KR20140010096A - Ｐｅｔ 트레이서로서 방사능표지된 옥트레오테이트 유사체 - Google Patents

Ｐｅｔ 트레이서로서 방사능표지된 옥트레오테이트 유사체 Download PDF

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줄리어스 레이톤
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앨랜 커스버트슨
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지이 헬쓰케어 리미티드
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Abstract

본 발명은 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화를 위한 신규한 방사성트레이서(들)에 관한 것이다. 신경내분비 종양의 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화를 위한 신규한 방사성트레이서(들)가 기재되어 있다. 보다 구체적으로, 본 발명은 신규한 [18F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 유사체; 특히 위장관췌장 신경내분비 종양의 세포 표면에 존재하는 소마토스타틴 수용체를 표적화하는 것에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 중간체(들), 전구체(들), 제약 조성물(들), 제조 방법 및 신규한 방사성트레이서(들)의 사용 방법에 관한 것이다.

Description

ＰＥＴ 트레이서로서 방사능표지된 옥트레오테이트 유사체{RADIOLABELLED OCTREOTATE ANALOGUES AS PET TRACERS}
본 발명은 양전자 방출 단층촬영(PET) 영상화를 위한 신규한 방사성트레이서(들); 구체적으로 위장관췌장 신경내분비 종양을 비롯한 신경내분비 종양의 영상화에 관한 것이다. 구체적으로 본 발명은 신규한 [18F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 유사체에 관한 것이다. 본 발명의 방사성트레이서는 위장관췌장 신경내분비 종양의 세포 표면에 존재하는 소마토스타틴 수용체를 표적화할 수 있다. 본 발명은 또한 중간체(들), 전구체(들), 제약 조성물(들), 제조 방법 및 신규한 방사성트레이서(들)의 사용 방법에 관한 것이다.
PET는 종양학 및 신경학에서의 질환의 조기 검출에 대한 중요성이 점차로 증가되고 있다. 방사능표지된 펩티드는 특히 질환의 검출, 치료의 모니터링에 대하여 그리고 펩티드 수용체 방사선요법(PRRT)에서 보다 자주 연구되고 있다(문헌([Chen, X. Y., et al., European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2004, 31, (8), 1081-1089]; [Lei, M., et al., Current Medical Imaging Reviews 6, (1), 33-41])).
펩티드 [Tyr3]옥트레오테이트(TOCA)(도 1)는 이전에 영상화([Nikolopoulou, A., et al., Journal of Peptide Science 2006, 12, 124-131]; [Li, W. P., et al., Bioconjugate Chemistry 2002, 13, 721-728]; [Reubi, J. C., et al., European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2000, 27, (3), 273-282]) 및 신경내분비 종양의 PRRT([Teunissen, J., et al., European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2009, 36, (11), 1758-1766])를 위하여 각종 방사성동위원소로 표지되었다. [Tyr3] 옥트레오테이트는 소마토스타틴보다 더 긴 생물학적 반감기(1.5-2 시간)를 가지며 수용체 특이성을 보유하는 소마토스타틴 유사체이다(문헌[Weiner, R. E., et al., Seminars in Nuclear Medicine 2001, 31, (4), 296-311]). 5종의 서브타입(sstr 1-5)이 존재하는 소마토스타틴 수용체는 신경내분비 종양의 표면에서 과발현되는 것으로 밝혀졌다(문헌[Rufini, V., et al., Seminars in Nuclear Medicine 2006, 36, (3), 228-247]). 이러한 과발현은 방사능표지된 옥트레오테이트 유사체를 사용하여 종양을 선택적으로 표적화할 수 있다. 소마토스타틴을 모사하기 위하여 최초로 발견된 8종의 아미노산 서열화 펩티드는 옥트레오티드이었다. 고리형 옥타펩티드는 소마토스타틴 수용체에 결합하기 위한 중요한 부위를 함유하며 급성 및 만성 췌장염[Uhl, W., et al., Digestion, International Journal of Gastroenterology 1999, 60, 23-31]과 같은 고통스러운 병태의 치료를 위하여 아편제 길항물질[Maurer, R., et al., PNAS 1982, 79, 4815-4817]로서 초기에 사용되었던 것으로 밝혀졌다. 옥트레오티드와 [Tyr3]옥트레오테이트를 비교하면, 후자는 소마토스타틴 수용체에 대한 더 높은 친화성을 갖는 것으로 밝혀졌으며([Reubi, J. C., et al., European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2000, 27, (3), 273-282]; [Wild, R., et al., European Journal of Nuclear Medicine and Molecular Imaging 2003, 30, (10), 1338-1347]); C-말단에서 티로신 대신에 페닐알라닌으로 그리고 트레오닌 대신에 트레오니놀을 치환시키는 것은 친화성을 증가시키는 것으로 나타났다. 그럼에도 불구하고, [111In]-DTPA-옥트레오티드(옥트레오스캔(Octreoscan)™)는 임상에서 여전히 선택되고 있는 펩티드이며 1994년에 소마토스타틴 수용체 양성 신경내분비 종양에 대한 조영제로서 FDA가 승인하였다(문헌[Rufini, V., et al., Seminars in Nuclear Medicine 2006, 36, (3), 228-247]).
보조(prosthetic) 기(즉, 이후에 관심 주요 약물작용발생단에 결합될 수 있는 작은 방사능표지된 유기 분자)를 사용하는 것은 18F-의 제한점, 예컨대 염기성 및 불량한 반응성을 극복하기 위하여 펩티드 또는 기타 거대분자를 표지할 때 일반적으로 사용되는 전략이다(문헌[Okarvi, S. M., European Journal of Nuclear Medicine 2001, 28, (7), 929-38]). 오늘날까지 사용되는 접근법은 모두 관련 단계의 수, 전체 반응 시간, 분리된 수율 및 분리 방법이 서로 다르다. 옥트레오티드는 이미 18F-개질된 유기 보조 기로 표지되었다. 문헌[Hostetler et al., Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals 1999, 42, S720-S721]에 의하여 사용된 초기 전략은 [18F]플루오로벤조산([18F]FBA)의 활성화된 에스테르로 옥트레오티드의 N-말단을 직접 표지시키고자 하는 것이었다. 이후의 생체분포 연구는 [18F]플루오로벤조일-옥트레오티드 유사체의 친유성이 너무 큰 것으로 나타났으며 그리고 간에서의 흡수율이 상당한 것으로 밝혀졌다. 옥트레오티드는 또한 2-[18F]플루오로프로피오네이트 4-니트로페닐에스테르로 N-말단에서 직접 표지되며, 그 자체는 합성을 위한 3가지의 화학적 변형 단계를 포함한다(문헌[Guhlke, S., et al., Applied Radiation and Isotopes 1994, 45, (6), 715-727]). 이러한 화학에 대한 주요 단점은 최종 단계에서 제거를 필요로 하는 공액화 도중에 옥트레오티드의 리신 측쇄를 Boc-보호할 필요성이다(문헌[Guhlke, S., et al., Nuclear Medicine and Biology 1994, 21, (6), 819-825]).
문헌[Schottelius et al., Clinical Cancer Research 2004, 10, (11), 3593-3606]에서는 종래의 유사체에 비하여 개선된 종양 흡수율 및 더 우수한 약물동력학을 갖는 18F-표지된 옥트레오테이트 유사체를 개발하고자 하였다. 저자는 친유성을 감소시키기 위하여 탄수화물 기로 옥트레오테이트를 개질시키고, 그에 따라 간 제거를 감소시키며 반대로 신장 제거를 돕도록 선택하였다. 글루코스 개질된 옥트레오테이트(Gluc-Lys-TOCA)가 개발되었으며, 펩티드의 리신은 2-[18F]플루오로프로피오네이트 4-니트로페닐에스테르로 표지되었다. 최종 생성물 Gluc-Lys([18F]FP)-TOCA는 문헌[Meisetschlager et al., Journal of Nuclear Medicine 2006, 47, 566-573]에 의하여 환자에게서 평가되었으며 그리고 신경내분비 종양의 검출에서 [111In]-DTPA-옥트레오티드보다 더 우수한 것으로 밝혀졌다. 그러나, [111In]-DTPA-옥트레오티드는 종양 흡수율에서 개선을 나타내는 한편, 긴 합성 시간(3 시간) 및 낮은 수율(20-30%)은 통상의 임상적 사용에 대하여서는 실행 불가한 선택이 되게 하였다(문헌[Meisetschlaeger, G., et al., Journal of Nuclear Medicine 2006, 47, 566-573]). 문헌[Schottelius et al., Clinical Cancer Research 2004, 10, (11), 3593-3606]에서는 또한 2종의 기타 탄수화물 유사체인 Cel-S-Dpr-[Tyr3]옥트레오테이트 및 Gluc-S-Dpr[Tyr3]옥트레오테이트를 [18F]플루오로벤즈알데히드로 표지시켜 옥심-유도체화된 방사성트레이서를 생성한다. Cel-S-Dpr([18F]FBOA)-[Tyr3]옥트레오테이트는 Gluc-Lys([18F]FP)-TOCA에 비하여 개선된 종양 흡수율을 나타내며, 개선된 수율(65-85%)로 더 짧은 합성 시간(50 분)을 갖는다. Gluc-S-Dpr[Tyr3]옥트레오테이트는 [18F]플루오로프로피오네이트([18F]FP) 및 [18F]플루오로벤즈알데히드([18F]FBOA) 양자 모두로 표지된다. Gluc-S-Dpr-([18F]FP)-Tyr3]옥트레오테이트 표지된 유사체는 Gluc-Lys([18F]FP)-TOCA와 유사한 종양 흡수율을 나타냈지만, 높은 종양 대 기관 비(혈액, 간 및 근육)를 가졌다. Gluc-S-Dpr-([18F]FBOA)[Tyr3]옥트레오테이트는 Cel-S-Dpr([18F]FBOA)-[Tyr3]옥트레오테이트에 필적하는 종양 흡수율을 나타내지만, 종양/근육비는 높았다.
가장 최근에 발표된 18F-표지된 옥트레오티드 유사체는 [18F]-알루미늄 불소화물-1,4,7-트리아자시클로노난-1,4,7-트리아세트산 옥트레오티드([18F]AlF-NOTA-옥트레오티드)이었다(문헌[Laverman, P., et al., Journal of Nuclear Medicine 51, (3), 454-461]). [18F]알루미늄 불소화물 표지 전략을 사용하는 잇점은 불소-18 공비 건조 단계를 필요로 하지 않는다는 점이며, 이는 전체 반응 시간이 더 짧다는 것을 의미한다. HPLC에 의하면 생성물은 2종의 이성질체로서 관찰되었으며, 이는 약 50%에 해당하는 [18F]AlF의 NOTA 킬레이트로 혼입되었으며, 나머지는 비-킬레이트화 [18F]AlF로서 명시되어 있다. 저자는 2종의 이성질체가 HPLC에 의하여 분리될 수 있다고 언급하였다. 재분석시 저자는 2종의 이성질체로 재-평형화되는 것을 관찰하였다. 이들 2종의 이성질체의 형태는 오늘날까지 규명되지 않았다.
클릭 화학은 종래에 펩티드의 불소-18 표지에서 사용되어 왔다(문헌([Li, Z. B., et al., Bioconjugate Chemistry 2007, (18), 1987-1994]; [Ramenda, T., et al., Chemical Communications 2009, 48, 7521-7523]; [Hausner et al., J. Med. Chem, 2008, 5901]; [Mamat et al., Mini - Rev . Org . Chem. 2009, 6, 21])). 반응은 효율적이므로, 양전자 방출 단층촬영(PET)에 대한 수명이 짧은 동위원소(18F의 반감기 109.7 분)를 사용하여 방사능표지된 트레이서 및 리간드의 합성에 적용 가능하다(문헌([ Glaser, M., and Arstad, E., Bioconjugate Chemistry 2007, 18, (3), 989-993]; [Glaser, M., et al., Journal of Labelled Compounds & Radiopharmaceuticals 2009, 52, (9-10), 407-414])).
문헌[Marik and Sutcliffe, Marik, J., et al., Tetrahedron Letters 2006, (47), 6681-6684]은 말단 알킨을 불소-18로 표지하고 그리고 아지드 부분을 각종 펩티드에 첨가하는 접근법을 택하였다. CuSO4/Na-아스코르베이트는 초기에는 촉매계로서 사용되었으나, 표지된 펩티드는 10% 수율로만 분리되었다. N,N-디이소프로필에틸아민(DIPEA)의 첨가와 함께 CuSO4를 CuI로 대체할 경우 개선이 관찰되었다. 문헌[Sirion et al., Tetrahedron Letters 2007, 48, 3953-3957]에서는 CuI의 사용이 미량의 1,5-치환된 트리아졸 부산물을 산출한다는 것을 발견하였다. 저자는 2개의 아세틸렌 및 2개의 아지드 모두가 용매로서 tBuOH를 사용하고 그리고 [18F]TBAF를 사용하여 표지화된 4종의 메실레이트 전구체를 합성하였다(문헌[Kim, D. W., et al., Journal of the American Chemical Society 2006, 128, 16394-16397]).
그러나, 이미 표지된 유사체에 비하여 개선된 종양 흡수율 및 약물동력학적 변수를 갖는 방사능표지된 옥트레오테이트 유사체에 대한 수요가 당업계에 여전히 존재한다. 또한, 그러한 방사능표지된 옥트레오테이트 유사체를 제조하기 위한 효율적이며 그리고 효과적인 방법에 대한 수요가 존재한다. 본 발명은 하기 기재한 바와 같이 이들 수요에 대한 답이 된다.
도 1은 펩티드 [Tyr3]옥트레오테이트(TOCA), 5종의 알킨(1a-5a) 및 트리아졸(1b-5b) 옥트레오테이트 유사체 및 스크램블 음성 대조군 알킨(6a) 및 트리아졸(6b)을 도시한다.
도 1a는 형성된 부산물 11 및 12를 나타내는 5b를 합성하기 위한 반응 혼합물의 준-분취용 HPLC 트레이스를 도시한다. 루나(Luna) C18 100×10 ㎜ 5 ㎛, 구배 25-50% MeCN/H2O 0.1% TFA를 사용한 준-분취용 HPLC. 상부 트레이스: 방사능 채널 5b(정체 시간 16.05 분). 바닥 트레이스: UV 채널, λ 254 ㎚, 2종의 부산물 12(정체 시간 14.27 분) 및 11(정체 시간 17.06 분).
도 2는 페노메넥스 루나(Phenomenex Luna) C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 15 분에 걸쳐 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 실시한 FET-G-PEG-TOCA(1b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 3은 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 15 분에 걸쳐 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 실시한 FETE-PEG-TOCA(2b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 4는 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 15 분에 걸쳐 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 실시한 FET-G-TOCA(3b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 5는 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 15 분에 걸쳐 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 실시한 FETE-TOCA(4b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 6은 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 15 분에 걸쳐 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 실시한 FET-βAG-TOCA(5b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 7은 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 15 분에 걸쳐 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 실시한 FET-βAG-[W-c(CTFTYC)K](6b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 8은 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 15 분에 걸쳐 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 실시한 [19F]-표준물질로 스파이크 처리한 FET-G-PEG-TOCA(1b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 9는 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 15 분에 걸쳐 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 [19F]-표준물질로 스파이크 처리한 FETE-PEG-TOCA(2b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 10은 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 15 분에 걸쳐 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 실시한 [19F]-표준물질로 스파이크 처리한 FET-G-TOCA(3b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 11은 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 15 분에 걸쳐 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 실시한 [19F]-표준물질로 스파이크 처리한 FETE-TOCA(4b)의 HPLC 분석을 도시한다. 이러한 유사체는 >1 개월 동안 수용액 중에서의 보관으로 인하여 분해 초과시간의 징후, 여기서는 2개의 피크를 나타내는 것으로 보인다. 초기 형성시 [19F]FETE-TOCA는 1개의 피크 단독으로 보였다.
도 12는 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 15 분에 걸쳐 실시한 [19F]-표준물질로 스파이크 처리한 FET-βAG-TOCA(5b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 13은 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)을 사용하여 5-80% ACN/0.1% TFA의 구배를 사용하여 15 분에 걸쳐 [19F]-표준물질로 스파이크 처리한 FET-βAG-[W-c(CTFTYC)K](6b)의 HPLC 분석을 도시한다.
도 14는 칼슘 플럭스 형광광도 영상화 평판 판독기(FLIPR) 분석(실시예 참고)을 사용하여 측정한 소마토스타틴 수용체 서브타입 sstr-2, 3 및 4에 대한 각종 [18F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 유사체의 친화도 프로파일을 도시한다. 칼슘 염료로 예비로딩된 sstr-2, 3 또는 4-발현 세포에서의 [18F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 유사체에 의한 칼슘 플럭스의 활성화는 상이한 농도에서 평가하였으며; 분석은 2회 실시하였다. 형광 출력을 측정하였으며, 데이타는 최대값의 % 형광 시그날로 나타냈다. 각종 작용물질 리간드에 대한 최대값의 반치 수용체 활성화를 요약한다. ND = 활성의 결여로 인하여 측정하지 않음.
도 15는 [18F]-FET-βAG-TOCA의 방사성HPLC 크로마토그래피를 도시한다. (a) 8.47 분에서의 분석물 정체 시간을 나타내는 기준 표준물질 및 (b) 안정한 방사성트레이서를 나타내는, 마우스에게 방사성트레이서를 주사후 30 분에 얻은 통상의 혈장 추출물.
도 16은 AR42J 종양을 갖는 마우스의 종양, 신장 및 방광에서 (a) [18F]-FET-βAG-TOCA 및 (b) 스크램블 펩티드 FET-βAG-[W-c-(CTFTYC)K]의 국소화를 나타내는 PET-CT 화상을 도시한다. 횡 및 시상 정적(30-60 분 융합됨; 0.5 ㎜ 슬라이스) 화상을 도시한다.
도 17은 AR42J 종양, 신장, 간, 근육 및 소변에서 [18F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 유사체의 조직 약물동력학을 비교하는 시간 활성 곡선을 도시한다. 동적 PET/CT 영상화는 종양을 갖는 마우스에서 각각의 방사성트레이서의 정맥내 주사후 60 분 동안 실시하였다. 명확히 하기 위하여, 간 곡선은 확대하였다(줌). 조직 방사성트레이서 흡수값은 조직의 1 ㎖당 주사된 투약량(%)으로서 나타낸다. 수치는 평균±SEM(n=3-5)을 나타내며; 명확히 나타내기 위하여 상부 및 하부 바아를 사용한다. 부호는 (□) FET-G-PEG-TOCA, (○) FETE-PEG-TOCA, (●) FET-βAG-TOCA, (■) FET-G-TOCA 및 (▲) FETE-TOCA이다.
도 18은 AR42J 이종이식 모델에서의 FET-βAG-TOCA 국소화의 특이성을 도시한다. [18F]-FET-βAG-TOCA의 역학 및 과잉의 저온 비표지된 옥트레오티드를 사용한 포화 수용체 결합 부위의 효과를 도시한다. 차단 실험은 [18F]-FET-βAG-TOCA의 정맥내 주사 10 분전 옥트레오티드(10 ㎎/㎏; i.v.)를 주사하여 실시하였다. 동적 영상화는 60 분에 걸쳐 실시하였다. 조직 방사성트레이서 흡수값은 조직 1 ㎖당 주사 용량%)으로 나타낸다. 그래프는 또한 동일한 마우스 모델에서 스크램블 펩티드, FET-βAG-[W-c-(CTFTYC)K]의 약물동력학을 예시한다. 수치는 평균±SEM(n=3-5)을 나타내며; 명확히 나타내기 위하여 상부 및 하부 바아를 사용한다. 부호는 (●) 옥트레오티드 나이브(naive) 마우스에서의 FET-βAG-TOCA, (▲) 10 ㎎/㎏ 비표지된 옥트레오티드를 예비투약한 마우스에서의 FET-βAG-TOCA 및 (■) 옥트레오티드 나이브 마우스에서의 FET-βAG-[W-c-(CTFTYC)K].
발명의 개요
본 발명은 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)를 제공한다.
본 발명은 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)를 제공한다. 본 발명의 화합물은 고 콘트라스트 PET 영상화를 위하여 높은 특이적 결합과 신속한 표적 국소화 및 신속한 약물동태학을 조합한다.
본 발명은 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)를 사용한 영상화 방법을 제공한다.
본 발명은 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들) 및 그의 제조 방법을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 1종 이상의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체와 함께 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 생체적합성 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들) 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는 소마토스타틴 수용체의 시험관내 또는 생체내 검출 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들) 또는 그의 제약 조성물을 사용한 시험관내 또는 생체내 소마토스타틴 수용체의 검출 방법을 추가로 제공한다.
본 발명은 하기 화학식 I의 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 I>
R1-링커-R2
(상기 화학식에서,
R1은
Figure pct00001
이고, 여기서 Y는 1종 이상의 방사성동위원소를 함유하는 리포터 부분이며;
R2는
Figure pct00002
의 구조를 가지며;
링커는 WO2008139207에 기재된 바와 같은 링커 기 또는 화학식 -(A)m-의 합성 링커 기이고, 여기서 각각의 A는 독립적으로 -CRr, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, C4-C8 시클로헤테로알킬렌 기, C4-C8 시클로알킬렌 기, C5-C12 아릴렌 기 또는 C3-C12 헤테로아릴렌 기, 아미노산, 당 또는 단분산 폴리에틸렌글리콜(PEG) 빌딩 블록이고; 각각의 R은 H, C1-C20 알킬, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, C1-C4 알콕시 C1-C20 알킬 또는 히드록시C1-C20 알킬로부터 독립적으로 선택되며; m은 1 내지 20의 정수값임).
본 발명에 의하면, 리포터 부분 Y의 방사성동위원소는 당분야에서 공지된 임의의 방사성동위원소일 수 있다. 하나의 실시양태에서, 방사성동위원소는 당분야에서 공지된 임의의 PET 방사성동위원소(예, 18F, 17Br, 76Br, 124I, 11C, 82Rb, 68Ga, 64Cu 및 62Cu; 바람직하게는 11C 또는 18F; 가장 바람직하게는 18F)이다. 하나의 실시양태에서, 방사성동위원소는 당분야에 공지된 임의의 SPECT 방사성동위원소(예, 123I, 124I, 131I)이다. 방사성동위원소는 리포터 부분 Y에 직접 혼입될 수 있거나(예,-CH2CH2 18F 또는 -CH2CH2 11CH2F) 또는 당분야에서 공지된 방법에 의하여 킬레이트화제에 혼입될 수 있다(예를 들면 WO 2006/067376 참조).
본 발명은 하기 화학식 II의 2-플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 II>
R1-링커-R2
(상기 화학식에서,
R1은
Figure pct00003
이고; 여기서 X는 상기 기재된 바와 같은 방사성동위원소이며, 링커 및 R2는 각각 화학식 I에 대하여 기재된 바와 같음).
본 발명은 하기 화학식 III의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 III>
R1-링커-R2
(상기 화학식에서,
R1은
Figure pct00004
이고;
R2는
Figure pct00005
의 구조를 가지며;
링커는 WO2008139207에 기재된 바와 같은 링커 기 또는 화학식 -(A)m-의 합성 링커 기이고, 여기서 각각의 A는 독립적으로 -CRr, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, C4-C8 시클로헤테로알킬렌 기, C4-C8 시클로알킬렌 기, C5-C12 아릴렌 기 또는 C3-C12 헤테로아릴렌 기, 아미노산, 당 또는 단분산 폴리에틸렌글리콜(PEG) 빌딩 블록이며; 각각의 R은 H, C1-C20 알킬, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, C1-C4 알콕시 C1-C20 알킬 또는 히드록시C1-C20 알킬로부터 독립적으로 선택되며; m은 1 내지 20의 정수값임).
본 발명은 각각 상기 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II 및/또는 화학식 III의 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공하며, 여기서 R1 및 R2 는 각각 화학식 I, 화학식 II 및/또는 화학식 III에 대하여 상기 기재된 바와 같으며, 링커는
-(폴리에틸렌 글리콜)n-;
Figure pct00006
;
Figure pct00007
;
Figure pct00008
;
Figure pct00009
; 또는
Figure pct00010
이고;
여기서 n은 1-20의 정수이며; 바람직하게는 n은 1-10의 정수이며; 더욱 바람직하게는 n은 1-6의 정수이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 각각 상기 기재된 바와 같은 화학식 I, 화학식 II 및 화학식 III의 R2 화합물은
Figure pct00011
이다.
본 발명은 하기 화학식 1b의 FET-G-PEG-TOCA인 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 1b>
Figure pct00012
(상기 화학식에서,
R1은
Figure pct00013
이고;
R2는
Figure pct00014
의 구조를 가지며;
바람직하게는 R2는
Figure pct00015
의 구조를 갖는다.
본 발명은 하기 화학식 2b의 FETE-PEG-TOCA인 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 2b>
Figure pct00016
(상기 화학식에서, R1 및 R2는 각각 화학식 1b의 화합물에 대하여 상기 기재된 바와 같음).
본 발명은 하기 화학식 3b의 FET-G-TOCA인 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 3b>
Figure pct00017
(상기 화학식에서, R1 및 R2는 각각 화학식 1b의 화합물에 대하여 상기 기재된 바와 같음).
본 발명은 하기 화학식 4b의 FETE-TOCA인 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 4b>
Figure pct00018
(상기 화학식에서, R1 및 R2는 각각 화학식 1b의 화합물에 대하여 상기 기재된 바와 같음).
본 발명은 하기 화학식 5b의 FET-βAG-TOCA인 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 5b>
Figure pct00019
(상기 화학식에서, R1 및 R2는 각각 화학식 1b의 화합물에 대하여 상기 기재된 바와 같음).
본 발명은 하기 화학식 7b의 FET-βAG-[W-c-(CTFTYC)K]인 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 7b>
Figure pct00020
(상기 화학식에서, R1은 화학식 1b의 화합물에 대하여 상기 기재된 바와 같으며, R3은
Figure pct00021
이며;
바람직하게는 R3은
Figure pct00022
의 구조를 가짐).
제약 또는 방사선제약 조성물
본 발명은 본원에 기재한 바와 같은 본 발명의 1종 이상의 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체 또는 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체와 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 생체적합성 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명은 본원에 기재한 바와 같은 본 발명의 1종 이상의 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체 또는 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체와 포유류 투여에 적절한 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 생체적합성 담체를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
당업자가 이해하고 있는 바와 같이, 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 생체적합성 담체는 당분야에 공지된 임의의 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 생체적합성 담체일 수 있다.
"제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 생체적합성 담체"는, 제약 조성물이 생리학적으로 견딜 수 있으며, 예를 들면 독성 또는 지나친 불편 없이 포유동물의 신체에 투여될 수 있도록 본 발명의 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체 또는 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체가 현탁 또는 용해될 수 있는 임의의 유체, 특히 액체가 될 수 있다. 생체적합성 담체는 적절하게는 주사 가능한 담체 액체, 예컨대 주사용 멸균 발열성물질 제거 수; 수용액, 예컨대 염수(주사용 최종 생성물이 등장성 또는 비등장성이 되도록 균형을 이룰 수 있는 것이 이로움); 1종 이상의 장력 조절 물질(예, 혈장 양이온과 생체적합성 반대이온의 염), 당(예, 글루코스 또는 수크로스), 당 알콜(예, 소르비톨 또는 만니톨), 글리콜(예, 글리세롤) 또는 기타 비이온성 폴리올 물질(예, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌 글리콜 등)의 수용액이다. 생체적합성 담체는 또한 생체적합성 유기 용매, 예컨대 에탄올을 포함할 수 있다. 그러한 유기 용매는 친유성이 더 큰 화합물 또는 제제를 가용화시키는데 유용하다. 생체적합성 담체로는 주사용 발열성물질 제거 수, 등장성 염수 또는 에탄올 수용액이 바람직하다. 정맥내 주사용 생체적합성 담체의 pH는 4.0 내지 10.5 범위내인 것이 적절하다.
본 발명의 제약 조성물은 비경구, 즉 주사에 의하여 투여될 수 있으며, 수용액인 것이 가장 바람직하다. 상기 조성물은 추가의 성분, 예컨대 완충제; 제약상 허용되는 가용화제(예, 시클로덱스트린 또는 계면활성제, 예컨대 플루로닉(Pluronic), 트윈(Tween) 또는 인지질); 제약상 허용되는 안정화제 또는 산화방지제(예컨대 아스코르브산, 겐티스산 또는 파라-아미노벤조산)을 임의로 함유할 수 있다. 본 발명의 제약 조성물의 제조 방법은 방사능표지된 화합물을 포함하는 제약 조성물을 얻는데 필요한 단계, 예를 들면 유기 용매의 제거, 생체적합성 완충제 및 임의의 선택적인 추가의 성분의 첨가를 더 포함할 수 있다. 비경구 투여의 경우, 본 발명의 제약 조성물은 무균 및 비발열성인 것을 확인하는 단계를 실시하여야만 한다. 그러한 단계는 당업자에게 주지되어 있다.
중간체
본 발명은 하기 화학식 IV의 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 IV>
R1-링커-R2
(상기 화학식에서,
R1은
Figure pct00023
이고;
R2는
Figure pct00024
의 구조를 가지며;
링커는 WO2008139207에 기재된 바와 같은 링커 기 또는 화학식 -(A)m-의 합성 링커 기이고, 여기서 각각의 A는 독립적으로 -CRr, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, C4-C8 시클로헤테로알킬렌 기, C4-C8 시클로알킬렌 기, C5-C12 아릴렌 기 또는 C3-C12 헤테로아릴렌 기, 아미노산, 당 또는 단분산 폴리에틸렌글리콜(PEG) 빌딩 블록이고; 각각의 R은 H, C1-C20 알킬, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, C1-C4 알콕시 C1-C20 알킬 또는 히드록시C1-C20 알킬로부터 독립적으로 선택되며; m은 1 내지 20의 정수값임).
본 발명은 상기 기재된 바와 같은 화학식 IV의 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공하며, 여기서 R1 및 R2는 각각 화학식 IV에 대하여 상기 기재된 바와 같으며, 링커는
-(폴리에틸렌 글리콜)n-;
Figure pct00025
;
Figure pct00026
;
Figure pct00027
;
Figure pct00028
; 또는
Figure pct00029
이고;
여기서 n은 1-20의 정수이며; 바람직하게는 n은 1-10의 정수이며; 더욱 바람직하게는 n은 1-6의 정수이다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 상기 기재된 바와 같은 화학식 IV의 R2 화합물은
Figure pct00030
이다.
본 발명은 하기 화학식 1a의 G-PEG-TOCA인 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 1a>
Figure pct00031
(상기 화학식에서,
R1은
Figure pct00032
이고;
R2는
Figure pct00033
의 구조를 가지며;
바람직하게는 R2는
Figure pct00034
의 구조를 가짐).
본 발명은 하기 화학식 2a의 E-PEG-TOCA인 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 2a>
Figure pct00035
(상기 화학식에서, R1 및 R2는 화학식 1a의 화합물에 대하여 상기 기재된 바와 같음).
본 발명은 하기 화학식 3a의 G-TOCA인 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 3a>
Figure pct00036
(상기 화학식에서, R1 및 R2는 화학식 1a의 화합물에 대하여 상기 기재된 바와 같음).
본 발명은 하기 화학식 4a의 E-TOCA인 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 4a>
Figure pct00037
(상기 화학식에서, R1 및 R2는 화학식 1a의 화합물에 대하여 상기 기재된 바와 같음).
본 발명은 하기 화학식 5a의 βAG-TOCA인 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 5a>
Figure pct00038
(상기 화학식에서, R1 및 R2는 화학식 1a의 화합물에 대하여 상기 기재된 바와 같음).
본 발명은 하기 화학식 6a의 βAG-[W-c-(CTFTYC)K]인 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 제공한다:
<화학식 6a>
Figure pct00039
(상기 화학식에서, R1은 화학식 1a의 화합물에 대하여 상기 기재된 바와 같으며, R3은
Figure pct00040
임).
합성
본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들) 및 본 발명의 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)는 당분야에 공지된 방법(WO2010/026388, 본원에 그 전문이 참고로 포함됨) 및 하기 예시된 방법에 의하여 생성될 수 있다
본원에 기재한 바와 같은 PET 방사성동위원소(즉, 임의의 양전자-방출 방사성동위원소)의 투입은 트리아졸 부분의 형성 이전에 또는 트리아졸 부분의 형성 이후에 당분야에서 공지된 임의의 방법(예, WO 2010/026388)에 의하여 화학식 I, 화학식 II, 화학식 III의 화합물 및 2-플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체로 투입될 수 있다. SPECT 방사성동위원소는 마찬가지의 방식으로 각각 본원에 기재된 바와 같이 화학식 I 또는 화학식 II의 분자에 투입될 수 있다.
본 발명에 의하면, 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)의 제조 방법은 각각 본원에 기재한 바와 같이 구리 촉매화된 클릭 화학 조건하에서 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)를 2-[18F]플루오로에틸아지드와 반응시켜 해당 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 형성하는 단계를 포함한다.
본 발명의 하나의 실시양태에서, 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체의 합성은 자동화된다. [18F]-방사성트레이서는 자동화된 방사성합성 장치에 의하여 자동화된 방식으로 간편하게 생성될 수 있다. 트레이서랩(Tracerlab)™ 및 패스트랩(FASTlab)™(모두 지이 헬쓰케어 리미티드(GE Healthcare Ltd.))을 비롯한 장치의 여러 시판중인 예가 존재한다. 그러한 장치는, 통상적으로 종종 일회용이며, 방사성화학이 실시되며, 방사성합성을 실시하기 위하여 장치에 장착되는 "카세트"를 포함한다. 카세트는 통상적으로 유체 경로, 반응 용기 및 시약 바이알을 수용하기 위한 포트뿐 아니라, 후-방사성합성 세정 단계에 사용되는 임의의 고체상 추출 카트리지를 포함한다.
그러므로, 본 발명은 또다른 구체예에서 하기를 포함하는 본원에서 정의된 바와 같은 PET 방사성트레이서의 자동화된 합성을 위한 카세트가 제공된다:
(i) 본원에서 기재된 바와 같이 알킨-결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 함유하는 용기; 및
(ii) 용기 (iii)의 알킨-결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체와의 클릭 화학 반응을 실시할 수 있는 아지드(예, MeCN, DMSO 또는 DMF의 용액 중의 토실에틸 아지드)를 함유하는 용기;
(iii) 상기 용기 (ii)의 내용물을 적절한 18F의 적절한 공급원으로의 첨가.
본 발명에 의하면, 본 발명의 카세트는 임의로 하기 중 하나 이상을 임의로 더 포함할 수 있다:
(iv) QMA 카트리지;
(v) K222, MeCN, 물 및 염기(예, TBAHCO3, K2CO3, Cs2CO3)로 이루어진 포획된 불소-18를 방출시키기 위한 QMA 용리제;
(vi) 구리 촉매(예, 구리(I) 촉매; 수용액 중의 황산구리)를 함유하는 용기;
(vii) Na-아스코르베이트(바람직하게는 pH 5.0에서 아세트산나트륨 완충액 중의)를 함유하는 용기;
(viii) 구리(I) 안정화 리간드(예, BPDS)를 함유하는 용기;
(ix) HPLC 시스템으로 연결되는 라인; 및
(ix) 과잉의 18F의 제거를 위한 이온-교환 카트리지.
실시예
시약 및 용매는 시그마-알드리치 컴파니, 리미티드(Sigma-Aldrich Co. Ltd.)(영국 질링엄 소재) 및 VWR 인터내셔날 리미티드 유케이(VWR International Ltd UK)가 시판하며, 추가로 정제하지 않고 사용하였다. BPDS(9)는 미국 웨스트버리에 소재하는 팔츠 앤 바우어 인코포레이티드(Pfaltz & Bauer Inc.)가 시판한다. [18F]-AIF-NOTA는 문헌[Laverman P, et al., J Nucl Med . 2010; 51:454-461]에 의하여 합성하였다. [68Ga]-DOTATATE는 고비디엔 (유케이) 커머셜 리미티드(Covidien (UK) Commercial Ltd.)(영국 고스포트 소재)가 시판하였다.
MALDI-TOF는 런던 약학 대학원(The London School of Pharmacy)에서 피니간 레이저매트(Finnigan Lasermat) 2000 기기로 측정하였다. 분석용 HPLC는 카라트(Karat)32 소프트웨어 또는 로라(Laura) 소프트웨어가 있는 벡맨 골드(Beckman Gold) 기기를 사용하여 실시하였다. 방사성 HPLC 시스템은 γ 검출기(바이오스캔 플로우-계수(Bioscan Flow-count))가 장착된 벡맨 시스템 골드 기기이었다. 페노메넥스 루나 C18(2) 컬럼(50×4.6 ㎜, 3 ㎛; 유속 1 ㎖/분)은 분석용 HPLC에 사용하였다. 준-분취용 컬럼(페노메넥스 루나 C18, 100×10 ㎜, 5㎛, 110A; 유속 3 ㎖/분)은 펩티드의 최종 정제에 사용하였다. 하기 이동상 시스템은 분석용 HPLC: 용매 A, 물/TFA(0.1%); 용매 B, 아세토니트릴/TFA(0.1%); 15 분에 걸쳐서 5-80% 용매 ACN/0.1% TFA의 선형 구배에 사용하였다. 분취용 HPLC(아질런트(Agilent) 1200, 컬럼 페노메넥스 루나 C18(2), 75×30 ㎜, 5 ㎛, 유속 15 ㎖/분)를 사용하여 비-방사성 화합물을 정제하였다. log D 계산을 위한 샘플을 분리하기 위하여, MSE 마이크로 센토르(Micro Centaur) 원심분리 장치를 사용하였으며, 월락(Wallac) 1282 컴푸감마 유니버셜(Compugamma Universal) 감마 계수기를 사용하여 감마 계수를 실시하였으며, 결과는 EdenTerm v1.2 소프트웨어를 사용하여 기록하였다. [18F]불소화물은 농축 [18O]H2O 표적의 16.4 MeV 양성자 조사로 18O(p,n)18F 핵 반응을 사용하는 시클로트론(PET 트레이스, 지이 메디칼 시스템즈(GE Medical systems))에 의하여 생성하였다.
약어:
ACN: 아세토니트릴
DCM: 디클로로메탄
DIPEA: 디이소프로필에틸아민
Fmoc: 9-플루오레닐메틸옥시카르보닐
HBTU: O-벤조트리아졸-1-일-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트
HOBt: 1-히드록시벤조트리아졸
NMP: 1-메틸-2-피롤리디논
PyBOP: (벤조트리아졸-1-일옥시)트리피롤리디노포스포늄 헥사플루오로포스페이트
SASRIN: 초강산 민감성 수지
TFA: 트리플루오로아세트산
TIS: 트리이소프로필실란
실시예 1
[ 19 F]플루오로에틸 트리아졸 펩티드 표준물질의 합성을 위한 일반적인 방법
(a) 구리 분말(20 ㎎, -40 메쉬)이 들어 있는 휘톤(Wheaton) 바이알에 DMF/H2O의 용액(1:1 v/v(60 ㎕)) 중의 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(알킨-펩티드)(5 ㎎)를 첨가하였다. 이에 [19F]플루오로에틸 아지드(1.5 eq, DMF 중의 0.354 M)를 첨가하였다(문헌[Glaser, M.; and Arstad, E., Bioconjugate Chemistry 2007, 18, (3), 989-993]). 반응을 실온에서 30 분 동안 교반되도록 한 후, 아질런트 분취용 HPLC를 사용한 정제를 위하여 주입 이전에 0.1 ㎖의 20% MeCN/H2O 0.1% TFA로 종결시켰다. 모든 유사체는 20-80% MeCN/H2O 0.1% TFA의 구배를 사용하여 30 분에 걸쳐 분리하였다. 질량 스펙트럼 결과를 하기 표 1에 요약한다.
<표 1>
Figure pct00041
(b) DMF 단독. [19F]표준물질, [19F]-1b-6b는 또한 구리 분말 및 용매로서 DMF를 사용하여 합성하였다. 화합물 [19F]-1a 및 [19F]-3a의 경우, 단독 용매로서 DMF의 사용은 서서히 진행되었다(> 3 시간). 물(DMF:H2O (3:2))의 첨가는 반응 속도를 향상시켜서 15 분 이내에 반응이 종료되었다.
실시예 2a
2-[ 18 F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr 3 ]옥트레오테이트 유사체의 합성을 위한 일반적인 방법
하기 반응식 1에 예시한 바와 같이, 본 발명의 방사능표지된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체는 구리 촉매화된 아지드-알킨 첨가고리화 반응(CuAAC)에 의하여 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 표지시켜 시약 2-[18F]플루오로에틸 아지드를 사용하여 1,4-치환된 트리아졸, 즉 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 형성하여 생성될 수 있다. CuAAC 반응 동안의 반응성에서의 예상밖의 변동성이 연구한 각각의 알킨 유사체에 대하여 관찰되었다.
<반응식 1>
Figure pct00042
실시예 2b
알킨 제조
5종의 알킨 작용화된 옥트레오테이트 유사체(도 1)는 하기 기재된 βAB-TOCA(5a)의 합성과 유사한 방식으로 합성하였다. 스크램블 펩티드(6b)(도 1)는 소마토스타틴 수용체에 대하여 특이성을 나타내지 않는 음성 대조군으로서 표시하였다. 옥트레오테이트 및 알킨 작용기 사이의 링커는 펩티드를 보충하고 그리고 합성의 용이성을 위하여 선택하였다. 폴리에틸렌 글리콜 기((1a) 및 (2a))를 함유하는 2종의 유사체를 표시하였다. 옥트레오테이트 알킨(1a-5a) 및 스크램블 유사체(6a)는 [18F]플루오로에틸 아지드(8)를 사용하여 표지하였다(반응식 1).
실시예 2b.1 βAB-TOCA(5a)의 합성
2b.1.1 프로피노일-β-Ala-OH의 합성
Figure pct00043
프로피올산(3.00 mmol, 184 ㎕)을 NMP(5 ㎖)에 용해된 H-β-Ala-OMe HCl 염(3.00 mmol, 419 ㎎), PyBOP(3.00 mmol, 1.56 g) 및 DIPEA(9.00 mmol, 1.53 ㎖)의 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물을 30 분 동안 진탕시킨 후, 물/0.1% TFA로 희석하고 그리고 정제를 위하여 분취용 HPLC 컬럼에 로딩하여 프로피노일-β-Ala-OMe를 제공하였다.
프로피노일-β-Ala-OMe를 ACN/물/0.1% TFA(200 ㎖)에 용해시키고, 0.1M NaOH를 사용하여 용액을 pH 11로 조절하였다. 용액을 1 시간 동안 교반한 후, 진공하에서 환원시켰다. 잔류물(50 ㎖)을 생성물 정제를 위하여 분취용 HPLC 컬럼에 주입하였다.
정제 및 특성화
분취용 HPLC(구배: 60 분에 걸쳐 0% ACN/0.1% TFA)로 정제하여 260 ㎎(3 mmol 출발 물질을 기준으로 하여 61%) 순수한 프로피노일-β-Ala-OH를 얻었다.
정제된 물질을 분석용 LC-MS(구배: 5 분에 걸쳐 0-15% ACN/0.1% TFA, tR: 0.29 분, 실측치 m/z: 142.3, 예상치 MH+: 142.0)에 의하여 분석하였다
2b.1.2 고체 지지체상에서의 H-Gly-[Tyr 3 ]-옥트레오테이트의 어셈블리
펩티딜 수지 H-Gly-D-Phe-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-중합체는 표준 펩티드 합성 절차를 사용하여 어셈블리하였다. 펩티딜 수지 H-Gly-D-Phe-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-D-Trp(Boc)-Lys(Boc)-Thr(tBu)-Cys(Trt)-Thr(tBu)-중합체는 0.25 mmol Fmoc-Thr(tBu)-SASRIN 수지로 출발하여 Fmoc 화학을 사용하는 시판중인 CEM 리버티(Liberty) 마이크로파 펩티드 합성기에서 어셈블리하였다. 1.0 mmol 아미노산을 현장내 활성화를 위하여 0.9 mmol HBTU/0.9 mmol HOBt/2.0 mmol DIPEA를 사용하는 각각의 커플링 단계(80℃에서 5 분)에서 적용하였다. NMP 중의 20% 피페리딘의 용액으로 수지를 처리하여 Fmoc를 제거하였다.
2b.1.3 프로피노일-β-Ala-Gly-[Tyr 3 ]-옥트레오테이트(즉, βAB-TOCA (5a))의 합성
Figure pct00044
프로피노일-β-Ala-OH(0.50 mmol, 71 ㎎, 상기 2b.1.1에 기재됨) 및 PyBOP(0.500 mmol, 260 ㎎)를 NMP(5 ㎖)에 용해시키고, 옥트레오테이트 수지(0.25 mmol, 상기 2b.1.2에 기재됨)에 첨가하였다. DIPEA(2.00 mmol, 340 ㎕)를 첨가하고, 혼합물을 90 분 동안 진탕시켰다. 시약을 여과로 제거하고, 수지를 NMP, DCM 및 디에틸 에테르로 세정하고, 건조시켰다.
축쇄 보호기의 동시 제거 및 수지로부터 펩티드의 분해는 2.5% TIS 및 2.5% 물을 함유하는 TFA(100 ㎖) 중에서 90 분 동안 실시하였다. 수지를 여과로 제거하고, TFA로 세정하고, 합한 여과액을 진공하에서 증발시켰다. 디에틸 에테르를 잔류물에 첨가하고, 형성된 침전물을 디에틸 에테르로 세정하고, 건조시켰다. 건조한 침전물을 50% ACN/물에 용해시키고, 밤새 방치하여 잔존하는 Trp 보호기를 제거하였다. 그후, 용액을 동결건조시켜 294 ㎎(96%) 미정제 프로피노일-β-Ala-Gly-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH를 얻었다.
ACN(0.75 ㎖)에 용해된 2,2'-디티오디피리딘(0.27 mmol, 59 ㎎)을 ACN/물/0.1% TFA(300 ㎖)에 용해된 미정제 프로피노일-β-Ala-Gly-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Thr-Cys-Thr-OH(294 ㎎)에 3개의 동일한 부분으로 첨가하고, 용액을 30 분 동안 진탕시켰다. 반응 혼합물을 생성물 정제용 분취용 HPLC 컬럼에 로딩시켰다.
정제 및 특성화
분취용 HPLC(구배: 60 분에 걸쳐 20-40% ACN/0.1% TFA)로 정제하여 140 ㎎(48%) 순수한 프로피노일-β-Ala-Gly-[Tyr3]-옥트레오테이트를 얻었다.
정제된 물질을 분석용 LC-MS(구배: 5 분에 걸쳐 20-30% ACN/0.1% TFA, tR: 2.49 분, 실측치 m/z: 1,229.5, 예상치 MH+: 1,229.5)로 분석하였다.
방사성화학
실시예 3
2-[ 18 F]플루오로에틸아지드(8)의 제조
8을 합성하는데 사용된 방법은 Glaser et al.이 사용한 것으로 약간 변경시켰다(문헌([Glaser, M., et al., Bioconjugate Chemistry 2007, 18, (3), 989-993]; [Demko, Z. P., et al., Angewandte Chemie - International Edition 2002, 41, (12), 2113-2116)])). [18F]불소화물 건조 단계 중에 K2CO3 대신에 KHCO3의 사용은 더 온화한 염기를 사용하여 전구체 7의 향상된 안정성으로 인하여 증류에 의한 정제후 더욱 일관된 분리 수율을 산출하였다.
크립토픽스(Kryptofix) 222(5 ㎎, 13.3 ㎛ol), 탄산수소칼륨(1.4 ㎎, 16.7 ㎛ol, 100 ㎕ 물 중의) 및 아세토니트릴(0.5 ㎖)의 혼합물에 물(0.1-1 ㎖) 중의 [18F]불소화물(5-15 mCi)을 첨가하였다. 100℃에서 질소 흐름(100 ㎖/분)하에서 가열하여 용매를 제거하였다. 그후, 아세토니트릴(0.5 ㎖)을 첨가하고, 증류를 지속하였다. 이러한 절차를 2회 더 반복하였다. 실온으로 냉각시킨 후, 무수 아세토니트릴(0.2 ㎖) 중의 2-아지도에틸-4-톨루엔술포네이트(7)(1.3 ㎕, 6.5 ㎛ol)([Glaser, M.; et al., Bioconjugate Chemistry 2007, 18, (3), 989-993]; [Demko, Z. P.; et al., Angewandte Chemie - International Edition 2002, 41, (12), 2113-2116])의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 15 분 동안 80℃에서 교반하였다. [18F]8을 130℃에서 아세토니트릴(30 ㎕)을 함유하는 포획 바이알로 증류시켰다(Arstad, E., WO2008/015391A1). 50-55%의 방사성화학적 수율(붕괴-보정됨)로 화합물 [18F]8을 수집하였다.
차후에 생체내 실험에 사용되는 클릭 화학을 통한 샘플의 제조를 위하여 2-[18F]플루오로에틸 아지드의 생성은 해머스미스 이마넷(Hammersmith Imanet)에서 건축한 원격 조절 장치로 실시하였다. 시스템은 출발 활성으로서 약 200-300 mCi의 [18F]불소화물의 사용을 가능케 한다. 이러한 시스템을 사용한 분리된 [18F]플루오로에틸 아지드의 방사성화학 수율(붕괴 보정됨)은 19 내지 26% 범위내이다. 그러나, 2-[18F]플루오로에틸 아지드의 생성은 당분야에서 공지된 기타의 방법에 의하여 달성될 수 있다(문헌([Glaser, M.; et al., Bioconjugate Chemistry 2007, 18, (3), 989-993]; [Demko, Z. P.; et al., Angewandte Chemie - International Edition 2002, 41, (12), 2113-2116)]; WO2008/015391A1)).
실시예 4
표지화를 위한 일반적인 방법
알킨 1a, 2a 및 4a의 경우: 물(25 ㎕) 중의 황산구리(II) 오수화물(4 eq)의 용액에 N2하에서 25 ㎕의 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0, 250 mM) 중의 나트륨 L-아스코르베이트(4.4 eq)를 첨가한 후, 25 ㎕의 물 중의 BPDS(9)(5 eq)를 첨가하였다. 알킨 3a 및 5a의 경우, CuSO4(2 eq), Na-아스코르베이트(2.2 eq) 및 BPDS(9)(4 eq)를 사용하였다.
MeCN 중의 [18F]8의 용액(100 ㎕)을 첨가한 후, DMF(30 ㎕) 중의 알킨(2 ㎎)을 첨가하고, 반응을 실온에서 실시하였다(최적의 반응 시간의 경우 표 2를 참고한다). 그후, 반응을 H2O 0.1% TFA(100 ㎕)로 희석하고, 하기 표 2에 명시한 구배를 사용하는 역상 분취용 HPLC로 정제하였다. 그후, HPLC 분획을 H2O(15-19 ㎖)로 희석하고, tC18 라이트 SPE 카트리지에 로딩시켰다. 생성물을 100 ㎕ 분획으로 에탄올로 용출시키고, >98% RCP로 10% 에탄올/PBS 완충액(pH 7.0)의 용액으로 생성하였다.
<표 2>
Figure pct00045
실시예 5
옥탄올 / 포스페이트 완충제 분배 계수 측정( Log D)
옥탄올/PBS 분배 계수는 진탕 플라스크 방법을 사용하여 측정하였다. 두 용매 모두를 함께 5 분 동안 진탕시켜 서로 예비포화시켰다. 500 ㎕의 옥탄올 및 PBS 모두의 용액에 EtOH 중의 방사능표지된 리간드 20 ㎕(n=3)를 첨가하였다. 용액 혼합물을 회전혼합기내에서 5 분 동안 진탕시켰다. 평형화후, 혼합물을 원심분리하여(13,000 rpm에서 10 분) 우수한 분리를 달성하였다. 각각의 층으로부터의 샘플(25 ㎕)을 취하고, γ 계수기로 측정하고, Log D를 하기 수학식에 따라 계산하였다:
log D = log (옥탄올층에서의 cpm/수성층에서의 cpm)
Log D 값은 18F-표지된 트리아졸을 사용하여 측정하였다. 예상한 바와 같이, 유사체 1b 및 2b에 대한 Log D 값은 PEG화로 인하여 최저이었으며, Log D 값이 최고인 유사체는 4b이었다(하기 표 3). [19F]1b-6b에 대한 수용체 친화도는 표지된 방사성트레이서로서 [111In]-옥트레오스캔을 사용한 AR42J 종양 세포에서의 경쟁적 결합 분석을 사용하여 측정하였다. 최대값의 반치 억제 농도(IC50) 값을 계산하고, 변위 곡선의 결과를 요약하였다(표 3). 기준 펩티드로서, IC50 값을 옥트레오티드에 대하여 측정하였으며, 14.7±7.7 nM인 것으로 밝혀졌다. 옥트레오테이트 유사체에 대한 IC50 값은 옥트레오티드에 필적하거나 또는 이보다 낮은 것으로 밝혀졌으며, 이는 소마토스타틴 수용체에 대한 결합 친화도가 높다는 것을 나타내며; 모두는 나노몰 범위내로 수용체에 대한 높은 결합 친화도를 나타냈다. 플루오로에틸 트리아졸 부분의 도입은 [19F]-2b, 3b, 4b 및 5b에 대한 친화도를 감소시키나, 상당하지는 않으며, 그 값은 여전히 옥트레오티드보다 낮거나 또는 그에 필적한다. 이와 같은 실험에서, 화합물 [19F]-5b는 IC50 값이 1.6±0.2 nM인 최고의 친화도를 나타냈다. 6개의 순차적인 에틸렌 글리콜 기의 첨가를 통한 펩티드의 PEG화는 각각 2.9±1.3 nM 및 13.2±7.8 nM의 IC50 값을 산출하는 [19F]-1b 및 [19F]-2b의 전체 친화도에 상당한 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다. 이에 비하여, 스크램블 아미노산 서열을 함유하는 [19F]-6b는 IC50 값이 >10 mM인 낮은 친화도를 나타냈다. 이러한 결과는 본원의 유사체가 소마토스타틴 수용체에 대하여 특이적으로 결합된다는 것을 나타낸다.
<표 3>
Figure pct00046
실시예 6
시험관내 수용체 결합 측정
[19F]-플루오로에틸트리아졸-[Tyr]3-옥트레오테이트 유사체(19F-1b-6b) 및 알킨-옥트레오테이트 유사체(1a-6a)의 결합 친화도를 측정하기 위하여, 시험관내 분석은 호프랜드 및 공역자가 이미 보고한 방법의 변형을 사용하여 실시하였다(문헌[Hofland, L. J.; et al., Endocrinology 1995, 136, (9), 3698-706]). AR42J 세포(5×104)를 24-웰 평판에 파종하고, PBS 중에서 2회 세정하고, 분석하고자 하는 증가되는 농도(0, 0.01, 0.1, 1, 1.0, 10, 100, 1,000 및 10,000 nM)의 화합물과 함께 10 분 동안 실온에서 배양하고, 이와 같은 실험 조건[Scemama, J. L.; et al., Gut 1987, 28 Suppl, 233-6]하에서 결합이 발생하는데 충분한 시간 동안 두었다. 그후, 평판을 추가의 30 분 동안 [111In]옥트레오스캔(고비디엔, 영국 고스포트 소재: (웰당 50,000))으로 배양하였다. 웰당 0.25 ㎖의 배양 완충액의 최종 부피를 사용하였다. 배양 완충액은 10 mM HEPES, 5.0 mM, MgCl2 6H2O, 1.0 mM 바시트라신, 1% BSA로 이루어졌으며, 최종 pH는 7.4로 조절하였다. 배양의 종반에, 평판을 빙냉 배양 완충액으로 3회 세정하고. 0.2N NaOH 용액에 가용화시켰다. 그후, 각각의 웰의 내용물을 계수관으로 옮기고, 감마-계수기(바이오소프트(Biosoft), 미국 미주리주 퍼거슨 소재)를 사용하여 샘플을 계수하였다. 각각의 농도를 4회 실시하고, 실험을 3회 반복하였다. 결과는 대조군의 비율로서 나타낸다(처음 4개의 웰은 표지된 [111In]옥트레오스캔만을 사용하여 처리한다). IC50 값은 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) 소프트웨어(버젼 4.00)(윈도우용 그래프패드 소프트웨어, 인코포레이티드(GraphPad Software, Inc.))를 사용하여 대입한 시그모이드 변위 곡선으로부터 계산하였다.
실시예 7
촉매로서 구리 와이어의 사용
촉매 Cu(I)의 대체 공급원으로서 구리 와이어의 사용을 연구하였다. 실험은 CuSO4/Na-아스코르베이트 방법을 사용하여 기타 유사체에 비하여 그의 향상된 반응성으로 인하여 3a를 사용하여 실시하였다. 구리 와이어 및 알킨을 예비혼합한 후, 8의 첨가 이전에 가열하여 반응이 5 분 이내에 완료된 것으로 밝혀졌다(하기 표 4, 엔트리 2). 2가지 성분을 예비-혼합하지 않으면, 클릭 반응은 완료되는데 더 오래 걸렸다(표 4, 엔트리 1). 기타 pH 완충계(표 4, 엔트리 4, 5 및 6)를 또한 적용하였으나, 모두 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0, 250 mM)보다 불량한 것으로 입증되었다(표 4, 엔트리 1). CuSO4 및 BPDS(9)를 구리 와이어를 사용하여 반응에 첨가하였으며, 이러한 접근법의 근거는 첨가된 CuSO4가 시판중인 Cu(II)의 농도를 증가시켜 균등화(comproportionation) 반응을 개선시킨다는 점이다(문헌([Gopin, A., et al., Bioconjugate Chemistry 2006, 17, 1432-1440]; [Bonnet, D., et al., Bioconjugate Chemistry 2006, 17, 1618-1623])). 상기 언급된 바와 같은 리간드(9)를 첨가하여 Cu(I) 종을 안정화시켰다. 전략을 잘 수행하였으며, 실온에서 수율이 개선된 것으로 나타났다(표 4, 엔트리 7). 이것이 탠덤 효과이었는지를 설정하기 위하여, 추가의 시약 모두를 별도로 조사하기 위하여 반응을 실시하였다(표 4, 엔트리 7, 8). 시약 모두는 어느 정도로는 속도에 영향을 미치지만, 함께 사용시 이들은 반응 속도에 더 큰 영향을 미치는 것으로 보인다. 모노포스(MonoPhos)™(문헌[Campbell-Verduyn, L. S., et al., Chemical Communications 2009, (16), 2139-2141])는 대체의 리간드로서 연구되었으나, 반응에서 덜 효율적인 것으로 입증되었다(표 4, 엔트리 10).
<표 4>
Figure pct00047
결과
알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체, G-TOCA(3a) 및 βAG-TOCA(5a)는 온화한 조건하에서 그리고 짧은 합성 시간(20℃에서 5 분)으로 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체 FET-G-TOCA(3b) 및 FET-βAG-TOCA(5b)로의 완전한 전환을 나타내는 클릭 반응에서 반응성이 매우 큰 것으로 밝혀졌다. 합성의 용이성뿐 아니라, 췌장 종양 AR42J 세포로의 시험관내 결합은 FET-G-TOCA(3b) 및 FET-βAG-TOCA(5b) 모두의 IC50이 각각 4.0±1.4 및 1.6±0.2 nM인 소마토스타틴 수용체에 대하여 높은 친화성을 갖는다는 것을 나타냈다.
알킨-펩티드 1a-5a에 대하여 관찰된 클릭 반응 속도에서의 변동성은 링커에서의 변동에 기인할 수 있는데, 이는 펩티드 부분이 불변 상태로 있기 때문이다. 말단 알킨 중심에 이웃한 기의 전자 성질은 반응 속도를 향상 또는 감소시키지 않는 것으로 여겨진다(문헌[Hein, J. E., et al., Chemical Society Reviews 2010, (39), 1302-1315]). 이와는 반대로, 아미드 부분으로 직접 치환된 말단 알킨(1a, 3a, 5a, 6a, (도 1))은 에틸-결합된 아미드로 직접 치환된 것(2a 및 4a, (도 1))에 비하여 반응성이 향상된 것으로 밝혀졌다. 유사한 결과는 1,3-후이스겐(Huisgen) 첨가고리화 반응의 연구 중에 문헌[Li et al., Tetrahedron Letters 2004, 45, 3143-3146]에 의하여 그리고 별도로 CuAAC의 속도에 대한 아지드 부분의 주위에서의 입체 장해 및 전자 끌개기의 영향을 연구한 문헌[Golas et al., Macromolecular Rapid Communications 2008, 29, 1167-1171]에 의하여 밝혀졌다. 알킨의 전자 성질과 함께 고려하여야 하는 기타 요인은 알킨-펩티드의 크기이다. 운동학적으로, 알킨-펩티드가 클수록 반응 속도은 더 느릴 것으로 예상되며, 이는 PEG화 유사체(1a, 2a)를 사용한 경우인 것으로 밝혀졌다. 1a는 3a 및 5a보다 더 느리게 반응한다는 것을 알 수 있다(표 5, 조건 B). 전자적으로, 이들은 유사하며, 모두 아미드 치환된 말단 알킨에 직접 결합되지만, 1a는 6개의 순차적 에틸렌 글리콜 기를 함유한다. PEG 쇄는 알킨 작용기를 입체적으로 방해할 수 있는 커다란 물에 의하여 둘러싸일 수 있다(문헌[Shiffman, M. L., Current Hepatitis Reports 2003, 2, 17-23]). 알킨 2a 및 4a는 동일한 관점에서 필적하며(PEG화 대 비-PEG화); 2a는 CuAAC 중에 더 느린 반응 속도를 나타내는 것으로 관찰되었다. 클릭 반응 중의 1a 및 2a를 사용하여 발견된 반응의 더 느린 속도 및 변동으로 인하여, 시약의 농도를 증가시켜야만 하였다. 반응의 재현성 및 속도에서는 개선이 나타났다(조건 D, 표 5). 유사체 1b-6b는 분리되어 90-120 분후 (출발 불소화물 활성을 기준으로 하여) 3-7%의 비-붕괴 보정된 수율을 산출한다. 감소되는 반응 시간과 함께 더 높은 온도를 사용하여 반응 속도를 증가시키지만, 이는 상당한 부산물 형성을 초래하며 그리고 정제를 더 곤란하게 하였다(표 5, 조건 C).
유사체 1a-6a를 사용한 클릭 반응 동안 발견된 일반적인 경향은 HPLC 모니터링 중에 나타난 2종의 안정한 부산물이었다. 2종의 부산물 11 및 12(반응식 2, 도 1a)는 5a를 사용한 반응 배지로부터 분리하였다(도 1). 이들을 분리하고, 수집하고, 충돌 유발 분해 질량 분광법(CID-MS)에 의하여 분석하였다. 극성이 더 큰 화합물 12는 CID-MS 분석 중에 알킨 전구체(5a)인 것으로 밝혀졌다. 이것이 그러한 경우인 것으로 밝혀지기는 하였으나, 반응 혼합물을 5a와 혼합하고, 크로마토그래피로 분석시, 부산물 12는 HPLC 트레이스에서 동시용출되지 않았다. 2-[18F]플루오로에틸 아지드(8)의 불완전한 혼입을 나타내는 반응은 심지어 12의 존재하에서도 추가로 더 상당하게 진행되지 않은 것으로 밝혀졌는데, 이는 CuAAC 반응에서의 이러한 종의 불충분한 반응성을 시사한다. 부산물 11을 분석하였으며, 1-비닐 트리아졸(반응식 2)에 해당하는 것으로 밝혀졌다.
<반응식 2>
Figure pct00048
아마도 11은 초기 라벨링 단계에서 제거 메카니즘으로부터의 부산물인 것으로 의심되는 아지도에텐(10)과의 클릭 반응을 통하여 형성된다. 문헌[Kim et al., Applied Radiation and Isotopes 2010, 68, 329-333]에는 4-토실옥시-1-부틴을 사용한 유사한 발생이 보고되었으며, 이들은 제거되어 비닐 아세틸렌을 형성한 후, 클릭 반응에서 아지드와 반응할 수 있는 것으로 관찰되었다. 부산물 11과의 주요 문제는 정제 동안 방사능표지된 생성물로의 유사한 정체 시간이며, 이는 가능한한 최고의 수율뿐 아니라, 매우 특이적인 방사능을 얻는 것이 곤란하게 된다.
CuSO4/Na-아스코르베이트 방법을 사용하여 실시한 실험은 일반적으로 pH 5.0에서의 아세트산나트륨 완충액(AB)을 사용하여 실시하였다. 증류수를 사용하여 3a를 사용한 실험을 실시하였을 때, 방사능표지된 생성물로의 전환은 더 느렸으며, 이는 완충계를 사용한 >98% 전환에 비하여 5 분에서 78% 전환율을 나타냈다.
8의 증류를 배제하는 원-포트(one-pot) 반응을 실시하였다. 반응은 2a 및 3a 모두를 사용하고자 하였으나, 이들 모두 아마도 경쟁하는 부반응으로 인하여 더 느린 반응 속도를 나타냈다. 반응 속도에 영향을 미칠 수 있는 또다른 변수는 2-[18F]플루오로에틸 아지드의 부피이다. 2a를 사용한 조건 B(표 5) 및 50 ㎕의 2-[18F]플루오로에틸 아지드(8)를 사용하여 실시한 반응은 30 분후 3b로의 84% 전환율을 나타냈다. 동일한 조건하에서 100 ㎕의 8을 사용하면 아무런 반응이 관찰되지 않았다(표 5).
BPDS 리간드(9)를 사용하면(반응식 1), Cu(I) 안정화 리간드[Gill, H. S., et al., Journal of Medicinal Chemistry 2009, 52, 5816-5825]는 클릭 반응의 속도를 크게 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 반응은 임의의 리간드를 사용하지 않고 평가하였다. 9를 사용하지 않고 4a를 사용하여 실시한 반응(표 5, 조건 A)은 소정의 생성물로 14% 전환율을 나타내지만, 9의 첨가시(조건 B) 47% 전환율을 산출하였다. 동일한 시약 농도를 사용하지만, 80℃로 반응의 가열은 5 분후 4b로 >98% 전환율을 산출하며(표 5, 조건 C); 이러한 온도에서의 생성물로의 전환이 우수하기는 하나, 부산물에서의 증가가 관찰되었으며, 이들의 일부는 4b와 동시용출되었다.
<표 5>
Figure pct00049
결론적으로, 5종의 신규한 알킨 작용화된 옥트레오테이트 유사체는 2-[18F]플루오로에틸 아지드와의 클릭 반응으로 반응하였다. 반응성이 가장 큰 알킨은 G-TOCA(3a) 및 βAG-TOCA(5a)이었으며, 이는 최적화된 조건을 사용하여 실온에서 5 분 이내에 표지화된 트리아졸 FET-G-TOCA(3b) 및 FET-βAG-TOCA(5b)로 완전 전환을 나타냈다. 클릭 반응에서의 효율뿐 아니라, 유사체 모두는 소마토스타틴 수용체에 대한 높은 결합 친화도를 나타냈다.
실시예 8
시험관내 결합 분석
대조용 저 친화도 수용체 서브타입으로서 소마토스타틴 수용체 서브타입 sstr-2 대 sstr-3 및 sstr-4에 대한 본 발명의 [19F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 유사체의 친화도는 형광광도 영상화 평판 판독기(FLIPR) 분석을 사용하여 측정하였다. 분석은 칼슘 염료로 예비로딩된 sstr-2, 3 또는 4-발현 Chem-1 세포(밀리포어(Millipore), 미국 미주리주 세인트 찰스 소재)에서의 칼슘 플럭스의 [19F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 유도된 활성화를 측정하는 것을 포함한다. 간략하게, 특이성 sstr-서브타입을 발현시키는 Chem-1 세포를 50,000 세포/웰로 96 웰 평판에 파종하고, 5% CO2 배양기내에서 24 시간 동안 배양하였다. 세포를 세정하고, 플루오-8-노-워시(Fluo-8-No-Wash) Ca2+ 염료를 사용하여 GPCRProfiler™ 분석 완충액(밀리포어) 중에서 90 분 동안 30℃에서 5% CO2 배양기내에서 로딩하였다. 본 발명의 상이한 농도의 [18F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 또는 소마토스타틴(시그마; 양성 대조군)을 첨가한 후, 형광 측정을 실시하였다. 분석을 작용물질 모드로 2회 실시하였다. 길항물질 활성은 작용물질 활성으로 인하여 평가하지 않았다. 형광 출력을 측정하고, 데이타를 기준선 보정후 형광 시그날 최대값(%)으로서 나타냈다. 각종 리간드에 대한 최대값의 반치 수용체 활성화는 윈도우용 그래프패드 프리즘 버젼 4.00(그래프패드 소프트웨어, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 사용하여 대입한 시그모이드 투여 반응에 의하여 평가하였다.
실시예 9
동물 및 종양 모델
6 내지 8주령의 BALB/c nu/nu 무흉선 마우스 암컷을 할란 유나이티드 킹덤 리미티드(Harlan United Kingdom Ltd)(영국 바이스터 소재)로부터 구하였다. 고 sstr-2 췌장 종양 세포주 AR42J[Taylor J.E., et al., 1994; 15:1229-1236]; 및 저 sstr-2 사람 결장 암 세포주 HCT116(엘지씨 스탠다즈(LGC Standards), 영국 미들섹스 소재)을 10% (v/v) 태아 소 혈청, 2 mmol/L L-글루타민, 100 단위/㎖ 페니실린 및 100 g/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 F12K 및 RPMI1640 성장 배지내에서 각각 배양하고, 5% CO2 배양기내에서 37℃에서 성장시켰다. 1×106 세포를 함유하는 100 ㎕의 PBS의 피하 주사에 의하여 종양을 설정하였다. 모든 동물 실험은 동물 실험에 대한 영국 내무부 안내(과학적 절차) Act 1986에 의거하여 그리고 암 연구에서의 동물 복지에 대한 영국 국립 암 연구 위원회(National Cancer Research Institute Committee)가 제시한 지침내에서 허가받은 연구자가 수행하였다(문헌[Workman, P., et al., Br J Cancer . 2010; 102:1555-1577]). 캘리퍼를 사용하여 종양 크기를 연속적으로 측정하고, 종양 부피는 수학식 부피=(π/6)×a×b×c로 계산하고, 여기서 a, b 및 c는 종양의 3개의 직교축을 나타낸다. 마우스의 종양이 약 200 ㎣이 되었을 때 마우스를 사용하였다.
실시예 10
FET-βAG-TOCA의 생체내 혈장 안정성
FET-βAG-TOCA(약 3.7MBq)를 종양이 없는 BALB/c nu/nu 마우스에게 꼬리 정맥을 통하여 주사하였다. 일반적인 이소플루오란 마취하에서 주사후 30 분에 혈액을 얻고, 혈장 샘플을 준비하고, 얼음으로 즉시 냉동시켰다. 분석을 위하여, 사용 직전 샘플을 해동시키고 그리고 4℃에서 유지하였다. 빙냉 메탄올(1.5 ㎖)을 첨가한 후 혼합물의 원심분리(3 분, 20,000×g; 4℃)에 의하여 혈장(약 0.2 ㎖)을 투명하게 만들었다. 상청액을 회전 증발기(헤이돌프 인스트루먼츠 게엠베하 운트 콤파니(Heidolph Instruments GMBH & Co), 독일 슈바바흐 소재)를 사용하여 35℃의 배쓰 온도에서 무수 상태로 증발시켰다. 잔류물을 HPLC 이동상(1.2 ㎖)에 재현탁시키고, 투명하게 만들고(0.2 ㎛ 필터), 샘플(1 ㎖)을 HPLC에 1 ㎖ 샘플 루프를 통하여 주사하였다. γ-RAM 모델 3 감마-검출기(아이엔/유에스 시스템즈 인코포레이티드(IN/US Systems Inc.), 미국 플로리다주 소재) 및 로라(Laura) 3 소프트웨어(라블로직(Lablogic), 영국 셰필드 소재) 및 UV(254 ㎚)가 장착된 아질런트 1100 시리즈 HPLC 시스템(아질런트 테크놀로지즈(Agilent Technologies), 영국 스톡포트 소재)에서 방사성-HPLC에 의하여 샘플을 분석하였다. 워터스(Waters) μ본다팩(μBondapak) C18 역상 컬럼(300 ㎜×7.8 ㎜) 정지상을 3 ㎖/분에서 등용매 전달되는 67% 물(0.1% TFA)/33% 아세토니트릴(0.1% TFA)을 포함하는 이동상으로 용출시켰다.
실시예 11
PET 영상화 실험
동적 PET 영상화 스캔은 전용 소동물 PET 스캐너(지멘스 인베온(Siemens Inveon) PET 모듈, 지멘스 몰레큘라 이매징 인코포레이티드(Siemens Molecular Imaging Inc.), 영국 소재)로 실시하였다(문헌([Workman, P., et al., Br J Cancer. 2010;102:1555-1577]; [Leyton, J., et al., Cancer Res. 2006;66:7621-7629])). 간략하게, 꼬리 정맥에 일반 마취(이소플루오란)하에서 캐뉼러를 삽입하였다. 동물을 스캐너내에서 자동온도 조절된 환경에 넣고; 심박수를 실험 중에 모니터하였다. 마우스에게 3.0-3.7 MBq의 각종 방사능표지된 화합물을 주사하고, 동적 PET-CT 스캔을 리스트-모드 포맷으로 60 분에 걸쳐 획득하였다. FET-βAG-TOCA의 경우, 차단 실험을 또한 실시하여 방사성트레이서 주사 및 영상화를 10 ㎎/㎏ 비표지된 옥트레오티드(시그마)를 마우스에게 정맥내 주사 10 분후 개시하였으며; 옥트레오티드의 이와 같은 투약량은 방사성트레이서 주입에서 비표지 FET-βAG-TOCA의 등가의 투약량보다 약 100배 더 높았다. 모든 경우에서 획득한 데이타는 화상 재구성을 위하여 0.5 ㎜ 부비동조영상 빈(bin) 및 19 시간 프레임(0.5×0.5×0.5 ㎜ 화소; 4×15s, 4×60s 및 11×300s)으로 분류하였다. 지멘스 인베온 리서치 워크플레이스(Siemens Inveon Research Workplace) 소프트웨어를 사용하여 얻은 화상 데이타-세트를 가시화 및 정량화하였다. 해당 3차원 구역(3D ROI)을 5종의 인접한 종양, 간, 신장, 근육 또는 소변/방광 구역(각각 0.5 ㎜ 두께)에서 수동으로 구획하였다. 시간 대 방사능 곡선(TAC)을 얻기 위하여 19개의 시점 각각에서의 조직에 대한 데이타의 평균값을 구하였다. 각각의 조직에 대한 방사성트레이서 흡수율을 주사된 투약량으로 정규화하고, 조직 1 ㎖당 주사된 활성 비율(%)로서 나타냈다(%ID/㎖).
실시예 12
조직 방사능의 직접 계수
60 분 PET 스캔후, 일반적인 이소플루란 마취하에서 심장 천자를 통한 방혈후 종양 조직의 일부를 마우스로부터 얻었다. 모든 샘플의 무게를 측정하고, 붕괴 보정을 적용하는 코브라 II 오토-감마(Cobra II Auto-gamma) 계수기(구 패커드 인스트루먼츠 메리덴(Packard Instruments Meriden) CT USA)를 사용하여 그의 방사능을 직접 측정하였다. 결과를 1 그램당 주사된 투약량의 비율(%)(%ID/g)로서 나타냈다.
실시예 13
통계학
소프트웨어 그래프패드 프리즘 버전 4.00(그래프패드 소프트웨어, 인코포레이티드, 미국 캘리포니아주 샌디에고 소재)을 사용하여 통계적 분석을 실시하였다. 군 사이의 비교는 비모수 맨-휘트니(Mann-Whitney) 테스트를 사용하여 실시하였다. 양측 검정 P 값≤0.05는 유의적인 것으로 간주하였다.
결과
방사성트레이서
모든 방사성트레이서는 >98% 방사성화학적 순도로 성공적으로 생성되었다. 총 합성 시간은 약 1.5 시간이었다. 방사성트레이서의 친유도(Log D)는 당분야에 공지된 방법[Barthel, H., et al., Br J Cancer . 2004;90:2232-2242]을 사용하여 측정하였으며, 측정된 Log D는 하기 표 6에 제시한다. 동물을 여러 날에 스캐닝하였으므로, 각각의 방사성트레이서에 대한 평균 비방사능(specific radioactivity)을 또한 제시한다(표 6).
<표 6>
Figure pct00050
시험관내 sstr-서브타입 특이성
모든 [19F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 유사체는 sstr-2에서 작용물질(agonist) 활성을 나타냈으며(도 14), 스크램블 펩티드(FET-βAG-[W-c-(CTFTYC)K])는 예상되는 바와 같이 친화도가 불량하였다. 리간드의 친화도(EC50)는 (5.6 nM에서 소마토스타틴에 대하여) 4 내지 19 nM 범위내이고, 폴리에틸렌 글리콜(PEG)-TOCA 유사체는 sstr-2에 대하여 최저 친화도를 나타냈다. 유사체는 상당한 작용물질 활성을 지니므로 길항물질 활성은 평가하지 않았다. 어떠한 화합물도 sstr-3에 대한 검출 가능한 활성을 나타내지 않았다. 스크램블 펩티드를 제외한 모든 [19F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 유사체는 sstr-4에 대하여 검출 가능한 활성을 나타냈지만, 친화도는 불량하였다(≥ 5.4 mM). 시험관내 실험은 트리아졸 유사체가 sstr-2에 대한 선택적 친화도가 높았으며, G-단백질 결합된 수용체에 대한 칼슘 플럭스 분석에서의 최대값의 반치 작용물질 활성(EC50)은 스크램블 펩티드에 비하여 4 내지 19 nM 범위내이어서 친화도가 낮았다.
FET -β AG - TOCA 는 생체내에서 안정하다. FET-βAG-TOCA의 생체내 안정성을 조사하였다. 투약 용액 및 30 분 마우스 혈장의 통상의 방사선-크로마토그램을 도 15에 도시한다. FET-βAG-TOCA의 대사산물은 보이지 않았으며, 원상태의 모 트레이서만이 발견되었다. sstr-수용체에 대한 높은 결합 친화도 및 비-표적 조직으로부터의 신속한 약효세척의 조합된 효과는 생체내 고-콘트라스트 PET 화상을 생성하였으며, 이는 도 16에서 FET-βAG-TOCA에 대하여 입증되었다. 생체내 동적 PET 화상 데이타로부터 유래하는 종양의 증가하는 시간 대 FET-βAG-TOCA의 활성 곡선(도 17)은 FET-βAG-TOCA의 높은 선택적 결합을 반영하였다. 이 방사성트레이서는 마우스에서 대사적으로 안정하며, 골 흡수율이 낮았고, 이는 유의한 탈불소화가 없음을 나타낸다.
[ 18 F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr 3 ]옥트레오테이트 유사체의 약물동력학 및 생체내 종양 국소화. FET-βAG-TOCA의 높은 친화도 및 전신 안정성을 고려하여, 종양에서의 이 방사성트레이서의 우수한 국소화가 관찰되는지 확인하였다. 도 16a는 sstr-2 발현 AR42J 종양을 갖는 마우스를 통한 통상의 횡 및 시상 PET 화상 슬라이스를 도시하며, 이는 높은 시그날-대-배경 콘트라스트로 종양, 신장 및 방광/소변에서의 FET-βAG-TOCA의 국소화를 나타낸다. 반대로, 스크램블 펩티드 FET-βAG-[W-c-(CTFTYC)K]를 주사하는 경우 마우스의 종양 및 신장에서는 방사성트레이서 국소화가 관찰되지 않았다(도 16b). 이러한 경우에서, 트레이서 국소화는 주로 뇌, 소변, 간 및 장에서 나타났다(데이타는 제시하지 않음). 종양, 신장, 간, 근육 및 방광/소변에서 [18F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트 유사체 모두의 비교용 약물동력학을 도 17에 도시한다. AR42J 종양에서의 방사성트레이서 흡수율은 60 분의 전체 스캐닝 기간에 걸쳐 신속한 증가를 특징으로 하였다. FET-G-TOCA는 최고의 종양 흡수율을 가지며, 이에 이어서 FET-βAG-TOCA는 [18F]-AIF-NOTA-OC에 대해 더 높거나 또는 이에 필적하는 흡수율을 갖는다. 상기 트레이서들은 종양 흡수율에 대하여 임상의 방사성트레이서인 [68Ga]-DOTATATE보다 우수하였다(표 6). FET-G-PEG-TOCA 및 FETE-PEG-TOCA의 구조내에서 구체화된 PEG-링커는 종양 흡수율이 감소되었다(도 17; 표 6). 간에서의 비특이성 흡수율은 일반적으로 낮으며(<7%ID/㎖), FET-βAG-TOCA는 간 흡수율이 최저이었으며; FET-G-TOCA 및 FETE-PEG-TOCA는 간 흡수율이 최고이었다. PEG-TOCA 유사체는 그의 더 낮은 지방친화도를 유지하면서 최고의 소변 청소율을 가졌다. 또한 sstr-을 발현시키는 신장에서의 방사성트레이서 동력학 프로파일[Bates, CM, et al., Kidney Int. 2003;63:53-63]은 종양에서의 것과는 상이하였으나, 흡수율의 정도는 2종의 방사성트레이서인 FET-βAG-TOCA 및 FET-G-TOCA의 경우 최고이었으며; [18F]-AIF-NOTA-옥트레오티드는 신장 흡수율이 비교적 낮았다. 평균 근육 흡수율은 모든 방사성트레이서의 경우 <3%ID/㎖이었다. 골에서의 방사성트레이서 흡수율은 모든 유사체에 대하여 낮았으며, 이는 탈불소화가 적거나 또는 없다는 것을 나타냈다. 본 출원인은 영상화 실험에서의 방사성트레이서의 흡수율과 직접 조직 계수를 비교하였다. 프로파일은 일반적으로 일치하였으나, 그 정도는 직접 계수에 대하여 더 높았으며, 이는 부분 부피 평균과 일치하였다. 영상화의 경우에서의 전체 종양의 샘플링에 비하여 조직의 일부분만의 직접 방사능 측정(감마 계수)은 또한 체계상의 차이를 초래할 수 있었다.
FET -β AG - TOCA 의 흡수율은 특이적이다. 이 방사성트레이서의 높은 종양 흡수율을 고려하여, 본 출원인은 원형 [18F]플루오로에틸트리아졸-[Tyr3]옥트레오테이트로서 FET-βAG-TOCA를 사용하여 생체내 흡수율의 특이성을 평가하였다. 본 출원인은 하기와 같이 방사성트레이서 흡수율이 특이적이라는 것을 입증하였다; i) sstr-2에 대한 불량한 친화도를 유지할 시에, 방사능표지된 스크램블 펩티드(FET-βAG-[W-c-(CTFTYC)K])는 생체내 AR42J 모델에서의 검출 가능한 종양 흡수율을 나타내지 않았다(도 18). FET-βAG-[W-c-(CTFTYC)K] 흡수율은 또한 높은 sstr-발현 정상 조직(신장)에서 낮았으며, 흡수율은 FET-βAG-TOCA에 비하여 간에서 더 높았다. ii) 방사성트레이서의 종양 흡수율이 수용체-매개되었다는 것을 나타내기 위하여, sstr-결합 부위를 포화시키기 위하여 과잉의 비표지 옥트레오티드(100배 몰 당량)로 마우스를 예비-주사하여 차단 실험을 실시하였다. 이는 AR42J 이종이식물에서 FET-βAG-TOCA의 2배(직접 계수에 의함) 더 낮은 흡수율을 초래하였다. 비표지 옥트레오티드를 사용한 차단후, 신장(초기 시점 단독), 근육 및 더 작은 정도로는 간 방사능 농도가 증가되었으며, 소변 방사능은 감소되었다(도 18). iii) FET-βAG-TOCA 흡수율의 특이성에 대한 추가의 증거는 AR42J 이종이식물에 비하여 낮은 sstr-발현 HCT116 이종이식물에서 낮은 흡수율에 의하여 제공되었다(표 6).
흥미롭게는, FET-G-TOCA 및 FET-βAG-TOCA 화합물에 대한 종양 흡수율은 오늘날까지 보고된 바는 최고이었으며, 임상적으로 사용되고 있는 [68Ga]-DOTA-TATE의 것보다 더 높았다(표 6). 유사하게, 2종의 [18F]-플루오로에틸트리아졸-[Tyr]3-옥트레오테이트 유사체의 종양 흡수율은 동일한 종양 모델에서 Froidevaux et al.이 [111In]-DTPA-옥트레오티드에 대하여 보고된 것(3.03±0.26%ID/g)보다 상당히 더 높았다(문헌[Froidevaux, S., et al., Endocrinology. 2000;141:3304-3312]). 트레이서는 또한 [18F]-AIF-NOTA-OC에 비하여 흡수율이 유사하거나 또는 더 높았다. FET-G-TOCA 및 FET-βAG-TOCA의 높은 종양 흡수율과는 대조적으로, 2종의 PEG화 유사체는 더 낮은 종양(및 신장) 흡수율을 나타냈다. 이는 펩티드의 PEG화가 종종 반감기를 증가시키며 그리고 일반적으로 신체로부터의 전체 청소율을 감소시킨다는 것을 고려하면 예상 밖의 발견이었다(문헌[Veronese, F.M., et al., Drug Discov Today. 2005; 10:1451-1458]). 이러한 발견은 PEG화의 성질 중 하나가 또한 분자의 수용성이 더 커지도록 한다는 사실에 의하여 부분적으로 설명될 수 있다. 문헌[Veronese, F.M., et al., BioDrugs. 2008;22:315-329]은 친수성이 적은 비-PEG화 유사체에 비하여 순환으로부터의 더 신속한 청소율을 뒷받침하며; 높은 소변 청소율에 의하여 뒷받침된다(도 17f). PEG-TOCA 유사체의 낮은 흡수율은 그의 더 낮은 시험관내 친화도에 의하여 설명될 수 있다(도 14).
수용체 발현이 결여된 조직, 예컨대 간 및 근육[Reynaert, H., et al., Gut. 2004; 53:1180-1189]은 방사성트레이서의 흡수율이 낮을 것이라는 것을 예측하였다. PEG-TOCA 유사체는 더 낮은 비-표적 조직 흡수율을 나타냈다. 이러한 시리즈에서의 PEG화로부터 생성된 더 높은 친수성은 비-표적 조직으로부터의 더욱 신속한 제거를 초래할 것으로 보인다. PET 실험으로부터의 시간 경로는 이러한 효과를 정량화하도록 하였다. 흥미롭게도, PEG화 유사체에 비하여 중간 친수성을 갖는 FET-βAG-TOCA(표 6)는 간 및 근육을 비롯한 비-표적 조직에서 유사한 낮은 흡수율을 나타냈다. 이는 최고의 종양 흡수율을 갖는 FET-G-TOCA에서 구현되지 않았던 FET-βAG-TOCA의 긍정적인 특성이 된다.
영상화
본 발명의 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체 또는 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체는 증가되거나 또는 높은 레벨의 소마토스타틴 수용체를 나타내는 질환 상태 또는 종양에 대한 방사성트레이서 또는 조영제로서 사용될 수 있다.
하나의 실시양태에서, 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체는 증가되거나 또는 높은 레벨의 소마토스타틴 수용체를 나타내는 질환 상태 또는 종양에 대한 PET 방사성트레이서로서 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체는 증가된 레벨의 소마토스타틴 수용체를 발현시키는 것으로 공지된 신경내분비 종양의 생체내 검출에 유용한 PET 방사성트레이서로서 사용될 수 있다. 하나의 실시양태에서, 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체는 높은 레벨의 소마토스타틴 수용체를 발현시키는 폐 종양의 검출에 유용한 PET 방사성트레이서로서 사용될 수 있다.
그러므로, 한 구체예에서, 본 발명은
i) 본원에 기재한 바와 같이 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)를 대상체에게 투여하는 단계,
ii) 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)가 상기 대상체에서 소마토스타틴 수용체(들)에 결합되도록 하는 단계;
iii) 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)에 포함된 18F에 의하여 방출되는 시그날을 검출하는 단계;
iv) 상기 시그날의 위치 및/또는 양을 대표하는 화상을 생성하는 단계를 포함하며, 증가되거나 또는 높은 레벨의 소마토스타틴 수용체를 나타내는 질환 상태 또는 종양의 분포 및/또는 정도를 측정하기 위한 PET 영상화 방법을 제공한다.
그러한 방법은 임의로 상기 대상체에서의 질환 상태의 분포 및 정도를 측정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 상기 질환 상태의 분포 및 정도는 상기 시그날과 직접 관련이 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명은
i) 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)를 대상체에게 투여하는 단계;
ii) 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)가 대상체에서 신경내분비 종양(들)의 표면에서 소마토스타틴 수용체(들)에 결합되도록 하는 단계;
iii) 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)에 포함된 18F에 의하여 방출된 시그날을 검출하는 단계;
iv) 상기 시그날의 위치 및/또는 양을 대표하는 화상을 생성하는 단계를 포함하며, 대상체에서 하나 또는 복수의 신경내분비 종양의 분포 및/또는 정도를 측정하기 위한 PET 영상화 방법을 제공한다.
그러한 방법은 임의로 대상체에서 신경내분비 종양(들)의 분포 및 정도를 측정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 신경내분비 종양(들)의 분포 및 정도는 상기 시그날과 직접 관련되어 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명은
i) 본원에 기재된 바와 같이 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)를 대상체에게 투여하는 단계;
ii) 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)가 대상체에서 폐 종양(들)의 표면에서 소마토스타틴 수용체(들)에 결합되도록 하는 단계;
iii) 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)에 포함된 18F에 의하여 방출된 시그날을 검출하는 단계;
iv) 상기 시그날의 위치 및/또는 양을 대표하는 화상을 생성하는 단계를 포함하며, 대상체에서 하나 또는 복수의 폐 종양의 분포 및/또는 정도를 측정하기 위한 PET 영상화 방법을 제공한다.
그러한 방법은 임의로 대상체에서 폐 종양(들)의 분포 및 정도를 측정하는 단계를 더 포함하며, 여기서 폐 종양(들)의 분포 및 정도는 상기 시그날과 직접 관련되어 있다.
본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 "투여하는" 단계는 바람직하게는 비경구, 가장 바람직하게는 정맥내로 실시된다. 정맥내 경로는 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 대상체의 신체를 통하여 전달하는 가장 효율적인 방식을 나타낸다. 정맥내 투여는 대상체에게 실질적인 물리적 개입 또는 실질적인 건강 위험을 나타내지는 않는다. 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체는 본원에서 정의된 바와 같이 본 발명의 방사선약물 조성물로서 투여되는 것이 바람직하다. 투여 단계는 본 발명의 PET 영상화 방법의 완전한 정의에 요구되지는 않는다. 그래서, 본 발명의 PET 영상화 방법은 또한 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 예비투여하게 되는 대상체에게 실시한 상기 정의된 단계 (ii)-(v)를 포함하는 것으로 이해할 수 있다.
투여 단계의 실시 이후 그리고 검출 단계 이전에, 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체는 소마토스타틴 수용체(들)에 결합되도록 한다. 예를 들면, 대상체가 무상해 포유동물인 경우, 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체는 포유동물의 신체를 통하여 동적으로 이동하여 그 내부의 다양한 조직과 접촉하게 된다. 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체가 소마토스타틴 수용체(들)와 접촉하면, 소마토스타틴 수용체(들)를 갖는 조직으로부터 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체의 청소율이 소마토스타틴 수용체(들)이 없거나 또는 적은 조직으로부터의 것보다 더 길게 소요되도록 특정한 상호작용이 발생한다. 소정 시점은 소마토스타틴 수용체(들)를 갖는 조직에 결합된 PET 방사성트레이서 대 소마토스타틴 수용체(들)가 없거나 또는 적은 조직에서 결합된 것 사이의 비율의 결과로서 소마토스타틴 수용체(들)에 특이적으로 결합되는 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체의 검출이 가능할 때 소정 시점이 도달될 것이다.
본 발명의 방법의 "검출" 단계는 시그날에 민감한 검출체, 즉 PET 카메라에 의하여 본 발명의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체에 포함된 18F에 의하여 방출되는 시그날의 검출을 포함한다. 이러한 검출 단계는 또한 시그날 데이타의 획득으로서 이해될 수 있다.
본 발명의 방법의 "생성" 단계는 획득한 시그날 데이타에 재구성 알고리즘을 적용하여 데이타세트를 생성하는 컴퓨터에 의하여 실시한다. 그후, 이러한 데이타세트를 조정하여 18F에 의하여 방출된 시그날의 위치 및/또는 양을 나타내는 화상을 생성한다. 생성된 화상의 평가에 의하여 "측정" 단계를 실시할 수 있도록 방출된 시그날은 소마토스타틴 수용체(들)의 발현과 직접 관련되어 있다.
본 발명의 "대상체"는 임의의 사람 또는 동물 대상체가 될 수 있다. 바람직하게는 본 발명의 대상체는 포유동물이다. 가장 바람직하게는 상기 대상체는 생체내에서 무상해 포유동물 신체이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 대상체는 사람이다. 생체내 영상화 방법은 소마토스타틴 수용체(들)의 비정상 발현과 관련된 병리학적 병태인 것으로 의심되거나 또는 공지된 대상체에서 또는 건강한 대상체에서 소마토스타틴 수용체(들)를 실험하는데 사용될 수 있다.
대안의 실시양태에서, 본 발명의 PET 영상화 방법은 상기 대상체에 대한 치료 섭생의 과정에서 반복적으로 실시될 수 있으며, 상기 섭생은 신경내분비 종양을 공격하는 약물의 투여를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 PET 영상화 방법은 신경내분비 종양을 공격하기 위한 약물을 사용한 치료 이전, 도중 그리고 이후에 실시할 수 있다. 이러한 방식에서, 상기 치료의 효과는 시간이 경과에 따라 모니터할 수 있다. PET는 우수한 민감도 및 해상도를 지니므로 이러한 적용예에 특히 적절하며, 그리하여 심지어 병변에서의 비교적 작은 변경이 시간 경과에 따라 관찰될 수 있으며, 치료 모니터링에 대하여 특히 이롭다.
상기에서 논의 및/또는 인용된 모든 특허, 학회지 논문, 간행물 및 기타의 문헌은 본원에 참고로 포함된다.

Claims (17)

  1. 하기 화학식 III의 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체.
    <화학식 III>
    R1-링커-R2
    (상기 화학식에서,
    R1은
    Figure pct00051
    이고;
    R2는
    Figure pct00052
    의 구조를 가지며;
    링커는 화학식 -(A)m-의 링커 기이고, 여기서 각각의 A는 독립적으로 -CRr, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, C4-C8 시클로헤테로알킬렌 기, C4-C8 시클로알킬렌 기, C5-C12 아릴렌 기 또는 C3-C12 헤테로아릴렌 기, 아미노산, 당 또는 단분산 폴리에틸렌글리콜(PEG) 빌딩 블록이고; 각각의 R은 H, C1-C20 알킬, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, C1-C4 알콕시 C1-C20 알킬 또는 히드록시C1-C20 알킬로부터 선택되며; m은 1 내지 20의 정수값임)
  2. 하기 화학식 1b의 FET-G-PEG-TOCA, 하기 화학식 2b의 FETE-PEG-TOCA, 하기 화학식 3b의 FET-G-TOCA, 하기 화학식 4b의 FETE-TOCA 및 하기 화학식 5b의 FET-βAG-TOCA로 이루어진 군으로부터 선택되는 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체.
    <화학식 1b>
    Figure pct00053
    ;
    <화학식 2b>
    Figure pct00054
    ;
    <화학식 3b>
    Figure pct00055
    ;
    <화학식 4b>
    Figure pct00056
    ;
    <화학식 5b>
    Figure pct00057

    (상기 화합물들 각각의 경우 R1은
    Figure pct00058
    이고,
    R2는
    Figure pct00059
    의 구조를 가짐)
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2가
    Figure pct00060
    인, 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체.
  4. 하기 화학식 7b의 FET-βAG-[W-c-(CTFTYC)K]인, 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체.
    <화학식 7b>
    Figure pct00061

    (상기 화학식에서, R1은
    Figure pct00062
    이고,
    R3은
    Figure pct00063
    임)
  5. 제4항에 있어서, R3이
    Figure pct00064
    인, 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 화합물 및 제약상 허용되는 담체, 부형제 또는 생체적합성 담체를 포함하는 제약 조성물.
  7. 하기 화학식 IV의 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체.
    <화학식 IV>
    R1-링커-R2
    (상기 화학식에서,
    R1은 이고,
    R2는
    Figure pct00066
    의 구조를 가지며;
    링커는 화학식 -(A)m-의 링커 기이고, 여기서 각각의 A는 독립적으로 -CRr, -CR=CR-, -C≡C-, -CR2CO2-, -CO2CR2-, -NRCO-, -CONR-, -NR(C=O)NR-, -NR(C=S)NR-, -SO2NR-, -NRSO2-, -CR2OCR2-, -CR2SCR2-, -CR2NRCR2-, C4-C8 시클로헤테로알킬렌 기, C4-C8 시클로알킬렌 기, C5-C12 아릴렌 기 또는 C3-C12 헤테로아릴렌 기, 아미노산, 당 또는 단분산 폴리에틸렌글리콜(PEG) 빌딩 블록이고; 각각의 R은 H, C1-C20 알킬, C2-C4 알케닐, C2-C4 알키닐, C1-C4 알콕시 C1-C20 알킬 또는 히드록시C1-C20 알킬로부터 독립적으로 선택되며; m은 1 내지 20의 정수값임)
  8. 하기 화학식 1a의 G-PEG-TOCA, 하기 화학식 2a의 E-PEG-TOCA, 하기 화학식 3a의 G-TOCA, 하기 화학식 4a의 E-TOCA 및 하기 화학식 5a의 βAG-TOCA로 이루어진 군으로부터 선택되는 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체.
    <화학식 1a>
    Figure pct00067
    ;
    <화학식 2a>
    Figure pct00068
    ;
    <화학식 3a>
    Figure pct00069
    ;
    <화학식 4a>
    Figure pct00070
    ;
    <화학식 5a>
    Figure pct00071

    (각각의 상기 화합물들의 경우 R1은
    Figure pct00072
    이고,
    R2는
    Figure pct00073
    의 구조를 가짐)
  9. 제7항 또는 제8항에 있어서, R2가
    Figure pct00074
    인, 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체.
  10. 하기 화학식 6a의 βAG-[W-c-(CTFTYC)K]인, 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체.
    <화학식 6a>
    Figure pct00075

    (상기 화학식에서, R1은
    Figure pct00076
    이고,
    R3은
    Figure pct00077
    임)
  11. 제10항에 있어서, R3이
    Figure pct00078
    인, 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체.
  12. 구리 촉매화된 클릭 화학 조건하에서 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)를 2-[18F]플루오로에틸아지드와 반응시켜 해당 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체를 형성하는 단계를 포함하는 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 알킨 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체(들)가 제7항의 화합물이며, 상기 해당 2-[18F]플루오로에틸 트리아졸 결합된 [Tyr3]옥트레오테이트 유사체가 제1항의 화합물인 방법.
  14. 제1항의 화합물을 대상체에게 투여하는 단계 및 상기 화합물을 대상체내에서 검출하는 단계를 포함하는 조영화 방법.
  15. (i) 대상체에게 제1항의 화합물 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 단계;
    (ii) 상기 화합물 또는 그의 제약 조성물을 상기 대상체내에 존재하는 소마토스타틴 수용체에 결합되도록 하는 단계;
    (iii) 상기 화합물 또는 그의 제약 조성물에서 방사성동위원소에 의하여 방출되는 시그날을 검출하는 단계;
    (iv) 상기 시그날의 위치 및/또는 양을 대표하는 화상을 생성하는 단계; 및 임의로
    (v) 상기 대상체에서 질병 상태의 분포 및 정도를 결정하는 단계를 포함하며, 대상체에서 생체내 증가되거나 또는 높은 레벨의 소마토스타틴 수용체를 나타내는 종양 또는 질환 상태의 검출 방법.
  16. (i) 대상체에게 제1항의 화합물 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 단계;
    (ii) 상기 화합물 또는 그의 제약 조성물이 상기 대상체에서 신경내분비 종양(들)의 표면에 존재하는 소마토스타틴 수용체(들)에 결합되도록 하는 단계;
    (iii) 상기 화합물 또는 그의 제약 조성물에서 방사성동위원소에 의하여 방출되는 시그날을 검출하는 단계;
    (iv) 상기 시그날의 위치 및/또는 양을 대표하는 화상을 생성하는 단계 및 임의로
    (v) 상기 대상체에서 신경내분비 종양(들)의 분포 및 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 생체내 신경내분비 종양(들)의 검출 방법.
  17. (i) 대상체에게 제1항의 화합물 또는 그의 제약 조성물을 투여하는 단계;
    (ii) 상기 화합물 또는 그의 제약 조성물이 상기 대상체에서 폐 종양(들)의 표면에 존재하는 소마토스타틴 수용체(들)에 결합되도록 하는 단계;
    (iii) 상기 화합물 또는 그의 제약 조성물에서의 방사성동위원소에 의하여 방출되는 시그날을 검출하는 단계;
    (iv) 상기 시그날의 위치 및/또는 양을 대표하는 화상을 생성하는 단계 및 임의로
    (v) 상기 대상체에서 폐 종양(들)의 분포 및 정도를 측정하는 단계를 포함하는, 대상체에서 생체내 폐 종양(들)의 검출 방법.
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