB의 에피토프에 결합하기 위하여 단일클론성 항체 L19와 경쟁할 수 있는 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함한다. 예를 들어, PCT 국제 특허출원 공개공보 WO 제2007/128563 A1호를 참조한다(본원에 참고로 그의 전체가 인용됨). 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 L19 단일클론 항체로부터 유래된 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 L19 단일클론성 항체로부터 유래된 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 L19 단일클론성 항체로부터 유래된 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-12 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 L19 단일클론성 항체로부터 유래된 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 L19 단일클론성 항체로부터 유래된 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IFNα 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 L19 단일클론성 항체로부터 유래된 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 L19 단일클론성 항체로부터 유래된 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 GM-CSF 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 L19 단일클론성 항체로부터 유래된 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 L19 단일클론성 항체로부터 유래된 제1 scFv가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 L19 단일클론성 항체로부터 유래된 제2 scFv와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 91의 폴리펩타이드 서열 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 L19 단일클론성 항체로부터 유래된 Fab 경쇄를 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 92 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 91 및 서열 번호 92 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 98 또는 작용기를 보유한 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 98 및 서열 번호 92 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 99 또는 작용기를 보유한 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 99 및 서열 번호 92 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 100 또는 작용기를 보유한 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 100 및 서열 번호 92 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 101 또는 작용기를 보유한 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 101 및 서열 번호 92 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 폴리펩타이드는, 예를 들어, 디설파이드 결합에 의해 공유적으로 연결된다.
한 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 테나신의 A1 도메인(TNC-A1)에 특이적인 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 TNC-A1의 에피토프에 결합하기 위해 단일클론성 항체 F16과 경쟁할 수 있는 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함한다. 예를 들어, PCT 국제 특허출원 공개공보 WO 제2007/128563 A1호를 참조한다(본원에 참고로 그의 전체가 인용됨). 한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 테나신의 A1 및/또는 A4 도메인(TNC-A1 또는 TNC-A4 또는 TNC-A1/A4)에 특이적인 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 테나신의 A1 도메인에 대해 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자, IL-12 분자, IFN α 분자 또는 GM-CSF 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 테나신의 A1 도메인에 대해 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 테나신의 A1 도메인에 대해 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 테나신의 A1 도메인에 대해 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 추가의 실시태양에서, 면역컨주게이트는 테나신의 A1 도메인에 대해 특이적인 제1 scFv가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 테나신의 A1 도메인에 대해 특이적인 제2 scFv와 공유하는 폴리펩타이드를 포함한다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 8 또는 서열 번호 9, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 6 또는 서열 번호 7, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 8 또는 서열 번호 9, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열, 및 서열 번호 6 또는 서열 번호 7, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 경쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트는 서열 번호 95 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 96 또는 서열 번호 105, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 97 또는 서열 번호 115 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 96 및 서열 번호 97 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 105 및 서열 번호 115 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 테나신의 A2 도메인(TNC-A2)에 특이적인 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 테나신의 A2 도메인에 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자, IL-12 분자, IFNα 분자 또는 GM-CSF 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 테나신의 A2 도메인에 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 테나신의 A2 도메인에 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 테나신의 A2 도메인에 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 5, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 85, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 3, 서열 번호 4; 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82 및 서열 번호 84, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 경쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 5, 서열 번호 71, 서열 번호 73, 서열 번호 75, 서열 번호 77, 서열 번호 79, 서열 번호 81, 서열 번호 83 및 서열 번호 85, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열, 및 서열 번호 3, 서열 번호 4; 서열 번호 70, 서열 번호 72, 서열 번호 74, 서열 번호 76, 서열 번호 78, 서열 번호 80, 서열 번호 82 및 서열 번호 84, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 경쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 117, 서열 번호 118 및 서열 번호 119, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로부터 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 120, 서열 번호 121 및 서열 번호 122, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 117, 서열 번호 118, 및 서열 번호 119 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열, 및 서열 번호 120, 서열 번호 121 및 서열 번호 122 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 117 및 서열 번호 121 또는 서열 번호 122, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 118 및 서열 번호 120 또는 서열 번호 121, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 119 및 서열 번호 120, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 섬유아세포 활성화된 단백질(FAP)에 특이적인 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 FAP에 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자, IL-12 분자, IFNα 분자 또는 GM-CSF 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 FAP에 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 FAP에 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 FAP에 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 FAP에 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 FAP에 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67 및 서열 번호 69, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66 및 서열 번호 68, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 경쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 12, 서열 번호 14, 서열 번호 15, 서열 번호 17, 서열 번호 19, 서열 번호 21, 서열 번호 23, 서열 번호 25, 서열 번호 27, 서열 번호 29, 서열 번호 31, 서열 번호 33, 서열 번호 35, 서열 번호 37, 서열 번호 39, 서열 번호 41, 서열 번호 43, 서열 번호 45, 서열 번호 47, 서열 번호 49, 서열 번호 51, 서열 번호 53, 서열 번호 55, 서열 번호 57, 서열 번호 59, 서열 번호 61, 서열 번호 63, 서열 번호 65, 서열 번호 67 및 서열 번호 69, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열, 및 서열 번호 10, 서열 번호 11, 서열 번호 13, 서열 번호 16, 서열 번호 18, 서열 번호 20, 서열 번호 22, 서열 번호 24, 서열 번호 26, 서열 번호 28, 서열 번호 30, 서열 번호 32, 서열 번호 34, 서열 번호 36, 서열 번호 38, 서열 번호 40, 서열 번호 42, 서열 번호 44, 서열 번호 46, 서열 번호 48, 서열 번호 50, 서열 번호 52, 서열 번호 54, 서열 번호 56, 서열 번호 58, 서열 번호 60, 서열 번호 62, 서열 번호 64, 서열 번호 66 및 서열 번호 68, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 경쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 102, 서열 번호 103, 서열 번호 104, 서열 번호 106, 서열 번호 107, 서열 번호 108, 서열 번호 109, 서열 번호 110 및 서열 번호 111, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 112, 서열 번호 113, 서열 번호 114 및 서열 번호 116 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 103, 서열 번호 107 및 서열 번호 108 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열, 및 서열 번호 113 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 102, 서열 번호 109, 서열 번호 110 및 서열 번호 111 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체로 구성된 군에서 선택된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열, 및 서열 번호 112 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 추가의 구체적인 실시태양에서 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 104 및 서열 번호 114 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 106 및 서열 번호 116 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 108 및 서열 번호 113 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 109 및 서열 번호 112 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 110 및 서열 번호 112 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 111 및 서열 번호 112 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 2개의 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 흑색종 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)에 특이적인 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 MCSP에 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자, IL-12 분자, IFNα 분자 또는 GM-CSF 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 MCSP에 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 MCSP에 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 MCSP에 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 86 또는 서열 번호 88 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 87 또는 서열 번호 90 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 경쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 86 또는 서열 번호 88, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열, 및 서열 번호 87 또는 서열 번호 90, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 경쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 86의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열, 및 서열 번호 87의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 경쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 88의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역 서열, 및 서열 번호 87의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 경쇄 가변성 영역 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 123 또는 서열 번호 125, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 124 또는 서열 번호 127, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 123 또는 서열 번호 125 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열, 및 서열 번호 124 또는 서열 번호 127, 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 123 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열, 및 서열 번호 124 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트는 서열 번호 125 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열, 및 서열 번호 124 또는 작용기를 보유하는 이의 변형체에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
한 실시태양에서, 면역컨주게이트는 암배아성 항원(CEA)에 특이적인 하나 이상의, 전형적으로 둘 이상의 항원 결합 구성부분을 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 CEA에 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자, IL-12 분자, IFNα 분자 또는 GM-CSF 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 CEA에 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 역시 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트는 CEA에 특이적인 제1 Fab 중쇄가 카복시-말단 펩타이드 결합을 IL-2 분자와 공유하고, 이는 다시 카복시-말단 펩타이드 결합을 CEA에 특이적인 제2 Fab 중쇄와 공유하는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 154 또는 작용기를 보유한 이의 변형체의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역을 포함한다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 155 또는 작용기를 보유한 이의 변형체의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 경쇄 가변성 영역을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 면역컨주게이트의 항원 결합 구성부분은 서열 번호 154, 또는 작용기를 보유한 이의 변형체의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역, 및 서열 번호 155, 또는 작용기를 보유한 이의 변형체의 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 중쇄 가변성 영역을 포함한다. 본 발명의 항원-결합 구성부분으로는 서열 번호 3 내지 127, 및 이의 작용성 단편 또는 변형체에 제시된 서열에 약 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 또는 100% 동일한 서열을 포함하는 구성부분이 포함된다. 본 발명은 또한 보존성 아미노산 치환을 갖는 서열 번호 3 내지 127의 서열을 포함하는 항원-결합 구성부분을 내포한다. 서열 번호 91, 93, 94, 95, 96, 102, 103, 104, 105, 106, 108, 109, 110, 111, 117, 118, 119, 123 및 125의 서열에서, 인간 IL-2의 서열(서열 번호 1 참조)은 본원에 기재된 IL-2 유사체(analogon), 특별히 돌연변이체 IL-2의 서열(서열 번호 2 참조)에 의해 대체될 수 있음을 알아야 한다.
면역컨주게이트의 효과자 구성부분
본 발명에 사용하기 위한 효과자 구성부분은 일반적으로 세포 활성에, 예를 들면, 신호 변환 경로를 통해 영향을 주는 폴리펩타이드이다. 따라서, 본 발명에 유용한 면역컨주게이트의 효과자 구성부분은 세포내 반응을 조절하기 위해 세포 막 밖으로부터 신호를 전달하는 수용체-매개된 신호작용과 연관될 수 있다. 예를 들면, 면역컨주게이트의 효과자 구성부분은 사이토킨이다. 하나의 특별한 실시태양에서, 효과자 구성부분은 본원에 기재된 바와 같은 단일-쇄 효과자 구성부분일 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 면역컨주게이트의 하나 이상의 효과자 구성부분, 전형적으로 단일-쇄 효과자 구성부분은 IL-2, GM-CSF, IFN-α, 및 IL-12으로 구성된 군에서 선택된 사이토킨이다. 한 실시태양에서 효과자 구성부분은 IL-2이다. 또 다른 실시태양에서, 면역컨주게이트의 하나 이상의 단일-쇄 효과자 구성부분은 IL-8, MIP-1α, MIP-1β, 및 TGF-β로 구성된 군에서 선택된다.
한 실시태양에서, 면역컨주게이트의 효과자 구성부분, 특별히 단일-쇄 효과자 구성부분은 IL-2이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, IL-2 효과자 구성부분은 하기 군에서 선택된 하나 이상의 세포 반응을 이끌어낼 수 있다: 활성화된 T 림프구 세포의 증식, 활성화된 T 림프구 세포에서의 분화, 세포독성 T 세포(CTL) 활성, 활성화된 B 세포에서의 증식, 활성화된 B 세포에서의 분화, 천연 킬러(NK) 세포에서의 증식, NK 세포에서의 분화, 활성화된 T 세포 또는 NK 세포에 의한 사이토킨 분비, 및 NK/림프구 활성화된 킬러(LAK) 항종양 세포독성. 특정 실시태양에서, IL-2 효과자 구성부분은 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분의 IL-2 수용체(CD25로 공지됨)의 α-서브유닛으로의 친화도를 감소 또는 제거하지만, 돌연변이되지 않은 IL-2 효과자 구성부분에 비하여 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분의 중간-친화도 IL-2 수용체(IL-2 수용체의 β- 및 γ-서브유닛으로 구성됨)로의 친화도를 보존하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함하는 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분이다. 한 실시태양에서 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분은 인간 IL-2의 잔기 42, 45, 및 72에 상응하는 위치로부터 선택된 1개, 2개 또는 3개의 위치(들)에서의 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 더 구체적인 실시태양에서, 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분은 인간 IL-2의 잔기 42, 45, 및 72에 상응하는 위치에서 3개의 아미노산 치환을 포함한다. 더욱 더 구체적인 실시태양에서 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분은 아미노산 치환 F42A, Y45A 및 L72G를 포함하는 인간 IL-2이다. 한 실시태양에서 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분은, IL-2의 O-글리코실화 부위를 제거하는, 인간 IL-2의 위치 3에 상응하는 위치에서의 아미노산 돌연변이를 부가적으로 포함한다. 특별히 상기 추가의 아미노산 돌연변이는 트레오닌 잔기를 알라닌 잔기로 대체하는 아미노산 치환이다. 아미노산 치환 T3A, F42A, Y45A 및 L72G를 포함하는 4중 돌연변이체(QM) IL-2의 서열은 서열 번호 2에 제시된다. 적합한 돌연변이체 IL-2 분자는 더 상세히 유럽 특허출원 번호 제EP11153964.9호에 기재되어 있다.
면역컨주게이트에서 효과자 구성부분으로서 유용한 돌연변이체 IL-2 분자는 당분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 결실, 치환, 삽입 또는 개질에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 DNA 서열을 코딩하는 부위-특이적 돌연변이발생, PCR, 유전자 합성 등을 포함한다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면 서열화에 의해 확인될 수 있다. 이와 관련하여, 천연의 IL-2의 뉴클레오티드 서열은 타니구치(Taniguchi) 등(Nature 302, 305-10 (1983))에 의해 기재되어 있고, 인간 IL-2를 코딩하는 핵산은 공공 기탁기관, 예컨대 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(매릴랜드주 락빌 소재)으로부터 입수가능하다. 인간 IL-2의 예시적인 서열은 서열 번호 1에 제시된다. 치환 또는 삽입은 천연 뿐만 아니라 비천연 아미노산 잔기를 포함할 수 있다. 아미노산 개질은 화학적 개질, 예컨대 글리코실화 부위의 부가 또는 제거, 또는 탄수화물 결합 등의 잘 공지된 방법을 포함한다.
한 실시태양에서, 면역컨주게이트의 효과자 구성부분, 특별히 단일-쇄 효과자 구성부분은 GM-CSF이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, GM-CSF 효과자 구성부분은 과립성백혈구, 단세포 또는 수지상 세포에서 증식 및/또는 분화를 이끌어 낼 수 있다. 한 실시태양에서, 면역컨주게이트의 효과자 구성부분, 특별히 단일-쇄 효과자 구성부분은 IFN-α이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, IFN-α 효과자 구성부분은 바이러스-감염된 세포에서의 바이러스 복제의 억제, 및 주요 조직상용성 착체 I(MHC I: major histocompatibility complex I)의 발현의 상향 조절로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 세포 반응을 이끌어낼 수 있다. 또 다른 구체적인 실시태양에서, IFN-α 효과자 구성부분은 종양 세포에서의 증식을 저해할 수 있다. 한 실시태양에서, 면역컨주게이트의 효과자 구성부분, 특별히 단일-쇄 효과자 구성부분은 IL-12이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, IL-12 효과자 구성부분은 NK 세포에서의 증식, NK 세포에서의 분화, T 세포에서의 증식, 및 T 세포에서의 분화로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 세포 반응을 이끌어낼 수 있다. 한 실시태양에서, 면역컨주게이트의 효과자 구성부분, 특별히 단일-쇄 효과자 구성부분은 IL-8이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, IL-8 효과자 구성부분은 호중구에서 화학주성을 이끌어낼 수 있다. 한 실시태양에서, 면역컨주게이트의 효과자 구성부분, 특별히 단일-쇄 효과자 구성부분은 MIP-1α이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, MIP-1α 효과자 구성부분은 단세포 및 T 림프구 세포에서 화학주성을 이끌어낼 수 있다. 한 실시태양에서, 면역컨주게이트의 효과자 구성부분, 특별히 단일-쇄 효과자 구성부분은 MIP-1β이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, MIP-1β 효과자 구성부분은 단세포 및 T 림프구 세포에서 화학주성을 이끌어낼 수 있다. 한 실시태양에서, 면역컨주게이트의 효과자 구성부분, 특별히 단일-쇄 효과자 구성부분은 TGF-β이다. 하나의 구체적인 실시태양에서, TGF-β 효과자 구성부분은 단세포에서의 화학주성, 대식세포에서의 화학주성, 활성화된 대식세포에서의 IL-1 발현의 상향조절, 및 활성화된 B 세포에서의 IgA 발현의 상향조절로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 세포 반응을 이끌어낼 수 있다.
항체
본 발명에서 유용한 항체로는 특이적 항원 결정자, 예를 들면 특이적 종양 세포 항원에 결합하고, Fc 영역을 포함하는 항체 또는 항체 단편이 포함된다. 특정 실시태양에서 항체는 종양 세포 상에 존재하는 항원으로 유도된다. 본 발명에서 유용한 항체의 특정 표적 항원으로는, 종양 세포의 표면 위에서 발현되는 항원, 제한되지 않지만, 세포 표면 수용체, 예컨대 상피 성장 인자 수용체(EGFR), 인슐린-유사 성장 인자 수용체(IGFR) 및 혈소판-유도된 성장 인자 수용체(PDGFR), 전립선 특이적 막 항원(PSMA), 암배아성 항원(CEA), 디펩티딜 펩티다아제 IV(CD26, DPPIV), FAP, HER2/neu, HER-3, E-카드헤린, CD20, 흑색종-회합된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP), c-Met, CUB 도메인-함유 단백질-1(CDCP1), 및 편평 세포 암종 항원(SCCA)이 포함된다.
하나의 구체적인 실시태양에서 항체는 CD20, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), HER2, HER3, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-1R), 암배아성 항원(CEA), c-Met, CUB 도메인-함유 단백질-1(CDCP1), 및 흑색종-회합된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)으로 구성된 군에서 선택된 항원으로 유도된다. 한 실시태양에서, 다중특이적 항체는 CD20, 상피 성장 인자 수용체(EGFR), HER2, HER3, 인슐린-유사 성장 인자 1 수용체(IGF-1R), 암배아성 항원(CEA), c-Met, CUB 도메인-함유 단백질-1(CDCP1), 및 흑색종-회합된 콘드로이틴 설페이트 프로테오글리칸(MCSP)으로 구성된 군에서 선택된 둘 이상의 항원으로 유도된다.
본 발명에서 유용한 특이적 항-CD20 항체는 인간화된다. IgG-부류 유형 Ⅱ 항-CD20 항체는 뮤린 B-Lyl 항체의 결합 특이성을 갖는다(Poppema and Visser, Biotest Bulletin 3, 131-139 (1987)). a) 중쇄 가변성 도메인에서 서열 번호 128의 CDR1, 서열 번호 129의 CDR2, 및 서열 번호 130의 CDR3, 및 b) 경쇄 가변성 도메인에서, 서열 번호 131의 CDR1, 서열 번호 132의 CDR2 및 서열 번호 133의 CDR3을 포함하는, 인간화된, IgG-부류 유형 Ⅱ 항-CD20 항체가 특별히 유용하다.
특별히, 상기 항체의 중쇄 가변성 영역 골격구조 영역(FR) FR1, FR2, 및 FR3은 VH1_10 인간 생식계열 서열에 의해 코딩된 인간 FR 서열이고, 상기 항체의 중쇄 가변성 영역 FR4은 JH4 인간 생식계열 서열에 의해 코딩된 인간 FR 서열이며, 상기 항체의 경쇄 가변성 영역(FR) FR1, FR2, 및 FR3은 VK_2_40 인간 생식계열 서열에 의해 코딩된 인간 FR 서열이고, 상기 항체의 경쇄 가변성 영역 FR4은 JK4 인간 생식계열 서열에 의해 코딩된 인간 FR 서열이다.
본 발명에서 유용한 더욱 특별한 항-CD20 항체는 서열 번호 134의 중쇄 가변성 도메인 및 서열 번호 135의 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
이러한 항-CD20 항체는 국제 특허출원 공개공보 WO 제2005/044859호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참고로 이의 전체가 인용된다.
본 발명에서 유용한 특정 항-EGFR 항체는 래트 ICR62 항체의 결합 특이성을 갖는 인간화된 IgG-부류 항체이다(Modjtahedi et al., Br J Cancer 67, 247-253 (1993)). a) 중쇄 가변성 도메인에서 서열 번호 136의 CDR1, 서열 번호 137의 CDR2, 및 서열 번호 138의 CDR3, 및 b) 경쇄 가변성 도메인에서 서열 번호 139의 CDR1, 서열 번호 140의 CDR2, 및 서열 번호 141의 CDR3을 포함하는 인간화된, IgG-부류 항-EGFR 항체가 특별히 유용하다.
본 발명에 유용한 더 특별한 항-EGFR 항체는 서열 번호 142의 중쇄 가변성 도메인 및 서열 번호 143의 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
이러한 항-EGFR 항체는 국제 특허출원 공개공보 WO 제2006/082515호 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/017963호에 기재되어 있고, 이들 각각은 본원에 참고로 이의 전체가 인용된다.
본 발명에 유용한 다른 적합한 인간화된 IgG-부류 항-EGFR 항체로는 세툭시맵(cetuximab)/IMC-C225(골드스타인(Goldstein) 등의 문헌[Clin Cancer Res 1, 1311-1318 (1995)]에 기재된 에르비툭스(Erbitux: 등록상표)), 패니투맵(panitumumab)/ABX-EGF(양(Yang) 등의 문헌[Cancer Res 59, 1236-1243 (1999)], 양 등의 문헌[Critical Reviews in Oncology/Hematology 38, 17-23 (2001)]에 기재된 벡티빅스(Vectibix: 등록상표)), 니모투추맵(nimotuzumab)/h-R3(마테오(Mateo) 등의 문헌[Immunotechnology 3, 71-81 (1997)]; 크롬베트-라모스(Crombet-Ramos) 등의 문헌[Int J Cancer 101, 567-575 (2002)], 보랜드(Boland) 및 베브(Bebb)의 문헌[Expert Opin Biol Ther 9, 1199-1206 (2009)]에 기재된 테라심(TheraCim: 등록상표)), 마투추맵(matuzumab)/EMD 72000(비어(Bier) 등의 문헌[Cancer Immunol Immunother 46, 167-173 (1998)], 김(Kim) 등의 문헌[Curr Opin Mol Ther 6, 96-103 (2004)]에 기재됨), 및 잘루투뮤맵(zalutumumab)/2F8(블리커(Bleeker) 등의 문헌[J Immunol 173, 4699-4707 (2004)], 및 라머츠 반 부에렌(Lammerts van Bueren)의 문헌[PNAS 105, 6109-6114 (2008)]에 기재됨)이 포함된다.
본 발명에서 유용한 구체적인 항-IGF-1R 항체는 국제 특허출원 공개공보 WO 제2005/005635호 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/077546호(각각의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨)에 기재되어 있고, 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1) 및 인슐린-유사 성장 인자-2(IGF-2)가 인슐린-유사 성장 인자-1 수용체(IGF-1R)에 결합하는 것을 억제한다.
본 발명에 유용한 항-IGF-1R 항체는 바람직하게는 단일클론성 항체, 및 또한, 키메라성 항체(인간 불변성 도메인), 인간화된 항체 및 특별히 바람직하게는 전체 인간 항체이다. 본 발명에 유용한 특정 항-IGF-1R 항체는 항체 18에 경쟁하여 인간 IGF-1R에 결합하고, 즉 이들은 항체 18과 동일한 IGF-1R의 에피토프에 결합하고, 이는 국제 특허출원 공개공보 WO 제2005/005635호에 기재되어 있다. 특정 항-IGF-1R 항체는 10-8M(KD) 이하, 특별히 약 10-9 내지 10 -13M의 IGF-1R로의 친화도를 추가로 특징으로 하고, 바람직하게는 인슐린 수용체로의 인슐린 결합의 검출가능한 농도-의존성 억제를 나타내지 않는다.
본 발명에 유용한 특정 항-IGF-1R 항체는 하기 서열을 갖는 상보성 결정 영역(CDR)을 포함한다:
a) CDR로서 서열 번호 144 또는 146의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 중쇄;
b) CDR로서 서열 번호 145 또는 147의 CDR1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 항체 경쇄.
특별히, 본 발명에 유용한 항-IGF-1R 항체는 서열 번호 41의 항체 중쇄 가변성 도메인 아미노산 서열 및 서열 번호 42의 항체 경쇄 가변성 도메인 아미노산 서열, 또는 서열 번호 43의 항체 중쇄 가변성 도메인 아미노산 서열 및 서열 번호 44의 항체 경쇄 가변성 도메인 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 유용한 특정 항-IGF-1R 항체는, 독일 소재의 더췌 삼룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 젤쿨투렌 게엠베하(DSMZ: Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)에 의해 각각 기탁번호 DSM ACC 2587 및 DSM ACC 2594하에 기탁된, 하이브리도마 세포주 <IGF-1R> HUMAB-클론 18 및 <IGF-1R> HUMAB-클론 22로부터 수득가능하다.
본 발명에 유용한 다른 적합한 항-IGF-1R 항체는 예를 들어 완전한 인간 IgG1 mAb 시수투뮤맵(cixutumumab)/IMC-A12(부르트룸(Burtrum) 등의 문헌[Cancer Res 63, 8912-21 (2003)]; 로윈스키(Rowinsky) 등의 문헌[Clin Cancer Res 13, 5549s-5555s (2007)]에 기재됨), 완전한 인간 IgG1 mAb AMG-479(벨트란(Beltran) 등의 문헌[Mol Cancer Ther 8, 1095-1105 (2009)]; 톨처(Tolcher) 등의 문헌[J Clin Oncol 27, 5800-7 (2009)]에 기재됨), 인간화된 IgG1 mAb MK-0646/h7C10(고에취(Goetsch) 등의 문헌[Int J Cancer 113, 316-28 (2005)]; 브라우사스(Broussas) 등의 문헌[Int J Cancer 124, 2281-93 (2009)]; 히달고(Hidalgo) 등의 문헌[J Clin Oncol 26, abstract 3520 (2008)]; 아츠오리(Atzori) 등의 문헌[J Clin Oncol 26, abstract 3519 (2008)]에 기재됨), 인간화된 IgG1 mAb AVE1642(데스캠프스(Descamps) 등의 문헌[Br J Cancer 100, 366-9 (2009)]; 톨처 등의 문헌[J Clin Oncol 26, abstract 3582 (2008)]; 모러우(Moreau) 등의 문헌[Blood 110, abstract 1166 (2007)]; 말로니(Maloney) 등의 문헌[Cancer Res 63, 5073-83 (2003)]에 기재됨), 완전한 인간 IgG2 mAb 피지투뮤맵(figitumumab)/CP-751,871(Cohen et al., Clin Cancer Res 11, 2063-73 (2005); Haluska et al., Clin Cancer Res 13, 5834-40 (2007); Lacy et al., J Clin Oncol 26, 3196-203 (2008); Gualberto & Karp, Clin Lung Cancer 10, 273-80 (2009)), 완전한 인간 IgG1 mAb SCH-717454(국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/076257호 또는 콜브(Kolb) 등의 문헌[Pediatr Blood Cancer 50, 1190-7 (2008)]에 기재됨), 2.13.2. mAb[미국 특허 제7,037,498호(WO 제2002/053596호)에 기재됨] 또는 완전한 인간 IgG4 mAb BⅡB022이다.
본 발명에서 유용한 구체적인 항-CEA 항체는 뮤린 PR1A3 항체의 결합 특이성을 갖는 인간화된, IgG-부류 항체이다(Richman and Bodmer, Int J Cancer 39, 317-328 (1987)). a) 중쇄 가변성 도메인에서 서열 번호 148의 CDR1, 서열 번호 149의 CDR2, 및 서열 번호 150의 CDR3, 및 b) 경쇄 가변성 도메인에서 서열 번호 151의 CDR1, 서열 번호 152의 CDR2, 및 서열 번호 153의 CDR3을 포함하는 인간화된, IgG-부류 항-CEA 항체가 특별히 유용하다.
본 발명에 유용한 더욱 특별한 항-CEA 항체는 서열 번호 154의 중쇄 가변성 도메인 및 서열 번호 155의 경쇄 가변성 도메인을 포함한다.
이러한 항-CEA 항체는 PCT 국제 특허출원 공개공보 WO 제2011/023787호에 기재되어 있고, 이는 본원에 참고로 그의 전체가 인용된다.
본 발명에서 유용한 구체적인 항-HER3 항체는 인간화된, IgG-부류 항체, 예컨대 Mab 205.10.1, Mab 205.10.2 및 Mab 205.10.3, 특별히 Mab 205.10.2이고, 이는 PCT 국제 특허출원 공개공보 WO 제2011/076683호에 기재되어 있다.
본 발명에서 유용한 구체적인 항-CDCP1-항체는 PCT 국제 특허출원 공개공보 WO 제2011/023389호에 기재된 바와 같은, CUB4 항체(기탁번호 DSM ACC 2551 (DSMZ))로부터 유래된 인간화된, IgG-부류 항체이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 예시적인 항-MCSP 항체는 예를 들어 국제 특허출원 공개공보 WO 제2006/100582호에 기재되어 있다.
한 실시태양에서 항체는 IgG-부류의 전장 항체이다. 하나의 특별한 실시태양에서, 항체는 IgG1 항체이다. 한 실시태양에서, 항체는 인간 Fc 영역, 더욱 특별히 인간 IgG Fc 영역, 가장 특별히 인간 IgG1 Fc 영역을 포함한다. 본 발명에서 유용한 항체, 예컨대 상기 기재된 항-IGF-1R, 항-EGFR 및 항-CD20 항체는 서열 번호 156에 제시된 바와 같은 인간 Ig 감마-1 중쇄 불변성 영역을 포함한다(즉, 항체는 인간 IgG1 하위부류이다).
본 발명에서 유용한 항체는 조작되지 않은 항체에 비하여 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된다. 한 실시태양에서 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체는 상응하는 조작되지 않은 항체에 비하여 2-배 이상, 10-배 이상 또는 100-배 이상 증가된 효과자 기능을 갖는다. 증가된 효과자 기능으로는, 제한되지 않지만, 증가된 Fc 수용체 결합, 증가된 Clq 결합 및 보체 의존성 세포독성(CDC), 증가된 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC), 증가된 항체-의존성 세포 식세포 작용(ADCP), 증가된 사이토킨 분비, 항원-제공 세포에 의한 증가된 면역 착체-중재된 항원 수용, NK 세포로의 증가된 결합, 대식세포로의 증가된 결합, 단세포로의 증가된 결합, 다형핵 세포로의 증가된 결합, 아포토시스(apoptosis)를 유도하는 증가된 직접적 신호작용, 표적-결합된 항체의 증가된 가교결합, 증가된 수지상 세포 성숙, 또는 증가된 T 세포 프라이밍(priming)중 하나 이상이 포함된다.
한 실시태양에서 증가된 효과자 기능은 증가된 Fc 수용체 결합, 증가된 CDC, 증가된 ADCC, 증가된 ADCP, 및 증가된 사이토킨 분비로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 기능이다. 한 실시태양에서 증가된 효과자 기능은 활성화 Fc 수용체로의 증가된 결합이다. 한 이러한 실시태양에서, 활성화 Fc 수용체로의 결합 친화도는 상응하는 조작되지 않은 항체의 결합 치환도에 비하여 2-배 이상, 특별히 10-배 이상 증가된다. 하나의 구체적인 실시태양에서 활성화 Fc 수용체는 FcγⅢa, FcγRI, 및 FcγRⅡa로 구성된 군에서 선택된다. 한 실시태양에서 활성화 Fc 수용체는 FcγⅢa이다. 또 다른 실시태양에서 증가된 효과자 기능은 증가된 ADCC이다. 한 이러한 실시태양에서 ADCC는 상응하는 조작되지 않은 항체에 의해 중재된 ADCC에 비하여 10-배 이상, 특별히 100-배 이상 증가된다. 역시 또 다른 실시태양에서 증가된 효과자 기능은 활성화 Fc 수용체로의 증가된 결합 및 증가된 ADCC이다.
증가된 효과자 기능은 당분야에 공지된 방법에 의해 측정될 수 있다. ADCC를 측정하기 위해 적합한 검정은 본원에 기재되어 있다. 흥미로운 분자의 ADCC 활성을 평가하기 위한 시험관내 검정의 다른 예는 미국 특허 제5,500,362호; 문헌[Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986)] 및 [Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985)]; 미국 특허 제5,821,337호; 문헌[Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987)]에 기재되어 있다. 다르게는, 비-방사성 검정 방법이 이용될 수 있다[예를 들면, 유동세포 분석을 위한 ACTI(등록상표) 비-방사성 세포독성 검정(미국 캘리포니아주 마운틴 뷰 소재의 셀테크놀로지 인코포레이티드(CellTechnology, Inc)); 및 사이토톡스 96(등록상표) 비-방사성 세포독성 검정(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가(Promega))을 참조한다]. 이러한 검정을 위한 유용한 효과자 세포로는 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 및 천연 킬러(NK) 세포가 포함된다. 다르게는, 또는 부가적으로, 흥미로운 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들어 동물 모델에서 평가될 수 있고, 예컨대 문헌[Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)]에 개시되어 있다. Fc 수용체로의 결합은 예를 들어 ELISA에 의해, 또는 표면 플라스몬 공명(SPR: Surface Plasmon Resonance)에 의해, 표준 장치, 예컨대 비아코어(BIAcore) 기기[지이 헬쓰케어(GE Healthcare)]를 사용하여 쉽게 결정될 수 있고, Fc 수용체는 예컨대 재조합 발현에 의해 수득될 수 있다. 특정 실시태양에 따라서, 활성화 Fc 수용체로의 결합 친화도는 비아코어(BIACORE: 등록상표) T100 기계(지이 헬쓰케어)를 사용하여 25℃에서 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다. 다르게는, Fc 수용체를 위한 항체의 결합 친화도는 특정 Fc 수용체, 예컨대 NK 세포 발현 FcγⅢa 수용체를 발현하는 것으로 공지된 세포주를 사용하여 평가될 수 있다. Clq 결합 검정은 또한 항체가 Clq에 결합하고 이에 따라 CDC 활성을 가질 수 있는 지의 여부를 결정하기 위해 수행될 수 있다. 예를 들어, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2006/029879호 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2005/100402호에 기재된 Clq 및 C3c 결합 ELISA를 참조한다. 보체 활성화를 평가하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다(예를 들면, 가차노-산토로(Gazzano-Santoro) 등의 문헌[J Immunol Methods 202, 163 (1996)]; 크래그(Cragg) 등의 문헌[Blood 101, 1045-1052 (2003)]; 및 크래그 및 글레니(Glennie)의 문헌[Blood 103, 2738-2743 (2004)] 참조).
증가된 효과자 기능은 예를 들어 Fc 영역의 글리코조작 또는 항체의 Fc 영역에서의 아미노산 돌연변이의 도입으로부터 초래될 수 있다. 한 실시태양에서 항체는 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 Fc 영역에 도입함으로써 조작된다. 하나의 구체적인 실시태양에서 아미노산 돌연변이는 아미노산 치환이다. 더욱 더 구체적인 실시태양에서 아미노산 치환은 Fc 영역의 위치 298, 333, 및/또는 334(잔기의 EU 번호매김)에서이다. 추가로 적합한 아미노산 돌연변이는 예를 들어 쉴즈 등의 문헌[J Biol Chem 9(2), 6591-6604 (2001)]; 미국 특허 제6,737,056호; 국제 특허출원 공개공보 WO 제2004/063351호 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2004/099249호에 기재되어 있다. 돌연변이체 Fc 영역은 당분야에 공지된 유전적 또는 화학적 방법을 사용하여 아미노산 결실, 치환, 삽입 또는 개질에 의해 제조될 수 있다. 유전적 방법은 인코딩 DNA 서열의 부위-특이적 돌연변이발생, PCR, 유전자 합성 등을 포함한다. 정확한 뉴클레오티드 변화는 예를 들면 서열화에 의해 확인될 수 있다.
또 다른 실시태양에서 항체는 Fc 영역에서 글리코실화의 개질에 의해 조작된다. 하나의 구체적인 실시태양에서 항체는 조작되지 않은 항체에 비하여 Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된다. 항체의 Fc 영역에서의 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율은 증가된 효과자 기능, 특히 증가된 ADCC를 갖는 항체를 생성한다.
더 구체적인 실시태양에서, 항체의 Fc 영역에서 N-연결된 올리고당의 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 이상 또는 약 100%, 바람직하게는 약 50% 이상, 더 바람직하게는 약 70% 이상은 푸코실화되지 않는다. 푸코실화되지 않은 올리고당은 하이브리드 또는 착체 유형일 수 있다.
또 다른 구체적인 실시태양에서 항체는 조작되지 않은 항체에 비하여 Fc 영역에서 이등분된 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된다. 더 구체적인 실시태양에서, 항체의 Fc 영역에서 N-연결된 올리고당의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 약 100%, 바람직하게는 약 50% 이상, 더 바람직하게는 약 70% 이상이 이등분된다. 이등분된 올리고당은 하이브리드 또는 착체 유형일 수 있다.
역시 또 다른 구체적인 실시태양에서 항체는 조작되지 않은 항체에 비하여 Fc 영역에서 이등분된, 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작된다. 더 구체적인 실시태양에서, 항체의 Fc 영역에서 N-연결된 올리고당의 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95% 이상, 또는 약 100%, 바람직하게는 약 15% 이상, 더 바람직하게는 약 25% 이상, 약 35% 이상 또는 약 50% 이상이 이등분되고, 푸코실화되지 않는다. 이등분된, 푸코실화되지 않은 올리고당은 하이브리드 또는 착체 유형일 수 있다.
항체 Fc 영역에서 올리고당 구조물은 당분야에 공지된 방법, 예를 들어 우마나(Umana) 등의 문헌[Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)] 또는 페라라(Ferrara) 등의 문헌[Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)]에 기재된 바와 같은 말디 토프(MALDI TOF) 질량 분석에 의해 분석될 수 있다. 푸코실화되지 않은 올리고당의 백분율은 Asn 297에 결합된 모든 올리고당에 비하여 푸코스 잔기가 부족한 올리고당의 양이고(예를 들어, 착체, 하이브리드 및 높은 만노스 구조물), 말디 토프 MS에 의해 N-글리코시다아제 F 처리된 샘플에서 확인된다. Asn 297은 Fc 영역에서 약 위치 297에 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭하지만(Fc 영역 잔기의 EU 번호매김); Asn297 위치는, 항체에서 극소수의 서열 편차에 기인하여, 297의 약 + 3 아미노산 상류 또는 하류에, 즉 위치 294 및 300에 위치될 수 있다. 이등분된, 또는 이등분되고 푸코실화되지 않은 올리고당의 백분율은 유사하게 결정된다.
한 실시태양에서 항체는, 하나 이상의 글리코실전이효소의 변경된 활성을 갖는 숙주 세포에서 항체를 생산함으로써, 조작되지 않은 항체에 비하여 Fc 영역에서 개질된 글리코실화를 갖도록 조작된다. 글리코실전이효소로는 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 Ⅲ(GnTⅢ), P(1,4)-갈락토실전이효소(GalT), β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 I(GnTI), β(1,2)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 Ⅱ(GnTⅡ) 및 α(1,6)-푸코실전이효소가 포함된다. 하나의 구체적인 실시태양에서 항체는, 증가된 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 Ⅲ(GnTⅢ) 활성을 갖는 숙주 세포에서 항체를 생산함으로써, 조작되지 않은 항체에 비하여 Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 비율이 증가되도록 조작된다. 더욱 더 구체적인 실시태양에서 숙주 세포는 추가로 증가된 α-만노시다아제 Ⅱ(ManⅡ) 활성을 갖는다. 본 발명에 유용한 항체를 조작하기 위해 사용될 수 있는 글리코조작 방법은 우마나 등의 문헌[Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)]; 페라라 등의 문헌[Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)]; 국제 특허출원 공개공보 WO 제99/54342호(미국 특허 제6,602,684호; EP 제1071700호); 국제 특허출원 공개공보 WO 제2004/065540호(미국 특허출원 공개공보 제2004/0241817호; EP 제1587921호), 국제 특허출원 공개공보 WO 제03/011878호(미국 특허출원 공개공보 제2003/0175884호)에 더 상세히 기재되어 있고, 각각의 전체 내용은 본원에 참고로 이의 전체가 인용된다. 이러한 방법을 사용하여 글리코조작된 항체는 본원에 글리코맵으로서 지칭된다.
일반적으로, 본원에 논의된 세포주를 포함하는 임의의 유형의 배양된 세포주는 변경된 글리코실화 패턴을 갖는 항-TNC A2 항체의 생산을 위한 세포주를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 특정 세포주로는 CHO 세포, BHK 세포, NS0 세포, SP2/0 세포, YO 골수종 세포, P3X63 마우스 골수종 세포, PER 세포, PER.C6 세포 또는 하이브리도마 세포, 및 다른 포유동물 세포가 포함된다. 특정 실시태양에서, 숙주 세포는 β(1,4)-N-아세틸글루코사미닐전이효소 Ⅲ(GnTⅢ) 활성을 갖는 증가된 수준의 하나 이상의 폴리펩타이드를 발현하도록 조작처리되었다. 특정 실시태양에서 숙주 세포는 추가로 α-만노시다아제 Ⅱ(ManⅡ) 활성을 갖는 증가된 수준의 하나 이상의 폴리펩타이드를 발현하도록 추가로 조작처리된다. 하나의 구체적인 실시태양에서, GnTⅢ 활성을 갖는 폴리펩타이드는 GnTⅢ의 촉매 도메인 및 이종성 골지 거주 폴리펩타이드의 골지 편재화 도메인을 포함하는 융합 폴리펩타이드이다. 특별히, 상기 골지 편재화 도메인은 만노시다아제 Ⅱ의 골지 편재화 도메인이다. 이러한 융합 폴리펩타이드를 생성하고 증가된 효과자 기능을 갖는 항체를 생산하기 위해 이들을 사용하기 위한 방법은 페라라 등의 문헌[Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)] 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2004/065540호에 개시되어 있고, 이의 전체 내용은 명백히 본원에 참고로 인용된다.
본 발명에 유용한 항체의 코딩 서열 및/또는 글리코실전이효소 활성을 갖는 폴리펩타이드의 코딩 서열을 포함하고 생물 활성 유전자 생성물을 발현하는 숙주 세포는, 예를 들어 DNA-DNA 또는 DNA-RNA 하이브리드화; "마커" 유전자 기능의 존재 또는 부재; 숙주 세포에서의 개개의 mRNA 전사물의 발현에 의해 측정될 경우의 전사 수준의 평가; 또는 면역검정 또는 그의 생물 활성에 의해 측정될 경우의 유전자 생성물의 검출-당분야에 공지된 방법-에 의해 확인될 수 있다. GnTⅢ 또는 Man Ⅱ 활성은, 예를 들어 GnTⅢ 또는 ManⅡ의 생물합성 생성물에 각각 결합하는 렉틴을 사용함으로써 검출될 수 있다. 이러한 렉틴을 위한 예는 이등분 GlcNAc를 포함하는 올리고당에 우선적으로 결합하는 E4-PHA 렉틴이다. GnTⅢ 또는 ManⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드의 생합성 생성물(즉, 특정 올리고당 구조물)은 또한 상기 폴리펩타이드를 발현하는 세포에 의해 생산된 당단백질로부터 방출된 올리고당의 질량 분광 분석에 의해 검출될 수도 있다. 다르게는, GnTⅢ 또는 ManⅡ 활성을 갖는 폴리펩타이드에 의해 조작된 세포에 의해 생산된 항체에 의해 중재된 증가된 효과자 기능, 예를 들어 증가된 Fc 수용체 결합을 측정하는 작용성 검정이 사용될 수 있다.
또 다른 실시태양에서 항체는, 감소된 α(1,6)-푸코실전이효소 활성을 갖는 숙주 세포에서 항체를 생산함으로써, 조작되지 않은 항체에 비하여 Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 비율이 증가되도록 조작된다. 감소된 α(1,6)-푸코실전이효소 활성을 갖는 숙주 세포는 α(1,6)-푸코실전이효소 유전자가 손실되거나 달리는 실활된, 예를 들어 넉아웃(knock out)된 세포일 수 있다(야마네-오누키(Yamane-Ohnuki) 등의 문헌[Biotech Bioeng 87, 614 (2004)]; 칸다(Kanda) 등의 문헌[Biotechnol Bioeng, 94(4), 680-688 (2006)]; 니와(Niwa) 등의 문헌[J Immunol Methods 306, 151-160 (2006)] 참조).
푸코실제거된 항체를 생산할 수 있는 세포주의 다른 예로는 단백질 푸코실화가 결핍된 Lec13 CHO 세포가 포함된다(립카(Ripka) 등의 문헌[Arch Biochem Biophys 249, 533-545 (1986)]; 미국 특허출원 공개공보 제2003/0157108호; 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2004/056312호, 특히 실시예 11). 본 발명에서 유용한 항체는 다르게는 EP 1 176 195 A1호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제03/084570호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제03/085119호 및 미국 특허출원 공개공보 제2003/0115614호, 제2004/093621호, 제2004/110282호, 제2004/110704호, 제2004/132140호, 미국 특허 제6,946,292호[교와(Kyowa)]에 개시된 기법에 따라, 예를 들어 항체 생산에 사용된 숙주 세포에서 GDP-푸코스 수송자 단백질의 활성을 감소 또는 제거함으로써 Fc 영역에서 푸코스 잔기가 감소되도록 글리코조작될 수 있다.
본 발명에서 유용한 글리코조작된 항체는 또한 개질된 당단백질을 생산하는 발현 시스템에서 생산될 수 있고, 예컨대 국제 특허출원 공개공보 WO 제03/056914호[글리코파이 인코포레이티드(GlycoFi, Inc.)] 또는 국제 특허출원 공개공보 WO 제2004/057002호 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2004/024927호[그리노베이션(Greenovation)]에 교시된 것들이다.
재조합 방법
본 발명에서 유용한 항체 및 면역컨주게이트를 생산하는 방법은 당분야에 잘 공지되어 있고, 예를 들면 국제 특허출원 공개공보 WO 제2011/020783호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2005/044859호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2006/082515호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/017963호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2005/005635호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2008/077546호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2011/023787호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2011/076683호, 국제 특허출원 공개공보 WO 제2011/023389호 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2006/100582호에 기재되어 있다. 다중클론성 항체 및 단일클론성 항체를 생산하기 위해 수립된 방법은, 또한, 예를 들어 할로우(Harlow) 및 레인(Lane)의 문헌[Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988]에 기재되어 있다.
비천연 발생 항체 또는 이의 단편은 고체 상-펩타이드 합성에 의해 작성될 수 있거나, 재조합적으로 생산될 수 있거나(예를 들어 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 바와 같음) 또는, 예를 들면, 가변성 중쇄 및 가변성 경쇄를 포함하는 조합적 라이브러리를 선별함으로써 수득될 수 있다[예를 들어 맥카퍼티(McCafferty)에게 허여된 미국 특허 제5,969,108호 참조]. 본 발명에서 유용한 면역컨주게이트 및 항체의 재조합 생산을 위해, 상기 면역컨주게이트 또는 항체를 코딩하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드(들)이 단리되고 숙주 세포에서의 추가의 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터내로 삽입된다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 관습적 절차에 의해 쉽게 단리되고 서열화될 수 있다. 적절한 전사/번역 제어 신호에 따라 항체 또는 면역컨주게이트의 코딩 서열을 함유하는 발현 벡터를 작성하기 위해 당분야의 숙련가에게 공지된 방법이 사용될 수 있다. 이들 방법으로는 시험관내 재조합 DNA 기법, 합성 기법 및 생체내 재조합/유전적 재조합이 포함된다. 예를 들면, 마니아티스(Maniatis) 등의 문헌[MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989)]; 및 어수벨(Ausubel) 등의 문헌[CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989)]에 기재된 기법을 참조한다.
본 발명에서 유용한 면역컨주게이트는 전체 면역컨주게이트를 코딩하는 단일 폴리뉴클레오티드로부터 또는 공동-발현되는 다중(예를 들어, 둘 이상의) 폴리뉴클레오티드로부터 발현될 수 있다. 공동-발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 폴리펩타이드는, 예를 들어, 디설파이드 결합을 통해 또는 작용성 면역컨주게이트를 형성하는 다른 수단을 통해 회합될 수 있다. 예를 들면, 항원 결합 구성부분의 중쇄 부분은 항원 결합 구성부분 및 효과자 구성부분의 경쇄 부분을 포함하는 면역컨주게이트의 부분으로부터 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다. 공동-발현될 경우, 중쇄 폴리펩타이드는 경쇄 폴리펩타이드와 회합하여 항원 결합 구성부분을 형성한다. 다르게는, 또 다른 예에서, 항원 결합 구성부분의 경쇄 부분은 항원 결합 구성부분 및 효과자 구성부분의 중쇄 부분을 포함하는 면역 컨주게이트의 부분으로부터 별도의 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩될 수 있다.
재조합 단백질의 발현을 복제하고 지지하는데 적합한 숙주 세포는 당분야에 공지되어 있다. 이러한 세포는 적절하다면 특정한 발현 벡터에 의해 형질감염되거나 형질전환되고, 다량의 벡터 함유 세포는 충분량의 단백질을 수득하기 위해, 예를 들어 임상적 적용을 위한 대규모 발효기를 접종하기 위해 성장될 수 있다. 적합한 숙주 세포로는 원핵 미생물, 예컨대 이. 콜라이, 또는 다양한 진핵 세포, 예컨대 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 곤충 세포 등이 포함된다. 예를 들면, 재조합 단백질은, 특히 글리코실화가 필요하지 않을 경우 박테리아에서 생산될 수 있다. 발현 후, 단백질은 용액 분별물중의 박테리아 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고, 추가로 정제될 수 있다. 원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 섬유상 곰팡이 또는 효모는 단백질-인코딩 벡터를 위한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이고, 글리코실화 경로가 "인간화"되어 인간 글리코실화 패턴을 부분적으로 또는 전체적으로 갖는 단백질의 생산을 초래하는 곰팡이 및 효모 균주가 포함된다. 게른그로스(Gerngross) 등의 문헌[Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004)], 및 리(Li) 등의 문헌[Nat Biotech 24, 210-215 (2006)]을 참조한다. (글리코실화된) 단백질의 발현에 적합한 숙주 세포는 또한 다세포 유기체(무척추동물 및 척추동물)로부터 유래될 수 있다. 무척추동물 세포의 예는 식물 및 곤충 세포이다. 곤충 세포와 함께, 특별히 스포돕테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포의 형질 감염을 위해 사용될 수 있는 다양한 바큘로바이러스(baculoviral) 균주가 식별되었다. 식물 세포 배양액 또한 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들어 미국 특허 제5,959,177호; 제6,040,498호; 제6,420,548호; 제7,125,978호, 및 제6,417,429호[형질감염 식물에서 항체를 생산하기 위한 플랜티바디스(PLANTIBODIES:등록상표) 기술을 기재함]를 참조한다. 척추동물 세포가 또한 숙주로서 사용될 수 있다. 예를 들면, 현탁액에서 성장하도록 적응된 포유동물 세포주가 유용하다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 다른 예는 SV40(COS-7)에 의해 형질변환된 원숭이 신장 CV1 세포주; 인간 배아 신장(HEK: human embryonic kidney) 세포주(예를 들어, 그라함(Graham) 등의 문헌[J Gen Virol 36, 59 (1977)]에 기재된 바와 같은 293 또는 293T 세포), 베이비 햄스터 신장 세포(BHK: baby hamster kidney cell), 마우스 세르톨리(sertoli) 세포(예를 들어, 매터(Mather) 등의 문헌[Biol Reprod 23, 243-251 (1980)]에 기재된 바와 같은 TM4 세포), 원숭이 신장 세포(CV1), 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포(VERO-76), 인간 경부 암종 세포(HELA), 고양이 신장 세포(MDCK), 버팔로 래트(buffalo rat) 간 세포(BRL 3A), 인간 폐 세포(W138), 인간 간 세포(Hep G2), 마우스 유방 종양 세포 (MMT 060562), TRI 세포(예를 들어, 매터 등의 문헌[Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)]에 기재된 바와 같음), MRC 5 세포, 및 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유동물 숙주 세포주로는 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 예컨대 dhfr- CHO 세포(Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); 및 골수종 세포주, 예컨대 YO, NS0, P3X63 및 Sp2/0가 포함된다. 단백질 생산에 적합한 특정 포유동물 숙주 세포주를 검토하기 위해, 예를 들어, 야자키(Yazaki) 및 우(Wu)의 문헌[Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Hmuana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003)]을 참조한다. 숙주 세포로는 배양된 세포, 예로서 몇 개를 들자면, 포유동물 배양된 세포, 효모 세포, 곤충 세포, 박테리아 세포 및 식물 세포, 뿐만 아니라 형질감염 동물, 형질감염 식물 또는 배양된 식물 또는 동물 조직내에 포함된 세포가 포함된다. 한 실시태양에서, 숙주 세포는 진핵 세포, 특별히 포유동물 세포, 예를 들어 중국 햄스터 난소(CHO) 세포, 인간 배아 신장(HEK) 293 세포, 또는 림프구 세포(예를 들어, Y0, NSO, Sp20 세포)이다.
항체 및 면역컨주게이트가 인간에게 사용하려고 의도된다면, 항체 또는 항원 결합 구성부분의 키메라성 형태가 사용될 수 있고, 여기서 항체 불변성 영역이 인간으로부터 유도된다. 항체 또는 항원 결합 구성부분의 인간화된 또는 완전한 인간 형태는 또한 당분야에 공지된 방법에 따라 제조될 수도 있다[예를 들어, 윈터(Winter)에게 허여된 미국 특허 제5,565,332호]. 인간화는 다양한 방법, 예컨대 제한되지 않지만, (a) 인간 이외의(예를 들어, 공여자 항체) CDR을 인간(예를 들어 수용자 항체) 골격구조 및 불변성 영역으로, 중요한 골격구조 잔기(예를 들어 양호한 항원 결합 친화도 또는 항체 기능을 보유하는데 중요한 잔기)를 보유하거나 보유하지 않고, 그래프팅시키거나, (b) 단지 인간 이외의 특이성-결정 영역(SDR 또는 a-CDR; 항체-항원 상호작용에 중요한 잔기)을 인간 골격구조 및 불변성 영역에 그래프팅시키거나, 또는 (c) 전체적인 인간 이외의 가변성 도메인을 이식하지만, 이들을 표면 잔기의 대체에 의해 인간-유사 구간으로 차단함으로써 달성될 수 있다. 인간화된 항체 및 이들을 제조하기 위한 방법은, 예를 들어, 알마그로(Almagro) 및 프란손(Fransson)의 문헌[Front Biosci 13, 1619-1633 (2008)]에 검토되어 있고, 추가로, 예를 들어, 리에치만(Riechmann) 등의 문헌[Nature 332, 323-329 (1988)]; 퀸(Queen) 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci USA 86, 10029-10033 (1989)]; 미국 특허 제5,821,337호, 제7,527,791호, 제6,982,321호, 및 제7,087,409호; 존스(Jones) 등의 문헌[Nature 321, 522-525 (1986)]; 모리슨(Morrison) 등의 문헌[Proc Natl Acad Sci 81, 6851-6855 (1984)]; 모리슨 및 오이(Oi)의 문헌[Adv Immunol 44, 65-92 (1988)]; 베르회옌(Verhoeyen) 등의 문헌[Science 239, 1534-1536 (1988)]; 파들란(Padlan)의 문헌[Molec Immun 31(3), 169-217 (1994)]; 카쉬미리(Kashmiri) 등의 문헌[Methods 36, 25-34 (2005)](SDR (a-CDR) 그래프팅을 기재함); 파들란의 문헌[Mol Immunol 28, 489-498 (1991)("재출현(resurfacing)"을 기재함); 달라쿠아(Dall'Acqua) 등의 문헌[Methods 36, 43-60 (2005)]("FR 셔플링(shuffling)"); 및 오스보른(Osbourn) 등의 문헌[Methods 36, 61-68 (2005)] 및 클림카(Klimka) 등의 문헌[Br J Cancer 83, 252-260 (2000)](FR 셔플링에 대한 "지침된 선택"을 기재함)에 기재되어 있다. 인간 항체 및 인간 가변성 영역은 당분야에 공지된 다양한 기법에 의해 생산될 수 있다. 인간 항체는 일반적으로 반 디지크(van Dijk) 및 반 데 윙켈(van de Winkel)의 문헌[Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001)] 및 롱베르그(Lonberg)의 문헌[Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008)]에 기재되어 있다. 인간 가변성 영역은 하이브리도마 방법에 의해 만들어진 인간 단일클론성 항체의 일부를 형성하고 이로부터 유래될 수 있다(예를 들어 문헌[Monoclonal Antibodies Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변성 영역은 또한 항원 챌린지(challenge)에 반응하여 인간 가변성 영역을 갖는 고유의 항체 또는 고유의 인간 항체를 생산하도록 개질된 형질감염 동물에게 면역원을 투여함으로써 제조될 수도 있다(예를 들어 롱베르그의 문헌[Nat Biotech 23, 1117-1125 (2005)] 참조). 인간 항체 및 인간 가변성 영역은 또한 인간-유래된 파아지 디스플레이 라이브러리로부터 선택된 Fv 클론 가변성 영역 서열을 단리함으로써 생산될 수도 있다(예를 들어, 후겐붐(Hoogenboom) 등의 문헌["Methods in Molecular Biology 178, 1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001)]; 맥카퍼티 등의 문헌[Nature 348, 552-554]; 및 클락슨(Clackson) 등의 문헌[Nature 352, 624-628 (1991)" 참조). 파아지는 전형적으로 항체 단편을 단일-쇄 Fv(scFv) 단편 또는 Fab 단편으로서 표시한다.
특정 실시태양에서, 본 발명에서 유용한 항체 또는 항원 결합 구성부분은, 예를 들면, 미국 특허출원 공개공보 제2004/0132066호(이의 전체 내용은 본원에 참고로 인용됨)에 개시된 방법에 따라 증진된 결합 친화도를 갖도록 조작된다. 특정 항원 결정자에 대한 항체 또는 항원-결합 구성부분의 능력은 효소-연결된 면역흡수 검정(ELISA) 또는 당분야의 숙련가에게 친숙한 다른 기법, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기법(비아코어 T100 시스템 상에서 분석됨)(Liljeblad, et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), 및 전통적 결합 검정(Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002))을 통해 측정될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같이 제조된 항체 및 면역컨주게이트는 당분야에 공지된 기법, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 전기영동, 친화도 크로마토그래피, 크기 배제 크로마토그래피 등에 의해 정제될 수 있다. 특정 단백질을 정제하기 위해 사용되는 실제 조건은, 부분적으로는, 예컨대 순 전하, 소수성, 친수성 등의 인자에 좌우될 것이고, 당분야의 숙련가에게 분명할 것이다.
약학 조성물
또 다른 양태에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체를 약학적으로 허용가능함 담체중에 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 이들 약학 조성물은, 예를 들어, 하기 기재된 임의의 치료 방법에서 사용될 수 있다.
본원에 기재된 바와 같은 증가된 효과자 기능을 갖는 항체 및 면역컨주게이트의 약학 조성물은, 원하는 순도를 갖는 이러한 면역컨주게이트 및 항체를 하나 이상의 임의적인 약학적으로 허용가능함 담체(Remington's Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Printing Company (1990))와, 동결건조된 제형 또는 수성 용액의 형태로 혼합함으로써 제조된다. 약학적으로 허용가능함 담체는 사용되는 투여량 및 농도에서 수용자에게 일반적으로 무독성이고, 제한되지 않지만: 완충액, 예컨대 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기 산; 항산화제, 예컨대 아스코르브산 및 메티오닌; 보존제(예컨대 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드; 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 사이클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레솔); 저분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩타이드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 라이신; 단당류, 이당류, 및 기타 탄수화물, 예컨대 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당분, 예컨대 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대이온, 예컨대 나트륨; 금속 착체(예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이 포함된다. 본원에서 예시적인 약학적으로 허용가능함 담체로는 추가로 간질 약물 분산제, 예컨대 가용성 중성-활성 히알루로니다아제(hyaluronidase) 당단백질(sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루로니다아제 당단백질, 예컨대 rHuPH20[하이레넥스(HYLENEX: 등록상표), 박스터 인터내셔널 인코포레이티드(Baxter International, Inc.)]이 포함된다. 특정한 예시적인 sHASEGP 및 사용 방법(rHuPH20 포함)이 미국 특허출원 공개공보 제2005/0260186호 및 제2006/0104968호에 기재되어 있다. 한 양태에서, sHASEGP는 하나 이상의 추가의 글리코사미노글리카나아제(glycosaminoglycanase), 예컨대 콘드로이티나아제와 조합된다.
예시적인 동결건조된 제형은 미국 특허 제6,267,958호에 기재되어 있다. 수성 제형은 미국 특허 제6,171,586호 및 국제 특허출원 공개공보 WO 제2006/044908호에 기재되어 있고, 후자의 제형은 히스티딘-아세테이트 완충액을 포함한다.
본원에서 약학 조성물은 또한 치료되는 특정 증후에 필요할 경우 추가의 활성 구성성분, 특별히 서로 해로운 효과를 주지 않는 상보성 활성을 갖는 구성성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 치료될 질병이 암이라면, 하나 이상의 항암제, 예를 들어 화학치료제, 종양 세포 증식 억제제, 또는 종양 세포 아포토시스 활성화제를 추가로 제공하는 것이 요망될 수 있다. 이러한 활성 구성성분들은 의도된 목적을 위해 효과적인 양으로 조합하여 적절히 존재한다.
활성 구성성분들은, 예를 들면, 코아세르베이션(coacervation) 기법 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐, 예를 들면, 하이드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐중에서 각각 콜로이드성 약물 전달 시스템(예를 들면, 리포좀, 알부민 마이크로구, 마이크로에멀전, 나노 입자 및 나노캡슐)으로 또는 매크로에멀전으로 트래핑될 수 있다. 이러한 기법은 레밍턴의 문헌[Pharmaceutical Sciences 18th edition, Mack Printing Company (1990)]에 개시되어 있다.
지연된 방출 제제가 제조될 수 있다. 지연된 방출 제제의 적합한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되고, 이러한 매트릭스는 성형 제품, 예를 들어 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 사용되는 조성물은 일반적으로 무균이다. 무균은, 예를 들어 멸균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
치료 방법
(a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 본원에 제공된 조합물은 치료 방법에 사용될 수 있다.
한 양태에서, 약제로서 사용하기 위한 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물이 제공된다. 추가의 양태에서, 질병의 치료에 사용하기 위한 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물이 제공된다. 특정 실시태양에서, 치료 방법에 사용하기 위한 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물이 제공된다. 특정 실시태양에서, 본 발명은, 개체에게 조합물의 치료 효과량을 투여함을 포함하는, 질병을 갖는 개체를 치료하는 방법에 사용하기 위한 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 제공한다. 하나의 이러한 실시태양에서, 본 방법은 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 이후 기재되는 바와 같은 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 본 발명은 효과자 세포의 기능을 자극하는데 사용하기 위한 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 제공한다. 특정 실시태양에서, 본 발명은 효과자 세포 기능을 자극하기 위해 개체에게 효과량의 조합물을 투여함을 포함하는, 개체에서 효과자 세포 기능을 자극하기 위한 방법에서 사용하기 위한 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 제공한다. 상기 임의의 실시태양에 따른 "개체"는 포유동물, 특별히 인간이다. 상기 임의의 실시태양에 따른 "질병"은 효과자 세포 기능의 자극에 의해 치료가능한 질병이다. 특정 실시태양에서 질병은 세포 증식 질환, 특별히 암이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 약제의 제작 또는 제조에 있어서의 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물의 용도를 제공한다. 한 실시태양에서, 약제는 질병의 치료를 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 약제는 질병을 앓는 개체에게 치료 효과량의 약제를 투여함을 포함하는 질병의 치료 방법에서 사용하기 위한 것이다. 하나의 이러한 실시태양에서, 방법은 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 이후 기재되는 바와 같은 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 추가의 실시태양에서, 약제는 효과자 세포 기능을 자극하기 위한 것이다. 추가의 실시태양에서, 약제는 개체에게 효과자 세포 기능을 자극하기에 효과적인 양의 약제를 투여함을 포함하는, 개체에서 효과자 세포 기능을 자극하는 방법에서 사용하기 위한 것이다. 임의의 상기 실시태양에 따른 "개체"는 포유동물이고, 특별히 인간이다. 임의의 상기 실시태양에 따른 "질병"은 효과자 세포 기능을 자극함으로써 치료가능한 질병이다. 특정 실시태양에서 질병은 세포 증식 질환이고, 특별히 암이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 질병을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 방법은 이러한 질병을 앓는 개체에게 치료 효과량의 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 투여함을 포함한다. 하나의 이러한 실시태양에서, 방법은 개체에게 치료 효과량의 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어 이후 기재되는 바와 같은 치료제를 투여함을 추가로 포함한다. 임의의 상기 실시태양에 따른 "개체"는 포유동물이고, 특별히 인간이다. 임의의 상기 실시태양에 따른 "질병"은 효과자 세포 기능을 자극함으로써 치료가능한 질병이다. 특정 실시태양에서 질병은 세포 증식 질환이고, 특별히 암이다.
추가의 양태에서, 본 발명은 효과자 세포 기능을 개체에서 자극하기 위한 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 방법은 효과자 세포 기능을 자극하기 위한 효과량의 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 개체에게 투여함을 포함한다. 한 실시태양에서, "개체"는 포유동물, 특별히 인간이다.
추가의 양태에서, 본 발명은, 예를 들어 임의의 상기 치료 방법에 사용하기 위한, 본원에 기재된 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 임의의 조합물을 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 한 실시태양에서, 약학 조성물은 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 본원에 제공된 조합물, 및 약학적으로 허용가능함 담체를 포함한다. 또 다른 실시태양에서, 약학 조성물은 본원에 제공된 임의의 조합물, 및 하나 이상의 추가의 치료제, 예를 들어, 이후 기재되는 바와 같은 치료제를 포함한다.
임의의 상기 실시태양에 따라서, 질병은 효과자 세포 기능을 자극함으로써 치료가능한 질환이다. 본 발명의 조합물은, 숙주의 면역 시스템의 자극이 이로운 질병 상태, 특히 증진된 세포 면역 반응이 요망되는 증상을 치료하는데 유용하다. 이들은 숙주 면역 반응이 불충분하거나 결핍되는 질환 상태를 포함할 수 있다. 본 발명의 조합물이 투여되는 질병 상태는, 예를 들면, 세포 면역 반응이 특정 면역성을 위해 중요한 기작일 수 있는 종양 또는 감염을 포함한다. 본 발명의 조합물이 이용될 수 있는 특정 질환 상태로는 암, 구체적으로 신장 세포 암종 또는 흑색종; 면역 결핍, 구체적으로 HIV-양성 환자, 면역저해된 환자에서의 결핍, 만성 감염 등이 포함된다. 특정 실시태양에서 질병은 세포 증식 질환이다. 하나의 특별한 실시태양에서 질병은 암, 구체적으로 폐 암, 결장 암, 신장 암, 전립선 암, 유방 암, 두경부암, 난소 암, 뇌암, 림프종, 백혈병, 피부암으로 구성된 군에서 선택되는 암이다.
본 발명의 조합물은 단독으로 또는 다른 치료 제제와 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조합물은 하나 이상의 추가의 치료제와 공동-투여될 수 있다. 특정 실시태양에서, 추가의 치료제는 항암제, 예를 들어 화학치료제, 종양세포 증식 억제제, 또는 종양 세포 아포토시스의 활성화제이다.
본원에 제공된 바와 같은 조합 치료는 항체 및 면역컨주게이트를 함께(여기서, 둘 이상의 치료제는 동일하거나 별도의 제형에 포함됨), 및 별도로 투여함을 포함하고, 이 경우 항체의 투여는 면역컨주게이트, 추가의 치료제 및/또는 보조제의 투여 이전에, 동시에 및/또는 이후에 발생할 수 있다. 본 발명의 치료는 방사능 치료와 조합될 수도 있다.
본 발명의 조합물(및 임의의 추가의 치료제)은 임의의 적합한 경로, 예컨대 비경구적, 폐내, 및 비강내, 및 국소 치료가 요망된다면, 병변내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구적 주입으로는 근육내, 정맥내, 동맥내, 복강내 또는 피하 투여가 포함된다. 항체 및 면역컨주게이트는 동일하거나 상이한 경로에 의해 투여될 수 있다. 투약은, 부분적으로 투여가 간단한지 만성인지의 여부에 따라, 임의의 적합한 경로, 예를 들어 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사에 의해 이루어질 수 있다. 다양한 투약 계획, 예컨대 제한되지 않지만 단일 투여 또는 다양한 시점에 걸친 다중 투여, 일시정맥(bolus) 투여, 및 맥동 주입이 본원에서 고려된다.
본 발명의 조합물은 양호한 의학적 실행과 일치하는 방식으로 제형화되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이와 관련하여 고려되는 인자들로는 치료될 특정 질환, 치료될 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 증상, 질환의 원인, 제제의 전달 부위, 투여 방법, 투여 계획, 및 의사에게 공지된 다른 인자들이 포함된다. 조합물은, 필수적이지는 않지만, 문제가 되는 질환을 예방하거나 치료하기 위해 현재 사용되는 하나 이상의 제제와 함께 임의적으로 제형화된다. 이러한 다른 제제의 효과량은 제형에 존재하는 항체 및 면역컨주게이트의 양, 질환 또는 치료의 유형, 및 상기 논의된 다른 인자들에 의해 좌우된다. 이들은 일반적으로 본원에 기재된 바와 동일한 투여량으로 및 투여 경로에 의해 사용되거나, 본원에 기재된 투여량의 약 1 내지 99%로, 또는 실험적으로/임상적으로 적절한 것으로 결정된 임의의 투여량 및 임의의 경로로 사용된다.
질병을 예방 또는 치료하기 위해, 항체 및 면역컨주게이트의 적절한 투여량(임의적으로 하나 이상의 다른 추가의 치료제와 함께 본 발명의 조합물에서 사용될 경우)은 치료될 질병의 유형, 항체 및 면역컨주게이트의 유형, 질병의 위중성 및 경과, 조합물이 예방을 위해서인지 치료를 위해서인지의 여부, 이전의 치료법, 환자의 병력, 및 항체 및/또는 면역컨주게이트에 대한 반응, 및 관련 전문의의 재량에 좌우될 것이다. 항체 및 면역컨주게이트는 한번에 또는 일련의 치료로 환자에게 적합하게 투여된다.
질병의 유형 및 위중성에 따라서, 약 1 μg/㎏ 내지 15 ㎎/㎏(예를 들어 0.1 ㎎/㎏ 내지 10 ㎎/㎏)의 항체는, 예를 들면, 하나 이상의 별도의 투여에 의해서인지, 또는 연속 주입에 의해서인지와 무관하게, 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량일 수 있다. 하나의 전형적인 1일 투여량은, 상기 언급된 인자에 따라서, 약 1 μg/㎏ 내지 100 ㎎/㎏ 이상의 범위일 수 있다. 증상에 따라서, 수일 또는 그 이상에 걸쳐 반복되는 투여의 경우, 치료는 일반적으로 질병 증후의 원하는 억제가 초래될 때까지 지속될 수 있다. 하나의 예시적인 항체의 투여량은 약 0.05 ㎎/㎏ 내지 약 10 ㎎/㎏일 것이다. 이와 같이, 약 0.5 ㎎/㎏, 2.0 ㎎/㎏, 4.0 ㎎/㎏ 또는 10 ㎎/㎏(또는 이의 조합)중 하나 이상의 투약량이 환자에게 투여될 수 있다. 이러한 투약량은 간헐적으로, 예를 들어 매주 또는 3주마다 투여될 수 있다(예를 들어 환자가 항체를 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들어 약 6회 투약받도록 투여됨). 초기에는 더 높은 투약량으로 투여되다가, 이후 더 낮은 투약량으로 투여될 수 있다. 예시적인 투약 섭생은 항체의 약 4 ㎎/㎏의 투약량을 초기에 투여하고, 이후 약 2 ㎎/㎏의 투약량을 매주 유지하여 투여함을 포함한다. 투여량에 관한 동일한 고려사항이 본 발명에 따른 조합물에 사용되는 면역컨주게이트에 적용된다. 그러나, 다른 투여량 섭생이 유용할 수 있다. 이러한 치료의 진행은 관습적인 기법 및 검정에 의해 쉽게 모니터링될 수 있다.
제품
본 발명의 또 다른 양태에서, 상기 기재된 질환의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 하나 이상의 용기, 및 용기 위의 또는 용기와 연결된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 용기는 다양한 재료, 예컨대 유리 또는 플라스틱으로 형성될 수 있다. 용기는 조성물을 그 자체로 또는 증상을 치료, 예방 및/또는 진단하는데 효과적인 또 다른 조성물과 함께 보유하고, 멸균 진입 포트를 가질 수 있다(예를 들면 용기는 피하 주사 바늘에 의해 뚫리는 마개를 갖는 정맥내 용액 백 또는 바이알일 수 있다). 조성물중 하나 이상의 활성 제제는 본 발명의 조합물에서 사용되는 항체이다. 또 다른 활성 제제는 본 발명의 조성물에 사용되는 면역컨주게이트이고, 이는 항체와 동일한 조성물 및 용기에 존재하거나, 상이한 조성물 및 용기에 제공될 수 있다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 조성물이 선택 증상을 치료하기 위해 사용됨을 지시한다.
한 양태에서, 본 발명은 (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체를 동일한 용기 또는 별도의 용기에 포함하고, 임의적으로 (c) 질병을 치료하기 위한 방법으로서 조합된 치료의 사용을 지시하는 인쇄된 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 추가로 포함하는, 질병의 치료용 키트를 제공한다. 더욱이, 키트는 (a) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체를 포함하는 조성물이 함유된 제1 용기; (b) 하나 이상의 항원 결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역 컨주게이트를 포함하는 조성물이 함유된 제2 용기; 및 임의적으로 (c) 추가의 세포독성 또는 다른 치료 제제를 포함하는 조성물이 함유된 제3 용기를 포함할 수 있다. 본 발명의 이러한 실시태양의 키트는 조성물이 특정 증상을 치료하기 위해 사용될 수 있음을 지시하는 패키지 삽입물을 추가로 포함할 수 있다. 다르게는, 또는 부가적으로, 키트는 약학적으로 허용가능한 완충액, 예컨대 주사용 정균수(BWFI: bacteriostatic water for injection), 포스페이트-완충된 염수, 링거(Ringer) 용액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 제3 (또는 제4) 용기를 추가로 포함할 수 있다. 이는 상업적 관점 및 사용자 관점에서 요망되는 다른 물질들, 예컨대 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 추가로 포함할 수 있다.
실시예
다음은 본 발명의 방법 및 조성물의 예이다. 상기 제공된 일반적 기재내용이 제시되지만, 다양한 다른 실시태양이 실행될 수 있음을 알아야 한다.
일반적 방법
항체의 Fc 영역의 글리코조작은 인간 FcγRⅢ 수용체로의 증가된 결합 친화도를 이끌어 내고, 이는 다시 증진된 ADCC 유도 및 항-종양 효능으로 언급될 수 있다. 인간 FcγRⅢ 수용체는 대식세포, 호중구, 및 천연 킬러(NK), 수지상 및 γδ T 세포 상에서 발현된다. 마우스에서, 임상전 효능 시험을 위해 가장 널리 이용되는 종인 뮤린 FcγRIV, 즉 인간 FcγⅢa의 뮤린 동족체는 대식세포 및 호중구 상에 존재하지만 NK 세포 상에는 존재하지 않는다. 따라서, 글리코조작된 항체에 의해 임의의 예상되는 개선된 효능은 이들 모델에서 완전히 반영되지 않는다. 본 발명자들은 혈액, 림프구 조직 및 종양에서 뮤린 NK 세포 상에서 안정한 인간 CD16a 발현을 나타내는, 인간 FcγⅢa(CD16a)을 위한 형질감염성 마우스를 생산하였다. 더욱이, 이들 형질감염 마우스의 혈액중 자극되지 않은 NK 세포 상에서의 인간 CD16a의 발현 수준은 인간에서 발견된 것을 반영한다. 본 발명자들은 또한 항체 치료 후 종양-회합된 NK 세포 상의 인간 FcγⅢa의 하향조절이 항종양 활성과 상관됨을 보여주었다. 최종적으로, 본 발명자들은 이러한 신규 마우스 종을 사용하여 이들의 인간 CD16-음성 한배새끼(littermate)에 비하여 크게 개선된 글리코조작된 항체 치료 효능을 보여주었다.
실시예 1
A549 폐 이종이식 모델
TNC A2-표적화된 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트(서열 번호 117 및 120) 및 항-EGFR 글리코맵(서열 번호 142 및 143)을 SCID-인간 FcγRⅢ(hCD16) 형질감염 마우스에 정맥내 주사된 인간 비-소 세포 폐 암종(NSCLC) 세포주 A549에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 테나신 C의 A2 도메인에 대해 양성인 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 제시되었다. A549 NSCLC 세포를 고유적으로 ATCC(CCL-185)로부터 수득하고 팽창 후 글리카트(Glycart) 국내 세포 은행에 기탁하였다. 종양 세포주를 관례대로 10% FCS[깁코(Gibco)]가 함유된 DMEM에서 37℃하에 수포화된 대기중에서 5% C02에서 배양하였다. 98%의 생존 능력으로 이식하기 위해 8회의 계대배양을 사용하였다. 동물당 5×106개 세포를 200 ㎕의 에임(Aim)V 세포 배양 배지(깁코)에서 꼬리 정맥에 정맥내 주사하였다. 실험 시작시 8 내지 9주령의 암컷 SCID-FcγRⅢ 마우스[글리카트(GLYCART)-RCC](스위스 소재의 RCC에서 사육됨)를 위탁된 방침에 따라 매일 12 시간 명/12 시간 암 주기로 특정-병원체가 없는 조건하에 유지시켰다[GV-솔라스(GV-Solas); 펠라사(Felasa); 티에르쉬그(TierschG)]. 실험 연구 프로토콜은 지방 정부가 검토하고 승인하였다(P 2008016). 도착 후, 동물들을 1주 동안 새로운 환경에 적응시키고 관찰을 위해 유지시켰다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적인 기준으로 수행하였다. 연구 0일에 마우스에 정맥내로 5×106개의 A549 세포를 주사하고, 무작위 분류하고, 칭량하였다. 종양 세포 주사 1주 후, 마우스에 정맥내로 3주 동안 주 2회 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트를 주사하거나, 3주 동안 주 1회 항-EGFR 글리코맵을 주사하거나, 또는 3주 동안 주 2회 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트를, 및 3주 동안 주 1회 항-EGFR 글리코맵을 조합하여 주사하였다. 모든 마우스에 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내로 주사하였다. 투약량은 표 2에 구체화되어 있다. 비히클 군의 마우스에 PBS를 주사하고, 치료 군의 마우스에 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵, 또는 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵의 조합물을 주사하였다. 200 ㎕당 면역컨주게이트의 적절한 양을 수득하기 위해, 필요하다면 스톡(stock) 용액을 PBS로 희석하였다. 도 1로부터 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR-글리코맵의 조합물이 탁월한 효능을 중재하여 hCD16 형질감염 SCID 마우스에서 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵을 단독으로 투여한 경우에 비하여 상승적으로 증진된 중앙 생존율 및 전체 생존율을 초래하였음을 알 수 있다.
화합물 투약량/마우스 제형 완충액 농도(㎎/㎖)

항-EGFR
글리코맵
625 ㎍		 20 mM His/HisCl
240 mM 트레할로스
0.02% 트윈(Tween) 20
pH 6.0
9.7(=스톡 용액)
huTNC A2
2B10(G65S)
Fab-IL-2-
Fab=2B10
16 ㎍		 25 mM 인산 칼륨
125 mM NaCl
100 mM 글리신
pH 6.7
1.86(=스톡 용액)
실시예 2
LS174T 결장 이종이식 모델
TNC A2-표적화된 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵을 SCID 마우스에 비장내로 주사된 인간 결장 LS174T 세포주에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 테나신 C의 A2 도메인에 대해 양성인 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 제시되었다. LS174T 세포(인간 결장 암종 세포)를 고유적으로 유러피안 콜렉션 오브 셀 컬쳐(ECACC: European Collection of Cell Culture)로부터 수득하고, 팽창 후 글리카트 국내 세포 은행에 기탁하였다. LS174T를 10% FCS[오스트리아 소재의 피에이에이 래보레이토리즈(PAA Laboratories)], 1% 글루타맥스(Glutamax) 및 1% MEM 비필수 아미노산[시그마(Sigma)]이 함유된 MEM 이글(Eagle)의 배지에서 배양하였다. 세포를 37℃에서 수포화된 대기중에서 5% C02에서 배양하였다. 97%의 생존 능력에서 비장내 주사를 위해 시험관내 18회의 계대배양을 사용하였다. 마취된 SCID 마우스의 왼쪽 복부에 작은 절개를 내었다. 50 마이크로리터의 세포 현탁액(에임V 배지중 3×106 LS174T 세포)을 복부 벽을 통해 비장의 피낭 바로 아래에 주사하였다. 피부 상처를 클램프로 폐쇄하였다. 실험 시작시 8 내지 9 주령의 암컷 SCID 마우스[덴마크 소재의 타코닉스(Taconics)로부터 구입]를 위탁된 방침에 따라 매일 12 시간 명/12 시간 암 주기로 특정-병원체가 없는 조건하에 유지시켰다(GV-솔라스; 펠라사; 티에르쉬그). 실험 연구 프로토콜은 지방 정부가 검토하고 승인하였다(P 2008016). 도착 후, 동물들을 1주 동안 새로운 환경에 적응시키고 관찰을 위해 유지시켰다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적인 기준으로 수행하였다. 연구 0일에 마우스에 비장내로 3×106개의 LS174T 세포를 주사하고, 무작위 분류하고, 칭량하였다. 종양 세포 주사 1주 후, 마우스에 정맥내로 3주 동안 주 2회 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트를 주사하거나, 3주 동안 주 1회 항-EGFR 글리코맵을 주사하거나, 또는 3주 동안 주 2회 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트를, 및 3주 동안 주 1회 항-EGFR 글리코맵을 조합하여 주사하였다. 모든 마우스에 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내로 주사하였다. 투약량은 표 3에 구체화되어 있다. 비히클 군의 마우스에 PBS를 주사하고, 치료 군의 마우스에 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵, 또는 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵의 조합물을 주사하였다. 200 ㎕당 면역컨주게이트의 적절한 양을 수득하기 위해, 필요하다면 스톡 용액을 PBS로 희석하였다. 도 2로부터 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR-글리코맵의 조합물이 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵을 단독으로 투여한 경우에 비하여 증진된 중앙 생존율 및 전체 생존율에 있어서 탁월한 효능을 중재하였음을 알 수 있다.
화합물 투약량/마우스 제형 완충액 농도(㎎/㎖)

항-EGFR
글리코맵
625 ㎍		 20 mM His/HisCl
240 mM 트레할로스
0.02% 트윈 20
pH 6.0
9.7(=스톡 용액)
huTNC A2
2B10(G65S)
Fab-IL-2-
Fab=2B10
16 ㎍		 25 mM 인산 칼륨
125 mM NaCl
100 mM 글리신
pH 6.7
1.86(=스톡 용액)
실시예 3
ACHN 신장 암종 이종이식 모델
FAP-표적화된 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트(서열 번호 102 및 112) 및 항-EGFR 글리코맵을 SCID 마우스에 신장내로 주사된 인간 신장 세포주 ACHN에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 FAP에 대해 양성인 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 제시되었다. ACHN 세포(인간 신장 아데노암종 세포)를 고유적으로 ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)로부터 수득하고, 팽창 후 글리카트 국내 세포 은행에 기탁하였다. ACHN 세포를 10% FCS가 포함된 DMEM에서 37℃하에 수포화된 대기중에서 5% C02에서 배양하였다. 97.7%의 생존 능력에서 신장내 주사를 위해 시험관내 9회의 계대배양을 사용하였다. 마취된 SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 및 복막 벽에 작은 절개(2 ㎝)를 내었다. 50 ㎕의 세포 현탁액(에임V 배지중 1×106 ACHN 세포)을 신장에 2 ㎜ 피막하에 주사하였다. 피부 상처 및 복막 벽을 클램프로 폐쇄하였다. 실험의 시작시 8 내지 9주령의 암컷 SCID 마우스[독일 슐츠펠트 소재의 찰스 리버(Charles River)로부터 구입됨]를 위탁된 방침에 따라 매일 12 시간 명/12 시간 암 주기로 특정-병원체가 없는 조건하에 유지시켰다(GV-솔라스; 펠라사; 티에르쉬그). 실험 연구 프로토콜은 지방 정부가 검토하고 승인하였다(P 2008016). 도착 후, 동물들을 1주 동안 새로운 환경에 적응시키고 관찰을 위해 유지시켰다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적인 기준으로 수행하였다. 연구 0일에 마우스에 신장내로 1×106개 ACHN 세포를 주사하고, 무작위 분류하고, 칭량하였다. 종양 세포 주사 1주 후, 마우스에 정맥내로 3주 동안 주 2회 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트를 주사하거나, 3주 동안 주 1회 항-EGFR 글리코맵을 주사하거나, 또는 3주 동안 주 2회 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트를, 및 3주 동안 주 1회 항-EGFR 글리코맵을 조합하여 주사하였다. 모든 마우스에 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내로 주사하였다. 투약량은 표 4에 구체화되어 있다. 비히클 군의 마우스에 PBS를 주사하고, 치료 군의 마우스에 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵, 또는 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵의 조합물을 주사하였다. 200 ㎕당 면역컨주게이트의 적절한 양을 수득하기 위해, 필요하다면 스톡 용액을 PBS로 희석하였다. 도 3으로부터 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR-글리코맵의 조합물이 SCID 마우스에서 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵을 단독으로 투여한 경우에 비하여 상승적으로 증진된 중앙 생존율 및 전체 생존율을 초래하였음을 알 수 있다.
화합물 투약량/마우스 제형 완충액 농도(㎎/㎖)

항-EGFR
글리코맵
625 ㎍		 20 mM His/HisCl
240 mM 트레할로스
0.02% 트윈 20
pH 6.0
9.7(=스톡 용액)
FAP 3F2
Fab-IL-2-Fab=FAP
3F2
16 ㎍		 25 mM 인산 칼륨
125 mM NaCl
100 mM 글리신
pH 6.7
2.46(=스톡 용액)
실시예 4
ACHN 신장 암종 이종이식 모델
FAP-표적화된 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵을 SCID-인간 FcγRⅢ 형질감염 마우스로 신장내로 주사된 인간 신장 세포주 ACHN에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 FAP에 대해 양성인 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 제시되었다. ACHN 세포(인간 신장 아데노암종 세포)를 고유적으로 ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)로부터 수득하고, 팽창 후 글리카트 국내 세포 은행에 기탁하였다. ACHN 세포를 10% FCS가 포함된 DMEM에서 37℃하에 수포화된 대기중에서 5% C02에서 배양하였다. 96.7%의 생존 능력에서 신장내 주사를 위해 시험관내 11회의 계대배양을 사용하였다. 마취된 SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 및 복막 벽에 작은 절개(2 ㎝)를 내었다. 50 ㎕의 세포 현탁액(에임V 배지중 1×106 ACHN 세포)을 신장에 2 ㎜ 피막하에 주사하였다. 피부 상처 및 복막 벽을 클램프로 폐쇄하였다. 실험 시작시 8 내지 9주령의 암컷 SCID-FcγRⅢ 마우스(글리카트-RCC)(스위스 소재의 RCC에서 사육됨)를 위탁된 방침에 따라 매일 12 시간 명/12 시간 암 주기로 특정-병원체가 없는 조건하에 유지시켰다(GV-솔라스; 펠라사; 티에르쉬그). 실험 연구 프로토콜은 지방 정부가 검토하고 승인하였다(P 2008016). 도착 후, 동물들을 1주 동안 새로운 환경에 적응시키고 관찰을 위해 유지시켰다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적인 기준으로 수행하였다. 연구 0일에 마우스에 신장내로 1×106개 ACHN 세포를 주사하고, 무작위 분류하고, 칭량하였다. 종양 세포 주사 1주 후, 마우스에 정맥내로 3주 동안 주 2회 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트를 주사하거나, 3주 동안 주 1회 항-EGFR 글리코맵을 주사하거나, 또는 3주 동안 주 2회 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트를, 및 3주 동안 주 1회 항-EGFR 글리코맵을 조합하여 주사하였다. 모든 마우스에 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내로 주사하였다. 투약량은 표 5에 구체화되어 있다. 비히클 군의 마우스에 PBS를 주사하고, 치료 군의 마우스에 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵, 또는 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵의 조합물을 주사하였다. 200 ㎕당 면역컨주게이트의 적절한 양을 수득하기 위해, 필요하다면 스톡 용액을 PBS로 희석하였다. 도 4로부터 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR-글리코맵의 조합물이 3F2 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵을 단독으로 투여한 경우에 비하여 전체 생존율에 있어서 탁월한 효능을 중재하였음을 알 수 있다.
화합물 투약량/마우스 제형 완충액 농도(㎎/㎖)

항-EGFR
글리코맵
625 ㎍		 20 mM His/HisCl
240 mM 트레할로스
0.02% 트윈 20
pH 6.0
9.7(=스톡 용액)
FAP 3F2
Fab-IL-2-Fab=FAP
3F2
16 ㎍		 25 mM 인산 칼륨
125 mM NaCl
100 mM 글리신
pH 6.7
2.46(=스톡 용액)
실시예 5
Z138 맨틀 세포 림프종 이종이식 모델
TNC A2-표적화된 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-CD20 글리코맵(서열 번호 134 및 135)을 SCID-인간 FcγRⅢ 형질감염 마우스에 정맥내로 주사된 인간 맨틀 세포 림프종 세포주 Z138에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 TNC A2에 대해 양성인 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 제시되었다. Z138 인간 맨틀 세포 림프종 세포를 고유적으로 프로페서 마틴 다이어(Professor Martin Dyer)[영국 라이세스터 소재의 엠알씨 톡시콜로지 유닛(MRC Toxicology Unit)]로부터 수득하고, 팽창후 글리카트 국내 세포 은행에 기탁하였다. 종양 세포주를 관례대로 10% FCS(깁코)가 함유된 DMEM에서 37℃하에 수포화된 대기중에서 5% C02에서 배양하였다. 98%의 생존 능력에서 이식을 위해 18회의 계대배양을 사용하였다. 동물당 10×106개 세포를 200 ㎕의 에임V 세포 배양 배지(깁코)에서 꼬리 정맥에 정맥내로 주사하였다. 실험 시작시 8 내지 9주령의 암컷 SCID-FcγRⅢ 마우스(글리카트-RCC)(스위스 소재의 RCC에서 사육됨)를 위탁된 방침에 따라 매일 12 시간 명/12 시간 암 주기로 특정-병원체가 없는 조건하에 유지시켰다(GV-솔라스; 펠라사; 티에르쉬그). 실험 연구 프로토콜은 지방 정부가 검토하고 승인하였다(P 2008016). 도착 후, 동물들을 1주 동안 새로운 환경에 적응시키고 관찰을 위해 유지시켰다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적인 기준으로 수행하였다. 연구 0일에 마우스에 정맥내로 10×106개의 Z138 세포를 주사하고, 무작위 분류하고, 칭량하였다. 종양 세포 주사 1주 후, 마우스에 정맥내로 3주 동안 주 2회 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트를 주사하거나, 3주 동안 주 1회 항-CD20 글리코맵을 주사하거나, 또는 3주 동안 주 2회 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트를, 및 3주 동안 주 1회 항-CD20 글리코맵을 조합하여 주사하였다. 모든 마우스에 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내로 주사하였다. 투약량은 표 6에 구체화되어 있다. 비히클 군의 마우스에 PBS를 주사하고, 치료 군의 마우스에 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-CD20 글리코맵, 또는 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-CD20 글리코맵의 조합물을 주사하였다. 200 ㎕당 면역컨주게이트의 적절한 양을 수득하기 위해, 필요하다면 스톡 용액을 PBS로 희석하였다. 도 5로부터 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 및 항-CD20-글리코맵의 조합물이 2B10 Fab-IL-2-Fab 면역컨주게이트 또는 항-CD20 글리코맵을 단독으로 투여한 경우에 비하여 중앙 생존율 및 전체 생존율에 있어서 상승적으로 증진된 탁월한 효능을 초래하였음을 알 수 있다.
화합물 투약량/마우스 제형 완충액 농도(㎎/㎖)

항-CD20
글리코맵
625 ㎍		 20 mM His/HisCl
140 mM NaCl
0.02% 트윈 20
pH 6.0
10.50(=스톡 용액)
huTNC A2
2B10(G65S)
Fab-IL-2-
Fab=2B10
16 ㎍		 25 mM 인산 칼륨
125 mM NaCl
100 mM 글리신
pH 6.7
1.86(=스톡 용액)
실시예 6
ACHN 신장 암종 이종이식 모델
CD25로의 결합이 결핍된 IL-2 4중 돌연변이체(qm)를 포함하는 FAP-표적화된 28H1 Fab-IL2-Fab 면역컨주게이트(서열 번호 108, 여기서 IL-2 서열(서열 번호 1)은 서열 번호 2에 의해 대체됨; 및 서열 번호 113) 및 항-EGFR 글리코맵을 SCID-인간 FcγRⅢ 형질감염 마우스에 신장내로 주사된 인간 신장 세포주 ACHN에서 시험하였다. 이러한 종양 모델은 FAP에 대해 양성인 신선한 동결된 조직 상에서 IHC에 의해 제시되었다. ACHN 세포(인간 신장 아데노암종 세포)를 고유적으로 ATCC(아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션)로부터 수득하고, 팽창 후 글리카트 국내 세포 은행에 기탁하였다. ACHN을 10% FCS가 포함된 DMEM에서 37℃하에 수포화된 대기중에서 5% C02에서 배양하였다. 97%의 생존 능력에서 신장내 주사를 위해 시험관내 18회의 계대배양을 사용하였다. 마취된 SCID 마우스의 오른쪽 옆구리 및 복막 벽에 작은 절개(2 ㎝)를 내었다. 50 ㎕의 세포 현탁액(에임V 배지중 1×106 ACHN 세포)을 신장에 2 ㎜ 피막하에 주사하였다. 피부 상처 및 복막 벽을 클램프로 폐쇄하였다. 실험의 시작시 8 내지 9주령의 암컷 SCID-FcγRⅢ 마우스(글리카트-RCC)(스위스 소재의 RCC에서 사육됨)를 위탁된 방침에 따라 매일 12 시간 명/12 시간 암 주기로 특정-병원체가 없는 조건하에 유지시켰다(GV-솔라스; 펠라사; 티에르쉬그). 실험 연구 프로토콜은 지방 정부가 검토하고 승인하였다(P 2008016). 도착 후, 동물들을 1주 동안 새로운 환경에 적응시키고 관찰을 위해 유지시켰다. 연속적인 건강 모니터링을 규칙적인 기준으로 수행하였다. 연구 0일에 마우스에 신장내로 1×106개 ACHN 세포를 주사하고, 무작위 분류하고, 칭량하였다. 종양 세포 주사 1주 후, 마우스에 정맥내로 3주 동안 주 3회 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역컨주게이트를 주사하거나, 3주 동안 주 1회 항-EGFR 글리코맵을 주사하거나, 또는 3주 동안 주 3회 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역컨주게이트를, 및 3주 동안 주 1회 항-EGFR 글리코맵을 조합하여 주사하였다. 모든 마우스에 200 ㎕의 적절한 용액을 정맥내로 주사하였다. 투약량은 표 7에 구체화되어 있다. 비히클 군의 마우스에 PBS를 주사하고, 치료 군의 마우스에 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵, 또는 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR 글리코맵의 조합물을 주사하였다. 200 ㎕당 면역컨주게이트의 적절한 양을 수득하기 위해, 필요하다면 스톡 용액을 PBS로 희석하였다. 도 6으로부터 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역컨주게이트 및 항-EGFR-글리코맵의 조합물이 28H1 Fab-IL-2 qm-Fab 면역컨주게이트 또는 항-EGFR 글리코맵을 단독으로 투여한 경우에 비하여 증진된 중앙 생존율에 있어서 탁월한 효능을 중재하였음을 알 수 있다.
화합물 투약량/마우스 제형 완충액 농도(㎎/㎖)

항-EGFR
글리코맵
625 ㎍		 20 mM His/HisCl
240 mM 트레할로스
0.02% 트윈 20
pH 6.0
9.7(=스톡 용액)
FAP 28H1
Fab-IL-2 qm-Fab
30 ㎍		 25 mM 인산 칼륨
125 mM NaCl
100 mM 글리신, pH 6.7
2.74=스톡 용액)
실시예 7
IL -2 면역컨주게이트에 의한 NK 세포 사멸 용량 및 NK 세포 IFN -γ 방출의 시험관내 상승
NK 세포 상의 면역컨주게이트의 효과를 결정하기 위해, 본 발명자들은 NK 세포에 의한 종양 세포의 사멸 및 IFN-γ 방출을 면역컨주게이트, 특별히 IL-2를 효과자 구성부분으로서 포함하는 면역컨주게이트에 의한 치료시 평가하였다. 이를 위하여, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를 표준 절차에 따라서 히스토파크(Histopaque)-1077[미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마 디애그노스틱스 인코포레이티드(Sigma Diagnositcs Inc.)]를 사용하여 단리하였다. 간단히, 정맥 혈액을 헤파린화된 주사기로 건강한 지원자로부터 채취하였다. 혈액을 칼슘 또는 마그네슘이 함유되지 않은 PBS로 2:1로 희석하고, 히스토파크-1077 위에 적층시켰다. 구배물을 450×g에서 30분 동안 실온(RT)에서 휴식없이 원심분리하였다. PBMC를 포함하는 내부상(interphase)을 수집하고, 총 3회 PBS로 세척하였다(350×g, 이후 300×g, 10분 동안 실온에서).
제1 실험에서, 단리된 PBMC를 상이한 농도의 IL-2(프로류킨) 또는 IL-2 면역컨주게이트(야생형 또는 4중 돌연변이체(qm) IL-2를 포함하는 FAP-표적화된 28H1 Fab-IL2-Fab)와 함께 항온처리하였다. 2개의 실험 세팅을 시험하였다; IL-2 함유 작성물을 세포 상청액에 첨가하는 "용액중" 세팅, 및 IL-2 함유 작성물을, 미리 96-F-웰-플레이트 상에 코팅된(PBS중 500 ng/웰, 20 시간 동안 4℃에서) FAP에 결합시키는 "코팅된" 세팅. 결합되지 않은 면역컨주게이트를 PBMC의 첨가 이전에 세척하였다. 두 경우 모두에서, PBMC를 IL-2 함유 작성물로 48 시간 동안 예비처리한 다음, 회수하고 10:1의 표적 세포에 대한 효과자 비율(E:T)에서 4시간 동안 K562 표적 세포의 사멸을 위해 사용하였다. 세포 상청액으로의 LDH 방출을 측정함으로써 표적 세포 사멸을 검출하였다(로슈 세포독성 검출 키트 LDH). 도 7로부터 용액중의(도 7a) 또는 세포 접시에 코팅된(도 7b) IL-2 작성물로 효과자 세포(PBMC)를 예비처리하였을 때, PBMC로 처리하지 않은 경우에 비하여 K562 종양 세포 사멸률이 증가하였음을 알 수 있다. IL-2 뿐만 아니라 Fab-IL2-Fab 면역컨주게이트는 표적 세포를 사멸시키는 PBMC의 용량을 상승시켰다.
제2 실험에서, 단리된 PBMC를 45 시간 동안 IL-2(프로류킨) 또는 IL-2 면역컨주게이트와 함께 항온처리하고, 세포 상청액에 첨가하였다. 후속적으로, PBMC를 회수하고, A549 세포의 항-EGFR 글리코맵-중재된 ADCC를 위해 10:1의 E:T에서 4 시간 동안 사용하였다. 세포 상청액으로의 LDH 방출을 측정함으로써 표적 세포 사멸을 검출하였다(로슈 세포독성 검출 키트 LDH). 도 8은, 상이한 농도의 항-EGFR 글리코맵의 존재하에, 야생형(wt) 또는 4중 돌연변이체(qm) IL-2를 포함하는 57 nM FAP-표적화된 28H1 Fab-IL2-Fab로 예비처리하거나 하지 않은, PBMC에 의한 전체 A549 종양 세포 사멸률을 제시한다. 결과로부터 면역컨주게이트 및 글리코맵의 조합물의 사용에 의해 거의 100%의 표적 세포 사멸률이 수득될 수 있음을 알 수 있고, 이는 본 실험 조건하에 이들 제제중 하나를 단독으로 사용하여서는 달성되지 않는다. 야생형 또는 4중 돌연변이체 IL-2를 포함하는 2개의 면역컨주게이트가 동일하게 강력하다.
또 다른 실험에서, 단리된 PBMC를 A549 세포 상에서 2가지 상이한 농도(5 및 500 ng/㎖)의 항-EGFR 글리코맵 및 비-글리코조작된 항-EGFR 항체(에르비툭스)에 의한 ADCC 검정에 5:1의 E:T에서 21 시간 동안 사용하였다. 항온처리 시간의 종결시, PBMC로부터 세포 상청액으로의 IFN-γ의 방출을 IFN-γ ELISA 키트(BD #550612)에 의해 검출하였다. 도 9로부터, 항체만으로 항온처리한 이후에는 상당한 IFN-γ 방출이 검출되지 않은 반면, 항온처리 시간 동안 IL-2 (프로류킨), 28H1 Fab-IL2-Fab 또는 28H1 Fab-IL2 qm-Fab의 존재는 (도 9a) 항-EGFR 글리코맵- 뿐만 아니라 (도 9b) 에르비툭스-중재된 ADCC 동안 IFN-γ 방출을 매우 증진시켰음을 알 수 있다. 전체적으로, 및 특별히, 더 낮은 항체 농도(5 ng/㎖) 및 가장 높은 IL-2(면역컨주게이트) 농도(1140 nM)에서, IFN-γ 방출은 에르비툭스의 경우에 비하여 항-EGFR 글리코맵의 경우에 더 높다.
최종적으로, 임의의 항체 없이, IL-2(프로류킨), 28H1 Fab-IL2-Fab 또는 28H1 Fab-IL2 qm-Fab와 항온처리한 후의 PBMC로부터의 IFN-γ 방출을 결정하였다. 실험 조건은 상기 기재된 바와 같다. 도 10에 제시된 바와 같이, IL-2(면역컨주게이트)는 ADCC 유도 항체의 부재하에 또한 PBMC로부터의 IFN-γ 방출을 증진시켰다. IFN-γ 수준은 5 ng/㎖ 에르비툭스의 존재하에 측정된 수준과 필적할만하였으나(도 9b 참조), 항-EGFR 글리코맵의 존재하에서의 수준에 비하여 더 낮았다(도 9a 참조).
본 발명이 이해를 분명히 할 목적으로 예시 및 실시예에 의해 상세히 기재되었지만, 기재내용 및 실시예는 본 발명을 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 본원에 인용된 모든 특허 및 과학 문헌의 개시내용은 이들 전체가 참고로 분명히 인용된다.
SEQUENCE LISTING <110> Roche Glycart AG <120> Improved Immunotherapy <130> 27306 <140> PCT/EP2012/051990 <141> 2012-02-07 <150> EP 11153976.3 <151> 2011-02-10 <160> 156 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 2 <211> 133 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Ala Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His 1 5 10 15 Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 20 25 30 Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Ala Lys Phe Ala Met Pro Lys 35 40 45 Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys 50 55 60 Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Gly Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu 65 70 75 80 Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu 85 90 95 Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 100 105 110 Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Ala Gln Ser Ile 115 120 125 Ile Ser Thr Leu Thr 130 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2B10; VL <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 4 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2B10(GS); VL <400> 4 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Asp 20 25 30 Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Asn Gly Leu Gln Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 5 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2B10; VH <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Leu Tyr Gly Tyr Ala Tyr Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2F11; VL <400> 6 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Tyr Thr Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 7 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2F11(VI); VL <400> 7 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu 65 70 75 80 Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Gln Tyr Thr Pro 85 90 95 Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 8 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2F11; VH <400> 8 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Met Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Arg Trp Met Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 2F11(MT); VH <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Arg Trp Met Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3F2; VL <400> 10 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Tyr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser 20 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<220> <223> 3F2; VH <400> 12 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 3D9, VL <400> 13 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser 20 25 30 Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser 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Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 125 <211> 615 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> MHLG Fab-IL2-Fab (heavy chain cytokine fusion construct) <400> 125 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Glu Ile Arg Leu Lys Ser Asn Asn Phe Gly Arg Tyr Tyr Ala Ala 50 55 60 Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn 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Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Ser Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly 115 120 125 Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala 130 135 140 Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln 145 150 155 160 Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser 165 170 175 Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr 180 185 190 Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser 195 200 205 Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 <210> 127 <211> 214 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> KV7 light chain <400> 127 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Asp Thr Asn 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Leu Ile 35 40 45 Tyr 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<212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR HCDR2 <400> 137 Tyr Phe Asn Pro Asn Ser Gly Tyr Ser Thr Tyr Ala Gln Lys Phe Gln 1 5 10 15 Gly <210> 138 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR HCDR3 <400> 138 Leu Ser Pro Gly Gly Tyr Tyr Val Met Asp Ala 1 5 10 <210> 139 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR LCDR1 <400> 139 Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 140 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR LCDR2 <400> 140 Asn Thr Asn Asn Leu Gln Thr 1 5 <210> 141 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR LCDR3 <400> 141 Leu Gln His Asn Ser Phe Pro Thr 1 5 <210> 142 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-EGFR VH <400> 142 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 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anti-IGF-1R VH (1) <400> 144 Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Gln Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Arg Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Ser Val Ser Ser 115 <210> 145 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-IGF-1R VL (1) <400> 145 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Lys Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ser Lys 100 105 <210> 146 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-IGF-1R VH (2) <400> 146 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Ala Ile Ile Trp Phe Asp Gly Ser Ser Lys Tyr Tyr Gly Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Leu Gly Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 147 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-IGF-1R VL (2) <400> 147 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Lys Trp Pro Pro 85 90 95 Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 148 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA HCDR1 <400> 148 Glu Phe Gly Met Asn 1 5 <210> 149 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA HCDR2 <400> 149 Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 150 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA HCDR3 <400> 150 Trp Asp Phe Tyr Asp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 151 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA LCDR1 <400> 151 Lys Ala Ser Gln Asn Val Gly Thr Asn Val Ala 1 5 10 <210> 152 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA LCDR2 <400> 152 Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser 1 5 <210> 153 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA LCDR3 <400> 153 His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr 1 5 10 <210> 154 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA VH <400> 154 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ser Glu Leu Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe 20 25 30 Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Val Phe Ser Leu Asp Thr Ser Val Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Ile Ser Ser Leu Lys Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Asp Phe Tyr Asp Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 155 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-CEA VL <400> 155 Asp Ile Gln 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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 305 310 315 320 Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325

Claims (26)

  1. 질병의 치료가 필요한 개체에서 질병을 치료하는데 사용하기 위한, (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분(moiety) 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트(immunoconjugate), 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물.
  2. 제1항에 있어서,
    효과자 구성부분이 사이토킨(cytokine)인 조합물.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    효과자 구성부분이 IL-2, GM-CSF, IFN-α, 및 IL-12로 구성된 군에서 선택된 사이토킨인 조합물.
  4. 제1항 내지 제3항중 어느 한 항에 있어서,
    효과자 구성부분이 IL-2인 조합물.
  5. 제4항에 있어서,
    IL-2 효과자 구성부분이, 돌연변이되지 않은 IL-2 효과자 구성부분에 비하여, 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분의 IL-2 수용체의 α-서브유닛으로의 친화도를 감소시키거나 제거하지만, 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분의 중간-친화도 IL-2 수용체로의 친화도를 보존하는 하나 이상의 아미노산 돌연변이, 특별히 아미노산 치환을 포함하는 돌연변이체 IL-2 효과자 구성부분인 조합물.
  6. 제1항 내지 제5항중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 구성부분이 항체 또는 항체 단편인 조합물.
  7. 제1항 내지 제6항중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 구성부분이 Fab 분자 및 scFv 분자로부터 선택되는 조합물.
  8. 제1항 내지 제7항중 어느 한 항에 있어서,
    면역컨주게이트가 제1 및 제2 항원-결합 구성부분을 포함하는 조합물.
  9. 제8항에 있어서,
    제1 및 제2 항원-결합 구성부분이 각각 Fab 분자인 조합물.
  10. 제8항 또는 제9항에 있어서,
    효과자 구성부분이 아미노- 또는 카복시-말단 펩타이드 결합을 제1 항원-결합 구성부분과 공유하고, 제2 항원-결합 구성부분이 아미노- 또는 카복시-말단 펩타이드 결합을 효과자 구성부분 또는 제1 항원-결합 구성부분과 공유하는 조합물.
  11. 제1항 내지 제10항중 어느 한 항에 있어서,
    면역컨주게이트가 효과자 구성부분, 특별히 단일 쇄 효과자 구성부분, 및 제1 및 제2 Fab 분자를 포함하고, 여기서 효과자 구성부분이 그의 아미노-말단 아미노산에서 제1 Fab 분자의 중쇄 또는 경쇄의 카복시-말단에 연결되고, 효과자 구성부분이 그의 카복시-말단 아미노산에서 제2 Fab 분자의 중쇄 또는 경쇄의 아미노-말단에 연결되는 조합물.
  12. 제1항 내지 제11항중 어느 한 항에 있어서,
    항원-결합 구성부분이 종양 세포 위에 존재하거나 종양 세포 환경에 존재하는 항원으로 유도되는 조합물.
  13. 제1항 내지 제12항중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체가 전장 IgG 부류 항체, 특별히 IgG1 하위부류 항체인 조합물.
  14. 제1항 내지 제13항중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 효과자 기능이 활성화 Fc 수용체로의 증가된 결합, 증가된 항체-의존성 세포-중재된 세포독성(ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity), 증가된 항체-의존성 세포-중재된 식세포 작용(ADCP: antibody-dependent cell-mediated phagocytosis), 증가된 보체 의존성 세포독성(CDC: complement dependent cytotoxicity), 및 증가된 사이토킨 분비로 구성된 군에서 선택되는 조합물.
  15. 제1항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 효과자 기능이 활성화 Fc 수용체로의 증가된 결합 및/또는 증가된 ADCC인 조합물.
  16. 제1항 내지 제15항중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체가 Fc 영역에서의 하나 이상의 아미노산 돌연변이의 도입, 또는 Fc 영역에서의 글리코실화의 개질에 의해 조작되는 조합물.
  17. 제1항 내지 제16항중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체가, 조작되지 않은 항체에 비하여, Fc 영역에서 푸코실화되지 않은 올리고당의 증가된 비율을 갖도록 조작되는 조합물.
  18. 제1항 내지 제17항중 어느 한 항에 있어서,
    증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체가 종양 세포 위에 존재하는 항원으로 유도되는 조합물.
  19. 제1항 내지 제18항중 어느 한 항에 있어서,
    질병이 효과자 세포 기능을 자극함으로써 치료가능한 질환, 특별히 암인 조합물.
  20. 제1항 내지 제19항중 어느 한 항에 있어서,
    개체가 포유동물, 특별히 인간인 조합물.
  21. (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체를 약학적으로 허용가능함 담체중에 포함하는 약학 조성물.
  22. 개체에서 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서의, (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 용도.
  23. (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을 치료 효과량으로 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 질병을 치료하는 방법.
  24. (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, 및 (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체의 조합물을, 효과자 세포 기능을 자극하기에 효과적인 양으로 개체에게 투여함을 포함하는, 개체에서 효과자 세포 기능을 자극하는 방법.
  25. (a) 하나 이상의 항원-결합 구성부분 및 효과자 구성부분을 포함하는 면역컨주게이트, (b) 증가된 효과자 기능을 갖도록 조작된 항체, 및 (c) 임의적으로 질병을 치료하는 방법으로서 조합된 치료의 사용을 지시하는 인쇄된 지침서를 포함하는 패키지 삽입물을 동일한 용기 또는 별도의 용기에 포함하는, 질병 치료용 키트.
  26. 이전에 기재된 바와 같은 발명.
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