KR20140033006A - 플라스미드 dna 이소폼 및 토포아이소머의 액체 상 분리 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 플라스미드 DNA(pDNA)의 이소폼(isoform), 토포아이소머 (topoisomer), 올리고머 및 멀티머(multimer) 형태를 분리하기 위한 양이온 그룹 (C), 및 수소 공여체 그룹(N-H)이 3 내지 5 원자수의 길이를 갖는 스페이서로 연결되고, 이종(heterogeneous) 매트릭스에 고정되거나 내재된, 카바모일이 결합된 음이온 교환 리간드를 포함하는 물질의 용도에 관한 것이다.
Description
본 발명은 이종(heterogeneous) 매트릭스에 고정되거나 내재된 카바모일이 결합된 음이온 교환 리간드를 사용하여 제어된 플라스미드 DNA(pDNA)의 이소폼 (isoform), 토포아이소머(topoisomer), 올리고머 및 멀티머(multimer) 형태를 분리하기 위한 크로마토그래피 물질 및 방법에 관한 것이다.
플라스미드 DNA(pDNA)는 그의 숙주 세포에 추가적인 작용성(function-alities)을 제공하는 염색체 외의 유전적 단위이다. 유전자 요법 또는 유전적 백신화에서 사용할 수 있는 플라스미드 DNA의 커다란 잠재성을 발견한 이후, 이러한 신규한 종류의 약물의 생물공학적 제조에 관심이 집중되고 있다(Schleef, M., Plasmids for Therapy and Vaccination, Wiley-VCH, Weinheim 2001). 보다 가능한 이소폼으로부터, 소위 공유결합 폐환형(ccc) 형태가 치료제로 가장 활성인 것으로 생각된다. 약학적 등급의 ccc 플라스미드 DNA는 대개 E. coli에서의 발효 후 수집, 알칼리성 용균 및 pDNA의 다단계 정제에 의해 제조된다(Urthaler, J., et al., Journal of Biotechnology, 2007, 128, pgs: 132-149). 인간 유전자 요법에 있어서, 이러한 모든 단계들은 조절 가이드라인을 충족시켜야 한다. 그러므로, 동물 유래 화합물(예를 들어, 암탉 알 흰자위 리소자임 같은 효소) 및/또는 독성 시약의 사용은 피해야 한다. 또한, 제조 공정은 (박테리아 숙주의 경우 내독소 같은)숙주와 연관된 불순물의 낮은 농도가 보장되어야 한다(Urthaler, J., Chemical Engineering & Technology, 2005, 28, pgs: 1408-1420 참조). 또한, 다른 pDNA 이소폼과 관련한 다량의 ccc 형태가 생체활성 약물의 최종 배합에 필요하다(FDA, U., in: Administration, F. a. D. (Ed.), Considerations for Plasmid DNA Vaccines for Infectious Disease Indications, Rockville, MD 2007).
품질관리에서뿐만 아니라 상류 및 하류 공정 동안 플라스미드 이소폼 분포에 대한 신뢰할 수 있는 분석이 필요하다. ccc 형태와는 별도로, 치료요법과 백신화에 덜 효과적인 것으로 간주되는 다른 형태를 모니터해야 한다.: (a) ccc 형태로부터 DNA 골격 내 단일 닉(nick)에 의해 생성된 개방환형 형태(oc) (b) 2개의 닉이 인접하여 있을 경우 생성된 선형 형태(lin). 이러한 모노머 형태뿐만 아니라, 연쇄체(concatemer)(즉, 연속적으로 연결된 동일한 DNA 서열의 다수 카피를 함유하는 길게 연속하는 DNA 분자) 및 카테난(catenane)(즉, 사슬 내의 링크로서 함께 엮여진 환형 DNA) 같은 디- 및 올리고머 종도 발효 동안 생성될 수 있다(Lahijani, R. et al., Human Gene Therapy, 1996, 7, pgs: 1971-1980). 카테네이트된 DNA는 말단 대 말단으로 결합된 연쇄 DNA와 대조적으로 루프 대 루프로 결합된다.
전체 플라스미드 DNA의 효과적 분리에 이용가능한 다양한 방법들이 있으며(Stadler J., et al., J Gene Med, 2004; 6, pgs: S54 - S66), 예를 들면 친유황(thiophilic) 방향족 크로마토그래피(Sandberg, L.M., et al., Journal of Biotechnology, 2004, 109, pgs:193-199), 소수성 상호작용 크로마토그래피 (Ferreira, G.N.M., et al., Pharm. Pharmacol. Commun., 1999, 5, pgs: 57-59; Diogo, M.M., et al., Journal of Chromatography A, 2005, 1069, pgs: 3-22; Tiainen P. et al., Journal of Chromatography A, 2007, 1138, pgs: 84-94; Urthaler J. et al., Chemical Engineering and Technology, 2005, 28, pgs: 1408-1420), 또는 펩티드 친화성 크로마토그래피(Han Y. and Gareth M.F., J. Chromatogr. B, 2008, 874, pgs: 21-26)이다. EP 1 187 840 B1에서는 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC)를 사용하는 두 개의 pDNA 이소폼, 즉 ccc와 oc의 제조용 분리를 기술하였다. 그러나, 이 경우에 분리가 비특이적(즉, 소수성) 상호작용에 기초하는 반면, 본 발명에 따른 공정과 비교하여 상대적으로 낮은 분리 효율을 감수하고 있다(예를 들어 33페이지 도 7). 또한, HIC 분리에 필요한 코스모트로픽 염(cosmotropic salt)의 극도로 높은 적재량(예를 들어, 28페이지 도 1)으로 인하여 이러한 적재 이후 얻어진 생성물 용액은 그에 따라 탈염되어야 하는데, 즉 남아도는 염을, 예를 들어 크기 배제 크로마토그래피, 투석, 또는 멤브레인 분리를 사용하여 제거해야 한다. 또한, 축적된 염의 처분은 재정적으로 매우 필요하다. 또한, 폴리(L-라이신) 규조토 크로마토그래피에 의한 다양한 종류의 핵산 단리가 기술되었다(예를 들어, Finkelstein D. B., et al., J. Biochemistry, 1972,11, 25, pgs: 4853-8 ; 또는 Monaghan-Cannon M. and Dunican L. K., The Biochemical Journal, 1969, 115, 3, 7P). 게다가 아미노산(Arg, His, Lys) 친화성 크로마토그래피 분리방법은 (a) 분석 용도로 Sousa A., et al., J. Sep. Sci. 2010, 33, pgs: 2610-2618에, 또한 (b) 제조 목적으로 Sousa F., et al., Trends in Biotechnology, Vol.26 No.9, 2008, pgs:518-525에 기술되었다. 최근, 폴리메타크릴레이트 모놀리스(monolith)에 결합된 NH2-Cys-Met-Lys-Tyr-Val-Ser-His-Gly-Thr-Val-Ser-Arg-Val-Val-Asn-Gln-COOH 서열을 갖는 16-머 펩티드를 보고하였고 pDNA에 대한 결합과 일부 이소폼에 대한 선택성을 입증하였다(Y. Han, et al., J. Chromatogr. B, 2008,874, pgs: 21-26).
자연적인 ccc 플라스미드 샘플은 일련의 개별 위상적(topological) 이성체(토포아이소머)로 구성되며, 이것은 다양한 초나선(supercoiling) 정도에 의해 차이가 난다. 이러한 ccc 토포아이소머는 상이한 결합수를 가지며, 따라서 상이한 초헬릭스(superhelical) 회전수를 갖는다(Depew, R. E., Wang, J. C., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 1975, 72, pgs: 4275-4279). 초나선은 두 개의 양(quantity), 트위스트(Tw)와 라이드(writhe, Wr)로 이루어지며, 이들은 호환적이지만 임의의 토포아이소머 경우 둘의 합은 변하지 않는다. 생명공학, 분자생물학 및 새로운 바이오의약품과 치료제 개발의 주요 요소인 박테리아성 플라스미드는 생체 내에서 네거티브(negatively)로 초나선화된다. 초나선의 양은 약 6%이며, 이는 평균적으로 6 네거티브 초나선이 표준 조건 하에서 가장 일반적인 형태의 DNA, 소위 B-DNA의 100 헬리칼 회전(turn)마다 삽입되는 것을 의미하며, 평균적으로 1050 염기쌍마다 6 네거티브 초나선에 해당한다(매 회전(turn) 마다 10.5 염기쌍의 표준화 값이 계산에 사용된 경우). 토포아이소머 패턴은 활동일주기(circadian rhythm)에 따른 생체내 박테리아 세포 증식 동안 변화되는 것을 발견하였다(Woelfle, M.A., PNAS, 2007, 104, 47, pgs: 18819-18824).
플라스미드 토포아이소머 분리방법과 관련하여, 강력한 분해능을 갖는 모세관 겔 전기영동 같은 다양한 겔 포함 전기영동방법(Schmidt, T., et al., Analytical Biochemistry, 1999, 274, pgs: 235-240)이 사용될 수 있으나, 전반적으로 낮은 역동성(robustness), 저조한 샘플 염-내성 및 높은 시간 소모성을 수반하고 있다. DNA 삽입제(intercalating agent)의 전제조건은 이 과정 내에서 원치 않는 독성을 유발할 수 있다. 그러므로, 액체 크로마토그래피에 기반한 방법이 분석적 및 제조용 용도 모두에 바람직하다. 수많은 상이한 크로마토그래피 방법과 상이한 크로마토그래피 고정상들(지지체, supports)이 다양한 품질 선호도의 제조용 플라스미드 정제에 이용가능하다(예를 들어, Diogo, M. M., et al., Journal of Chromatography, A 2005, 1069, pgs: 3-22; Wu, L., Pang, G.-c., Chromatographia 2007, 66, pgs:151-157; Tiainen, P. et al., Journal of Chromatography, A 2007, 1149, pgs: 158-168; Sousa, F. et al., Analytical Biochemistry 2005, 343, pgs: 183 -185; 또는 Urthaler, J., et al., Journal of Chromatography, A 2005, 1065, pgs: 93-106). 그러나, 분석 스케일에서는 음이온 교환 컬럼, 예컨대 동일한 기본 물질, 즉 디에틸아미노에틸(DEAE)계 리간드를 갖는 친수성 유기 폴리머를 포함하는비다공성 2.5 μm 입자들을 사용하는, Tosoh Bioscience의 DNA-NPR(Tosoh Corporation, Tokyo, 일본) 또는 Waters의 GenPak FAX(Waters Corporation, Milford, Massachusetts, 미국)으로 선택이 제한된다. 토포아이소머 분포는 이제까지 전기영동기술에 의해서만 분석가능하다. 이와는 별개로, 최근의 기술에서 이러한 종류의 ccc 플라스미드 DNA를 분리하는데 이용가능한 물질이나 방법(크로마토그래피 포함)은 없다.
일반적으로, 크로마토그래피 방법의 유효성은 주로 다음 3가지 핵심사항에 의해 결정된다: (1) 분리 구획, 예를 들어 크로마토그래피 물질로 채워진 컬럼의 길이, (2) 컬럼에서 분석물의 이동속도를 나타내는 체류인자(용량인자), 및 (3) 분리되어야 하는 2종의 체류인자 간의 비율을 나타내는 선택성. 이들 중 가장 결정적인 것은 후자의 것으로, 여기에서 선택성은 (고체상/ 매트릭스/ 지지체로서 알려진)지지 물질과 지지체에 부착되거나 내재된 리간드 성질의 특성에 영향을 받는다.
작은 분자에 사용된 중간크기 기공(메조기공(mesopore))을 가진 다공성 지지체는 생체분자가 내부로 들어갈 수 없다(Rozing, G. P., Journal of Chromatography A, 1989, 476, pgs: 3-19). 거대 및 기가(giga)기공 물질은 물질 이송이 느리고 샘플 회수가 저조하다. 이 분야에서 분석에 사용하기 위한 가장 확실한 선택은 비기공성 입자 표면에서 체류성 박층을 특징으로 하는 미세 펠리큘라(micropellicular) 정지상인 것으로 생각된다(Huber, C. G., Journal of Chromatography, A, 1998, 806, pgs: 3-30). (제조 용도에 특히 적합한)또다른 대안은 우수한 결합능력과 초단(ultra-short) 분석으로 인한 모놀리스이며, 빠른 컬럼 흐름에서의 높은 분해능과 물질 이송의 제한이 없는 이점을 갖는다(Hahn, R., et. al., Separation Science and Technology, 2002, 37, pgs: 1545-1565).
최신 기술에서 단순한 삼차(예컨대 DEAE, 디에틸아미노에틸) 또는 사차(대개 Q로 약칭) 아민이 표준물로서 사용되는, 플라스미드 분리용 이온교환 크로마토그래피에 사용된 리간드는 거의 주목되지 않았다. 이러한 상당히 비특이적 그룹은 분석물의 음전하 수에 따라 핵산을 분리(Wieder, W., et al., Journal of Separation Science, 2006, 29, pgs: 2478-2484)하기 때문에, 분리가 상대적으로 불충분하다. 분석용과 제조용 방법 모두에 밀접하게 관련되어 있는 분리는 전하밀도와 유체역학 인자에 좌우되므로(Onishi, Y., et al, Analytical Biochemistry, 1993, 210, pgs: 63-68) 슬라롬(slalom) 크로마토그래피와 유사한 효과(즉, 폐쇄된 컬럼을 통과하는 DNA 분자의 진행이 유동 방향을 따르고 소위 "사행운동(reptation)"이라고 불리는 스네이크 에징(edging)과 같다)를 관찰할 수 있다. 이 방법에서는 pDNA 이성체 분리가 유속과 그래디언트 기울기에 좌우되어(Smith, C. R., et al., Journal of Chromatography, B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences, 2007, 854, pgs: 121-127), 이 시스템을 덜 강력하고 보다 예측할 수 없게 한다. 게다가, Molloy 등(Nucleic Acid Research, 2004, 32, e129/121-e129/110)은 DEAE 리간드에 기초한 이온교환 크로마토그래피를 사용하는 플라스미드 분리의 단점을 지적하였으며, 여기에서 ccc pDNA 샘플 내에서 계산된 oc 이성체(불순물) 함량은 아가로스겔 전기영동 적용과 비교하여 훨씬 더 낮았다.
신코난(cinchonan) 카바메이트와 신코난 우레아를 포함하는 다양한 신코난 알칼로이드 리간드가 비대칭 유기합성에서 키랄 촉매로서(WO92/20677과 US6197 994B1), 또한 분석화학에서 키랄 판별제(discriminant)(즉, 키랄 선택제)로서(Laemmerhofer M., et al., Journal of Chromatography, A 1996, 741, pgs: 33-48; WO97/46557; US6616825 B1; Lee Y. K. et al., Polymer 43, 2002, pgs: 7539-7547) 기술되었다. 또한, 아미노산(아르기닌, 리신 및 히스티딘) 리간드 구조물이 최근에 Sousa F., Queiroz J.A., J of Chromatography A, doi:10.1016/ j.chroma.2010.11.002 (in press) 및 Sousa A, et al., J. Sep. Sci. 2010, 33, pgs: 2610-2618에 분석 스케일로 oc 및 ccc pDNA 이소폼의 분리에 대해 기술되었다.
결론적으로, 크로마토그래피(친화성 크로마토그래피 포함)를 제조용 및 분석용 스케일로 사용하여 세 가지 pDNA 이소폼(ccc, oc, 및 lin) 모두를 효과적으로 분리하기 위한 충분히 강력하고, 예측가능하며 신뢰성 있고 정확한 방법 및/또는 물질은 이 분야의 현재 기술에서는 얻을 수 없다.
발명의 요약
본 발명은 플라스미드 DNA 이소폼(isoform) 또는 토포아이소머를 분리하기 위한 다음 화학식 1에 따른 리간드를 포함하는 물질의 용도에 관한 것이다:
상기 식에서,
리간드는 3 내지 5 원자수의 길이를 갖는 스페이서로 연결된 양이온 그룹 (C)와 수소 공여체 그룹 (N-H)를 함유하고,
m, o 및 r은 서로에 대해 독립적으로 0 또는 1이고,
k, l, n 및 p는 서로에 대해 독립적으로 0, 1 또는 2이고,
Y는 그룹 -CH2-, -0-, -NH- 또는 -S-에서 선택된 임의의 잔기이고,
Z는 그룹 -C-, -S-, 또는 -P-에서 선택된 임의의 잔기이고,
R1, R2 및 R3는 수소, C1 -18 분지되거나 미분지된(unbranched) 알킬, C2 -18 분지되거나 미분지된 알케닐, C2 -18 분지되거나 미분지된 알키닐, C3 -11-카보사이클, C3 -8-헤테로사이클, C5 -18-아릴 및 C5 -13-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 치환체이고,
여기에서 R1, R2 및 R3는 임의로 서로에 대해 독립적으로 그룹 -S-, -0-, -NH-에서 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하고,
R1, R2 및 R3 각각은 임의로 수소, C1 -6 분지되거나 미분지된 알킬, C2 -6 분지되거나 미분지된 알케닐, C2 -6 분지되거나 미분지된 알키닐, C3 -8-카보사이클, C3 -8-헤테로사이클 및 C5 -10-아릴, C5 -10-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환될 수 있고,
그에 따라 양이온 그룹 C는 적어도 하나의 질소 원자와, 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는 C3 -11 헤테로사이클이거나,
적어도 하나의 질소 원자와, 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는 C5 -18 헤테로아릴이거나,
적어도 하나의 질소 원자와, 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는, 분지되거나 미분지된 C1 -10 알킬, 분지되거나 미분지된 C2 -10 알케닐, 분지되거나 미분지된 C2 -10 알키닐(여기에서 C와 R3 또는 C와 R2는 고리를 형성하여 임의로 서로에 연결되고, 리간드는 임의로 R1 또는 R3 그룹에 의해 매트릭스에 고정되거나 내재된다)이다.
또한, 본 발명은 공유결합 폐환형(ccc), 개방 환형(oc) 및 선형(lin) 형태, 올리고머와 멀티머 형태, 예컨대 모노머, 다이머, 트라이머, 테트라머, 올리고머, 멀티머 및/또는 ccc 토포아이소머를 포함하는 플라스미드 DNA 이소폼을 본 발명에 따른 물질을 사용하여 분리하는 방법에 관한 것이다.
발명의 상세한 설명
놀라웁게도, 이종 매트릭스에 고정되거나 내재된 카바모일이 결합된 음이온 교환 리간드를 포함하는 본 발명에 따른 물질이 플라스미드 DNA(pDNA)의 이소폼, 토포아이소머, 올리고머 및 멀티머 형태를 분리하는데 사용될 수 있다는 것을 발견하였다.
광범위한 측면에서, 본 발명은 플라스미드 DNA 이소폼 또는 토포아이소머를 분리하기 위한 다음 화학식 1에 따른 리간드를 포함하는 물질을 제공한다:
상기 식에서, 리간드는 3 내지 5 원자수의 길이를 갖는 스페이서로 연결된 양이온 그룹 (C)와 수소 공여체 그룹 (N-H)를 함유하고,
m, o 및 r은 서로에 대해 독립적으로 0 또는 1이고,
k, l, n 및 p는 서로에 대해 독립적으로 0, 1 또는 2이고,
Y는 그룹 -CH2-, -0-, -NH- 또는 -S-에서 선택된 임의의 잔기이고,
Z는 그룹 -C-, -S-, 또는 -P-에서 선택된 임의의 잔기이고,
R1, R2 및 R3는 수소, C1-18 분지되거나 미분지된(unbranched) 알킬, C2-18 분지되거나 미분지된 알케닐, C2-18 분지되거나 미분지된 알키닐, C3-11-카보사이클, C3-8-헤테로사이클, C5-18-아릴 및 C5-13-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 치환체이고,
여기에서 R1, R2 및 R3는 임의로 서로에 대해 독립적으로 그룹 -S-, -0-, -NH-에서 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하고,
R1, R2 및 R3 각각은 임의로 수소, C1 -6 분지되거나 미분지된 알킬, C2 -6 분지되거나 미분지된 알케닐, C2 -6 분지되거나 미분지된 알키닐, C3 -8-카보사이클, C3 -8-헤테로사이클 및 C5 -10-아릴, C5 -10-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환될 수 있고,
그에 따라 양이온 그룹 C가 적어도 하나의 질소 원자와, 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는 C3-11 헤테로사이클이거나,
적어도 하나의 질소 원자와, 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는 C5-18 헤테로아릴이거나,
적어도 하나의 질소 원자와, 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는, 분지되거나 미분지된 C1-10 알킬, 분지되거나 미분지된 C2-10 알케닐, 분지되거나 미분지된 C2-10 알키닐(여기에서 C와 R3 또는 C와 R2는 고리를 형성하여 임의로 서로에 연결되고, 리간드는 임의로 R1 또는 R3 그룹에 의해 매트릭스에 고정되거나 내재된다)이다.
바람직한 추가 구체예들 중 하나는 플라스미드 DNA 또는 토포아이소머를 분리하기 위한 다음 화학식 2에 따른 물질이다:
상기 식에서, NA는 양이온 그룹의 질소 원자를, NB-H는 수소 공여체(카보닐 C=0에 인접하여 위치)를 나타내고,
Y는 카바메이트 그룹을 수득하는 산소(-0-)이거나 우레아 그룹을 수득하는 (-NH-)이고,
R1, R2 및 R3는 수소, C1 -18 분지되거나 미분지된 알킬, C2 -18 분지되거나 미분지된 알케닐, C2 -18 분지되거나 미분지된 알키닐, C3 -11-카보사이클, C3 -8-헤테로사이클, C5 -18-아릴 및 C5 -13-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 치환체이고,
여기에서 R1, R2 및 R3는 임의로 서로에 대해 독립적으로 그룹 -S-, -0-, -NH-에서 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하고,
R1, R2 및 R3는 임의로 수소, C1 -6 분지되거나 미분지된 알킬, C2 -6 분지되거나 미분지된 알케닐, C2 -6 분지되거나 미분지된 알키닐, C3 -8-카보사이클, C3 -8-헤테로사이클 및 C5 -10-아릴, C5 -10-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환될 수 있고, 치환은 임의로 R1 또는 R3 그룹에 의한 매트릭스로의 앵커링(anchoring)을 포함한다.
화학식 2에 따른 가장 바람직한 구체예 중 하나에 있어서, Y= -0-이고, R1은 실리카 또는 티올프로필-개질된 실리카에 고정된 알킬이고, R2는 메톡시퀴놀린이고 R3는 에틸 또는 비닐이다.
본 발명에 따른 "물질"이란 용어는 크로마토그래피 고정상, 기질, 멤브레인 또는 액체 상(phase) 같은 이종(고체 또는 액체) 매트릭스에 임의로 고정되거나 내재된 카바모일이 결합된 음이온 교환 리간드를 지칭하며, 이를 포함한다.
본 발명의 의미 내에서 "카바모일(carbamoyl)"이란 용어는 -0-C(=0)-NH-, -C(=0)-NH-, -C(=0)-NH2, 또는 우레아 -NH-C(=0)-NH- 또는 카바지드 -NH-NH-C(=0)-NH-의 일부일 수도 있는 것의 군에서 선택된 잔기를 지칭한다.
본 발명의 의미 내에서 카바모일은 화학식 2에 의해 정의된 바와 같이, 설폰아미드, 포스폰아미드 및 유사한 작용그룹 같은 수소-공여체 수용체 시스템으로 구성되는 다른 등전자(isosteric) 작용그룹을 제외하지 않는다.
본 발명에 따른 "리간드"라는 용어는 링커(linker)에 의해 결합되거나 매트릭스에 내재되고 플라스미드 DNA와 상호작용할 수 있는 화학적 구조를 지칭하며 이를 포함한다. 리간드의 바람직한 구체예는 퀸코린(quincorine)- 또는 퀸코리딘 (quincoridine) 카바메이트, 또는 퀸코린- 또는 퀸코리딘 우레아이다. 플라스미드 DNA 이소폼, 토포아이소머, 올리고머 및 멀티머 형태의 분리를 위한 사용에 있어서, 더욱 바람직한 구체예 중 하나는 신코난(cinchonan) 카바메이트 또는 신코난 우레아이고, 퀴닌(quinine)- 또는 퀴니딘 카바메이트, 특히 프로필 카바모일 퀴닌 또는 퀴니딘, tert-부틸카바모일-퀴닌 또는 퀴니딘, 및 알릴카바모일-10,11-디하이드로퀴닌 또는 퀴니딘이 가장 바람직하다.
"임의로 치환된"이란 용어는 메틸렌 그룹의 수소 원자 또는 방향족 또는 헤테로방향족 고리의 수소 원자가 상이한 유기 또는 무기 치환체로 치환되는 것을 의미한다.
여기에서 "C1 -18-알킬"이란 용어는 탄소원자수가 1-18인 분지되거나 미분지된 포화 탄화수소 사슬을 의미한다.
여기에서 "C1 -6-알킬"이란 용어는 탄소원자수가 1-6인 분지되거나 미분지된 포화 탄화수소 사슬을 의미한다.
여기에서 "C2 -18-알케닐"이란 용어는 적어도 하나의 이중결합을 포함하는, 탄소원자수가 2-18인 분지되거나 미분지된 불포화 탄화수소 사슬을 의미한다.
여기에서 "C2 -6-알케닐"이란 용어는 적어도 하나의 이중결합을 포함하는, 탄소원자수가 2-6인 분지되거나 미분지된 불포화 탄화수소 사슬을 의미한다.
여기에서 "C2 -18-알키닐"이란 용어는 적어도 하나의 삼중결합을 포함하는, 탄소원자수가 2-18인 분지되거나 미분지된 불포화 탄화수소 사슬을 의미한다.
여기에서 "C2 -6-알키닐"이란 용어는 적어도 하나의 삼중결합을 포함하는, 탄소원자수가 2-6인 분지되거나 미분지된 불포화 탄화수소 사슬을 의미한다.
"분지된"이란 용어는 임의로 황, 산소 또는 질소에서 선택된 사슬 원자(chain atom)를 포함하는 탄화수소 사슬의 적어도 하나의 원자가 다른 사슬 원자와 공유결합하는 것을 의미한다.
"미분지된(unbranched)"이란 용어는 임의로 황, 산소 또는 질소에서 선택된 사슬 원자를 포함하는 탄화수소 사슬의 임의 원자가 다른 사슬 원자와 공유결합하지 않는 것을 의미한다.
본 발명의 의미 내에서 "사슬 원자"란 용어는 탄소, 황, 산소 또는 질소 같은 2개 별도 결합을 나타내는 원자에 관한 것이다.
"C3 -11-카보사이클"이란 용어는 탄소 고리 원자수 3-11의 지방족 탄화수소 고리를 의미한다.
"C3 -8-카보사이클"이란 용어는 탄소 고리 원자수 3-8의 지방족 탄화수소 고리를 의미한다.
"C3 -8-헤테로사이클"이란 용어는 적어도 하나의 고리 원자가 탄소가 아니고 N, O, 또는 S에서 선택된 원자인 3-8의 고리 원자를 포함하는 카보사이클이다.
"C5 -18-아릴"이란 용어는 5-18의 고리 원자를 갖는 방향족 탄화수소 고리이다.
"C5 -10-아릴"이란 용어는 5-10의 고리 원자를 갖는 방향족 탄화수소 고리이다.
"C5 -13-헤테로아릴"이란 용어는 5-13의 고리 원자를 갖는 방향족 고리이며, 여기에서 적어도 하나의 고리 원자는 탄소가 아니라 N, O, 또는 S에서 선택된 원자이다.
"C5 -10-헤테로아릴"이란 용어는 5-10의 고리 원자를 갖는 방향족 고리이며, 여기에서 적어도 하나의 고리 원자는 탄소가 아니라 N, O, 또는 S에서 선택된 원자이다.
바람직한 구체예 중 하나에서, R1은 임의로 하나 이상의 황 원자를 포함하는, 수소, C1 -8 분지되거나 미분지된 알킬, C2 -8 분지되거나 미분지된 알케닐 및 C2 -8 분지되거나 미분지된 알키닐로 구성되는 군에서 선택된 치환체이다.
다른 바람직한 구체예에서, R1은 C3 -8-카보사이클, C5 -8-헤테로사이클 및 C5 -10-아릴, C5 -9-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 치환체이다.
또다른 바람직한 추가 구체예에서, R3는 임의로 하나 이상의 황 원자를 포함하는 수소, C1-8 분지되거나 미분지된 알킬, C2-8 분지되거나 미분지된 알케닐 및 C2-8 분지되거나 미분지된 알키닐로 구성되는 군에서 선택된 치환체이다.
또다른 바람직한 구체예에서, R2는 수소, C5 -10-아릴 및 C5 -9-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 치환체이다.
화학식 1에 따른 가장 바람직한 구체예 중 하나에서, o = 0이고 m = 1이거나, o = 1이고 m = 0이다.
화학식 1에 따른 다른 추가의 바람직한 구체예에서, o = 0이고 m = 1이고, k = 1이고 l = 1이며, Z는 -C-이고 n = 1이다. 선택적으로, 또다른 가장 바람직한 구체예에서, o = 1이고 m = 0, 및 k = 1이고 l = 1이며, Z는 -C- 및 p = 1이다.
화학식 1에 따른 추가의 바람직한 구체예에서, o = 0 및 m = 1이고, k = 1 및 l = 1이고, Z는 -S- 및 n = 2이다.
화학식 1에 따른 다른 바람직한 구체예에서, o = 1 및 m = 0이고, k = 1 및 l = 1이며, Z는 -S- 및 p = 2이다.
"매트릭스에 대한 앵커링(anchoring)"이라는 용어는 리간드와 매트릭스 사이 또는 리간드와 매트릭스에 결합된 잔기들 사이에서 안정한 연결을 형성하는 치환체를 의미한다.
본 발명에 따른 "분자량"이란 용어는 본 발명에 따른 리간드의 구성 원자들의 상대원자질량의 합을 지칭한다. 바람직한 구체예에서, 리간드의 분자량은 200 내지 2000Da, 더욱 바람직하게 250 내지 1200Da, 가장 바람직하게 400 내지 700 Da이다.
"양이온 그룹 C"는 적어도 하나의 질소 원자와 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는 C3 -11 헤테로사이클, 또는
적어도 하나의 질소 원자와 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는 C5 -18 헤테로아릴, 또는
적어도 하나의 질소 원자와, 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는, 분지되거나 미분지된 C1 -10 알킬, 분지되거나 미분지된 C2 -10 알케닐, 분지되거나 미분지된 C2 -10 알키닐(여기에서 C와 R3 또는 C와 R2는 고리를 형성하여 임의로 서로에 연결된다)이다.
본 발명의 의미 내에서 "고리"란 용어는 모노-, 비(bi)-, 폴리사이클릭 또는 스피로사이클릭 고리를 지칭한다.
추가의 바람직한 구체예에서, 양이온 그룹은 사이클릭 또는 비사이클릭 고리 시스템에 포함된다.
바람직한 구체예에서, 비사이클릭 고리 시스템은 트로판(tropane), (하이드로)퀴놀리지딘, (하이드로)피롤리지딘, 1-아자-아다만탄, 아자비시클로[3.2.1]옥탄, 아자비시클로[3.2.1]노난, 아자비시클로[3.3.1]노난, (하이드로)인돌리지딘, (하이드로)벤즈이미다졸, (하이드로)퀴놀린, (하이드로)이소퀴놀린, 더욱 바람직하게 아자비시클로[4.4.0]데칸, 가장 바람직하게 퀴누클리딘(quinuclidine)이다.
본 발명의 의미 내에서 "양이온 그룹"이란 용어는 또한 3차-, 4차-, 2차-, 1차 아민 또는 구아니딘, 아미딘 및 (헤테로)방향족 아미노 그룹으로 구성되는 군에서 선택된 부분적 또는 영구적 양전하를 갖는 하나의 질소 원자를 함유하는 잔기를 지칭한다. 양이온 그룹의 바람직한 구체예는 지방족 아민이며, 더욱 바람직하게 4차 아민, 가장 바람직하게 3차 아민이다. 가장 바람직한 구체예 중 하나에서, 3차 아민은 퀴누클리딘의 일부이다.
"수소 공여체 잔기"란 용어는 질소, 산소 또는 불소 같은 전기 음성적 원자에 결합된 수소 원자의 조합을 지칭한다.
"수소 수용체 그룹"이란 용어는 적어도 하나의 자유 전자쌍을 갖는 산소, 질소, 불소 또는 황 같은 전기 음성적 원자를 지칭한다.
본 발명의 의미 내에서 "스페이서(spacer)"란 용어는 양쪽에 작용적으로 중요한 잔기, 즉 한쪽에는 양이온 그룹 (C), 그리고 다른 쪽에 수소 공여체 잔기 (N-H)를 결합하고 있는 특정한 수의 인접 원자 그룹을 지칭한다. 인접 원자의 수는 원자 사슬을 통과하는 가장 짧은 거리로서 계수된다. 스페이서의 길이는 3 내지 5원자이다. 가장 바람직한 구체예에서, 스페이서의 길이는 4원자이다.
더욱 바람직한 다른 구체예에서, 본 발명에 따른 리간드는 매트릭스에서 6 원자를 넘지 않게 위치된다.
본 발명의 의미 내에서 "고정된"이란 용어는 고체 또는 액체 매트릭스(고정상)에 대한 공유결합을 지칭한다.
본 발명의 의미 내에서 "내재된(embedded)"이란 용어는 고체 또는 액체 매트릭스(고정상) 내에 비공유로 포함되는 것을 지칭한다.
"매트릭스에 대한 앵커링(anchoring)"이란 용어는 리간드와 매트릭스 또는 리간드와 매트릭스에 결합된 잔기들 사이에서 안정한 연결을 형성하는 치환체를 의미한다.
본 발명의 의미 내에서 "이종 매트릭스"란 용어는 불용성이거나 비혼화성인 용해된 플라스미드 DNA를 함유하는 용매와 균일화될 수 없는 매트릭스(고정상)에 관한 것이다.
"플라스미드 DNA"란 용어는 이중가닥 데옥시리보핵산으로 구성되는 염색체외 유전단위를 지칭한다.
본 발명의 의미 내에서 "이소폼"이란 공유결합 폐환형(ccc), 개방 환형(oc) 및 선형(lin) 플라스미드의 군에서 선택된 같은 분자량의 플라스미드 DNA의 상이한 형태를 지칭한다. 이러한 이소폼의 수반된 분석은 이소폼 분석으로 나타내어야 한다.
본 발명의 의미 내에서 "올리고머릭(oligomeric) 및 멀티머릭(multimeric)"이란 용어는 모노머 이소폼의 거대 분자로의 조합에서 유래한 상이한 분자량의 플라스미드 DNA의 서로 다른 형태에 관한 것으로, 여기에서 분자량은 모노머 분자량의 정수배(integral multiple)이다. 다음으로, 올리고머릭이란 용어는 2, 3 또는 4 모노머의 조합을 나타내지만, 멀티머릭이란 용어는 5 이상의 모노머의 조합을 나타낸다. 올리고머릭과 멀티머릭 조합은 카테난 또는 연쇄체 형태 중 하나일 수 있다.
본 발명에 따른 "카테난"이란 용어는 사슬 내에서 링크로서 함께 엮인 환형 DNA를 지칭한다.
본 발명에 따른 "연쇄체"는 연속으로 연결된 동일한 DNA 서열의 복수 카피를 함유하는 긴 연속 DNA 분자를 지칭한다.
"카테난"과 "연쇄체"란 용어는 카테네이트 DNA가 루프 대 루프로 결합된 것과 대조하여 연쇄된 DNA는 말단 대 말단으로 결합되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 의미 내에서 "토포아이소머"란 용어는 토폴로지컬 결합수 또는 결합수 차이로 기술된 상이한 초나선도를 갖는 공유결합된 폐환형(ccc) 플라스미드 DNA 분자를 지칭한다. 개별적인 플라스미드의 토포아이소머는 같은 분자량과 연결성을 가진다. 이러한 토포아이소머의 수반된 분석은 토폴로지 분석 또는 토포아이소머 분석으로 표시되어야 한다.
본 발명의 의미 내에서 "분리"란 용어는 (화학친화성 원리라 지칭되는)리간드에 대한 서로 다른 친화도에 따라 이소폼, 토포아이소머, 올리고머 및 멀티머 형태 같은 플라스미드 DNA의 상이한 형태를 구분하는 것에 관한 것이다.
"크로마토그래피"란 용어는 이동상이라고 불리는 하나의 상이 정지상이라고 불리는 다른 상을 따라 움직이는 2개의 이종 상을 적용하는 분리기술을 지칭한다.
바람직한 구체예는 본 발명에 따라 수소 공여체 N-H가 수소 수용체 그룹에 인접하여 위치된 물질이다.
본 발명의 의미 내에서 "인접한"이란 용어는 단일 공유결합에 의한 두 원자 또는 원자 그룹 사이의 직접 연결을 나타낸다.
바람직한 구체예에서, 수소 수용체는 카보닐(C=0), 설포닐(S02) 및 포스포닐 그룹(P=0)에서 선택된다.
바람직한 다른 추가 구체예에서, 수소 수용체 및 수소 공여체 그룹은 아미드, 카바메이트, 우레아, 포스폰아미드(phosphonamide) 또는 설폰아미드 그룹의 일부를 형성한다.
바람직한 추가 구체예에서, 플라스미드 DNA는 플라스미드와 그의 뉴클레오티드 서열의 크기와는 별개로 ccc와 그의 토포아이소머, oc, lin, 다이머, 트리머, 테트라머, 올리고머, 멀티머(카테난 또는 연쇄체 형태)로 구성되는 군에서 선택된 성분의 혼합물을 포함한다.
본 발명의 의미 내에서, "매트릭스"라는 용어는 리간드와 결합할 수 있는 고체 지지체, 또는 리간드를 용해할 수 있는 액체를 포함한다.
본 발명의 의미 내에서, "고체 매트릭스"라는 용어는 무기 폴리머 또는 유기 폴리머의 군에서 선택된, 목적하는 크로마토그래피 분리 또는 액체-고체 추출에 적합한 고체 지지체, 바람직하게 미세 펠리큘라(micropellicular) 실리카계 입자를 지칭한다.
"미세 펠리큘라(micropellicular)"란 용어는 정지상의 체류성(retentive) 박층으로 덮여진 유체 불침투성 지지체 물질의 코어(용융 실리카 입자 또는 유기 폴리머 미소구)를 특징으로 하는 비다공성 매트릭스 입자를 지칭한다. 정지상의 체류성 박층은 타겟 용질을 체류시킬 수 있는 흡착 표면을 얻기 위해 표면을 거칠게 하고 각각의 크로마토그래피 리간드를 결합하여 얻어질 수 있다.
"액체 매트릭스"란 알칸, 사이클로알칸 같은 비극성 용매, 또는 폴리실록산, 폴리에틸렌옥사이드 같은 폴리머 액체, 또는 다른 용매로 희석된 폴리실록산 또는 폴리에틸렌옥사이드 같은 폴리머 액체의 군에서 선택된 액체를 지칭한다.
바람직한 구체예에서, 본 발명에 따른 매트릭스는 무기 또는 유기 폴리머에서 선택된다.
"유기 폴리머"란 용어는 고체 유기 폴리머, 예컨대 폴리(메트)아크릴레이트와 그의 코폴리머, 폴리스티렌과 그의 코폴리머, 폴리(메트)아크릴아미드와 그의 코폴리머, 개환 복분해 폴리머, 아가로스 같은 폴리사카라이드와 그의 코폴리머를 지칭하고, 스페이서 및/또는 리간드가 공유결합할 수 있는 폴리머 표면에 화학그룹을 가진다.
"무기 폴리머"란 용어는 고체 무기 폴리머, 예컨대 실리콘 옥사이드(실리카), 티타늄 옥사이드, 게르마늄 옥사이드, 지르코늄 옥사이드, 알루미늄 옥사이드 및 유리를 지칭한다. 폴리머 표면은 스페이서 및/또는 리간드의 공유결합이 가능하다.
바람직한 또다른 추가 구체예에서, 고체 매트릭스는 입자, 모놀리스 수지, 멤브레인 또는 자성구슬이다.
"입자"라는 용어는 다양한 크기와, 비제한적으로 무정형, 정형, 구형, 다공성, 비다공성, 미세 펠리큘라를 포함하는 형태학적 특징의 고체 매트릭스 구조를 지칭한다. 일반적으로 하나의 분리 컴파트먼트 내에 수많은(> 1000) 개별 입자들이 있다.
"모놀리스 수지"란 용어는 추가적으로 메조기공(mesopore) 및 미세기공 같은 작은 크기의 기공을 임의로 함유하는 소위 거대기공(macropore)이라고 불리는, 대류흐름(convective flow)이 가능한 관류 채널을 함유하는 고체 매트릭스 구조를 지칭한다. 일반적으로 하나의 분리 컴파트먼트 내에 단일 조각 또는 단지 적은 수(< 10)의 개별 모놀리스 수지들이 있다.
"멤브레인"이란 용어는 용매가 투과가능하고 샘플 성분들을 포함하는 용질이 반투과할 수 있는 박층 형태의 고체 매트릭스를 지칭한다. 멤브레인은 셀룰로스 같은 폴리사카라이드, 셀룰로스 에스테르, 폴리(메트)아크릴레이트, 폴리(스티렌), 폴리테트라플루오로에틸렌, 폴리설폰, 폴리아크릴로니트릴, 폴리페닐렌옥사이드, 폴리에틸렌, 폴리로필렌(polyropylen), 테플론, 폴리에틸렌테레프탈레이트, 폴리비닐리덴클로라이드, PVC, 폴리이미드, PVA, 폴리카보네이트의 군에서 선택된다.
"자성구슬"이란 용어는 자성 또는 강자성(ferromagnetic) 내부 코어와 외부 고체 매트릭스 껍질로 구성된 입자를 지칭하는 것으로, 이것은 자기장이 적용될 때 부착된다.
본 발명에 따른 물질의 바람직한 구체예는 다음으로 구성되는 군에서 선택된다:
(화학식 a)
3-머캡토프로필실리카 매트릭스에 고정된 3-(알릴카바모일옥시)-N-벤질피페리딘
점선의 왼쪽에 있는 화학식은 지지 매트릭스를 나타내고 오른쪽에 있는 화학식은 리간드를 나타낸다.
(화학식 b)
순수 실리카(bare silica) 매트릭스에 고정된 트리에톡시실릴 활성화 프로필카바모일퀴닌 리간드
점선의 왼쪽에 있는 화학식은 지지 매트릭스를 나타내고 오른쪽에 있는 화학식은 리간드를 나타낸다.
(화학식 c)
3-머캡토프로필 개질 실리카 매트릭스에 고정된 알릴카바모일-10,11-디하이드로퀴닌 리간드
점선의 왼쪽에 있는 화학식은 지지 매트릭스를 나타내고 오른쪽에 있는 화학식은 리간드를 나타낸다.
(화학식 d)
3-머캡토프로필 개질 실리카 매트릭스에 고정된 O-tert-부틸카바모일-퀸코린(quincorine)
점선의 오른쪽에 있는 화학식은 지지 매트릭스를 나타내고 왼쪽에 있는 화학식은 리간드를 나타낸다.
(화학식 e)
3-머캡토프로필 개질 실리카 매트릭스에 고정된 tert-부틸퀸코리닐-우레아 리간드
점선의 오른쪽에 있는 화학식은 지지 매트릭스를 나타내고 왼쪽에 있는 화학식은 리간드를 나타낸다.
(화학식 f)
머캡토프로필 개질 실리카 매트릭스에 고정된 tert-부틸카바모일-퀴닌
점선의 오른쪽에 있는 화학식은 지지 매트릭스를 나타내고 왼쪽에 있는 화학식은 리간드를 나타낸다.
(화학식 g)
티올 개질 폴리메타크릴레이트 구슬(Suprema-Gel 30u)에 고정된 tert-부틸카바모일-퀴닌 리간드
점선의 오른쪽에 있는 화학식은 지지 매트릭스를 나타내고 왼쪽에 있는 화학식은 리간드를 나타낸다.
3가지 pDNA 이소폼 또는 토포아이소머의 분리는 카바모일이 결합된 음이온 교환 리간드를 포함하는 물질에 의해 좌우되며, 이것은 이제까지 이러한 종류의 액체 상 분리에 적용된 적이 없다. 이러한 본 발명에 따른 리간드는 잘 규정된 배열의 NH-공여체, H-수용체 및 음이온 교환 부위를 포함한다. 따라서, 리간드를 포함하는 물질과 플라스미드 이소폼/토포아이소머의 상호작용은 정의된 방향으로 진행되어 변함 없는 용출순서를 보장한다. 그러므로, 본 발명은 화학친화성 원리에 근거한 초거대 생체분자의 분리에 대한 신뢰성 있고 예측가능한 새로운 개념에 관한 것이다. 또한, ccc 토포아이소머는 최종 생성물 특성화를 포함하는 생명공학적 생산에서 추가의 품질관리 파라미터를 제공할 수 있다.
본 발명의 물질, 방법 및 공정에 대해 다양한 수정이 가능하다는 것은 당업자들에게 자명할 것이다. 따라서, 본 발명은 이러한 수정과 변경이 첨부된 특허청구범위와 그의 등가물의 범위 내에 있는 한, 이들을 포함한다. 여기에 인용된 모든 간행물은 그 전체가 참조로 포함되었다.
플라스미드 DNA 분리에 적합한 크로마토그래피 리간드는 매트릭스에 대한 용이한 결합이 가능하도록 설계되었으며(실시예 1), 여기에서 터미널 알켄 그룹을 함유하는 리간드는 라디칼 첨가반응에서 티올 그룹과 반응한다. 따라서, 제1 단계에서 링커는 터미널 티올 그룹을 함유하는 매트릭스에 결합한다. 제2 단계에서, 매트릭스와 알켄 함유 리간드는 라디칼 개시제 존재 하에 혼합되어 리간드와 매트릭스에 결합된 링커 사이에 안정한 티오-에테르 결합을 형성한다(화학식 a 참조). 이 방법을 사용하여 안정한 크로마토그래피 물질이 매트릭스 표면상에서 높은 리간드 범위로 용이하게 얻어진다.
본 발명에 따른 물질의 역할을 실제적으로 평가하기 위해 두 개의 퀴닌-카바메이트 리간드, 즉 프로필카바모일퀴닌과 알릴카바모일-10,11-디하이드로퀴닌을 플라스미드 pMCP1 (Boehringer Ingelheim, 크기 4.9 kb)의 크로마토그래피 분석적 분리에 사용하였다. 처음 것은 리간드와 실리카 매트릭스 사이의 짧은 프로필-링커(매트릭스의 제1 실리콘 원자와 NH 수소 공여체 사이의 4개 결합, 화학식 b 참조)에 의해 앵커링되고, 다른 것은 티오프로필 개질된 실리카 매트릭스에 긴 링커(매트릭스의 제1 실리콘 원자와 NH 수소 공여체 사이의 8개 결합, 화학식 c 참조)에 의해 앵커링된다. 긴 링커와 짧은 링커의 크로마토그래피 특성의 비교는 oc 형태의 회수가 짧은 링크 리간드를 사용하여 상당히 개선된 것을 나타내고 있다(즉, 1 μg의 4.9 kb 플라스미드와 동등한 전체 회수가 실시예 2에 나타낸 바와 같이 1회 크로마토그래피 작업 동안 기록되었다). 주요 차이는 링커의 길이(3 원자 대 7 원자)이며, 즉 리간드와 매트릭스 표면 사이의 거리는 동일하지 않다. 짧은 링커를 함유하는 물질을 사용하여 pDNA에서 리펄싱(repulsing) 효과를 갖는 음으로 하전된 남아있는 실라놀의 근접으로 인하여 oc 형태를 포함하는 모든 이소폼의 완전한 회수가 확인되었다. 또한, pDNA 이소폼 분석에 현재 사용되는 상업적으로 입수가능한 컬럼과 비교하여 이러한 데이터는 물질의 oc 회복뿐만 아니라 oc 및 ccc 형태 사이의 분해능 측면에서 물질 특성의 총체적 개선(우월성)을 나타내고 있다.
매트릭스 형태의 영향을 시험하기 위해서 이전 단락에서 기술된 긴 링크 리간드를 긴 링커에 의해 다음과 같은 실리카계 매트릭스에 결합하였다: 1.5 μm 비다공성 입자, 10 μm 다공성 입자 및 모놀리스(실시예 3). 이러한 물질을 함유하는 컬럼을 이전 단락에 기술된 유추적 실험셋업에서 시험하였다. 여기에서, 3가지 pDNA 이소폼(pMCP1 플라스미드의 oc, ccc 및 lin 이소폼) 모두를 함유하는 샘플을 컬럼에 적재한 다음 동일한 조건에서 컬럼으로부터 용출한다. 실질적 차이가 이들 고체 지지체 사이에서 관찰되었다. 시험된 모든 매트릭스가 ccc 이소폼을 oc 이소폼에서 분리하는 것과 ccc 이소폼을 lin 이소폼에서 분리하는데 적합하였다. 또한, 1.5 μm 매트릭스를 사용하는 경우, oc와 선형 이소폼 간의 효과적 분리가 얻어졌다(도 1a 참조). 따라서, 분석목적에 있어서는 1.5 μm의 지지체의 선택이 바람직하다. 그러나, 10 μm 다공성 매트릭스(도 1b 참조)와 모놀리스 지지체(도 1c 참조) 모두 ccc 형태의 분리에만 집중하는 제조용 적용에 적합하다. oc 및 lin 이소폼의 동시용출에도 불구하고 ccc 형태의 보다 효과적 분리가 이 경우에서 얻어진다.
토포아이소머 분리와 관련하여, 가장 풍부한 토포아이소머 사이에서 체류시간 차이로서 계산된 크로마토그래피 선택성은 시험된 모든 지지체에 대해 같은 것(0.12 ± 0.02)을 발견하였다. 이것은 분리의 높은 역동성(robustness)을 유발하는 화학친화성 분리 원리의 중요성을 보여주는 것이다. 그러나, 1.5 μm 매트릭스는 작은 피크 폭으로 인해 가장 높은 분리 효율을 제공하며, 따라서 분석 목적에 있어서 바람직한 선택이다. 일반적으로, 작은 비다공성 구형 입자들은 pDNA 이소폼과 토포아이소머에 가장 양호한 분리 효율을 제공하므로 분석 규모의 분리에 가장 적합한 것을 확인하였다. 거대 다공성 입자와 모놀리스도 특히 ccc 이소폼을 oc 및 선형 이소폼에서 분리하는 경우에 pDNA 형태를 잘 분리할 수 있다. 이들의 낮은 압력강하와 높은 결합능으로 인하여, 특히 모노리스에 내재하여 이들은 제조용 적용에 더 적합하다.
또한, 실시예 4에서는 pDNA 분리에 대한 두 개의 상이한 방법, 즉 염화나트륨(NaCl)의 증가 그래디언트를 사용하는 것에 의한 방법 1과 증가하는 pH 그래디언트를 사용하는 방법 2를 비교한다. 두 가지 경우에서 1.5 μm 비다공성 입자를 기초로 하는 물질(화학식 b)을 함유하는 크로마토그래피 컬럼이 pDNA 분리에 적용된다. pDNA 특성화를 위한 이 두 가지 분석 방법 사이에서 유의한 차이가 확인되었다. 방법 1을 사용하여 결합된 pDNA의 용출을 위해 NaCl과 2-프로판올의 합쳐진 그래디언트로 분석하는 동안 NaCl과 2-프로판올의 이동상 농도가 동시에 증가한다. 이 경우에 oc, 선형 및 개별 ccc 토포아이소머는 단일 크로마토그래피 작업 동안 모두 분리된다(도 1a 참조). 방법 2를 사용하여 결합된 pDNA의 용출을 위해 pH와 2-프로판올의 합쳐진 그래디언트로 분석하는 동안 이동상 농도의 pH값과 그의 2-프로판올 함량은 동시에 증가한다. 이 경우에 세 가지 이소폼(oc, ccc 및 선형) 모두의 분리가 얻어졌으나(도 2a 참조), 개별 토포아이소머의 분리는 얻어지지 않았다. ccc 이소폼이 단일 피크로 용출되므로, 다른 두 가지 형태의 분리는 NaCl 매개 용출과 비교하여 훨씬 향상되었다. 또한, 1 μg의 각 이소폼을 50 x 4.6 mm 컬럼에 적재하였을 때, 시험된 플라스미드 크기(즉, 4.9 kb 및 특히 9.9 kb와 14.5 kb)의 전체 범위에서 모든 이소폼(oc, lin 및 ccc)의 완전 회수를 확인하였다(즉, 이온 교환 크로마토그래피 같은 공지된 기술과 비교하여 거대크기 pDNA 분리의 분리가 뛰어나다). 그러므로, 방법 2는 NaCl 매개 용출과 비교하여 그의 좁은 피크 형태와 수집된 분획들의 낮은 염 적재량으로 인하여 (토포아이소머의 분리 없이)ccc pDNA의 단리를 위한 제조용 적용뿐만 아니라 플라스미드 크기와 독립적으로, 플라스미드 균질성, 즉 다른 형태(oc 및 lin)에 비해 상대적으로 ccc 형태의 함량의 분석 측정에 바람직하다.
pDNA 이소폼과 토포아이소머 분리에 사용될 리간드의 가변성을 입증하기 위하여 3개의 상이한 리간드를 5 μm 구형 실리카 입자에 부착하였으며, 즉 tert-부틸카바모일-퀸코린(화학식 d)과 tert-부틸퀸코리닐-우레아(화학식 e)는 긴 링커에 부착하고, 프로필카바모일퀴닌(화학식 b)은 지지체에 직접 부착하였다(실시예 5). 약 5%의 oc 이소폼을 함유하는 ccc pDNA 샘플을 이러한 컬럼들 각각에 적재하고 동일 조건 하에서 염화나트륨과 2-프로판올의 선형 그래디언트를 적용하여 용출하였다. 도 3a는 tert-부틸퀸코리닐-우레아 리간드를 사용하는 pDNA 샘플의 크로마토그래피 분리를 나타낸 것이고, 도 3b는 tert-부틸카바모일-퀸코린 리간드를 사용한 분리를 나타낸 것이지만, 도 4a(실선)에서 이러한 분리는 프로필카바모일퀴닌 리간드를 사용하는 것을 나타내고 있다. 이 컬럼들 모두에서 비교할 만한 용출 패턴(동등한 용출 순서)이 얻어져서 화학친화성 원리의 역동성을 입증하고 있다. 최초로, oc 이소폼이 컬럼에서 용출되었으며, 이후 소위 ccc 토포아이소머의 볼츠만(Boltzmann) 분포 패턴이 얻어졌다(즉, 이들의 자유 에너지에 따른 개별 종 각각의 상대적 농도; 에너지에 따른 시스템 상태의 분포에 대한 확률 척도(probability measure)). 특히 플라스미드 토포아이소머의 이러한 신규하고 강력한 분리는 플라스미드 DNA의 사용을 위한 중요한 발명임을 나타내며, 분석 및 제조용 규모 적용 모두에 상당한 이점을 보여준다. 물질의 적재능을 입증하기 위하여, 총 284 μg의 pDNA를 프로필카바모일퀴닌 리간드를 갖는 1.5 μm 비다공성 실리카 지지체를 함유하는 50 x 4.6 mm 컬럼에 적재하였다. 이 실험에서는 HPLC 시스템의 최대 주입부피를 사용하였다. 합쳐진 염 및 2-프로판올 그래디언트를 사용한 용출 시에 도 3c에 나타낸 바와 같은 크로마토그램을 얻었다. 개별 토포아이소머 피크 사이에서 크로마토그래피 분리에 대한 어떠한 오버로딩 효과 및 어떠한 감소도 관찰되지 않았다. 따라서, 이러한 작은 크기의 단일 분석 컬럼을 사용하여 개별 토포아이소머의 밀리그램 양을 약 30 내지 50회 수행한 후 용이하게 단리할 수 있다. 또한, 크로마토그래피는 일반적으로 선형 확장에 의해 특성화되므로, 대량 규모의 제조용 적용은 크로마토그래피 상향을 위한 일반적 규칙에 따라 준비할 수 있다.
토포아이소머의 용출 패턴은 상보적(complementary) 방법, 모세관 겔 전기영동을 사용하는 용출된 분획을 분석하여 평가하였다(실시예 6). 개별 토포아이소머의 용출 동안 네가티브 초나선이 적은 것들이 먼저 용출하는 것을 확인하였다. 따라서, 고도의 네가티브 초나선을 갖는 토포아이소머가 나중에 용출되며, 단리된 크로마토그래피 분획 "A"와 "B"를 클로로퀸(chloroquine) 함유 모세관 겔 전기영동(도 4b)에 의한 도 4a(점선)의 크로마토그램에서 분리하여 나타내었다. 초나선이 적은 토포아이소머, 이 실시예에서 토포아이소머 "A"는 또한 더 낮은 라이드 (writhe)를 가지므로, 이 분자는 더 많이 초나선된 토포아이소머 "B"보다 큰 크기를 갖는다. 겔 전기영동 분리는 크기 의존적이므로, 토포아이소머 "B"는 토포아이소머 "A"보다 빨리 이동하고 이완된 oc 이소폼은 샘플에서 가장 천천히 이동하는 종이다. 볼츠만 분포에 따른 pMCP1 플라스미드(4.9 kbp)에 대한 토포아이소머 패턴 또한 프로필카바모일퀴닌 리간드를 함유하는 컬럼을 사용하여 pUC19(2.7kbp, Sigma Aldrich), pBR322(4.4 kb, Sigma Aldrich), pET-40b(+)(6.2 kbp, Invitrogen), 또는 pBACsurf-1(9.5 kbp, Invitrogen) 같은 상업적으로 입수할 수 있는 플라스미드를 분석하여 기록하였다.
토포아이소머 분석의 관련성을 입증하기 위해 플라스미드 토포아이소머 패턴을 플라스미드 발효의 시간 경과에 따라 시험하였다(실시예 7). 박테리아 세포를 함유하는 세포 매스 샘플을 NaOH/SDS를 사용하여 분쇄하였다. 현탁액을 원심분리하여 pDNA를 함유하는 세포질 내용물을 얻었다. 2차원 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)를 사용하였으며, 여기에서 제1 단계로 전체 pDNA를 혼합물로부터 크기 배제 크로마토그래피(SEC)로 단리하고 제2 단계로 알릴카바모일-10,11-디하이드로퀴닌 리간드 함유 실리카(화학식 c에 표시) 컬럼을 ccc 토포아이소머 분리에 사용하였다. 발효 샘플을 2시간 간격으로 꺼내어 2D HPLC로 분석하였다. 결과는 제2 단계 후에 얻어진 크로마토그램의 오버레이로 나타내었다(도 5a). 나타낸 크로마토그램은 발효 개시로부터 11, 13, 15 및 17시간 후에 취해진 샘플로부터 기록된 것이다. (도 5a에서 화살표로 표시된)가장 밀집된 ccc 토포아이소머로 나타낸 최대 토포아이소머 분포는 발효하는 동안 옮겨진다. 이 경우에 전체 초나선은 더 낮은 네가티브 초나선으로 이동한다. 분포 최대치의 전체 진행을 도 5b에 나타내었다. 발효과정 에서 ccc pDNA의 초나선은 발효의 최초 시간 동안 상당히 변화하지만 말단쪽은 유사하다. 이러한 데이터는 공정 단계의 지표로서, 또한 액체 크로마토그래피를 사용하는 간단한 방법으로 측정된 품질관리 파라미터로서 사용될 수 있고 전체 제조과정에 대한 안정성 시험을 위한 토포아이소머 분석의 중요성을 뒷받침한다.
도 1a 내지 1c: 동일한 용출조건에서 pMCP1 플라스미드(4.9 kbp)의 ccc와 oc 및 lin 이소폼의 혼합물을 함유하는 pDNA 샘플을 분석하여 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램.
3개 컬럼이 사용되었으며, 각각은 상이한 실리카 매트릭스, 즉 1.5 μm 비다공성 입자(도 1 a), 10 μm 다공성 입자(도 1 b) 및 모놀리스(Chromolith Si Performance, Merck)(도 3c)에 결합된 tert-부틸카바모일-퀴닌 리간드(화학식 f 참조)를 함유한다. 용출조건: 방법 1(실시예 4 참조). "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 2: pH- 및 2-프로판올 매개 그래디언트 용출조건에서 pMCP1 플라스미드 (4.9 kbp)의 ccc, oc 및 lin 이소폼을 함유하는 pDNA 샘플의 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램.
3개의 주요 피크는 3가지 개별 pDNA 이소폼 oc, lin, ccc(도 2에 표시)에 해당한다. 용출조건: 방법 2, "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 3a 및 3b: NaCl 매개 용출에서 높은 ccc 함량의 pMCP1 플라스미드(4.9 kbp)를 갖는 pDNA 샘플을 분석하여 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램.
이 크로마토그램들에서 ccc 형태는 oc 이소폼 후에 용출되며 개별 토포아이소머의 세트로 나뉜다. 화학식 e에 나타낸 3-머캡토프로필 개질 실리카에 고정된 tert-부틸퀸코리닐-우레아 리간드를 사용하는 것(도 3b)보다 화학식 d에 나타낸 3-머캡토프로필 개질 실리카에 고정된 tert-부틸카바모일-퀸코린 리간드를 사용(도 3a)할 때 토포아이소머들 간의 분리가 더 높다. "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 3c: 높은 ccc 함량의 pMCP1 플라스미드(4.9 kbp)를 갖는 pDNA 샘플 284 μg을 적재한 후 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램. 용출은 1.5 μm 비다공성 실리카에 결합된 트리에톡시실릴 활성화 프로필카바모일퀴닌 리간드를 사용하는 NaCl 그래디언트에 의해 수행되었다.
제1 피크는 개방 환형(oc) 이소폼을 나타내고, ccc 이소폼의 21 토포아이소머가 나중에 용출된다. "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(absorption units [AU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 4a: 1.5 μm 비다공성 실리카에 결합된 트리에톡시실릴 활성화 프로필카바모일퀴닌 리간드를 사용하는 NaCl 매개 그래디언트에서 높은 ccc 함량의 pMCP1 플라스미드(4.9 kbp)를 갖는 pDNA 샘플을 분석하여 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램의 오버레이.
이 크로마토그램들에서 ccc 형태는 oc 이소폼 이후에 용출되고 개별 토포아이소머의 세트로 나뉜다. A와 B는 단리된 토포아이소머 분획을 나타낸다. 점선은 동일 컬럼의 용출된 토포아이소머의 이전 분획화 이후 재주입된 분획 A와 B를 나타낸다. "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 4b: 도 4a에 나타낸 분획 A 및 B와 동일한 분획 A 및 B를 함유하는 혼합물의 모세관 전기영동 분리.
선형 형태가 가장 빠른 이동형태이다. 분획 B가 분획 A보다 더 빨리 이동함에 따라, 그의 더 작은 크기와 고도의 초나선을 시사하고 있다. "Y"축은 이동시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 5a: 제2 크로마토그래피 단계, 즉 정제되지 않은 샘플의 정제단계 시 NaCl 매개 그래디언트 용출 동안 화학식 b로 기술된 물질을 사용하여 11, 13, 15 및 17시간 후에 얻어진 pDNA 발효 동안 취한 pDNA 샘플로부터 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램의 오버레이.
화살표는 토포아이소머 분포 내에서 가장 풍부한 토포아이소머를 나타내고, 따라서 발효 동안 확실하게 변화하는 전체 초나선의 지표로서 작용한다. 도 4b를 제외한 모든 크로마토그램에서, "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 5b: 전체 초나선의 척도인 가장 풍부한 토포아이소머의 상대적 결합수(발효 초기에 이 값은 0이다)로 표시된 (최대 피크 영역으로 계산된)최대 토포아이소머 분포(y 축)를 발효의 전체 지속기간(x 축)에 대해 플롯하였다.
전반적으로 토포아이소머 패턴은 발효 중에 변화한다. "Y"축은 지속시간[시간]을 반영하는 "X"축과 관련하여 상대적 결합수 ΔLk를 나타낸다.
3개 컬럼이 사용되었으며, 각각은 상이한 실리카 매트릭스, 즉 1.5 μm 비다공성 입자(도 1 a), 10 μm 다공성 입자(도 1 b) 및 모놀리스(Chromolith Si Performance, Merck)(도 3c)에 결합된 tert-부틸카바모일-퀴닌 리간드(화학식 f 참조)를 함유한다. 용출조건: 방법 1(실시예 4 참조). "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 2: pH- 및 2-프로판올 매개 그래디언트 용출조건에서 pMCP1 플라스미드 (4.9 kbp)의 ccc, oc 및 lin 이소폼을 함유하는 pDNA 샘플의 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램.
3개의 주요 피크는 3가지 개별 pDNA 이소폼 oc, lin, ccc(도 2에 표시)에 해당한다. 용출조건: 방법 2, "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 3a 및 3b: NaCl 매개 용출에서 높은 ccc 함량의 pMCP1 플라스미드(4.9 kbp)를 갖는 pDNA 샘플을 분석하여 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램.
이 크로마토그램들에서 ccc 형태는 oc 이소폼 후에 용출되며 개별 토포아이소머의 세트로 나뉜다. 화학식 e에 나타낸 3-머캡토프로필 개질 실리카에 고정된 tert-부틸퀸코리닐-우레아 리간드를 사용하는 것(도 3b)보다 화학식 d에 나타낸 3-머캡토프로필 개질 실리카에 고정된 tert-부틸카바모일-퀸코린 리간드를 사용(도 3a)할 때 토포아이소머들 간의 분리가 더 높다. "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 3c: 높은 ccc 함량의 pMCP1 플라스미드(4.9 kbp)를 갖는 pDNA 샘플 284 μg을 적재한 후 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램. 용출은 1.5 μm 비다공성 실리카에 결합된 트리에톡시실릴 활성화 프로필카바모일퀴닌 리간드를 사용하는 NaCl 그래디언트에 의해 수행되었다.
제1 피크는 개방 환형(oc) 이소폼을 나타내고, ccc 이소폼의 21 토포아이소머가 나중에 용출된다. "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(absorption units [AU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 4a: 1.5 μm 비다공성 실리카에 결합된 트리에톡시실릴 활성화 프로필카바모일퀴닌 리간드를 사용하는 NaCl 매개 그래디언트에서 높은 ccc 함량의 pMCP1 플라스미드(4.9 kbp)를 갖는 pDNA 샘플을 분석하여 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램의 오버레이.
이 크로마토그램들에서 ccc 형태는 oc 이소폼 이후에 용출되고 개별 토포아이소머의 세트로 나뉜다. A와 B는 단리된 토포아이소머 분획을 나타낸다. 점선은 동일 컬럼의 용출된 토포아이소머의 이전 분획화 이후 재주입된 분획 A와 B를 나타낸다. "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 4b: 도 4a에 나타낸 분획 A 및 B와 동일한 분획 A 및 B를 함유하는 혼합물의 모세관 전기영동 분리.
선형 형태가 가장 빠른 이동형태이다. 분획 B가 분획 A보다 더 빨리 이동함에 따라, 그의 더 작은 크기와 고도의 초나선을 시사하고 있다. "Y"축은 이동시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 5a: 제2 크로마토그래피 단계, 즉 정제되지 않은 샘플의 정제단계 시 NaCl 매개 그래디언트 용출 동안 화학식 b로 기술된 물질을 사용하여 11, 13, 15 및 17시간 후에 얻어진 pDNA 발효 동안 취한 pDNA 샘플로부터 258 nm에서의 UV 흡수로 기록된 크로마토그램의 오버레이.
화살표는 토포아이소머 분포 내에서 가장 풍부한 토포아이소머를 나타내고, 따라서 발효 동안 확실하게 변화하는 전체 초나선의 지표로서 작용한다. 도 4b를 제외한 모든 크로마토그램에서, "Y"축은 체류시간[분]에 해당하는 "X"축과 관련하여 258 nm에서의 UV 흡수(milliabsorption units [mAU])로 검출된 pDNA 이소폼의 농도를 반영한다.
도 5b: 전체 초나선의 척도인 가장 풍부한 토포아이소머의 상대적 결합수(발효 초기에 이 값은 0이다)로 표시된 (최대 피크 영역으로 계산된)최대 토포아이소머 분포(y 축)를 발효의 전체 지속기간(x 축)에 대해 플롯하였다.
전반적으로 토포아이소머 패턴은 발효 중에 변화한다. "Y"축은 지속시간[시간]을 반영하는 "X"축과 관련하여 상대적 결합수 ΔLk를 나타낸다.
실시예
실시예 1: 리간드 합성 및 고체 매트릭스와의 커플링 방법
도식 1 : 980 mg(5 mmol)의 (R)-(-)-1-벤질-3-하이드록시피리딘 (Sigma Aldrich)을 3구 둥근바닥 플라스크에 옮겨서 15 ml 디클로로메탄에 용해하였다. 이 장치를 질소로 세척하고, 502 μl(5.7 mmol, 1.15 eq.) 알릴이소시아네이트 (Fluka)와 3 μl(5 μmol) 디부틸틸디라우레이트(Aldrich)를 촉매로서 혼합물에 첨가하였다. 황색을 띠는 용액을 3시간 동안 환류하였고 반응과정을 tlc(디클로로메탄:메탄올 = 20:1)로 모니터하였다. 디클로로메탄:메탄올 = 25:1을 용리액으로 사용하여 플래쉬 실리카 컬럼 크로마토그래피한 후에 생성물인 3-(알릴카바모일옥시)-N-벤질피페리딘을 58%의 수율로 단리하였다. 3-머캡토프로필 개질 실리카 매트릭스(또는 지지체)를 순수 5 μm 구형 실리카(30 g, Daiso, 일본)와 3-머캡토프로필-메틸디메톡시실란(8.6 ml)으로부터 건조 톨루엔 중에서 4-디메틸아미노피리딘(57 mg, Fluka) 존재 하에 7시간 동안 환류하여 제조하였다. 생성된 3-머캡토프로필 개질 실리카와 1,1,1,3,3,3-헥사메틸디실라잔(Fluka)을 톨루엔 중에서 3시간 동안 환류하여 엔드캡핑(endcapping)하여 트리메틸실릴(TMS) 엔드캡핑 실라놀을 형성하였다. 330 mg(1.2 mmol)의 3-(알릴카바모일옥시)-N-벤질피페리딘과 2.05 g의 엔드캡핑된 머캡토프로필 개질 5 μm 실리카를 기계식 교반기가 구비된 3구 둥근바닥 플라스크에 옮겨서 30 ml 메탄올에 현탁하였다. 5 mg 아조-비스-(이소부티로니트릴)(AIBN, Merck)의 5 ml 메탄올 용액을 첨가하면서 장치를 강력하게 플러싱 (flushing)하였다. 혼합물을 질소 분위기 하에서 20시간 동안 환류한 다음, 소결유리필터(공극률 3)로 여과하였다. 실리카 물질을 메탄올로 잘 세척한 후, 60 ℃에서 48시간 동안 건조하였다. 합성된 물질은 3-머캡토프로필실리카 매트릭스에 고정된 3-(알릴카바모일옥시)-N-벤질피페리딘(화학식 a)이다.
도식 2: 티올 개질 유기 폴리머 매트릭스를 다음과 같이 얻었다: 178 mg의 디소듐하이드로겐포스페이트(Merck)를 20 ml의 증류수와 5 ml 2-프로판올(Roth)의 혼합물에 용해하여 반응 완충액을 제조하였다. 희석된 오르토인산으로 pH를 8.0으로 조절하였다. 132.6 mg Suprema-Gel 30u(Polymer Standards Service-USA, Inc.)를 1.8 ml의 반응 완충액에 현탁하였다. 이후, NaSH 수화물(Sigma Aldrich)의 반응 완충액(100 mg/ml) 용액 192 μl를 첨가하고, 혼합물을 2시간 동안 63 ℃에서 항온교반기(Eppendorf)로 교반하였다. 작은 유리깔대기(공극률 3)에 의해 개질된 물질을 반응 완충액으로 2회, 물로 2회, 0.1 mol/l HCl로 1회, 다시 물, 및 메탄올로 2회 세척하였다.
디설파이드의 터미널 티올로의 환원: 11.8 ml 물과 2.8 ml 메탄올의 혼합물(pH 4.6으로 측정)에 672 mg 소듐 디하이드로겐포스페이트를 용해하여 TCEP 완충액을 제조하였다. 이후, 19 mg(75 μmol) 트리스(2-카복시에틸)-포스핀 염산염(TCEP)(Fluka)을 1 ml의 TCEP 완충액에 용해하였다. 34.5 mg의 티올 개질 Suprema Gel을 이 용액에 첨가하고 혼합물을 밤새 실온에서 교반하였다. 현탁액을 작은 깔대기를 통해 여과하고 물질을 TCEP 완충액, 메탄올 및, 최종적으로 헥산으로 세척하였다. 원소분석(54.52% 탄소, 7.67% 수소, 1.40% 황)에서는 황 농도가 0.44 mmol/g이고 질소는 존재하지 않는 것으로 나타났다. 분광광도법(Nogueira et al., Analytica Chimica Acta, 2005, vol. 533 (2), pp. 179-183)으로 측정된 반응성 티올의 농도는 0.14 mmol/g이었다.
리간드 개질: 14.4 mg의 환원된 티올 개질 Suprema-Gel 30u를 안전잠금 플라스틱 반응튜브(eppendorf)에 옮겼다. 3.2 mg/ml tert-부틸카바모일퀴닌(내부에서 제조)의 메탄올 용액 130 μl, 2 mg/ml AIBN(Merck)의 메탄올 용액 10 μl 및 0.36 ml 메탄올을 첨가하고 혼합물을 질소로 퍼징하였다. 반응튜브를 65 ℃에서 18시간 동안 교반하였다. 현탁액을 작은 깔대기로 여과하고 물질을 메탄올로 3x, 최종적으로 석유 에테르로 세척하였다. 원소분석(50.27% 탄소, 7.70% 수소, 0.11 % 질소, 0.97% 황) 결과, 티올 개질 유기 폴리머 매트릭스상의 tert-부틸카바모일퀴닌 리간드 (화학식 g)의 성공적 고정이 나타났다.
실시예 2: 플라스미드 이소폼의 회수율에 대한 링커 길이의 영향
짧은 링커에 의해 리간드가 앵커링되는 매트릭스(순수 실리카상의 트리에톡시실릴 활성화 프로필카바모일퀴닌, 화학식 b)와 긴 링커에 의한 다른 매트릭스(3-머캡토프로필 개질 실리카상의 9-알릴카바모일-10,11-디하이드로퀴닌, 화학식 c 참조)상에 퀴닌-카바메이트 리간드를 갖는 크로마토그래피용 고체 지지체 2개를 합성하였다. 긴 링커를 갖는 지지체를 실시예 1, 도식 1에 따라 10,11-디하이드로퀴닌 (Buchler, 독일) 및 알릴이소시아네이트(Sigma Aldrich)에서 출발하여 95% 수율로 합성하고 엔드캡핑된 3-머캡토프로필 개질 실리카에 결합하였다. 원소분석(14.01 % C, 2.18% H, 1.38% N, 및 1.90% S)에 따른 리간드 밀도는 318 μmol/g이었다.
짧은 링크 리간드를 갖는 매트릭스의 제조에 있어서는, 3-이소시아네이토프로필-트리에톡시실란(1 mol eq.)과 퀴닌(1.05 mol eq.)을 메탄올 중에서 환류하여 카바메이트를 함유하는 생성물을 얻었다. 기계적으로 교반하면서 순수한 5 μm 구형 실리카를 혼합물에 직접 첨가하고(퀴닌 1 mmol 당 0.5 g의 순수 실리카) 현탁액을 추가로 환류하여 트리에톡시실릴프로필카바모일퀴닌 개질 실리카를 얻었다. 메탄올로 세척한 후, 실라놀 그룹을 실시예 1, 도식 1에 따라 엔드캡핑하였다. 원소분석(7.90% C, 1.21 % H, 0.911 % N)에 따른 리간드 밀도는 217 μmol/g이었다.
제조된 지지체를 함유하는 HPLC 컬럼을 개질된 5 μm 실리카 정지상으로 600 바아(bar)의 압력에서 자체 내 충전하였다. HPLC 분석을 바이너리 펌프, 온도조절된 자동 샘플러(4 ℃로 냉각) 및 UV 광원으로 D2 램프를 사용하는 DAD UV 검출기가 구비된 Agilent 1200 SL 시스템(Waldbronn, 독일)에서 수행하였다. 샘플 성분들은 방법 1, 즉 증가하는 NaCl 그래디언트와 증가하는 2-프로판올 그래디언트를 동시에("NaCl 및 2-프로판올 혼합 그래디언트") 사용하여 용출되었다.
HPLC용 용리액과 크로마토그래피 조건: 먼저 NaH2P04(Merck)로 0.5 mol/L의 저장용액을 준비하였다. 용리액 A는 5M NaOH로 7.0으로 적정된 1:10 희석된 저장용액(50 mmol/L NaH2P04)을 포함한다. 용리액 B는 5M NaOH로 7.0으로 적정된 0.6 mol/L NaCl(Fluka)과 10% (v/v) 이소프로판올(Roth)을 함유하는 1:10 희석된 저장용액(50 mmol/L NaH2P04)을 포함한다. 15분 이내의 0 내지 100% B의 그래디언트를 분석하는 동안 진행한다. 유속은 0.7 ml/분, 검출파장 258 nm(슬릿: 4nm, 레퍼런스 360 nm, 100 nm 밴드 폭), 및 온도 50 ℃(3 μl 열교환기에서 용매 예열)로 세팅하였다.
크로마토그래피 작업을 기록하기 위하여 (겔 전기영동 결과에 근거하여)5% oc 형태를 함유하는 2.84 mg/ml의 ccc pDNA 샘플 용액 3 μl를 컬럼에 적재하여 용리액 B의 양을 증가하면서 용출하였다. 잔재가 없도록 하기 위해 100% 용리액 B로 컬럼을 세척하면서 50 μl 플러그(plug)의 3 M NaCl을 4회 주입하여 컬럼을 세척하고 컬럼을 0% B로 5분 동안 재평형한 후, 0.05 mg/ml의 oc 이소폼 용액 20 μl를 컬럼에 적재하여 용리액 B의 양을 증가하면서 용출하였다. 추가로 50 μl 플러그의 3 M NaCl을 4회 주입하여 컬럼을 세척하고 컬럼을 100% 용리액 B로 세척한 후, 0.05 mg/ml의 lin 이소폼 용액 20 μl를 컬럼에 적재하여 용리액 B의 양을 증가하면서 용출하였다. 길게 링크된 리간드를 갖는 매트릭스를 사용한 oc와 선형 이소폼에 대해 얻어진 피크 영역을 비교할 때 (oc 이소폼의 1 μg pDNA당 피크 영역과 1 μg pDNA당 선형 이소폼의 피크 영역 간의 비율로 계산된)회수율은 약 60%이다. 그러나, 짧게 링크된 리간드를 사용하는 경우 데이터는 분석오차(5%) 내에서 서로 일치하였다. ccc와 선형 이소폼 샘플에 대해 얻어진 피크 영역을 비교하면 시험된 양 지지체 모두 95 내지 100%의 회수율을 나타냈다.
실시예 3: pDNA 이소폼과 토포아이소머의 분리에 대한 매트릭스 형태의 영향
실시예 2에 기술된 방법에 따라 tert-부틸이소시아네이트와 퀴닌으로부터 합성된 tert-부틸카바모일퀴닌 리간드를 3-머캡토프로필실란 활성화 지지체에 의해 1.5 μm 비다공성 실리카 입자(미국 Micra Scientific Inc.로부터 입수), 10 μm 다공성 실리카 입자(일본 Daiso Co, Ltd.로부터 입수) 및 2 μm 거대기공을 함유하는 실리카 모놀리스 Chromolith™ (독일 Merck로부터 입수)에 결합하였다. 이 지지체들은 1.5 μm 입자에 대하여 3 m2/g, 10 μm 입자와 모놀리스 각각에 대하여 300 m2/g의 비표면적을 가진다. 1.5 μm 비다공성 실리카 입자를 50 x 4.6 mm 컬럼 내에 비숍(Bischoff) 크로마토그래피(독일)에 의해 충전하면서, 10 μm 입자들을 자체 내에서 600 바의 압력으로 150 x 4.0 mm 컬럼에 충전하였다. 사용된 크로마토그래피 조건 및 크로마토그래피 장비를 실시예 2에 기재하였다.
3종 이소폼 모두를 함유하는 샘플을 10 mM 에틸렌디아민테트라아세트산 디소듐염("EDTA Na2", Fluka)을 갖는 60 μl 수용액, 약 10% oc 이소폼을 함유하는 2.84 μg/μl ccc pDNA 샘플 10 μl와, 0.05 g/μl 선형 이소폼 50 μl를 혼합하여 제조하였다. 선형 이소폼은 제조업자의 지시에 따라 EcoR V(Sigma Aldrich)로 분해하여 생성하고 EDTA를 첨가하여 엔도뉴클레아제를 불활성화하였다. 크로마토그래피 작업에서, pDNA의 3종 이소폼(pMCP1 플라스미드의 oc, ccc 및 lin 이소폼) 모두를 함유하는 pDNA 샘플 용액 10 μl를 컬럼에 적재하여 동일 조건 하에 용출하였다. 분석 목적을 위하여는 1.5 μm 지지체의 선택이 바람직하다. 그러나, 10 μm 다공성 지지체(도 1b 참조)와 모놀리스 지지체(도 1c 참조) 모두 ccc 형태의 분리에만 집중하고 있는 제조용 적용에 적합하였다.
실시예 4: NaCl/2-프로판올 혼합 그래디언트 용출(방법 1)과 비교한 pH와 2-프로판올 혼합 그래디언트 용출(방법 2)을 사용하는 크로마토그래피 방법
0.15 μg oc 이소폼, 0.3 μg 선형 이소폼 및 14.2 μg ccc 이소폼을 함유하는 100 μl의 pDNA 샘플을 1.5 μm 비다공성 실리카에 결합된 트리에톡시실릴프로필카바모일퀴닌 리간드(화학식 b 참조)를 포함하는 물질상에 적재하였다. 샘플 성분들은 방법 2, 즉 증가하는 pH 그래디언트와 증가하는 2-프로판올 그래디언트를 동시("pH 및 2-프로판올 혼합 그래디언트")에 Agilent 1200 SL 시스템에서 사용하여 용출하고 258 nm에서 UV 흡광도를 기록하였다.
HPLC용 용리액과 크로마토그래피 조건: 먼저 NaH2P04(Merck, Darmstadt, 독일)로 0.5 mol/L의 저장용액을 준비하였다. 용리액 A는 5M NaOH로 7.2로 적정된 1:10 희석된 저장용액(50 mmol/L NaH2P04)을 포함한다. 용리액 B는 5M NaOH로 7.9로 적정된 20% (v/v) 2-프로판올과 1:10 희석된 저장용액(50 mmol/L NaH2P04)을 포함한다. 15분 이내의 0 내지 100% B의 선형 그래디언트(pH 7.2 내지 pH 7.9의 그래디언트에 해당)를 분석하는 동안 진행한다. 분석 진행 사이에 컬럼을 염화나트륨 플러그로 세척(50μl 3M NaCl(aq.) 주입)하는 한편, 이동상 조성물을 80% B에서 1분 동안 유지한 다음, 0% B로 5분 동안 재평형하였다. 유속 0.7 ml/분, 검출파장 258 nm(슬릿: 4 nm, 레퍼런스 360 nm, 100 nm 밴드 폭), 및 온도 60 ℃(3 μl 열교환기에서 용매 예열)로 세팅하였다. 이 크로마토그램들과 실시예 2에 기술된 방법 1에서 얻어진 것들(도 1a 참조)을 비교할 때, 후자의 것이 pDNA 토포아이소머 분리에 바람직하다. 방법 2는 (토포아이소머 분리 없이)ccc pDNA를 단리하기 위한 제조용 적용에 바람직할 뿐만 아니라 플라스미드 균질성, 즉 다른 형태(oc와 선형)에 대하여 상대적으로 ccc 형태 함량의 분석 측정에 바람직하다.
실시예 5: 리간드 변이와 고적재량의 입증
크로마토그래피용 고체 지지체 3종을 합성하였다. tert-부틸카바모일-퀸코린 리간드(화학식 d)를 실시예 1, 도식 1에 따라 퀸코린(Buchler, 독일)과 tert-부틸이소시아네이트에서 출발하여 에틸 아세테이트(내부에서 재증류)/트리에틸아민 (Fluka) (10:1)으로 플래쉬 실리카 컬럼 크로마토그래피를 96%의 수율로 수행하여 합성하고 엔드캡핑된 머캡토프로필 개질 5 μm 실리카 입자에 결합하였다. 원소분석(10.51 % C, 1.98% H, 0.979% N, 1.85% S)에 따른 리간드 밀도는 307 μmol/g이었다.
tert-부틸퀸코리닐우레아 리간드(화학식 e)를 실시예 1, 도식 1에 따라 퀸코린-아민 (Buchler, 독일)과 tert-부틸이소시아네이트에서 출발하여 에틸 아세테이트(내부에서 재증류)/메탄올/트리에틸아민(Fluka)(10:1:1)으로 플래쉬 실리카 컬럼 크로마토그래피를 96%의 수율로 수행하여 합성하고 엔드캡핑된 머캡토프로필 개질 5 μm 실리카 입자에 결합하였다. 원소분석(8.965% C, 1.87% H, 0.979% N, 1.94% S)에 따른 리간드 밀도는 210 μmol/g이었다.
트리에톡시실릴프로필카바모일퀴닌 개질 실리카 매트릭스를 실시예 2에 따라 1.5 μm 비다공성 실리카 입자(Micra Scientific Inc., 미국)를 사용하여 제조하였다. 원소분석에 따른 리간드 밀도는 100 x 더 작은 비표면적으로 인해 9 μmol/g이었다. 트리에톡시실릴프로필카바모일퀴닌 개질 실리카 물질을 4.6 x 50 mm 컬럼에 충전하는 한편, 다른 두 물질을 150 x 4.0 mm 컬럼에 충전하였다.
HPLC용 용리액과 크로마토그래피 조건: 먼저 NaH2P04(Merck)로 0.5 mol/L의 저장용액을 준비하였다. 용리액 A는 5M NaOH로 7.0으로 적정된 1:10 희석된 저장용액(50 mmol/L NaH2P04)을 포함한다. 용리액 B는 5M NaOH로 7.0으로 적정된 30% (v/v) 이소프로판올(Roth)과 0.6 mol/L NaCl(Fluka)을 함유하는 1:10 희석된 저장용액(50 mmol/L NaH2P04)을 포함한다. 24분 이내의 60 내지 100% B의 그래디언트 (tert-부틸카바모일-퀸코린 및 tert-부틸퀸코리닐우레아 리간드) 또는 15분 이내의 0 내지 25% B 그래디언트(트리에톡시실릴프로필카바모일퀴닌 리간드)를 분석 중에 진행하였다. 유속 0.7 ml/분, 검출파장 258 nm(슬릿: 4 nm, 레퍼런스 360 nm, 100 nm 밴드 폭), 및 온도 60 ℃(3 μl 열교환기에서 용매 예열)로 세팅하였다.
크로마토그래피 수행을 기록하기 위하여(도 5c, 5d 및 6a), 5% oc 형태를 함유하는 2.84 mg/ml의 ccc pDNA 샘플 용액 3 μl를 컬럼에 적재하여 용리액 B의 양을 증가하면서 용출하였다. 고적재량을 입증하기 위하여, 284 μg의 전체 pDNA를 함유하는 샘플 용액 100 μl를 4.6 x 50 mm 컬럼에 적재하여 용리액 B의 양을 증가하면서 용출하였다. 대략 추정으로 컬럼은 약 0.5 g의 크로마토그래피 물질을 함유하였으며, 이것은 284 μg의 전체 pDNA를 분리하는데 충분한 것으로 확인되었다. 본 발명에 따른 모든 리간드는 동일한 용출 패턴으로 확인된 pDNA 이소폼과 토포아이소머를 분리할 수 있으므로 화학친화성 원리의 역동성을 나타내었다.
실시예 6: 토포아이소머 동일성과 그의 용출 순서의 입증
알릴카바모일-10,11-디하이드로퀴닌 리간드를 함유하는 매트릭스(도 2b 참조)를 실시예 1, 도식 1에 따라 합성하고 내부에서 150 x 4.0 mm 컬럼에 충전하였다. 크로마토그래피 시스템과 크로마토그래피 조건은 30분 내에서 10 내지 60% B로 수행하는 그래디언트를 제외하고 실시예 5에 기술된 바와 같다.
크로마토그래피 수행을 기록하기 위하여, 약 4% oc 형태를 함유하는 2.84 mg/ml의 ccc pDNA 샘플 용액 100 μl를 컬럼에 적재하여 용리액 B의 양을 증가하면서 용출하였다. 수행하는 동안 2개 분획을 UV 검출기 다음에 수집하였고, 각각은 단일 토포아이소머를 함유하였다. 이 분획들을 Millipore (MA, 미국)가 공급한 VSWP 셀룰로스 에스테르 멤브레인(직경 25 mm, 기공 25 nm)을 사용하여 정제수에 대해 투석하였다. 디스크를 반짝이는 면을 위로 하여 물 표면에 얹고 300 μl 부피를 주의 깊게 디스크 표면에 적재하였다. 15 내지 30분 동안 4 ℃에서 부유시킨 후, 샘플을 피펫으로 회수하고, 각 분획으로부터의 이 용액 20 μl를 크로마토그래피 시스템에 재주입하였다.
모세관 겔 전기영동을 Agilent Technologies의 3 DCE 장비에서 수행하였다. 100 μm i.d.의 DB-17 코팅된 모세관을 J&W Scientific (Folsom, CA)에서 구입하여 32 cm 길이로 절단하고 폴리이미드 코팅을 면도날(유효길이 24.5 cm)로 제거하여 검출 윈도우를 만들었다. 토포아이소머 분석에 있어서, 이 모세관을 Acros organics(Geel, 벨기에)에서 구입한 0.1% 하이드록시프로필메틸셀룰로스(HPMC, 86 kDa)를 함유하는 트리스-보레이트-EDTA(TBE, 89 mM 붕산, 89 mM Tris, 2 mM EDTA; NaOH를 사용하여 pH 9.0으로 적정됨) 완충액으로 채웠다. 완충액의 완전 균질화를 위해, 바이오폴리머를 첨가한 후에 용액을 24시간 동안 교반한 다음, 추가로 24시간 동안 교란 없이 실온에 방치하였다. 고도로 초나선된 ccc 플라스미드의 높은 분해율을 얻기 위해, 삽입제를 전기영동 완충액[de Carmejane et al., Proceedings of SPIE-The International Society for Optical Engineering, 1999, vol. 3602, p.346-354]에 첨가하였고, 이 경우에 12 μl의 5 mg/ml 클로로퀸 디포스페이트(Fluka) 수용액을 4 ml의 전기영동 완충액에 첨가하여 각각 15 μg/ml 클로로퀸의 최종 농도를 얻는다. 샘플을 동전기적(electrokinetic) 주입에 의해 -5 kV에서 4초 동안 삽입하였다. 이후, 전기영동을 네가티브 모드로 3.3 kV에서 25분 동안 25 ℃에서 258 nm에서의 UV 검출로 수행하였다. 주입하기 전에 모세관을 물로 3분 동안 플러싱한 다음, 완충액을 5분 동안 흘려서 사전조건화하였다. 대체로, 개별 토포아이소머의 용출에서 네가티브 초나선이 적은 것들이 먼저 용출하는 것을 확인하였다.
실시예 7: 플라스미드 DNA의 생명공학적 생산에서 토포아이소머 분포의 과정 내 제어
E. coli에서 AS24 (4.4 kb, Boehringer Ingelheim)로서 코딩된 pDNA의 뱃치 발효 동안, 샘플을 2시간 간격으로 꺼내어 즉시 냉동하였다. 분석 전에 샘플을 해동하고 pDNA를 단리하여 MiniPrep Kit(Qiagen)를 제조자의 지시에 따라 사용하여 농축하였다. 정제되지 않은 플라스미드 샘플을 2차원 HPLC 시스템에 직접 주입하여 분석하였다.
크로마토그래피 조건: 2D HPLC 시스템(생체적합성 Ultimate 3000: Dionex), 2개의 추가 10-1 컬럼 스위칭 밸브 포함, 제1 차원(dimension): Sepax Technologies Inc.(미국)의 SRT SEC 1000 (크기 배제 컬럼), 용리액: 0.1 mol/l NaCl과 1 mmol/l EDTA를 갖는 0.1 mol/l Tris(Fluka), pH 7.5 (등용매 용리), 유속: 2.0 ml/min, 제2 차원: 도 2b에 기술된 리간드를 함유하는 5 μm 실리카를 갖는 100 x 4.0 mm 컬럼, 용리액 A: 50 mM 인산염 완충액 pH 7.2, 용리액 B: 0.6 mol/l NaCl과 10% (v/v) 이소프로판올 pH 7.2를 갖는 용리액 A, 컬럼 온도 60 ℃, 유속 1.0 ml/min, det. UV 258 nm; 선형 그래디언트 15분 이내의 0 - 100%B, 주입 부피 20 μl. 발효공정 동안 ccc pDNA의 초나선은 상당히 변화하였고, 이것은 본 발명에 따른 pDNA 토포아이소머의 분리방법을 사용하여 신뢰할 수 있게 측정되었다.
실시예 8: CIM 모놀리스의 신코린(Cinchorine) 타입 리간드
CIM® Epoxy Disk 모놀리스 컬럼(BIA Separations)을 메탄올과 0.1 M 수성 소듐 디하이드로겐포스페이트(Merck)의 혼합물(20:80, v/v) (pH 8.15) 중의 새로 제조된 2 M 소듐 하이드로겐 설파이드(Sigma-Aldrich) 용액으로 유수 방식으로 HPLC 펌프를 사용하여 2시간 동안 세정하였다. 이후, 컬럼을 메탄올/물 (20:80, v/v), 이어서 메탄올로 세척하였다.
0.25 M의 tert-부틸카바모일퀸코린(화학식 d) 용액을 메탄올에 용해하여 제조하고 α,α'-아조이소부티로니트릴(AIBN) (6 mg/ml, 0.037 M)을 라디칼 개시제로 첨가하였다. 이 혼합물을 5분 동안 초음파처리하고 나일론 멤브레인에 여과하여 질소로 10분 동안 퍼징하였다. 이후, 이 tert-부틸카바모일퀸코린 용액을 티올 작용화된 CIM 디스크 컬럼에 펌프하였다. 컬럼의 양 말단을 밀봉하여 물 중탕기에 옮겼으며, 여기에서 크로마토그래피 리간드의 라디칼 첨가가 60 ℃에서 일어났다. 24시간 후에 컬럼을 물 중탕기에서 꺼내어 메탄올로 세정한 다음, HPLC 펌프를 사용하여 이동상으로 평형시켰다. 플라스미드 이소폼의 분리는 용출방법 1(NaCl-그래디언트)을 사용하여 특히 제조 용도에 적합한 유기 매트릭스로 수행되었다.
실시예 9: 비다공성 유기 폴리머 입자를 함유하는 에폭시 그룹의 개질
에폭시 개질된 비다공성 폴리메타크릴레이트 구슬(에폭시-NPR, 2.5 μm Tosoh 제품)을 3구 둥근바닥 플라스크에서 메탄올에 현탁하였다. 메탄올과 0.1 M 수성 소듐 디하이드로겐포스페이트의 혼합물(20:80, v/v) (pH 8.15) 중의 2M 소듐 하이드로겐 설파이드 용액을 (에폭시 그룹에 대하여 10배 몰 초과)첨가하고 질소 기류 하에서 2시간 동안 교반하였다. 이후에, 입자들을 여과하고 메탄올/물 (20:80, v/v), 다음으로 메탄올로 세척하였다. 0.25 M tert-부틸카바모일퀸코린(화학식 d) 용액을 메탄올에 용해하여 제조하고 α,α'-아조이소부티로니트릴(AIBN) (6 mg/ml, 0.037 M)을 라디칼 개시제로 첨가하였다. 이 혼합물을 5분 동안 초음파처리하고 나일론 멤브레인에 여과하여 질소로 10분 동안 퍼징하였다. 이후, 이 tert-부틸카바모일퀸코린 용액을 3구 둥근바닥 플라스크 내의 앞서 합성된 티올 개질 NPR 입자의 현탁액에 첨가하였다. 셀렉터(selector)를 티올 작용화된 구슬에 결합하는 라디칼 첨가반응을 60 ℃에서 24시간 동안 질소 기류 하에서 교반하여 수행하였다. 이후, 입자들을 여과하고 메탄올로 수 회 세척하였다. 입자들을 33 x 4.6 mm ID 크기의 스테인레스 스틸 컬럼에 슬러리 충전하였다. 플라스미드 이소폼의 분리를 위한 컬럼의 시험은 용출 방법 1(NaCl- 및 2-프로판올 동시 그래디언트)을 사용하여 특히 분석 용도에 적합한 유기 매트릭스로 수행되었다.
Claims (21)
- 플라스미드 DNA 이소폼(isoform) 또는 토포아이소머를 분리하기 위한 다음 화학식 1에 따른 리간드를 포함하는 물질의 용도:
상기 식에서,
리간드는 3 내지 5 원자수의 길이를 갖는 스페이서로 연결된 양이온 그룹 (C)와 수소 공여체 그룹 (N-H)를 함유하고,
m, o 및 r은 서로에 대해 독립적으로 0 또는 1이고,
k, l, n 및 p는 서로에 대해 독립적으로 0, 1 또는 2이고,
Y는 그룹 -CH2-, -0-, -NH- 또는 -S-에서 선택된 임의의 잔기이고,
Z는 그룹 -C-, -S-, 또는 -P-에서 선택된 임의의 잔기이고,
R1, R2 및 R3는 수소, C1 -18 분지되거나 미분지된(unbranched) 알킬, C2 -18 분지되거나 미분지된 알케닐, C2 -18 분지되거나 미분지된 알키닐, C3 -11-카보사이클, C3 -8-헤테로사이클, C5 -18-아릴 및 C5 -13-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 치환체이고,
여기에서 R1, R2 및 R3는 임의로 서로에 대해 독립적으로 그룹 -S-, -0-, -NH-에서 선택된 하나 이상의 잔기를 포함하고,
R1, R2 및 R3 각각은 임의로 수소, C1 -6 분지되거나 미분지된 알킬, C2 -6 분지되거나 미분지된 알케닐, C2 -6 분지되거나 미분지된 알키닐, C3 -8-카보사이클, C3 -8-헤테로사이클 및 C5 -10-아릴, C5 -10-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 하나 이상의 치환체로 독립적으로 치환될 수 있고,
그에 따라 양이온 그룹 C는 적어도 하나의 질소 원자와, 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는 C3 -11 헤테로사이클이거나,
적어도 하나의 질소 원자와, 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는 C5 -18 헤테로아릴이거나,
적어도 하나의 질소 원자와, 임의로 황, 산소, 질소 및 인으로 구성되는 군에서 선택된 또다른 헤테로원자를 포함하는, 분지되거나 미분지된 C1 -10 알킬, 분지되거나 미분지된 C2 -10 알케닐, 분지되거나 미분지된 C2 -10 알키닐(여기에서 C와 R3 또는 C와 R2는 고리를 형성하여 임의로 서로에 연결되고, 리간드는 임의로 R1 또는 R3 그룹에 의해 매트릭스에 고정되거나 내재된다)이다. - 제1항에 있어서, 스페이서 길이가 4 원자수와 동일한 용도.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 수소, C1 -8 분지되거나 미분지된 알킬, C2 -8 분지되거나 미분지된 알케닐, 및 C2 -8 분지되거나 미분지된 알키닐로 구성되는 군에서 선택된 치환체이고, 임의로 하나 이상의 황 원자를 포함하는 용도.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 C3 -8-카보사이클, C5 -8-헤테로사이클, C5 -10-아릴 및 C5 -9-헤테로아릴로 구성되는 군에서 선택된 치환체인 용도.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, R3가 수소, C1 -8 분지되거나 미분지된 알킬, C2 -8 분지되거나 미분지된 알케닐, 및 C2 -8 분지되거나 미분지된 알키닐로 구성되는 군에서 선택된 치환체이고, 임의로 하나 이상의 황 원자를 포함하는 용도.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, R3가 C5 -10-아릴 및 C5 -10-아릴헤테로아릴인 용도.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 수소 공여체 그룹 (N-H)가 카보닐(C=0), 설포닐(-S02-) 및 포스포닐 그룹(-P(=0)-)으로 구성되는 군에서 선택된 적어도 하나의 수소 수용체에 인접하여 위치하는 용도.
- 제7항에 있어서, 수소 수용체가 카보닐 그룹(C=O)인 용도.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, o = 0이고 m = 1인 용도.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, o = 1이고 m = 0인 용도.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, o = 0이고 m = 1이고, k = 1이고 l = 1, Z가 -C-이고 n = 1인 용도.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, o = 1이고 m = 0이고, k = 1이고 l = 1, Z가 -C-이고 p = 1인 용도.
- 제1항 내지 제12항 중 어느 하나의 항에 있어서, 매트릭스가 고체 또는 액체이고, 유기 또는 무기 폴리머에서 선택되며, 여기에서 유기 폴리머는 실리카계이거나 지르코늄 옥사이드이고 유기 폴리머는 폴리메타크릴레이트 또는 아가로스계인 용도.
- 제13항에 있어서, 매트릭스가 입자, 모놀리스(monolith) 수지, 멤브레인 또는 자성구슬인 용도.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 하나의 항에 있어서, 플라스미드 DNA 이소폼이 공유결합 폐환형(ccc), 개방 환형(oc) 또는 선형(lin) 형태인 용도.
- 제15항에 있어서, 플라스미드 DNA 이소폼이 모노머, 다이머, 트라이머, 테트라머, 올리고머, 또는 멀티머의 혼합물을 포함하고, 여기에서 올리고머릭 및 멀티머릭 플라스미드 DNA는 카테난(catenane) 또는 연쇄체(concatemer) 형태인 용도.
- 제1항 내지 제16항 중 어느 하나의 항에 있어서, 물질이 다음으로 구성되는 군에서 선택된 용도:
화학식 (b)
화학식 (c)
화학식 (f)
화학식 (g)
- 다음으로 구성되는 군에서 선택된 물질:
화학식 (a)
화학식 (d)
화학식 (e)
- 플라스미드 DNA 이소폼 또는 토포아이소머의 분리를 위한 제18항에 따른 물질의 용도.
- 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 따른 물질을 사용하는, 플라스미드 DNA 이소폼 또는 토포아이소머의 크로마토그래피 분리방법.
- 제20항에 있어서,
a. pDNA 이소폼 또는 토포아이소머를 함유하는 샘플의 희석/용해
b. 물질 상에 샘플 적재
c. 결합된 샘플의 세척
d. 물질로부터 샘플의 용출
e. 용출된 분획의 검출 및/또는 수집 단계들을 포함하는 방법.
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