KR20140000711A - 수크로스 이용에 있어서의 야로위아 리포라이티카에서의 사카로마이세스 세레비지애 suc2 유전자의 용도 - Google Patents

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퀸 쿤 주
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Abstract

수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica)가 본 발명에서 개시된다. 형질전환된 와이. 리포라이티카의 사용 방법이 또한 개시된다.

Description

수크로스 이용에 있어서의 야로위아 리포라이티카에서의 사카로마이세스 세레비지애 SUC2 유전자의 용도{USE OF SACCAROMYCES CEREVISIAE SUC2 GENE IN YARROWIA LIPOLYTICA FOR SUCROSE UTILIZATION}
본 출원은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함되는, 2010년 12월 30일자로 출원된 미국 가특허 출원 제61/428,590의 이익을 청구한다.
본 발명은 생명 공학 분야이다. 더 구체적으로, 본 발명은 수크로스를 탄소 공급원으로 사용하는 능력을 갖는 형질전환된 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica)에 관한 것이며, 여기서, 형질전환된 와이. 리포라이티카는 또한 관심대상의 비천연 생성물, 예를 들어 다중불포화 지방산(polyunsaturated fatty acid; "PUFA")을 생성하도록 선택적으로 엔지니어링될 수 있다.
유지성(oleaginous) 효모, 예를 들어 야로위아 리포라이티카는 글루코스를 그의 유일한 탄소 공급원으로 사용하는 천연적인 능력을 갖지만; 이 기질은 항상 가장 비용 효율적인 탄소 공급원인 것은 아니다. 글루코스 대신 탄소 공급원으로서 (단독으로든지 또는 다른 탄소 공급원과 조합해서든지 간에) 수크로스를 탄소 공급원으로 사용하는 것은 그의 비용으로 인하여 유리할 수 있다.
와이. 리포라이티카는 수크로스를 탄소 공급원으로 이용할 수 없으며, 그 이유는 이것이 인버타아제를 코딩하는 유전자를 갖지 않기 때문인데, 상기 인버타아제는 수크로스(이당류)가 단당류인 글루코스 및 프룩토스로 전환되는 것을 촉매한다. 이전의 몇몇 연구원들은 성숙 인버타아제 단백질을 주위 매질 내로 분비하도록 효모를 엔지니어링하기 위하여 시그널(signal) 서열을 인버타아제를 코딩하는 이종 유전자 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 SUC2 유전자)에 융합시켰는데, 상기 주위 매질에서 수크로스가 후에 가수분해될 수 있다.
와이. 리포라이티카로부터 단리된 하나의 잘 알려진 시그널 서열은 유도성 알칼리성 세포외 프로테아제(alkaline extracellular protease; "AEP")의 것이다 (유럽 특허 제0220864 B1호; 문헌[Davidow, et al., J. Bacteriol., 169:4621-4629 (1987)]; 문헌[Matoba, et al., Mol. Cell Biol., 8:4904-4916 (1988)]). AEP는 와이. 리포라이티카에서 XPR2 유전자에 의해 코딩된다. 더욱이, 대량이 자연적으로 세포외로 분비된다.
니코드(Nicaud) 등 (문헌[Current Genetics, 16:253-260 (1989)]; 유럽 특허 제0402226 A1호)은 와이. 리포라이티카 XPR2 프로모터 및 그의 시그널 서열을 포함하는 에스. 세레비지애 SUC2의 키메라 발현을 보고하였는데, 이는 와이. 리포라이티카에서 수크로스-이용(SUC + ) 표현형으로 이어졌다. 구체적으로, XPR2 유래의 23개 N-말단 아미노산은 절두형(truncated) SUC2 (여기서, 절두에 의해 전장 단백질의 처음 4개 아미노산이 제거됨)에 융합되었다. 인버타아제 활성 중 약 10%는 배양 브로쓰에서 관찰되며(즉, 세포외 분비를 통하여), 반면에 활성의 90%는 전세포를 사용하면 회복됨 (즉, 인버타아제는 주변세포질(periplasm) 내로 분비됨)이 보고되었다. 따라서, 세포외 수크로스 가수분해에서의 효율은 상대적으로 낮았다.
니코드 등에 의해 기재된 방법은 수크로스를 탄소 공급원으로 사용하는, 시트르산을 생성하는 형질전환 와이. 리포라이티카 주(strain)를 개발하려는 노력으로 다른 이들에 의해 이용되었다 (문헌[Wojtatowicz, M.,et al., Pol. J. Food Nutr. Sci ., 6/47(4): 49-54 (1997)]; 문헌[
Figure pct00001
, A. et al., Appl . Microbiol . Biotechnol., 75:1409-1417 (2007)]; 문헌[Lazar, Z. et al., Bioresour . Technol., 102:6982-6989 (2011)]). 상기 포스터(Foster) 등은 대다수(60-70%)의 인버타아제 활성이 세포 표면에서 발견되며(즉, 전세포에서 검출가능한 세포-결합된 활성), 반면에 인버타아제의 30-40%는 무세포 배양 배지에서 검출가능하고; 바이오매스(biomass)로부터의 최대 인버타아제 수율은 바이오매스의 건조 중량 1 g당 110 U임을 보고하였다. 가장 최근에는, 상기 라자르(Lazar) 등은 와이. 리포라이티카 XPR2 프로모터 및 그의 시그널 서열과, 에스. 세레비지애 SUC2를 포함하는 융합물의 두 카피(copy)를 함유하는 와이. 리포라이티카 주를 확인하였으며, 대부분의 인버타아제 활성이 세포와 결부된 반면 (세포 1 g당 2568 내지 3736 U), 약 232 내지 589 U/g은 세포외 활성임(즉, 활성의 단지 5-20%가 세포외 활성임)을 보여주었다.
따라서, 개선된 세포외 인버타아제 활성을 갖도록 와이. 리포라이티카를 엔지니어링하는 것이 바람직하며, 그 이유는 이것이 수크로스를 탄소 공급원으로 더욱 잘 이용하기 때문이다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 야로위아 리포라이티카에 관한 것이며, 여기서,
a) 상기 폴리펩티드는 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 폴리펩티드 서열에 융합된 시그널 서열을 포함하고;
b) 상기 시그널 서열은
(i) Xpr2 프리(pre)/프로(pro)-영역 및 N-말단 Xpr2 단편; 및
(ii) 제2 아미노산이 임의의 소수성 아미노산일 수 있는 수크로스 인버타아제 시그널 서열
로 이루어진 군으로부터 선택되며;
c) 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 상기 폴리펩티드 서열은, 서열 번호 4의 서열("m-ScSUC2")과 비교할 때, CLUSTALW 정렬법을 기반으로 할 경우 서열 동일성이 80% 이상이다.
바람직하게는, 상기에 기재된 수크로스 인버타아제 시그널 서열의 제2 아미노산은 류신, 페닐알라닌, 아이소류신, 발린 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제2 실시 형태에서, 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4("m-ScSUC2")에 기술되어 있다.
제3 실시 형태에서, Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편은 와이. 리포라이티카로부터 유래되고, 상기 수크로스 인버타아제 시그널 서열은 사카로마이세스 세레비지애로부터 유래된다. 바람직하게는, Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편은 하기를 포함한다:
(i) 알칼리성 세포외 프로테아제 전구체의 N-말단의 157개 아미노산을 포함하는 Xpr2 프리/프로-영역; 및
(ii) 성숙 알칼리성 세포외 프로테아제의 N-말단의 13개 아미노산을 포함하는 N-말단 Xpr2 단편을 포함하는 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
바람직하게는, Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편은 서열 번호 10["XPR2PP+13"]에 기술되어 있다.
제4 실시 형태에서, 수크로스 인버타아제 시그널 서열은 서열 번호 8["Suc2SS"]에 기술되어 있다.
제5 실시 형태에서, 수크로스 인버타아제 코딩 서열에 융합된 시그널 서열을 포함하는 상기 폴리펩티드는 서열 번호 12["Suc2SS/m-ScSUC2"] 및 서열 번호 20["XPR2PP+13/m-ScSUC2"]의 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제6 실시 형태에서, 형질전환된 와이. 리포라이티카는 수크로스가 유일한 탄소 공급원인 조건 하에서 성장할 수 있다.
제7 실시 형태에서, 형질전환된 와이. 리포라이티카는 관심대상의 적어도 하나의 비천연 생성물을 생성할 수 있다. 바람직하게는, 관심대상의 상기 적어도 하나의 비천연 생성물은 다중불포화 지방산, 카로티노이드, 아미노산, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 유기 산, 폴리올 및 하이드록시에스테르, 퀴논-유도된 화합물 및 레스베라트롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제8 실시 형태에서, 탄소 공급원으로서 적어도 수크로스를 갖는 배양 배지에서 성장된 본 발명의 임의의 형질전환된 와이. 리포라이티카는 80% 이상의 수크로스 인버타아제를 세포외로 분비할 수 있다.
제9 실시 형태에서, 본 발명은
a) 수크로스; 및
b) 글루코스
로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 탄소 공급원을 갖는 배양 배지에서 본 발명의 형질전환된 야로위아 리포라이티카를 성장시키고,
이에 의해 관심대상의 적어도 하나의 비천연 생성물을 생성하는 단계와, 선택적으로, 관심대상의 상기 적어도 하나의 비천연 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 관심대상의 적어도 하나의 비천연 생성물을 생성하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게는, 관심대상의 상기 적어도 하나의 비천연 생성물은 다중불포화 지방산, 카로티노이드, 아미노산, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 유기 산, 폴리올 및 하이드록시에스테르, 퀴논-유도된 화합물 및 레스베라트롤로 이루어진 군으로부터 선택된다.
제10 실시 형태에서, 형질전환된 와이. 리포라이티카는 80% 이상의 수크로스 인버타아제를 세포외로 분비할 수 있다.
도면의 간단한 설명 및 서열 설명
<도 1>
도 1은 세포외 인버타아제 발현 제작물 pYRH68 (서열 번호 13), pYRH74 (서열 번호 21), pYRH69 (서열 번호 18) 및 pYRH73 (서열 번호 15)과, 이들 제작물을 와이. 리포라이티카에서 발현시킬 때 생성된 표현형(즉, 수크로스-이용(SUC + ) 또는 수크로스-비이용(SUC - ))의 개략적인 요약을 제공한다.
<도 2a>
도 2a는 사카로마이세스 세레비지애 인버타아제("ScSUC2")의 N-말단 부분의 뉴클레오티드 및 번역 아미노산 서열을 제공한다. 더 구체적으로, 서열 번호 2의 아미노산 1-32가 예시되어 있으며; 처음 19개 아미노산은 본 명세서에서 Suc2SS (서열 번호 8)로 기술된 인버타아제 시그널 서열에 상응하는 반면, 윤곽이 그려진 박스 내에 예시된 나머지 아미노산은 본 명세서에서 m-ScSUC2 (서열 번호 4)로 표기된, 성숙 인버타아제 단백질의 N-말단을 나타낸다.
<도 2b>
도 2b는 XPR2 유전자에 의해 코딩되는 와이. 리포라이티카 알칼리성 세포외 프로테아제의 일부분의 뉴클레오티드 및 번역 아미노산 서열을 제공한다. 구체적으로, 알칼리성 세포외 프로테아제 전구체 (서열 번호 6)의 아미노산 145-192가 예시되어 있다. 이들 중, 점선 박스 내에 예시된 아미노산 145-157은 Xpr2 프리/프로-영역의 C-말단에 상응하는 반면, 아미노산 158-192는 성숙 단백질의 N-말단 Xpr2 단편에 상응한다. 밑줄이 그어진 아미노산은 본 명세서에서 XPR2PP+13 (서열 번호 10)으로 칭해지는 , Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편에 존재하는 N-말단 Xpr2 단편의 13개 아미노산에 상응한다.
<도 3>
도 3은 pZSUC의 플라스미드 지도를 제공한다.
<도 4>
도 4는 하기: (도 4a) pYRH68 및 (도 4b) pYRH70의 플라스미드 지도를 제공한다.
<도 5>
도 5는 하기: (도 5a) pYRH73 및 (도 5b) pYRH69의 플라스미드 지도를 제공한다.
<도 6>
도 6은 pYRH74의 플라스미드 지도이다.
<도 7>
도 7은 글루코스 및 수크로스 배지 둘 모두 상에서의 주 Y4184U + Suc2SS/m-ScSUC2 및 Y4184 (대조군)의 성장을 나타낸다.
<도 8>
도 8은 (도 8a) 글루코스; 및 (도 8b) 수크로스를 포함하는 배지 상에서의 주 Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2, Z1978U + 2_Suc2SS/m-ScSUC2, Z1978U + XPR2PP+13/m-ScSUC2, Z1978U + m-ScSUC2, Z1978U + XPR2PP+13/Suc2SS/m-ScSUC2 및 Z1978 (대조군)의 성장을 나타낸다.
<도 9>
도 9는 pZKL3-9DP9N의 플라스미드 지도이다.
하기의 서열들은 37 C.F.R. §§1.821-1.825("뉴클레오티드 서열 및/또는 아미노산 서열 개시를 포함하는 특허출원에 관한 요건 - 서열 규정")를 따르며 세계지적재산권기구(World Intellectual Property Organization, WIPO) 표준 ST.25(1998), 및 EPO 및 PCT의 서열 목록 요건(규정 5.2 및 49.5(a-bis), 및 시행세칙의 섹션 208 및 부칙 C)에 부합한다. 뉴클레오티드 및 아미노산 서열 데이터에 사용된 기호 및 체제는 37 C.F.R. §1.822에 제시된 규정을 준수한다.
서열 번호 1-41은 표 1에 확인된 바와 같이, 유전자를 코딩하는 ORF, 단백질(또는 그의 부분), 프라이머 또는 플라스미드이다.
Figure pct00002
Figure pct00003
본 명세서에 개시된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 전체적으로 참고로 포함된다.
본 개시내용에서, 다수의 용어 및 약어가 사용된다. 하기의 정의가 제공된다.
"오픈 리딩 프레임(open reading frame)"은 "ORF"로 약칭된다.
"폴리머라아제 연쇄 반응"은 "PCR"로 약칭된다.
"아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)"은 "ATCC"로 약칭된다.
"다중불포화 지방산(들)"은 "PUFA(들)"로 약칭된다.
"트라이아실글리세롤"은 "TAG"로 약칭된다.
"전체 지방산"은 "TFA"로 약칭된다.
"지방산 메틸 에스테르"는 "FAME"로 약칭된다.
"건조 세포 중량"은 "DCW"로 약칭된다.
"중량 퍼센트"는 "wt%"로 약칭된다.
본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에 사용되는 바와 같이, 문맥이 명백하게 달리 지시하지 않는 한, 단수형("a", "an" 및 "the")은 복수 언급(plural reference)을 포함한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포 및 당업자에게 공지된 그의 등가물 등을 포함한다.
용어 "분비 경로"는 세포가 분비 과정에서 단백질을 세포 외부로 수송하는 경로를 말한다. 일반적으로, 분비될 단백질은 조면 소포체["ER"] 내로 번역되고, 골지체(Golgi apparatus)를 통하여 수송되고, 그 후 소포(vesicle) 내로 혼입되고, 이는 궁극적으로 엑소사이토시스(exocytosis) 과정에서 원형질막과 융합되고 이럼으로써 상기 단백질을 방출한다. 분비는 구성적으로 또는 조절된 방식으로 일어날 수 있다.
"시그널 서열" (당업계에서 "프리-" 서열 영역, "시그널 펩티드", "표적화 시그널", "운반 펩티드(transit peptide)", 또는 "국재화 시그널"로도 칭해짐)은 일반적으로 세포 내에서 또는 세포외 환경으로 폴리펩티드의 나머지 부분의 수송 및 국재화를 지시하는 짧은 펩티드 서열(즉, 폴리펩티드의 가장 말단의 N-부분의, 길이가 약 3-60개인 아미노산)이다. 진핵생물에 있어서 평균 길이는 22.6개 아미노산이다. 일반적으로 시그널 서열은 막, 예를 들어 ER 막을 가로질러 전좌를 통하여 단백질을 그의 작용 부위로 표적화하는 규정된 펩티드 모티프를 포함한다. 전좌 후, 시그널 서열은 일반적으로 내인성 시그널 펩티다아제에 의해 후속적으로 절단된다. 시그널 서열을 포함하는 단백질은 "프리-단백질"로 칭해진다.
콘센서스(consensus) 서열은 없는 반면, 대부분의 모든 시그널 펩티드는 공통 구조, 즉 짧은, 양으로 하전된 아미노 영역(n-영역); 중심 소수성 영역(h-영역); 및 시그널 펩티다아제에 의해 절단되는 부위를 함유하는 더욱 극성인 영역(c-영역)을 보유한다 (문헌[Nielsen, et al., Protein Engineering , 10:1-6 (1997)]).
용어 "프로-단백질" 및 "단백질 전구체"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, N-말단 "프로-" 서열 영역의 절단에 의해 변형될 수 있는 폴리펩티드를 말한다. 일반적으로 엔도프로테아제에 의한 "프로-" 서열 영역의 제거는 "성숙 단백질"의 형성으로 이어진다. 이러한 "프로-" 서열 영역은 다양한 번역후 변형을 증강시키는 데 있어서 원인이 될 수 있거나, 성숙 단백질의 적당한 폴딩(folding)을 필요로 할 수 있거나, 또는 이것은 성숙 단백질의 활성을 그의 번역후 제거까지 저해하는 작용을 할 수 있다.
"프리/프로-단백질"은 프리/프로 영역이 제거될 때 성숙 단백질이 되는 것에 부착된 "프리/프로-" 영역을 갖는다. "프리/프로-단백질"은 "프리-" 서열 영역(즉, N-말단 시그널 서열) 및 "프로-" 서열 영역(즉, "프리-" 서열 영역과, 프리/프로 영역이 제거될 때 성숙 단백질이 되는 것 사이에 병치됨") 둘 모두를 포함한다.
용어 "인버타아제" 및 "베타-프룩토푸라노시다아제"는 가수분해 반응을 통하여 수크로스(즉, 알파-1,4-글리코시딕 결합에 의해 연결된 알파-D-글루코스 분자 및 베타-D-프룩토스 분자로 구성된 이당류)를 글루코스 및 프룩토스로 전환시키는 능력을 갖는 단백질(EC 3.2.1.26)을 말한다. 사카로마이세스 세레비지애에서, 인버타아제를 코딩하는 유전자는 Suc2 이다.
용어 "세포외 인버타아제"는 미생물 세포가 성장하는 배양 배지 내로 분비되는 인버타아제를 말한다. 따라서, 세포외 인버타아제 활성은 전형적으로 배양 배지 그 자체 내에서 측정된다. 이와는 대조적으로, "전세포 인버타아제"는 세포 외부로는 분비되지 않으며, 대신 세포 내의 주변 세포질 공간 내로 분비되는 인버타아제를 말한다. 전형적으로, 전세포 인버타아제 활성은 전세포 내에서 측정된다. 전세포 활성에 대한 세포외 인버타아제 활성의 상대적인 양(즉, 퍼센트)은 하기와 같이 결정된다: 100 * 배양 배지 중 인버타아제 활성/ [(전세포 중 인버타아제 활성) + (배양 배지 중 인버타아제 활성)].
용어 "알칼리성 세포외 프로테아제" 또는 "AEP"는 와이. 리포라이티카에서 XPR2 유전자에 의해 코딩되는 단백질(EC 3.4.21.-)을 말한다. AEP는 이 효모에 의해 분비되는 주요 세포외 단백질이며 (배양물 1 리터당 1 g 초과), 이때 상기 단백질의 99%는 무세포 배지 상청액에 존재한다. 전장 프로테아제의 N-말단은 "프리/프로-" 영역을 함유하며, 이는 성숙 단백질의 프로세싱 및 분비에 연루된다.
용어 "관심대상의 비천연 생성물"은 야생형 미생물에서 천연적으로는 생성되지 않는 임의의 생성물을 말한다. 전형적으로, 관심대상의 비천연 생성물은, 적절한 이종 유전자(들)가 숙주 미생물 내로 도입되어 관심대상의 생성물인 이종 단백질의 발현을 가능하게 하도록 재조합적 수단을 통하여 생성된다. 관심대상의 바람직한 비천연 생성물의 비제한적 예에는 다중불포화 지방산, 카로티노이드, 아미노산, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 유기 산, 폴리올 및 하이드록시에스테르, 퀴논-유도된 화합물 및 레스베라트롤이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
용어 "관심대상의 비천연 생성물을 코딩하는 적어도 하나의 이종 유전자"는 그가 도입되는 숙주 미생물과는 상이한 기원으로부터 유래된 유전자(들)를 말한다. 이종 유전자는 숙주 미생물에서 관심대상의 비천연 생성물의 생성을 촉진한다. 일부의 경우, 단지 단일한 이종 유전자가 관심대상의 생성물의 생성을 가능하게 하는 데 필요할 수 있는데, 이는 어떠한 중간 단계 또는 경로의 중간체 없이 기질을 직접적으로 관심대상의 원하는 생성물로 전환시키는 것을 촉매한다. 대안적으로, 일련의 반응이 일어나 관심대상의 원하는 비천연 생성물을 생성하도록 신규한 생합성 경로를 코딩하는 일련의 유전자들을 미생물 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있다.
일반적으로, 용어 "유지성"은 유기체의 에너지원을 오일의 형태로 저장하는 경향이 있는 유기체를 지칭한다(문헌[Weete, In: Fungal Lipid Biochemistry, 2nd Ed., Plenum, 1980]). 이러한 과정 동안, 유지성 미생물의 세포 오일 함량은 일반적으로 S자 모양의 곡선을 따르며, 여기서, 지질의 농도는 그것이 후기 대수 성장기 또는 초기 정지 성장기에서 최대에 도달할 때까지 증가하였다가 후기 정지기 및 사멸기 동안에 점차적으로 감소한다(문헌[Yongmanitchai and Ward, Appl. Environ. Microbiol., 57:419-25 (1991)]). 용어 "유지성"은 본 출원의 목적을 위해, 미생물의 건조 세포 중량["DCW"]의 적어도 약 25%를 오일로 축적할 수 있는 미생물을 말한다.
용어 "유지성 효모"는 오일을 만들 수 있는 효모로 분류되는 이러한 유지성 미생물을 말하며, 다시 말하면, 여기서, 효모의 DCW의 약 25%의 과량으로 오일이 축적될 수 있다. 유지성 효모의 예에는 하기의 속이 포함되나, 이에 제한되는 것을 의미하는 것은 아니다: 야로위아, 칸디다(Candida), 로도토룰라(Rhodotorula), 로도스포리듐(Rhodosporidium), 크립토코커스(Cryptococcus), 트리코스포론(Trichosporon) 및 리포마이세스(Lipomyces). 효모의 DCW의 약 25% 과량의 오일을 축적하는 능력은 재조합 엔지니어링(engineering)의 결과를 통하여 또는 유기체의 천연의 능력을 통하여 이루어질 수 있다.
용어 "탄소 공급원"은 미생물이 대사하여 에너지를 유도하는 탄소를 포함하는 영양소를 말한다. 예를 들어,
야생형 와이. 리포라이티카는 글루코스, 프룩토스, 글리세롤, 아세테이트, 알코올, 알칸, 지방산 및 트라이글리세라이드를 포함하는 다양한 탄소 공급원을 이용할 수 있지만; 이것은 수크로스를 유일한 탄소 공급원으로 사용할 수는 없다 (문헌[Barth, G. and C. Gaillardin, FEMS Microbiol. Rev., 19:219-237 (1997)]). 이와는 대조적으로, 본 발명의 재조합 와이. 리포라이티카는 수크로스를 유일한 발효성 탄소 공급원으로 또는 다른 적합한 탄소 공급원과 조합하여 사용할 수 있다.
용어 "미생물 숙주 세포" 및 "미생물 숙주 유기체"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 외래 또는 이종 유전자를 받아들일 수 있으며 그 유전자를 발현할 수 있는 미생물을 말한다. "재조합 미생물 숙주 세포"는 (예를 들어, 미생물 숙주 세포가 외인성 폴리뉴클레오티드로 형질전환되도록) 재조합적으로 엔지니어링된 미생물 숙주 세포를 말한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이, "단리된 핵산 단편"은 선택적으로 합성, 비천연 또는 변경 뉴클레오티드 염기를 포함하는 단일 가닥 또는 이중 가닥인 RNA 또는 DNA의 중합체이다. DNA의 중합체 형태인 분리된 핵산 단편은 cDNA, 게놈 DNA 또는 합성 DNA의 하나 이상의 절편으로 이루어질 수 있다.
아미노산 또는 뉴클레오티드 서열의 "상당한 부분"은, 당업자에 의한 서열의 수동 평가에 의해, 또는 BLAST(기본 국소 정렬 검색 도구(Basic Local Alignment Search Tool); 문헌[Altschul, S. F., et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1993)])와 같은 알고리즘을 사용한 컴퓨터-자동화 서열 비교 및 확인에 의해 그 폴리펩티드 또는 유전자를 추정적으로 확인하기에 충분한 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 유전자의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 부분이다. 일반적으로, 폴리펩티드 또는 핵산 서열을 공지의 단백질 또는 유전자와 상동성인 것으로 추정적으로 확인하기 위해서는 10개 이상의 연접 아미노산 또는 30개 이상의 뉴클레오티드의 서열이 필요하다. 또한, 뉴클레오티드 서열에 있어서는, 서열-의존적인 유전자 확인(예를 들어, 서던 혼성화(Southern hybridization)) 및 단리(예를 들어, 박테리아 콜로니 또는 박테리오파지 플라크의 원위치 혼성화(in situ hybridization)) 방법에 20 내지 30개의 연접 뉴클레오티드를 포함하는 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드 프로브가 사용될 수 있다. 게다가, 프라이머를 포함하는 특정 핵산 단편을 얻기 위하여, 12-15개 염기의 짧은 올리고뉴클레오티드가 폴리머라아제 연쇄 반응("PCR")에서 증폭 프라이머로 사용될 수 있다. 따라서, 뉴클레오티드 서열의 "실질적인 부분"은, 서열을 포함하는 핵산 단편을 특이적으로 확인 및/또는 단리하기에 충분한 서열을 포함한다.
용어 "상보적인"은, 역평행 배향으로 정렬될 때 왓슨-크릭(Watson-Crick) 염기쌍 형성이 가능한 2개 서열의 뉴클레오티드 염기 사이의 관계를 기술한다. 예를 들어, DNA에 있어서, 아데노신은 티민과 염기쌍 형성이 가능하고 시토신은 구아닌과 염기쌍 형성이 가능하다.
"코돈 축퇴성"은 코딩된 폴리펩티드의 아미노산 서열에 영향을 주지 않으면서 뉴클레오티드 서열의 변이를 허용하는 유전자 코드의 성질을 지칭한다. 주어진 아미노산을 특정하기 위한 뉴클레오티드 코돈의 사용에 있어서 특정 숙주 세포에서 나타나는 "코돈-바이어스(codon-bias)"가 당업자에게 주지되어 있다. 그러므로, 숙주 세포 내의 발현을 개선하기 위한 유전자를 합성할 경우에는, 그의 코돈 사용 빈도가 숙주 세포가 선호하는 코돈의 사용 빈도에 근접하도록 유전자를 디자인하는 것이 바람직하다.
"합성 유전자"는 당업자에게 공지되어 있는 절차를 사용하여 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드 빌딩 블록(building block)으로부터 조립될 수 있다. 이들 빌딩 블록들을 라이게이션시키고 어닐링시켜 유전자 절편을 형성하며, 이어서, 효소적으로 조립하여 전체 유전자를 제작한다. 따라서, 유전자는 숙주 세포의 코돈 바이어스를 반영하기 위하여 뉴클레오티드 서열의 최적화에 기초하여 최적의 유전자 발현을 위해 맞춤화될 수 있다. 당업자는 코돈 사용이 숙주가 선호하는 코돈 쪽으로 편향된다면, 성공적인 유전자 발현이 가능함을 인식한다. 바람직한 코돈의 결정은 서열 정보를 이용할 수 있는 숙주 세포로부터 유래된 유전자의 조사에 기초할 수 있다. 예를 들어, 와이. 리포라이티카에 있어서 코돈 사용 프로파일이 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 제7,125,672호에 제공되어 있다.
"유전자"는 특정 단백질을 발현시키는 핵산 단편을 지칭하며, 이는 코딩 영역만을 지칭하거나 코딩 서열 앞에 있는 조절 서열(5' 비-코딩 서열) 및 코딩 서열 뒤에 있는 조절 서열(3' 비-코딩 서열)을 포함할 수 있다. "천연 유전자"는 그 자신의 조절 서열과 함께 자연에서 발견되는 유전자를 지칭한다. "키메라 유전자"는 자연에서 함께 발견되지 않는 조절 및 코딩 서열을 포함하는, 천연 유전자가 아닌 임의의 유전자를 지칭한다. 따라서, 키메라 유전자는 상이한 공급원으로부터 유래된 조절 서열과 코딩 서열, 또는 동일한 공급원으로부터 유래되었지만, 자연에서 발견되는 것과 상이한 방식으로 배열된 조절 서열과 코딩 서열을 포함할 수 있다. "내인성 유전자"는 유기체의 게놈에서 그의 자연적 위치에 있는 천연 유전자를 지칭한다. "외래" 유전자 (또는 "외인성 유전자")는 유전자 전달에 의해 숙주 유기체 내로 도입된 유전자를 말한다. 외래 유전자는 비-천연 유기체에 삽입된 천연 유전자, 천연 숙주 내의 새로운 위치에 도입된 천연 유전자, 또는 키메라 유전자를 포함할 수 있다. "트랜스유전자(transgene)"는 형질전환 절차에 의해 게놈 내로 도입된 유전자이다. "코돈-최적화된 유전자"는 그의 코돈 사용 빈도가 숙주 세포의 선호하는 코돈 사용의 빈도를 모방하도록 디자인된 유전자이다.
"코딩 서열"은 특정 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 서열을 말한다.
"적합한 조절 서열"은 코딩 서열의 상류(5' 비-코딩 서열), 그의 내부 또는 그의 하류(3' 비-코딩 서열)에 위치하고, 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성 또는 결부된 코딩 서열의 번역에 영향을 미치는 뉴클레오티드 서열을 말한다. 조절 서열은 프로모터, 인핸서(enhancer), 사일런서(silencer), 5' 비번역 리더(untranslated leader) 서열(예를 들어, 전사 시작 부위와 번역 개시 코돈의 사이), 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 프로세싱 부위, 이펙터(effector) 결합 부위 및 스템-루프 구조를 포함할 수 있다.
"프로모터"는 코딩 서열 또는 기능성 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 말한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3'에 위치한다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그 전체가 유래될 수도 있거나, 자연에서 발견되는 상이한 프로모터로부터 유래된 상이한 요소로 구성될 수도 있거나, 또는 심지어 합성 DNA 절편을 포함할 수도 있다. 상이한 프로모터는 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발생 단계에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 유도할 수 있음을 당업자는 이해할 것이다. 유전자가 대부분의 시점에 대부분의 세포 유형에서 발현되게 하는 프로모터는 통상 "구성적(constitutive) 프로모터"로 지칭된다. 대부분의 경우에, 조절 서열의 정확한 경계가 완벽하게 규정되어 있지 않기 때문에, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있다는 것이 추가로 인식된다.
용어 "3' 비-코딩 서열", "전사 종결자(terminator)" 및 "종결자"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용되며, 코딩 서열의 3' 하류에 위치한 DNA 서열을 말한다. 이는 폴리아데닐화 인식 서열 및 mRNA 프로세싱 또는 유전자 발현에 영향을 미칠 수 있는 조절 신호를 코딩하는 다른 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 통상적으로 mRNA 전구체의 3' 말단에 폴리아데닐산 트랙트(tract)를 부가하는 데에 영향을 미치는 것을 특징으로 한다. 3' 영역은 전사, RNA 프로세싱 또는 안정성, 또는 관련 코딩 서열의 번역에 영향을 미칠 수 있다.
용어 "작동가능하게 연결된"은 하나의 기능이 나머지에 의해 영향을 받도록 하는, 단일 핵산 단편 상에서의 핵산 서열의 결부를 말한다. 예를 들어, 프로모터는 그것이 코딩 서열의 발현을 초래할 수 있는 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 다시 말하면, 코딩 서열은 프로모터의 전사적 조절 하에 있다. 코딩 서열은 센스(sense) 또는 안티센스(antisense) 배향으로 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 용어 "발현"은 센스(mRNA) 또는 안티센스 RNA의 전사 및 안정적인 축적을 지칭한다. 발현은 mRNA로부터의 폴리펩티드로의 번역을 지칭할 수도 있다.
"형질전환"은 핵산 분자의 숙주 유기체로의 전달을 지칭한다. 핵산 분자는 자가 복제되는 플라스미드일 수 있거나; 또는 이것은 숙주 유기체의 게놈 내로 통합될 수 있다. 형질전환된 핵산 단편을 함유하는 숙주 유기체는 "트랜스제닉" 또는 "재조합" 또는 "형질전환된" 유기체 또는 "형질전환체"로 지칭된다.
"안정적인 형질전환"은 핵산 단편을 핵 및 세포소기관 게놈 둘 모두를 포함하는 숙주 유기체의 게놈 내로 전달하여, 유전적으로 안정적인 유전을 야기하는 것을 말한다(즉, 핵산 단편은 "안정적으로 통합된다"). 반대로, "일시적 형질전환"은, 숙주 유기체의 핵, 또는 DNA-함유 소기관 내로 핵산 단편을 전달하여, 통합 또는 안정적인 유전성이 없는 유전자 발현을 유발하는 것을 지칭한다.
용어 "플라스미드" 및 "벡터"는 흔히 세포의 중추적 대사의 일부가 아닌 유전자를 운반하는 보통 원형의 이중 가닥 DNA 단편 형태의 염색체 외 요소를 지칭한다. 이러한 요소는 자가 복제되는 서열, 게놈 통합 서열, 파지 또는 뉴클레오티드 서열일 수 있으며, 임의의 공급원으로부터 유래되는 선형 또는 원형의 단일- 또는 이중-가닥 DNA 또는 RNA일 수 있고, 여기서, 다수의 뉴클레오티드 서열은 세포 내로 발현 카세트(들)를 도입할 수 있는 독특한 제작물 내로 연결되거나 재조합된다.
용어 "발현 카세트는", 선택된 유전자의 코딩 서열 및 선택된 유전자 생성물의 발현을 위해 필요한 코딩 서열에 선행하는 조절 서열(5' 비-코딩 서열) 및 후행하는 조절 서열(3' 비-코딩 서열)을 포함하는 DNA의 단편을 지칭한다. 따라서, 발현 카세트는 전형적으로 1) 프로모터 서열; 2) 코딩 서열(즉, 오픈 리딩 프레임("ORF")); 및 3) 진핵생물에서 대개 폴리아데닐화 부위를 함유하는 3' 비번역 영역(즉, 종결자)으로 구성된다. 발현 카세트(들)는 통상적으로 벡터 내에 포함되어, 클로닝 및 형질전환을 용이하게 한다. 정확한 조절 서열이 각각의 숙주에 대하여 사용되는 한, 상이한 발현 카세트로 박테리아, 효모, 식물 및 포유류 세포를 비롯한 상이한 유기체를 형질전환시킬 수 있다.
용어 "서열 분석 소프트웨어"는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 분석하는데 유용한 임의의 컴퓨터 알고리즘 또는 소프트웨어 프로그램을 말한다. "서열 분석 소프트웨어"는 상업적으로 입수할 수 있거나 독립적으로 개발할 수 있다. 전형적인 서열 분석 소프트웨어에는 하기의 것이 포함될 것이나, 이에 한정되지 않는다: 1) GCG 프로그램 모음(위스콘신 패키지 버전(Wisconsin Package Version) 9.0, 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹(Genetics Computer Group, GCG)); 2) BLASTP, BLASTN, BLASTX(문헌[Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]); 3) DNASTAR(미국 위스콘신주 매디슨 소재의 디엔에이스타, 인코포레이티드); 4) 시퀀쳐(Sequencher)(미국 미시간주 앤 아버 소재의 진 코즈 코포레이션(Gene Codes Corporation)); 및 5) 스미스-워터만(Smith-Waterma) 알고리즘을 통합하는 FASTA 프로그램(문헌[W. R. Pearson, Comput. Methods Genome Res., [Proc. Int. Symp.] (1994), Meeting Date 1992, 111-20. Editor (s): Suhai, Sandor. Plenum: New York, NY])을 포함하는 FASTA 프로그램. 본 출원과 관련하여, 서열 분석 소프트웨어가 분석을 위해 사용된 경우에는, 그 분석 결과가 달리 명시되지 않는 한, 참조한 프로그램의 "디폴트 값"에 기초할 것임을 이해할 것이다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, "디폴트 값"은 최초 초기화할 때에 소프트웨어에 원래 로딩된 값 또는 파라미터의 임의의 세트를 의미할 것이다.
핵산 또는 폴리펩티드 서열과 관련하여 "서열 동일성" 또는 "동일성"은, 특정된 비교창 상에 최대 상응도로 정렬될 경우에 2개 서열 중의 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기를 말한다. 따라서, "서열 동일성의 백분율" 또는 "동일성 백분율"은 비교창에 걸쳐 최적으로 정렬된 2개의 서열을 비교함으로써 결정된 값을 지칭하며, 여기서 비교창 내의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열의 부분은 2개 서열의 최적 정렬을 위한 기준 서열(삽입 또는 결실을 포함하지 않음)과 비교하여 삽입 또는 결실(즉, 갭)을 포함할 수 있다. 양자 모두의 서열 내에서 동일한 핵산 염기 또는 아미노산 잔기가 나타나는 위치의 개수를 결정하여 일치하는 위치의 개수를 산출하고, 일치하는 위치의 개수를 비교창 내의 위치의 총 개수로 나누고, 그 결과에 100을 곱하여 서열 동일성의 백분율을 산출함으로써 백분율을 계산한다.
"동일성 백분율" 및 "유사성 백분율"의 결정 방법은 공중 이용가능한 컴퓨터 프로그램에 코드화되어 있다. 동일성 백분율 및 유사성 백분율은 하기의 문헌에 기재된 것을 포함하나 이에 한정되지 않는 공지의 방법에 의해 용이하게 계산될 수 있다: 1) 문헌[Computational Molecular Biology (Lesk, A. M., Ed.) Oxford University: NY (1988)]; 2) 문헌[Biocomputing: Informatics and Genome Projects (Smith, D. W., Ed.) Academic: NY (1993)]; 3) 문헌[Computer Analysis of Sequence Data, Part I (Griffin, A. M., and Griffin, H. G., Eds.) Humania: NJ (1994)]; 4) 문헌[Sequence Analysis in Molecular Biology (von Heinje, G., Ed.) Academic (1987)]; 및 5) 문헌[Sequence Analysis 프라이머 (Gribskov, M. and Devereux, J., Eds.) Stockton: NY (1991).
서열 정렬 및 퍼센트 동일성 또는 유사성 계산은 상동 서열을 검출하도록 디자인된 다양한 비교 방법을 사용하여 결정될 수 있다.
서열의 다중 정렬은 "ClustalV 정렬법" 및 "ClustalW 정렬법"(문헌[Higgins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)]; 문헌[Higgins, D.G. et al., Comput . Appl. Biosci ., 8:189-191(1992)])을 포함하는 그리고 상기 멕얼라인(MegAlign™) (버전 8.0.2) 프로그램에서 발견되는 몇몇 다양한 알고리즘을 포함하는 "Clustal 정렬법"을 이용하여 수행될 수 있다. Clustal 프로그램 중 어느 하나를 사용한 서열의 정렬 후에, 프로그램 내의 "서열 거리" 표를 봄으로써 "동일성 백분율"을 수득할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 표준 재조합 DNA 및 분자 클로닝 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1989)] (이하, "Maniatis"); 문헌[Silhavy, T. J., Bennan, M. L. and Enquist, L. W., Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY (1984)]; 및 문헌[Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, published by Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience, Hoboken, NJ (1987)]에 기재되어 있다.
와이. 리포라이티카는 수크로스를 탄소 공급원으로 사용하도록 재조합적으로 엔지니어링될 수 있다. 이는 상기 유기체가 인버타아제를 코딩하는 유전자를 발현하도록 엔지니어링하는 것을 포함하였는데, 상기 인버타아제는 수크로스의 글루코스 및 프룩토스로의 전환을 촉매한다. 그러나, 수크로스는 효모가 성장하는 배지에 존재하기 때문에, 수크로스는 세포내 인버타아제에 의한 그의 가수분해 이전에는 세포 내로 수송될 필요가 있거나 또는 인버타아제는 세포외에서 발현되어야 하며, 여기서 상기 인버타아제는 배지 중 수크로스를 글루코스 및 프룩토스로 가수분해할 수 있고 이것이 다시 세포 내로 수송될 수 있다. 바람직하게는, 시그널 서열이 이종 인버타아제 유전자에 융합되어서 인버타아제가 주위 매질 내로 세포외로 분비되게 한다.
사카로마이세스 세레비지애는 수크로스의 글루코스 및 프룩토스로의 전환을 촉매하는 기능성 인버타아제(EC 3.2.1.26; "β-프룩토푸라노시다아제"로도 칭해짐)의 발현에 의한 것 때문에 수크로스를 발효시킨다. 에스. 세레비지애 내의 동일 SUC2 대립유전자로부터 발현된 2가지 형태의 인버타아제, 즉 글루코스 억제에 의해 조절되는 분비형의 글리코실화된 형태 및 구성적으로 생성되는 세포내의 비글리코실화된 형태가 있다. 이들 두 형태 사이의 차이는 분비형의 글리코실화된 인버타아제의 합성에 필요한 5'-시그널 서열의 존재 또는 부재에 기인한다. 이 시그널 서열은 인버타아제 단백질의 처음 19개 아미노산으로 정의되었다 (문헌[Perlman, D., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79:781-785 (1982)]; 문헌[Carlson and Botstein, Cell, 28(1):145-54 (1982)]; 문헌[Taussig and Carlson, Nucleic Acids Res., 11:1943-54 (1983)]).
따라서, 전장 에스. 세레비지애 SUC2["ScSUC2"] 유전자 (서열 번호 1)는 길이가 1599개 뉴클레오티드이며, 이는 글리코실화된 형태로 에스. 세레비지애의 주변세포질 내로 분비되는 532개 아미노산의 전장 인버타아제 (서열 번호 2)를 코딩한다. 이와는 대조적으로, "성숙" ScSUC2 유전자["m-ScSUC2"]는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되는 19개 아미노산 길이의 5' 시그널 서열이 결여되어 있으며; 따라서, m-ScSUC2의 세포내 비글리코실화 형태는 서열 번호 3으로 기술된 1542 bp 뉴클레오티드 서열로 코딩되며 (이는 서열 번호 1의 뉴클레오티드 58-1599에 상응함), 이는 513개 아미노산의 절두형 m-ScSUC2 단백질 (서열 번호 4)을 생성하도록 번역된다.
세포의 막을 통하여 분비되는 단백질은 일반적으로 "프리"-단백질로서 세포내에서 생성된다. 이 형태에 있어서, 단백질은 아마도 그의 분비 및 국재화를 돕지만 분비 과정 동안 분비된 "성숙" 단백질로부터 궁극적으로 절단되는 추가의 "시그널" 펩티드 서열에 융합된다. 프리-단백질의 시그널 펩티드는 일부 유사성을 공유하지만, 그의 일차 구조는 상당히 상이하다. 이는 각각의 단백질이 세포막을 통하여 그 특정 단백질의 전좌에 특히 적합한 시그널 서열과 함께 진화되었음을 시사한다. 상기에 논의된 바와 같이, 와이. 리포라이티카는 다량의 AEP를 배양 배지 내로 천연적으로 분비한다. 서열 번호 6의 전장 와이. 리포라이티카 AEP (길이: 454개 아미노산)는 1365 bp XPR2 유전자 (서열 번호 5)에 의해 코딩된다. 상기 프로테아제의 N-말단 157개 아미노산 잔기는 성숙 단백질의 프로세싱 및 분비에 연루된 시그널 서열 및 프리/프로-영역을 함유한다.
상세한 연구에 의하면, AEP는 프리프로I-프로II-프로III N-말단 영역과 함께 합성됨이 밝혀졌으며, AEP의 4가지 상이한 전구체가 검출되었다. 아미노산 위치 1 내지 13은 분비성 시그널 서열, 이어서 전형적인 다이펩티딜 아미노펩티다아제 인식 부위들인 -Xaa-Ala- 및 -Xaa-Pro-의 런(run)을 포함하는 위치 14 내지 33을 함유한다. 아미노산 위치 54 또는 60은 프로I 영역과 프로II 영역 사이의 절단 부위인 것으로 생각되는 반면, 위치 129 또는 131은 프로II 영역과 프로III 영역 사이의 다른 절단 부위이다. 마지막으로, 서열 번호 6의 아미노산 위치 157은 프로 III과 성숙 AEP 사이의 절단 부위이다 (문헌[Matoba, S. et al., Mol. Cell Biol., 8(11):4904-4916 (1988)]; 또한 미국 특허 제4,937,189호 및 유럽 특허 제0220864 B1호 참조). 아미노산 1-157에 상응하는 프리/프로-영역은 단백질 폴딩, 효율적인 분비, 조기 활성화의 방지 등에 연루되며; 프리/프로-영역의 절단 없이는, AEP 단백질은 비기능성인 것으로 제안되었다.
Xpr2 프리프로-영역은 와이. 리포라이티카에서 다양한 이종 단백질의 분비에 이용되었지만; 단백질 분비에 있어서의 Xpr2 프리프로-영역의 사용은 혼합된 결과를 생성하였다 (문헌[Madzak, C.,et al., Microbiology, 145(1):75-87 (1999)]). 만족스럽지 못한 단백질 발현의 이유는 불완전 단백질 프로세싱 (문헌[Park, C. S., et al., J. Biol. Chem., 272:6876-6881 (1997)]; 문헌[Park, C. S., et al., Appl. Biochem. Biotechnol., 87:1-15 (2000)]; 문헌[Swennen, D., et al., Microbiology, 148:41-50 (2002)]) 및 세포외 발현의 결여 (문헌[Hamsa, P. V. and B. B. Chattoo, Gene, 143:165-70 (1994)]; 문헌[Tharaud, C., et al., Gene, 121:111-119 (1992)])를 포함한다. 따라서, 프로-서열은 이종 단백질 분비에 필요하지 않을 수 있거나 또는 심지어 해로울 수 있음이 제안되었다 (문헌[Madzak, C., et al., J. Biotechnol., 109:63-81 (2004)]; 문헌[Park, et al., J. Biol. Chem. (상기)]; 문헌[Tharaud, C., et al., 상기]). 이는 문헌[Tabuchi, M., et al., J. Bacteriol., 179:4179-4189 (1997)]에 나타나 있으며, 여기서, 카르복시펩티다아제 Y(CPY)의 프리프로-영역은 쉬조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe) 유래의 Suc2의 분비에 효과가 없었다.
ScSuc2 시그널 서열 (서열 번호 1의 뉴클레오티드 1-57[즉, ScSUC2의 아미노산 1-19]에 상응함)을 발현하는 제작물을 아미노산 위치 2에서 돌연변이시켜 PciI 제한 효소 부위를 도입하였다. 그 결과, 야생형 Leu2 잔기는 다른 소수성 잔기인 Phe2로 돌연변이되었으며, 이럼으로써 ScSuc2의 분비 과정에 영향을 주지 않고서 시그널 서열의 소수성이 유지되었다 (문헌[Kaiser, C. A.,et al., Science, 235:312-317 (1987)]). 따라서, 본 발명의 하나의 적합한 ScSuc2 시그널 서열(즉, "Suc2SS")은 본 명세서에서 서열 번호 7 및 8로 기술된다.
Xpr2 프리/프로-영역을 포함하는 제작물은 서열 번호 10의 아미노산 1-170을 코딩하도록 디자인되었다. Xpr2 프리/프로-영역은 본 명세서에서 서열 번호 6의 아미노산 1-157만을 포함하는 것으로 기재되었지만, 프리/프로-영역(즉, N-말단 Xpr2 단편) 이후의 상기 프로테아제의 추가의 13개 아미노산을 "링커"로서 포함시켜 Xpr6 엔도펩티다아제가 Lys156-Arg157 절단 부위에 접근하는 것을 보장하였으며, 그 이유는 융합 접합부의 부정확한 프로세싱이 추정 2차 구조로 인하여 이전에 주목되었기 때문이었다 (문헌[Park, C. S., et al., J. Biol. Chem., 272:6876-6881 (1997)]). 따라서, 본 발명의 하나의 적합한 Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편(즉, "XPR2PP+13")은 본 명세서에서 서열 번호 9 및 10으로 기술된다.
하기 표 2에 요약되고 도 1에 예시된 발현 카세트는 형질전환된 와이. 리포라이티카에서의 인버타아제 발현에 대하여 평가되었다. 더 구체적으로, 발현 플라스미드 pYRH68은 Suc2SS 시그널 서열이 성숙 SUC2(즉, 서열 번호 3; "m-ScSUC2")를 코딩하는 유전자에 융합된 것을 포함하며, 발현 플라스미드 pYRH70은 Suc2SS 시그널 서열이 서열 번호 3의 서열에 융합된 것의 2개의 카피를 포함하며, 발현 플라스미드 pYRH69는 Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편 둘 모두와 Suc2SS 시그널 서열이 서열 번호 3에 융합된 것을 포함하며, 발현 플라스미드 pYRH73은 단지 서열 번호 3의 서열을 포함하며 (그리고 Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편도 포함하지 않고 분비성 시그널 서열로서 Suc2SS 시그널 서열도 포함하지 않음), 발현 플라스미드 pYRH74는 Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편이 서열 번호 3의 서열에 융합된 것을 포함하였다. "FBAINm 프로모터 영역"(즉, fba1 유전자에 의해 코딩되는 프룩토스-비스포스페이트 알돌라아제 효소(E.C. 4.1.2.13)의 'ATG' 번역 개시 코돈 앞의 5' 상류 비번역 영역으로부터 유래됨 [미국 특허 제7,202,356호])은 인버타아제 유전자 제작물에 작동가능하게 연결되었다.
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상기 플라스미드 제작물들 각각을 발현하는 와이. 리포라이티카 형질전환체는 수크로스가 유일한 탄소 공급원인 배지 상에서 성장시켰다. Suc2SS 시그널 서열이 성숙 SUC2를 코딩하는 유전자(이는 ScSuc2[즉, 서열 번호 2]를 코딩하는 전장 유전자에 효과적으로 상응함)에 융합된 것을 발현하는 형질전환체(즉, pYRH68 및 pYRH70) 또는 Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편이 성숙 SUC2를 코딩하는 유전자에 융합된 것을 발현하는 형질전환체(즉, pYRH74)만이 인버타아제, 즉, SUC+ 표현형을 발현하였다. 따라서, 이는 와이. 리포라이티카에서의 ScSUC2의 기능적 발현으로 이어지는 융합물들을 예시한다.
일 태양에서, 본 발명은 수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 와이. 리포라이티카에 관한 것이며, 여기서,
(a) 상기 폴리펩티드는 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 폴리펩티드 서열에 융합된 시그널 서열을 포함하고;
(b) 상기 시그널 서열은
(i) Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편; 및
(ii) 제2 아미노산이 임의의 소수성 아미노산일 수 있는 수크로스 인버타아제 시그널 서열로 이루어진 군으로부터 선택되며;
(c) 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 상기 폴리펩티드 서열은, 서열 번호 4의 서열("m-ScSUC2")과 비교할 때, CLUSTALW 정렬법을 기반으로 할 경우 서열 동일성이 80% 이상이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 형질전환된 와이. 리포라이티카는, 적어도 수크로스를 탄소 공급원으로 갖는 배양 배지에서 배양될 때, 80% 이상의 수크로스 인버타아제를 세포외로 분비할 수 있을 것이다(한편, 세포내[또는 주변 세포질] 인버타아제 활성은 전체 인버타아제 활성의 20% 이하이다). 더 바람직하게는, 세포외 인버타아제 활성은 전체 인버타아제 활성의 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%이다.
이전에 기재된 바와 같이, 본 명세서에서 서열 번호 4로 기술된 "성숙 ScSUC2 단백질["m-ScSUC2"]은 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩되는 19개 아미노산 길이의 5' 시그널 서열이 결여되어 있다. 바람직하게는, 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4("m-ScSUC2")에 기술되어 있다. 다른 실시 형태에서, 성숙 수크로스 인버타아제는 CLUSTALW 정렬법에 기초하면 서열 번호 4의 서열과 비교할 때 서열 동일성이 80% 이상이며, 즉, 상기 폴리펩티드는 서열 번호 4의 서열과 비교할 때 동일성이 적어도 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다.
일 실시 형태에서, 서열 번호 4의 서열을 와이. 리포라이티카에서의 발현용으로 코돈-최적화하는 것이 바람직할 수 있다. 이는 이전의 와이. 리포라이티카 코돈 사용 프로파일의 결정, 바람직한 코돈의 확인, 및 'ATG' 개시 코돈 주위의 콘센서스 서열의 결정에 기초하면 가능하다 (미국 특허 제7,238,482호 참조).
다른 실시 형태에서, 표 14의 인버타아제 서열 (실시예 8) 또는 그 부분들이 본 발명에서 사용될 수 있다. 대안적으로, 이들 중 임의의 것은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 동일하거나 다른 종에서 인버타아제 상동체를 검색하는 데 사용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 컴퓨터 소프트웨어는 상동성 정도를 다양한 치환, 결실 및 다른 변형에 할당함으로써 유사한 서열들을 매칭시킨다. 소프트웨어 알고리즘, 예를 들어 낮은 복잡성의 필터 및 하기 파라미터, 즉 기대 값 = 10, 매트릭스 = Blosum 62 (문헌[Altschul, et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)])를 이용한 BLASTP 정렬법의 사용은 표 14의 임의의 인버타아제 단백질을 핵산 또는 단백질 서열의 데이터베이스에 대하여 비교하고 이럼으로써 바람직한 유기체 내에서 유사한 공지된 서열들을 확인하기 위한 수단으로서 잘 알려져 있다.
공지된 서열의 데이터베이스를 통하여 찾기 위하여 소프트웨어 알고리즘을 사용하는 것은 표 14에 기재된 것과 같이, 공개적으로 입수가능한 인버타아제 서열에 대하여 상대적으로 낮은 퍼센트의 동일성을 갖는 상동체의 단리에 특히 적합하다. 단리는 공개적으로 입수가능한 인버타아제 서열에 대하여 적어도 약 80%-85%의 동일성의 인버타아제 상동체에 대하여 상대적으로 더욱 용이한 것으로 예측가능하다. 또한, 적어도 약 85%-90% 동일한 서열이 단리에 특히 적합할 것이며, 적어도 약 90%-95% 동일한 서열이 가장 용이하게 단리될 것이다.
일부 인버타아제 상동체는 또한 인버타아제 효소에 독특한 모티프의 사용에 의해 단리되었다. 모티프는 단백질 상동체들의 패밀리의 정렬된 서열들에 있어서 그의 높은 보존도에 의해 확인된다. 독특한 "시그너쳐(signature)"로서, 모티프는 새롭게 결정된 서열을 갖는 단백질이 이전에 확인된 단백질 패밀리에 속하는지를 결정할 수 있다. 이들 모티프는 신규한 인버타아제 유전자의 신속한 확인을 위한 진단 도구로서 유용하다.
본 명세서에 기재되거나 또는 공개 문헌에 기재된 인버타아제 핵산 단편들 중 임의의 것, 또는 임의의 확인된 상동체는 동일하거나 또는 다른 종으로부터 상동 단백질을 코딩하는 유전자를 단리하는 데 사용될 수 있다. 서열-의존성 프로토콜을 사용하는 상동 유전자의 분리는 당업계에 주지되어 있다. 서열-의존성 프로토콜의 예에는 1) 핵산 혼성화법; 2) 핵산 증폭 기술의 다양한 사용에 의해 예시되는 바와 같이 DNA 및 RNA 증폭법, 예를 들어 폴라머라아제 연쇄 반응["PCR"] (미국 특허 제4,683,202호); 리가아제 연쇄 반응(ligase chain reaction)["LCR"] (문헌[Tabor, S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:1074 (1985)]); 또는 가닥 대체식 증폭법(strand displacement amplification)["SDA"] (문헌[Walker, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 89:392 (1992)]); 및 3) 상보성에 의한 스크리닝 및 라이브러리 제작 방법이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 형질전환된 와이. 리포라이티카는 수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 여기서, 폴리펩티드는 시그널 서열이 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 외인성 폴리펩티드에 융합된 것을 포함할 것이며, 상기 시그널 서열은 1) Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편; 및 2) 제2 아미노산이 임의의 소수성 아미노산일 수 있는 수크로스 인버타아제 시그널 서열로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편을 포함하는 시그널 서열과 관련하여, 당업자라면 성숙 단백질을 코딩하는 서열에 대하여 프리/프로-영역을 코딩하는 서열을 확인하기 위하여 알칼리성 세포외 프로테아제(EC 3.4.21.-)를 코딩하는 적합한 XPR2 유전자를 분석할 수 있을 것이다. 예를 들어, SignalP 4.0 서버 (덴마크 DK-2800 링그비 소재의 테크니칼 유니버시티 오브 덴마크(Technical University of Denmark), 시스템 생물학과, 생물 서열 분석 센터(Center for Biological Sequence Analysis, Department of Systems Biology))는 상이한 유기체 유래의 아미노산 서열에 있어서 시그널 펩티드 절단 부위의 존재 및 위치를 예측하는 데 유용하다 (문헌[Nielsen, H., et al., Protein Engineering, 10:1-6 (1997)]; 문헌[Petersen, T. N., et al., Nature Methods, 8:785-786 (2011)]). 이 확인 후, 전장 Xpr2 프리/프로-영역, + 성숙 Xpr2 단백질(즉, AEP)의 추가의 N-말단 단편을 코딩하는 적절한 서열을 단리하는 것이 쉽게 가능해진다.
이러한 N-말단 Xpr2 단편은, (정확한 길이의 N-말단 단편이 이용되는 각각의 XPR2 유전자에 대하여 실험적으로 결정될 필요가 있을 것이지만) 프리/프로-영역과 성숙 단백질 사이의 절단 부위로의 Xpr6 엔도펩티다아제의 접근을 보장하기 위하여, 성숙 프로테아제의 대략 아미노산 1-10 이상, 그리고 성숙 프로테아제의 대략 아미노산 1-25 이하를 코딩한다.
더 바람직하게는, 성숙 프로테아제의 N-말단 Xpr2 단편은 성숙 프로테아제의 아미노산 1 내지 11, 아미노산 1 내지 12, 아미노산 1 내지 13, 아미노산 1 내지 14, 아미노산 1 내지 15, 아미노산 1 내지 16, 아미노산 1 내지 17, 아미노산 1 내지 18, 아미노산 1 내지 19, 아미노산 1 내지 20, 아미노산 1 내지 21, 아미노산 1 내지 22, 아미노산 1 내지 23 또는 성숙 프로테아제의 아미노산 1 내지 24를 코딩할 것이다.
와이. 리포라이티카 유래의 Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편은 Xpr2 프리/프로-영역의 적어도 157개 아미노산(서열 번호 6의 즉, 아미노산 1-157) 및 성숙 프로테아제를 코딩하는 추가의 N-말단 Xpr2 단편(즉, 서열 번호 6의 아미노산 158-167 또는 아미노산 158-168 또는 아미노산 158-169 또는 아미노산 158-170 또는 아미노산 158-171 또는 아미노산 158-172 또는 아미노산 158-173 또는 아미노산 158-174 또는 아미노산 158-175 또는 아미노산 158-176 또는 아미노산 158-177 또는 아미노산 158-178 또는 아미노산 158-179 또는 아미노산 158-180 또는 아미노산 158-181 또는 아미노산 158-182)을 포함할 것이다.
바람직한 Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편(즉, "XPR2PP+13", 서열 번호 10에 기술되어 있는 바와 같음)은 서열 번호 6의 아미노산 1-170을 포함하였으며, 이는 Lys156-Arg157 절단 부위에 대한 Xpr6 엔도펩티다아제의 접근을 보장하기 위하여 Xpr2 프리/프로-영역 이후의 추가의 13개 아미노산(즉, 성숙 프로테아제의 아미노산 1 내지 13)에 부합되었다.) 따라서, Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편은 하기를 포함한다:
(a) AEP 전구체의 N-말단의 157개 아미노산을 포함하는 Xpr2 프리/프로-영역; 및
(b) 성숙 AEP의 N-말단의 13개 아미노산을 포함하는 N-말단 Xpr2 단편.
와이. 리포라이티카를 형질전환시킬 수 있는, 수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 하나의 바람직한 외인성 폴리펩티드는 서열 번호 10의 N-말단 Xpr2 단편 및 Xpr2 프리/프로-영역의 시그널 서열이 서열 번호 4의 성숙 수크로스 인버타아제("m-ScSUC2")에 융합된 것을 포함하며, 이럼으로써 XPR2PP+13/m-ScSUC2 융합물을 생성하는데, 이는 서열 번호 19로 개시된 뉴클레오티드 서열을 갖고 서열 번호 20의 단백질을 코딩한다.
수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드 - 여기서, 폴리펩티드는 시그널 서열이 성숙 수크로스를 코딩하는 폴리펩티드에 융합된 것을 포함함 - 를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 와이. 리포라이티카는 대안적으로는 수크로스 인버타아제 시그널 서열을 이용할 수 있으며, 여기서, 수크로스 인버타아제 시그널 서열의 제2 아미노산은 임의의 소수성 아미노산일 수 있다.
당업자라면 성숙 인버타아제 단백질을 코딩하는 서열에 대하여 인버타아제 시그널 서열을 코딩하는 서열을 확인하기 위하여 상기에 기재된 유사한 방법을 이용할 수 있을 것이다. 일단 확인되면, 본 명세서에 기재된 바와 같이, 인버타아제 시그널 서열을 단리하여 수크로스 인버타아제 활성을 갖는 융합 폴리펩티드를 제작하는 것이 쉽게 가능해지며, 이는 본 명세서에 기재된 바와 같다. 명확함을 위하여, 수크로스 인버타아제 시그널 서열 및 성숙 수크로스 인버타아제는 단일 종으로부터 단리될 수 있거나 (이럼으로써 그 종의 전장 인버타아제 프리-단백질에 대하여 효과적으로 등가가 됨); 또는 수크로스 인버타아제 시그널 서열은 종 "A"로부터 단리될 수 있는 반면, 성숙 수크로스 인버타아제는 종 "B"로부터 단리될 수 있다. 수크로스 인버타아제 시그널 서열의 제2 아미노산은 임의의 소수성 아미노산, 예를 들어 류신, 페닐알라닌, 아이소류신, 발린 또는 메티오닌일 수 있다.
인버타아제 시그널 펩티드를 조사하는 몇몇 이전의 연구는 본질적으로 랜덤한 아미노산 서열들의 20% 이상이 적어도 부분적으로, 인버타아제를 위한 엑스포트(export) 시그널로서 작용할 수 있음을 보여주었다. 엑스포트 시그널의 기능은 시그널 펩티드의 규정된 구조 또는 길이라기보다는 오히려 소수성에 관련된다 (예를 들어, 문헌[Kaiser et al., Science, 235:312-317 (1987)]; 문헌[Kaiser and Botstein, Mol. Cell. Biol., 6:2382-2391(1986)] 참조). 또한, 천연 ScSUC2 시그널 서열과 성숙 ScSUC2 사이의 접합 서열은 시그널 펩티드의 적당한 절단에 중요한 것으로 공지되어 있다. 예를 들어, 서열 번호 2의 잔기 Ala19가 Val으로 돌연변이될 경우, ScSUC2는 결함을 갖게 된다 (문헌[Schauer et al., J. Cell Biol., 100:1664-1075 (1985)]). SUC2 시그널 서열의 변형에 대한 추가의 정보에 대해서는, 문헌[Ngsee et al. (Mol . Cell . Biol ., 9:3400-3410(1989)]을 참조하라.
일 실시 형태에서, 수크로스 인버타아제 시그널 서열은 사카로마이세스 속의 유기체로부터 유래될 수 있다. 더 바람직하게는, 수크로스 인버타아제 시그널 서열, 예를 들어 서열 번호 8에 기술되어 있는 수크로스 인버타아제 시그널 서열["Suc2SS"]은 사카로마이세스 세레비지애로부터 단리된다. 서열 번호 8의 제2 아미노산은 다른 소수성 아미노산으로 쉽게 치환될 수 있으며(즉, Phe2는 대안적으로 Leu2, Ile2, Val2 또는 Met2로 돌연변이될 수 있음), 이럼으로써 인버타아제의 분비 과정에 영향을 주지 않고서 시그널 서열의 소수성을 유지할 것으로 기대된다. 더 구체적으로, 본 발명에서 형질전환된 와이. 리포라이티카에서 사용되는 수크로스 인버타아제 시그널 서열은, 이것이 분비 활성을 사실상 유지하기만 한다면, 서열 번호 8의 서열과 비교할 때 동일성이 적어도 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다 (예를 들어, 문헌[Kaiser and Botstein, Mol. Cell. Biol., 6:2382-2391(1986)] 참조).
와이. 리포라이티카의 형질전환을 위한, 수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 하나의 바람직한 외인성 폴리뉴클레오티드는 서열 번호 8의 수크로스 인버타아제 시그널 서열이 서열 번호 4의 성숙 수크로스 인버타아제("m-ScSUC2")에 융합된 것을 포함하고, 이럼으로써 Suc2SS/m-ScSUC2 융합물을 생성하는데, 이는 서열 번호 11로 기술된 뉴클레오티드 서열을 갖고 서열 번호 12의 단백질을 코딩한다.
서열 번호 12의 Suc2SS/m-ScSUC2 융합물은 예를 들어 (아미노산 2에서의 변화를 제외하고는) 서열 번호 2에 기술된 바와 같은 전장 인버타아제 프리-단백질에 대하여 효과적으로 등가가 되며, 그 이유는 Suc2SS 시그널 서열이 서열 번호 2의 아미노산 1-19에 상응하는 반면 m-ScSUC2가 서열 번호 2의 아미노산 20-532에 상응하기 때문임을 알아야 한다. 따라서, 예를 들어 수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드는 서열 번호 2의 서열에 대한 서열 동일성이 80% 이상일 수 있지만 (CLUSTALW 정렬법에 기초함), 상기 폴리펩티드는 더 바람직하게는 서열 번호 2의 서열과 비교할 때 동일성이 적어도 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100%일 수 있다.
당업자라면 하기를 설명하는 표준 자원 재료를 알고 있다: 1) 거대분자, 예를 들어 DNA 분자, 플라스미드 등의 제작, 조작 및 단리를 위한 특정한 조건 및 절차; 2) 재조합 DNA 단편 및 재조합 발현 제작물의 생성; 및 3) 클론의 스크리닝 및 단리. 문헌[Maniatis, Silhavy, and Ausubel]을 참조하라.
일반적으로, 제작물에 포함되는 서열의 선택은 원하는 발현 생성물, 숙주 세포의 성질 및 형질전환되지 않은 세포에 대하여 형질전환된 세포를 분리하는 제안된 수단에 따라 달라진다. 전형적으로, 벡터는 적어도 하나의 발현 카세트, 선발가능한 마커 및 자가 복제 또는 염색체 통합을 허용하는 서열을 함유한다. 전형적으로, 적합한 발현 카세트는 프로모터, 선택된 유전자의 코딩 서열 및 종결자를 포함한다(즉, 키메라 유전자). 바람직하게는, 둘 모두의 제어 영역은 형질전환된 숙주 세포 유래의 유전자로부터 유래된다.
수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 ORF의 발현을 지시할 수 있는 사실상 임의의 프로모터(즉, 천연, 합성 또는 키메라 프로모터)가 적합하지만, 와이. 리포라이티카 유래의 전사 및 번역 영역이 특히 유용하다. 발현은 유도된 방식 또는 구성적 방식으로 달성될 수 있다. 유도된 발현은 대상 유전자에 작동가능하게 연결된 조절가능한 프로모터의 활성을 유도함으로써 달성될 수 있으며, 구성적 발현은 대상 유전자에 작동가능하게 연결된 구성적 프로모터의 사용에 의해 달성될 수 있다.
종결자는 프로모터가 수득되는 유전자의 3' 영역 또는 상이한 유전자로부터 유래될 수 있다. 매우 다수의 종결자가 공지되어 있으며, 그들이 유래된 것과 동일한 속과 종, 및 그와 상이한 속과 종에서 이용하는 경우 둘 모두에 다양한 숙주에서 만족스럽게 기능한다. 종결자는 통상 임의의 특정 특성 때문이 아니라, 편의성의 문제로 선택된다. 바람직하게는, 종결자는 효모 유전자 유래의 것이다. 또한, 종결자는 당업자가 종결자를 설계하고 합성하기 위하여 입수할 수 있는 정보를 이용할 수 있음에 따라, 합성일 수 있다. 종결자가 불필요할 수 있지만, 이는 매우 바람직하다.
한정하고자 하는 것은 아니지만, 재조합 와이. 리포라이티카에서 사용하기에 바람직한 프로모터 및 종결자는 미국 특허 공개 제2009-0093543-A1호, 미국 특허 공개 제2010-0068789-A1호, 미국 특허 공개 제2011-0059496-A1호, 미국 가특허 출원 제61/469,933호(대리인 문서 번호 CL4736USPRV(출원일: 2011년 3월 31일)), 미국 가특허 출원 제61/470,539호(대리인 문서 번호 CL5380USPRV(출원일: 2011년 4월 1일)), 미국 가특허 출원 제61/471,736호(대리인 문서 번호 CL5381USPRV(출원일: 2011년 4월 5일)) 및 미국 가특허 출원 제61/472,742호(대리인 문서 번호 CL5382USPRV(출원일: 2011년 4월 7일))에 교시된 것이며, 각각의 개시내용은 본 명세서에 참고로 포함된다. 더 구체적으로, 바람직한 프로모터는 GPD, GPDIN, GPM, GPM/FBAIN, FBA, FBAIN, FBAINm, GPAT, YAT1, EXP1, DGAT2, EL1, ALK2, 및 SPS19를 포함한다.
많은 특수 발현 벡터가 높은 발현율을 수득하기 위하여 생성되었다. 이러한 벡터는 전사, RNA 안정성, 번역, 단백질 안정성 및 위치, 및 숙주 세포로부터의 분비를 좌우하는 소정 특성들의 조정에 의해 만들어진다. 이들 특성은 관련 전사 프로모터 및 종결자 서열의 성질; 클로닝된 유전자의 카피수(여기서, 플라스미드 카피수를 증가시키거나, 클로닝된 유전자를 게놈 내로 다수 통합시킴으로써 추가의 카피가 단일의 발현 제작물 내에 클로닝될 수 있고/거나 추가의 카피가 숙주 세포에 도입될 수 있다); 유전자가 플라스미드-운반형(plasmid-borne)인지 숙주 세포 게놈 내로 통합된 것인지의 여부; 숙주 유기체에서의 단백질의 올바른 폴딩 및 번역의 효율; 숙주 세포 내의 클로닝된 유전자의 mRNA 및 단백질의 내재적 안정성; 및 클로닝된 유전자 내에서의 코돈 사용 - 그의 빈도가 숙주 세포의 바람직한 코돈 사용 빈도에 근접하도록 - 을 포함한다.
일단 와이. 리포라이티카에서의 발현에 적합한 DNA 카세트 (예를 들어, 프로모터, 수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 ORF 및 종결자를 포함하는 키메라 유전자를 포함함)가 수득되었으면, 이것은 숙주 세포 내에서 자율 복제가 가능한 플라스미드 내에 두어지거나, 또는 상기 키메라 유전자를 함유하는 DNA 단편은 게놈 내로 직접적으로 통합된다. 발현 카세트의 통합은 와이. 리포라이티카 게놈 내에서 랜덤하게 발생할 수 있거나, 또는 특정 유전자좌와의 재조합을 표적화하기에 충분한 게놈과의 상동성 영역을 함유하는 제작물의 사용을 통하여 표적화시킬 수 있다. 제작물이 내인성 유전자좌에 표적화될 경우, 전사 및 번역 조절 영역의 전부 또는 일부가 내인성 유전자좌에 의해 제공될 수 있다.
관심대상의 키메라 수크로스 인버타아제 유전자(들)를 포함하는 제작물은 임의의 표준 기술에 의해 와이. 리포라이티카 내로 도입될 수 있다. 이들 기술로는 형질전환(예컨대, 아세트산리튬 형질전환(문헌[Methods in Enzymology, 194:186-187 (1991)]), 바이올리스틱 충격, 전기천공, 미세주입, 또는 관심대상의 유전자(들)를 숙주 세포 내로 도입하는 임의의 다른 방법이 포함된다. 와이. 리포라이티카에 적용가능한 더욱 특정한 교시는 미국 특허 제4,880,741호 및 미국 특허 제5,071,764호와, 문헌[Chen, D. C. et al. (Appl. Microbiol. Biotechnol., 48(2):232-235 (1997))]을 포함한다. 바람직하게는, 숙주의 게놈 내로의 선형 DNA 단편의 통합이 와이. 리포라이티카 숙주 세포의 형질전환에서 선호된다. 높은 유전자 발현 수준이 바람직한 경우, 게놈 내의 다수의 위치로의 통합이 특히 유용할 수 있다. 바람직한 유전자좌는 미국 특허 공개 제2009-0093543-A1호의 표 3에 기재되어 있다.
용어 "형질전환된", "형질전환체" 또는 "재조합체"는 본 명세서에서 상호교환가능하게 사용된다. 형질전환된 숙주는 적어도 하나의 카피의 발현 제작물을 가질 것이며, 발현 카세트가 게놈 내로 통합되는지, 증폭되는지 아니면 다중 카피수를 갖는 염색체외 요소 상에 존재하는지에 따라 2개 이상을 가질 수 있다. 형질전환된 숙주 세포는 도입된 제작물에 함유되는 마커에 대한 선발에 의해 확인될 수 있다. 대안적으로, 별도의 마커 제작물은 많은 형질전환 기술에 의해 많은 DNA 분자가 숙주 세포 내로 도입됨에 따라 원하는 제작물과 함께 공동-형질전환시킬 수 있다. 전형적으로, 형질전환된 숙주는 항생제가 혼입되거나 또는 형질전환되지 않은 숙주의 성장에 필요한 인자, 예컨대 영양소 (예를 들어, 수크로스) 또는 성장 인자가 결여될 수 있는 선발 배지에서 그들이 성장하는 능력에 대하여 선발된다. 도입된 마커 유전자는 항생제 내성을 부여하거나 필수 성장 인자 또는 효소를 코딩하여, 형질전환된 숙주에서 발현되는 경우 선발 배지에서의 성장을 가능하게 할 수 있다. 또한, 형질전환된 숙주의 선발은 발현된 마커 단백질이 직접적으로 또는 간접적으로 검출될 수 있는 경우에 또한 발생할 수 있다. 추가의 선발 기술은 미국 특허 제7,238,482호, 미국 특허 제7,259,255호 및 국제특허 공개 WO 2006/052870호에 기재되어 있다.
와이. 리포라이티카에서의 통합된 DNA 단편의 안정성은 사용되는 개별 형질전환체, 수용 주 및 표적화 플랫폼에 의존적이다. 따라서, 특정 재조합 미생물 숙주의 다수의 형질전환체를 스크리닝하여, 원하는 발현 수준 및 패턴을 나타내는 주를 수득해야 한다. DNA 블롯의 서던 분석 (문헌[Southern, J. Mol. Biol., 98:503 (1975)]), mRNA 발현의 노던 분석(문헌[Kroczek, J. Chromatogr. Biomed. Appl., 618 (1-2):133-145 (1993)]), 단백질 발현의 웨스턴 분석, 표현형 분석 또는 GC 분석이 적합한 스크리닝 방법이다.
임의의 와이. 리포라이티카를 본 발명에 따른 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 적절한 폴리펩티드 서열로 형질전환시켜서, 수크로스를 탄소 공급원으로 이용할 수 있는 형질전환된 주를 생성할 수 있다. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션["ATCC"]을 통하여 획득될 수 있는 쉽게 입수가능한 와이. 리포라이티카의 예에는 예를 들어 #8661, #8662, #9773, #15586, #16617, #16618, #18942, #18943, #18944, #18945, #20114, #20177, #20182, #20225, #20226, #20228, #20327, #20255, #20287, #20297, #20315, #20320, #20324, #20336, #20341, #20346, #20348, #20363, #20364, #20372, #20373, #20383, #20390, #20400, #20460, #20461, #20462, #20496, #20510, #20628, #20688, #20774, #20775, #20776, #20777, #20778, #20779, #20780, #20781, #20794, #20795, #20875, #20241, #20422, #20423, #32338, #32339, #32340, #32341, #34342, #32343, #32935, #34017, #34018, #34088, #34922, #38295, #42281, #44601, #46025, #46026, #46027, #46028, #46067, #46068, #46069, #46070, #46330, #46482, #46483, #46484, #46436, #60594, #62385, #64042, #74234, #76598, #76861, #76862, #76982, #90716, #90811, #90812, #90813, #90814, #90903, #90904, #90905, #96028, #201241, #201242, #201243, #201244, #201245, #201246, #201247, #201249, 또는 #201847이 포함된다. 이와 유사하게, 하기의 와이. 리포라이티카 주가 헤르만 제이. 파프 이스트 컬쳐 콜렉션, 유니버시티 오브 캘리포니아 데이비스 (Herman J. Phaff Yeast Culture Collection, University of California Davis; 미국 캘리포니아주 데이비스 소재)로부터 획득될 수 있었다: 와이. 리포라이티카 49-14, 와이. 리포라이티카 49-49, 와이. 리포라이티카 50-140, 와이. 리포라이티카 50-46, 와이. 리포라이티카 50-47, 와이. 리포라이티카 51-30, 와이. 리포라이티카 60-26, 와이. 리포라이티카 70-17, 와이. 리포라이티카 70-18, 와이. 리포라이티카 70-19, 와이. 리포라이티카 70-20, 와이. 리포라이티카 74-78, 와이. 리포라이티카 74-87, 와이. 리포라이티카 74-88, 와이. 리포라이티카 74-89, 와이. 리포라이티카 76-72, 와이. 리포라이티카 76-93, 와이. 리포라이티카 77-12T 및 와이. 리포라이티카 77-17. 또는, 주들은 프랑스 소재의, INRA 센터 드 그리뇽, 쟝-마끄 니코(Jean-Marc Nicaud) 박사의 래보러뜨와 드 마이크로바이올로지 엣 제네티크 몰레쿨레어(Laboratoire de Microbiologie et
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)로부터 획득될 수 있으며, 이는 예를 들어 와이. 리포라이티카 JMY798 (문헌[
Figure pct00006
, K. et al., Appl . Environ . Microbiol., 70(7):3918-24 (2004)]), 와이. 리포라이티카 JMY399 (문헌[Barth, G., and C. Gaillardin. In, Nonconventional Yeasts In Biotechnology; Wolf, W.K., Ed.; Springer-Verlag: Berlin, Germany, 1996; pp 313-388]) 및 와이. 리포라이티카 JMY154 (문헌[Wang, H.J., et al., J. Bacteriol., 181(17):5140-8 (1999)])를 포함한다.
바람직하게는, 와이. 리포라이티카 숙주 세포는 유지성이며, 즉, 오일 합성 및 축적이 가능하고, 여기서, 전체 오일 내용물은 건조 세포 중량(dry cell weight)["DCW"]의 약 25% 초과, 더 바람직하게는 DCW의 약 30% 초과, 그리고 가장 바람직하게는 DCW의 약 40% 초과로 포함될 수 있다. 일 실시 형태에서, ATCC #20362, ATCC #8862, ATCC #18944, ATCC #76982 및/또는 LGAM S(7)1 (문헌[Papanikolaou S., and Aggelis G., Bioresour. Technol., 82(1):43-9 (2002)])로 표기되는 와이. 리포라이티카 주가 특히 적합하다.
또한 본 발명은 수크로스 인버타아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하는 형질전환된 와이. 리포라이티카에 관한 것이며 (여기서, 상기 폴리펩티드는 시그널 서열이 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 폴리펩티드 서열에 융합된 것을 포함함), 또한 여기서, 형질전환된 와이. 리포라이티카는 관심대상의 적어도 하나의 비천연 생성물을 생성할 수 있다. 관심대상의 이러한 적어도 하나의 비천연 생성물은 바람직하게는 형질전환된 와이. 리포라이티카를 탄소 공급원으로서 수크로스 (또는 그 혼합물)를 사용하여 성장시킬 때 생성된다. 와이. 리포라이티카가 이종 유전자들로 형질전환되는 순서는 중요하지 않다. 이러한 형질전환은 또한 동시적일 수 있다.
관심대상의 적합한 비천연 생성물의 예에는 예를 들어 다중불포화 지방산, 카로티노이드, 아미노산, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 유기 산, 폴리올 및 하이드록시에스테르, 퀴논-유도된 화합물 및 레스베라트롤이 포함되지만, 이것은 본 명세서에서 한정적인 것으로 의도되는 것은 아니다.
"다중불포화 지방산"(또는 "PUFA"), 특히 오메가-3 및 오메가-6 PUFA과 결부된 건강 상의 효과가 기록되어 왔다. 더 구체적으로, 본 명세서에서 PUFA는 18개 이상의 탄소 원자 및 2개 이상의 이중 결합을 갖는 지방산을 말한다. 용어 "지방산"은 약 C12 내지 C22의 다양한 쇄 길이의 장쇄 지방족 산(알칸산)을 지칭하지만, 더 긴 쇄 길이의 산과 더 짧은 쇄 길이의 산이 둘 모두 공지되어 있다. 주된 쇄 길이는 C16 내지 C22이다. 지방산의 구조는 "X:Y"의 단순한 표기 체계로 표현되며, 여기서, X는 특정 지방산에서의 전체 탄소 원자["C"]의 개수이고, Y는 이중 결합의 개수이다.
"포화 지방산" 대 "불포화 지방산", "단일불포화 지방산" 대 "다중불포화 지방산"["PUFA"] 및 "오메가-6 지방산"["n-6"] 대 "오메가-3 지방산"["n-3"] 간의 구별에 관한 추가의 상세사항은 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 제7,238,482호에 제공되어 있다. 미국 특허 공개 제2009-0093543-A1호의 표 3은 오메가-3 및 오메가-6 PUFA와 그 전구체의 화학명 및 일반명과, 일반적으로 사용되는 약어의 상세한 요약을 제공한다.
그러나, PUFA의 일부 예에는 리놀레산['LA", 18:2 ω-6], 감마-리놀렌산["GLA", 18:3 ω-6], 에이코사다이엔산["EDA", 20:2 ω-6], 다이호모-감마-리놀렌산["GLA", 20:3 ω-6], 아라키돈산["ARA", 20:4 ω-6], 도코사테트라엔산["DTA", 22:4 ω-6], 도코사펜타엔산["DPAn-6", 22:5 ω-6], 알파-리놀렌산["ALA", 18:3 ω-3], 스테아리돈산["STA", 18:4 ω-3], 에이코사트라이엔산["ETA", 20:3 ω-3], 에이코사테트라엔산["ETrA", 20:4 ω-3], 에이코사펜타엔산["EPA", 20:5 ω-3], 도코사펜타엔산["DPAn-3", 22:5 ω-3] 및 도코사헥사엔산["DHA", 22:6 ω-3]이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
PUFA 생성을 위하여 와이. 리포라이티카 주를 엔지니어링하는 쪽으로 많은 노력이 투자되었다. 예를 들어, 미국 특허 제7,238,482호에서는 효모에서의 오메가-6 및 오메가-3 지방산의 생성 가능성이 입증되었다. 미국 특허 제7,932,077호에서는 전체 지방산의 28.1%의 EPA의 재조합적 생성이 입증되었으며; 미국 특허 제7,588,931호에서는 전체 지방산의 14%의 ARA의 재조합적 생성이 입증되었으며; 미국 특허 제7,550,286호에서는 전체 지방산의 5%의 DHA의 재조합적 생성이 입증되었으며; 미국 특허 공개 제2009-0093543-A1호에는 EPA 생성용으로 최적화된 재조합 주가 기재되어 있고 전체 지방산의 최대 55.6%의 EPA의 생성이 입증되었다. 미국 특허 공개 제2010-0317072-A1호에는 TFA의 최대 50%의 EPA를 포함하고, TFA의 중량%로 측정된 리놀레산에 대한, TFA의 중량%로 측정된 EPA의 비가 3.1 이상인 미생물 오일을 생성하는 최적화된 재조합 와이. 리포라이티카 주가 추가로 기재되어 있다. 형질전환 와이. 리포라이티카는 PUFA의 생성을 위하여 데새츄라아제(즉, 델타-12 데새츄라아제, 델타-6 데새츄라아제, 델타-8 데새츄라아제, 델타-5 데새츄라아제, 델타-17 데새츄라아제, 델타-15 데새츄라아제, 델타-9 데새츄라아제, 델타-4 데새츄라아제) 및 엘롱가아제(즉, C14/16 엘롱가아제, C16/18 엘롱가아제, C18/20 엘롱가아제, C20/22 엘롱가아제 및 델타-9 엘롱가아제) 유전자의 다양한 조합을 발현한다. 그러나, 이들 방법 전부에서, 글루코스를 탄소 공급원으로 사용하여 성장시킨 유지성 효모를 사용하여 PUFA의 생성을 입증하였다.
표 3은 상기에 인용된 참고 문헌에 기재된 특정 와이. 리포라이티카 주들 중 일부에 관한 정보를 제공하며, 여기서, 상기 주는 데새츄라아제 및 엘롱가아제의 다양한 조합을 보유하지만, 특정 주 및 생성된 특정 PUFA (또는 그 양)는 결코 본 발명을 한정하지 않음을 인식하여야 한다.
Figure pct00007
Figure pct00008
또한 카로티노이드가 관심대상의 적합한 비천연 생성물로서 고려되는데, 이는 수크로스를 탄소 공급원으로 이용하여 성장시킬 때 형질전환된 와이. 리포라이티카에서 생성될 수 있다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "카로티노이드"는 공식적으로 아이소프렌으로부터 유도된 공액 폴리엔 탄소 골격을 갖는 탄화수소 부류를 말한다. 이 부류의 분자는 트라이테르펜["C30 다이아포카로티노이드"] 및 테트라테르펜["C40 카로티노이드"] 및 그의 산화된 유도체로 구성되며; 이들 분자는 전형적으로 강한 흡광 특성을 갖고, C200을 초과하는 길이의 범위일 수 있다. 다른 "카로티노이드 화합물"이 공지되어 있으며, 이는 예를 들어 길이가 C35, C50, C60, C70 및 C80 이다. 용어 "카로티노이드"는 카로틴 및 잔토필 둘 모두를 포함할 수 있다. "카로틴"은 탄화수소 카로티노이드 (예를 들어, 피토엔, β-카로틴 및 라이코펜)를 말한다. 이와는 대조적으로, 용어 "잔토필"은 하이드록시-, 메톡시-, 옥소-, 에폭시-, 카르복시- 또는 알데하이드 작용기의 형태의 하나 이상의 산소 원자를 함유하는 C40 카로티노이드를 말한다. 잔토필은 카로틴보다 극성이 더 크며, 이 특성은 유지류에서의 그의 용해도를 극적으로 감소시킨다. 따라서, 카로티노이드의 적합한 예에는 안테락산틴, 아도니루빈, 아도닉산틴, 아스탁산틴(즉, 3,3'-다이하이드록시-β,β-카로틴-4,4'-다이온), 칸탁산틴(즉, β,β-카로틴-4,4'-다이온), 캅소루브린, β-크립토잔틴, α-카로틴, β,ψ-카로틴, δ-카로틴, ε-카로틴, β-카로틴 케토-γ-카로틴, 에치네논, 3-하이드록시에치네논, 3'-하이드록시에치네논, γ-카로틴, ψ-카로틴, ζ-카로틴, 제아잔틴, 아도니루빈, 테트라하이드록시-β,β'-카로텐-4,4'-다이온, 테트라하이드록시-β,β'-카로텐-4-온, 칼로잔틴, 에리트로잔틴, 노스토잔틴, 플렉시잔틴, 3-하이드록시-γ-카로틴, 3-하이드록시-4-케토-γ-카로틴, 박테리오루비잔틴, 박테리오루비잔티날, 4-케토-γ-카로틴, α-크립토잔틴, 데옥시플렉시잔틴, 다이아토잔틴, 7,8-다이데하이드로아스타잔틴, 다이데하이드로라이코펜, 푸코잔틴, 푸코잔티놀, 아이소레니에라텐, β-아이소레니에라텐, 락투카잔틴, 루테인, 라이코펜, 믹소박톤, 네오잔틴, 뉴로스포렌, 하이드록시뉴로스포렌, 페리디닌, 피토엔, 피토플루엔, 로도핀, 로도핀 글루코시드, 4-케토-루비잔틴, 시포나잔틴, 스페로이덴, 스페로이데논, 스피릴로잔틴, 토룰렌, 4-케토-토룰렌, 3-하이드록시-4-케토-토룰렌, 우리올리드, 우리올리드 아세테이트, 비올라잔틴, 제아잔틴-β-다이글루코시드 및 그 조합이 포함된다.
야생형 와이. 리포라이티카는 보통은 카로티노이드 생성성(carotenogenic)이 아니다. 그러나, 국제특허 공개 WO 2008/073367호 및 국제특허 공개 WO 2009/126890호에는 카로티노이드 생합성 경로 유전자, 예를 들어 제라닐 제라닐 파이로포스페이트 신타아제를 코딩하는 crtE, 피토엔 신타아제를 코딩하는 crtB, 피토엔 데새츄라아제를 코딩하는 crtI, 라이코펜 사이클라아제를 코딩하는 crtY, 카로티노이드 하이드록실라아제를 코딩하는 crtZ 및/또는 카로티노이드 케톨라아제를 코딩하는 crtW의 도입을 통하여 재조합 와이. 리포라이티카에서 카로티노이드 모음을 생성하는 것이 기재되어 있다.
수크로스를 탄소 공급원으로 이용하여 성장시킬 때, 형질전환된 와이. 리포라이티카에서 생성될 수 있는 관심대상의 다른 비천연 생성물은 예를 들어 퀴닌-유도된 화합물, 스테롤 및 레스베라트롤을 포함한다. 용어 "적어도 하나의 퀴논 유도된 화합물"은 레독스-활성 퀴논 고리 구조를 갖는 화합물을 말하며, 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는 화합물을 포함한다: CoQ 시리즈의 퀴논(즉, 이것은 Q6, Q7, Q8, Q9 및 Q10임), 비타민 K 화합물, 비타민 E 화합물, 및 그 조합. 예를 들어, 용어 조효소 Q10["CoQ10""]은 2,3-다이메톡시-다이메틸-6-데카프레닐-1,4-벤조퀴논을 말하며, 이는 유비퀴논-10 (CAS 등록 번호: 303-98-0)으로도 공지되어 있다. CoQ10의 벤조퀴논 부분은 타이로신으로부터 합성되며, 반면에 아이소프렌 측쇄는 메발로네이트 경로를 통하여 아세틸-CoA로부터 합성된다. 따라서, CoQ 화합물, 예를 들어 CoQ10의 생합성은 NADPH를 필요로 한다. "비타민 K 화합물"은 예를 들어 메나퀴논 또는 필로퀴논을 포함하는 반면, 비타민 E 화합물은 예를 들어 토코페롤, 토코트라이엔올 또는 α-토코페롤을 포함한다. 용어 "레스베라트롤"은 3,4',5-트라이하이드록시스틸벤을 말한다.
미국 특허 공개 제2009/0142322-A1호 및 국제특허 공개 WO 2007/120423호에는 이종 퀴논 생합성 경로 유전자, 예를 들어 조효소 Q10의 생성을 위한 데카프레닐 다이포스페이트 신타아제를 코딩하는 ddsA , 비타민 K 화합물의 생성을 위한 MenF, MenD, MenC, MenE, MenB, MenA, UbiE, 및/또는 MenG 폴리펩티드를 코딩하는 유전자, 및 비타민 E 화합물의 생성을 위한 tyrA, pdsl(hppd), VTEl, HPT1(VTE2), VTE3, VTE4, 및/또는 GGH 폴리펩티드를 코딩하는 유전자 등의 도입을 통하여 와이. 리포라이티카에서 다양한 퀴논 유도된 화합물을 생성하는 것이 기재되어 있다. 국제특허 공개 WO 2008/130372호에는 스쿠알렌 신타아제를 코딩하는 ERG9/SQS1 및 스쿠알렌 에폭시다아제를 코딩하는 ERGl의 도입을 통하여 와이. 리포라이티카에서 스테롤을 생성하는 것이 기재되어 있다. 그리고, 미국 특허 제7,772,444호에는 레스베라트롤 신타아제를 코딩하는 유전자의 도입을 통하여 와이. 리포라이티카에서 레스베라트롤을 생성하는 것이 기재되어 있다.
형질전환된 숙주 세포는 키메라 유전자 (예를 들어, 인버타아제를 코딩함, 관심대상의 비천연 생성물의 생합성을 가능하게 하는 유전자)의 발현을 최적화하는 조건 하에서 성장시킨다. 일반적으로, 최적화될 수 있는 배지 조건은 탄소 공급원의 유형 및 양, 질소 공급원의 유형 및 양, 탄소-대-질소 비, 상이한 미네랄 이온들의 양, 산소 수준, 성장 온도, pH, 바이오매스 생성기의 길이, 오일 축적기의 길이 및 세포 수확의 시간 및 방법을 포함한다. 유지성 효모는 흔히 성장에 필요한 성분이 결여되고 이럼으로써 원하는 발현 카세트의 선발을 강요하는 최소 규정 배지 (예를 들어, 이스트 니트로겐 베이스(Yeast Nitrogen Base; 미국 미시간주 디트로이트 소재의 디프코 래보러토리즈(DIFCO Laboratories)) 또는 복합 배지 (예를 들어, 효모 추출물-펩톤-덱스트로스 브로쓰["YPD"]에서 성장시킨다.
본 발명에서 발효 배지는 발효성 탄소 공급원을 포함한다. 발효성 탄소 공급원은 예를 들어 수크로스, 전화당(invert sucrose), 글루코스, 프룩토스 및 이들의 조합일 수 있다. 본 명세서에서 전화당은 수크로스의 가수분해에서 생기는, 대략 동일한 부의 프룩토스 및 글루코스를 포함하는 혼합물을 말한다. 전화당은 25 내지 50%의 글루코스 및 25 내지 50%의 프룩토스를 포함하는 혼합물일 수 있지만, 전화당은 수크로스를 또한 포함할 수 있으며, 그 양은 가수분해도에 따라 달라진다. 전화당은 수크로스의 가수분해에 의해 수득될 수 있으며, 상기 수크로스는 다양한 공급원, 예를 들어 사탕수수 또는 사탕무로부터 수득될 수 있다. 수크로스의 글루코스 및 프룩토스로의 가수분해는 산에 의해 (예를 들어, 시트르산 또는 아스코르브산의 첨가에 의해) 또는 효소에 의해 (예를 들어, 인버타아제 또는 β-프룩토푸라노시다아제에 의해) 촉매될 수 있으며, 이는 당업계에 공지된 바와 같다.
일부 실시 형태에서, 본 명세서에 개시된 와이. 리포라이티카는 다른 당류("혼합된 당류")의 존재 하에 수크로스를 함유하는 배지에서 성장시킨다. 혼합된 당류는 수크로스에 더하여 적어도 하나의 추가의 당을 포함한다. 와이. 리포라이티카 세포의 대사를 위한 에너지 공급원을 제공할 수 있는 임의의 당, 또는 수크로스를 함유하는 혼합물에 존재하는 임의의 당이 포함될 수 있다. 그러나, 야생형 와이. 리포라이티카 세포와 같이, 본 명세서에 개시된 수크로스-이용 와이. 리포라이티카는 여전히 글루코스를 유일한 탄소 공급원으로 사용할 수 있다.
부가적으로, 발효 배지는 적합한 질소 공급원을 포함한다. 질소는 무기 (예를 들어, (NH4)2SO4) 또는 유기 (예를 들어, 우레아, 글루타메이트 또는 효모 추출물) 공급원으로부터 공급될 수 있다. 수크로스 및 질소 공급원에 더하여, 발효 배지는 또한 적합한 미네랄, 염, 보조 인자, 완충제, 비타민 및 미생물의 성장에 적합한 당업자에게 공지된 다른 성분을 함유한다.
본 발명에서 바람직한 성장 배지로는 구매가능한 완제 배지(prepared media), 예를 들어 이스트 니트로겐 베이스 (미국 미시간주 디트로이트 소재의 디프코 래보러토리즈)가 있다. 다른 규정 또는 합성 성장 배지도 사용할 수 있으며, 특정 미생물의 성장에 적절한 배지는 미생물학 또는 발효과학 분야의 당업자에게 공지되어 있을 것이다. 전형적으로, 발효에 적합한 pH 범위는 약 pH 4.0 내지 pH 8.0이며, pH 5.5 내지 pH 7.5가 초기 성장 조건의 범위로서 바람직하다. 발효는 호기성 또는 혐기성 조건 하에 행해질 수 있으며, 미세호기성(microaerobic) 조건이 바람직하다.
전형적으로, 유지성 효모 세포에서의 높은 수준의 PUFA의 축적은 2단계 발효 공정을 필요로 하며, 이는 대사 상태가 성장과 지방의 합성/저장 간에 "균형을 이루어야" 하기 때문이다. 따라서, 가장 바람직하게는, 유지성 효모에서 PUFA를 생성하기 위해 2단계 발효 공정이 이용된다. 이러한 공정은 다양한 적합한 발효 공정 디자인(즉, 배치식, 유가식(fed-batch) 및 연속식) 및 성장 동안의 고려 사항이 그러한 바와 같이, 미국 특허 제7,238,482호에 기재되어 있다.
실시예
본 발명은 하기 실시예에서 추가로 정의된다. 이들 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 나타내면서도 단지 예로써만 주어지는 것으로 이해해야 할 것이다. 상기 논의 및 이러한 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적 특징을 확인할 수 있으며, 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않는 한 본 발명을 다양하게 변경하고 수정하여 다양한 용도 및 조건에 적합하게 할 수 있다.
약어의 의미는 다음과 같다: "sec"는 초를 의미하고, "min"은 분을 의미하며, "h"는 시간을 의미하고, "d"는 일을 의미하며, "㎕"은 마이크로리터를 의미하고, "mL"은 밀리리터를 의미하며, "L"은 리터를 의미하며, "μM"은 마이크로몰을 의미하고, "mM"은 밀리몰을 의미하며, "M"은 몰을 의미하고, "mmol"은 밀리몰을 의미하며, "μmole"는 마이크로몰을 의미하고, "g"는 그램을 의미하며, "μg"는 마이크로그램을 의미하고, "ng"는 나노그램을 의미하며, "U"는 유닛을 의미하고, "bp"는 염기쌍을 의미하며, "kB"는 킬로베이스를 의미한다.
발현 카세트에 대한 명명법
발현 카세트의 구조는 "X::Y::Z"의 간단한 표기 체계에 의해 나타내며, 여기서, X는 프로모터 단편을 말하며, Y는 유전자 단편을 말하고, Z는 종결자 단편을 말하며, 이들 모두는 서로 작동가능하게 연결된다.
야로위아 리포라이티카의 형질전환 및 배양
와이. 리포라이티카 주 ATCC #20362를 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (미국 메릴랜드주 록빌 소재)로부터 구매하였다. 야로위아 리포라이티카 주를 전형적으로 하기에 나타낸 방법에 따라 몇몇 배지에서 28 내지 30℃에서 성장시켰다.
고 글루코스 배지["HGM"](리터당): 80의 글루코스, 2.58 g의 KH2PO4 및 5.36 g의 K2HPO4, pH 7.5 (조정할 필요가 없음).
고 수크로스 배지 ["HSM"] (리터당): 80의 수크로스, 2.58 g의 KH2PO4 및 5.36 g의 K2HPO4, pH 7.5 (조정할 필요가 없음).
합성 덱스트로스 배지["SD"] (리터당): 황산암모늄을 포함하고 아미노산을 포함하지 않는 6.7 g의 효모 질소 베이스; 20 g의 글루코스.
합성 수크로스 배지 ["SS"] (리터당): 황산암모늄을 포함하고 아미노산을 포함하지 않는 6.7 g의 효모 질소 베이스; 20 g의 수크로스.
발효 배지["FM"](리터당): 아미노산을 포함하지 않는 6.7 g/L의 YNB; 6 g/L의 KH2PO4; 2 g/L의 K2HPO4; 1.5 g/L의 MgSO4-7수화물; 5 g/L의 효모 추출물; 2%의 탄소 공급원 (여기서, 탄소 공급원은 글루코스 또는 수크로스 중 어느 하나임).
야로위아 리포라이티카의 형질전환을 본 명세서에 참고로 포함되는 미국 특허 공개 제2009-0093543-A1호에 기재된 바와 같이 수행하였다.
야로위아 리포라이티카의 지방산 분석
지방산["FA"] 분석을 위하여, 세포를 원심분리에 의해 수집하고, 지질을 문헌[Bligh, E. G. & Dyer, W. J. (Can . J. Biochem . Physiol., 37:911-917 (1959))]에 기재된 바와 같이 추출하였다. 지방산 메틸 에스테르["FAME"]를 소듐 메톡시드를 사용한 지질 추출물의 에스테르 교환에 의해 제조하고(문헌[Roughan, G., and Nishida I., Arch Biochem Biophys., 276(1):38-46 (1990)]), 후속적으로 30-m X 0.25 mm(내경) HP-이노왁스(INNOWAX; 휴렛-패커드(Hewlett-Packard)) 컬럼을 갖춘 휴렛-패커드 6890 GC로 분석하였다. 오븐 온도는 3.5℃/분으로 170℃(25분 유지)로부터 185℃까지였다.
직접적인 염기 에스테르 교환을 위하여, 야로위아 세포(0.5 mL 배양물)를 수확하고, 증류수에 1회 세척하고, 스피드-백(Speed-Vac)에서 5 내지 10분 동안 진공 하에 건조시켰다. 소듐 메톡시드(1%의 100 μl) 및 공지된 양의 C15:0 트라이아실글리세롤(C15:0 TAG; 카탈로그 번호 T-145, 누-체크 프렙(Nu-Check Prep), 미국 미네소타주 엘라이시안 소재)을 샘플에 첨가하고, 그 후 샘플을 50℃에서 30분 동안 와동시키고 흔들었다. 3 드롭의 1 M NaCl 및 400 μl의 헥산의 첨가 후, 샘플을 와동시키고 스핀시켰다. 상층을 제거하고, GC로 분석하였다.
대안적으로, 문헌[Lipid Analysis, William W. Christie, 2003]에 기재된 염기-촉매작용된 에스테르 교환 방법의 변형법을 발효 또는 플라스크 샘플 중 어느 하나로부터의 브로쓰(broth) 샘플의 통상적인 분석을 위해 사용하였다. 구체적으로, 브로쓰 샘플을 실온의 물에서 빠르게 해동시킨 다음, 0.22 μm 코닝(Corning)(등록 상표) 코스타(Costar)(등록 상표) 스핀(Spin)-X(등록 상표) 원심분리용 튜브 필터(카탈로그 번호 8161)를 갖춘 타르를 칠한 2 mL 미량 원심분리용 튜브에 칭량해 넣었다(0.1 ㎎까지). 이전에 결정된 DCW에 따라 샘플(75 - 800 μl)을 사용하였다. 에펜도르프(Eppendorf) 5430 원심분리기를 사용하여, 샘플을 14,000 rpm에서 5 내지 7분 동안 또는 브로쓰를 제거하는데 필요한 만큼 오랫동안 원심분리하였다. 필터를 제거하고, 액체를 빼내고, 약 500 μl의 탈이온수를 필터에 첨가하여 샘플을 세척하였다. 물을 제거하기 위한 원심분리 후에, 필터를 다시 제거하고, 액체를 빼내고, 필터를 다시 삽입하였다. 그 다음, 튜브를 원심분리기에 다시 삽입하고, 이번에는 상측을 개방하여 약 3 내지 5분 동안 건조시켰다. 이어서, 필터를 튜브의 대략 절반에서 절단하고, 새로운 2 mL 둥근 바닥 에펜도르프 튜브(카탈로그 번호 22 36 335-2)에 삽입하였다.
필터를 오직 절단된 필터 용기의 가장자리와 접촉하며 샘플 또는 필터 물질과는 접촉하지 않는 적절한 도구를 사용하여 튜브의 바닥으로 프레스하였다. 톨루엔 중의 공지되어 있는 양의 C15:0 TAG(상기)를 첨가하고, 새로 제조한, 메탄올 중 1% 소듐 메톡시드의 용액 500 μl를 첨가하였다. 샘플 펠렛을 적절한 도구를 사용하여 철저히 부수고, 튜브를 닫고, 30분 동안 50℃ 히트 블록(heat block)(VWR 카탈로그 번호 12621-088) 내에 넣었다. 이어서, 튜브를 5분 이상 동안 냉각시켰다. 이어서, 헥산 400 μl 및 물 중의 1 M NaCl 용액 500 μl를 첨가하고, 튜브를 6초 동안 2회 와동시키고, 1분 동안 원심분리하였다. 대략 150 μl의 상부(유기)층을 인서트(insert)가 있는 GC 바이얼에 두고, GC로 분석하였다.
GC 분석을 통해 기록된 FAME 피크를 공지되어 있는 지방산의 피크와 비교시 그들의 체류 시간에 의해 확인하고, FAME 피크 면적을 공지되어 있는 양의 내부 표준물질(C15:0 TAG)의 피크 면적과 비교함으로써 정량화하였다. 따라서, 임의의 지방산 FAME의 근사량(㎍)["FAME ㎍"]은 식: (특정 지방산의 FAME 피크의 면적/표준물질 FAME 피크의 면적) * (표준물질 C15:0 TAG의 ㎍)에 따라 계산하는 반면, 임의의 지방산의 양(㎍)["FA ㎍"]은 식: (특정 지방산의 FAME 피크의 면적/표준물질 FAME 피크의 면적) * (표준물질 C15:0 TAG의 ㎍) * 0.9503에 따라 계산하는데, 이는 1 ㎍의 C15:0 TAG가 0.9503 ㎍의 지방산과 같기 때문이다. 0.9503의 변환 인자가 0.95 내지 0.96 범위인 대부분의 지방산에 대하여 결정된 값의 근사치임을 주목하라.
TFA의 wt%로서 각각의 개별 지방산의 양을 요약하는 지질 프로파일을 개별 FAME 피크 면적을 모든 FAME 피크 면적의 합으로 나누고 이에 100을 곱함으로써 결정하였다.
플라스크 분석법에 의한 야로위아 리포라이티카에서의 전체 지질 함량 및 조성의 분석
와이. 리포라이티카의 특정 주에서의 전체 지질 함량 및 조성의 상세한 분석을 위하여, 플라스크 분석법을 하기와 같이 행하였다. 구체적으로, 하나의 루프의 새로 스트리킹한 세포를 3 mL FM 배지에 접종하고, 250 rpm 및 30℃에서 하룻밤 성장시켰다. OD600 nm를 측정하고, 세포의 분취물을 125 mL 플라스크에서 25 mL FM 배지 중에 최종 0.3의 OD600 nm로 첨가하였다. 250 rpm 및 30℃의 진탕 인큐베이터에서 2일 후에, 6 mL의 배양물을 원심분리에 의해 수확하고, 125 mL 플라스크에서 25 mL HGM에 재현탁시켰다. 250 rpm 및 30℃의 진탕 인큐베이터에서 5일 후에, 1 mL 분취물을 지방산 분석(상기)을 위해 사용하고, 건조 세포 중량["DCW"] 결정을 위하여 10 mL을 건조시켰다.
DCW 결정을 위하여, 10 mL 배양물을 베크만(Beckman) GS-6R 원심분리기 내의 베크만 GH-3.8 로터에서 4000 rpm에서 5분 동안 원심분리함으로써 수확하였다. 펠렛을 25 mL의 물에 재현탁시키고, 상기와 같이 다시 수확하였다. 세척된 펠렛을 20 mL의 물에 재현탁시키고, 사전-칭량된 알루미늄 팬으로 옮겼다. 세포 현탁물을 80℃에서 진공 오븐에서 하룻밤 건조시켰다. 세포의 중량을 결정하였다.
세포의 전체 지질 함량["TFA % DCW"]을 계산하고, TFA의 중량%["% TFA"]로서의 각각의 지방산의 농도 및 건조 세포 중량의 퍼센트로서의 EPA 함량["EPA % DCW"]을 표로 만든 데이터와 함께 고려하였다.
실시예 1
야로위아 리포라이티카 세포외 인버타아제 발현 플라스미드 pZSUC 의 제작 및 발현
본 실시예는 문헌[Nicaud et al., Current Genetics (16:253-260 (1989))]에 보고된 것과 유사한 방식으로, 인버타아제를 코딩하는 사카로마이세스 세레비지애 SUC2의 절두형 변이체["m-ScSuc2"]의 유전자에 XPR2 프로모터 및 시그널 서열을 융합시킨 것을 포함하는 플라스미드 pZSUC (서열 번호 22)을 제작하는 것을 설명한다.
더 구체적으로, 니코드 등은, 와이. 리포라이티카 XPR2 유전자의 프로모터 및 N-말단 아미노산 시그널 서열의 제어 하에 에스. 세레비지애 SUC2 유전자를 발현시킬 때, 와이. 리포라이티카의 주변세포질 내로 인버타아제가 분비됨을 보고하였다. 상기 문헌(제257면) 내에는, "융합은 아미노산 11에서 시작하여 인버타아제의 앞에 XPR2 유전자 유래의 23개 N-말단 아미노산을 둔다" (즉, 이에 따라 전장 인버타아제의 처음 10개 아미노산은 절두된 반면, 시그널 서열의 아미노산 11-19는 발현되는 성숙 단백질과 함께 포함되었다)는 것이 기술되어 있다. 그러나, 니코드 등의 도 1b (제255면)에 따르면, 융합 제작물은 대신에 아미노산 5에서 시작하여 시그널 서열로서 XPR2 유전자 유래의 23개 N-말단 아미노산이 인버타아제에 융합된 것을 포함하는 것으로 보인다(즉, 이에 따라 전장 인버타아제의 처음 4개 아미노산은 절두된 반면, 시그널 서열의 아미노산 5-19는 발현되는 성숙 단백질과 함께 포함되었다). 융합에 관한 명확성의 결여에도 불구하고, 니코드 등은 인버타아제의 발현이 형질전환된 와이. 리포라이티카에서 수크로스-이용(Suc +) 표현형을 부여함을 보고하였다.
XPR2::SUC2 융합 제작물을 상기 니코드 등의 것과 유사한 방식으로 만들었다 ("pZSUC"; 도 2). 먼저, 369 bp XPR 프로모터 (-369 내지 -1) + 63 bp 코딩 영역 (+1 내지 +63)을 함유하는 432 bp DNA 단편을, 야로위아 게놈 DNA를 주형으로, 그리고 올리고뉴클레오티드 YL427 및 YL428 (서열 번호 36 및 37)을 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. ClaI 부위를 디자인된 PCR 단편 (서열 번호 38)의 5' 말단에 부가하고, HindIII 부위를 3' 말단에 부가하였다. PCR 증폭은 하기를 포함하는 50 μl의 총 부피로 수행하였다: PCR 완충제 (10 mM KCl, 10 mM (NH4) 2SO4, 20 mM 트리스(Tris)-HCl (pH 8.75), 2 mM MgSO4, 0.1% 트리톤(Triton) X-100을 함유함), 100 ㎍/mL의 BSA (최종 농도), 200 μM의 각각의 데옥시리보뉴클레오티드 트라이포스페이트, 10 pmole의 각각의 프라이머, 50 ng의 와이. 리포라이티카 (ATCC #76982) 게놈 DNA 및 1 μl의 Taq DNA 폴리머라아제 (에피센터 테크놀로지즈(Epicentre Technologies)). 서모사이클러 조건을 35회 사이클의 경우 95℃, 1 min, 56℃, 30 sec, 및 72℃, 1 min, 이어서 72℃에서 10 min 동안의 최종 연장으로 설정하였다.
PCR 생성물을 퀴아젠(Qiagen) PCR 정제 키트 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 정제하고, 그 후 ClaI/HindIII로 절단하고; 절단된 생성물을 1% (w/v) 아가로스에서 겔 전기영동에 의해 분리하고, ClaI/HindIII 단편을 pZSUC (하기)의 제작에 사용하였다.
처음 10개 아미노산을 제외하고 에스. 세레비지애 SUC2 코딩 영역을 함유하는 1569 bp DNA 단편을, 에스. 세레비지애 게놈 DNA를 주형으로, 그리고 올리고뉴클레오티드 YL429 및 YL430 (서열 번호 39 및 40)을 프라이머로 사용하여 PCR에 의해 증폭시켰다. HindIII 부위를 SUC2 코딩 영역의 동일 리딩 프레임 내에서 5' 말단에 부가하고, BsiWI 부위를 SUC2 코딩 영역 (서열 번호 41)의 종결 코돈 이후에 부가하였다. 50 ng의 에스. 세레비지애의 게놈 DNA를 50 ng의 와이. 리포라이티카 (ATCC #76982) 게놈 DNA대신 사용한 것을 제외하고는, 상기에 기술한 성분들을 포함하는 50 μl의 총 부피로 PCR 증폭을 수행하였다. 서모사이클러 조건을 35회 사이클의 경우 95℃, 1 min, 56℃, 30 sec, 및 72℃, 2 min, 이어서 72℃에서 10 min 동안의 최종 연장으로 설정하였다.
PCR 생성물을 퀴아젠 PCR 정제 키트 (미국 캘리포니아주 발렌시아 소재)를 사용하여 정제하고, 그 후 HindIII/BsiWI로 절단하고; 절단된 생성물을 1% (w/v) 아가로스에서 겔 전기영동에 의해 분리하고, HindIII/BsiWI 단편을 pZSUC (하기)의 제작에 사용하였다.
따라서, 플라스미드 pZSUC2는 하기 성분을 함유한다.
Figure pct00009
그 후, 발현 플라스미드 pZSUC (서열 번호 22)로 와이. 리포라이티카 ATCC# 76982를 형질전환시켜 인버타아제 발현에 대하여 시험하였다. 형질전환체를 합성 수크로스 배지["SS"]에서 성장시켰다. 그러나, 형질전환된 와이. 리포라이티카 주는 수크로스 배지에서 성장할 수 없었다.
pZSUC 내의 XPR2::SUC2 융합 제작물에서, XPR2 코딩 서열의 처음 63 bp(즉, 프리/프로-영역)을 "시그널 서열"로 사용하였으며, SUC2 유전자에서는 처음 30개 뉴클레오티드가 결실되었다(즉, SUC2 시그널 서열의 처음 10개 아미노산을 제거함). 니코드 등에 의한 설명의 주의 깊은 연구 후, 이들이 엔지니어링된 주의 성장을 시험하기 위하여 오토클레이브된(autoclaved) 수크로스 배지를 사용하였음을 알아차렸다. 오토클레이브 공정은 일부 수크로스를 프룩토스 및 글루코스로 가수분해할 수 있었으며, 이는 와이. 리포라이티카에 의해 탄소 공급원으로 사용될 수 있었다 (데이터는 예시되어 있지 않음).
이 실시예에 제시된 데이터는, 니코드 등에 의해 기재된 바와 같이, ScSuc2의 절두형 변이체와 융합된 와이. 리포라이티카 XPR2 의 N-말단 21개 아미노산의 융합물을 발현하는 형질전환된 와이. 리포라이티카 주가 수크로스를 탄소 공급원으로 사용할 수 없음을 입증하였다. Suc2 시그널 서열의 소수성 코어는 적당한 분비 과정과 결부되며, 이의 파괴는 인버타아제의 세포내 축적에 이르게 됨이 보고되었다 (문헌[Kaiser and Botstein, Mol. Cell Biol., 6;2382-2391 (1986)]; 문헌[Perlman, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 83:5033-5037 (1986)]).
실시예 2
야로위아 리포라이티카 세포외 인버타아제 발현 플라스미드, 즉 pYRH68 , pYRH69 , pYRH70, pYRH73 및 pYRH74 의 제작
이 실시예는 인버타아제를 코딩하는 "성숙" 사카로마이세스 세레비지애 SUC2 ["m-ScSuc2"] 유전자에 융합된 XPR2 프리프로-영역 ["XPR2PP+13"] 및/또는 SUC2 시그널 서열 ["Suc2SS"]의 다양한 상이한 조합들을 포함하는 일련의 플라스미드의 제작을 설명한다. 각각의 제작물 내의 이종 유전자는 강한 와이. 리포라이티카 프로모터 (FBAINm; 미국 특허 제7,202,356호) 및 와이. 리포라이티카 Pex20 종결 서열이 측면에 존재하였다.
SucSS /m- ScSUC2 를 포함하는 pYRH68 의 제작
플라스미드 pYRH68은 Suc2 시그널 서열 ("SucSS"; 서열 번호 8)이 인버타아제를 코딩하는 "성숙" ScSUC2 유전자 ("m-ScSUC2"; 서열 번호 4)에 융합된 것을 과다발현하도록 제작하였다. 그러나, 실질적으로, SucSS/m-ScSUC2로 본 명세서에 기재된 이 인공 융합물은 5'-시그널 서열을 천연적으로 함유하는 야생형 전장 ScSUC2 유전자와 부합한다.
ScSUC2 ORF를 코딩하는 1.6 kB 단편을 프라이머 Sc.SUC2-5' (서열 번호 23) 및 Sc.SUC2-3' (서열 번호 24)를 사용하여 에스. 세레비지애 BY4743 (미국 앨라배마주 헌츠빌 소재의 오픈 바이오시스템즈(Open Biosystems))의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 이들 프라이머는 아미노산 위치 2에 PciI 제한 효소 부위를 도입하도록 디자인하였다 (이럼으로써 야생형 Leu2 잔기를 Phe2로 변경하여 Suc2의 분비 과정에 영향을 주지 않고서 시그널 서열의 소수성을 유지함; 문헌[Kaiser, et al., Science, 235:312-317 (1987)]). 반응 혼합물은 1 μl의 게놈 DNA, 1 μl의 각각의 프라이머, 2 μl의 물 및 45 μl의 AccuPrime™ Pfx 수퍼믹스(SuperMix; 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로겐(Invitrogen))를 함유하였다. 증폭을 하기와 같이 수행하였다: 94℃에서 5 min 동안 초기 변성, 이어서 94℃에서 15 sec 동안 변성, 55℃에서 30 sec 동안 어닐링 및 68℃에서 2 min 동안 신장의 35회 사이클. 68℃에서 7 min 동안 최종 신장 사이클을 수행하고, 4℃에서 반응을 종료하였다. 그 후, ScSUC2 ORF를 PciII/NotI 제한 효소로 절단하고, 이를 이용하여 플라스미드 pYRH68 (도 3a; 서열 번호 13)를 생성하였으며, 이는 하기 성분을 함유하였다 (NcoI 및 PciI는 아이소스키조머(isoschizomer)이다):
Figure pct00010
2개의 카피의 SucSS/m-ScSUC2를 포함하는 pYRH70의 제작
플라스미드 pYRH70은 2개의 카피의 SucSS/m-ScSUC2 (서열 번호 12)를 과다발현하도록 제작하였으며, 이는 5'-시그널 서열을 천연적으로 함유하는 야생형 전장 ScSUC2 유전자의 2개의 카피와 부합한다. 플라스미드 pYRH68 (서열 번호 13)을 SalI/SwaI로 절단하여 두 번째 카피의 1.6 kB PciII/NotI ScSUC2 단편을 삽입한다. 구체적으로, 하기를 포함하는 사원(four-way) 라이게이션을 제조하였다: 1) pYRH68 벡터 골격; 2) PciII/NotI 절단된 ScSUC2 단편; 3) 플라스미드 pZKLY-PP2 (서열 번호 25; 미국 특허 공개 제2011-0244512-A1호에 기재되어 있음)로부터 잘라낸 와이. 리포라이티카 FBA 프로모터 (미국 특허 제7,202,356호)를 포함하는 533 bp SalI/NcoI-단편; 및 4) 또한 pZKLY-PP2 (서열 번호 25)로부터 잘라낸, 야로위아 Lip1 유전자 (젠뱅크 등록 번호: Z50020) 유래의 Lip1 종결자 서열을 포함하는 322 bp NotI/SwaI-단편. 이는 pYRH70 (도 3b; 서열 번호 14)의 합성으로 이어졌다.
XPR2PP +13 또는 SUC2SS 를 포함하지 않는 m- ScSUC2 를 포함하는 pYRH73 의 제작
플라스미드 pYRH73은 인버타아제를 코딩하는 "성숙" ScSUC2 유전자("m-ScSUC2"; 서열 번호 4) - 이는 Suc2 시그널 서열 ("SucSS"; 서열 번호 8)이 결여됨 - 를 과다발현하도록 제작하였다. 따라서, SucSS의 5'- 시그널 서열 (서열 번호 2의 뉴클레오티드 1 내지 57에 상응함)을, 5'-시그널 서열을 천연적으로 함유하는 야생형 전장 ScSUC2 유전자로부터 절두시켰다. 성숙 ScSUC2 유전자를 스패닝하는 1.55 kB 단편을 프라이머 Sc.SUC2-5' (서열 번호 23) 및 nSc.SUC2-3' (서열 번호 26)를 사용하여 에스. 세레비지애 BY4743의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 그 후, 이 단편을 상기에 기재한 것과 동일한 방식으로 PciII/NotI로 절단하여 와이. 리포라이티카 벡터 내로 클로닝하여 플라스미드 pYRH73 (도 4a; 서열 번호 15)을 생성하였다.
XPR2PP +13/ SucSS /m- ScSUC2 를 포함하는 pYRH69 의 제작
플라스미드 pYRH69는 XPR2 프리프로-영역 ["XPR2PP+13"; 서열 번호 10]이 SUC2 시그널 서열 ["Suc2SS"; 서열 번호 8]에 융합된 것이 인버타아제를 코딩하는 "성숙" ScSUC2 유전자("m-ScSUC2"; 서열 번호 4)에 융합된 것을 과다발현하도록 제작하였다. 그러나, 이전에 pYRH68에서 설명한 바와 같이, SucSS/m-ScSUC2로 본 명세서에 기재된 인공 융합물은 5'-시그널 서열을 천연적으로 함유하는 야생형 전장 ScSUC2 유전자와 부합한다. 따라서, 본 명세서에서 XPR2PP+13/SucSS/m-ScSUC2로 기재되고 서열 번호 16 및 17로 기술된 이 특정 제작물은 XPR2PP+13을 전장 ScSUC2 유전자에 효과적으로 융합시킨다.
상기에 논의된 바와 같이, 서열 번호 10의 XPR2PP+13 영역은 서열 번호 6의 아미노산 1-170을 코딩하도록 디자인하였으며, 이럼으로써 프리프로-영역 이후에 Xpr2의 추가의 13개 아미노산을 코딩하게 되어서 Xpr6 엔도펩티다아제가 Lys156-Arg157 절단 부위에 접근하는 것을 보장하였다.
먼저, 전장 ScSUC2 ORF를 코딩하는 1.6 kB 단편은, 상기 플라스미드 pYRH68의 제작 동안 이용한 것과 동일한 방식으로 증폭시키고 PciI/NotI로 절단하였다. 그 후, 와이. 리포라이티카 XPR2 유전자의 N-말단 170개 아미노산을 코딩하는 단편(즉, 157개 아미노산 프리프로영역 + 성숙 AEP 단백질의 N-말단 13개 아미노산을 포함함)(즉, 서열 번호 9의 서열 + NcoI 및 PciI 제한 효소에 상응하는 측면 서열)을 프라이머 Yl.XPR2-5' (서열 번호 27) 및 Yl.XPR2-3' (서열 번호 28)를 사용하여 와이. 리포라이티카 ATCC #20362의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다. 절단 후, PciI/ NcoI 절단된 513 bp XPR2PP+13 단편을 생성하였다.
PciI 및 NcoI 절단된 말단들은 양립가능하기 때문에, PciI/ NcoI 절단된 513 bp XPR2PP+13 단편 및 1.6 kB PciI/ NotI 절단된 ScSUC2 단편을 PciI/ NotI 절단된 pYRH68 골격 내로 삽입하여 pYRH69 (도 4b; 서열 번호 18)를 생성하였다. PciI/NcoI 절단된 513 bp XPR2PP+13 단편의 배향을 확인하였다. 프라이머 Yl.XPR2-5' (서열 번호 27) 및 Yl.XPR2-3' (서열 번호 28)를 이용한 pYRH69의 서열 결정에 의하면, 와이. 리포라이티카 ATCC #20362의 서열 번호 9에 기술되어 있는 XPR2PP+13 서열은 공개된 XPR2 서열 (문헌[Matoba, S. et al. , Mol. Cell Biol., 8:4904-4916 (1988)])에 대한 동일성이 100%임이 확증되었다.
XPR2PP +13/m- ScSUC2 를 포함하는 pYRH74 의 제작
플라스미드 pYRH74는 XPR2 프리프로-영역 ["XPR2PP+13"; 서열 번호 10]이 인버타아제를 코딩하는 "성숙" ScSUC2 유전자("m-ScSUC2"; 서열 번호 4)에 융합된 것을 과다발현하도록 제작하였다.
성숙 ScSUC2 유전자를 스패닝하는 1.55 kB 단편을 프라이머 Sc.SUC2-5' (서열 번호 23) 및 nSc.SUC2-3' (서열 번호 24)를 사용하여 에스. 세레비지애 BY4743의 게놈 DNA로부터 증폭시켰다.
구체적으로, 성숙 ScSUC2 유전자를 포함하는 1.55 kB PciI/NotI 단편 및 513 bp PciI/NcoI XPR2PP+13 단편을 각각 플라스미드 pYRH73 및 플라스미드 pYRH69에 대하여 상기에 설명한 바와 같이 제조하였다. 이들 단편을 함께 pYRH68 골격과 라이게이션시켜 플라스미드 pYRH74 (도 5; 서열 번호 21)를 생성하였다.
실시예 3
수크로스 또는 글루코스 중 어느 하나를 유일한 탄소 공급원으로 이용하여 성장시킨 야로위아 리포라이티카에서의 플라스미드 pYRH68 , pYRH69 , pYRH70 , pYRH73 및 pYRH74 의 형질전환 및 발현
플라스미드 pYRH68, pYRH69, pYRH70, pYRH73, 및 pYRH74는 와이. 리포라이티카 주 Y4184U (실시예 5) 및 와이. 리포라이티카 주 Z1978U (실시예 6) - 이들 둘 모두는 유의한 양의 EPA % TFA를 생성하도록 유전적으로 엔지니어링됨 - 를 형질전환시키기 위하여 AscI/ SphI로 개별적으로 절단하였다. 수크로스 또는 글루코스 중 어느 하나를 유일한 탄소 공급원으로 포함하는 다양한 배지에서 형질전환체를 성장시켰다.
구체적으로, 먼저 우라실이 결여된 SD 배지 플레이트 상에서 형질전환체를 선발하였다 (일반 방법). 다양한 Y4184U 및 Z1978U 형질전환 주를 생성하였으며, 이는 하기 표 6에 기재된 바와 같았다.
Figure pct00011
주 Y4184U+Suc2SS/m-ScSUC2 및 Y4184 (대조군)의 성장을 SD(즉, 글루코스) 및 SS(즉, 수크로스) 배지에서 비교하였다. 수크로스 가수분해를 피하기 위하여, 배지를 오토클레이브에 의한 것 대신 여과에 의해 살균하였다. 구체적으로, 세포를 0.03의 OD600으로 접종하고, 30℃에서 성장시켰다. 도 6에 예시된 바와 같이, Y4184U + Suc2SS/m-ScSUC2 주는 수크로스에서 매우 잘 성장한 반면, 대조 주 Y4184는 유일한 탄소 공급원으로서의 수크로스 상에서 성장하지 못하였다. 상기 둘 모두의 주는, 글루코스를 유일한 탄소 공급원으로 제공할 때 유사하게 성장하였다. 주 Y4184U + XPR2PP+13/Suc2SS/m-ScSUC2도 수크로스에서 성장하지 않았으며 (데이터는 예시되어 있지 않음); 2개의 상이한 시그널 서열은 서로를 간섭하고 분비 과정을 방지할 수 있다고 가정된다.
그 후, 주 Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2, Z1978U + 2_ Suc2SS/m-ScSUC2, Z1978U + m-ScSUC2, Z1978U + XPR2PP+13/Suc2SS/m-ScSUC2, Z1978 + XPR2PP+13/m-ScSUC2 및 Z1978 (대조군)의 성장을, 수크로스 또는 글루코스 중 어느 하나를 유일한 탄소 공급원으로 포함하는 FM에서 비교하였다. 수크로스 가수분해를 피하기 위하여, 배지를 오토클레이브에 의한 것 대신 여과에 의해 살균하였다. 세포를 0.03의 OD600으로 접종하고, 30℃에서 성장시켰다. 모든 주는 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스를 포함하는 FM에서 비슷하게 성장하였다 (도 7a). 유일한 탄소 공급원으로 수크로스를 포함하는 FM에서 (도 7b), 주 Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2, Z1978U + 2_Suc2SS/m-ScSUC2 및 Z1978 + XPR2PP+13/m-ScSUC2는 매우 잘 성장하였지만, 주 Z1978U + m-ScSUC2, Z1978U + XPR2PP+13/Suc2SS/m-ScSUC2 및 Z1978 (대조군)은 매우 적게 성장하였으며; 사실상, 나머지 성장은 세포가 효모 추출물을 탄소 공급원으로 사용하는 능력으로 인한 것일 수 있었다.
따라서, 둘 모두의 Suc2SS/m-ScSUC2 (서열 번호 12) 및 XPR2PP+13/m-ScSUC2 (서열 번호 20)의 과다발현은 유일한 탄소 공급원으로 수크로스를 포함하는 배지에서 성장할 수 있는 형질전환된 와이. 리포라이티카 주로 이어졌다.
실시예 4
수크로스 또는 글루코스 중 어느 하나를 유일한 탄소 공급원으로 이용하여 성장시킨 형질전환 야로위아 리포라이티카에서의 지질 함량 및 조성
이 실시예에서는 수크로스를 유일한 탄소 공급원으로 함유하는 배지에서 성장시킬 때 에스. 세레비지애 세포외 인버타아제를 과다발현하는 Z1978 주(즉, 주 Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2, Z1978U + 2_Suc2SS/m-ScSUC2 및 Z1978 + XPR2PP+13/m-ScSUC2)에서의 지질 함량 및 조성을 조사한다. 이들 주에서의 축적된 지질의 수준 및 조성은 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스에서 성장시킨 대조 주의 것과 비견되었다.
주 Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2에서의 전체 지질 함량 및 지방 조성에 대한 수크로스 이용의 영향을 평가하기 위하여, 상기 주의 이중 배양물을 HSM (유일한 탄소 공급원으로서 수크로스)에서 비견되는 유지성 조건 하에 성장시켰으며, 이는 일반 방법에서 설명한 바와 같았다. 따라서, Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2의 두 배양물 (각각 배양물 RHY243 및 RHY244로 표기함)을, HGM (유일한 탄소 공급원으로서 글루코스)에서 비견되는 유지성 조건 하에 성장시킨 대조 주 Z1978의 이중 샘플과 비교하였다. 더 구체적으로, 유지성 조건은 먼저 배양물을 25 mL의 SD 또는 SS 배지에서 30℃에서 48 h 동안 배양물을 호기적으로 성장시킴으로써 성취하였으며, 그 후 원심분리에 의해 수확하였다. 그 후, 펠렛을 25 mL의 HGM 또는 HSM에 재현탁시키고, 배양물을 250 rpm 및 30℃에서 진탕 인큐베이터에서 5일 동안 추가로 인큐베이션하였다.
주에 있어서 건조 세포 중량["DCW"], 세포의 전체 지질 함량["TFA % DCW"], TFA의 중량%로서의 각각의 지방산의 농도["% TFA"] 및 EPA 생산성(즉, 건조 세포 중량의 퍼센트로서의 EPA 함량["EPA % DCW"])을 하기 표 7에 예시하며, 이때 평균은 회색으로 하일라이트되어 있고 "Ave"로 나타내어져 있다. 지방산의 약어는 하기와 같다: 올레산 (18:1), 리놀레산 (18:2), 및 에이코사펜타엔산 ("EPA", 20:5).
Figure pct00012
표 7의 결과는 수크로스에서 성장시킨 주 Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2에 있어서의 TFA % DCW가 글루코스에서 성장시킨 주 Z1978의 것과 유사함을 나타냈다. 그러나, 수크로스가 유일한 탄소 공급원일 때 평균 EPA % DCW의 대략 10%의 감소가 관찰되었다.
주 Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2에 있어서 주의 능력의 임의의 변화가 있는지를 결정하기 위하여, 유일한 탄소 공급원으로서 글루코스 또는 수크로스 중 어느 하나에서 RHY243 (표 7)을 이중으로 성장시켰다. 표 8에는 표 7에서 사용한 것과 유사한 포맷으로, DCW, TFA % DCW, % TFA로서의 각각의 지방산의 농도, 및 EPA % DCW가 요약되어 있다.
Figure pct00013
표 8의 결과는 수크로스에서 성장시킨 주 Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2에 있어서의 TFA % DCW가 글루코스에서 상기 주를 성장시킬 때 상기 주의 지질 함량과 유사함을 나타냈다. 그러나, 수크로스가 유일한 탄소 공급원일 때 평균 EPA % DCW의 대략 10%의 감소가 관찰되었다.
또한 전체 지질 함량 및 지방산 조성은 일반 방법에서 설명한 바와 같이, 비견되는 유지성 조건 하에서 HSM (유일한 탄소 공급원으로서 수크로스)에서 성장시킬 때 Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2의 두 배양물 (즉, RHY243 및 RHY244), Z1978U + 2_Suc2SS/m-ScSUC2 (RHY248, RHY249 및 RHY250로 표기함)의 세 배양물 및 Z1978 + XPR2PP+13/m-ScSUC2의 세 배양물 (RHY257, RHY258 및 RHY259로 표기함)에서 비교하였다.) 이들 주는 HGM (유일한 탄소 공급원으로서 글루코스)에서 비견되는 유지성 조건 하에서 성장시킨 대조 주 Z1978의 이중 샘플과 비교하였다.
표 9에는 표 7에서 사용한 것과 유사한 포맷으로, DCW, TFA % DCW, % TFA로서의 각각의 지방산의 농도, 및 EPA % DCW가 요약되어 있다.
Figure pct00014
상기 결과는, 유일한 탄소 공급원으로서 수크로스에서 성장시킨 주 Z1978U + Suc2SS/m-ScSUC2, Z1978U + 2_Suc2SS/m-ScSUC2 및 Z1978 + XPR2PP+13/m-ScSUC2에 있어서 TFA % DCW 및 EPA % DCW가 글루코스에서 성장시킨 대조 주 Z1978의 TFA % DCW 및 EPA % DCW와 10% 미만만큼 다름을 나타냈다. 3개의 SUC2 엔지니어링된 주 중에서, 주 Z1978 + XPR2PP+13/m-ScSUC2가 최상의 EPA % DCW 성능을 가졌다. 모든 3가지의 SUC2 발현 주는 대조 주 Z1978보다 최대 14% 더 높은 최종 DCW (g/L)를 일관되게 나타냈다. 따라서, EPA 부피 생산성은 대조 주 Z1978과 엔지니어링된 수크로스-이용 주 사이에서 유사하다.
실시예 5
고 EPA 생성을 위한 야로위아 리포라이티카 주 Y4184 및 Y4184U 의 생성
와이. 리포라이티카 주 Y4184U를 상기 실시예 3에서 숙주로 사용하였다. 주 Y4184U는 와이. 리포라이티카 ATCC #20362로부터 유래되었으며, 이는 델타-9 엘롱가아제/델타-8 데새츄라아제 경로의 발현을 통하여 전체 지질에 비하여 높은 EPA를 생성할 수 있다. 상기 주는 Ura- 표현형을 가지며, 그 제작은 본 명세서에 참고로 포함된 국제특허 공개 WO 2008/073367호의 실시예 7에 기재되어 있다.
주 Y4184U의 개발은 주 Y2224, Y4001, Y4001U, Y4036, Y4036U, Y4069, Y4084, Y4084U1, Y4127 (기탁 번호 ATCC PTA-8802로, 2007년 11월 29일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁됨), Y4127U2, Y4158, Y4158U1 및 Y4184의 제작을 필요로 하였다.
야생형 와이. 리포라이티카 ATCC #20362에 대한 주 Y4184 (전체 지질의 30.7%의 EPA를 생성함)의 최종 유전형은 unknown 1-, unknown 2-, unknown 4-, unknown 5-, unknown 6-, unknown 7-, YAT1::ME3S::Pex16, EXP1::ME3S::Pex20 (2개의 카피), GPAT::EgD9e::Lip2, FBAINm::EgD9eS::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, FBA::EgD9eS::Pex20, YAT1::EgD9eS::Lip2, GPD::EgD9eS::Lip2, GPDIN::EgD8M::Lip1, YAT1::EgD8M::Aco, EXP1::EgD8M::Pex16, FBAINm::EgD8M::Pex20, FBAIN::EgD8M::Lip1 (2개의 카피), GPM/FBAIN::FmD12S::Oct, EXP1::FmD12S::Aco, YAT1::FmD12::Oct, GPD::FmD12::Pex20, EXP1::EgD5S::Pex20, YAT1::EgD5S::Aco, YAT1::Rd5S::Oct, FBAIN::EgD5::Aco, FBAINm::PaD17::Aco, EXP1::PaD17::Pex16, YAT1::PaD17S::Lip1, YAT1::YlCPT1::Aco, GPD::YlCPT1::Aco였다.
상기 약어는 하기와 같다: ME3S는 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)로부터 유래된, 코돈-최적화된 C16 /18 엘롱가아제 유전자이고[미국 특허 제7,470,532호]; EgD9e는 유글레나 그라실리스(Euglena gracilis) 델타-9 엘롱가아제 유전자이고[미국 특허 제7,645,604호]; EgD9eS는 유글레나 그라실리스로부터 유래된, 코돈-최적화된 델타-9 엘롱가아제 유전자이고[미국 특허 제7,645,604호]; EgD8M은 유글레나 그라실리스[미국 특허 제7,256,033]로부터 유래된, 합성 돌연변이 델타-8 데새츄라아제이고 [미국 특허 제7,709,239호]; FmD12는 푸사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme) 델타-12 데새츄라아제 유전자이고[미국 특허 제7,504,259호]; FmD12S는 푸사리움 모닐리포르메로부터 유래된 코돈-최적화된 델타-12 데새츄라아제 유전자이고[미국 특허 제7,504,259호]; EgD5는 유글레나 그라실리스 델타-5 데새츄라아제이고[미국 특허 제7,678,560호]; EgD5S는 유글레나 그라실리스로부터 유래된, 코돈-최적화된 델타-5 데새츄라아제 유전자이고 [미국 특허 제7,678,560호]; RD5S는 페리디늄(Peridinium) sp. CCMP626으로부터 유래된, 코돈-최적화된 델타-5 데새츄라아제이고 [미국 특허 제7,695,950호]; PaD17은 피티움 아파니더마툼(Pythium aphanidermatum) 델타-17 데새츄라아제이고 [미국 특허 제7,556,949호]; PaD17S는 피티움 아파니더마툼으로부터 유래된 코돈-최적화된 델타-17 데새츄라아제이고[미국 특허 제7,556,949호] YlCPT1은 야로위아 리폴리티카 다이아실글리세롤 콜린포스포트랜스퍼라아제 유전자이다[미국 특허 제7,932,077호].
마지막으로, 주 Y4184에서 Ura3 유전자를 파괴하기 위하여, 제작물 pZKUE3S (국제특허 공개 WO 2008/073367호, 그 안의 서열 번호 78)를 사용하여 EXP1::ME3S::Pex20 키메라 유전자를 주 Y4184의 Ura3 유전자내로 통합시켜 각각 주 Y4184U1 (전체 지질의 11.2%의 EPA), Y4184U2 (전체 지질의 10.6%의 EPA) 및 Y4184U4 (전체 지질의 15.5%의 EPA) (총괄적으로, Y4184U)를 생성하였다.
국제특허 공개 WO 2008/073367호에는 다른 성장 조건으로 인하여 Y4184U (평균 12.4%)에 대하여 Y4184에서 정량화된 EPA % TFA (30.7%)에 있어서의 차이가 기재되어 있음이 주목된다.
실시예 6
고 EPA 생성을 위한 야로위아 리포라이티카 주 Z1978 및 Z1978U의 생성
와이. 리포라이티카 주 Z1978U를 상기 실시예 3에서 숙주로 사용하였다. 주 Z1978U는 와이. 리포라이티카 ATCC #20362로부터 유래되었으며, 이는 델타-9 엘롱가아제/델타-8 데새츄라아제 경로의 발현을 통하여 전체 지질에 비하여 높은 EPA를 생성할 수 있다. 상기 주는 Ura- 표현형을 가지며, 그 제작은 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 출원 제13/218,708호 (이.아이. 듀폰 디 네모아 앤드 컴퍼니, 인크.(E.I. duPont de Nemours & Co., Inc.), 대리인 문서 번호: CL5411USNA, 2011년 8월 26일자로 출원됨)의 실시예 2에 기재되어 있다.
주 Z1978U의 개발은 주 Y2224, Y4001, Y4001U, Y4036, Y4036U, L135, L135U9, Y8002, Y8006, Y8006U, Y8069, Y8069U, Y8154, Y8154U, Y8269, Y8269U, Y8412 (기탁 번호 ATCC PTA-10026으로 2009년 5월 14일자로 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 기탁됨) Y8412U, Y8647, Y8467U, Y9028, Y9028U, Y9502, Y9502U 및 Z1978의 제작을 필요로 하였다.
야로위아 리포라이티카 주 Y9502 의 유전형
주 Y9502의 생성은 미국 특허 공개 제2010-0317072-A1호에 기재되어 있다. 와이. 리포라이티카 ATCC #20362로부터 유래된 주 Y9502는 델타-9 엘롱가아제/델타-8 데새츄라아제 경로의 발현을 통하여 전체 지질과 비교하여 약 57.0%의 EPA를 생성할 수 있었다.
야생형 와이. 리포라이티카 ATCC #20362에 대한 주 Y9502의 최종 유전형은 Ura+, Pex3-, unknown 1-, unknown 2-, unknown 3-, unknown 4-, unknown 5-, unknown6-, unknown 7-, unknown 8-, unknown9-, unknown 10-, YAT1::ME3S::Pex16, GPD::ME3S::Pex20, YAT1::ME3S::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, GPAT::EgD9e::Lip2, YAT1::EgD9eS::Lip2, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1::EgD8M::Pex16, FBAIN::EgD8M::Lip1, GPD::EaD8S::Pex16 (2개의 카피), YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1, YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco, FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::Oct, EXP1::FmD12S::Aco, GPDIN::FmD12::Pex16, EXP1::EgD5M::Pex16, FBAIN::EgD5SM::Pex20, GPDIN::EgD5SM::Aco, GPM::EgD5SM::Oct, EXP1::EgD5SM::Lip1, YAT1::EaD5SM::Oct, FBAINm::PaD17::Aco, EXP1::PaD17::Pex16, YAT1::PaD17S::Lip1, YAT1::YlCPT1::Aco, YAT1::MCS::Lip1, FBA::MCS::Lip1, YAT1::MaLPAAT1S::Pex16이었다.
상기에서 사용한 그리고 실시예 5에 기술되어 있지 않은 약어는 하기와 같다: EaD8S는 유글레나 아나바에나(Euglena anabaena) 유래의 코돈-최적화된 델타-8 데새츄라아제 유전자이고[미국 특허 제7,790,156호]; E389D9eS/EgD8M은 유트렙티엘라Eutreptiella sp. CCMP389로부터 유래된 코돈-최적화된 델타-9 엘롱가아제 유전자("E389D9eS")(미국 특허 제7,645,604호)를 델타-8 데새츄라아제 "EgD8M" (상기) [미국 특허 공개 제2008-0254191-A1호]에 연결함으로써 생성되는 DGLA 신타아제이고; EgD9eS/EgD8M은 델타-9 엘롱가아제 "EgD9eS" (상기)를 델타-8 데새츄라아제 "EgD8M" (상기) [미국특허 공개 제2008-0254191-A1호]에 연결함으로써 생성되는 DGLA 신타아제이고; EaD9eS/EgD8M은 이. 아나바에나로부터 유래된 코돈-최적화된 델타-9 엘롱가아제 유전자 ("EaD9eS") [미국 특허 제7,794,701호]를 델타-8 데새츄라아제 "EgD8M" (상기) [미국 특허 공개 제2008-0254191-A1호]에 연결함으로써 생성되는 DGLA 신타아제이고; EgD5M 및 EgD5SM은 유글레나 그라실리스 [미국 특허 제7,678,560호]로부터 유래된, 돌연변이 HPG 모티프를 포함하는 합성 돌연변이 델타-5 데새츄라아제 유전자이고 [미국 특허 공개 제2010-0075386-A1호]; EaD5SM은 이. 아나바에나 [미국 특허 제7,943,365호]로부터 유래된, 돌연변이 HaGG 모티프를 포함하는 합성 돌연변이 델타-5 데새츄라아제 유전자이고 [미국 특허 공개 제2010-0075386-A1호]; MCS는 리조비움 레구미노사룸(Rhizobium leguminosarum) 생물변이형 비시애(bv. viciae) 3841로부터 유래된 코돈-최적화된 말로닐-CoA 신타아제 유전자이고 [미국 특허 공개 제2010-0159558-A1호]; MaLPAAT1S는 모르티에렐라 알피나(Mortierella alpina)로부터 유래된 코돈-최적화된 라이소포스파티드산 아실트랜스퍼라아제 유전자이다[미국 특허 제7,879,591호].
주 Y9502 내의 전체 지질 함량 및 조성의 상세한 분석을 위하여, 세포를 총 7일 동안 2단계로 성장시키는 플라스크 분석법을 행하였다. 분석에 기초하여, 주 Y9502는 3.8 g/L DCW, 37.1 TFA % DCW, 21.3 EPA % DCW를 생성하였으며, 지질 프로파일은 하기와 같았고, 여기서, 각 지방산의 농도는 TFA의 중량 백분율["% TFA"]로서의 것이다: 16:0(팔미테이트)-2.5, 16:1(팔미톨레산)-0.5, 18:0(스테아르산)-2.9, 18:1(올레산)-5.0, 18:2(LA)-12.7, ALA-0.9, EDA-3.5, DGLA-3.3, ARA-0.8, ETrA-0.7, ETA-2.4, EPA-57.0, 기타-7.5.
야로위아 리포라이티카 주 Z1978의 생성
주 Y9502로부터의 주 Z1978의 개발은 처음에 미국 가특허 출원 제61/377248호 (미국 특허 출원 제13/218,591호에 상응함) 및 미국 가특허 출원 제61/428,277호 (미국 특허 출원 제13/218,673호에 상응함)에 기재되었으며, 이는 본 명세서에 참고로 포함되었다.
구체적으로, 주 Y9502에서의 Ura3 유전자의 파괴를 위하여, SalI/PacI-절단된 제작물 pZKUM (미국 특허 공개 제2009-0093543-A1호, 그 안의 표 15, 서열 번호 133 및 도 8a 참조)을 사용하여 Ura3 돌연변이 유전자를 주 Y9502의 Ura3 유전자 내로 통합시켰으며, 이는 일반 방법에 따른 것이었다. 총 27개의 돌연변이체(8개의 형질전환체를 포함하는 제1군, 8개의 형질전환체를 포함하는 제2군 및 11개의 형질전환체를 포함하는 제3군으로부터 선택되는)를 최소 배지 + 5-플루오로오로트산["MM + 5-FOA"] 선발 플레이트에서 성장시키고, 30℃에서 2 내지 5일 동안 유지시켰다. MM+ 5-FOA는 (리터당) 하기를 포함한다: 20 g의 글루코스, 6.7 g의 효모 질소 베이스, 75 ㎎의 우라실, 75 ㎎의 우리딘 및 100 ㎎/L 내지 1000 ㎎/L의 농도 범위에 대하여 시험한 FOA 활성을 기준으로 하여 (이는, 공급자로부터 수령한 각각의 배치 내에서 변동이 일어나기 때문임) 적당량의 FOA (미국 캘리포니아주 오렌지 소재의 자이모 리서치 코포레이션(Zymo Research Corp.)).
추가의 실험에 의해, 오직 제3 형질전환체 군만이 실제 Ura- 표현형을 갖는 것으로 결정되었다.
Ura- 세포를 MM + 5-FOA 플레이트로부터 긁어내고, 일반 방법에 따라 지방산 분석을 가하였다. 이러한 방식으로, GC 분석에 의해, 각각 군 3의 MM + 5-FOA 플레이트 상에서 성장시킨 pZKUM-형질전환체 #1, #3, #6, #7, #8, #10 및 #11에서 TFA 중 28.5%, 28.5%, 27.4%, 28.6%, 29.2%, 30.3% 및 29.6%의 EPA가 있는 것으로 나타났다. 이들 7개의 주를 각각 주 Y9502U12, Y9502U14, Y9502U17, Y9502U18, Y9502U19, Y9502U21 및 Y9502U22 (총괄적으로, Y9502U)로 명명하였다.
이어서, 하나의 델타-9 데새츄라아제 유전자, 하나의 콜린-포스페이트 시티딜릴-트랜스퍼라아제 유전자 및 하나의 델타-9 엘롱가아제 돌연변이 유전자가 주 Y9502U의 야로위아 YALI0F32131p 유전자좌(젠뱅크 등록 번호: XM_506121) 내로 통합되도록 제작물 pZKL3-9DP9N(도 9; 서열 번호 29)을 생성하였다. 따라서, pZKL3-9DP9N 플라스미드는 하기의 성분을 포함하였다:
Figure pct00015
pZKL3-9DP9N 플라스미드를 AscI/SphI로 절단한 다음, 주 Y9502U17의 형질전환을 위해 사용하였다. 형질전환된 세포를 최소 배지["MM"] 플레이트 상에 도말하고, 30℃에서 3 내지 4일 동안 유지시켰다. MM 플레이트는 (리터당) 20 g의 글루코스, 아미노산을 포함하지 않는 1.7 g의 효모 질소 베이스, 1.0 g의 프롤린 및 pH 6.1 (조정할 필요가 없음)을 포함하였다. 단일의 콜로니를 MM 플레이트 상으로 다시 스트리킹한 다음, 30℃에서 액체 MM 내에 접종하고, 250 rpm/분으로 2일 동안 진탕시켰다. 세포를 원심분리에 의해 수집하고, HGM에 재현탁시킨 다음, 250 rpm/분에서 5일 동안 진탕시켰다. 세포는 상기 지방산 분석을 가하였다.
GC 분석에 의해, pZKL3-9DP9N을 갖는 선발된 96개의 Y9502U17 주의 대부분이 TFA 중 50 내지 56% EPA를 생성하는 것으로 나타났다. TFA 중 약 59.0%, 56.6%, 58.9%, 56.5% 및 57.6% EPA를 생성하였던 5개의 주(즉, #31, #32, #35, #70 및 #80)를 각각 주 Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 및 Z1981로 명명하였다.
야생형 와이. 리포라이티카 ATCC #20362에 대한 이들 pZKL3-9DP9N 형질전환 주의 최종 유전형은 Ura +, Pex3 -, unknown 1-, unknown 2-, unknown 3-, unknown 4-, unknown 5-, unknown6 -, unknown 7-, unknown 8-, unknown9-, unknown 10-, unknown 11-, YAT1::ME3S::Pex16, GPD::ME3S::Pex20, YAT1::ME3S::Lip1, FBAINm::EgD9eS::Lip2, EXP1::EgD9eS::Lip1, GPAT::EgD9e::Lip2, YAT1::EgD9eS::Lip2, YAT1::EgD9eS-L35G::Pex20, FBAINm::EgD8M::Pex20, EXP1::EgD8M::Pex16, FBAIN::EgD8M::Lip1, GPD::EaD8S::Pex16 (2개의 카피), YAT1::E389D9eS/EgD8M::Lip1, YAT1::EgD9eS/EgD8M::Aco, FBAINm::EaD9eS/EaD8S::Lip2, GPDIN::YlD9::Lip1, GPD::FmD12::Pex20, YAT1::FmD12::Oct, EXP1::FmD12S::Aco, GPDIN::FmD12::Pex16, EXP1::EgD5M::Pex16, FBAIN::EgD5SM::Pex20, GPDIN::EgD5SM::Aco, GPM::EgD5SM::Oct, EXP1::EgD5SM::Lip1, YAT1::EaD5SM::Oct, FBAINm::PaD17::Aco, EXP1::PaD17::Pex16, YAT1::PaD17S::Lip1, YAT1::YlCPT1::Aco, YAT1::MCS::Lip1, FBA::MCS::Lip1, YAT1::MaLPAAT1S::Pex16, EXP1::YlPCT::Pex16이었다.
주 Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 및 Z1981에서의 YALI0F32131p 유전자좌(젠뱅크 등록 번호: XM_50612)의 넉아웃(Knockout)은 pZKL3-9DP9N을 이용한 형질전환에 의해 생성되는 이들 임의의 EPA 주에서 확인되지 않았다.
주 Z1977, Z1978, Z1979, Z1980 및 Z1981의 YPD 플레이트로부터의 세포를 성장시키고, 전체 지질 함량 및 조성에 대하여 분석하였다. 구체적으로, 플라스크 분석법을 일반 방법에 기재된 바와 같이 행하였다. 하기 표 11에는 이들 주 각각에서의 전체 지질 함량 및 조성이 요약되어 있다(즉, 총 DCW, TFA % DCW, TFA의 중량%로서의 각각의 지방산의 농도["% TFA"] 및 EPA % DCW). 지방산은 16:0(팔미테이트), 16:1(팔미톨레산), 18:0(스테아르산), 18:1(올레산), 18:2(리놀레산), ALA(알파-리놀렌산), EDA(에이코사다이엔산), DGLA(다이호모-감마-리놀렌산), ARA(아라키돈산), ETrA(에이코사트라이엔산), ETA(에이코사테트라엔산), EPA(에이코사펜타엔산) 등이 있다.
Figure pct00016
주 Z1978을 이후에 부분 게놈 서열 결정을 하였다. 미국 특허 출원 제13/218,673호에 기재된 바와 같이, 이 연구에 의하면, 야로위아 게놈 내로 통합된 6개의 델타-5 데새츄라아제 유전자(즉, 키메라 유전자 EXP1::EgD5M::Pex16, FBAIN::EgD5SM::Pex20, GPDIN::EgD5SM::Aco, GPM::EgD5SM::Oct, EXP1::EgD5SM::Lip1, YAT1::EaD5SM::Oct) 대신에, 엔지니어링된 주는 실제로 단지 4개의 델타-5 데새츄라아제 유전자(즉, EXP1::EgD5M::Pex16, FBAIN::EgD5SM::Pex20, EXP1::EgD5SM::Lip1, 및 YAT1::EaD5SM::Oct)를 보유함이 결정되었다.
주 Z1978에서 Ura3 유전자를 파괴하기 위하여, 주 Y9502 (상기)의 pZKUM 형질전환에 대하여 설명한 것과 유사한 방식으로 제작물 pZKUM (미국 특허 공개 제2009-0093543-A1호, 그 안의 표 15, 서열 번호 133 및 도 8a 참조)을 사용하여 Ura3 돌연변이 유전자를 주 Z1978의 Ura3 유전자 내로 통합시켰다. 총 16개 형질전환체(8개의 형질전환체를 포함하는 제1 "B" 군 및 8개의 형질전환체를 포함하는 제2 "C" 군으로부터 선택)를 성장시켰으며, 이는 Ura- 표현형을 갖는 것으로 확인되었다.
GC 분석에 의해, MM + 5-FOA 플레이트 상에서 성장시킨, B 군 pZKUM-형질전환 주 #1, #2, #3 및 #4 각각에서 TFA의 30.8%, 31%, 30.9% 및 31.3%의 EPA의 존재가 나타났다. 이들 4개의 주를 각각 주 Z1978BU1, Z1978BU2, Z1978BU3 및 Z1978BU4로 명명하였다.
GC 분석에 의해, MM + 5-FOA 플레이트 상에서 성장시킨, C 군 pZKUM-형질전환 주 #1, #2, #5 및 #6 각각에서 TFA의 34.4%, 31.9%, 31.2% 및 31%의 EPA의 존재가 나타났다. 이들 4개의 주를 각각 주 Z1978CU1, Z1978CU2, Z1978CU3 및 Z1978CU4로 명명하였다.
주 Z1978BU1, Z1978BU2, Z1978BU3, Z1978BU4, Z1978CU1, Z1978CU2, Z1978CU3 및 Z1978CU4 주를 총괄적으로 주 Z1978U로 명명하였다.
실시예 7
야로위아 리포라이티카 형질전환체에서의 분비된 인버타아제의 국재화
플라스미드 pYRH68 (서열 번호 13, Suc2SS/m-ScSUC2 융합물을 포함함), pYRH73 (서열 번호 15, 단지 m-ScSUC2를 포함함), pYRH69 (서열 번호 18, XPR2PP+13/Suc2SS/
m-ScSUC2 융합물을 포함함) 및/또는 pYRH74 (서열 번호 21, XPR2PP+13/m-ScSUC2 융합물을 포함함)를, 와이. 리포라이티카 주 Y2224U (야생형 야로위아 주 ATCC #20362의 Ura3 유전자의 자율 돌연변이에 의한 5-플루오로오로트산["FOA"] 내성 돌연변이체) 또는 와이. 리포라이티카 주 Z1978U (실시예 6) 중 어느 하나의 형질전환을 위하여 BsiWI/ PacI로 개별적으로 절단하였다. 인버타아제 활성을 형질전환체의 전세포에서 그리고 그 배양 배지로부터 측정하였다.
인버타아제 활성 분석
생체내 인버타아제 활성은 문헌[Silveira, et al. (Anal . Biochem ., 238:26-28 (1996)])에 기재된 것을 약간 변경하여 전세포를 사용하여 측정하였다. 간략하게는, 40 ㎎ (건조 세포 중량)의 대수기 성장 세포 (1.4-1.8의 OD600) - SD 또는 SS 배지 중 - 를 4℃의 원심분리에 의해 수집하고, 냉 아세트산나트륨 완충제 (50 mM, pH 5.0)에서 3회 세척하였다. 세포를 교반하면서 30℃에서 15 min 동안 8 mL의 100 mM NaF에서 인큐베이션하였다. 50 mM 아세트산나트륨 완충제 - pH 5.0 - 중 300 mM 수크로스 용액 4 mL의 첨가 후, 최대 10 min의 상이한 시간 간격으로, 나노셉(Nanosep) MF 0.2μ (미국 뉴욕주 포트 워싱턴 소재의 폴 라이프 사이언시즈(Pall Life Sciences))를 사용한 여과 후 글루코스 분석기 (와이에스아이 라이프 사이언시즈(YSI Life Sciences))를 이용하여 측정하였다. 1 단위(U)의 효소 활성은 분당 생성되는 글루코스의 μmol로 정의하였으며, 수율을 계산하여 DCW의 그램당 인버타아제 활성의 단위를 제공하였다.
배양 배지로부터의 인버타아제 활성을 1.5 mL의 여과된 매질로부터 측정하였다. 샘플 중 임의의 잔류 당을 제거하기 위하여, 샘플을 0.1 M 아세트산염 완충제 (pH 5.0)에 대하여 4℃에서 하룻밤 투석시켰다. 투석시킨 샘플 (200 μl)을, 50 mM 아세트산나트륨 완충제 - pH 5.0 - 중 300 mM 수크로스 용액 100 μl를 이용하여 최대 30 min 동안 인큐베이션하였다. 50 μl의 1.0 M K2HPO4를 첨가하고, 즉각적으로 95℃ 히트 블록 내에 10 min 동안 둠으로써 반응을 중지시켰다. 인버타아제 활성을 글루코스 분석기 (와이에스아이 라이프 사이언시즈)를 이용하여 측정하였다. 단백질 농도는 소 혈청 알부민을 표준물질로 이용하여 쿠마시 플러스 브래드포드 분석 키트(Coomassie Plus Bradford Assay kit; 미국 일리노이주 록포드 소재의 서모 사이언티픽(Thermo Scientific))에 의해 측정하였다. 활성은 배양 배지 1 리터당 인버타아제 활성의 단위(U)로서, 그리고 비활성은 단백질 1 ㎎당 단위로서 계산하였다. 수율을 계산하여 배양물의 DCW 그램당 인버타아제 활성의 단위를 제공하였다.
형질전환 와이. 리포라이티카 Y2224U SUC + 주에서의 세포외 및 전세포 인버타아제 활성
세포외 및 전세포 인버타아제 활성은 각각 배양 상청액 및 전세포를 사용하여 대수기 성장 세포로부터 측정하였다. 두 독립 실험으로부터의 4회 이상의 분석을 행하였으며, 평균 값이 보고되어 있는데, 이는 하기 표 12에 예시한 바와 같다.
Figure pct00017
성장 연구의 결과와 일치하여, 인버타아제 활성이 pYRH68 또는 pYRH74로 형질전환된 와이. 리포라이티카 주에서 배양 상청액 및 전세포로부터 관찰되었다. pRH69 및 pRH73의 와이. 리포라이티카 형질전환체는 수크로스 배지 상에서 성장하지 않았으며, 글루코스 배지에서 성장시킨 세포 배양물로부터 어떠한 검출가능한 세포외 또는 전세포 인버타아제 활성도 없었다.
인버타아제 활성은 XPR2PP+13/m-ScSuc2에 대비하여 Suc2SS/m-ScSuc2의 형질전환체에서 약간 더 높았다. 심지어 성숙 Xpr2의 추가의 13개 아미노산에 의한 분비 시그널 프로세싱에 필요한 엔도펩티다아제에의 접근에 있어서 여전히 약간의 2차 구조 장해가 있었다는 것이 가능하다. 그러나, 98% 초과의 인버타아제 활성이 둘 모두의 SUC + 주의 배양 배지에서 검출되었으며, 배양 상청액 중 바이오매스당, 이전에 보고된 것보다 더 높은 세포외 인버타아제 활성이 관찰되었다.
형질전환 와이. 리포라이티카 주 Y1978U SUC + 주에서의 세포외 및 전세포 인버타아제 활성
인버타아제 활성을 형질전환체의 전세포에서 그리고 그 배양 배지로부터 측정하였다. 글루코스 또는 수크로스를 유일한 탄소 공급원으로 포함하는 YP (10 g/L의 박토(Bacto) 효모 추출물 및 20 g/L의 박토 펩톤) 배지에서 배양물을 성장시켰다. 2개의 상이한 형질전환체를 SUC2 제작물들 각각에 대하여 시험하였으며, 평균 값이 보고되어 있는데, 이는 하기 표 13에 예시된 바와 같다.
Figure pct00018
YP-기반 배양 배지 중 단백질 농도는 합성 기반 배양 배지의 것보다 유의하게 더 높았으며 (표 12), 이는 인버타아제 비활성(U/㎎의 단백질)을 감소시켰다. 이것에도 불구하고, pRHY68 형질전환체는 글루코스 배양물과 수크로스 배양물 사이에서 유사한 인버타아제 활성을 나타냈으며, 90% 초과의 인버타아제 활성이 배양 배지에서 검출되었다. pYRH74 형질전환체에 있어서, 하나의 형질전환체는 시험한 모든 조건에서 다른 형질전환체보다 훨씬 더 높은 인버타아제 활성을 나타냈다. 따라서, 평균 인버타아제 활성은 큰 표준 오차로 상승하였다. 그렇기는 하지만, 90% 초과의 인버타아제 활성이 글루코스 또는 수크로스 중 어느 하나를 유일한 탄소 공급원으로 포함하는 배양 배지에서 검출되었다.
실시예 8
공개적으로 입수가능한 인버타아제 코딩 유전자의 확인
사카로마이세스 세레비지애 인버타아제는 본 명세서에서 서열 번호 1로 기술된 SUC2 유전자에 의해 코딩된다. 이 1599 bp 유전자는 532개 아미노산의 전장 인버타아제 (서열 번호 2)를 코딩하며, 이는 글리코실화된 형태로 에스. 세레비지애의 주변세포질 내로 분비된다. 이와는 대조적으로, 19개 아미노산 길이의 5' 시그널 서열(즉, 서열 번호 1의 뉴클레오티드 1-57에 의해 코딩됨)이 결여된 "성숙" ScSUC2 유전자["m-ScSUC2"]는 서열 번호 3으로 기술되어 있으며, 서열 번호 4의 단백질을 코딩한다.
m-ScSUC2를 코딩하는 단백질 서열 (서열 번호 4)을 사용하여, 미국 국립 생물공학 정보 센터[National Center for Biotechnology Information; "NCBI"] BLASTP 2.2.26+ (문헌[Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)]; 문헌[Altschul, S. F., et al., FEBS J., 272:5101-5109 (2005)]) 검색을 행하여 BLAST "nr" 데이터베이스 (모든 비-잉여 젠뱅크 CDS 번역을 포함함), 단백질 데이터 은행[Protein Data Bank; "PDB"] 단백질 서열 데이터베이스, SWISS-PROT 단백질 서열 데이터베이스, 단백질 정보 리소스[Protein Information Resource; "PIR"] 단백질 서열 데이터베이스 및 단백질 연구 재단[Protein Research Foundation; "PRF"] 단백질 서열 데이터베이스 내에서 유사성을 갖는 서열을 확인하였으며, 전 게놈 샷건[whole genome shotgun; "WGS"] 프로젝트로부터 환경 샘플을 배제하였다).
서열 번호 4의 서열이 가장 큰 유사성을 갖는 서열을 요약한, BLASTP 비교 결과는 동일성 %, 유사성 % 및 기대값에 따라 보고될 수 있다. "동일성 %"는 두 단백질 사이에서 동일한 아미노산의 백분율로서 정의된다. "유사성 %"는 두 단백질 사이에서 동일하거나 또는 보존된 아미노산의 백분율로서 정의된다. "기대값"은 매치의 통계적 유의성을 개산한 것으로서, 이는 절대적으로 우연히 이 크기의 데이터베이스의 검색에서 기대되는 매치의 수를 주어진 스코어에 의해 특정한다.
다수의 단백질은 m-ScSUC2 (서열 번호 4)에 대하여 상당한 유사성을 공유하는 것으로 확인되었다. 표 14는 "4e-90" 이상의 기대값을 갖는 히트의 부분 요약 및 "인버타아제" 또는 "베타-프룩토푸라노시다아제" 중 어느 하나로서 당해 단백질을 특정적으로 확인해 주는 주석을 제공하지만, 이는 본 발명의 개시 내용을 한정하는 것으로 여겨져서는 안된다. 사카로마이세스 세레비지애에 대한 모든 히트는 하기에 보고된 결과에서 배제하였다. 표 14의 단백질은 91% 내지 99%의 질의 커버리지(query coverage)를 서열 번호 4의 서열과 공유하였다.
Figure pct00019
SEQUENCE LISTING <110> E.I. du Pont de Nemours and Company Hong, Raymond Seip, John Zhu, Quinn <120> Use of Saccharomyces cerevisaie SUC2 gene in Yarrowia lipolytica for sucrose utilization <130> CL5174 <160> 41 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1599 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(1599) <220> <221> sig_peptide <222> (1)..(57) <400> 1 atg ctt ttg caa gct ttc ctt ttc ctt ttg gct ggt ttt gca gcc aaa 48 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15 ata tct gca tca atg aca aac gaa act agc gat aga cct ttg gtc cac 96 Ile Ser Ala Ser Met Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Pro Leu Val His 20 25 30 ttc aca ccc aac aag ggc tgg atg aat gac cca aat ggg ttg tgg tac 144 Phe Thr Pro Asn Lys Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr 35 40 45 gat gaa aaa gat gcc aaa tgg cat ctg tac ttt caa tac aac cca aat 192 Asp Glu Lys Asp Ala Lys Trp His Leu Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn 50 55 60 gac acc gta tgg ggt acg cca ttg ttt tgg ggc cat gct act tcc gat 240 Asp Thr Val Trp Gly Thr Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asp 65 70 75 80 gat ttg act aat tgg gaa gat caa ccc att gct atc gct ccc aag cgt 288 Asp Leu Thr Asn Trp Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg 85 90 95 aac gat tca ggt gct ttc tct ggc tcc atg gtg gtt gat tac aac aac 336 Asn Asp Ser Gly Ala Phe Ser Gly Ser Met Val Val Asp Tyr Asn Asn 100 105 110 acg agt ggg ttt ttc aat gat act att gat cca aga caa aga tgc gtt 384 Thr Ser Gly Phe Phe Asn Asp Thr Ile Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val 115 120 125 gcg att tgg act tat aac act cct gaa agt gaa gag caa tac att agc 432 Ala Ile Trp Thr Tyr Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser 130 135 140 tat tct ctt gat ggt ggt tac act ttt act gaa tac caa aag aac cct 480 Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro 145 150 155 160 gtt tta gct gcc aac tcc act caa ttc aga gat cca aag gtg ttc tgg 528 Val Leu Ala Ala Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp 165 170 175 tat gaa cct tct caa aaa tgg att atg acg gct gcc aaa tca caa gac 576 Tyr Glu Pro Ser Gln Lys Trp Ile Met Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp 180 185 190 tac aaa att gaa att tac tcc tct gat gac ttg aag tcc tgg aag cta 624 Tyr Lys Ile Glu Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu 195 200 205 gaa tct gca ttt gcc aat gaa ggt ttc tta ggc tac caa tac gaa tgt 672 Glu Ser Ala Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys 210 215 220 cca ggt ttg att gaa gtc cca act gag caa gat cct tcc aaa tct tat 720 Pro Gly Leu Ile Glu Val Pro Thr Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Tyr 225 230 235 240 tgg gtc atg ttt att tct atc aac cca ggt gca cct gct ggc ggt tcc 768 Trp Val Met Phe Ile Ser Ile Asn Pro Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser 245 250 255 ttc aac caa tat ttt gtt gga tcc ttc aat ggt act cat ttt gaa gcg 816 Phe Asn Gln Tyr Phe Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala 260 265 270 ttt gac aat caa tct aga gtg gta gat ttt ggt aag gac tac tat gcc 864 Phe Asp Asn Gln Ser Arg Val Val Asp Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala 275 280 285 ttg caa act ttc ttc aac act gac cca acc tac ggt tca gca tta ggt 912 Leu Gln Thr Phe Phe Asn Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly 290 295 300 att gcc tgg gct tca aac tgg gag tac agt gcc ttt gtc cca act aac 960 Ile Ala Trp Ala Ser Asn Trp Glu Tyr Ser Ala Phe Val Pro Thr Asn 305 310 315 320 cca tgg aga tca tcc atg tct ttg gtc cgc aag ttt tct ttg aac act 1008 Pro Trp Arg Ser Ser Met Ser Leu Val Arg Lys Phe Ser Leu Asn Thr 325 330 335 gaa tat caa gct aat cca gag act gaa ttg atc aat ttg aaa gcc gaa 1056 Glu Tyr Gln Ala Asn Pro Glu Thr Glu Leu Ile Asn Leu Lys Ala Glu 340 345 350 cca ata ttg aac att agt aat gct ggt ccc tgg tct cgt ttt gct act 1104 Pro Ile Leu Asn Ile Ser Asn Ala Gly Pro Trp Ser Arg Phe Ala Thr 355 360 365 aac aca act cta act aag gcc aat tct tac aat gtc gat ttg agc aac 1152 Asn Thr Thr Leu Thr Lys Ala Asn Ser Tyr Asn Val Asp Leu Ser Asn 370 375 380 tcg act ggt acc cta gag ttt gag ttg gtt tac gct gtt aac acc aca 1200 Ser Thr Gly Thr Leu Glu Phe Glu Leu Val Tyr Ala Val Asn Thr Thr 385 390 395 400 caa acc ata tcc aaa tcc gtc ttt gcc gac tta tca ctt tgg ttc aag 1248 Gln Thr Ile Ser Lys Ser Val Phe Ala Asp Leu Ser Leu Trp Phe Lys 405 410 415 ggt tta gaa gat cct gaa gaa tat ttg aga atg ggt ttt gaa gtc agt 1296 Gly Leu Glu Asp Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Met Gly Phe Glu Val Ser 420 425 430 gct tct tcc ttc ttt ttg gac cgt ggt aac tct aag gtc aag ttt gtc 1344 Ala Ser Ser Phe Phe Leu Asp Arg Gly Asn Ser Lys Val Lys Phe Val 435 440 445 aag gag aac cca tat ttc aca aac aga atg tct gtc aac aac caa cca 1392 Lys Glu Asn Pro Tyr Phe Thr Asn Arg Met Ser Val Asn Asn Gln Pro 450 455 460 ttc aag tct gag aac gac cta agt tac tat aaa gtg tac ggc cta ctg 1440 Phe Lys Ser Glu Asn Asp Leu Ser Tyr Tyr Lys Val Tyr Gly Leu Leu 465 470 475 480 gat caa aac atc ttg gaa ttg tac ttc aac gat gga gat gtg gtt tct 1488 Asp Gln Asn Ile Leu Glu Leu Tyr Phe Asn Asp Gly Asp Val Val Ser 485 490 495 aca aat acc tac ttc atg acc acc ggt aac gct cta gga tct gtg aac 1536 Thr Asn Thr Tyr Phe Met Thr Thr Gly Asn Ala Leu Gly Ser Val Asn 500 505 510 atg acc act ggt gtc gat aat ttg ttc tac att gac aag ttc caa gta 1584 Met Thr Thr Gly Val Asp Asn Leu Phe Tyr Ile Asp Lys Phe Gln Val 515 520 525 agg gaa gta aaa tag 1599 Arg Glu Val Lys 530 <210> 2 <211> 532 <212> PRT <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 2 Met Leu Leu Gln Ala Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys 1 5 10 15 Ile Ser Ala Ser Met Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Pro Leu Val His 20 25 30 Phe Thr Pro Asn Lys Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr 35 40 45 Asp Glu Lys Asp Ala Lys Trp His Leu Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn 50 55 60 Asp Thr Val Trp Gly Thr Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asp 65 70 75 80 Asp Leu Thr Asn Trp Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg 85 90 95 Asn Asp Ser Gly Ala Phe Ser Gly Ser Met Val Val Asp Tyr Asn Asn 100 105 110 Thr Ser Gly Phe Phe Asn Asp Thr Ile Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val 115 120 125 Ala Ile Trp Thr Tyr Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser 130 135 140 Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro 145 150 155 160 Val Leu Ala Ala Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp 165 170 175 Tyr Glu Pro Ser Gln Lys Trp Ile Met Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp 180 185 190 Tyr Lys Ile Glu Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu 195 200 205 Glu Ser Ala Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys 210 215 220 Pro Gly Leu Ile Glu Val Pro Thr Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Tyr 225 230 235 240 Trp Val Met Phe Ile Ser Ile Asn Pro Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser 245 250 255 Phe Asn Gln Tyr Phe Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala 260 265 270 Phe Asp Asn Gln Ser Arg Val Val Asp Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala 275 280 285 Leu Gln Thr Phe Phe Asn Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly 290 295 300 Ile Ala Trp Ala Ser Asn Trp Glu Tyr Ser Ala Phe Val Pro Thr Asn 305 310 315 320 Pro Trp Arg Ser Ser Met Ser Leu Val Arg Lys Phe Ser Leu Asn Thr 325 330 335 Glu Tyr Gln Ala Asn Pro Glu Thr Glu Leu Ile Asn Leu Lys Ala Glu 340 345 350 Pro Ile Leu Asn Ile Ser Asn Ala Gly Pro Trp Ser Arg Phe Ala Thr 355 360 365 Asn Thr Thr Leu Thr Lys Ala Asn Ser Tyr Asn Val Asp Leu Ser Asn 370 375 380 Ser Thr Gly Thr Leu Glu Phe Glu Leu Val Tyr Ala Val Asn Thr Thr 385 390 395 400 Gln Thr Ile Ser Lys Ser Val Phe Ala Asp Leu Ser Leu Trp Phe Lys 405 410 415 Gly Leu Glu Asp Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Met Gly Phe Glu Val Ser 420 425 430 Ala Ser Ser Phe Phe Leu Asp Arg Gly Asn Ser Lys Val Lys Phe Val 435 440 445 Lys Glu Asn Pro Tyr Phe Thr Asn Arg Met Ser Val Asn Asn Gln Pro 450 455 460 Phe Lys Ser Glu Asn Asp Leu Ser Tyr Tyr Lys Val Tyr Gly Leu Leu 465 470 475 480 Asp Gln Asn Ile Leu Glu Leu Tyr Phe Asn Asp Gly Asp Val Val Ser 485 490 495 Thr Asn Thr Tyr Phe Met Thr Thr Gly Asn Ala Leu Gly Ser Val Asn 500 505 510 Met Thr Thr Gly Val Asp Asn Leu Phe Tyr Ile Asp Lys Phe Gln Val 515 520 525 Arg Glu Val Lys 530 <210> 3 <211> 1542 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <220> <221> CDS <222> (1)..(1542) <400> 3 tca atg aca aac gaa act agc gat aga cct ttg gtc cac ttc aca ccc 48 Ser Met Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg 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Pro Ala Gly Gly Ser Phe Asn Gln 225 230 235 240 tat ttt gtt gga tcc ttc aat ggt act cat ttt gaa gcg ttt gac aat 768 Tyr Phe Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala Phe Asp Asn 245 250 255 caa tct aga gtg gta gat ttt ggt aag gac tac tat gcc ttg caa act 816 Gln Ser Arg Val Val Asp Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala Leu Gln Thr 260 265 270 ttc ttc aac act gac cca acc tac ggt tca gca tta ggt att gcc tgg 864 Phe Phe Asn Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ala Trp 275 280 285 gct tca aac tgg gag tac agt gcc ttt gtc cca act aac cca tgg aga 912 Ala Ser Asn Trp Glu Tyr Ser Ala Phe Val Pro Thr Asn Pro Trp Arg 290 295 300 tca tcc atg tct ttg gtc cgc aag ttt tct ttg aac act gaa tat caa 960 Ser Ser Met Ser Leu Val Arg Lys Phe Ser Leu Asn Thr Glu Tyr Gln 305 310 315 320 gct aat cca gag act gaa ttg atc aat ttg aaa gcc gaa cca ata ttg 1008 Ala Asn Pro Glu Thr Glu Leu Ile Asn Leu Lys Ala Glu Pro Ile Leu 325 330 335 aac att agt aat gct ggt ccc tgg tct cgt ttt gct act aac aca act 1056 Asn Ile Ser Asn Ala Gly Pro Trp Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr Thr 340 345 350 cta act aag gcc aat tct tac aat gtc gat ttg agc aac tcg act ggt 1104 Leu Thr Lys Ala Asn Ser Tyr Asn Val Asp Leu Ser Asn Ser Thr Gly 355 360 365 acc cta gag ttt gag ttg gtt tac gct gtt aac acc aca caa acc ata 1152 Thr Leu Glu Phe Glu Leu Val Tyr Ala Val Asn Thr Thr Gln Thr Ile 370 375 380 tcc aaa tcc gtc ttt gcc gac tta tca ctt tgg ttc aag ggt tta gaa 1200 Ser Lys Ser Val Phe Ala Asp Leu Ser Leu Trp Phe Lys Gly Leu Glu 385 390 395 400 gat cct gaa gaa tat ttg aga atg ggt ttt gaa gtc agt gct tct tcc 1248 Asp Pro Glu Glu Tyr Leu Arg Met Gly Phe Glu Val Ser Ala Ser Ser 405 410 415 ttc ttt ttg gac cgt ggt aac tct aag gtc aag ttt gtc aag gag aac 1296 Phe Phe Leu Asp Arg Gly Asn Ser Lys Val Lys Phe Val Lys Glu Asn 420 425 430 cca tat ttc aca aac aga atg tct gtc aac aac caa cca ttc aag tct 1344 Pro Tyr Phe Thr Asn Arg Met Ser Val Asn Asn Gln Pro Phe Lys Ser 435 440 445 gag aac gac cta agt tac tat aaa gtg tac ggc cta ctg gat caa 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Met Val Val Asp Tyr Asn Asn Thr Ser Gly 85 90 95 Phe Phe Asn Asp Thr Ile Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val Ala Ile Trp 100 105 110 Thr Tyr Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser Tyr Ser Leu 115 120 125 Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro Val Leu Ala 130 135 140 Ala Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Glu Pro 145 150 155 160 Ser Gln Lys Trp Ile Met Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp Tyr Lys Ile 165 170 175 Glu Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu Glu Ser Ala 180 185 190 Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys Pro Gly Leu 195 200 205 Ile Glu Val Pro Thr Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Tyr Trp Val Met 210 215 220 Phe Ile Ser Ile Asn Pro Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser Phe Asn Gln 225 230 235 240 Tyr Phe Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala Phe Asp Asn 245 250 255 Gln Ser Arg Val Val Asp Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala Leu Gln Thr 260 265 270 Phe Phe Asn Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ala Trp 275 280 285 Ala Ser Asn Trp Glu Tyr Ser Ala 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Leu Val Asp Glu Asp Ser 85 90 95 tcc aac ggt atc acc tct gct ctt gat ctt cct gtc tac acg gat gga 336 Ser Asn Gly Ile Thr Ser Ala Leu Asp Leu Pro Val Tyr Thr Asp Gly 100 105 110 tct ggc ttt ctc gga ttt gtt gga aag ttc aac tcc act atc gtt gac 384 Ser Gly Phe Leu Gly Phe Val Gly Lys Phe Asn Ser Thr Ile Val Asp 115 120 125 aag ctc aag gag tcg tct gtt ctg acg gtc gag ccc gat acc att gtg 432 Lys Leu Lys Glu Ser Ser Val Leu Thr Val Glu Pro Asp Thr Ile Val 130 135 140 tct ctc ccc gag att cct gct tct tct aat gcc aag cga gct atc cag 480 Ser Leu Pro Glu Ile Pro Ala Ser Ser Asn Ala Lys Arg Ala Ile Gln 145 150 155 160 act act ccc gtc act caa tgg ggc ctg tct aga atc tct cat aag aag 528 Thr Thr Pro Val Thr Gln Trp Gly Leu Ser Arg Ile Ser His Lys Lys 165 170 175 gcc cag act gga aac tac gcc tac gtt cga gag aca gtt ggc aag cac 576 Ala Gln Thr Gly Asn Tyr Ala Tyr Val Arg Glu Thr Val Gly Lys His 180 185 190 ccc acc gtt tct tac gtt gtt gac tct ggt atc cga acc acc cac tcc 624 Pro Thr Val Ser Tyr Val Val Asp Ser Gly Ile Arg Thr Thr His Ser 195 200 205 gag ttc gga ggc cga gct gtc tgg gga gcc aac ttc gct gac aca cag 672 Glu Phe Gly Gly Arg Ala Val Trp Gly Ala Asn Phe Ala Asp Thr Gln 210 215 220 aac gct gat ctt ctc ggt cac ggc act cac gtt gca ggt acc gtg gga 720 Asn Ala Asp Leu Leu Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Gly 225 230 235 240 gga aag aca tac gga gtc gac gcc aac acc aag ctg gtg gcc gtc aag 768 Gly Lys Thr Tyr Gly Val Asp Ala Asn Thr Lys Leu Val Ala Val Lys 245 250 255 gtg ttt gca ggc cga tcc gca gct ctc tcc gtc atc aac cag ggc ttc 816 Val Phe Ala Gly Arg Ser Ala Ala Leu Ser Val Ile Asn Gln Gly Phe 260 265 270 acc tgg gct ctc aac gac tac atc tcc aag cga gac act ctg cct cga 864 Thr Trp Ala Leu Asn Asp Tyr Ile Ser Lys Arg Asp Thr Leu Pro Arg 275 280 285 gga gtg ctg aac ttc tct gga gga gga ccc aag tcc gct tcc cag gac 912 Gly Val Leu Asn Phe Ser Gly Gly Gly Pro Lys Ser Ala Ser Gln Asp 290 295 300 gcc cta tgg tct cga gct acc cag gag ggt ctg ctt gtc gcc atc gct 960 Ala Leu Trp Ser Arg Ala Thr Gln Glu Gly Leu Leu Val Ala Ile Ala 305 310 315 320 gcg gga aac gat gcc gtg gac gcc tgt aac gac tct ccc ggt aac att 1008 Ala Gly Asn Asp Ala Val Asp Ala Cys Asn Asp Ser Pro Gly Asn Ile 325 330 335 gga ggc tcc acc tct ggt atc atc act gtg ggt tcc att gac tct agc 1056 Gly Gly Ser Thr Ser Gly Ile Ile Thr Val Gly Ser Ile Asp Ser Ser 340 345 350 gat aag atc tcc gtc tgg tcc ggt gga cag gga tcc aac tac gga act 1104 Asp Lys Ile Ser Val Trp Ser Gly Gly Gln Gly Ser Asn Tyr Gly Thr 355 360 365 tgt gtt gat gtc ttt gcc ccc ggc tcc gat atc atc tct gcc tct tac 1152 Cys Val Asp Val Phe Ala Pro Gly Ser Asp Ile Ile Ser Ala Ser Tyr 370 375 380 cag tcc gac tct ggt act ttg gtc tac tcc ggt acc tcc atg gcc tgt 1200 Gln Ser Asp Ser Gly Thr Leu Val Tyr Ser Gly Thr Ser Met Ala Cys 385 390 395 400 ccc cac gtt gcc ggt ctt gcc tcc tac tac ctg tcc atc aat gac gag 1248 Pro His Val Ala Gly Leu Ala Ser Tyr Tyr Leu Ser Ile Asn Asp Glu 405 410 415 gtt ctc acc cct gcc cag gtc gag gct ctt att act gag tcc aac acc 1296 Val Leu Thr Pro Ala Gln Val Glu Ala Leu Ile Thr Glu Ser Asn Thr 420 425 430 ggt gtt ctt ccc acc acc aac ctc aag ggc tct ccc aac gct gtt gcc 1344 Gly Val Leu Pro Thr Thr Asn Leu Lys Gly Ser Pro Asn Ala Val Ala 435 440 445 tac aac ggt gtt ggc att tag 1365 Tyr Asn Gly Val Gly Ile 450 <210> 6 <211> 454 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 6 Met Lys Leu Ala Thr Ala Phe Thr Ile Leu Thr Ala Val Leu Ala Ala 1 5 10 15 Pro Leu Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ala Val 20 25 30 Pro Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala Tyr Ser Ser Ile Leu Ser Val Val 35 40 45 Ala Lys Gln Ser Lys Lys Phe Lys His His Lys Arg Asp Leu Asp Glu 50 55 60 Lys Asp Gln Phe Ile Val Val Phe Asp Ser Ser Ala Thr Val Asp Gln 65 70 75 80 Ile Ala Ser Glu Ile Gln Lys Leu Asp Ser Leu Val Asp Glu Asp Ser 85 90 95 Ser Asn Gly Ile Thr Ser Ala Leu Asp Leu Pro Val Tyr Thr Asp Gly 100 105 110 Ser Gly Phe Leu Gly Phe Val Gly Lys Phe Asn Ser Thr Ile Val Asp 115 120 125 Lys Leu Lys Glu Ser Ser Val Leu Thr Val Glu Pro Asp Thr Ile Val 130 135 140 Ser Leu Pro Glu Ile Pro Ala Ser Ser Asn Ala Lys Arg Ala Ile Gln 145 150 155 160 Thr Thr Pro Val Thr Gln Trp Gly Leu Ser Arg Ile Ser His Lys Lys 165 170 175 Ala Gln Thr Gly Asn Tyr Ala Tyr Val Arg Glu Thr Val Gly Lys His 180 185 190 Pro Thr Val Ser Tyr Val Val Asp Ser Gly Ile Arg Thr Thr His Ser 195 200 205 Glu Phe Gly Gly Arg Ala Val Trp Gly Ala Asn Phe Ala Asp Thr Gln 210 215 220 Asn Ala Asp Leu Leu Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Gly 225 230 235 240 Gly Lys Thr Tyr Gly Val Asp Ala Asn Thr Lys Leu Val Ala Val Lys 245 250 255 Val Phe Ala Gly Arg Ser Ala Ala Leu Ser Val Ile Asn Gln Gly Phe 260 265 270 Thr Trp Ala Leu Asn Asp Tyr Ile Ser Lys Arg Asp Thr Leu Pro Arg 275 280 285 Gly Val Leu Asn Phe Ser Gly Gly Gly Pro Lys Ser Ala Ser Gln Asp 290 295 300 Ala Leu Trp Ser Arg Ala Thr Gln Glu Gly Leu Leu Val Ala Ile Ala 305 310 315 320 Ala Gly Asn Asp Ala Val Asp Ala Cys Asn Asp Ser Pro Gly Asn Ile 325 330 335 Gly Gly Ser Thr Ser Gly Ile Ile Thr Val Gly Ser Ile Asp 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<221> CDS <222> (1)..(510) <400> 9 atg aag ctc gct acc gcc ttt act att ctc act gcc gtt ctg gcc gct 48 Met Lys Leu Ala Thr Ala Phe Thr Ile Leu Thr Ala Val Leu Ala Ala 1 5 10 15 ccc ctg gcc gcc cct gcc cct gct cct gat gct gcc cct gct gct gtg 96 Pro Leu Ala Ala Pro Ala Pro Ala Pro Asp Ala Ala Pro Ala Ala Val 20 25 30 cct gag ggc cct gcc gcc gct gcc tac tca tct att ctg tcc gtg gtc 144 Pro Glu Gly Pro Ala Ala Ala Ala Tyr Ser Ser Ile Leu Ser Val Val 35 40 45 gct aag cag tcc aag aag ttt aag cac cac aag cga gat ctt gat gag 192 Ala Lys Gln Ser Lys Lys Phe Lys His His Lys Arg Asp Leu Asp Glu 50 55 60 aag gat cag ttc atc gtt gtc ttt gac agt agc gct act gtt gac cag 240 Lys Asp Gln Phe Ile Val Val Phe Asp Ser Ser Ala Thr Val Asp Gln 65 70 75 80 atc gcc tcc gaa atc cag aag ctg gac tct ctg gtc gac gag gac tcg 288 Ile Ala Ser Glu Ile Gln Lys Leu Asp Ser Leu Val Asp Glu Asp Ser 85 90 95 tcc aac ggt atc acc tct gct ctt gat ctt cct gtc tac acg gat gga 336 Ser Asn Gly Ile Thr Ser Ala Leu Asp Leu Pro Val 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tac ttt caa tac aac cca aat 192 Asp Glu Lys Asp Ala Lys Trp His Leu Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn 50 55 60 gac acc gta tgg ggt acg cca ttg ttt tgg ggc cat gct act tcc gat 240 Asp Thr Val Trp Gly Thr Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asp 65 70 75 80 gat ttg act aat tgg gaa gat caa ccc att gct atc gct ccc aag cgt 288 Asp Leu Thr Asn Trp Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg 85 90 95 aac gat tca ggt gct ttc tct ggc tcc atg gtg gtt gat tac aac aac 336 Asn Asp Ser Gly Ala Phe Ser Gly Ser Met Val Val Asp Tyr Asn Asn 100 105 110 acg agt ggg ttt ttc aat gat act att gat cca aga caa aga tgc gtt 384 Thr Ser Gly Phe Phe Asn Asp Thr Ile Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val 115 120 125 gcg att tgg act tat aac act cct gaa agt gaa gag caa tac att agc 432 Ala Ile Trp Thr Tyr Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser 130 135 140 tat tct ctt gat ggt ggt tac act ttt act gaa tac caa aag aac cct 480 Tyr Ser Leu Asp Gly Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro 145 150 155 160 gtt tta gct gcc aac tcc act caa ttc aga gat cca aag gtg ttc tgg 528 Val Leu Ala Ala Asn Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp 165 170 175 tat gaa cct tct caa aaa tgg att atg acg gct gcc aaa tca caa gac 576 Tyr Glu Pro Ser Gln Lys Trp Ile Met Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp 180 185 190 tac aaa att gaa att tac tcc tct gat gac ttg aag tcc tgg aag cta 624 Tyr Lys Ile Glu Ile Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu 195 200 205 gaa tct gca ttt gcc aat gaa ggt ttc tta ggc tac caa tac gaa tgt 672 Glu Ser Ala Phe Ala Asn Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys 210 215 220 cca ggt ttg att gaa gtc cca act gag caa gat cct tcc aaa tct tat 720 Pro Gly Leu Ile Glu Val Pro Thr Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Tyr 225 230 235 240 tgg gtc atg ttt att tct atc aac cca ggt gca cct gct ggc ggt tcc 768 Trp Val Met Phe Ile Ser Ile Asn Pro Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser 245 250 255 ttc aac caa tat ttt gtt gga tcc ttc aat ggt act cat ttt gaa gcg 816 Phe Asn Gln Tyr Phe Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala 260 265 270 ttt gac aat caa 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gca tca atg 576 Phe Leu Phe Leu Leu Ala Gly Phe Ala Ala Lys Ile Ser Ala Ser Met 180 185 190 aca aac gaa act agc gat aga cct ttg gtc cac ttc aca ccc aac aag 624 Thr Asn Glu Thr Ser Asp Arg Pro Leu Val His Phe Thr Pro Asn Lys 195 200 205 ggc tgg atg aat gac cca aat ggg ttg tgg tac gat gaa aaa gat gcc 672 Gly Trp Met Asn Asp Pro Asn Gly Leu Trp Tyr Asp Glu Lys Asp Ala 210 215 220 aaa tgg cat ctg tac ttt caa tac aac cca aat gac acc gta tgg ggt 720 Lys Trp His Leu Tyr Phe Gln Tyr Asn Pro Asn Asp Thr Val Trp Gly 225 230 235 240 acg cca ttg ttt tgg ggc cat gct act tcc gat gat ttg act aat tgg 768 Thr Pro Leu Phe Trp Gly His Ala Thr Ser Asp Asp Leu Thr Asn Trp 245 250 255 gaa gat caa ccc att gct atc gct ccc aag cgt aac gat tca ggt gct 816 Glu Asp Gln Pro Ile Ala Ile Ala Pro Lys Arg Asn Asp Ser Gly Ala 260 265 270 ttc tct ggc tcc atg gtg gtt gat tac aac aac acg agt ggg ttt ttc 864 Phe Ser Gly Ser Met Val Val Asp Tyr Asn Asn Thr Ser Gly Phe Phe 275 280 285 aat gat act att gat cca aga caa aga tgc gtt gcg att tgg act tat 912 Asn Asp Thr Ile Asp Pro Arg Gln Arg Cys Val Ala Ile Trp Thr Tyr 290 295 300 aac act cct gaa agt gaa gag caa tac att agc tat tct ctt gat ggt 960 Asn Thr Pro Glu Ser Glu Glu Gln Tyr Ile Ser Tyr Ser Leu Asp Gly 305 310 315 320 ggt tac act ttt act gaa tac caa aag aac cct gtt tta gct gcc aac 1008 Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Tyr Gln Lys Asn Pro Val Leu Ala Ala Asn 325 330 335 tcc act caa ttc aga gat cca aag gtg ttc tgg tat gaa cct tct caa 1056 Ser Thr Gln Phe Arg Asp Pro Lys Val Phe Trp Tyr Glu Pro Ser Gln 340 345 350 aaa tgg att atg acg gct gcc aaa tca caa gac tac aaa att gaa att 1104 Lys Trp Ile Met Thr Ala Ala Lys Ser Gln Asp Tyr Lys Ile Glu Ile 355 360 365 tac tcc tct gat gac ttg aag tcc tgg aag cta gaa tct gca ttt gcc 1152 Tyr Ser Ser Asp Asp Leu Lys Ser Trp Lys Leu Glu Ser Ala Phe Ala 370 375 380 aat gaa ggt ttc tta ggc tac caa tac gaa tgt cca ggt ttg att gaa 1200 Asn Glu Gly Phe Leu Gly Tyr Gln Tyr Glu Cys Pro Gly Leu Ile Glu 385 390 395 400 gtc cca act gag caa gat cct tcc aaa tct tat tgg gtc atg ttt att 1248 Val Pro Thr Glu Gln Asp Pro Ser Lys Ser Tyr Trp Val Met Phe Ile 405 410 415 tct atc aac cca ggt gca cct gct ggc ggt tcc ttc aac caa tat ttt 1296 Ser Ile Asn Pro Gly Ala Pro Ala Gly Gly Ser Phe Asn Gln Tyr Phe 420 425 430 gtt gga tcc ttc aat ggt act cat ttt gaa gcg ttt gac aat caa tct 1344 Val Gly Ser Phe Asn Gly Thr His Phe Glu Ala Phe Asp Asn Gln Ser 435 440 445 aga gtg gta gat ttt ggt aag gac tac tat gcc ttg caa act ttc ttc 1392 Arg Val Val Asp Phe Gly Lys Asp Tyr Tyr Ala Leu Gln Thr Phe Phe 450 455 460 aac act gac cca acc tac ggt tca gca tta ggt att gcc tgg gct tca 1440 Asn Thr Asp Pro Thr Tyr Gly Ser Ala Leu Gly Ile Ala Trp Ala Ser 465 470 475 480 aac tgg gag tac agt gcc ttt gtc cca act aac cca tgg aga tca tcc 1488 Asn Trp Glu Tyr Ser Ala Phe Val Pro Thr Asn Pro Trp Arg Ser Ser 485 490 495 atg tct ttg gtc cgc aag ttt tct ttg aac act gaa tat caa gct aat 1536 Met Ser Leu Val Arg Lys Phe Ser Leu Asn Thr Glu Tyr Gln Ala Asn 500 505 510 cca gag act gaa ttg atc aat ttg aaa gcc gaa cca ata ttg aac att 1584 Pro Glu Thr Glu Leu Ile Asn Leu Lys Ala Glu Pro Ile Leu Asn Ile 515 520 525 agt aat gct ggt ccc tgg tct cgt ttt gct act aac aca act cta act 1632 Ser Asn Ala Gly Pro Trp Ser Arg Phe Ala Thr Asn Thr Thr Leu Thr 530 535 540 aag gcc aat tct tac aat gtc gat ttg agc aac tcg act ggt acc cta 1680 Lys Ala Asn Ser Tyr Asn Val Asp Leu Ser Asn Ser Thr Gly Thr Leu 545 550 555 560 gag ttt gag ttg gtt tac gct gtt aac acc aca caa acc ata tcc aaa 1728 Glu Phe Glu Leu Val Tyr Ala Val Asn Thr Thr Gln Thr Ile Ser Lys 565 570 575 tcc gtc ttt gcc gac tta tca ctt tgg ttc aag ggt tta gaa gat cct 1776 Ser Val Phe Ala Asp Leu Ser Leu Trp Phe Lys Gly Leu Glu Asp Pro 580 585 590 gaa gaa tat ttg aga atg ggt ttt gaa gtc agt gct tct tcc ttc ttt 1824 Glu Glu Tyr Leu Arg Met Gly Phe Glu Val Ser Ala Ser Ser Phe Phe 595 600 605 ttg gac cgt ggt aac tct aag gtc aag ttt gtc aag gag aac cca tat 1872 Leu Asp Arg Gly Asn Ser Lys Val Lys Phe Val Lys Glu Asn 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gattcatttc gtgacactag tttctcactt tcccccccgc 3180 acctatagtc aacttggcgg acacgctact tgtagctgac gttgatttat agacccaatc 3240 aaagcgggtt atcggtcagg tagcacttat cattcatcgt tcatactacg atgagcaatc 3300 tcgggcatgt ccggaaaagt gtcgggcgcg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc 3360 ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg 3420 ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc 3480 cacagaatca ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag 3540 gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca 3600 tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca 3660 ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg 3720 atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag 3780 gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt 3840 tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca 3900 cgacttatcg ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg 3960 cggtgctaca gagttcttga 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cagcactgca taattctctt actgtcatgc catccgtaag 4860 atgcttttct gtgactggtg agtactcaac caagtcattc tgagaatagt gtatgcggcg 4920 accgagttgc tcttgcccgg cgtcaatacg ggataatacc gcgccacata gcagaacttt 4980 aaaagtgctc atcattggaa aacgttcttc ggggcgaaaa ctctcaagga tcttaccgct 5040 gttgagatcc agttcgatgt aacccactcg tgcacccaac tgatcttcag catcttttac 5100 tttcaccagc gtttctgggt gagcaaaaac aggaaggcaa aatgccgcaa aaaagggaat 5160 aagggcgaca cggaaatgtt gaatactcat actcttcctt tttcaatatt attgaagcat 5220 ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttaga aaaataaaca 5280 aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct gatgcggtgt gaaataccgc 5340 acagatgcgt aaggagaaaa taccgcatca ggaaattgta agcgttaata ttttgttaaa 5400 attcgcgtta aatttttgtt aaatcagctc attttttaac caataggccg aaatcggcaa 5460 aatcccttat aaatcaaaag aatagaccga gatagggttg agtgttgttc cagtttggaa 5520 caagagtcca ctattaaaga acgtggactc caacgtcaaa gggcgaaaaa ccgtctatca 5580 gggcgatggc ccactacgtg aaccatcacc ctaatcaagt tttttggggt cgaggtgccg 5640 taaagcacta aatcggaacc 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gtcagaccca cagcctccaa cgaagaatgt atcgtcaaag 8220 tgatccaagc acactcatag ttggagtcgt actccaaagg cggcaatgac gagtcagaca 8280 gatactcgtc gacgtttaaa cagtgtacgc agatctacta tagaggaaca tttaaattgc 8340 cccggagaag acggccaggc cgcctagatg acaaattcaa caactcacag ctgactttct 8400 gccattgcca ctaggggggg gcctttttat atggccaagc caagctctcc acgtcggttg 8460 ggctgcaccc aacaataaat gggtagggtt gcaccaacaa agggatggga tggggggtag 8520 aagatacgag gataacgggg ctcaatggca caaataagaa cgaatactgc cattaagact 8580 cgtgatccag cgactgacac cattgcatca tctaagggcc tcaaaactac ctcggaactg 8640 ctgcgctgat ctggacacca cagaggttcc gagcacttta ggttgcacca aatgtcccac 8700 caggtgcagg cagaaaacgc tggaacagcg tgtacagttt gtcttaacaa aaagtgaggg 8760 cgctgaggtc gagcagggtg gtgtgacttg ttatagcctt tagagctgcg aaagcgcgta 8820 tggatttggc tcatcaggcc agattgaggg tctgtggaca catgtcatgt tagtgtactt 8880 caatcgcccc ctggatatag ccccgacaat aggccgtggc ctcatttttt tgccttccgc 8940 acatttccat tgctcgatac ccacaccttg cttctcctgc acttgccaac cttaatactg 9000 gtttacattg accaacatct 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cag ttc atc gtt gtc ttt gac agt agc gct act gtt gac cag 240 Lys Asp Gln Phe Ile Val Val Phe Asp Ser Ser Ala Thr Val Asp Gln 65 70 75 80 atc gcc tcc gaa atc cag aag ctg gac tct ctg gtc gac gag gac tcg 288 Ile Ala Ser Glu Ile Gln Lys Leu Asp Ser Leu Val Asp Glu Asp Ser 85 90 95 tcc aac ggt atc acc tct gct ctt gat ctt cct gtc tac acg gat gga 336 Ser Asn Gly Ile Thr Ser Ala Leu Asp Leu Pro Val Tyr Thr Asp Gly 100 105 110 tct ggc ttt ctc gga ttt gtt gga aag ttc aac tcc act atc gtt gac 384 Ser Gly Phe Leu Gly Phe Val Gly Lys Phe Asn Ser Thr Ile Val Asp 115 120 125 aag ctc aag gag tcg tct gtt ctg acg gtc gag ccc gat acc att gtg 432 Lys Leu Lys Glu Ser Ser Val Leu Thr Val Glu Pro Asp Thr Ile Val 130 135 140 tct ctc ccc gag att cct gct tct tct aat gcc aag cga gct atc cag 480 Ser Leu Pro Glu Ile Pro Ala Ser Ser Asn Ala Lys Arg Ala Ile Gln 145 150 155 160 act act ccc gtc act caa tgg ggc ctg tct aac atg tca atg aca aac 528 Thr Thr Pro Val Thr Gln Trp Gly Leu Ser Asn Met Ser Met Thr Asn 165 170 175 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gag gtg tgg aag act gcc cag aac gaa aag 1344 Arg Gly Gly Met Glu Val Glu Val Trp Lys Thr Ala Gln Asn Glu Lys 435 440 445 aag gac cag aac att gtc tcc gat gag agt gga aac cga atc cac cga 1392 Lys Asp Gln Asn Ile Val Ser Asp Glu Ser Gly Asn Arg Ile His Arg 450 455 460 gct ggt ctc cag gcc acc cgg gtc gag aac ccc ggt atg tct ggc atg 1440 Ala Gly Leu Gln Ala Thr Arg Val Glu Asn Pro Gly Met Ser Gly Met 465 470 475 480 gct gct tag 1449 Ala Ala <210> 33 <211> 482 <212> PRT <213> Yarrowia lipolytica <400> 33 Met Val Lys Asn Val Asp Gln Val Asp Leu Ser Gln Val Asp Thr Ile 1 5 10 15 Ala Ser Gly Arg Asp Val Asn Tyr Lys Val Lys Tyr Thr Ser Gly Val 20 25 30 Lys Met Ser Gln Gly Ala Tyr Asp Asp Lys Gly Arg His Ile Ser Glu 35 40 45 Gln Pro Phe Thr Trp Ala Asn Trp His Gln His Ile Asn Trp Leu Asn 50 55 60 Phe Ile Leu Val Ile Ala Leu Pro Leu Ser Ser Phe Ala Ala Ala Pro 65 70 75 80 Phe Val Ser Phe Asn Trp Lys Thr Ala Ala Phe Ala Val Gly Tyr Tyr 85 90 95 Met Cys Thr Gly Leu Gly Ile Thr Ala Gly Tyr His Arg 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Asp Leu 305 310 315 320 Gln Thr Phe Ser Gln Asn Ala Ile Glu Gln Gly Leu Val Gln Gln Arg 325 330 335 Gln Lys Lys Leu Asp Lys Trp Arg Asn Asn Leu Asn Trp Gly Ile Pro 340 345 350 Ile Glu Gln Leu Pro Val Ile Glu Phe Glu Glu Phe Gln Glu Gln Ala 355 360 365 Lys Thr Arg Asp Leu Val Leu Ile Ser Gly Ile Val His Asp Val Ser 370 375 380 Ala Phe Val Glu His His Pro Gly Gly Lys Ala Leu Ile Met Ser Ala 385 390 395 400 Val Gly Lys Asp Gly Thr Ala Val Phe Asn Gly Gly Val Tyr Arg His 405 410 415 Ser Asn Ala Gly His Asn Leu Leu Ala Thr Met Arg Val Ser Val Ile 420 425 430 Arg Gly Gly Met Glu Val Glu Val Trp Lys Thr Ala Gln Asn Glu Lys 435 440 445 Lys Asp Gln Asn Ile Val Ser Asp Glu Ser Gly Asn Arg Ile His Arg 450 455 460 Ala Gly Leu Gln Ala Thr Arg Val Glu Asn Pro Gly Met Ser Gly Met 465 470 475 480 Ala Ala <210> 34 <211> 1101 <212> DNA <213> Yarrowia lipolytica <220> <221> CDS <222> (1)..(1101) <223> cholinephosphate cytidylyltransferase; GenBank Accession No. XM_502978 <400> 34 atg gcc aaa agc aaa cga cgg tcg gag gct gtg gaa gag cac gtg acc 48 Met Ala Lys Ser Lys Arg Arg Ser Glu Ala Val Glu Glu His Val Thr 1 5 10 15 ggc tcg gac gag ggc ttg acc gat act tcg ggt cac gtg agc cct gcc 96 Gly Ser Asp Glu Gly Leu Thr Asp Thr Ser Gly His Val Ser Pro Ala 20 25 30 gcc aag aag cag aag aac tcg gag att cat ttc acc acc cag gct gcc 144 Ala Lys Lys Gln Lys Asn Ser Glu Ile His Phe Thr Thr Gln Ala Ala 35 40 45 cag cag ttg gat cgg gag cgc aag gag gag tat ctg gac tcg ctg atc 192 Gln Gln Leu Asp Arg Glu Arg Lys Glu Glu Tyr Leu Asp Ser Leu Ile 50 55 60 gac aac aag gac tat ctc aag tac cgt cct cga ggc tgg aag ctc aac 240 Asp Asn Lys Asp Tyr Leu Lys Tyr Arg Pro Arg Gly Trp Lys Leu Asn 65 70 75 80 aac ccg cct acc gac cga cct gtg cga atc tac gcc gat gga gtg ttt 288 Asn Pro Pro Thr Asp Arg Pro Val Arg Ile Tyr Ala Asp Gly Val Phe 85 90 95 gat ttg ttc cat ctg gga cac atg cgt cag ctg gag cag tcc aag aag 336 Asp Leu Phe His Leu Gly His Met Arg Gln Leu Glu Gln Ser Lys Lys 100 105 110 gcc ttc ccc aac gca gtg ttg att gtg ggc att ccc agc gac aag gag 384 Ala Phe Pro Asn Ala Val Leu Ile Val Gly Ile Pro Ser Asp Lys Glu 115 120 125 acc cac aag cgg aag gga ttg acc gtg ctg agt gac gtc cag cgg tac 432 Thr His Lys Arg Lys Gly Leu Thr Val Leu Ser Asp Val Gln Arg Tyr 130 135 140 gag acg gtg cga cac tgc aag tgg gtg gac gag gtg gtg gag gat gct 480 Glu Thr Val Arg His Cys Lys Trp Val Asp Glu Val Val Glu Asp Ala 145 150 155 160 ccc tgg tgt gtc acc atg gac ttt ctg gaa aaa cac aaa atc gac tac 528 Pro Trp Cys Val Thr Met Asp Phe Leu Glu Lys His Lys Ile Asp Tyr 165 170 175 gtg gcc cat gac gat ctg ccc tac gct tcc ggc aac gac gat gat atc 576 Val Ala His Asp Asp Leu Pro Tyr Ala Ser Gly Asn Asp Asp Asp Ile 180 185 190 tac aag ccc atc aag gag aag ggc atg ttt ctg gcc acc cag cga acc 624 Tyr Lys Pro Ile Lys Glu Lys Gly Met Phe Leu Ala Thr Gln Arg Thr 195 200 205 gag ggc att tcc acc tcg gac atc atc acc aag att atc cga gac tac 672 Glu Gly Ile Ser Thr Ser Asp Ile Ile Thr Lys Ile Ile Arg Asp Tyr 210 215 220 gac aag tat tta atg cga aac ttt gcc cgg ggt gct aac cga aag gat 720 Asp Lys Tyr Leu Met Arg Asn Phe Ala Arg Gly Ala Asn Arg Lys Asp 225 230 235 240 ctc aac gtc tcg tgg ctc aag aag aac gag ctg gac ttc aag cgt cat 768 Leu Asn Val Ser Trp Leu Lys Lys Asn Glu Leu Asp Phe Lys Arg His 245 250 255 gtg gcc gag ttc cga aac tcg ttc aag cga aag aag gtc ggt aag gat 816 Val Ala Glu Phe Arg Asn Ser Phe Lys Arg Lys Lys Val Gly Lys Asp 260 265 270 ctc tac ggc gag att cgc ggt ctg ctg cag aat gtg ctc att tgg aac 864 Leu Tyr Gly Glu Ile Arg Gly Leu Leu Gln Asn Val Leu Ile Trp Asn 275 280 285 ggc gac aac tcc ggc act tcc act ccc cag cga aag acg ctg cag acc 912 Gly Asp Asn Ser Gly Thr Ser Thr Pro Gln Arg Lys Thr Leu Gln Thr 290 295 300 aac gcc aag aag atg tac atg aac gtg ctc aag act ctg cag gct cct 960 Asn Ala Lys Lys Met Tyr Met Asn Val Leu Lys Thr Leu Gln Ala Pro 305 310 315 320 gac gct gtt gac gtg gac tcc tcg gag aac gtg tct gag aac gtc act 1008 Asp Ala Val Asp Val Asp Ser Ser Glu Asn Val Ser Glu Asn Val Thr 325 330 335 gat 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<220> <223> Primer YL429 <400> 39 cccaagcttg ctggttttgc agccaaaata tctgcatc 38 <210> 40 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer YL430 <400> 40 cttcgtacgc tattttactt cccttacttg gaacttg 37 <210> 41 <211> 1581 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 41 aagcttgctg gttttgcagc caaaatatct gcatcaatga caaacgaaac tagcgataga 60 cctttggtcc acttcacacc caacaagggc tggatgaatg acccaaatgg gttgtggtac 120 gatgaaaaag atgccaaatg gcatctgtac tttcaataca acccaaatga caccgtatgg 180 ggtacgccat tgttttgggg ccatgctact tccgatgatt tgactaattg ggaagatcaa 240 cccattgcta tcgctcccaa gcgtaacgat tcaggtgctt tctctggctc catggtggtt 300 gattacaaca acacgagtgg gtttttcaat gatactattg atccaagaca aagatgcgtt 360 gcgatttgga cttataacac tcctgaaagt gaagagcaat acattagcta ttctcttgat 420 ggtggttaca cttttactga ataccaaaag aaccctgttt tagctgccaa ctccactcaa 480 ttcagagatc caaaggtgtt ctggtatgaa ccttctcaaa aatggattat gacggctgcc 540 aaatcacaag actacaaaat tgaaatttac tcctctgatg acttgaagtc ctggaagcta 600 gaatctgcat ttgccaacga aggtttctta ggctaccaat acgaatgtcc aggtttgatt 660 gaagtcccaa ctgagcaaga tccttccaaa tcttattggg tcatgtttat ttctatcaac 720 ccaggtgcac ctgctggcgg ttccttcaac caatattttg ttggatcctt caatggtact 780 cattttgaag cgtttgacaa tcaatctaga gtggtagatt ttggtaagga ctactatgcc 840 ttgcaaactt tcttcaacac tgacccaacc tacggttcag cattaggtat tgcctgggct 900 tcaaactggg agtacagtgc ctttgtccca actaacccat ggagatcatc catgtctttg 960 gtccgcaagt tttctttgaa cactgaatat caagctaatc cagagactga attgatcaat 1020 ttgaaagccg aaccaatatt gaacattagt aatgctggtc cctggtctcg ttttgctact 1080 aacacaactc taactaaggc caattcttac aatgtcgatt tgagcaactc gactggtacc 1140 ctagagtttg agttggttta cgctgttaac accacacaaa ccatatccaa atccgtcttt 1200 gccgacttat cactttggtt caagggttta gaagatcctg aagaatattt gagaatgggt 1260 tttgaagtca gtgcttcttc cttctttttg gaccgtggta actctaaggt caagtttgtc 1320 aaggagaacc catatttcac aaacagaatg tctgtcaaca accaaccatt caagtctgag 1380 aacgacctaa gttactataa agtgtacggc ctactggatc aaaacatctt ggaattgtac 1440 ttcaacgatg gagatgtggt ttctacaaat acctacttca tgaccaccgg taacgctcta 1500 ggatctgtga acatgaccac tggtgtcgat aatttgttct acattgacaa gttccaagta 1560 agggaagtaa aatagcgtac g 1581

Claims (15)

  1. 수크로스 인버타아제(invertase) 활성을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 외인성 폴리뉴클레오티드를 포함하며,
    (a) 상기 폴리펩티드는 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 폴리펩티드 서열에 융합된 시그널(signal) 서열을 포함하고;
    (b) 상기 시그널 서열은
    (i) Xpr2 프리(pre)/프로(pro)-영역 및 N-말단 Xpr2 단편; 및
    (ii) 제2 아미노산이 임의의 소수성 아미노산일 수 있는 수크로스 인버타아제 시그널 서열
    로 이루어진 군으로부터 선택되며;
    (c) 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 상기 폴리펩티드 서열은, 서열 번호 4의 서열과 비교할 때, CLUSTALW 정렬법을 기반으로 할 경우 서열 동일성이 80% 이상인 형질전환된 야로위아 리포라이티카(Yarrowia lipolytica).
  2. 제1항에 있어서, 수크로스 인버타아제 시그널 서열의 상기 제2 아미노산은 류신, 페닐알라닌, 아이소류신, 발린 및 메티오닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  3. 제1항에 있어서, 성숙 수크로스 인버타아제를 코딩하는 상기 폴리펩티드 서열은 서열 번호 4에 기술되어 있는 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  4. 제1항에 있어서, 상기 Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편은 야로위아 리포라이티카로부터 유래되고, 상기 수크로스 인버타아제 시그널 서열은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae )로부터 유래된 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  5. 제4항에 있어서, 상기 Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편은
    (a) 알칼리성 세포외 프로테아제 전구체의 N-말단의 157개 아미노산을 포함하는 Xpr2 프리/프로-영역; 및
    (b) 성숙 알칼리성 세포외 프로테아제의 N-말단의 13개 아미노산을 포함하는 N-말단 Xpr2 단편을 포함하는 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  6. 제5항에 있어서, 상기 Xpr2 프리/프로-영역 및 N-말단 Xpr2 단편은 서열 번호 10에 기술되어 있는 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  7. 제4항에 있어서, 상기 수크로스 인버타아제 시그널 서열은 서열 번호 8에 기술되어 있는 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  8. 제1항에 있어서, 수크로스 인버타아제 코딩 서열에 융합된 시그널 서열을 포함하는 상기 폴리펩티드는 서열 번호 12의 서열 및 서열 번호 20의 서열로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  9. 제1항에 있어서, 수크로스가 유일한 탄소 공급원인 조건 하에서 성장할 수 있는 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  10. 제1항에 있어서, 관심대상의 적어도 하나의 비천연 생성물을 생성할 수 있는 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  11. 제10항에 있어서, 관심대상의 상기 적어도 하나의 비천연 생성물은 다중불포화 지방산, 카로티노이드, 아미노산, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 유기 산, 폴리올 및 하이드록시에스테르, 퀴논-유도된 화합물 및 레스베라트롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  12. 제1항 또는 제10항에 있어서, 80% 이상의 수크로스 인버타아제를 세포외로 분비할 수 있는, 탄소 공급원으로서 적어도 수크로스를 갖는 배양 배지에서 성장된 형질전환된 야로위아 리포라이티카.
  13. a) 수크로스; 및
    b) 글루코스
    로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 탄소 공급원을 갖는 배양 배지에서 제10항의 형질전환된 야로위아 리포라이티카를 성장시키고,
    이에 의해 관심대상의 적어도 하나의 비천연 생성물을 생성하는 단계와, 선택적으로, 관심대상의 상기 적어도 하나의 비천연 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 관심대상의 적어도 하나의 비천연 생성물을 생성하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 관심대상의 상기 적어도 하나의 비천연 생성물은 다중불포화 지방산, 카로티노이드, 아미노산, 비타민, 스테롤, 플라보노이드, 유기 산, 폴리올 및 하이드록시에스테르, 퀴논-유도된 화합물 및 레스베라트롤로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 형질전환된 야로위아 리포라이티카는 80% 이상의 수크로스 인버타아제를 세포외로 분비할 수 있는 방법.
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