KR20140010517A - 약물 전달 및 세포내 흡수의 직접 모니터링이 가능한 약물전달 복합체 및 그 제조방법 - Google Patents

약물 전달 및 세포내 흡수의 직접 모니터링이 가능한 약물전달 복합체 및 그 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 약물 전달 및 세포내 흡수의 직접 모니터링이 가능한 약물전달 복합체 및 그 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 구체적으로는 이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자, 암세포 표적화분자 및 유효약물 성분을 포함하는 약물전달 복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 다양한 표적 세포에 대한 영상화와 치료효과를 동시에 제공할 수 있으며, 모니터링과 치료효과를 효과적으로 소형화함으로써 세포 수준에서 기능할 수 있는 새로운 테라그노시스 약물 개발에 대한 새로운 장을 열 수 있다.

Description

약물 전달 및 세포내 흡수의 직접 모니터링이 가능한 약물전달 복합체 및 그 제조방법 {Drug delivery complex enabling direct monitoring of delivery and cellular uptake of the drug and method for preparing the same}
본 발명은 특정 표적세포로 대상 약물을 전달하는 약물전달 복합체로서, 주입된 약물의 세포 흡수 및 방출을 광학적으로 직접 모니터링할 수 있는 약물전달 복합체 및 그 제조방법에 관한 것이다.
최근 수년 동안, 화학요법 치료방법의 개선을 위해 표적화된 약물전달 시스템에 대한 연구가 활발하게 진행되었다. 이와 관련하여, 세포 유형에 대해 선택적인 리간드의 사용과 약물의 선택적인 표적화를 가능하게 해 주는 컨주게이션이 매력적인 접근방법으로 등장하게 되었다 ((a) Chen, X.; Plasencia, C.; Hou, Y.; Neamati, N. J. Med . Chem . 2005, 48, 1098-1106. (b) Yamazaki, N.; Kojima, S.; Bovin, N. V.; Andre, S.; Gabius, S.; Gabius, H.-J. Adv . Drug Deliv . Rev . 2000, 43, 225-244. (c) Henne, W. A.; Doorneweerd, D. D.; Hilgenbrink, A. R.; Kularatne, S. A.; Low, P. S. Bioorg . Med . Chem . Lett . 2006, 16, 5350-5355. (d) Russell-Jones, G.; McTavish, K.; McEwan, J.; Rice, J.; Nowotnik, D. J. Inorg. Biochem . 2004, 98, 1625-1633).
그 중에서도, RGD (Arg-Gly-Asp) 서열을 포함하는 고리형 펩티드는 매우 효과적인 표적화제이다. 상기 서열은 잘 알려진 종양 관련 수용체인 ανβ3 인테그린에 의해 인식되어 세포 내로 반입되는데 (Pierschbacher, M. D.; Ruoslathi, E. Nature 1984, 309, 30-33), 상기 수용체는 일부 종양의 활성화된 내피세포에서 고발현되며, 종양에 의한 혈관신생 및 성장에 있어 중요한 역할을 한다 (Brooks, P. C.; Clarks, R. A.; Cheresh, D. A. Science 1994, 264, 569-571). 실제로, 독소루비신 ((a) Arap, W.; Pasqualini, R.; Ruoslahti, E. Science 1998, 279, 377-380. (b) de Groot, F. M. H.; Broxterman, H. J.; Adams, H. P. H. M.; van Vliet, A.; Tesser, G. I.; Elderkamp, Y. W.; Schraa, A. J.; Kok, R. J.; Molema, G.; Pinedo, H. M.; Scheere, H. W. Mol . Cancer Ther . 2002, 1, 901-911), 캄토테신 ((a) Dal Pozzo, A.; Ni, M.-H.; Esposito, E.; Dallavalle, S.; Musso, L.; Bargiotti, A.; Pisano, C.; Vesci, L.; Bucci, F.; Castorina, M.; Foder R.; Giannini, G.; Aulicino, C.; Penco, S. Bioorg . Med . Chem . 2010, 18, 64-72. (b) Dal Pozzo, A.; Esposito, E.; Ni, M.-H.; Muzi, L.; Pisano, C.; Bucci, F.; Vesci, L.; Castorina, M.; Penco, S. Bioconjugate Chem . 2010, 21, 1956-1967. (c) Huang, B.; Desai, A.; Tang, S.; Thomas, T. P.; Baker, J. R. Org . Lett . 2010, 12, 1384-1387), 및 파클리탁셀 ((a) Chen, X.; Plasencia, C.; Hou, Y.; Neamati, N. J. Med . Chem . 2005, 48, 1098-1106. (b) Yin, J.; Li, Z.; Yang, T.; Wang, J.; Zhang, X.; Zhang, Q. J. Drug Target . 2011, 19, 25-36. (c) Cao, Q.; Li, Z.-B.; Chen, K.; Wu, Z.; He, L.; Neamati, N.; Chen, X. Eur . J. Nucl . Med . Mol . Imaging 2008, 35, 1489-1498)과 같은 항암제와 컨주게이션된 고리형 RGD 펩티드가 생체 외 및 생체 내에서 유리된 약물에 비해 개선된 치료작용을 나타내는 것으로 보고된 바 있다. 통상적으로, 표적화된 약물은 보통 세포 내에서 활성 상태의 약물로 변환되도록 해 주는 절단성 링커를 가지는 RGD 담체와 결합된다.
일반적으로, 약물의 흡수 및 방출은 직접적으로 측정되는 것이 아니라 활성 또는 세포부착의 증가를 통해 유추되는 것이다. 따라서, 약학적으로 활성을 가지는 약물이 정확히 언제, 어디에서, 어떻게 세포로 전달되는지를 알기 어렵다. 그러므로, 치료효과를 위한 활성 약물과, 흡수 및 전달의 용이한 모니터링을 위한 형광원을 갖는, RGD를 이용한 약물전달 시스템은 이러한 문제점을 해결하기 위한 바람직한 방안이 될 수 있을 것이며, 이를 통해 약물의 전달과 방출을 직접적으로 모니터링할 수 있을 것이다. 또한, 효능의 개선과 더불어 용이한 이미징을 가능하게 함으로써, 치료와 진단을 겸비한 테라그노시스의 적용분야를 세포 이하 수준까지도 확장시킬 수 있을 것이다.
따라서, 본 발명은 상기 요구를 충족시키기 위해서, 특정 표적세포로 대상 약물을 효과적으로 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 주입된 약물의 세포 흡수 및 방출을 광학적으로 직접 모니터링할 수 있는 약물전달 복합체 및 그 제조방법을 제공한다.
본 발명은 상기 첫 번째 과제를 해결하기 위해서,
이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자, 암세포 표적화분자 및 유효약물 성분을 포함하는 약물전달 복합체를 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 암세포 표적화분자는 RGD 서열을 포함하는 고리형 펩티드이고, 상기 형광표지자는 나프탈이미드 유도체일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 나프탈이미드 유도체는 나프탈렌, 파이렌 및 로다민으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 유효약물은 캄토테신, 독소루비신 및 젬시타빈으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 약물전달 복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 복합체일 수 있다:
Figure pat00001
또한, 본 발명은 상기 두 번째 과제를 해결하기 위해서,
이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자와 유효약물 성분을 반응시킴으로써 중간체 화합물을 제조하는 단계; 및
상기 중간체 화합물에 암세포 표적화분자를 결합시키는 단계
를 포함하는 약물전달 복합체의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 암세포 표적화분자는 RGD 서열을 포함하는 고리형 펩티드이고, 상기 형광표지자는 나프탈이미드 유도체이며, 상기 유효약물은 캄토테신일 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 상기 중간체 화합물은 하기 화학식 2의 화합물과 캄토테신을 반응시킴으로써 제조되는 하기 화학식 3의 화합물일 수 있다:
Figure pat00002
Figure pat00003
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 약물전달 복합체는 상기 화학식 3의 화합물과 하기 화학식 4의 화합물을 반응시킴으로써 제조되는 상기 화학식 1의 화합물일 수 있다:
Figure pat00004
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 화학식 3의 화합물은 상기 화학식 4의 화합물과 반응시키기 이전에, 트리플루오로 아세트산 및 디클로로메탄의 혼합물과 반응시킴으로써 가수분해될 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면, 상기 화학식 2의 화합물은 상기 캄토테신과 반응시키기 이전에, 트리포스젠과 반응시킬 수 있다.
본 발명에 따르면, 다양한 표적 세포에 대한 영상화와 치료효과를 동시에 제공할 수 있으며, 모니터링과 치료효과를 효과적으로 소형화함으로써 세포 수준에서 기능할 수 있는 새로운 테라그노시스 약물 개발에 대한 새로운 장을 열 수 있다.
도 1은 화합물 8에 대한 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
도 2는 화합물 1에 대한 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
도 3a 및 3b는 화합물 3에 대한 흡수 (3a) 및 형광 (3b) 스펙트럼을 나타낸 도면들이며, 도 3c는 GSH의 농도를 증가시키면서 관찰한 화합물 3의 형광 스펙트럼 변화 그래프이며, 도 3d는 GSH가 존재하거나 존재하지 않는 경우에, 화합물 3의 형광 반응을 pH에 대한 함수로서 도시한 그래프이다.
도 4a 및 4b는 GSH, 시스테인, 호모시스테인 및 다양한 금속 양이온들의 존재 및 부존재하에서 측정된 화합물 3의 흡수 (4a) 및 형광 (4b) 스펙트럼을 나타낸 도면들이다.
도 5a 및 5b는 GSH, 시스테인, 호모시스테인 및 다른 아미노산들에 대한 화합물 3의 흡수 (5a) 및 형광 (5b) 스펙트럼을 나타낸 도면들이다.
도 6a 및 6b는 GSH 부존재시 (6a) 및 존재시 (6b)의 화합물 3의 역상 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도면들이다.
도 7은 캄토테신, 화합물 3 및 화합물 6의 혼합 용액에 대한 역상 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도면이다.
도 8a 및 8b는 캄토테신, 화합물 1 및 화합물 8의 혼합 용액 (8a)과, 화합물 1 및 GSH의 혼합 용액 (8b)에 대한 역상 HPLC 크로마토그램을 나타낸 도면이고, 도 8c는 ESI-MS 스펙트럼 및 UV 흡수 스펙트럼에 의해서 지시된 피크에 해당되는 물질들의 화학 조성을 확인한 그래프이다.
도 9a 및 9b는 캄토테신 및 화합물 1의 흡수 (9a) 및 형광 (9b) 스펙트럼을 GSH의 존재 및 부존재 하에서 측정한 정규화된 그래프들이다.
도 10a는 GSH의 존재 및 부존재 하에서 측정한 화합물 1의 형광 반응 그래프이고, 도 10b는 GSH의 존재 및 부존재 하에서 시간의 함수로서 화합물 1로부터 방출된 CPT 양의 비율을 측정한 그래프이다.
도 11은 화합물 1로 처리된 U87 및 C6 세포들에 대한 공초점 현미경 영상들이다.
도 12는 화합물 3으로 처리된 U87 및 C6 세포들에 대한 공초점 현미경 영상들이다.
도 13은 화합물 1 및 화합물 3으로 처리된 U87 세포들에 대한 공초점 현미경 영상들이다.
도 14는 U87 세포 내에서 ERTrackerTMRed (0.01 μM)(A), LysoTracker
Figure pat00005
Red DND-99 (0.1 μM)(B), 또는 MitoTracker
Figure pat00006
Red FM(0.1 μM)(C)을 사용하여 수행한 화합물 1 및 3의 동일위치 (Colocalization) 분석실험 결과이다.
도 15a 및 15b는 각각 다른 농도의 화합물 1 (15a)과 화합물 3 (15b) 존재 하에서 세포 생존성을 나타낸 그래프들이다.
도 16은 화합물 1의 약물전달 메카니즘에 대한 개략도이다.
이하, 도면 및 실시예를 참조하여 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하기로 한다.
본 발명에 따른 약물전달 복합체는 이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자, 암세포 표적화분자 및 유효약물 성분을 포함한다.
본 발명에 따른 약물전달 복합체는 세포 내에 투입되어 복합체에 포함된 유효약물 성분이 방출됨에 따라서 온-오프 (on-off)되는 형광 변화 특성을 갖는다. 이는, 본 발명에 따른 약물전달 복합체가 표적 암세포에 도달하게 되면, 암세포에 상대적으로 풍부한 양으로 존재하는 티올류 (예를 들어, 글루타치온 또는 티오레독신)에 의해서 형광표지자의 이황화결합 잔기가 절단됨으로써 가능해진다. 따라서, 본 발명에 따른 약물전달 복합체는 암세포 표적화분자를 갖는 관계로 암세포에 특이적으로 유효약물 성분을 전달할 수 있을 뿐만 아니라, 암세포에 도달하면 암세포에 존재하는 티올류 화합물에 의해서 형광 특성을 나타내는 형광표지자를 갖는 관계로 약물방출을 광학적으로 직접 모니터링할 수도 있게 된다.
본 발명에 있어서, 상기 암세포 표적화분자는, 암세포로 타겟팅되어 유효약물 성분을 전달할 수 있는 분자들이 널리 사용될 수 있으며, 예를 들면 종양 관련 수용체인 ανβ3 인테그린에 의해 인식되어 세포 내로 반입되는 것으로 알려진 RGD (Arg-Gly-Asp) 서열을 포함하는 고리형 펩티드일 수 있다.
또한, 상기 형광표지자는 이황화결합 잔기를 포함함으로써 상기 이황화결합이 절단될 때 형광 특성의 변화가 나타나는 형광표지자가 사용될 수 있으며, 예를 들면 이황화결합이 절단될 때 적색편이 형광 특성을 나타내는 나프탈이미드 유도체가 형광표지자로 사용될 수 있다. 구체적으로, 상기 나프탈이미드 유도체는 나프탈렌, 파이렌 및 로다민으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물일 수 있다.
본 발명에 따른 약물전달 복합체에 의해서 암세포로 전달되는 유효약물로는, 형광표지자와 화학결합에 의해서 연결될 수 있는 암세포 치료용 약물들이 사용될 수 있으며, 구체적으로, 캄토테신 (camptothecin: CPT), 독소루비신 (doxorubicin) 및 젬시타빈 (gemcitabin)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물을 유효약물로 사용할 수 있다.
하기 화학식 1에는 본 발명에 따른 약물전달 복합체의 구체적인 예로서, 암세포 표적화분자로서 RGD (Arg-Gly-Asp) 서열을 포함하는 고리형 펩티드를, 유효약물로서 항종양 억제제로 널리 알려진 캄토테신을, 또한 형광표지자로서 나프탈이미드 유도체를 포함하는 복합체가 표시되어 있다:
<화학식 1>
Figure pat00007
본 발명은 또한, 이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자와 유효약물 성분을 반응시킴으로써 중간체 화합물을 제조하는 단계; 및 상기 중간체 화합물에 암세포 표적화분자를 결합시키는 단계를 포함하는 약물전달 복합체의 제조방법을 제공한다.
하기 반응식 1에는 예를 들어, 암세포 표적화분자로서 RGD 서열을 포함하는 고리형 펩티드를, 형광표지자로서 이황화결합 잔기를 포함하는 나프탈이미드 유도체를, 유효약물로서 캄토테신을 사용하여 본 발명에 따른 약물전달 복합체를 제조하는 반응을 개략적으로 나타내었다.
<반응식 1>
Figure pat00008
상기 반응식 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 먼저 유효약물 성분 (상기 반응식 1에서는 캄토테신)과 형광표지자 (상기 반응식 1에서는 하기 화학식 2의 화합물)를 반응시킴으로써 중간체 화합물 (상기 반응식 1에서는 하기 화학식 3의 화합물)을 제조하게 된다:
<화학식 2>
Figure pat00009
<화학식 3>
Figure pat00010
이때, 상기 화학식 2의 화합물, 즉 형광표지자는 캄토테신과의 화학결합을 위해서 트리포스젠과 반응시킴으로써 먼저 -OH기 말단을 카본산기로 치환해줄 수 있으며, 이어서, 치환된 카본산기 말단에 캄토테신이 결합된다.
또한, 상기 반응식 1로부터 알 수 있는 바와 같이, 제조된 중간체 화합물, 즉 상기 화학식 3의 화합물을 하기 화학식 4의 화합물과 반응시킴으로써 본 발명에 따른 약물전달 복합체를 제조할 수 있게 된다:
<화학식 4>
Figure pat00011
이때, 상기 화학식 3의 화합물, 즉 중간체 화합물은 상기 화학식 4의 화합물, 즉 암세포 표적화분자와의 화학결합을 위해서 트리플루오로 아세트산 및 디클로로메탄의 혼합물과 반응시켜서 가수분해를 수행함으로써 먼저 t-부틸기 말단을 제거해줄 수 있으며, 이어서, t-부틸기 말단이 제거된 카르복시기 말단에 암세포 표적화분자로서 RGD (Arg-Gly-Asp) 서열을 포함하는 고리형 펩티드가 부착된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하기로 하되, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.
실시예
β-ala-O t Bu를 종래 문헌에 보고된 바에 따라서 합성하였다 (Ruijtenbeek, R.; Kruijtzer, J. A. W.; van de Wiel, W.; Fischer, M. J. E.; Fluck, M.; Redegeld, F. A. M.; Liskamp, R. M. J.; Nijkamp, F. P. ChemBioChem 2001, 2, 171-179). 또한, 각각 하기 화학식 5, 6 및 7을 갖는 나프탈이미드 유도체들 역시 종래 문헌에 보고된 바에 따라서 합성하였다 (Lee, M. H.; Han, J. H.; Kwon, P.-S.; Bhuniya, S.; Kim, J. Y.; Kang, C.; Kim, J. S. J. Am . Chem. Soc . 2012, 134, 1316-1322).
Figure pat00012
Figure pat00013
Figure pat00014
암세포 표적화분자로서, 하기 화학식 4의 RGD 서열을 포함하는 고리형 펩티드 c(RGDyK)는 FutureChem Co., Ltd.에서 구입하였다.
<화학식 4>
Figure pat00015
또한, 이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자의 이황화결합이 절단되어 생성되는 산물의 확인을 위해서, 하기 화학식 8의 화합물을 아래에 서술된 방법에 의해서 합성하였다.
Figure pat00016
화합물 8의 합성
DMF (0.5 mL) 중의 화합물 7 (2.0 mg, 0.7 μmol)과 DIPEA (2.5 μL, 1.4 μmol)의 혼합물에 TSTU (1.6 mg, 5.5 μmol)를 가하고 반응혼합물을 실온에서 교반하였다. 2 시간 동안 교반한 후, DMF에 용해된 c(RGDyK) (4.7 mg, 5.5 μmol)를 가하였다. 반응혼합물을 질소 하에서 밤새 교반하였다. 휘발성분을 제거하고 잔류물을 HPLC (고정상 : VP-ODS, 4.6 x 150 mm, 이동상 : 완충액 A(H2O), 완충액 B(CH3CN))로 정제하였다. 화합물 8을 5~90%의 완충액 B로 5~20 분 동안 용리시키고 동결건조하여 노란색의 부드러운 분말을 얻었다 (2.0 mg, 33%). 도 1에는 화합물 8에 대한 HPLC 크로마토그램을 나타내었다 (순도 > 98%). HPLC 체류시간 : 9.1 분, ESI-MS m/z(M+) 계산값 885.9, 측정값 886.4(M+H +).
화합물 2의 합성
20 ml의 무수 톨루엔 중의 화합물 6 (1.0 g, 2.9 mmol)과 트리포스진 (2.6 g, 8.7 mmol)의 혼합물에 DIPEA (1.5 ml, 8.7 mmol)를 적가하였다. 얻어진 용액을 3 시간 동안 환류 하에 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 반응혼합물을 질소기체로 플러싱하였다. 미반응 포스진 기체 (주의: 유독성)를 제거하고 NaOH로 중화한 후, 증류 THF/DCM (v/v, 1:1) 내의 2,2'-디티오디에탄올 (2.3 g, 14.5 mmol) 용액을 혼합물에 가하였다. 반응혼합물을 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고 CH2Cl2 (100 ml)와 물 (100 ml)을 가한 후, 유기층을 모았다. CH2Cl2 층을 무수 MgSO4로 건조시켰다. 용매를 제거한 뒤, 에틸아세테이트/헥산 (v/v, 1:1)을 용리액으로 사용하여 얻어진 조생성물을 실리카겔로 정제하였으며, 화합물 2가 노란색 오일로 얻어졌다 (91.5 mg, 60%). ESI-MS m/z(M+) 계산값 520.1, 측정값 519.1(M-H+). 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) : δ 8.54~8.48 (m, 2 H); 8.25 (t, 2 H, J = 9.6 Hz); 7.99 (br s, 1 H); 7.69 (t, 1 H, J = 8.3 Hz); 4.54 (t, 2 H, J = 5.9 Hz); 4.41 (t, 2 H, J = 7.4 Hz); 3.96 (br t, 2 H, J = 5.2 Hz); 3.06 (t, 2 H, J = 6.3 Hz); 2.95 (t, 2 H, J = 6.0 Hz); 2.68 (t, 2 H, J = 7.4 Hz); 2.56 (br s, 1 H); 1.42 (s, 9 H). 13C NMR(CDCl3, 100 MHz) : 170.9, 164.1, 163.6, 153.2, 139.3, 132.6, 131.5, 128.9, 126.7, 123.1, 117.7, 117.1, 81.1, 64.0, 60.7, 41.7, 37.6, 36.4, 34.0, 28.2 ppm.
화합물 3의 합성
20 ml의 무수 클로로포름 내의 CPT (50 mg, 0.1 mmol)와 DMAP (123 mg, 0.7 mmol)의 혼합물에 트리포스진 (0.2 g, 0.5 mmol)을 적가하였다. 얻어진 용액을 3 시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 반응혼합물을 질소기체로 플러싱하였다. 미반응 포스진 기체(주의 : 유독성)를 제거하고 NaOH로 중화한 후, 화합물 2 (70 mg, 0.1 mmol), DMAP (35 mg, 0.2 mmol), DIPEA (25 μL, 0.1 mmol)를 혼합물에 가하였다. 반응혼합물을 밤새 교반하였다. 용매를 증발시키고 CH2Cl2 (100 ml)와 물 (100 ml)을 가한 후, 유기층을 모았다. CH2Cl2 층을 무수 MgSO4로 건조시켰다. 용매를 제거한 뒤, 에틸아세테이트/헥산 (v/v, 4:1)을 용리액으로 사용하여 얻어진 조생성물을 실리카겔로 정제하였으며, 화합물 3이 노란색 고체로 얻어졌다 (60 mg, 47%). ESI-MS m/z(M+) 계산값 894.2, 측정값 923.2(M-H+). 1H NMR(CDCl3, 400 MHz) : δ 8.57~8.49 (m, 2 H); 8.38 (s, 1 H); 8.30 (d, 1 H, J = 8.4 Hz) 8.22~8.16 (m, 2 H); 8.05 (s, 1 H); 7.95 (d, 1 H, J = 8.2 Hz); 7.86~7.82 (m, 1 H); 7.71~7.67 (m, 2 H); 7.32 (s, 1 H); 5.37~5.03 (m, 4 H); 4.58~4.30 (m, 6 H); 3.07~2.95 (m, 4 H); 2.70 (t, 2 H, J = 7.4 Hz); 2.27~2.02 (m, 2 H); 1.43 (s, 9 H); 0.98 (t, 3 H, J = 7.4 Hz). 13C NMR(CDCl3, 100 MHz): 170.7, 167.4, 164.0, 163.5, 157.1, 153.9, 152.9, 152.1, 148.9, 146.5, 145.6, 139.4, 132.4, 131.3, 130.9, 129.6, 128.9, 128.4, 128.3, 126.8, 126.5, 123.1, 123.0, 120.0, 117.6, 116.5, 95.9, 80.8, 78.4, 66.9, 66.5, 63.0, 50.0, 37.6, 36.5, 36.3, 33.9, 31.8, 28.1, 7.7 ppm.
화합물 1의 합성
TFA/DCM (v/v, 1:1) 용액을 화합물 3 (9 mg, 0.1 mmol)에 가하였다. 30 분 동안 교반한 후, 휘발성분을 감압 하에 제거하였다. 얻어진 조생성물을 MS 분석을 통해 확인하고, 바로 다음 반응에 사용하였다. 조생성물을 DMF (0.5 mL)에 녹이고 DIPEA (3.5 μL, 0.2 mmol)를 가하였다. 이어, TSTU (3.0 mg, 0.1 mmol)를 가하고 혼합물을 실온에서 교반하였다. 2 시간 동안 교반한 후, DMF 내의 화합물 4 ( c(RGDyK): 8.5 mg, 0.1 mmol)를 가하였다. 반응혼합물을 질소 하에 밤새 교반하였다. 용매를 제거하고 잔류물을 HPLC (고정상 : C18, 3.5 μm, 4.6 x 150 mm; 이동상 : 완충액 A (0.1% TFA를 포함하는 H2O); 완충액 B (0.1% TFA를 포함하는 CH3CN))로 정제하였다. 화합물 1을 5~70%의 완충액 B로 5~30 분 동안 용리시키고 동결건조하여 노란색의 부드러운 분말을 얻었다 (8.0 mg, 28%). 화합물 1의 HPLC 크로마토그램을 도 2에 도시하였다 (순도 > 97%). HPLC 체류시간 : 29.0 분, MALDI-TOF MS m/z(M+) 계산값 1440.5, 측정값 1440.1(M +).
합성 재료 및 방법
모든 반응은 질소 분위기 하에서 수행하였다. 컬럼 크로마토그래피에는 실리카겔 60 (Merck, 0.063~0.2 mm)을 사용하였다. 분석용 박층 크로마토그래피는 Merck 60 F254 실리카겔 (0.25 mm 두께로 프리코팅한 박판)을 사용하여 수행하였다. 1H 및 13C NMR 스펙트럼은 Varian 300 및 400 MHz 분광계를 사용하여 CDCl3와 CD3OD (Cambridge Isotope Laboratories, Cambridge, MA) 내에서 측정하였다. 화학적 이동은 모두 TMS의 잔류 양성자 피크를 내부표준으로 하여 ppm 단위로 기록하였다. 역상 HPLC 실험은 분석용으로 Agilent HPLC (Agilent 1100 시리즈)와 Zorbax C18 컬럼 (3.5 μm, 4.6 x 150 mm), 예비 분취용으로 Shim-pack VP-ODS (4.6 x 150 mm) 컬럼, Waters HPLC (Waters 600)와 XBridgeTM C18 컬럼 (5 mm, 19 x 150 mm)을 사용하여 수행하였다. 분석용 및 예비 분취용 HPLC의 유동속도는 각각 1.0 ml/min와 6.0 ml/min이었다. 이동상으로 완충액 A (0.1% v/v TFA가 포함된 물)와 완충액 B (0.1% v/v TFA가 포함된 아세토니트릴)를 사용하여 용매 농도기울기를 형성하였다. ESI 질량분석은 LC/MS-2020 시리즈 기기 (Shinmadzu)를 사용하여 수행하였다. MALDI-TOF 질량분석은 서울대학교 공동기기원에서 실시하였다.
분광분석 재료 및 방법
생물학적 분석물 [티올, Val, Tyr, Thr, Tau, Ser, Pro, Phe, Met, Lys, Leu, Ile, His, Gly, Gluc, Glu, Gln, Asp, Asn, Arg, Ala, Trp, Zn(II), Na(I), Mg(II), K(I), Fe(III), Fe(II), Cu(II) 및 Ca(II)]의 저장용액은 3차 증류수를 사용하여 제조하였다. 화합물 1과 화합물 3의 저장용액 역시 3차 증류수를 사용하여 제조하였다. 모든 분광학적 측정은 생리적 조건 (16%(v/v)의 DMSO를 포함하는 PBS 완충액, pH 7.4, 37)에서 수행하였다. 흡수 스펙트럼은 S-3100 분광광도계 (Scinco)를, 형광 스펙트럼은 크세논 램프가 구비된 RF-5301 PC 분광형광계 (Shimadzu)를 사용하여 측정하였다. 흡수 및 형광 스펙트럼 측정용 샘플은 석영 큐벳 (부피 3 ml)에 넣어 측정하였다. 여기 파장은 430 nm이었으며, 여기용 슬릿과 발산용 슬릿의 폭은 각각 3 nm와 1.5 nm이었다.
세포배양
C6 래트 신경교종 세포와 U87 인체 신경교종 세포를 10% 우태아혈청과 1% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM 내에서 2 일에 한 번씩 계대하면서 37, 5% CO2 및 95% ir 환경 하에 배양하였다. 세포를 24-웰 플레이트에 도말하고 밤새 안정화시켰다. 이어서, 화합물 1과 3의 세포흡수 및 약물방출을 모니터링하기 위하여 화합물 1과 3을 세포에 가하였다. 일부 세포는 화합물 1 또는 3으로 처리하기 전에 오카다산, Mitotracker, Lysotracker 또는 ERtracker를 포함하는 배지에서 배양하였다. 이어, 세포를 1 ml의 PBS로 세척한 다음, PBS 내의 화합물 1 또는 3으로 처리하였다. 배양 후, 세포를 PBS로 3회 세척하여 흡수되지 않고 잔류하는 화합물 1 또는 3을 제거한 다음 세포를 1 ml의 PBS 용액으로 옮겼다. 이어, 공초점 레이저 주사현미경 (Zeiss LSM 510, Zeiss, Oberko, Germany)을 사용하여 형광 이미지를 촬영하였다.
결과
화학식 1의 화합물은 토포이소머라제 I의 항종양 억제제인 캄토테신, 종양세포 내에 상대적으로 풍부한 티올에 의해 절단되는, 글루타티온(GSH) 또는 티오레독신(Trx)과 같은 이황화결합 링커, 그리고 이황화결합이 절단될 때 강한, 적색 편이된 형광을 발하는 나프탈이미드 부분으로 구성된다.
중간체 화합물인 화합물 3은 RGD를 포함하지 않는, 화합물 1의 유용한 유사체로서, 이를 이용하여 티올로 처리할 때 이황화결합의 절단이 일어나는지 확인하였다. 화합물 3의 수용액을 0-60 당량의 글루타티온(GSH)으로 처리하고 흡수 및 형광 스펙트럼의 변화를 모니터링하였다. 도 3a 및 3b로부터 알 수 있는 바와 같이, 5.0 mM GSH로 처리하자 370 nm와 473 nm에서의 화합물 3 특유의 넓은 흡수 및 발광 밴드가 각각 430 nm와 535 nm로 적색편이된 것을 확인할 수 있다. 535 nm에서 나타난 새로운 발광 밴드는 4-아미노나프탈이미드 유도체인 화합물 6 (도 3c)와 일치한다. 특히, 535 nm의 형광 밴드는 GSH의 농도 (0~5 당량 범위)에 따라 선형적으로 (R = 0.99619) 증가함을 알 수 있다 (도 3c의 삽입도면 참조).
다른 생물학적 분석물에 의한 간섭의 가능성을 확인하기 위하여, 동일한 조건에서 다양한 티올, 비티올계 아미노산 및 금속이온과 화합물 3의 반응을 조사하였다. 시스테인 (Cys) 또는 호모시스테인 (Hcy)을 화합물 3에 가했을 때, GSH의 경우와 비슷한 흡수 및 발광 특성의 변화가 나타났다 (도 4a 및 4b와, 도 5a 및 5b 참조). 반면에, 비티올계 아미노산 또는 금속이온으로 처리한 경우에는 분광학적 특성에 별다른 변화가 나타나지 않았다.
또한, GSH에 의한 535 nm에서의 형광 강도 증가가 pH에 의존하는 것임이 확인되었다. 도 3d에 도시된 바와 같이, 화합물 3은 GSH가 존재하지 않는 경우 pH 2~9 범위에서 안정하나, GSH 존재 하에서는 pH 5~11 범위에서 상당량의 형광 발광이 관찰된다. 이를 종합하면, 본 발명에 따른 중간체 화합물인 화합물 3은 생물학적 환경 하에서 티올에 의해 이황화결합이 절단되지만, 금속 양이온을 포함한 다양한 다른 잠재적인 경쟁물질의 존재 하에서는 절단되지 않는 것으로 판단된다.
한편, 역상 HPLC 및 ESI-MS 분석을 통해서, 이황화결합이 절단되고 GSH에 노출됨으로써 캄토테신이 방출된다는 것을 확인하였다. 분석 조건 하에서, 화합물 3의 수용액은 HPLC 크로마토그램에서 14.3분에 단일 피크를 보이고, ESI-MS 스펙트럼에서는 [화합물 3+Na]+에 해당하는 917.3 m/z에서 주피크를 나타내었다 (도 6a 및 6b 참조). 도 6a 및 6b로부터 알 수 있듯이, GSH (0.1 mM) 존재 하에서 화합물 3 (0.1 mM)에 해당하는 14.3분 피크의 강도가 감소하고 용리시간 10.1분과 11.3분에서 절단에 따른 새로운 피크들이 강하게 나타난다. 새로 나타난 피크들은 캄토테신 및 화합물 6의 피크와 잘 일치한다 (도 7 참조). 또한, ESI-MS 스펙트럼 분석 결과에서도, 화합물 3이 GSH에 노출된 후 캄토테신 ([M-H] = 347.1 m/z)과 화합물 6 ([M-H] = 339.2 m/z)에 해당하는 절단 결과물이 확인되었다 (도 6c 참조).
상기 결과들을 종합할 때, 화합물 3의 이황화결합이 GSH에 의해 절단되는 것으로 생각된다. 화학적인 관점에서 볼 때, 이러한 절단에 이어 분자 내 고리화와 인접 카바메이트 결합의 절단이 진행될 것으로 생각된다. 그 결과, 하기 반응식 2에서 보듯이 캄토테신이 방출되고 형광성 물질인 화합물 6이 생성될 것이다.
<반응식 2>
Figure pat00017
따라서, 형광 강도는 GSH에 의한 이황화결합 절단의 결과 화합물 3 (및 화합물 1)로부터 방출되는 캄토테신의 양에 정비례할 것으로 생각된다. GSH를 포함한 티올 물질은 정상세포보다 종양세포에 풍부하므로, 이러한 방출 시스템은 모니터링이 용이한 약물전달 시스템에 유용하게 적용될 수 있으며, 향후 항암 테라그노시스제로의 개발이 가능할 것으로 기대된다.
RGD를 포함하는 화합물 1의 이황화결합이 GSH에 의해 절단되는지를 확인하기 위하여, 화합물 3의 경우와 동일한 조건에서 화합물 1을 GSH와 반응시켰다. 예상한 바와 같이, RP-HPLC 및 ESI-MS 분석 결과 화합물 1의 경우의 반응 생성물은 유리된 캄토테신 (유효성분)과 나프탈이미드 유도체인 화합물 8로 확인되었다. (도 8a 내지 8c 참조). 흡수 및 형광 스펙트럼의 변화는 화합물 3의 경우와 유사하였다 (도 9a 및 9b 참조).
이황화결합의 절단에 의해 형광 발광의 변화와 함께 캄토테신의 방출이 일어난다는 것이 화합물 1의 RP-HPLC와 시간의존적 형광분석을 통해 재확인되었다. 도 10a 및 10b로부터 알 수 있는 바와 같이, 화합물 1을 GSH로 처리하는 경우 캄토테신의 방출량은 535 nm에서 관찰되는 화합물 8에 의한 형광 강도의 증가와 상관관계가 있는 것으로 확인되었다. 이와 대조적으로, GSH가 존재하지 않는 경우에는 화합물 1의 용액을 시간에 따라 모니터링하였을 때 캄토테신의 방출이나 535 nm에서의 형광 강도 증가가 나타나지 않았다. 따라서, 535 nm에서의 형광의 변화를 캄토테신의 방출을 알려주는 오프-온 신호로 생각할 수 있다.
화합물 1을 ανβ3 인테그린이 풍부한 종양세포로 유도하는 데 있어서 RGD 부분이 수행하는 기능을 확인하기 위하여, 두 가지 세포주, 즉 U87과 C6를 화합물 1과 화합물 3의 존재 하에 배양하였다. 이들 세포주를 선택한 이유는 U87 세포 내의 ανβ3 인테그린 발현 정도가 C6 세포 내에서에 비해 훨씬 높기 때문이다. 화합물 1로 처리한 경우, U87 세포는 형광 강도가 크게 증가하였으나, C6 세포에서는 60분 동안 배양한 후에도 약한 형광신호만이 관찰되었다 (도 11 참조). 이에 반해서, RGD 유도부분이 없는 화합물 3의 경우, 두 세포주는 거의 동일한, 강한 형광응답을 보였다 (도 12 참조). 두 세포주에서 관찰되는 이러한 뚜렷하게 다른 발광특성은 U87 세포에서 나타나는 선택적인 화합물 1의 흡수가 인테그린 수용체에 의해 매개되는 엔도시토시스에 의한 것이라는 가설과 부합한다.
엔도시토시스 과정에 대한 가설을 추가로 확인하기 위하여, 엔도시토시스 억제제인 오카다산 존재 하에 화합물 1의 세포흡수 여부를 조사하였다. 실험 결과를 도 13에 도시하였다. 도 13을 참조하면, U87 세포 내에서 화합물 1의 형광 강도는 오카다산의 농도가 증가함에 따라 (0~30 nM) 감소하였다. 반면, 화합물 3의 경우에는 오카다산이 존재함에도 강한 형광신호가 관찰되었다. 도 11 및 도 12에 도시된 결과를 함께 고려할 때, 이러한 사실은 U87 세포 내로의 흡수가 ανβ3 인테그린에 의해 매개되는 엔도시토시스에 의한 것이라는 예측을 뒷받침해 준다. 따라서, 이러한 세포의존적인 캄토테신 약물방출과 오프-온 형광의 변화는 티올에 의한 이황화결합의 절단에 기인함을 알 수 있다.
ανβ3 인테그린에 의해 매개되는 엔도시토시스가 진행된 후 세포 내에서의 화합물 1의 위치를 확인하기 위하여, 소포체(ER), 리소좀 및 미토콘드리아에 선택적인 염색시약을 사용하여 동일위치 분석실험을 수행하였다. 도 14에 도시된 바와 같이, 화합물 1로부터 발광되는 형광은 ERtracker (패널 1-A)와 잘 일치하나, Mitotracker 또는 Lysotracker (패널 1-B, 1-C)와는 일치하지 않는다. 반면, 화합물 3을 사용한 경우에는 ER (패널 2-A)보다는 미토콘드리아 (패널 2-C)의 형광 발광이 증가하였다. ER 막은 핵 내막과 인접하므로, 핵 내막으로 전달되는 물질은 ER 막을 통해 확산되는 것으로 생각할 수 있다. 따라서, 티올에 의한 이황화결합의 절단이 화합물 1의 경우 ER 내에서 진행되며, 그로 인해 캄토테신 분자가 방출되어 세포핵 내로 확산되어 토포이소머라제 I의 억제제로 작용하는 것으로 생각된다.
화합물 1 및 3의 효능과, 그에 따른 캄토테신의 전달 정도를 표준 세포생존율 분석방법을 통해 평가하였으며, 그 결과를 도 15a 및 15b에 도시하였다. U87 세포를 화합물 1 (1.0-50.0 μM)로 처리한 경우, 용량의존적인 세포생존율의 감소가 분명하게 나타났다 (1.0 x 104 세포/웰의 경우 세포생존율 49~29%). 1.0 μM 농도에서 48 시간 이내에 세포생존율이 49%에 도달하여, 화합물 1의 약리활성이 뚜렷이 나타났다 (도 15a). 화합물 3 역시 비슷한 방법으로 시험하였으나 세포독성 수준이 더 낮게 나타났다 (1.0 mM 농도의 경우 48 시간 후의 세포생존율이 76%였다. 도 15b 참조). 이러한 결과는 예상한 것과 정확히 일치하며, 화합물 1의 세포 내 전달의 주된 경로가 인테그린 수용체에 의해 매개되는 엔도시토시스와 관련된다는 가설을 실험적으로 뒷받침한다. 화합물 3은 이러한 국소화 메커니즘의 혜택을 받지 못하므로 활성이 낮은 것이다. 따라서, 화합물 1이 화합물 3에 비해 상대적으로 약리활성이 우수한 것은 캄토테신이 ER 내에서 방출되는 경우, 미토콘드리아 내에서 방출되는 경우에 비해 더 강한 능력을 가진다는 점에 의해 설명된다.
도 16에는 화합물 1의 약물전달 메커니즘을 도시하였다. 화합물 1은 인테그린 수용체에 의해 매개되는 엔도시토시스에 의해 종양세포 내로 선택적으로 투과되는 것으로 생각된다. ER 내에서, 티올에 노출되면서 이황화결합이 절단된다. 그 결과, 캄토테신이 방출되고 이와 동시에 ER 내에서 형광 오프-온 신호 응답이 촉발된다. 이처럼 정밀한 국소화 메커니즘으로 인해, 화합물 1과 같은 복합체를 이용하면 다양한 표적화된 세포에 대하여 영상화와 치료효과를 동시에 제공할 수 있을 것으로 기대된다. 따라서, 본 발명은 테라그노시스 약물의 개발에 있어 새로운 장을 열 수 있을 것이며, 모니터링과 치료효과를 효과적으로 소형화함으로써 세포 수준에서 기능하도록 한다는 점에서 큰 의의가 있다 하겠다.

Claims (11)

  1. 이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자, 암세포 표적화분자 및 유효약물 성분을 포함하는 약물전달 복합체.
  2. 제1항에 있어서, 상기 암세포 표적화분자는 RGD 서열을 포함하는 고리형 펩티드이고, 상기 형광표지자는 나프탈이미드 유도체인 것을 특징으로 하는 약물전달 복합체.
  3. 제2항에 있어서, 상기 나프탈이미드 유도체는 나프탈렌, 파이렌 및 로다민으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 약물전달 복합체.
  4. 제1항에 있어서, 상기 유효약물은 캄토테신, 독소루비신 및 젬시타빈으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 화합물인 것을 특징으로 하는 약물전달 복합체.
  5. 제1항에 있어서, 상기 약물전달 복합체는 하기 화학식 1로 표시되는 복합체인 것을 특징으로 하는 약물전달 복합체:
    <화학식 1>
    Figure pat00018
  6. 이황화결합 잔기를 포함하는 형광표지자와 유효약물 성분을 반응시킴으로써 중간체 화합물을 제조하는 단계; 및
    상기 중간체 화합물에 암세포 표적화분자를 결합시키는 단계
    를 포함하는 약물전달 복합체의 제조방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 암세포 표적화분자는 RGD 서열을 포함하는 고리형 펩티드이고, 상기 형광표지자는 나프탈이미드 유도체이며, 상기 유효약물은 캄토테신인 것을 특징으로 하는 약물전달 복합체의 제조방법.
  8. 제6항에 있어서, 상기 중간체 화합물은 하기 화학식 2의 화합물과 캄토테신을 반응시킴으로써 제조되는 하기 화학식 3의 화합물인 것을 특징으로 하는 약물전달 복합체의 제조방법:
    <화학식 2>
    Figure pat00019

    <화학식 3>
    Figure pat00020
  9. 제8항에 있어서, 상기 약물전달 복합체는 하기 화학식 3의 화합물과 하기 화학식 4의 화합물을 반응시킴으로써 제조되는 하기 화학식 1의 화합물인 것을 특징으로 하는 약물전달 복합체의 제조방법:
    <화학식 3>
    Figure pat00021

    <화학식 4>
    Figure pat00022

    <화학식 1>
    Figure pat00023
  10. 제9항에 있어서, 상기 화학식 3의 화합물은 상기 화학식 4의 화합물과 반응시키기 이전에, 트리플루오로 아세트산 및 디클로로메탄의 혼합물과 반응시킴으로써 가수분해되는 것을 특징으로 하는 약물전달 복합체의 제조방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 화학식 2의 화합물은 상기 캄토테신과 반응시키기 이전에, 트리포스젠과 반응시키는 것을 특징으로 하는 약물전달 복합체의 제조방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN106046029A (zh) * 2016-06-01 2016-10-26 西南大学 一类还原性响应两亲性小分子前药及其制备方法
WO2021005583A1 (en) 2019-07-11 2021-01-14 Sun Pharma Advanced Research Company Ltd. Camptothecin derivatives with a disulfide moiety and a piperazine moiety
CN113616803A (zh) * 2021-07-27 2021-11-09 中山大学附属第七医院(深圳) 一种gsh响应型吉西他滨纳米粒子及其制备方法与应用

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